LT6992B - Regenerative phospholipid biosensor on silanized oxides surface - Google Patents
Regenerative phospholipid biosensor on silanized oxides surface Download PDFInfo
- Publication number
- LT6992B LT6992B LT2021533A LT2021533A LT6992B LT 6992 B LT6992 B LT 6992B LT 2021533 A LT2021533 A LT 2021533A LT 2021533 A LT2021533 A LT 2021533A LT 6992 B LT6992 B LT 6992B
- Authority
- LT
- Lithuania
- Prior art keywords
- membrane
- oxide
- biosensor according
- differs
- phospholipid
- Prior art date
Links
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 title claims abstract description 36
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 title description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 93
- 239000013545 self-assembled monolayer Substances 0.000 claims abstract description 41
- 239000002094 self assembled monolayer Substances 0.000 claims abstract description 37
- 239000010410 layer Substances 0.000 claims abstract description 16
- 150000004756 silanes Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 36
- XLOMVQKBTHCTTD-UHFFFAOYSA-N Zinc monoxide Chemical compound [Zn]=O XLOMVQKBTHCTTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 28
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 20
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 14
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 claims description 14
- 239000011787 zinc oxide Substances 0.000 claims description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims description 10
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- XOLBLPGZBRYERU-UHFFFAOYSA-N tin dioxide Chemical compound O=[Sn]=O XOLBLPGZBRYERU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000010936 titanium Substances 0.000 claims description 8
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims description 7
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- GYHNNYVSQQEPJS-UHFFFAOYSA-N Gallium Chemical compound [Ga] GYHNNYVSQQEPJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052733 gallium Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 claims description 6
- MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N Zirconium dioxide Chemical compound O=[Zr]=O MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- YBMRDBCBODYGJE-UHFFFAOYSA-N germanium dioxide Chemical compound O=[Ge]=O YBMRDBCBODYGJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 claims description 4
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 claims description 4
- 229910000531 Co alloy Inorganic materials 0.000 claims description 3
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- RCAQADNJXBGEKC-UHFFFAOYSA-N [O].[In].[Sb] Chemical compound [O].[In].[Sb] RCAQADNJXBGEKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910045601 alloy Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000000956 alloy Substances 0.000 claims description 3
- BEQNOZDXPONEMR-UHFFFAOYSA-N cadmium;oxotin Chemical compound [Cd].[Sn]=O BEQNOZDXPONEMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052681 coesite Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims description 3
- 229910052906 cristobalite Inorganic materials 0.000 claims description 3
- MXPKSPPUARJRSI-UHFFFAOYSA-H dibismuth;triselenite Chemical compound [Bi+3].[Bi+3].[O-][Se]([O-])=O.[O-][Se]([O-])=O.[O-][Se]([O-])=O MXPKSPPUARJRSI-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims description 3
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N indium atom Chemical compound [In] APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000010445 mica Substances 0.000 claims description 3
- 229910052618 mica group Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910001000 nickel titanium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000010453 quartz Substances 0.000 claims description 3
- 229910052594 sapphire Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000010980 sapphire Substances 0.000 claims description 3
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 3
- SKRWFPLZQAAQSU-UHFFFAOYSA-N stibanylidynetin;hydrate Chemical compound O.[Sn].[Sb] SKRWFPLZQAAQSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052682 stishovite Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052905 tridymite Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910021521 yttrium barium copper oxide Inorganic materials 0.000 claims description 3
- YVTHLONGBIQYBO-UHFFFAOYSA-N zinc indium(3+) oxygen(2-) Chemical compound [O--].[Zn++].[In+3] YVTHLONGBIQYBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- HZEWFHLRYVTOIW-UHFFFAOYSA-N [Ti].[Ni] Chemical compound [Ti].[Ni] HZEWFHLRYVTOIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 claims description 2
- VOANFGTXELDUQQ-UHFFFAOYSA-N antimony;indium;oxotin Chemical compound [In].[Sb].[Sn]=O VOANFGTXELDUQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 claims description 2
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 claims description 2
- LJCFOYOSGPHIOO-UHFFFAOYSA-N antimony pentoxide Inorganic materials O=[Sb](=O)O[Sb](=O)=O LJCFOYOSGPHIOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical class 0.000 claims 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims 1
- 238000002207 thermal evaporation Methods 0.000 claims 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 16
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 abstract description 14
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 abstract description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 28
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 22
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 20
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 11
- 238000001453 impedance spectrum Methods 0.000 description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 10
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 10
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 10
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- 101710092462 Alpha-hemolysin Proteins 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010036176 Melitten Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 6
- VDXZNPDIRNWWCW-JFTDCZMZSA-N melittin Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(N)=O)CC1=CNC2=CC=CC=C12 VDXZNPDIRNWWCW-JFTDCZMZSA-N 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- -1 gold thiolates Chemical class 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 229910052755 nonmetal Inorganic materials 0.000 description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 0.000 description 4
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 238000012650 click reaction Methods 0.000 description 4
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000010408 film Substances 0.000 description 4
- 238000002444 silanisation Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical compound [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 3
- 238000000157 electrochemical-induced impedance spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 3
- 229910001887 tin oxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 239000005047 Allyltrichlorosilane Substances 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 239000003012 bilayer membrane Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002542 deteriorative effect Effects 0.000 description 2
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- PSGAAPLEWMOORI-PEINSRQWSA-N medroxyprogesterone acetate Chemical compound C([C@@]12C)CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@](OC(C)=O)(C(C)=O)CC[C@H]21 PSGAAPLEWMOORI-PEINSRQWSA-N 0.000 description 2
- OVHQWOXKMOVDJP-UHFFFAOYSA-N melitin Chemical compound OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(O)C(OC=2C=C3C(C(C(OC4C(C(O)C(O)C(COC5C(C(O)C(O)C(CO)O5)O)O4)O)=C(C=4C=CC(O)=CC=4)O3)=O)=C(O)C=2)OC(C)C1O OVHQWOXKMOVDJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- 238000002139 neutron reflectometry Methods 0.000 description 2
- 239000000075 oxide glass Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 238000000682 scanning probe acoustic microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- ZDHXKXAHOVTTAH-UHFFFAOYSA-N trichlorosilane Chemical compound Cl[SiH](Cl)Cl ZDHXKXAHOVTTAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005052 trichlorosilane Substances 0.000 description 2
- KWVGIHKZDCUPEU-UHFFFAOYSA-N 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(OC)(OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 KWVGIHKZDCUPEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150065749 Churc1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N Fluorine atom Chemical compound [F] YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHIQFHXMXDVBQS-UHFFFAOYSA-N [In].[Sn]=O.[In] Chemical compound [In].[Sn]=O.[In] GHIQFHXMXDVBQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SKYGTJFKXUWZMD-UHFFFAOYSA-N ac1l2n4h Chemical compound [Co].[Co] SKYGTJFKXUWZMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001356 alkyl thiols Chemical class 0.000 description 1
- 239000004411 aluminium Substances 0.000 description 1
- 239000003849 aromatic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000003659 bee venom Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 238000001460 carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 150000001841 cholesterols Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000002484 cyclic voltammetry Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 239000003989 dielectric material Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- PHTXVQQRWJXYPP-UHFFFAOYSA-N ethyltrifluoromethylaminoindane Chemical compound C1=C(C(F)(F)F)C=C2CC(NCC)CC2=C1 PHTXVQQRWJXYPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- AMGQUBHHOARCQH-UHFFFAOYSA-N indium;oxotin Chemical compound [In].[Sn]=O AMGQUBHHOARCQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000001755 magnetron sputter deposition Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- DZVCFNFOPIZQKX-LTHRDKTGSA-M merocyanine Chemical compound [Na+].O=C1N(CCCC)C(=O)N(CCCC)C(=O)C1=C\C=C\C=C/1N(CCCS([O-])(=O)=O)C2=CC=CC=C2O\1 DZVCFNFOPIZQKX-LTHRDKTGSA-M 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002843 nonmetals Chemical class 0.000 description 1
- QJAOYSPHSNGHNC-UHFFFAOYSA-N octadecane-1-thiol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCS QJAOYSPHSNGHNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000004544 sputter deposition Methods 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 150000007944 thiolates Chemical class 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 1
- HKFSBKQQYCMCKO-UHFFFAOYSA-N trichloro(prop-2-enyl)silane Chemical compound Cl[Si](Cl)(Cl)CC=C HKFSBKQQYCMCKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DAHWFTWPSFSFMS-UHFFFAOYSA-N trihydroxysilane Chemical group O[SiH](O)O DAHWFTWPSFSFMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Fluid Adsorption Or Reactions (AREA)
Abstract
Description
IŠRADIMO SRITISFIELD OF THE INVENTION
Išradimas yra susijęs su paviršiuje prikabintomis lipidinėmis membranomis, konkrečiai, su regeneruojamo fosfolipidinio biojutiklio konstravimu ant elektrai laidžių ir nelaidžių oksidinių paviršių.The invention relates to surface-attached lipid membranes, specifically to the construction of a regenerated phospholipid biosensor on electrically conductive and non-conductive oxide surfaces.
