LU82946A1 - Procedes pour traiter la maladie de l'orme subereux antibiotique et antimycotique pour leur mise en oeuvre et procede pour leur preparation - Google Patents

Description

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La présente invention concerne le traitement de la maladie de l'orme subéreux.

La maladie de l'orme subéreux, causée par Ceratocystis ulmi (Buisman) 0. Moreau, a tué des 5 millions d'ormes américains depuis sa première apparition signalée aux Etats-Unis d'Amérique en 1950· kaperte économique due à la maladie de l'orme est évaluée à plusieurs milliards de dollars. Les stratégies recommandées pour la lutte contre cette maladie ont compris 10 la destruction des vecteurs par assainissement et par des pulvérisations d'insecticides, des traitements de la terre pour empêcher la transmission par greffage sur racine, des traitements protecteurs et thérapeutiques par des fongicides systémiques, une surveillance intensive 15 et un élagage d'éradication, et des variétés résistantes d'orme. Bien qu'un seul arbre intéressant puisse être protégé par une combinaison d'une ou plusieurs de ces stratégies au prix de plusieurs centaines de dollars par an, aucun procédé individuel de lutte n'a été 20 complètement efficace.

Jusqu'à une époque récente, la lutte biologique contre les maladies des plantes a été dirigée plus contre les maladies des racines que contre les maladies des parties aériennes des plantes, comme la 25 maladie de l'orme. Néanmoins, la lutte biologique contre Fornes annosus (Er.) Oke dans les souches de pin sylvestre au moyen d'une deuxième espèce de basidiomycètes, Peniophora gigantea (Fr.) Masse, est un exemple d'une lutte biologique très efficace concernant une partie 30 aérienne de plante. La lutte biologique contre la maladie de l'orme a été dirigée contre le vecteur, le grand scolyte de l'orme, et au stade saprophytique de C. ulmi.

Il est connu que certaines souches de 35 Pseudomonas syringae produisent des antibiotiques à large spectre qui sont efficaces contre un certain nombre de champignons et de bactéries pathogènes dans 2 des essais in vitro. Ce type de technique est illustré par le brevet des E.ÏÏ.A. N° 3 155 583 au nom de De Vay; J.E. De Vay et autres, Phytopathology, 58: 95-101 (1968); S.L. Sinden et autres, Physiol. Plant Pathol., 1: 199-5 213 (1971); D. Gross et J.E. De Vay, Proc. Amer.

Phytopathol. Soc. 3i 269-270 (1976); D.C. Gross et autres, J. Appl. Bact., 4-3 : 453-463 (1977); J.E* De Vay et G.A. Strobel, Phytopathology, 52 : 360 (1962); et D.C. Gross et J.E. De Vay, Phytopathology, 67 : 475-483 10 (1977)· Le brevet des E.ÏÏ.A. ïï° 3 155 585 indique aussi un effet in vivo dans certains arbres fruitiers de la matière antibiotique formée par P. syringae.

L'utilisation de nystatine, un agent antifongique, pour arrêter la maladie de l'orme subéreux 15 dans l'arbre est connue. Comme exemple de ce type dans la technique antérieure, on peut citer R. J. Campana,

Proc. Amer. Phytopathol. Soc.. 3? 266 (1976). De plus, il est connu que certaines souches de P. syringae exercent un effet antimycotique contre C. ulmi lors 20 d'essais in vitro. Ce type de technique antérieure est illustré par D.P. Myers, D.C. Sands et G.A. Strobel,

Proc. Amer. Phytopathol. Soc., 12: 202 (1978).

Toutefois, cette technique antérieure et l'autre, pour autant qu'on sache, ne fournissent pas 25 un procédé de traitement de la maladie de l'orme n'exigeant qu'un procédé unique de lutte. De plus, cette • technique antérieure ne fournit pas un procédé à un seul traitement pour le traitement de la maladie de l'orme, car un retraitement est nécessaire.

30 C'est donc un but de la présente inven tion de fournir un procédé pour le traitement de la maladie de l'orme subéreux n'exigeant qu'un seul mode de lutte, c'est-à-dire n'exigeant pas une combinaison de stratégies de lutte.

35 Un autre but de la présente invention est de fournir un procédé de traitement de la maladie de l'orme subéreux qui exige seulement un seul traitement, 5

A

Λ * c'est-à-dire qu'un retraitement n'est pas nécessaire.

D'autres "buts et avantages de l'invention résulteront encore de la description ci-après.

Pour atteindre les "buts et objectifs 5 ci-dessus, il est prévu par la présente invention un procédé pour traiter la maladie de l'orme subéreux.

Ce procédé comprend l'étape consistant à appliquer à un orme une quantité efficace contre la maladie de l'orme subéreux de P.syringae KRRL B-12050 ou de n'importe quel 10 microorganisme équivalent qui produit une substance antimycotique ou un antibiotique de poids moléculaire élevé qui est le même que celui produit et obtenu à partir de P. syringae KERL B-12050 comme expliqué ci-après.

15 La substance antimycotique est caracté risée comme étant la même que celle obtenue en faisant incuber P. syringae KRRL B-12050 à 25-28°C environ dans un bouillon dextrosé à la pomme de terre à 1,5-2,5% environ réglé à une concentration finale d'environ 0,5-20 3% de glucose, pendant deux à quatre jours environ, et en traitant le bouillon après l'incubation par un agent d'extraction de manière à isoler la substance ant imyc otique.

L'antibiotique est caractérisé comme 25 étant le même que celui obtenu en mettant à incuber P. syringae KRRL B-12050 à 25-28° C environ dans un bouillon dextrosé à la pomme de terre à 1,5-2,5% environ réglé à une concentration finale d'environ 0,5-3% de glucose, pendant deux à quatre jours environ; en mélan-30 géant un agent précipitant avec le bouillon inoculé en quantité suffisante pour faire précipiter à partir du bouillon des substances de poids moléculaire très élevé; en séparant le précipité et la phase liquide l'un de l'autre; en évaporant à sec la phase liquide, de 35 manière à laisser un résidu; en chromatographiant le résidu sur une colonne capable de séparer dans le volume vide d'éluat les substances ayant un poids 4 moléculaire d'au moins 1 800 environ des substances de poids moléculaire peu élevé; et en recueillant l'antibiotique à partir du volume vide d'éluat; les étapes pour l'obtention de l'antibiotique étant conduites à une tem-5 pérature inférieure à 50°0 environ.

La présente invention fournit aussi un procédé pour traiter la maladie de l'orme subéreux en utilisant soit la substance antimycotique soit l'antibiotique de poids moléculaire élevé. Enfin, elle concerne 10 un procédé pour obtenir l'antibiotique et l'antibiotique produit par ce procédé.

L'invention est décrite particulièrement ici à propos de P. syringae NERL B-12050.

Le procédé est mis.en oeuvre de préférence 15 en appliquant à un orme une quantité efficace contre la maladie de l'orme subéreux de P. syringae NEEL B-12050 ou d'un microorganisme équivalent. Pour les meilleurs résultats, l'application est effectuée de préférence tôt dans la période de végétation, spécialement quand la 20 sève est active. P. syringae NERL B-12050, un exemple de souche utile dans la présente invention, est un organisme fluorescent du genre Pseudomonas, négatif à l'oxydase, qui forme une substance antimycotique. Cette souche a été obtenue à partir de David Sands de 1'Univer-25 sité de l'Etat de Montana, E.U.A. et a été désignée par DC27+ dans la collection de cultures de l'Université de 1 l'Etat de Montana, Bozeman, Montana, E.U.A. Une culture de cette souche a été placée en dépôt permanent sans restriction avec la collection de cultures de la Northern 50 Utilization Kesearch and Development Division du

Department of Agriculture des E.U.A. et on lui a attribué le numéro NERL B-12050. Une culture a également été déposée auprès de la collection nationale de micro-organismes tenue par l'Institut Pasteur de Paris, 55 le 17 nov.1980 sous le N° d'enregistrement I - 142.

