LU86721A1 - METHOD FOR IN VITRO DETERMINATION OF THE SENSITIVITY OF TUMORS AND CELL LINES TO THE SPECIFIC ACTION OF ANTI-CANCER DRUGS - Google Patents
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Description
PROCEDE DE DETERMINATION IN VITRO DE LA SENSIBILITE DE TUMEURS ET DE LIGNEES CELLULAIRES A L'ACTION SPECIFIQUE DEMETHOD FOR IN VITRO DETERMINATION OF THE SENSITIVITY OF TUMORS AND CELL LINES TO THE SPECIFIC ACTION OF
MEDICAMENTS ANTI-CANCÉREUX.ANTI-CANCER DRUGS.
Arrière-plan technologiqueTechnological background
Le cancer est, en Europe occidentale et en Amérique du Nord, la deuxième cause de morbidité et de mortalité, immédiatement après les affections cardio-vasculaires. Outre les traitements locaux (chirurgie et'radiothérapie), l'on dispose à l'heure actuelle de médicaments hormonaux ^ q ou cytotoxiques qui permettent d'enrayer son évolution chez un certain nombre de malades. Appliqués de manière intensive et précocement, ils permettent de réduire la mortalité, comme par exemple dans le cas du cancer du sein. Cependant, le spectre d'action de ces médicaments .j g est relativement restreint et leurs effets secondaires ne sont pas négligeables.Cancer is the second leading cause of morbidity and mortality in western Europe and North America, immediately after cardiovascular disease. In addition to local treatments (surgery and radiation therapy), hormonal or cytotoxic drugs are currently available which make it possible to halt its development in a certain number of patients. Applied intensively and early, they reduce mortality, as for example in the case of breast cancer. However, the spectrum of action of these .j g drugs is relatively small and their side effects are not negligible.
De très nombreuses tentatives ont été effectuées à ce jour pour prédire l'efficacité réelle de ces traitements, pour chaque malade individuellement, afin de sélec-2q tionner les produits les plus actifs et d'éviter l'administration inutile de composés toxiques. La technique la plus prometteuse développée à ce jour est sans conteste celle mise au point par Hamburger et Salmon aux U.S.A. Elle est basée sur la mise en culture en agarose ou en 2^ milieu synthétique d’une suspension cellulaire préparée à partir de la tumeur fraîchement opérée. En quelques semaines on peut assister, si la culture réussit (+ 60% de prise) au développement de colonies cellulaires bien identifiables par examen microscopique. Dans ce système, on peut mesurer l'inhibition de la formation de colonies que provoque l'addition de médicaments dans le milieu. Une technique analogue peut être utilisée, en remplaçant le milieu semi-solide que représente 1'agarose par un support solide (boîte de Pétry ou dérivé) recouvert de milieu liquide, les cellules ;adhérant au fond de la boîte. Une tendance récente, notamment en matière de screening de nouveaux médicaments potentiellement utiles en cancérologie, est de remplacer les tumeurs "sauvages" par un 2 certain nombre de lignées établies à partir de tumeurs humaines, et que l'on espère représentatives des cancers dont elles sont dérivées.Numerous attempts have been made to date to predict the real effectiveness of these treatments, for each patient individually, in order to select the most active products and avoid unnecessary administration of toxic compounds. The most promising technique developed to date is undoubtedly that developed by Hamburger and Salmon in the USA. It is based on the cultivation in agarose or in 2 ^ synthetic medium of a cell suspension prepared from the tumor freshly operated. In a few weeks, if the culture succeeds (+ 60% uptake), one can assist in the development of cell colonies that can be clearly identified by microscopic examination. In this system, the inhibition of colony formation caused by the addition of drugs into the medium can be measured. A similar technique can be used, replacing the semi-solid medium that represents agarose with a solid support (Petry dish or derivative) covered with liquid medium, the cells adhering to the bottom of the dish. A recent trend, notably in the screening of new drugs potentially useful in oncology, is to replace "wild" tumors with a certain number of lines established from human tumors, and which we hope are representative of the cancers of which they are derived.