TECHNIKOS LYGISSTATE OF THE ART
Ląstelė yra mažiausias gyvybės struktūrinis vienetas. Ją supa plazminė membrana, kuri apsaugo ir atskiria ląstelės vidų nuo išorės. Viena svarbiausių sudedamųjų dalių yra fosfolipidai. Tai yra amfifilinės medžiagos, kurios turi dvi hidrofobines anglies grandines (uodegos) ir hidrofilinę fosfato grupę (galva). Fosfolipidai suformuoja dviejų sluoksnių struktūrą, kur hidrofilinės galvos yra nukreiptos į išorę, o hidrofobines uodegos nukreiptos į bisluoksnio vidų. Tam, kad vyktų medžiagų transportas iš ląstelės vidų į išorę ir vykdytų kitas gyvybiškai svarbias funkcijas, tokias kaip kvėpavimas, membranoje taip pat yra įsiterpę įvairių tipų baltymai. Būtent dėl šios membranos savybės - gebėti įterpti baltymus, buvo sukurti lipidinių membranų modeliai. Jie pasižymi paprastesne sudėtimi, kurią galima kontroliuoti. Membranų modeliai yra pritaikomi, kaip eksperimentinė platforma baltymų ir membranų sąveikos tyrimams, tarp jų: integralinių baltymų (poras formuojantys toksinai, jonų kanalai) ir periferinių baltymų (fermentai, elektronų pernešėjai) funkcijai įvertinti. Elektrocheminiai metodai, kartu su mikroskopiniais ir spektriniais metodais yra labai efektyvūs membraninių procesų tyrimuose, tačiau norint tokius metodus taikyti, membranų modeliai turėtų būti formuojami ant kietų elektrai laidžių paviršių (Ragaliauskas T. et ai., 2017).A cell is the smallest structural unit of life. It is surrounded by a plasma membrane that protects and separates the inside of the cell from the outside. One of the most important components is phospholipids. These are amphiphilic substances that have two hydrophobic carbon chains (tails) and a hydrophilic phosphate group (head). Phospholipids form a bilayer structure, where the hydrophilic heads face outwards and the hydrophobic tails face the interior of the bilayer. Different types of proteins are also interspersed in the membrane for the transport of substances from the inside to the outside of the cell and for other vital functions such as respiration. It is precisely because of this property of the membrane - the ability to insert proteins - that models of lipid membranes were created. They are characterized by a simpler composition that can be controlled. Membrane models are applicable as an experimental platform for the study of protein-membrane interactions, including: assessing the function of integral proteins (pore-forming toxins, ion channels) and peripheral proteins (enzymes, electron transporters). Electrochemical methods, together with microscopic and spectral methods, are very effective in studying membrane processes, but in order to apply such methods, membrane models should be formed on solid electrically conductive surfaces (Ragaliauskas T. et ai., 2017).
Vienas patogiausių membranos ant kieto paviršiaus formavimo metodų yra vezikulių liejimas. Vezikulės yra sferinės struktūros liposomos, sudarytos iš fosfolipidų bisluoksnio. Užliejus vezikulių tirpalą tiesiai ant tiriamojo paviršiaus, vyksta savaiminė lipidų savitvarka, kai fosfolipidai iš sferinės formos pereina ant kieto paviršiaus, suformuojant bisluoksnę plokščią struktūrą. Kadangi membranos formavimo metodas yra pagrįstas savitvarka, jis nereikalauja jokios brangios įrangos, todėl tai yra pigus ir prieinamas metodas. Šis membranos formavimo metodas yra patogus ir tuo, kad galima lengvai kontroliuoti bisluoksnio sudėtį, keičiant lipidų sudėtį vezikulėse.One of the most convenient methods of forming a membrane on a solid surface is vesicle casting. Vesicles are liposomes with a spherical structure, consisting of a phospholipid bilayer. After the vesicle solution is poured directly onto the test surface, self-assembly of lipids takes place, when phospholipids move from a spherical shape to a solid surface, forming a bilayer flat structure. Since the membrane forming method is based on self-assembly, it does not require any expensive equipment, making it a cheap and accessible method. This method of membrane formation is also convenient in that the composition of the bilayer can be easily controlled by changing the lipid composition in the vesicles.
Vienas paprasčiausių membranų modelių yra plokščioji lipidinė membrana. Ji yra sudaryta iš dviejų fosfolipidų sluoksnių, tačiau, kitaip nei ląstelė, kuri yra sferinės formos, šis bisluoksnis yra įmobilizuotas horizontalioje plokštumoje (Castellana E.T. et ai., 2006). Plokščioji lipidinė membrana pasižymi tuo, kad turi labai ploną vandens sluoksnį tarp membranos ir kieto paviršiaus. Šis vandens sluoksnis „imituoja“ ląstelės vidų. Turint tokią modelinę sistemą, baltymai gali būti įterpiami ir atliekami įvairūs tyrimai, siekiant išsiaiškinti membranos pralaidumą, defektiškumą ir kitas savybes. Nors šis membranos modelis pasižymi vidutinišku stabilumu, tačiau membranoje esantys įvairūs defektai bei jų gausa neleidžia pritaikyti elektrocheminių matavimų metodų plokščiųjų membranų integralumui įvertinti bei panaudoti tokias membranas elektrocheminiams biojutikliams bakterinių toksinų bei kitų membranų integralumą pažeidžiančiais agentų aktyvumui išmatuoti. Hibridinės membranos (Plant A.L. 1999) pasižymi nepalyginamai mažesniu defektų kiekiu. Jose pirmą sluoksnį prie paviršiaus sudaro savitvarkis monosluoksnis (SAM), o antrą sluoksnį-fosfolipidai. SAM susideda iš anglies atomų grandinę turinčių molekulių su vadinama aktyvia funkcine grupe (galva) vienoje pusėje, kurią dažniausiai sudaro tiolio arba thalkoksisilano funkcinė grupė. SAM prie paviršiaus prikimba funkcinei grupei su paviršiumi suformuojant stiprius kovalentinius ryšius. Aktyvios SAM funkcinės grupės parinkimas priklauso nuo to, koks substratas bus naudojamas SAM formavimui. Jeigu naudojamas auksinis paviršius - tai parenkamas SAM turintis tiolio grupę, o jeigu metalo oksidinis paviršius - tai naudojamas SAM su thalkoksisilano grupe. Vienas pagrindinių hibridinių membranų pranašumų yra tai, kad jos pasižymi labai dideliu stabilumu (palyginus su plokščiosiomis lipidinėmis membranomis) ir mažu nedidelių defektų kiekiu. Dėl to galima taikyti įvairius, taip pat ir elektrocheminius tyrimų metodus atliekant dinaminius eksperimentus. Tačiau hibridinė membrana turi ir trūkumą, - joje nėra plono vandens pasluoksnio tarp membranos ir kieto paviršiaus, kuris leistų į ją įterpti integralinius baltymus ir panaudoti tokius dvisluoksnius biojutikliams, matuojantiems bakterinių toksinų, įsiterpiančių į membranas aktyvumą. Todėl buvo sukurtas kitas membranų modelis - tai paviršiuje prikabintos membranos (Junghans A. et ai., 2010; McGillivray D.J. et ai., 2007). Paviršiuje prikabintų membranų struktūra yra ypatinga tuo, kad jas sudaro savitvarkis monosluoksnis iš lipidų struktūrą primenančių „inkarinių“ junginių. Šie inkarai taip pat turi aktyvią funkcinę grupę, kuri suformuoja tvirtus ryšius su pagrindu, kaip ir įprastame SAM, tačiau toliau esanti uodega susideda iš polietilenglikolio (PEG) grandinės ir šis junginys užsibaigia dvejomis anglies atomų grandinėmis, kurios primena lipidų hidrofobinę dalį. Suformavus tokį savitvarkį monosluoksnį, vezikulių liejimo metu, dėl afiniškumo susiformuoja plonas vandens sluoksnis savitvarkio monosluoksnio dalyje, kur yra PEG. Norint įterpti toksinus ar kitus baltymus, reikia „praskiesti“ inkarų kiekį ant paviršiaus, naudojant trumpagrandžius mažos molekulinės masės SAM junginius, kurie išorėje turėtų hidrofilinę grupę (pavyzdžiui, hidroksi grupę), dar vadinamus skiedikliais. Suformavus mišrų SAM iš ilgų inkarinių junginių ir trumpų skiediklių bei užliejus vezikules gaunama paviršiuje prikabinta bisluoksnė fosfolipidinė membrana, kuri turi pomembraninį vandens rezervuarą. Tokia sistema gali būti pritaikoma integralinių baltymų tyrimams, poras formuojančių toksinų detekcijai.One of the simplest membrane models is the planar lipid membrane. It is composed of two layers of phospholipids, but unlike the cell, which is spherical in shape, this bilayer is immobilized in a horizontal plane (Castellana E.T. et ai., 2006). A flat lipid membrane is characterized by having a very thin layer of water between the membrane and the solid surface. This layer of water "simulates" the interior of the cell. With such a model system, proteins can be inserted and subjected to various assays to elucidate membrane permeability, defectivity, and other properties. Although this membrane model is characterized by moderate stability, the various defects in the membrane and their abundance prevent the application of electrochemical measurement methods to evaluate the integrity of flat membranes and to use such membranes as electrochemical biosensors to measure the activity of bacterial toxins and other agents that violate membrane integrity. Hybrid membranes (Plant A.L. 1999) are characterized by an incomparably lower amount of defects. In them, the first layer near the surface consists of a self-assembled monolayer (SAM), and the second layer consists of phospholipids. SAMs consist of molecules containing a chain of carbon atoms with a so-called active functional group (head) on one side, which usually consists of a thiol or thalcoxysilane functional group. SAM adheres to the surface by forming strong covalent bonds between the functional group and the surface. The selection of the active SAM functional group depends on the substrate to be used for SAM formation. If a gold surface is used, a SAM containing a thiol group is selected, and if a metal oxide surface is used, a SAM with a thalcoxysilane group is used. One of the main advantages of hybrid membranes is that they exhibit very high stability (compared to planar lipid membranes) and a low amount of small defects. As a result, it is possible to apply various research methods, including electrochemical ones, in dynamic experiments. However, the hybrid membrane also has a drawback - it does not have a thin layer of water between the membrane and the solid surface, which would allow the insertion of integral proteins into it and the use of such bilayers for biosensors that measure the activity of bacterial toxins embedded in the membranes. Therefore, another model of membranes was developed - these are surface-attached membranes (Junghans A. et al., 2010; McGillivray D.J. et al., 2007). The structure of the membranes attached to the surface is special in that they consist of a self-organized monolayer of "anchor" compounds resembling the structure of lipids. These anchors also have an active functional group that forms strong bonds with the base, as in a conventional SAM, but the tail further down consists of a polyethylene glycol (PEG) chain and this compound ends with two carbon chains that resemble the hydrophobic part of lipids. After the formation of such a self-assembled monolayer, during vesicle casting, a thin layer of water is formed in the part of the self-assembled monolayer where PEG is present due to affinity. Incorporating toxins or other proteins requires "dilution" of the anchors on the surface using short-chain, low-molecular-weight SAM compounds that have a hydrophilic group (such as a hydroxy group) on the outside, also known as diluents. Forming a mixed SAM from long anchor compounds and short diluents and flooding the vesicles results in a surface-tethered bilayer phospholipid membrane that has a submembrane water reservoir. Such a system can be applied to studies of integral proteins, detection of pore-forming toxins.