L'organisme P. syringae est maintenu ordinairement dans de l'eau distilléestérile et est isolable de nouveau à 28°C environ dans l'obscurité sur des plaques de gélose dextrosée à la pomme de terre (PDA) ou sur . le milieu B de E.O. King et autres dans 5 * J. Lab· Olin. Med., 44; 301-307 (195^-), la portion appropriée de cette publication étant incorporée par référence dans la présente description.

, L’organisme P. syringae est de préférence 5 appliqué à l'orme par injection, une quantité suffisante 8 ΛΛ des P. seringae étant de 10 à 10 cellules totales

Q Q

environ, ou de 10 à 10*7 cellules vivantes environ. Commodément, on injecte l'organisme P. seringae dans un véhicule aqueux contenant des substances nutri-10 tives comme des sels de Dye additionnés d'environ 1% de glucose. Les sels de Dye sont décrits par D.W. Dye dans N.Z.J.Sei., 6:495-506 0965), dont le contenu est ainsi incorporé par référence dans la présente description.

15 Une technique pour effectuer l'injection est une technique d'écoulement par gravité. Cette technique est utilisable dans des ormes assez petits. Dans cette technique, l'organisme P. syringae, commodément dans environ 1 litre de sels de Dye additionnés de 1% 20 de glucose, est injecté dans un orme en perçant quatre à six trous, de 11 mm de diamètre et 2,5 cm de profondeur, à la base de l'orme, en fixant dans ces trous un réseau de conduits souples en matière plastique relié à une bouteille de 1 litre en matière plastique contenant 25 le mélange de 1 litre et en plaçant la bouteille en matière plastique à environ 1 mètre au-dessus du sol. L'absorption est complète quand la bouteille est vide, une période de 12 à 36 heures environ étant suffisante. Une autre technique est l'injection sous pression. Cette 30 technique préférable pour des ormes assez grands. Une pression d'environ 0,7 bar est utilisable. Pour l'injection sous pression, on utilise 4 à 5 fois environ le nombre de cellules de P. syringae dans 60 litres d'eau contenant environ 4 litres de sels de Dye additionnés 35 de 1% de glucose. On injecte ce mélange dans l'orme par 20 à 30 tés, dans des renflements des racines à 20 cm au-dessous du sol. L'injection du volume de 60 litres i « 6 demande 24 heures, une pression plus forte exigeant un temps plus court et une pression plus faible exigeant un temps plus long. Une fois l'injection de la solution de 60 litres terminée, on "balaie l'arbre avec de l'eau pour 5 assurer une distribution suffisante des cellules bactériennes dans l'arbre. Une période d'environ 24 heures est suffisante pour cette étape de balayage.

On peut utiliser P. syringae de manière prophylactique ou thérapeutique pour traiter la maladie 10 de l'orme. Le traitement thérapeutique est décrit plus en détail ci-après.

La substance antimycotique de P. syringae UKRL B-12050 est produite selon le procédé décrit ci-après pour produire un antibiotique, de poids moléculaire 15 élevé des P. seringae. Dans un procédé moins préféré, le bouillon dextrosé à la pomme de terre contient environ 0,4% d'hydrolysat de caséine en plus du glucose.

On obtient une préparation brute de la substance antimycotique en mettant en contact le bouillon ayant subi 20 l'incubation avec un agent d'extraction tel que du n-butanol, conformément au procédé de D.C. Gross et J.E.

De Vay dans Physiol. Plant Pathol., 11: 13-28 (1977)* cette publication étant ainsi incorporée par référence dans la présente description. L'activité in vitro 25 contre C. ulmi du produit ainsi isolé est démontrée par la méthode décrite ci-après dans l'exemple 1, à ceci près qu'on dilue 5 microlitres de la préparation avec un volume égal d'eau et que la préparation diluée est déposée dans un puits (2 mm de diamètre x 6 mm de hauteur) 30 sur la plaque au lieu de l'inoculation de la plaque avec P. syringae.

On effectue le traitement de la maladie de l'orme subéreux par la substance antimycotique en injectant la substance dans un orme selon le mode opé-35 ratoire décrit ci-dessus, à ceci près que le véhicule aqueux ne contient pas les substances nutritives (sels de Dye et glucose). On injecte l'antimycotique à 7 raison d'une quantité efficace contre la maladie de l'orme. Un inconvénient avec ce procédé de traitement de la maladie est qu'un retraitement peut être nécessaire. Toutefois, en raison de l'efficacité de cette substance 5 antimycotique, la présente invention englobe tous P. syringae formant cette substance antimycotique, pour le traitement de la maladie de l'orme subéreux. La quantité de la substance antimycotique injectée dépend de facteurs tels que la taille de l'arbre.

10 La dialyse et la chromatographie sur couche mince (TLC) de la substance antimycotique formée par l'Isolat Comparatif 2 de P. syringae (voir les exemples) et de la substance antimycotique formée par P. syringae NRRL B-12050 montrent que ces deux substances 15 antimycotiques sont différentes. Spécifiquement, ces essais montrent la présence de trois composés dans la substance formée par P. syringae NRRL B-12050 et la présence de deux composés dans la substance formée par l'Isolat Comparatif 2 de P. syringae, le composé supplé-20 mentaire dans la première substance étant retenu par une membrane de dialyse, tandis que les autres composés passent à travers la membrane. Des essais in vitro d'un isolat brut de ce composé supplémentaire, généralement en utilisant le mode opératoire de l'exemple 1 ci-25 après, indiquent une activité contre C. ulmi, et ainsi que la substance est antifongique. Des essais in vitro d'un isolat brut des deux autres composés en combinaison, et d'un isolat brut de la matière formée par l'Isolat Comparatif 2 de P. syringae en combinaison, montrent aussi 50 l'activité contre C. ulmi.

Une comparaison de la chromatographie sur couche mince de la première substance et de la chromatographie sur couche mince de la substance antimycotique formée par la souche B-5 de P. seringae de De Yay montre 55 par les valeurs de que les constituants des substances sont complètement différents. Cette différence peut expliquer l'absence apparente de phototoxicité de P^ 8 syringae KEEL B-12050 dans l'orme, qui est clairement montrée par examen du cylindre de xylème dans l'expérience comparative de l'exemple 5> où il n'y a pas d'inoculation de C. ulmi.