Pour évaluer de manière fiable les effets d’une 5 drogue, il faut que la culture ait donné lieu, dans les contrôles cultivés sans médicament, au développement d'un nombre suffisant de colonies, ce qui réduit l'applicabilité du test à environ 30% des cas. La valeur prédictive des cultures clonogéniques à l'égard de la réponse thérapeuti-10 que observée chez le patient est loin d'être absolue, et de nombreux faux positifs ou faux négatifs ont été décrits, ce qui suggère que la procédure de mise en suspension cellulaire suivie de culture prolongée altère profondément les caractéristiques biologiques du matériel testé. 15 Finalement, cette technique exige un temps de l'ordre de 3 semaines avant l'obtention d'une réponse, ce qui constitue une perte de temps précieux pour l'application du traitement au malade.In order to reliably assess the effects of a drug, the culture must have resulted in the development of a sufficient number of colonies in the controls cultivated without drug, which reduces the applicability of the test to approximately 30 % of cases. The predictive value of clonogenic cultures with respect to the therapeutic response observed in the patient is far from absolute, and many false positives or false negatives have been described, suggesting that the suspension procedure cell followed by prolonged culture profoundly alters the biological characteristics of the material tested. Finally, this technique requires a time of the order of 3 weeks before obtaining a response, which constitutes a waste of precious time for the application of the treatment to the patient.
Objet de l'invention 20 La présente invention vise à fournir un procédé permettant de déterminer in vitro la sensibilité de tumeurs et de lignées cellulaires à l'action spécifique de médicaments anti-cancéreux, aussi bien des médicaments du type hormonal que du type cytotoxique.OBJECT OF THE INVENTION The present invention aims to provide a method making it possible to determine in vitro the sensitivity of tumors and cell lines to the specific action of anti-cancer drugs, both drugs of the hormonal type and of the cytotoxic type.
2 5 Elle vise tout particulièrement à fournir un procédé qui, par sa nature, est applicable pratiquement à tous les cas de tumeurs, qui est plus fiable, notamment en réduisant le risque de réponses fausses, et qui permet une observation spécifique de l'activité sur différentes popu-30 lations cellulaires provenant d'une même tumeur et qui finalement soit plus rapide que les techniques de l'art antérieur. La technique envisagée devrait être également transposable à un traitement partiellement ou totalement automatisé des essais.2 5 It aims in particular to provide a process which, by its nature, is applicable practically to all cases of tumors, which is more reliable, in particular by reducing the risk of false answers, and which allows a specific observation of the activity on different cell populations from the same tumor and which ultimately is faster than the techniques of the prior art. The envisaged technique should also be transposable to a partially or fully automated processing of the tests.
35 Eléments caractéristiques de l'invention35 Character-defining elements of the invention
Le principe à la base de l'invention est celui qui consiste à suivre l'évolution de la fraction proliférante provenant d'un fragment de tissu frais ou d'une 3 suspension cellulaire de ce tissu, grâce à un marquage.The principle underlying the invention is that which consists in monitoring the development of the proliferating fraction originating from a fragment of fresh tissue or from a cell suspension of this tissue, by means of labeling.
De manière spécifique, l'invention porte sur un procédé de détermination in vitro de la sensibilité de tumeurs et de lignées cellulaires à l'action spécifique de 5 médicaments anti-cancéreux comportant le marquage de la fraction cellulaire de manière appropriée, l'incubation en présence du médicament à tester pendant un temps suffisant pour observer l'effet toxique dudit médicament et une mesure de la fraction cellulaire proliférante.Specifically, the invention relates to a method for in vitro determination of the sensitivity of tumors and cell lines to the specific action of anti-cancer drugs comprising labeling of the cell fraction in an appropriate manner, incubation in presence of the drug to be tested for a sufficient time to observe the toxic effect of said drug and a measurement of the proliferating cell fraction.
10 La mesure de la tumeur peut s'effectuer par simple découpage du tissu frais en fragments de l'ordre du millimètre cube ou peut se faire de manière classique sous forme d'une suspension cellulaire, bien que cette manière de procéder offre moins d'informations pratiques ou rende 15 plus difficile et moins complète l'interprétation des résultats.10 The measurement of the tumor can be carried out by simple cutting of the fresh tissue into fragments of the order of a cubic millimeter or can be carried out in the conventional manner in the form of a cell suspension, although this procedure offers less practical information or make it more difficult and less complete to interpret the results.
La mise en présence de la préparation et du médicament à tester peut s'effectuer avant le marquage mais pour éviter une interférence ou un effet éventuel de 2 0 ce médicament avec le marquage, il est préférable que cette mise en contact se produise après le marquage.The preparation of the test drug can be brought into contact before labeling, but to avoid any interference or possible effect of this drug with the labeling, it is preferable that this contacting occurs after labeling. .