Membranos gali būti formuojamos ant skirtingų paviršių. Vienas populiariausių substratų yra atomiškai lygus aukso paviršius, kuris dažniausiai būna paruoštas magnetroninio dulkinimo metodu. Toks paviršius gali būti naudojamas su AFM, SPR ar N R metodais. Suformuotos membranos pasižymi dideliu homogeniškumu (membranos formavimo metu gaunamas minimalus kiekis defektų) ir dideliu stabilumu. Neutronų reflektomethjos metodu nustatytas vandens pomembraninio sluoksnio storis siekia 2 nm (McGillivray D.J. et ai., 2007). Todėl šios membranos yra sėkmingai pritaikomos poras formuojančių toksinų tyrimams ir kuriami biologiniai jutikliai bakterinių toksinų, savaime įsiterpiančių į membranas, koncentracijos nustatymui.Membranes can be formed on different surfaces. One of the most popular substrates is an atomically smooth gold surface, which is usually prepared by magnetron sputtering. Such a surface can be used with AFM, SPR or N R methods. Formed membranes are characterized by high homogeneity (minimum defects are obtained during membrane formation) and high stability. The thickness of the submembrane layer of water was determined by the neutron reflectometry method (McGillivray D.J. et al., 2007). Therefore, these membranes are successfully applied to studies of pore-forming toxins, and biological sensors are developed for determining the concentration of bacterial toxins self-intercalated in membranes.
Membranų modeliai ant garinto aukso paviršiaus yra gana plačiai ištirta tema ir nustatyti optimalūs parametrai membranų formavimui, todėl žengiami pirmieji žingsniai link biologinių jutiklių komercializavimo (patentas nr. LT6424B (2017) „Paviršiuje imobilizuotų fosfolipidinių bisluoksnių membranų (tBLM) gavimo būdas“). Žinant, kad auksas ir paviršių paruošimo procesas (magnetroninis dulkinimas) yra brangūs, yra siekiama atrasti alternatyvių substratų, kurie būtų pigesni ir lengviau komerciškai prieinami siekiant sukurti pigų ir lengvai paruošiamą biologinį jutiklį. Pastebėsime, kad membranų modeliai ant metalinių substratų, tokių kaip auksas yra neskaidrūs todėl tokiems modeliams sunkiai pritaikomi optiniai metodai, kuriems būtinas šviesos pralaidumas. Svarbu pastebėti, jog yra duomenų (Rakovska et ai., 2015), kad inkariniai junginiai, aukso tiolatai gali nesunkiai migruoti aukso paviršiumi, kas lemia inkarinių junginių sankaupų paviršiuje susidarymo ir funkcinių membranų savybių blogėjimą, ypač bandant regeneruoti kontakte su vandens terpe esančias membranas.Membrane patterns on the vaporized gold surface is a rather widely researched topic and the optimal parameters for membrane formation have been determined, leading to the first steps towards the commercialization of biosensors (Patent No. LT6424B (2017) "Method for obtaining surface-immobilized phospholipid bilayer membranes (tBLM)"). Knowing that gold and the surface preparation process (electron sputtering) are expensive, the aim is to discover alternative substrates that are cheaper and more easily commercially available in order to create a cheap and easy-to-prepare biosensor. We will note that membrane patterns on metallic substrates such as gold are opaque, so optical methods that require light transmission are difficult to apply to such patterns. It is important to note that there are data (Rakovska et al., 2015) that anchoring compounds, gold thiolates, can easily migrate on the gold surface, which leads to the formation of clusters of anchoring compounds on the surface and the deterioration of functional membrane properties, especially when trying to regenerate membranes in contact with water media.
Viena iš alternatyvų aukso substratams galėtų būti plonų plėvelių metalų oksidai. Pastaruoju metu vis daugiau dėmesio susilaukia skirtingais elementais legiruotas alavo oksidas. Tai yra optiškai skaidrūs ir elektros srovei laidūs puslaidininkiai, todėl atsiveria galimybė suformuotas sistemas pritaikyti fotovoltikoje. Taip pat suformuotų membranų tyrimams galima pritaikyti optinius tyrimų metodus.One alternative to gold substrates could be thin film metal oxides. Recently, tin oxide doped with different elements is getting more and more attention. These are optically transparent and electrically conductive semiconductors, which opens up the opportunity to apply the formed systems in photovoltaics. Optical research methods can also be applied to the research of formed membranes.
Norint suformuoti paviršiuje prikabintą membraną ant metalo oksidinių paviršių, reikia naudoti savitvarkį monosluoksnį susidedantį iš trialkoksisilanų. Hidrolizės reakcijos metu, suformuojami stiprūs Si-O-metalas kovalentiniai ryšiai (Wasserman S.R. et ai., 1989). Siekiant ant metalo oksidinių paviršių suformuoti membraną, kuri turėtų pomembraninį vandens rezervuarą ir galėtų būti pritaikyta poras formuojančių baltymų tyrimams, reikia atrasti tokius junginius SAM formavimui, kurie turėtų hidrofilinę dalį į viršų nuo funkcinės grupės (suformuoja ryšius su paviršiumi) ir hidrofobinę uodegą. Suformavus tokį SAM, hidrofilinėje dalyje susidarytų plonas vandens sluoksnis dėl vandenilinių ryšių, o hidrofobinė dalis vezikulių liejimo metu įsiterptų tarp fosfolipidų ir taptų membranos dalimi.In order to form a surface-attached membrane on metal oxide surfaces, it is necessary to use a self-assembled monolayer consisting of trialkoxysilanes. During the hydrolysis reaction, strong Si-O-metal covalent bonds are formed (Wasserman S.R. et al., 1989). In order to form a membrane on metal oxide surfaces, which would have a sub-membrane water reservoir and could be applied to studies of pore-forming proteins, it is necessary to discover such compounds for SAM formation, which would have a hydrophilic part above the functional group (forms connections with the surface) and a hydrophobic tail. After the formation of such a SAM, a thin layer of water would form in the hydrophilic part due to hydrogen bonds, while the hydrophobic part would intercalate between the phospholipids and become part of the membrane during vesicle casting.
Taigi, apibendrinant galima būtų išskirti pagrindinius trūkumus paviršiuje imobilizuotų membranų pritaikymui biojutiklių kūrime:Thus, in summary, the main disadvantages for the application of surface-immobilized membranes in the development of biosensors could be identified:
1. Auksiniai membranų substratai yra neskaidrūs, todėl yra sunkiau pritaikyti optinius tyrimų metodus. Tuo tarpu, oksidiniai substratai gali būti pagaminti optiškai skaidrūs.1. Gold membrane substrates are opaque, making it more difficult to apply optical research methods. Meanwhile, oxide substrates can be made optically transparent.
2. Nebloginant jų savybių membranos ant auksinių paviršių gali būti suformuojamos tik vieną kartą, t.y. dėl aukso-tiolatų labilumo ir polinkio migruoti paviršiuje, negalima membranos regeneracija. Todėl aktualu pritaikyti oksidinius paviršius, tinkamus daugkartiniam membranų formavimui.2. Without deteriorating their properties, membranes can be formed on gold surfaces only once, i.e. due to the lability and tendency of gold-thiolates to migrate on the surface, membrane regeneration is not possible. Therefore, it is relevant to apply oxide surfaces suitable for multiple membrane formation.
3. Naudojant tiolatų chemiją inkariniams junginiams suformuoti biosensoriaus substratų ratas apribotas metalais, pvz., auksu, tuo tarpu silanų inkariniai junginiai leidžia išplėsti substratų sąrašą iki puslaidininkių ir dielekthkų.3. Using thiolate chemistry to form anchor compounds, the range of biosensor substrates is limited to metals, such as gold, while silane anchor compounds allow expanding the list of substrates to semiconductors and dielectrics.
4. Įprastai naudojamas paviršius - auksas, yra brangus metalas, jo paruošimui naudojama brangi įranga, todėl siekiama pritaikyti pigesnius elektrai laidžius ir nelaidžius oksidinius ir oksiduotus metalų paviršius.4. The commonly used surface is gold, it is an expensive metal, expensive equipment is used for its preparation, so the aim is to apply cheaper electrically conductive and non-conductive oxide and oxidized metal surfaces.