5 P. syringae NERL B-12050 forme un anti biotique de poids moléculaire élevé. On produit l'antibiotique en mettant le micro-organisme en incubation à 25-28°C environ dans un bouillon dextrosé à la pomme de terre à 1,5-2,5% environ (Difco) réglé à une concen-10 tration finale d'environ 0,5-3% de glucose, pendant deux à quatre jours environ. De préférence, on utilise s* du bouillon dextrosé à la pomme de terre à 2% environ et environ 1% de glucose, et la durée d'incubation est d'environ trois jours à 27°C environ. Bien que le micro-15 organisme puisse être mis en incubation dans une culture en repos, il est préféré d'augmenter l’oxygène disponible en secouant la culture ou en l'oxygénant en utilisant un barboteur classique. Commodément, on secoue constamment la culture en utilisant un appareil classi-20 que. On favorise particulièrement la production d'antibiotique en incluant dans le bouillon environ 10 millimoles de chlorure ferrique et environ 2,5 grammes d'histidine par'litre. D'autres amino-acides tels que 1'ornithine qui stimulent la production d'antibiotique 25 peuvent être utilisés à la place de l'histidine. Ces amino-acides peuvent être inclus dans le véhicule aqueux quand on injecte les P. syringae. Une quantité utile de chlorure ferrique est comprise entre 5 et 20 millimoles environ et une quantité utile d'histidine est 30 comprise entre environ la moitié et'environ le double ou le triple de la quantité d'histidine qui vient d'être décrite.

L'antibiotique de poids moléculaire élevé est recueilli à partir du bouillon ayant subi l'incu-35 bation de la manière suivante. On mélange un agent précipitant avec le bouillon en quantité suffisante pour précipiter les substances de poids moléculaire très , 4 9 élevé. Par "poids moléculaire très élevé", on veut dire un poids moléculaire d’au moins 15 000-20 000 environ.

On utilise l’acétone de manière particulièrement avantageuse comme agent précipitant, deux volumes environ 5 d'acétone étant utilisables pour mélange avec environ un volume de bouillon. Le précipité et la phase liquide sont ensuite séparés l’un de l'autre par une technique classique comme par filtration, on se débarrasse du précipité, et la phase liquide est évaporée à sec, lais-10 sant un résidu. Dans les étapes de traitement, on maintient la température au-dessous de 50°C environ, de manière à assurer qu'il ne se produise pas de décomposition de l'antibiotique.

On chromatographie le résidu sur une 15 colonne capable de séparer, dans le volume vide d'éluat, les substances ayant un poids moléculaire d'au moins 1 800 environ des substances de poids moléculaire peu élevé. Par "poids moléculaire peu élevé", on veut dire un poids moléculaire de moins de 1 800 environ. La chro-20 matographie est effectuée commodément à la pression atmosphérique en utilisant un écoulement par gravité. On effectue avantageusement la chromatographie en utilisant comme éluant un solvant aqueux tel que de l'eau, et une colonne d'environ 90 cm x 1,5 cm garnie de perles 25 d'acrylamide telles que celles dites "Biogel" P-2, fournies par Biorad. On place le résidu sur la colonne après qu'il a été dissous dans une quantité minimale d'éluant, et l'antibiotique de poids moléculaire élevé est obtenu dans le volume vide d'éluat.

50 L'antibiotique est cristallin et est recueilli à partir de l'éluat sous la forme de cristaux par une technique classique. Commodément, on obtient les cristaux en laissant reposer l'éluat. L'analyse des cristaux montre que l'antibiotique est constitué d'amiho-55 acides. Ces amino-acides sont l'arginine, un amino-acide inconnu, l'acide aspartique, la thréonine, la sérine, la glutamine, la glycine, l'alanine, la * 10 * valine, la méthionine, 1'isoleucine, la leucine, la tyrosine et la phénylalanine. Les rapports molaires relatifs des amino-acides sont inconnus, mais d'après le travail chromatographique décrit ci-dessus, on sait que 5 l'antibiotique a un poids moléculaire compris entre 1 800 et 15 000-20 000 environ. Bien que l’antibiotique soit retenu durant 1'ultrafiltration par une membrane EM-10, qui a un seuil de coupure au poids moléculaire nominal de 10 000 et qui est disponible en provenance 10 d'Amicon, l'antibiotique peut avoir un poids moléculaire inférieur à 10 000 car l’affinité pour la membrane pourrait être responsable de la rétention. L'antibiotique n'entre pas dans un gel naturel à 15% de poly-acrylamide.

15 On vérifie la bioactivité des cristaux d'antibiotique en redissolvant les cristaux, en déposant des gouttes de la solution résultante sur une plaque de gélose et en appliquant ensuite par pulvérisation C. ulmi (essai par touches). En utilisant une technique 20 d'essai similaire, on trouve que le liquide surnageant restant après formation des cristaux est inactif.

L'antibiotique est soluble dans l'acétone, assez soluble dans l'eau, stable à la chaleur, sensible aux bases au-dessus d'un pH de 7,5 à 8 environ, 25 stable aux acides à un pH pas plus bas que 4 ou 5 environ, insensible à la protéinase K, et réfractaire à l'inactivation par la leusine aminopeptidase. On montre la stabilité à la chaleur en faisant bouillir pendant trois minutes et en effectuant ensuite l'essai par touches.

50 L'effet d'une base est montré par un traitement par l'hydroxyde de sodium 1 N suivi d'une neutralisation et de l'essai par touches. L'insensibilité à la protéinase K est montré par un traitement de JO minutes suivi de l'essai par touches. On montre d'une manière similaire que 55 l'antibiotique est réfractaire à l'inactivation par la leucine aminopeptidase.

11

La production de l'antibiotique est stimulée par l'addition d'histidine ou d'ornithine. Cela a été montre dans du milieu de Dye contenant environ 1% de glucose. La production est ralentie par l'addition de 5 glutamate ou d'asparagine, ou par l'addition de casamino-acides. Cela a été trouvé aussi en utilisant le milieu de Dye. L'addition d'environ 10 ppm de chlorure ferrique remédie au ralentissement causé par les casamino-acides. L'antibiotique a été isolé de manière reproductible à 10 partir de bouillon de culture en utilisant le mode opératoire décrit plus haut, et à partir de milieu de Dye auquel on avait ajouté de l'histidine et du chlorure ferrique, mais il n'a pas été isolé de manière reproductible à partir de milieu de Dye auquel on avait ajouté 15 des casamino-acides et du chlorure ferrique, ni à partir de milieu de Dye auquel on avait ajouté seulement de l'histidine.

Le traitement de la maladie de l'orme subéreux par l'antibiotique de poids moléculaire élevé 20 peut être effectué en injectant l'antibiotique dans l'orme en utilisant le mode opératoire décrit ci-dessus pour le micro-organisme, à ceci près qu'il n'est pas nécessaire que le véhicule aqueux contienne des substances nutritives (sels de Dye et glucose). Un retrai-25 tement peut être nécessaire avec ce procédé, et ainsi ce procédé est moins préféré qu'un procédé utilisant une source appropriée de P. syringae. On injecte l'antibiotique en quantité suffisante pour lutter efficacement contre la maladie de l'orme. Comme c'est cette matière 50 qui apparaît clairement comme permettant à P. syringae NBEL B-I205O de lutter efficacement contre la maladie de l'orme, la présente invention englobe l'utilisation de tous P. syringae formant cet antibiotique de poids moléculaire élevé, pour le traitement de la maladie 55 de l'orme subéreux. De plus, comme en utilisant des techniques de recombinaison d'ADN on peut préparer des micro-organismes autres que des P. syringae qui produiront 12 cet antibiotique de poids moléculaire élevé, ces microorganismes produits génétiquement sont équivalents à cette souche de P. syringae pour les buts de la présente invention. L'antibiotique de poids moléculaire élevé est 5 un composant de la substance antimycotique dont il a été question ci-dessus.