Ledit marquage peut s'effectuer selon des techniques connues en soi. Selon une première forme d'exécution de l'invention, ce marquage peut s'effectuer à l'aide 25 de thymidine tritiée, auquel cas la mesure de la fraction cellulaire proliférante s'effectue avantageusement par autoradiographie. Une autre forme d'exécution comporte le marquage à la biotine et la mesure se réalise avantageusement dans ce cas par une mesure de la densité optique 30 intégrée.Said marking can be carried out according to techniques known per se. According to a first embodiment of the invention, this labeling can be carried out using tritiated thymidine, in which case the measurement of the proliferating cell fraction is advantageously carried out by autoradiography. Another embodiment includes labeling with biotin and the measurement is advantageously carried out in this case by measuring the integrated optical density.
La mesure de la fraction cellulaire proliférante peut donc être une mesure de pourcentage de cellules en phase S ou en phase M ou à la fois une mesure du pourcentage de cellules en phase S et M, ce qui fournit des indi- 35 cations précieuses sur le mode d'action du médicament testé.The measurement of the proliferating cell fraction can therefore be a measurement of the percentage of cells in phase S or in phase M or both a measurement of the percentage of cells in phase S and M, which provides valuable information on the mode of action of the drug tested.
De manière pratique, pour obtenir une réponse statistiquement fiable, la durée nécessaire pour observer « 4 la toxicité du médicament testé est égale ou supérieure à 24 h/ mais est cependant nettement inférieure (une semaine au maximum) aux délais de l'ordre de plusieurs semaines qui sont nécessaires dans les techniques de l'art 5 antérieur.In practical terms, to obtain a statistically reliable answer, the time required to observe “4 the toxicity of the drug tested is equal to or greater than 24 h / but is however significantly lower (one week at most) than the delays of the order of several weeks which are required in the prior art techniques.
Selon une forme d'exécution particulière, il est possible de procéder à la mesure de la fraction cellulaire proliférante à l'aide d'un appareillage automatisé du type Système d'Analyse Microscopique à Balayage Automatique 10 (SAMBA 200).According to a particular embodiment, it is possible to proceed to the measurement of the proliferating cell fraction using an automated apparatus of the type of Microscopic Analysis System with Automatic Scanning 10 (SAMBA 200).
Selon la technique de l'invention, il devient possible d'améliorer considérablement le rendement et la fiabilité de 1'hormonochimiogramme et la technique est applicable à tous les cancers (tumeurs solides, lignées, 15 cancers hématologiques). Elle permet d'évaluer les effets d'un médicament dans tous les cas et types de tumeurs. Les résultats sont fiables car les propriétés biologiques de la tumeur (environnement, architecture du tissu) sont préservées puisqu'il n'est pas nécessaire de procéder à 20 une homogénisation de la préparation. La quantité de tissu disponible ne représente pas un facteur limitant, dans la mesure où, à partir de 10 mm3, il est déjà possible actuellement par la technique de l'invention de tester un médicament à une concentration déterminée. Si l'on dispose 2 5 d'un cm3, on peut tester au minimum trois drogues, à une concentration, ou une drogue à trois concentrations différentes. Il est probable qu'il sera possible d'encore affiner la technique à l'avenir pour utiliser moins de matière de départ.According to the technique of the invention, it becomes possible to considerably improve the yield and the reliability of the hormochemogram and the technique is applicable to all cancers (solid tumors, lines, hematological cancers). It makes it possible to evaluate the effects of a drug in all cases and types of tumors. The results are reliable because the biological properties of the tumor (environment, architecture of the tissue) are preserved since it is not necessary to carry out a homogenization of the preparation. The quantity of available tissue does not represent a limiting factor, insofar as, from 10 mm 3, it is already possible at present by the technique of the invention to test a medicament at a determined concentration. If you have 25 cm3, you can test at least three drugs at one concentration, or one drug at three different concentrations. It is likely that it will be possible to further refine the technique in the future to use less starting material.