IŠRADIMO ESMĖESSENCE OF THE INVENTION
Šiam išradimui įgyvendinti buvo parinkti metalų ir nemetalų oksidų paviršiai. Plonų plėvelių oksidinių paviršių pritaikymas membranų formavimui turi pranašumų, lyginant su iki šiol membranų formavimui naudojamais aukso plėvelių paviršiais, kurių minimalus storis viršija 50 nm ir dėl to nėra optiškai skaidrūs. Kadangi plonasluoksniai oksidai pasižymi optiniu skaidrumu, todėl suformuotos fosfolipidinės membranos gali būti tiriamos optiniais tyrimų metodais ir galimai pritaikomos fotosrovės generavimui ar saulės elementų kūrime.Metal and non-metal oxide surfaces have been selected for the implementation of this invention. The application of thin film oxide surfaces for membrane formation has advantages compared to the previously used gold film surfaces for membrane formation, which have a minimum thickness of over 50 nm and are therefore not optically transparent. Since thin-layer oxides are optically transparent, the formed phospholipid membranes can be studied by optical research methods and possibly applied to photocurrent generation or solar cell development.
Dėl oksidų paviršiaus chemijos savitvarkio monosluoksnio formavimui naudojami silanų junginiai su metalų oksidų paviršiumi sudarantys stiprų Si-O-metalas ryšį, kuris užtikrina kad susiformavęs savitvarkis monosluoksnis pasižymėtų dideliu stabilumu. Dėl šios priežasties silanizuoti oksidiniai paviršiai gali būti tinkami daugkartiniam tomis pačiomis savybėmis pasižyminčių fosfolipidinių membranų formavimui, priešingai nei aukso plėvelių paviršiai pasižymintys aukso tiolatų molekulių paviršiniu judrumu, sąlygojančiu inkarinių monosluoksnių nestabilumą ir inkarų susitelkimą į paviršinius telkinius bei membranų funkcinių savybių degradacija.Due to the chemistry of the surface of the oxides, for the formation of the self-assembled monolayer, silane compounds are used with the surface of metal oxides forming a strong Si-O-metal bond, which ensures that the formed self-assembled monolayer is characterized by high stability. For this reason, silanized oxide surfaces can be suitable for multiple formation of phospholipid membranes with the same properties, in contrast to gold film surfaces characterized by surface mobility of gold thiolate molecules, leading to instability of anchor monolayers and concentration of anchors in surface pools and degradation of functional properties of membranes.
Šiame darbe SAM formavimui panaudota naują silanų sintezės procedūra, paremta klik-reakcijos chemija ir nereikalaujanti brangios įrangos. Sintezės metu paruošiamas ilgagrandžio ir trumpagrandžio silanų mišinys iš karto gali būti pritaikomas monosluoksnio formavimui be papildomo gryninimo. Vezikulių liejimo metu suformuotos fosfolipidinės membranos pasižymi stabilumu ir gali būti regeneruojamos.In this work, a new procedure for the synthesis of silanes, based on click-reaction chemistry and requiring no expensive equipment, was used for the formation of SAMs. The mixture of long-chain and short-chain silanes prepared during the synthesis can be immediately applied to monolayer formation without additional purification. Phospholipid membranes formed during vesicle casting are stable and can be regenerated.
Metalų ar nemetalų oksidai yra pigesni, nei įprastai fosfolipidinių membranų formavimui naudojami Au paviršiai, todėl atsiranda daugiau galimybių komerciškai pritaikyti fosfolipidinius biojutiklius toksinų ir kitų biologiškai aktyvių medžiagų detekcijai sukonstruotus ant elektrai laidžių ir nelaidžių oksidinių paviršių.Metal or non-metal oxides are cheaper than Au surfaces commonly used for the formation of phospholipid membranes, so there are more opportunities for commercial application of phospholipid biosensors for the detection of toxins and other biologically active substances constructed on electrically conductive and non-conductive oxide surfaces.
Siūlomo būdo privalumai:Advantages of the proposed method:
1. Panaudojant silanų inkarus galima sukonstruoti fosfolipidinius biojutiklius ant nebrangių, taip pat ir komerciškai prieinamų, elektrai laidžių ir nelaidžių oksidinių ir oksiduotų metalų paviršių.1. Using silane anchors, phospholipid biosensors can be constructed on inexpensive, as well as commercially available, electrically conductive and non-conductive oxide and oxidized metal surfaces.
2. Siūlomas biojutiklis gali būti regeneruojamas ir panaudojamas kelis ar daugiau kartų.2. The proposed biosensor can be regenerated and used several or more times.
3. Siūlomas biojutiklis gali būti sukonstruojamas ant optiškai skaidraus pagrindo ir integruojamas į optinius tyrimo prietaisus/metodus.3. The proposed biosensor can be constructed on an optically transparent substrate and integrated into optical research devices/methods.
4. Siūlomas biojutiklis gali būti sukonstruojamas ant laidžių, puslaidininkių ir dielektrinių savybių turinčių paviršių.4. The proposed biosensor can be constructed on conductive, semiconducting and dielectric surfaces.
TRUMPAS BRĖŽINIŲ APRAŠYMAS paveikslas. Elektrocheminio impedanso spektrai Cole - Cole koordinatėse išmatuoti esant 0 V potencialui vs Ag/AgCI,Clsot.: juodi apskritimai - švarus FTO stikliukas, balti apskritimai - FTO stikliukas funkcionalizuotas TOPS:ATS 1:1 SAM mišiniu heptano tirpiklyje, juodi trikampiai - tBLM, sudėtis - DOPC/Chol 6:4.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS picture. Electrochemical impedance spectra in Cole-Cole coordinates measured at 0 V potential vs Ag/AgCI,Clsot.: black circles - clean FTO glass, white circles - FTO glass functionalized with TOPS:ATS 1:1 SAM mixture in heptane solvent, black triangles - tBLM, composition - DOPC/Chol 6:4.
paveikslas. Elektrocheminio impedanso spektrai Cole - Cole koordinatėse išmatuoti esant 0 V potencialui vs Ag/AgCI,Clsot.: juodi apskritimai - švarus FTO stikliukas, balti apskritimai - FTO stikliukas funkcionalizuotas TOPS:ATS 1:1 SAM mišiniu tolueno tirpiklyje, juodi trikampiai - tBLM, sudėtis - DOPC/Chol 6:4.picture. Electrochemical impedance spectra in Cole-Cole coordinates measured at 0 V potential vs Ag/AgCI,Clsot.: black circles - clean FTO glass, white circles - FTO glass functionalized with TOPS:ATS 1:1 SAM mixture in toluene solvent, black triangles - tBLM, composition - DOPC/Chol 6:4.
paveikslas. Elektrocheminio impedanso spektrai Cole - Cole koordinatėse išmatuoti esant 0 V potencialui vs Ag/AgCI,Clsot.: juodi apskritimai - švarus ITO stikliukas, balti apskritimai - ITO stikliukas funkcionalizuotas TOPS:ATS 1:1 SAM mišiniu heptano tirpiklyje, juodi trikampiai - tBLM, sudėtis - DOPC/Chol 6:4.picture. Electrochemical impedance spectra in Cole-Cole coordinates measured at 0 V potential vs Ag/AgCI,Clsot.: black circles - clean ITO glass, white circles - ITO glass functionalized with TOPS:ATS 1:1 SAM mixture in heptane solvent, black triangles - tBLM, composition - DOPC/Chol 6:4.
paveikslas. Fluorescencinio mikroskopo nuotraukos, A-D - DOPC/Chol 6:4 tBLM, (kur 1% cholesterolio yra žymėtas fluorescenciniu dažu (Chol-Cy5)) ant TOPS:ATS 1:1 SAM funkcionalizuotų mikroskopinio stiklo plokštelių, E-F - tokia pat membrana ant mikroskopinio stiklo plokštelių, kurios nebuvo funkcionalizuotos SAM. A, B ir C - membranos kraštas.picture. Fluorescence microscope images, A-D - DOPC/Chol 6:4 tBLM, (where 1% cholesterol is labeled with fluorescent dye (Chol-Cy5)) on TOPS:ATS 1:1 SAM-functionalized glass slides, E-F - same membrane on glass slides plates that were not functionalized with SAM. A, B and C - the edge of the membrane.
paveikslas. Elektrocheminio impedanso spektrai Cole - Cole koordinatėse išmatuoti esant 0 V potencialui vs Ag/AgCI,CLsot.: juodi apskritimai - švari NP plokštelė, balti apskritimai - NP plokštelė funkcionalizuota TOPS:ATS 1:1 SAM mišiniu heptano tirpiklyje, juodi trikampiai - tBLM, sudėtis - DOPC/Chol 6:4. A - priartinta kreivės dalis.picture. Electrochemical impedance spectra in Cole - Cole coordinates measured at 0 V potential vs Ag/AgCI,CLsot.: black circles - clean NP wafer, white circles - NP wafer functionalized with TOPS:ATS 1:1 SAM mixture in heptane solvent, black triangles - tBLM, composition - DOPC/Chol 6:4. A - zoomed-in part of the curve.
paveikslas. Elektrocheminio impedanso spektrai Cole - Cole koordinatėse išmatuoti esant 0 V potencialui vs Ag/AgCI,CLSot.: juodi apskritimai - švari garinto Ti/TiO2 plokštelė, balti apskritimai - Ti/TiO2 plokštelė funkcionalizuota TOPS:ATS 1:1 SAM mišiniu heptano tirpiklyje, juodi trikampiai - tBLM, sudėtis - DOPC/Chol 6:4. A priartinta kreivės dalis.picture. Electrochemical impedance spectra in Cole - Cole coordinates measured at 0 V potential vs Ag/AgCI,CL S ot.: black circles - clean evaporated Ti/TiO2 wafer, white circles - Ti/TiO2 wafer functionalized with TOPS:ATS 1:1 SAM mixture in heptane solvent , black triangles - tBLM, composition - DOPC/Chol 6:4. A zoomed-in part of the curve.