Les exemples ci-après illustrent le procédé selon la présente invention et illustrent le caractère imprévisible de la présente découverte d'un 10 type de P. syringae qui est utile contre la maladie de l'orme subéreux. Compte tenu des travaux de De Vay, par exemple du brevet des E.U.A. N° 3 155 585» la probabilité existait que toute souche de P. syringae se révélant efficace contre la maladie de l'orme subéreux 15 serait phytotoxique. La présente invention fournit un procédé très avantageux pour traiter la maladie de l'orme subéreux car les P. syringae sont capables de vivre dans l'orme. Ainsi, un procédé à un seul traitement est rendu possible, puisque le micro-organisme est 20 viable dans l'arbre et fournit un effet efficace contre la maladie de l'orme durant la période de viabilité. EXEMPLE 1 P. syringae NERL B-12050, une bactérie formant une substance antimycotique, est essayée selon le 25 mode opératoire suivant en ce qui concerne l’activité in vitro contre un isolat UÏ-5E de C. ulmi, provenant de N.K. Yan Alfen de l'Université de l'Etat d'Utah, E.U.A.

Un échantillon de 5 microlitres de P. syringae est prélevé dans une culture liquide contenant environ O 3: 30 1 x 10° unités de formation de colonies par car et est déposé aseptiquement par inoculation à la boucle de platine sur de la gélose glucosée de Dye (DGA). Le milieu de formation de plaques de DGA est un milieu aux sels minéraux modifié dans lequel la source de 35 carbone est constituée par 1% de glucose et dans lequel on utilise de la gélose Noble (1,2%) (Difco). La plaque inoculée est mise à incuber à 28°C dans l'obscurité » 13 pendant 27 heures. On pulvérise ensuite sur la surface de la plaque, en utilisant une pulvérisation de 3 secondes, une suspension aqueuse de 0. ulmi ayant une con-centration de 5 x 10 spores/cm . On utilise un pulvéri-5 sateur à gaz propulseur et on maintient le pulvérisateur à environ 30 mm de la plaque. Après que la plaque ayant reçu la pulvérisation a été mise en incubation à la température ambiante pendant 2 jours, l'activité de P. syringae contre T. ulmi est déterminée par la sur-10 face de la zone claire d'inhibition entourant la colonie de P« syringae. La surface de la zone claire d'inhibi-tion est de 216 mm pour cette souche de P. syringae. EXEMPLE 2 :

Selon le mode opératoire de l'exemple 1, ^ à ceci près qu'on utilise une plaque de gélose dextrosée à la pomme de terre (PDA) au lieu du milieu de formation de plaques DGA, on trouve qu'il y a une zone d'inhibi- p tion claire ayant une surface de 204 mm .

EXEMPLE COMPARATIF 1 20 Selon le mode opératoire de l'exemple 1, à ceci près qu'on utilise l'Isolat Comparatif 1 de P.

syringae au lieu de P. syringae NEEL B-12050, on obtient 2 une zone claire d'inhibition ayant une surface de O m . Cette souche de P. syringae est désignée par DC 27-25 dans la collection de l'Université de l'Etat de Montana, E.U.A. et diffère de P. syringae NEEL B-12050 seulement en ce qu'elle ne forme pas du tout de substance antimycotique.

EXEMPLE COMPARATIF 2 30 Selon le mode opératoire de l'exemple 1, à ceci près qu'on utilise l'Isolat Comparatif 2 de P.

syringae au lieu de P. syringae NEEL B-12050, on obtient une zone claire d'inhibition ayant une surface 2 de 452 mm . Cette souche de P. syringae est désignée par 35 DC323+ dans la collection de l'Université de l'Etat du Montana et forme une substance antimycotique.

14 EXEMPLE 5 :

On détermine l'activité in vitro de P. syringae NRRL B-12050 contre C. ulmi UT-5E sur un milieu contenant de l'extrait de bois d'orme en suivant 5 le mode opératoire décrit dans l'exemple 1, à ceci près que le milieu contenant l'extrait de bois d'orme est utilisé à la place du milieu de formation de plaques DGA. Le milieu contenant l'extrait est préparé comme suit. On récolte des brindilles d'orme provenant de 10 la végétation de l'année en cours d'ormes adultes, on excise les feuilles et on coupe les brindilles en tronçons de 2 à 5 cm. On homogénéise les tronçons de brindilles avec un "omni-Mixer" (Sorvall) pendant 2 minutes dans de l'eau distillée dans la proportion de 15 1 partie de brindilles (poids frais en grammes) pour 5 parties d'eau (en cm^). On filtre l'extrait à travers deux couches de gaze et on le centrifuge à 4°0 pendant 20 minutes à 4 000 g. On se débarrasse des sédiments. On stérilise le liquide surnageant /"11,5 mg (poids à sec)/ 20 cm^_7, on le dilue avec de l'eau distillée à 4,0, 6,0, 12,5, 20,0 et 100% (vol/vol) et on l'incorpore dans de la gélose (Sigma, 1,5%), pH 7,1· Les résultats sont présentés dans le Tableau 1. La production d'antimycotique est calculée dans ce tableau et dans le tableau 2 25 en utilisant l'équation « a + b Log x, où j est la ο surface de la zone d'inhibition (mm ), x est la concentration d'antimycotique (mg/cm^ , et a et b sont des constantes dont les valeurs dépendent en partie du type et de l'épaisseur de la gélose.

5° EXEMPLE COMPARATIF 5 :

Selon le mode opératoire de l'Exemple 5, à ceci près qu'on utilise l'Isolat Comparatif 2 de P. syringae au lieu de P. syringae NRRL B-12050, on obtient les résultats présentés dans le tableau 1.

15 TABLEAU 1

Activité contre C.ulmi sur un milieu contenant de l'extrait de bois d'orme (unités)* 5 Dilution de l'extrait initial de bois d ' orme

Isolat de P. syringae J J ^5 W TÖÖ UREL-B-12050 7,1 7,1 0 0,8 0 * Isolat comparatif 2 19,6 5,1 5,1 7,1 0 10 *Une unité d'activité antimycotique est définie comme la quantité d'antimycotique qui produit une zone d'inhibi-tion de 1 mm dans une détermination biologique contre C. ulmi (UT-5F)· TABLEAU 2 15 Activité contre C.ulmi sur un milieu contenant de la sève H'orme exprimée (unités)

Concentration, %_

Isolat de P. syringae 0 0,01 ^ 0,05 0,1 1,0 20 UERL-B-12050 0 0,8 0,8 5,1 3,1

Isolat Comparatif 2 0,2 4,9 15,9 9,6 4,9 î* La concentration de sève qui se rapproche le plus de sa concentration dans l'orme.

\ 16 * * EXEMPLE 4 : L'activité in vitro de P. syringae NBHL B-12050 contre O.ulmi sur un milieu contenant de la sève de cellules exprimée est déterminée selon le mode 5 opératoire décrit dans l'exemple 1, à ceci près qu'on utilise un milieu contenant de la sève exprimée au lieu du milieu de formation de plaques de DGA. Le milieu contenant de la sève d'orme exprimée est préparé en exprimant la sève de petits morceaux coupés de végéta- % 10 tion récente d'ormes adultes au moyen d'un dispositif dénommé "water plant status console" (modèle 3005, Soilmoisture Equipment Corp.). Une quantité de liquide passant à travers les tiges égale au volume de tige est recueillie avec une lecture des instruments de 5 à 10 15 bars, est concentrée à un coefficient 10 environ par évaporation par détente à 35°0, est séchée par congélation et la poudre résultante est séchée sur du Pg0^.