30 Du fait que, contrairement aux procédés de l'état de la technique, le procédé de l'invention n'implique pas une homogénéisation (broyage) préalable de la préparation avec destruction des cellules, un examen et une observation histologique reste possible et il devient pour 3 5 la première fois envisageable de déterminer pour deux médi caments qui auraient un effet cytotoxique identique, celui qui exerce l'effet toxique le plus réduit sur les cellules saines.Since, unlike the methods of the prior art, the method of the invention does not involve prior homogenization (grinding) of the preparation with destruction of the cells, examination and histological observation remains possible and it is it becomes for the first time possible to determine for two drugs which would have an identical cytotoxic effect, that which exerts the most reduced toxic effect on healthy cells.
, 5, 5
Formes d’exécution préférées.Preferred forms of execution.
L'invention sera décrite plus en détail à l'aide des illustrations qui suivent des techniques d’exécution appliquées d'une part à des tumeurs solides et d'autre 5 part à des "monolayers" ou suspensions cellulaires.The invention will be described in more detail with the aid of the illustrations which follow execution techniques applied on the one hand to solid tumors and on the other hand to "monolayers" or cell suspensions.
A. Tumeurs solides.A. Solid tumors.
Le matériel utilisé est constitué par des tumeurs fraîchement prélevées, stérilement.The material used consists of tumors freshly removed, sterile.
Les étapes opératoires sontî 10 1. Les tumeurs sont fragmentées (scalpel, ciseaux,...) en morceaux d'environ 1 mm3. Ceux-ci sont incubés pendant toute la procédure dans un milieu de culture synthétique (par exemple MEM ou DMEM, additionnés d'antibiotiques) et maintenus en survie dans des conditions 15 adéquates de température, d'humidité et d'oxygénation (par exemple étuve).The operating steps are: 1. The tumors are fragmented (scalpel, scissors, etc.) into pieces of approximately 1 mm 3. These are incubated during the whole procedure in a synthetic culture medium (for example MEM or DMEM, supplemented with antibiotics) and maintained in survival under adequate conditions of temperature, humidity and oxygenation (for example oven ).
2. Marquage de 1'ADN de la fraction cellulaire proliférante par une base purique ou pyrimidique elle-même marquée (par exemple au tritium, au carbone 14, à la 2 0 biotine, ou par un substrat reconnaissable par anti corps spécifique...). Ce marquage s'effectue pendant 1 à 3 heures et l'opération est suivie de plusieurs lavages afin de se débarrasser de l'excédent non incorporé de base nucléique marquée.2. Labeling of the DNA of the proliferating cell fraction with a purine or pyrimidine base which is itself labeled (for example with tritium, carbon-14, biotin, or by a substrate recognizable by specific anti-bodies ... ). This labeling is carried out for 1 to 3 hours and the operation is followed by several washes in order to get rid of the unincorporated excess of labeled nucleic base.
25 3. Exposition du matériel tumoral aux drogues dont on veut tester l'action cytotoxique ou antiproliférative. La durée d'exposition (quelques minutes à quelques heures) et les concentrations dépendent des drogues étudiées. L'opération est suivie ou non de lavages afin de se 30 débarrasser éventuellement de l'excédent de drogue(s).25 3. Exposure of the tumor material to drugs whose cytotoxic or antiproliferative action is to be tested. The duration of exposure (a few minutes to a few hours) and the concentrations depend on the drugs studied. The operation is followed or not by washing in order to possibly get rid of the excess drug (s).
Une partie du matériel tumoral, servant de contrôle, n'est pas soumise à l'action de la (des) drogue (s).Part of the tumor material, used as a control, is not subjected to the action of the drug (s).
4. Incubation pour des durées variables (de 1 heure à 7 jours), dépendant des drogues étudiées et de la 35 quantité de matériel disponible. Celui-ci est éventuellement réparti dans des cupules individuelles (une par condition) convenant à la culture organotypique.4. Incubation for variable durations (from 1 hour to 7 days), depending on the drugs studied and the amount of material available. This is optionally distributed in individual wells (one per condition) suitable for organotypic culture.
5. Fixation histologique, déshydratation, inclusion, sec- 6 tion au microtome du matériel.5. Histological fixation, dehydration, inclusion, microtome section of the material.