paveikslas. Elektrocheminio impedanso spektrai Cole - Cole koordinatėse išmatuoti esant 0 V potencialui vs Ag/AgCI,Clsot.: juodi apskritimai - švari Si plokštelė, balti apskritimai - Si plokštelė funkcionalizuota TOPS:ATS 1:1 SAM mišiniu heptano tirpiklyje, juodi trikampiai - tBLM, sudėtis - DOPC/Chol 6:4.picture. Electrochemical impedance spectra in Cole - Cole coordinates measured at 0 V potential vs Ag/AgCI,Clsot.: black circles - clean Si wafer, white circles - Si wafer functionalized with TOPS:ATS 1:1 SAM mixture in heptane solvent, black triangles - tBLM, composition - DOPC/Chol 6:4.
paveikslas.Elektrocheminio impedanso spektrai Cole - Cole koordinatėse išmatuoti esant 0 V potencialui vs Ag/AgCI,Clsot.: juodi apskritimai - DOPC/Chol 6:4 tBLM suformuota ant FTO, kuris buvo funkcionalizuotas TOPS:ATS 1:1 SAM, balti apskritimai - praėjus 60 min po 50 nM melitino įterpimo į membraną, juodi trikampiai praėjus 60 min po 100 nM melitino įterpimo į membraną. A - priartinta kreivės dalis paveikslas. Elektrocheminio impedanso spektrai Cole - Cole koordinatėse išmatuoti esant 0 V potencialui vs Ag/AgCI,Clsot.: juodi apskritimai - DOPC tBLM suformuota ant FTO, kuris buvo funkcionalizuotas TOPS:ATS 1:1 SAM, balti apskritimai - praėjus 60 min po 50 nM melitino įterpimo į membraną, juodi trikampiai praėjus 60 min po 100 nM melitino įterpimo į membraną.figure. Electrochemical impedance spectra in Cole - Cole coordinates measured at 0 V potential vs Ag/AgCI,Clsot.: black circles - DOPC/Chol 6:4 tBLM formed on FTO that was functionalized with TOPS:ATS 1:1 SAM, white circles - 60 min after 50 nM melittin insertion into the membrane, black triangles 60 min after 100 nM melittin insertion into the membrane. A - zoomed-in picture of part of the curve. Electrochemical impedance spectra in Cole-Cole coordinates measured at 0 V potential vs Ag/AgCI,Clsot.: black circles - DOPC tBLM formed on FTO that was functionalized with TOPS:ATS 1:1 SAM, white circles - after 60 min after 50 nM melittin of membrane insertion, black triangles 60 min after membrane insertion of 100 nM melittin.
paveikslas. DOPC:Chol 6:4 tBLM laidumo pokyčio priklausomybė nuo skirtingos melitino koncentracijos įterpimo į membraną.picture. Dependence of the change in conductance of DOPC:Chol 6:4 tBLM upon incorporation of different concentrations of melittin into the membrane.
paveikslas. Elektrocheminio impedanso spektrai Cole - Cole koordinatėse išmatuoti esant 0 V potencialui vs Ag/AgCI,Clsot.: juodi apskritimai - DOPC/Chol 6:4 tBLM suformuota ant FTO, kuris buvo funkcionalizuotas TOPS:ATS 1:1 SAM, balti apskritimai - praėjus 60 min po 50 nM alfa-hemolizino įterpimo į membraną, juodi trikampiai - praėjus 60 min po 100 nM alfa-hemolizino įterpimo į membraną. A priartinta kreivės dalis.picture. Electrochemical impedance spectra in Cole - Cole coordinates measured at 0 V potential vs Ag/AgCI,Clsot.: black circles - DOPC/Chol 6:4 tBLM formed on FTO that was functionalized with TOPS:ATS 1:1 SAM, white circles - after 60 min after 50 nM alpha-hemolysin insertion into the membrane, black triangles - 60 min after 100 nM alpha-hemolysin insertion into the membrane. A zoomed-in part of the curve.
paveikslas. Elektrocheminio impedanso spektrai Cole - Cole koordinatėse išmatuoti esant 0 V potencialui vs Ag/AgCI,Clsot.: juodi apskritimai - DOPC tBLM suformuota ant FTO, kuris buvo funkcionalizuotas TOPS:ATS 1:1 SAM, balti apskritimai - praėjus 60 min po 100 nM alfa-hemolizino įterpimo į membraną.picture. Electrochemical impedance spectra in Cole-Cole coordinates measured at 0 V potential vs Ag/AgCI,Clsot.: black circles - DOPC tBLM formed on FTO that was functionalized with TOPS:ATS 1:1 SAM, white circles - 60 min after 100 nM alpha -hemolysin insertion into the membrane.
paveikslas. DOPC:Chol 6:4 tBLM laidumo pokyčio priklausomybė nuo skirtingos alfa-hemolizino koncentracijos įterpimo į membraną.picture. Dependence of the change in conductance of DOPC:Chol 6:4 tBLM upon incorporation of different concentrations of alpha-hemolysin into the membrane.
paveikslas. Elektrocheminio impedanso spektrai Cole - Cole koordinatėse išmatuoti esant 0 V potencialui vs Ag/AgCI,Clsot.: balti simboliai - membranos suformavimas kelis kartus; juodi simboliai - membranos nuplovimas.picture. Electrochemical impedance spectra in Cole - Cole coordinates measured at 0 V potential vs Ag/AgCI,Clsot.: white symbols - membrane formation several times; black symbols - membrane washing.
DETALUS IŠRADIMO APRAŠYMASDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Atsižvelgiant į tai, kad ankstesnių fosfolipidinių biojutiklių kūrime buvo naudojamas aukso paviršius, kuris nėra optiškai skaidrus, suformuoti alkiltiolių savitvarkiai monosluoksniai ir fosfolipidinės membranos ant aukso paviršių nėra pakankamai stabilūs ir nėra regeneruojami, taip pat įvertinus aukso savikainą, šiam išradimui įgyvendinti buvo parinkti metalų ir nemetalų oksidų paviršiai. Pirmasis privalumas šių medžiagų panaudojime yra tai, kad oksidai plonų plėvelių forma pasižymi aukštu regimosios šviesos ir UV spinduliuotės pralaidumu. Ši savybė leidžia pritaikyti optinius tyrimų metodus biojutiklių kūrime, ko nebuvo galima atlikti su auksiniais paviršiais. Optinių tyrimų metodai praplečia galimas tyrimų sritis ir atveria kelią fosfolipidinės membranas ant kietų paviršių pritaikyti fotosrovę generuojančių sistemų kūrime.Taking into account the fact that the development of previous phospholipid biosensors used a gold surface that is not optically transparent, formed self-assembled monolayers of alkylthiols and phospholipid membranes on gold surfaces are not stable enough and cannot be regenerated, as well as considering the cost of gold, metals and non-metals were selected for the implementation of this invention oxide surfaces. The first advantage in the use of these materials is that the oxides in the form of thin films have a high transmittance of visible light and UV radiation. This property allows the application of optical research methods in the development of biosensors, which could not be done with gold surfaces. Optical research methods expand the possible areas of research and pave the way for the application of phospholipid membranes on solid surfaces in the development of photocurrent generating systems.
Fosfolipidinio biojutiklio formavimui reikalingas savitvarkis monosluoksnis pasižymintis hidrofobiškumu ir gebantis adsorbuoti ir suardyti fosfolipidų vezikules taip, kad susiformuotų vientisas fosfolipidų dvisluoksnis. Au paviršiuje monosluoksnis yra formuojamas naudojant alkiltiolių junginius, kur susidaro kovalentinės Au-S jungtys. Nors susiformavę Au-S ryšiai yra stiprūs, tačiau dėl paviršinių aukso atomų labilumo, monosluoksnio molekulės yra judrios paviršiuje. Esant ilgesniam kontaktui su vandenine terpe (iki keliolikos valandų) retai, po visą paviršių išsidėsčiusios monosluoksnio molekulės suformuoja saleles, o tai trukdo vientiso fosfolipidinio bisluoksnio - fosfolipidinio biojutiklio formavimui. Tuo tarpu, savitvarkio monosluoksnio formavimui ant metalo oksidinių paviršių yra naudojami trichlorosilano (arba trialkoksisilano) funkcinę grupę turintys junginiai. Dėl oksidų paviršiaus chemijos, susiformuoja stiprūs Si-O-metalas kovalentiniai ryšiai, dėl to savitvarkiai monosluoksniai pasižymi aukštu stabilumu (Wasserman S.R. et ai., 1989). Ilgas kontaktas su vandenine terpe ar su kitais fiziniais išoriniais veiksniais menkai veikia arba iš viso neveikia monosluoksnio savybių. Tai suteikia papildomus privalumus oksidinių paviršių panaudojime fosfolipidinių membranų formavimui: membranos ne tik pasižymi aukštu stabilumu ilgą laiko tarpą (keletą dienų), bet ir atsiranda galimybė regeneruoti membranas ant to paties paviršiaus, neblogėjant membranos savybėms.The formation of a phospholipid biosensor requires a self-assembled monolayer characterized by hydrophobicity and capable of adsorbing and breaking down phospholipid vesicles so that a single phospholipid bilayer is formed. A monolayer is formed on the Au surface using alkylthiol compounds, where covalent Au-S bonds are formed. Although the formed Au-S bonds are strong, but due to the lability of the surface gold atoms, the molecules of the monolayer are mobile on the surface. In case of prolonged contact with the aqueous medium (up to several hours), the monolayer molecules spread over the entire surface rarely form islands, which hinders the formation of a solid phospholipid bilayer - a phospholipid biosensor. Meanwhile, for the formation of a self-assembled monolayer on metal oxide surfaces, compounds containing the trichlorosilane (or trihydroxysilane) functional group are used. Due to the surface chemistry of oxides, strong Si-O-metal covalent bonds are formed, due to which self-assembled monolayers are characterized by high stability (Wasserman S.R. et al., 1989). Prolonged contact with aqueous media or other physical external factors has little or no effect on the properties of the monolayer. This provides additional advantages in the use of oxide surfaces for the formation of phospholipid membranes: the membranes not only exhibit high stability over a long period of time (several days), but also the possibility of regenerating the membranes on the same surface without deteriorating the membrane properties.