Cette poudre est ensuite incorporée dans un milieu solide (1,2% de gélose Noble, Difco) à 0,01, 0,05, 0,1 et 20 1,0% (poids/volume). Les résultats sont présentés dans le Tableau 2. Ces résultats et ceux du Tableau 1 montrent que l'extrait de bois d'orme et la sève de xylème exprimée entretiennent le développement de P. syringae KERL B-I205O.

25 EXEMPLE COMPARATIF 4 :

Selon le mode opératoire de l'Exemple 4, à ceci près qu'on utilise l'Isolat 2 de P. syringae au lieu de P. syringae NRRL B-12050, on obtient les résultats présentés dans le Tableau 2.

30 EXEMPLE 5 : (A) L'efficacité de P, syringae KKRL B-12050 comme agent de protection contre la maladie de l'orme subéreux est étudiée dans une serre en utilisant de jeunes ormes ayant une hauteur de 1,5 à 2,0 m environ.

35 Dans chacun de 8 arbres, on injecte au milieu du

Q

printemps par écoulement par gravité 5 x 10° cellules de P« syringae par cm^, dans 60 cm^ d'eau distillée « 17 contenant 1% en poids/volume de glucose. On effectue l'injection en laissant couler la suspension de cellules 3 à partir d'une boîte en matière plastique de 60 cm renversée suspendue à environ 1 mètre au-dessus du ni-5 veau de la terre dans le pot et contenant la suspension de cellules, dans un trou (0,44 cm de diamètre) percé dans un entre-noeud de l'arbre à environ 20 cm au-dessus du sol. On effectue la jonction entre l'arbre et la bouteille en introduisant dans le trou un raccord en 10 matière plastique pour tubes qui est collé à l'arbre avec un adhésif au caoutchouc de silicone et en introduisant une extrémité d'un tube en caoutchouc (3 mm de diamètre intérieur) dans ce raccord et l'autre extrémité dans un raccord en matière plastique pour tubes 15 fixé sur la bouteille. Deux semaines après l'injection de P. syringae, on soumet chaque arbre à une attaque massive par 1 cm d'une suspension d'un isolat de C. ulmi (10^ spores/cm^). Pour l'injection de C. ulmi, une surface rectangulaire d'écorce (5-^0 x 20-25 mm) à environ 20 10 cm au-dessus de l'endroit où on a inoculé P.syringae est coupée sur trois côtés, on replie le rectangle d'écorce résultant pour mettre à nu le xylème et on arrose avec les C. ulmi le xylème exposé. Ensuite, on remet en place le rectangle d'écorce, et on enveloppe 25 le site d'inoculation au moyen d'un ruban adhésif de masquage et ensuite d'une feuille d'aluminium pour - réduire la dessication.

Huit à dix semaines après l'inoculation de C. ulmi, on examine chaque arbre en ce qui concerne 30 les symptômes de maladie, y compris le flétrissement et l'altération de couleur vasculaire, cette dernière étant déterminée par le pourcentage de la longueur du xylème de la tige ayant une couleur altérée. Les résultats sont présentés dans le Tableau 3· 35 (B) A titre d'expérience comparative, on suit le mode opératoire ci-dessus pour 11 autres ormes, à ceci près qu'on injecte seulement C. ulmi. On utilise ¥ 18 \ l'altération de couleur du xylème comme évaluation du développement pathogène car elle se produit dans 100% de ces arbres inoculés et est étroitement associée à l’importance du développement pathogène dans la maladie 5 de l’orme subéreux. Les résultats sont présentés dans le Tableau 3· TABLEAU 5

Traitement Nombre % moyen d'altération Nombre d'arbres d'ar- de la couleur (ar- présentant un 10 bres bres individuels)+ flétrissement ou jaunisse- __________ment _ P.syringae 8 2X 0 NÉELB-T205O (0,0,0,0,0,3, 15 et C.ulmi 4,6)

Isolat Compa- 14 4ly 7 ratif 1 de (0,0,2,8,10, P. syringae 11,58,30*56, et C.ulmi 51,82,83,86,89) 20 Isolat Compa- 11 21x 1 ratif 2 de (0,9,3,7,^0,13, P.syringae 14,25,27,30,100) et C.ulmi'"

Isolat compa- 10 67y 2 25 ratif 3 de (8,29,36,41,67, P.syringae 91,100,100,100 et C.ulmi 100) P.syringae 6 0X 0 NEBL B-I2050 (0,0,0,0,0,0) 30 Isolat compa- 5 10x 0 (3,8,12,13,7) P.syringae v ’ C.ulmi 11 54y 8 (comparaison) (7,9,23,45,47, 35 60,60,67,74,100, 100)_ +Les valeurs suivies de la même lettre ne sont pas notablement différentes (P = 0,05) conformément à l'essai Newman-Keuls.

« « iq ✓ (G) Gomme expérience comparative supplémentaire, le mode opératoire ci-dessus utilisé pour P. syringae RRBL B-12050 est utilisé aussi pour six autres ormes, à ceci près que l'injection de P.

5 syringae n'est pas suivie de 1*attaque par C.ulmi.

Le Tableau 3 indique les résultats. L'absence d'altération de couleur montre que cette souche n'est pas phytotoxique.

EXEMPLE COMPARATIF 5 10 (A) Selon le mode opératoire de l'exemple 5(A), à ceci près qu'on utilise l’Isolat Comparatif 1 de P» syringae au lieu de P. syringae NREL B-12050 et qu'on utilise 14· ormes de plus, on obtient les résul tats présentés dans le Tableau 3· L'Isolat Comparatif 15 1 de P.syringae diffère de P,syringae HKRL B-12050 seu lement en ce qu'il ne forme pas une substance antimycotique.

(B) Selon le mode opératoire de l'exemple 5(A), à ceci près qu'on utilise l'Isolat Comparatif 2 20 de P. syringae au lieu de P. syringae NERL B-12050 et qu'on utilise 11 ormes de plus, on obtient les résul tats présentés dans le Tableau 3. On utilise des cellules provenant de cultures de deux jours de cet isolat.

A titre d'expérience comparative, le 25 mode opératoire décrit dans le paragraphe ci-dessus est suivi pour cinq autres ormes, à ceci près que les ormes ne sont pas attaqués par C. ulmi. La présence de 10% d'altération moyenne de couleur du xylème suggère que cette souche de P. syringae est phytotoxique. 30 Au contraire, comme montré par l'exemple 5(C), P.

syringae NRRL B-12050 n'est pas phototoxique. L'absence apparente de phytotoxicité pour cette souche est inattendue compte tenu des travaux antérieurs de De Vay, par exemple du brevet des E.U.A. N° 3 155 585. Il y 35 est dit que plus un isolat de P. syringae est virulent ou phytotoxique, plus il est antibiotique ou antifongique. Ainsi, il existait la probabilité· que même 20 si on pouvait trouver une souche de P. syringae utile pour traiter la maladie de l'orme, cette souche serait phytotoxique et en conséquence ne serait pas utile. Contrairement à ces prévisions de la technique anté-5 rieure, les présents résultats indiquent un type de P. syringae dans lequel l'activité antifongique et l'efficacité dans le traitement de la maladie de l'orme subéreux ne sont pas en relation avec la phytoxicité.

(C) Selon le mode opératoire de » Ί0 l'Exemple 5(A), a ceci près qu'on utilise l'Isolat

Comparatif 3 de P. syringae au lieu de P.syringae NERL B-12050 et qu'on utilise 10 autres ormes, on obtient les résultats présentés dans le Tableau 3· On utilise dans ce traitement des cellules provenant de 13 cultures de deux jours de cet isolat. L'Isolat Comparatif 3 diffère de l'Isolat Comparatif 2 seulement en ce qu'il ne forme pas une substance antimycotique.