6. Révélation de la base marquée par procédé approprié (autoradiographie, immunohistochimie, technique à l'avi-dine-biotine, protéine A,...) et contre-coloration 5 éventuelle.6. Revelation of the labeled base by an appropriate method (autoradiography, immunohistochemistry, avidin-biotin technique, protein A, etc.) and possible counter staining.
| 7. Lecture des lames afin de définir pour les contrôles (C), et pour chaque condition expérimentale (E) la proportion de cellules marquées en fin d'incubation. Le rapport E/C définit la proportion des cellules survi- 10 vantes au sein de la fraction proliférante initialement marquée; il permet d'apprécier l'effet cytotoxique ou antiprolifératif de la (des) drogue(s) considéréeis). La lecture se fait à l'aide d'un microscope optique, soit manuellement, soit de manière automatisée, à l'ai-1 15 de par exemple du Système d'Analyse Microscopique à | Balayage Automatique (SAMBA 200).| 7. Reading of the slides in order to define for the controls (C), and for each experimental condition (E) the proportion of labeled cells at the end of incubation. The W / C ratio defines the proportion of surviving cells within the initially labeled proliferating fraction; it makes it possible to assess the cytotoxic or antiproliferative effect of the drug (s) considered). The reading is done using an optical microscope, either manually or automatically, using for example the Microscopic Analysis System at | Automatic scanning (SAMBA 200).
En variante, il est possible de procéder de manière que l’exposition à la ou aux drogue(s) précède l'opération de marquage.Alternatively, it is possible to proceed in such a way that the exposure to the drug (s) precedes the labeling operation.
20 b. Monolayers ou suspensions cellulairesB. Monolayers or cell suspensions
Le matériel peut être constitué par des lignées cellulaires, établies ou non, ou des suspensions cellulaires (cytoponction ou dispersion de tumeurs solides, sang, moëlle ou liquide d'épanchement).The material can be constituted by cell lines, established or not, or cell suspensions (cytopuncture or dispersion of solid tumors, blood, marrow or effusion fluid).
25 Au cours des quatre premières étapes, les cellu les sont traitées de la manière indiquée pour les étapes 1 à 4 du mode opératoire prévu pour les tumeurs solides. Les i monolayers sont cultivés sur lamelle histologique; les suspensions sont centrifugées en fin d'incubation, soit 30 sur lame, soit sous forme de culot.During the first four steps, the cells are treated as indicated for steps 1 to 4 of the procedure intended for solid tumors. The monolayers are cultivated on a histological slide; the suspensions are centrifuged at the end of incubation, either on a slide or in the form of a pellet.
La cinquième étape consiste en une fixation histologique, déshydratation, inclusion, le cas échéant, des culots et section au microtome de ces derniers.The fifth step consists of histological fixation, dehydration, inclusion, if necessary, of the pellets and section of the microtome thereof.
Pour les étapes 6 et 7 la procédure est identi-35 que à celle décrite dans le mode opératoire pour les tumeurs solides.For steps 6 and 7 the procedure is identical to that described in the procedure for solid tumors.
Egalement dans ce cas, il est possible de procéder de manière que l'exposition à la ou aux drogues 7 précède l'opération de marquage.Also in this case, it is possible to proceed so that the exposure to the drug or drugs 7 precedes the marking operation.
L'invention sera de plus décrite à titre illustratif à l'aide de l'exemple d'exécution qui suit. Exemple: 5 Illustration d'un chimiogramme ou d'un hormonogramme établi à partir de culture organotypique de tissu tumoral humain.The invention will be further described by way of illustration with the aid of the following embodiment example. Example: 5 Illustration of a chemogram or a hormonogram established from organotypic culture of human tumor tissue.
1. Milieu de transport1. Transport medium
La culture de tissus humains nécessite le trans-10 port à partir de la salle d’opération à la chambre de culture.Culture of human tissue requires trans-10 port from the operating room to the culture chamber.
Le milieu minimum essentiel (MEM) fourni par la firme Gibco, dépourvu de sérum, mais additionné de L-glu-tamine (0,6 mg/ml, Gibco), de gentamycine '(40 pg/ml, She-15 ring Corporation), de pénicilline (100 U/ml, Difco) et de streptomycine (100 pg/ml, Difco) a été utilisé comme "milieu de transport”. Ce milieu est contenu dans des flacons stériles, à usage unique, maintenus à 4°C sur des glaçons. Le temps écoulé entre le moment du prélèvement aseptique 20 de la tumeur et la mise en culture est en. moyenne de 2 à 12 heures.The minimum essential medium (MEM) supplied by the company Gibco, devoid of serum, but supplemented with L-glu-tamine (0.6 mg / ml, Gibco), gentamycin '(40 pg / ml, She-15 ring Corporation ), penicillin (100 U / ml, Difco) and streptomycin (100 pg / ml, Difco) was used as “transport medium”. This medium is contained in sterile, single-use vials, kept at 4 ° C on ice The time elapsed between the time of aseptic removal of the tumor and the setting in culture is on average from 2 to 12 hours.