Taip pat atsižvelgiant į auksinių paviršių paruošimo kainą, metalų ir nemetalų oksidiniai paviršiai yra ženkliai pigesni, o tai yra aktualu siekiant fosfolipidinį biojutiklį toksinų ir kitų membraninių baltymų bei biologiškai aktyvių medžiagų detekcijai pritaikyti komerciniam panaudojimui.Also taking into account the cost of preparing gold surfaces, metal and non-metal oxide surfaces are significantly cheaper, which is relevant in order to apply the phospholipid biosensor for the detection of toxins and other membrane proteins and biologically active substances for commercial use.
Šiame išradime siekiant pritaikyti metalų ir nemetalų oksidus fosfolipidinių biojutiklių formavimui, buvo atsižvelgta į komerciškai prieinamų trichlorosilanų inkarų trūkumą. Remiantis klik-reakcijos chemija, kuri nereikalauja brangios įrangos, buvo atlikta naujų silanų sintezė. Ši metodika yra pranašesnė už jau žinomus sintezės metodus tuo, kad yra paruošiamas ilgagrandžio ir trumpagrandžio silano mišinys, kur savitvarkio monosluoksnio formavimo metu trumpagrandis atskiedžia ilgų inkarų kiekį ant paviršiaus, suformuodamas retai išsidėsčiusį savitvarkį monosluoksnį (angį. sparsely populated). Tai sudaro galimybę susiformuoti paviršiuje prikabintai membranai.In this invention, the lack of commercially available trichlorosilane anchors was taken into account in order to adapt metal and non-metal oxides for the formation of phospholipid biosensors. Based on click-reaction chemistry, which does not require expensive equipment, the synthesis of new silanes has been carried out. This methodology is superior to already known synthesis methods in that a mixture of long-chain and short-chain silane is prepared, where during the formation of a self-organized monolayer, the short chain dilutes the amount of long anchors on the surface, forming a sparsely populated self-organized monolayer. This allows for the formation of a surface-attached membrane.
Sutartiniai žymėjimai:Conventional designations:
EIS - elektrocheminio impedanso spektroskopijaEIS - electrochemical impedance spectroscopy
CV - ciklinė voltamperometrijaCV - cyclic voltammetry
AFM - atominių jėgų mikroskopasAFM - atomic force microscope
SPR - paviršiaus plazmonų rezonansasSPR - surface plasmon resonance
NR - neutronų reflektometrijaNR - neutron reflectometry
SAM - savitvarkis monosluoksnisSAM - self-assembled monolayer
PEG - polietilenglikolisPEG - polyethylene glycol
BMR - branduolių magnetinis rezonansas tBLM - paviršiuje prikabintos fosfolipidinės bisluoksnės membranosNMR - nuclear magnetic resonance tBLM - surface attached phospholipid bilayer membranes
FTO - fluoru legiruotas alavo oksido stiklasFTO - fluorine doped tin oxide glass
ITO - indžio alavo oksidasITO - indium tin oxide
ATS - aliltrichlorsilanasATS - allyltrichlorosilane
TOPS - trichloro(3-(oktadeciltio)propil)silanasTOPS - trichloro(3-(octadecylthio)propyl)silane
ODT - oktadekantiolisODT - Octadecanethiol
DMPA - 2,2-dimetoksi-2- fenilacetofenonasDMPA - 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone
Medžiagos ir metodai:Materials and methods:
Fluoru legiruotas alavo oksido stiklas - FTO, 300 mm χ 300 mm χ 2,2 mmFluorine doped tin oxide glass - FTO, 300 mm χ 300 mm χ 2.2 mm
Indžio alavo oksidas - ITO, 150 mm χ 150 mm χ 0,7 mmIndium tin oxide - ITO, 150 mm x 150 mm x 0.7 mm
Nerūdijantis plienas - NP, 316L lydinys pagal AISI nomenklatūrą: sudėtis: Fe/Cr 18%/Ni 10%/Mo 3%, 150 mm χ 150 mm χ 0,5 mmStainless steel - NP, 316L alloy according to AISI nomenclature: composition: Fe/Cr 18%/Ni 10%/Mo 3%, 150 mm χ 150 mm χ 0.5 mm
Stiklo plokštelė - 25 mm χ 75 mmGlass plate - 25 mm x 75 mm
Trichloro(3-(oktadeciltio)propil)silanas - TOPSTrichloro(3-(octadecylthio)propyl)silane - TOPS
Dejonizuotas vanduo - dejon. H2O)Deionized water - dejon. H2O)
Natrio chloridas - NaCISodium chloride - NaCI
Natrio dihidrofosfatas - NaH2PO4-2H2OSodium dihydrogen phosphate - NaH2PO4-2H2O
Natrio hidroksidas - NaOHSodium hydroxide - NaOH
Aliltrichlorosilanas - H2C=CHCH2SiCl3Allyltrichlorosilane - H2C=CHCH2SiCl3
Oktadekantiolis - CH3(CH2)i7SHOctadecanethiol - CH3(CH2)i7SH
2,2-dimetoksi-2-fenilacetofenonas - C16H16O32,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone - C16H16O3
Heptanas - C7H16Heptane - C7H16
Toluenas - C7H8Toluene - C7H8
Chloroformas - CHChChloroform - CHCh
1,2- dioleoil-3-fosfoglicerocholinas - DOPC1,2-dioleoyl-3-phosphoglycerocholine - DOPC
Cholesterolis - cholCholesterol - chol
Melitinas - mel, iš bičių nuodųMelitin - mel, from bee venom
Alfa hemolizinas - aHL, iš Staphylococcus aureusAlpha hemolysin - aHL, from Staphylococcus aureus
Cholesterolio darinys su merocianino dažu: 2-(1E,3E,5E)-5-(1-(5carboksipentil)-3,3-dimetilindolin-2-iliden)penta-1,3,3-trimetil-3H-indolo bromidu Chol-Cy5Cholesterol derivative with merocyanine dye: 2-(1E,3E,5E)-5-(1-(5carboxypentyl)-3,3-dimethylindolin-2-ylidene)penta-1,3,3-trimethyl-3H-indole bromide Chol -Cy5
UV lempa - 365 nM 5W 13C ir1H BMR spektrai užrašyti prietaisu Bruker Ascend 400 spektrometru (400 MHz dažnis1 H BMR ir 100 MHz-13C NMR), naudojant tirpiklio likučių (CDCI3) signalus.UV lamp - 365 nM 5W 13 C and 1 H NMR spectra were recorded with a Bruker Ascend 400 spectrometer (400 MHz frequency for 1 H NMR and 100 MHz- 13 C NMR), using solvent residue (CDCI3) signals.
Cheminis poslinkis pateikiamas δ skalėje (ppm).The chemical shift is given on the δ scale (ppm).
EIS matavimai atlikti potenciostatu/galvanostatu pAutolab Type III su instaliuota programine įranga FRA. Matavimai buvo vykdomi standartinėje trijų elektrodų celėje, kurioje darbinis elektrodas - metalo oksidinis paviršius (darbinis plotas 0,32 cm2), palyginamasis - Ag/AgCI, Chsot., pagalbinis - platinos viela. Elektrocheminiams matavimams naudojamas fosfatinis buferinis tirpalas susidėjo iš 0,01 M NaH2PO4 ir 0,1 M NaCI, naudojantis NaOH pH koreguojamas iki 7,1 vertės.EIS measurements were performed on a potentiostat/galvanostat pAutolab Type III with installed software FRA. The measurements were carried out in a standard three-electrode cell, in which the working electrode is a metal oxide surface (working area 0.32 cm 2 ), the reference electrode is Ag/AgCI, Chsot., and the auxiliary electrode is a platinum wire. The phosphate buffer solution used for electrochemical measurements consisted of 0.01 M NaH2PO4 and 0.1 M NaCl, with pH adjusted to 7.1 using NaOH.
Fluorescencinė mikroskopija buvo atlikta naudojantis Olympus BX61WI fluorescenciniu mikroskopu, į vandenį įmerkiamu objektyvu UMPIanFN-W (10X/0.30 NA) ir Qimaging EXi Aqua kamera. Hg lempa ir Olympus U-MWG2 filtras buvo naudojami nustatyti Chol-Cy5 paviršinį pasiskirstymą. Stiklo plokštelės buvo pritvirtintos ant Petri lėkštelių dugno ir, prieš nuotraukų registravimą, vezikulių tirpalas buvo pilnai išplaunamas iš sistemos su švariu PBS pH 7,1.Fluorescence microscopy was performed using an Olympus BX61WI fluorescence microscope, a UMPIanFN-W water immersion objective (10X/0.30 NA) and a Qimaging EXi Aqua camera. A Hg lamp and an Olympus U-MWG2 filter were used to determine the surface distribution of Chol-Cy5. Glass slides were mounted on the bottom of Petri dishes and the vesicle solution was completely washed out of the system with clean PBS pH 7.1 before recording the images.