Pour déterminer le développement relatif de P. syringae NERL B-12050, de l'Isolat Comparatif 2 20 de P. syringae et de C.ulmi dans les arbres de l'exemple 3 et de l'exemple comparatif 3» on coupe chaque tronc d'arbre en morceaux de 2-3 cm, on les coupe longitudinalement en deux et on enlève l'écorce. On inocule un morceau sur un milieu sélectif pour 25 P. syringae et l'autre morceau sur un milieu sélectif pour C.ulmi. Le xylème de tous les arbres traités par l'Isolat Comparatif 2 de P. syringae présente une altération de la couleur au point d'injection jusqu'à 10 cm à partir de cet entre-noeud. On n'observe 30 aucun symptôme de phytotoxicité sur les feuilles, les pétioles ou les troncs des arbres traités par l'une ou 1'autre souche de P, syringae. On isole P, syringae à partir du dessous de l'écorce de 90% des sites d'injection de P. syringae NERL B-12030. L'Isolat 35 Comparatif 2 de P. syringae se déplace d'une moyenne de 21 cm (intervalle 0-64) à partir du point d'injection, et P. syringae NERL B-12050 se déplace d'une 21 moyenne de 8 cm (intervalle 0-12) à partir du point d'injection.

Comme on peut le voir d'après ces résultats, l'injection effectuée dans les ormes au début 5 de la deuxième période de végétation (milieu du printemps) de P. syringae îfEKL B-12050 ou d'Isolat Comparatif 2 de P. syringae supprime dans une large mesure l'altération de couleur vasculaire due à C.ulmi, par rapport à des arbres dans lesquels on a injecté des 10 isolats ne produisant pas d'antimycotiques ou dans lesquels on a injecté C.ulmi seulement.

Des expériences supplémentaires sur des ormes en serre montrent que l'application de P. syringae aux ormes à la fin de la deuxième période de végéta-15 tion (milieu de l'été) ne les protège pas contre la maladie de 1'orme.

EXEMPLE 6 :

On effectue une étude limitée de l'efficacité de P.syringae KREL B-12050 comme agent protecteur 20 contre la maladie de l'orme sur de jeunes ormes de 6 m de hauteur et de 7-10 cm de diamètre, dans une parcelle de terrain située près de Washington D.C., E.U.A. A la fin du printemps, on inocule à un arbre sur trois dans la parcelle, par écoulement par gravité, environ 11 25 10 cellules de P. syringae dans 1 litre de sels de

Dye contenant en outre 1% de glucose. On effectue > l'inoculation en perçant quatre à six trous de 11 mm de diamètre et de 2,5 cm de profondeur dans la base de chaque arbre et en introduisant dans les trous un 50 réseau de tuyaux souples en matière plastique reliés à une bouteille en matière plastique d'une capacité de 1 litre placée à 1 m au-dessus du sol et contenant la suspension de cellules. L'inoculation est complète en 12 à 36 heures. Environ deux semaines plus tard, 35 chaque arbre est attaqué massivement par un mélange de deux isolats agressifs de C.ulmi (UT-5E et un isolat provenant de Washington, D.C.) en arrosant 4 à 8 blessu- 22 res faites au ciseau dans les "branches principales de chaque arbre avec 5 x 104 spores de C.ulmi et en recouvrant ensuite les "blessures d’un ruban adhésif en matière plastique transparente. A la fin de la deuxième 5 période de végétation, on examine chaque arbre en ce qui concerne les symptômes de maladie et on note le pourcentage de la cime notablement affecté par la maladie de l’orme. Sur les trois arbres, on trouve qu'un est exempt de symptômes et que les deux autres 10 sont morts. On répète cette expérience avec deux autres arbres et à la fin de la période de végétation l’année suivante, on trouve qu'un arbre présente 1% de symptômes de cime et que l'autre est mort.

A titre d’expérience comparative, on 15 répète le mode opératoire ci-dessus sur plusieurs arbres, à ceci près qu'on injecte seulement C.ulmi.

On trouve que tous les arbres soumis à cette expérience comparative présentent des symptômes de la maladie de l'orme et meurent.

20 On répète le mode opératoire décrit dans le premier paragraphe de cet exemple, à ceci près qu'on effectue l'inoculation de P. syringae au milieu de l'été. On injecte le champignon au début de septembre. On observe sur chaque arbre le 25 développement de la maladie de l'orme l'année suivante et il meurt. On essaie une expérimentation en utilisant une injection sous pression de 2,1 kg/cm au lieu de l'écoulement par gravité, mais on trouve qu'elle est inefficace aussi pour conférer une protection aux 30 ormes.

EXEMPLE COMPARATIF 6 :

En répétant le mode opératoire de l'exemple 6 (utilisant une injection à la fin du printemps), à ceci près qu'on utilise l'Isolat Comparatif 2 de 35 P. syringae au lieu de P. syringae NERL B-12050, et en utilisant quatre autres ormes dans la parcelle, l'observation à la fin de la deuxième période de végé- 23 tation montre que les trois arbres sont morts. On répète cette expérience avec cinq autres arbres et, à la fin de la période de végétation un an plus tard, deux arbres ne présentent pas de symptômes et les trois autres 5 sont morts. L'examen du bois du xylème au-dessous de l'écorce des arbres vivants montre une altération de couleur importante et ainsi un développement de C.ulmi.

Il est donc à prévoir que ces trois arbres succomberont aussi à la maladie de l'orme subéreux l'année suivante.

‘ 10 EXEMPLE 7 î

On essaie l'effet thérapeutique de P.syringae RRRL B-12050 contre la maladie de l'orme subéreux dans les champs comme suit. Vingt ormes à Sioux Falls,

Dakota du Sud, de 36-77 cm de diamètre (1,5 m) et deux 15 ormes à Missoula, Montana, présentant des symptômes d'infection naturelle de la maladie de l'orme subéreux, 11 sont soumis chacun à l'inoculation d'environ 5 x 10 cellules de P.syringae dans 60 litres d'eau contenant quatre litres de sels de Dye et contenant en outre 1% de 20 glucose. On vérifie que chaque arbre est atteint de la maladie de l'orme par culture de C.ulmi sur le milieu sélectif de R.V. Miller et autres, Plant Disease (1980) ou par une réaction immuno-chimique positive. L'exécution d'essais de ce dernier type est décrite par J. Dordin 25 et autres dans Plant Physiology (1980). L'inoculation est effectuée par 20 à 30 tés reliés à un réseau de * tuyaux flexibles et introduits dans les renflements des racines 20 cm au-dessous du sol, l'injection étant effectuée à 0,7 bar pendant 24 heures, chaque arbre 30 étant soumis ensuite à un balayage à l'eau pendant 24 heures pour assurer une distribution suffisante des bactéries dans l'arbre. On soumet un total de 22 arbres à l'injection et on évalue chaque arbre en ce qui concerne l'importance des symptômes de cime par des 35 estimations effectuées d'après des diagrammes en grille ou d'après des photographies de chaque arbre. Les estimations sont effectuées au moment du traitement 24 et au début et à la fin de la deuxième période de végé-tation. Les branches mortes apparaissant sur les arbres à la fin de la première période de végétation ne sont pas enlevées. Les résultats sont présentés dans le 5 Tableau 4.