2. Milieu de manipulation2. Handling medium
Le découpage de la tumeur en fragments de 1 x 1 x 2 mm ("expiants de survie"), à l'aide d'un scalpel, doit 25 se faire dans un milieu liquide où l'on immerge les tissus afin d'éviter leur altération et leur dessication. Pour les manipulations le "milieu de transport" précité a été utilisé, mais avec une concentration d'antibiotiques cinq fois supérieure.The cutting of the tumor into fragments of 1 x 1 x 2 mm ("survival explants"), using a scalpel, must be done in a liquid medium where the tissues are immersed in order to avoid their deterioration and their desiccation. For the manipulations the above-mentioned "transport medium" was used, but with a concentration of antibiotics five times higher.
30 Le milieu de manipulation est versé dans une boîte de Petri stérile de 60 x 10 mm. En fin de découpage, les expiants sont rinçés trois fois dans le milieu riche en antibiotiques.The handling medium is poured into a sterile 60 x 10 mm Petri dish. At the end of cutting, the explants are rinsed three times in the medium rich in antibiotics.
3. Le marquage de la fraction cellulaire proliférante.3. The labeling of the proliferating cell fraction.
35 Dès que le découpage (+ rinçages) est terminé, les fragments tumoraux sont incubés pendant 2 heures dans une boîte de Petri (60 x 10 mm) contenant 20 ml de milieu MEM (défini au §1) auquel on a ajouté 1 pci de thymidine 8 tritiée (^H-TdR: activité spécifique 40 Ci/mmol) par ml de milieu MEM. Cette étape représente le "marquage de la fraction cellulaire proliférante" de la tumeur. Lorsque les deux heures de marquage se sont écoulées', les fragments 5 sont rinçés quatre fois afin d'éliminer la thymidine tritiée qui ne s'est pas incorporée.As soon as the cutting (+ rinses) is complete, the tumor fragments are incubated for 2 hours in a Petri dish (60 x 10 mm) containing 20 ml of MEM medium (defined in §1) to which 1 pc of tritiated thymidine 8 (^ H-TdR: specific activity 40 Ci / mmol) per ml of MEM medium. This step represents the "labeling of the proliferating cell fraction" of the tumor. When the two hours of labeling have elapsed, the fragments are rinsed four times in order to remove the tritiated thymidine which has not incorporated.
4. Traitement chimiothérapique et/ou hormonothérapique des fragments tumoraux.4. Chemotherapeutic and / or hormone therapy treatment of tumor fragments.
Les fragments tumoraux sont répartis dans diver-10 ses boîtes de PETRI (60 x 10 mm), correspondant chacune à une condition expérimentale individuelle. La figure ci-jointe représente 1'hormonogramme suivant: 25 fragments tumoraux ont été incubés dans 2 0 ml de "milieu de transport" uniquement (condition de contrôle "Ct" de la figure 15 ci-jointe), tandis que 3 x 25 fragments ont été incubés respectivement dans 20 ml de "milieu de transport" contenant soit 0,1 pg d'adriamycine (ADM)/ml de milieu MEM (condition "ADM 0,1 pg/ml" de la figure ci-jointe), soit 1 pg ADM/ml MEM (condition "ADM 1 pg/ml"), soit 10 pg ADM/ml 20 MEM (condition "ADM 10 pg/ml). L'incubation en présence de 11 ADM fut d'une heure dans le cas présent. Les fragments tumoraux furent ensuite rinçés quatre fois dans le "milieu de transport".The tumor fragments are distributed in diver-10 its PETRI boxes (60 × 10 mm), each corresponding to an individual experimental condition. The attached figure shows the following hormonogram: 25 tumor fragments were incubated in 20 ml of "transport medium" only (control condition "Ct" in attached figure 15), while 3 x 25 fragments were respectively incubated in 20 ml of "transport medium" containing either 0.1 μg of adriamycin (ADM) / ml of MEM medium (condition "ADM 0.1 pg / ml" in the attached figure), or 1 pg ADM / ml MEM (condition "ADM 1 pg / ml"), ie 10 pg ADM / ml 20 MEM (condition "ADM 10 pg / ml). The incubation in the presence of 11 ADM was one hour in the The tumor fragments were then rinsed four times in the "transport medium".