IŠRADIMO REALIZAVIMO PAVYZDŽIAI pavyzdysEXAMPLES OF IMPLEMENTATION OF THE INVENTION example
1. TOPS junginio sintezė atliekama klik-reakcijos mechanizmu (TuckerSchwartz A. K. etai., 2011). ATS irODT yra sumaišomi moliniu santykiu 2:1 skaidriame mėgintuvėlyje. Įdedama 2 mol% DMPA iniciatoriaus ir maišoma ant magnetinės maišyklės kol gaunamas homogeninis mišinys. Šis mišinys yra apšvitinamas 365 nm bangos ilgio 5 W galingumo UV lempa 24 vai. Po šios sintezės procedūros turime paruoštą naudoti silanizavimo mišinį (TOPS:ATS 1:1) SAM formavimui. TOPS:ATS 1:1 mišinys laikomas suvyniotas į aliuminio foliją, kad būtų išvengta tiesioginių saulės spindulių, kurių poveikis galimai mažina susintetinto mišinio cheminį aktyvumą.1. The synthesis of the TOPS compound is carried out by a click-reaction mechanism (TuckerSchwartz A.K. etai., 2011). ATS and ODT are mixed in a molar ratio of 2:1 in a clear tube. 2 mol% DMPA initiator is added and stirred on a magnetic stirrer until a homogeneous mixture is obtained. This mixture is irradiated with a 365 nm wavelength 5 W UV lamp for 24 hours. After this synthesis procedure, we have a ready-to-use silanization mixture (TOPS:ATS 1:1) for SAM formation. The TOPS:ATS 1:1 mixture is kept wrapped in aluminum foil to avoid direct sunlight, which may reduce the chemical activity of the synthesized mixture.
2. Prieš membranos formavimą, FTO dengta stiklo plokštelė buvo supjaustoma į 25 mm χ 10 mm dydžio elektrodus ir atliekama plovimo procedūra. Ultragarsinėje vonelėje plaunama 2 skirtingose terpėse po 10 min: (i) 2% „Micro 90“ tirpale; (ii) dejonizuotame vandenyje. Toliau, FTO plokštelė 1 vai. yra inkubuojama kone. H2SO4, po to skalaujama dejon. H2O ir laikoma 2-propanolyje ultragarso vonelėje 10 min. Paskutiniame žingsnyje, FTO yra laikomas dejon. H2O apytikriai 18-20 vai. (per naktį) ir išdžiovinamas N2 dujų sraute.2. Before the formation of the membrane, the FTO-coated glass plate was cut into 25 mm × 10 mm size electrodes and a washing procedure was performed. Washing in an ultrasonic bath in 2 different media for 10 min each: (i) 2% Micro 90 solution; (ii) in deionized water. Next, FTO plate 1 vai. is incubated for approx. H2SO4, followed by a deion rinse. H2O and kept in 2-propanol in an ultrasonic bath for 10 min. In the final step, the FTO is held in dejon. H2O approximately 18-20 years. (overnight) and dried under a stream of N2 gas.
3. Paruoštas mėginys toliau naudojamas SAM formavimo - silanizavimo procedūroje. 20 ml heptano (ar kito sotaus alkano) nedidelėje stiklinėje kaitinama iki 60°C ir įpilama 30 pi susintetinto TOPS:ATS mišinio. Tada elektrodas įstatomas vertikalioje padėtyje į maišomą silanizavimo tirpalą 1 vai. 60°C temperatūroje. Po to mėginys nuplaunamas švariu heptanu, išdžiovinamas N2 dujų sraute ir iškaitinamas 100°C temperatūroje 1 valandą.3. The prepared sample is further used in the SAM formation - silanization procedure. 20 ml of heptane (or other saturated alkane) is heated to 60°C in a small beaker and 30 pi of the synthesized TOPS:ATS mixture is added. Then the electrode is inserted in a vertical position into the stirred silanization solution for 1 minute. at a temperature of 60°C. After that, the sample is washed with clean heptane, dried in a stream of N2 gas and heated at 100°C for 1 hour.
4. tBLM formavimas atliekamas naudojant vezikulių liejimo metodą (1 pav.) (patentas nr. LT6424B (2017)). Paruošiami lipidų 10 mM tirpalai chloroforme, kurie laikomi -20°C temperatūroje. Į kitą indą paimamas toks kiekis tirpalo, kad būtų paruošiama 1 mM koncentracijos norimo tūrio tirpalas. Chloroformas yra išgarinamas azoto dujų srove (pučiama apie 30 min), kol ant indo dugno lieka baltos spalvos lipidinė plėvelė. Ji užpilama buferiniu tirpalu, kurio pH - 4,4, o sudėtis yra 0,1 M NaH2PO4 ir 0,01 M NaCI. Į tirpalą yra merkiama automatinė pipetė, ir kartojami įtraukimo ir išstūmimo ciklai, kol lipidinė plėvelė atšoka nuo sienelių, ji soliubilizuojasi ir susidaro homogeninis tirpalas.4. The formation of tBLM is performed using the vesicle casting method (Figure 1) (Patent No. LT6424B (2017)). 10 mM solutions of lipids in chloroform are prepared and stored at -20°C. In another vessel, such amount of solution is taken to prepare a solution with a concentration of 1 mM in the desired volume. Chloroform is evaporated with a stream of nitrogen gas (blow for about 30 min) until a white lipid film remains on the bottom of the container. It is filled with a buffer solution with a pH of 4.4 and a composition of 0.1 M NaH2PO4 and 0.01 M NaCl. An automatic pipette is dipped into the solution, and cycles of insertion and ejection are repeated until the lipid film bounces off the walls, solubilizes, and forms a homogeneous solution.
pavyzdysexample
Atliekama taip pat kaip aprašyta 1 pavyzdyje, tik 3 punkte silanizavimas atliekamas aromatiniame tirpiklyje (pvz., toluene) (2 pav.), tačiau galima naudoti ir benzeną.It is carried out in the same way as described in Example 1, only in point 3 the silanization is carried out in an aromatic solvent (eg toluene) (Figure 2), but benzene can also be used.
pavyzdysexample
Atliekama taip pat kaip aprašyta 1 pavyzdyje, tik 2 punkte naudojamas:It is carried out in the same way as described in example 1, only in point 2 it is used:
(i) ITO stiklas (3 pav.), tačiau galima naudoti ir kitais oksidais dengtą stiklo plokštelę: kadmio alavo oksidą (CdSnO4), cinko oksidą (ZnO), aliuminiu legiruoto cinko oksidą (AI:ZnO), stibio alavo oksidą (SnO2/Sb2Os), indžio stibio oksidą (InSbO), galio cinko oksidą (GaZnO), indžio cinko oksidą (InZnO), stibio indžio alavo oksidą (InSbSnO), indžio galio cinko oksidą (InGaZnO), bismuto selenitą (Bi2SeOs), itrio bario kupratą, metalų oksidų perovskitus;(i) ITO glass (Figure 3), but it is also possible to use a glass plate coated with other oxides: cadmium tin oxide (CdSnO4), zinc oxide (ZnO), aluminum doped zinc oxide (AI:ZnO), antimony tin oxide (SnO2/ Sb2Os), indium antimony oxide (InSbO), gallium zinc oxide (GaZnO), indium zinc oxide (InZnO), indium indium tin oxide (InSbSnO), indium gallium zinc oxide (InGaZnO), bismuth selenite (Bi2SeOs), yttrium barium cuprate, metal oxide perovskites;
(ii) stiklo plokštelė (4 pav.), tačiau galima ir naudoti ir spalvotą stiklą, kvarcą, safyrą, žėrutį;(ii) glass plate (Figure 4), but it is also possible to use colored glass, quartz, sapphire, mica;
(iii) nerūdijantis plienas (5 pav.), tačiau galima naudoti ir aliuminį, titaną, varį, nikelį, nikelio-titano lydinius, kobaltą ir kobalto lydinius;(iii) stainless steel (Figure 5), but aluminium, titanium, copper, nickel, nickel-titanium alloys, cobalt and cobalt alloys can also be used;
(iv) garinto Ti/TiO2 plokštelė (6 pav.), tačiau galima naudoti ir garinto Zn/ZnO, Zr/ZrO2, Cr/CrxOy plokšteles;(iv) vaporized Ti/TiO2 plate (Figure 6), but vaporized Zn/ZnO, Zr/ZrO2, Cr/CrxOy plates can also be used;
(v) Si/SiO2 plokštelė (7 pav.), tačiau galima ir naudoti ir Ge/Ge02.(v) Si/SiO2 wafer (Figure 7), but Ge/GeO2 can also be used.
pavyzdysexample
Atliekama, kaip aprašyta 1 pavyzdyje, tik stebima DOPC/Chol 6:4 ir DOPC membranos pažaida su skirtingų koncentracijų baltymais - poras formuojančiais toksinais: (i) melitinu (8 ir 9 pav.); (ii) alfa-hemolizinu (11 ir 12 pav.), sudaromos fosfolipidinio biojutiklio kalibracinės kreivės - membranos laidumo pokyčio priklausomybės nuo toksino koncentracijos (10 ir 13 pav.) pavyzdysIt is carried out as described in example 1, only the membrane damage of DOPC/Chol 6:4 and DOPC with different concentrations of proteins - pore-forming toxins is observed: (i) melittin (Figures 8 and 9); (ii) with alpha-hemolysin (Figures 11 and 12), the calibration curves of the phospholipid biosensor are created - an example of the dependence of the change in membrane conductance on the concentration of the toxin (Figures 10 and 13)
Atliekama, kaip aprašyta 1 pavyzdyje, tik stebimas fosfolipidinio bisluoksnio pašalinimas ir pakartotinis suformavimas ant to paties paviršiaus keletą kartų (14 pav.).This is done as described in Example 1, only observing the removal and re-formation of the phospholipid bilayer on the same surface several times (Figure 14).