Des arbres des mêmes dimensions relatives qui présentent à peu près le même degré de sévérité de la maladie sont utilisés comme témoins. Les résultats pour les témoins sont indiqués dans le Tableau 4.

- 10 Les résultats du Tableau 4 montrent que le traitement doit être effectué dans la partie initiale de la période de végétation et que la eine doit être saine à au moins 90% environ quand on commence le traitement- Six arbres sur sept traités dans la partie 15 initiale de la période de végétation et ayant au moins 90% de la cime apparemment dans un état sain ne présentent pas d'aggravation de la maladie à la fin de la deuxième période de végétation; tandis que seulement un sur neuf des arbres pris comme témoins, trai-20 tés durant la même période et ayant au moins 90% de la cime apparemment dans un état sain se révèle avoir résisté à une propagation supplémentaire de la maladie.

Les résultats obtenus en serre et ceux obtenus dans un champ à Washington, D.C., en utilisant 25 P. syringae d'une manière prophylactique, montrent qu’il est préférable d’injecter P. syringae tôt dans la , période de végétation, comme au milieu du printemps.

Le moment optimal est celui où la sève monte dans l'arbre et où se produit le maximum de transpiration 30 précoce. Ainsi, dans la mise en oeuvre de la présente invention, le traitement doit être effectué tôt dans la période de végétation, pour le micro-organisme ou pour le constituant actif produit par le micro-organisme.

TABLEAU 4 25

Traitement thérapeutique d'ormes malades dans les champs*

Arbre Date Proportion Proportion Proportion de _ de cime ap- de cime de cjLme restant 5 trai- paremment apparemment % η . -, tement saine au saine au dé- seconde ério_ début de but de la de (1 g tem_

l'essai seconde pe~ -u. < 0/ F

% riode (20 Dre; /o 10 . Mai) %

Trait é-1 6/14 90 90 90 1 Témoin-1 90 0 0

Traité-2 6/19 70 0 0 Témoin-2 80 0 0 15 Traité-3 6/21 80 60 0 Témoin-5 70 0 0

Traité-4 6/21 90 90 85 Témoin-4 80 0 0

Traité-5 6/22 80 0 0 20 Témoin-5 90 10 0

Traité-6 6/25 90 50 0 Témoin-6 90 40 0

Traité-7 6/29 80 50 0 Témoin-7 80 30 0 25 Traité-8 6/29 95 95 95 Témoin-8 90 10 0

Traité-9 7/2 .70 0 0 Témoin-9 90 0 0

Traité-10 7/2 80 80 60 30 Témoin-10 90 10 0

Traité-11 7/5 95 95 95 Témoin-11 95 95 95

Trait é-12 7/9 90 80 40 Témoin-12 80 50 0 35 Traité-13 7/9 80 50 0 Témoin-13 80 0 0

Traité-14 7/10 90 70 0 Témoin-14 80 20 0

Trait é-15 7/11 80 50 0 40 Témoin-15 80 50 0

Traité-16 7/16 90 90 0 Témoin-16 90 80 0 26 TABLEAU 4 (suite)

Arbre Date Proportion Proportion Pronortion de de cime ap- de cime de ~ime restant trai- paremment apparemment à la fin de la 5 tement saine au saine au de- ΗΡρηγ^Ρ «**,.,· début de but de la, ^°B_ l'essai seconde pe- , ^ 0/ % riode (20 Dre; /o

Mai ) % 10 Traité-17 7/18 80 0 0 Témoin-17 80 80 0

Traité-18 7/19 90 0 0 Témoin-18 80 0 0

Traité-19 7/20 80 80 0 15 Témoin-19 90 80 0

Traité-20 7/24 90 90 0 Témoin-20 80 10 0 +Traité-21 8/2 90 90 90 +Témoin-21 90 80 50 +Traité-22 8/2 90 90 90 20 +Témoin-22 90 ‘ 80 40 ♦Les moyens de traitement .et les groupes de témoins lors de la deuxiemé lecturé et de la lecture finale étaient notablement différents au niveau de 1%.

+Ces arbres sont situés à Missoula, MT. Ces arbres sont en retard de trois semaines environ, en végétation et ^ développement,· par rapport à ceux de Sioux Palls, SD.

Dans tous les arbres traités par P. syringae, sauf un, les pseudomonades fluorescents producteurs d'antimycotique sont recueillis facilement à partir de trous percés dans le tronc durant le prin-30 temps de la seconde saison et à partir de branches prélevées à au moins trois endroits différents dans les cimes d'arbres qui survivent à deux périodes de végétation. Cela montre la capacité des P. syringae de vivre dans l'arbre et de survivre durant l'hiver. On 35 ne récupère pas de P. syringae à partir des cimes d'arbres traités qui succombent à la maladie de l'orme subéreux.

27 EXEMPLE 8 : L'antibiotique de poids moléculaire élevé de P. syringae HERL B-12050 est produit par incubation du micro-organisme à 2?°G pendant trois jours dans un 5 bouillon dextrosé à la pomme de terre à 2% contenant 1% de glucose ainsi que 10 millimoles de chlorure ferrique et 2,33 grammes d'histidine par litre. La culture est secouée constamment durant l'incubation. On recueille l'antibiotique de poids moléculaire élevé à partir 10 du bouillon en ajoutant deux vol-urnes d'acétone à un volume du bouillon, en séparant le précipité et la phase liquide l'un de l'autre par filtration, en évaporant le filtrat et en soumettant le résidu à une chromatographie sur colonne. On effectue la chromatographie 15 à la pression atmosphérique en utilisant un écoulement par gravité. On conduit ces étapes de traitement à une température inférieure à 50°C environ pour être certain qu'il ne se produise pas de décomposition de 1'antibiotique.

20 On effectue la chromatographie en utili sant de l'eau comme éluant, et une colonne de 90 cm x 1,5 cm garnie de perles de Biogel P-2, disponibles en provënance de Biorad. On place le résidu sur la colonne après l'avoir dissous dans une quantité 25 minimale d'eau et l'antibiotique de poids moléculaire élevé est obtenu dans le volume vide de l'éluat.

= On abandonne l'éluat toute une nuit pour obtenir des cristaux de l'antibiotique de poids moléculaire élevé. L'analyse des cristaux indique que l'an-30 tibiotique est constitué d'amino-acides. Des informations concernant cet antibiotique sont données ci-dessus dans la description précédant les exemples. EXEMPLE 9 ï

On obtient la substance antimycotique 35 de P. syringae NRRL B-12050 en faisant incuber les P. syringae dans un bouillon dextrosé à la pomme de terre (Difco) contenant 0,4-% d'hydrolysat de caséine 28 (Sigma) et réglé à une concentration finale de 1,5% de glucose. On effectue l'incubation à 2?°C pendant trois jours dans une culture sans agitation. Un litre de la suspension de cellules ayant subi l'incubation est 5 soumis à une extraction au n-butanol, on élimine le n-butanol par évaporation et on dissout le résidu dans 5-10 cnr d'eau. On injecte le mélangé aqueux résultant dans une branche (1-1,5 cm de diamètre) d'un orme. Ensuite, on soumet la branche à une attaque de C.ulmi.

10 On observe que la branche est exempte de symptômes de la maladie de l'orme environ un an plus tard.

On utilise la présente invention pour lutter contre la maladie de l'orme subéreux.