Ensuite, les fragments tumoraux provenant d'une 2 5 même condition expérimentale furent alors répartis dans 5 boîtes de Petri 35 x 10 mm, contenant 2 ml de "milieu de transport", à raison de 5 fragments par boîte de Petri. Ces fragments tumoraux furent fixés pour l'histologie respectivement 2 heures, 1, 3, 5 et 7 jours après leur 30 mise en culture dans ces boîtes de Petri de 35 x 10 mm.Then, the tumor fragments originating from the same experimental condition were then distributed in 5 35 x 10 mm Petri dishes, containing 2 ml of "transport medium", at a rate of 5 fragments per Petri dish. These tumor fragments were fixed for histology respectively 2 hours, 1, 3, 5 and 7 days after their cultivation in these 35 x 10 mm Petri dishes.
5. Evaluation de la fraction cellulaire proliférante par autoradiographie.5. Evaluation of the proliferating cell fraction by autoradiography.
Les fragments sont fixés pour l’histologie pendant 24 heures, dans un liquide composé de 75 parties 35 d'éthanol 96°, de 20 parties de formol neutre (40%) et de 5 parties d'acide acétique pur. Les pièces sont ensuite déshydratées, enrobées à la paraffine, coupées à 4 pm d'épaisseur, déparaffinées et trempées dans de l'émulsion / 9 nucléaire liquide (Ilford K5).The fragments are fixed for histology for 24 hours, in a liquid composed of 75 parts of 96 ° ethanol, 20 parts of neutral formalin (40%) and 5 parts of pure acetic acid. The pieces are then dehydrated, coated with paraffin, cut to 4 μm thick, dewaxed and soaked in liquid nuclear emulsion / 9 (Ilford K5).
Ces lames histologiques sont exposées pendant 2 semaines puis révélées et fixées pour l'autoradiographie, légèrement contre-colorées à 1’hématoxyline et finalement 5 montées au DPX (BDH Chemicals).These histological slides are exposed for 2 weeks then revealed and fixed for autoradiography, slightly counter-stained with hematoxylin and finally 5 mounted with DPX (BDH Chemicals).
L'évaluation de la fraction cellulaire proliférante consiste à établir le pourcentage des cellules dont le noyau est marqué par la thymidine tritiée, c'est-à-dire le TLI (Thymidine Labeling Index) dans chacun des 5 frag-10 ments tumoraux correspondant à la même condition expérimentale. Ce pourcentage est établi sur 1000 cellules tumorales comptées par fragment.The evaluation of the proliferating cell fraction consists in establishing the percentage of cells whose nucleus is marked by tritiated thymidine, that is to say the TLI (Thymidine Labeling Index) in each of the 5 tumor fragments corresponding to the same experimental condition. This percentage is established on 1000 tumor cells counted per fragment.
Les résultats peuvent être par exemple présentés sous forme de moyenne de TLI + l'erreur standard sur la 15 moyenne (SEM). Le test F de Fischer (analyse de la variance à un critère) a été utilisé pour évaluer l'effet d'une drogue ou d'une hormone sur la fraction cellulaire proliférante de la tumeur étudiée.The results can for example be presented as an average of TLI + the standard error over the average (SEM). The Fischer F test (analysis of variance with one criterion) was used to assess the effect of a drug or hormone on the proliferating cell fraction of the tumor studied.
20 25 1 3520 25 1 35
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1997019189A1 (en) * | 1995-11-17 | 1997-05-29 | Medenica Rajko D | Flow cytometric pharmacosensitivity assay and method of cancer treatment |
EP1795897A1 (en) * | 2005-12-12 | 2007-06-13 | Université de Limoges | Predictive test of therapeutic response of breast cancer |
-
1986
- 1986-12-23 LU LU86721A patent/LU86721A1/en unknown
Cited By (3)
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EP1795897A1 (en) * | 2005-12-12 | 2007-06-13 | Université de Limoges | Predictive test of therapeutic response of breast cancer |
FR2894594A1 (en) * | 2005-12-12 | 2007-06-15 | Univ Limoges | PREDICTIVE TEST FOR THERAPEUTIC RESPONSE TO BREAST CANCER |
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