Claims (20)

1. 29
2. 1. Un procédé pour traiter la maladie de l'orme subéreux, caractérisé en ce qu'on applique à un orme une souche de F. syringae formant un antibioti-5 que de poids moléculaire élevé, en quantité efficace contre la maladie de l'orme subéreux; cet antibiotique étant le même que celui obtenu en faisant incuber P. syringae NRRL B-12050 à 25-28°C environ dans un bouillon dextrosé à la pomme de terre à 1,5-2,5% environ 10 réglé à une concentration finale d'environ 0,5-5% de glucose, pendant deux à quatre jours environ; en mélangeant un agent précipitant avec le bouillon inoculé en quantité suffisante pour faire précipiter à partir du bouillon des substances de poids moléculaire très 15 élevé; en séparant le précipité et la phase liquide l'un de l'autre; en évaporant à sec la phase liquide, de manière à laisser un résidu; en chromatographiant le résidu sur une colonne capable de séparer dans le volume vide d'éluat les substances ayant un poids molé-20 culaire d'au moins 1 800 environ des substances de poids moléculaire peu élevé; et en recueillant l'antibiotique à partir du volume vide de l'éluat; les étapes pour l'obtention de l'antibiotique étant conduites à une température inférieure à 50°C environ.
3. 2. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la souche formant un antibiotique de poids moléculaire élevé est une souche de P.syringae formant une substance antimycotique; cette substance antimycotique étant la même que celle obtenue en faisant JO incuber P. syringae NRRL B-12050 à 25-28°C environ dans un bouillon dextrosé à la pomme de terre à 1,5-2,5% environ réglé à une concentration finale d'environ 0,5-3% de glucose, pendant deux à quatre jours environ, et en traitant lfe bouillon après l'incubation par un 35 agent d'extraction de manière à isoler la substance antimycotique. 30
4. 3. Un procédé pour traiter la maladie de l'orme subéreux, caractérisé en ce qu'on applique à un orme une quantité efficace contre la maladie de l'orme subéreux de P. syringae NKRL B-12050. 5 4· Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on traite l'orme à titre prophylactique.
5. 5· Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on traite l'orme à titre thérapeu-10 tique.
6. 6. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'orme a une proportion d'au moins environ 90% de sa cime exempte de maladie de 1'orme. 15 7- Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue l'application tôt dans la période de végétation.
7. 8. Un procédé selon l'une des revendications 1 ou 3, caractérisé en ce qu'on effectue l'appli-20 cation par injection dans l'orme.
8. 9- Un procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la quantité appliquée est comprise 8 11 entre environ 10 et environ 10 cellules totales.
9. 10. Un procédé selon la revendication 8, 23 caractérisé en ce que la quantité appliquée est d'en-8 Q viron 10-10” cellules vivantes. " 11. Un procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on injecte P. syringae dans un véhicule aqueux contenant des substances nutritives pour 30 P. syringae.
10. 12. Un procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le véhicule aqueux comprend en outre un amino-acide qui stimule la production de l'antibiotique dans l'orme. 35 13· Un procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on effectue l'injection par écoulement par gravité. 31
11. 14. Un procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu’on effectue l'infection à une pression supérieure à la force de la pesanteur.
12. 15· Un procédé selon la revendication 14, 5 caractérisé en ce qu'il comprend 1*étape supplémentaire consistant à balayer l'orme avec de l'eau après l'étape d'infection, de manière à assurer une distribution suffisante de P. syringae dans l'arbre.
13. 16. Un procédé selon la revendication 3* 10 caractérisé en ce que l'orme est traité à titre prophy-‘ : lactique; l'application est effectuée par infection dans l'orme tôt dans la période de végétation; et on infecte les P. syringae dans un véhicule aqueux contenant des substances nutritives pour les P. syringae.
14. 17. Un procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on traite l'orme à titre thérapeutique, l'orme ayant une proportion d'au moins environ 90% de sa cime exempte de la maladie de l'orme; l'application est effectuée par injection dans l'orme tôt dans 20 la période de végétation; et on injecte les P. syringae dans un véhicule aqueux contenant des substances nutritives pour les P. syringae. '18. Un antibiotique de poids moléculaire élevé utile dans le traitement de la maladie de l'orme 25 subéreux, cet antibiotique étant produit en faisant incuber P. syringae NKEL B-12050 à 25-28°C environ dans un bouillon dextrosé à la pomme de terre à 1,5-2,5% environ réglé à une concentration finale d'environ 0,5--- 3% de glucose, pendant deux à quatre jours environ; en 30 mélangeant un agent précipitant avec le bouillon après l'incubation en quantité suffisante pour faire précipiter à partir du bouillon des substances de poids moléculaire très élevé; en séparant le précipité et la phase liquide l'un de l'autre; en évaporant à sec la phase 35 liquide, de manière à laisser un résidu; en chromato-graphiant le résidu sur une colonne capable de séparer dans le volume vide de l'éluat les substances ayant un a 32 poids moléculaire d'au moins 1 800 environ des substances de poids moléculaire peu élevé; et en recueillant l'antibiotique de poids moléculaire élevé à partir du volume vide de l'éluat; les étapes de traitement étant 5 conduites à une température inférieure à 50°C environ·
15. 19- Un procédé pour obtenir un antibiotique de poids moléculaire élevé à partir de P. syringae NERL B-12050, caractérisé en ce qu'on fait incuber P. syringae à 25-28°C environ dans un bouillon dextrosé 10 à la pomme de terre à 1,5-2,5% environ réglé à une : concentration finale d'environ 0,5-3% de glucose, pen dant deux à quatre jours environ; on mélange un agent précipitant avec le bouillon après l'incubation en quantité suffisante pour faire précipiter à partir du 15 bouillon des substances de poids moléculaire très élevé; on sépare le précipité et la phase liquide l'un de l'autre; on évapore à sec la phase liquide, de manière à laisser un résidu; on chromatographie le résidu sur une colonne capable de séparer dans le volume vide 20 de l'éluat les substances ayant un poids moléculaire d'au moins 1 800 environ des substances de poids moléculaire peu élevé; et on recueille l'antibiotique de poids moléculaire élevé à partir du volume vide de l'éluat; les étapes de traitement étant conduites à une tempé-2S rature inférieure à 50°C environ.
16. 20. Un procédé selon la revendication 19, \ caractérisé en ce que le bouillon dextrosé à la pomme de terre contient environ 10 millimoles de chlorure ferrique et environ 2,5 grammes d'histidine par litre.
17. 21. Un procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'agent précipitant est de l'acétone.
18. 22. Un procédé pour traiter la maladie de l'orme subéreux, caractérisé en ce qu'on injecte 55 dans un orme une quantité efficace contre la maladie de l'orme subéreux d'une substance antimycotique obtenue en faisant incuber P. syringae HEBL B-12050 à 25-28°C 33 w > environ dans un "bouillon dextrosé à la pomme de terre à 1,5-2,5% environ réglé à une concentration finale d'environ 0,5-3% de glucose, pendant deux à quatre jours environ, et en traitant le "bouillon après l'incubation 5 par un agent d'extraction de manière à isoler la substance antimycotique.
19. 25. Un procédé pour traiter la maladie de l'orme subéreux, caractérisé en ce qu'on injecte à un orme une quantité efficace contre la maladie de ^ 10 l'orme subéreux de 1 Antibiotique de poids moléculaire élevé selon la revendication 18.
20. 24. Un procédé selon la revendication 22 ou 23, caractérisé en ce qu'on effectue l'injection tôt dans la période de végétation.