Pateikti pavyzdžiai parodo, kad pasitelkiant klik-reakcijos cheminį procesą galima susintetinti naudojimui tinkamą silanų mišinį, į kurį įmerkus metalo oksidini paviršių, pavyzdžiui stiklo plokštelę padengtą FTO sluoksniu, arba ITO sluoksniu, arba gryno stiklo, spalvoto stiklo, kvarco, safyro plokštelę, žėrutį, arba nerūdijantį plieną, aliuminį, titaną, varį, nikelį, nikelio-titano lydinį, kobalto ir kobalto lydinį, arba garinto Ti/TiO2 plokštelę, arba Si/SiO2 plokštelę, arba kitą metalo ar puslaidininkio gaminį padengtą oksidu, pvz., kadmio alavo oksidą (CdSnO4), cinko oksidą (ZnO), aliuminiu legiruotą cinko oksidą (AI:ZnO), stibio alavo oksidą (SnO2/Sb2Os), indžio stibio oksidą (InSbO), galio cinko oksidą (GaZnO), indžio cinko oksidą (InZnO), stibio indžio alavo oksidą (InSbSnO), indžio galio cinko oksidą (InGaZnO), bismuto selenitą (Bi2SeOs), itrio bario kupratą, perovskitą, gaunamas inkarinis monosluoksnis, tinkamas paviršiuje imobilizuotų membranų, tBLM, prikabinimui daugiasluoksnių vezikulių liejimo metodu, aprašytu patente Nr. LT6424B (2017). tBLM sudėtis gali būti lengvai varijuojama priklausomai nuo su membrana sąveikaujančio ir įsiterpiančio į membraną poras formuojančio baltymo-toksino, taip pat gaunami tBLM gali būti lengvai regeneruojami neprarandant funkcinių tBLM savybių. Sukurti fosfolipidiniai biojutikliai yra tinkami toksinų koncentracijos nustatymui, naudojant kalibracinę kreivę, pvz., membranos laidumo pokyčio priklausomybė nuo toksino koncentracijos.The presented examples show that by using the click-reaction chemical process, it is possible to synthesize a mixture of silanes suitable for use, into which a metal oxide surface, such as a glass plate covered with an FTO layer or an ITO layer, or pure glass, colored glass, quartz, sapphire plate, mica, or stainless steel, aluminum, titanium, copper, nickel, nickel-titanium alloy, cobalt-cobalt alloy, or evaporated Ti/TiO2 wafer, or Si/SiO2 wafer, or other oxide-coated metal or semiconductor product, such as cadmium tin oxide (CdSnO4), zinc oxide (ZnO), aluminum alloyed zinc oxide (AI:ZnO), antimony tin oxide (SnO2/Sb2Os), indium antimony oxide (InSbO), gallium zinc oxide (GaZnO), indium zinc oxide (InZnO), antimony indium tin oxide (InSbSnO), indium gallium zinc oxide (InGaZnO), bismuth selenite (Bi2SeOs), yttrium barium cuprate, perovskite, an anchor monolayer is obtained, suitable for attachment of surface-immobilized membranes, tBLM, by the multilayer vesicle casting method described in patent no. LT6424B (2017). The composition of tBLMs can be easily varied depending on the pore-forming protein-toxin that interacts with the membrane and inserts into the membrane, and the resulting tBLMs can be easily regenerated without losing the functional properties of tBLMs. The developed phospholipid biosensors are suitable for the determination of toxin concentration using a calibration curve, such as the dependence of the change in membrane conductance on toxin concentration.
LiteratūraLiterature
1. Castellana E. T, Cremer P. S., Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design, Surface Science Reports 61 (2006) 429-444.1. Castellana E. T, Cremer P. S., Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design, Surface Science Reports 61 (2006) 429-444.
2. Eicher-Lorka O., Charkovą T., Matijoška A., Kuodis Z., Urbelis G., Penkauskas T., Mickevičius M., Bulovas A., Valincius G., Cholesterol-based tethers and markers for model membranes investigation, Chemistry and Physics of Lipids 195 (2016) 71-86.2. Eicher-Lorka O., Charkovą T., Matijoška A., Kuodis Z., Urbelis G., Penkauskas T., Mickevičius M., Bulovas A., Valincius G., Cholesterol-based tethers and markers for model membranes investigation , Chemistry and Physics of Lipids 195 (2016) 71-86.
3. Junghans A., Koper I., Structural Analysis of Tethered Bilayer Lipid Membranes, Langmuir 26 (2010) 11035-11040.3. Junghans A., Koper I., Structural Analysis of Tethered Bilayer Lipid Membranes, Langmuir 26 (2010) 11035-11040.
4. McGillivray D. J., Valincius G., Vanderah D. J., Febo-Ayala W., Woodward J. T, Heinrich F., Kasianowicz J. J., Losche M., Molecular-scale structural and functional characterization of sparsely tethered bilayer lipid membranes, Biointerphases 2 (2007) 21-33.4. McGillivray D. J., Valincius G., Vanderah D. J., Febo-Ayala W., Woodward J. T, Heinrich F., Kasianowicz J. J., Losche M., Molecular-scale structural and functional characterization of sparsely tethered bilayer lipid membranes, Biointerphases 2 (2007) 21-33.
5. Plant A.L., Supported Hybrid Bilayer Membranes as Rugged Cell Membrane Mimics, Langmuir 15 (1999) 5128-5135.5. Plant A.L., Supported Hybrid Bilayer Membranes as Rugged Cell Membrane Mimics, Langmuir 15 (1999) 5128-5135.
6. Ragaliauskas T., Mickevičius M., Rakovska B., Penkauskas T., Vanderah D. J., Heinrich F., Valincius G., Fast formation of low-defect-density tethered bilayers by fusion of multilamellar vesicles. Biochimica et Biophysica Acta 1859 (2017) 669678.6. Ragaliauskas T., Mickevičius M., Rakovska B., Penkauskas T., Vanderah D.J., Heinrich F., Valincius G., Fast formation of low-defect-density tethered bilayers by fusion of multilamellar vesicles. Biochimica et Biophysica Acta 1859 (2017) 669678.
7. Rakovska B. Ragaliauskas, T., Mickevičius, M., Jankunec, M., Niaura, G., Vanderah, D.J., Valincius G.. Structure and Function of Membrane Anchoring SelfAssembled Monolayers. Langmuir, 31, (2015) 846-8577. Rakovska B. Ragaliauskas, T., Mickevičius, M., Jankunec, M., Niaura, G., Vanderah, D.J., Valincius G.. Structure and Function of Membrane Anchoring Self-Assembled Monolayers. Langmuir, 31, (2015) 846-857
8. Tucker-Schwartz A. K., Farrell R. A., Garrell R. L., Thiol-ene Click Reaction as a General Route to Functional Trialkoxysilanes for Surface Coating Applications, Journal of American Chemical Society 133 (2011) 11026-11029.8. Tucker-Schwartz A.K., Farrell R.A., Garrell R.L., Thiol-ene Click Reaction as a General Route to Functional Trialkoxysilanes for Surface Coating Applications, Journal of American Chemical Society 133 (2011) 11026-11029.
9. Wasserman S. R., Tao Y. T., Whitesides G. M., Structure and Reactivity of Alkylsiloxane Monolayers Formed by Reaction of Alkyltrichlorosilanes on Silicon Substrates, Langmuir, 5 (1989) 1074-1087.9. Wasserman S. R., Tao Y. T., Whitesides G. M., Structure and Reactivity of Alkylsiloxane Monolayers Formed by Reaction of Alkyltrichlorosilanes on Silicon Substrates, Langmuir, 5 (1989) 1074-1087.
Claims (9)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LT2021533A LT6992B (en) | 2021-06-30 | 2021-06-30 | Regenerative phospholipid biosensor on silanized oxides surface |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LT2021533A LT6992B (en) | 2021-06-30 | 2021-06-30 | Regenerative phospholipid biosensor on silanized oxides surface |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| LT2021533A LT2021533A (en) | 2023-01-10 |
| LT6992B true LT6992B (en) | 2023-04-25 |
Family
ID=84777461
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| LT2021533A LT6992B (en) | 2021-06-30 | 2021-06-30 | Regenerative phospholipid biosensor on silanized oxides surface |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| LT (1) | LT6992B (en) |
-
2021
- 2021-06-30 LT LT2021533A patent/LT6992B/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| LT2021533A (en) | 2023-01-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lingler et al. | Fusion of small unilamellar lipid vesicles to alkanethiol and thiolipid self-assembled monolayers on gold | |
| Lukkari et al. | Organic thiosulfates (bunte salts): novel surface-active sulfur compounds for the preparation of self-assembled monolayers on gold | |
| Ron et al. | Self-assembled monolayers on oxidized metals. 3. Alkylthiol and dialkyl disulfide assembly on gold under electrochemical conditions | |
| US7169272B2 (en) | Microfabricated recessed disk microelectrodes: characterization in static and convective solutions | |
| Bandyopadhyay et al. | Self-assembled monolayers of small aromatic disulfide and diselenide molecules on polycrystalline gold films: a comparative study of the geometrical constraint using temperature-dependent surface-enhanced Raman spectroscopy, X-ray photoelectron spectroscopy, and electrochemistry | |
| JPS6188137A (en) | Method and device for determining the concentration of chemical species in an aqueous electrolyte solution | |
| Lang et al. | Self-assembly of thiolipid molecular layers on gold surfaces: optical and electrochemical characterization | |
| Creczynski-Pasa et al. | Self-assembled dithiothreitol on Au surfaces for biological applications: phospholipid bilayer formation | |
| Anh et al. | Highly Sensitive Nonenzymatic Cholesterol Sensor Based on Zinc Oxide Nanorods: Anh, Lan, LT Tam, Pham, and PD Tam | |
| McKenzie et al. | Nanoporous iron oxide membranes: layer-by-layer deposition and electrochemical characterisation of processes within nanopores | |
| WO2019238589A1 (en) | A method and device for assaying the interaction and dynamics of permeation of a molecule and a lipid bilayer | |
| Jadhav et al. | Fabrication of highly insulating tethered bilayer lipid membrane using yeast cell membrane fractions for measuring ion channel activity | |
| Ariga | Organized Organic Ultrathin Films: Fundamentals and Applications | |
| Lazzara et al. | Separating attoliter-sized compartments using fluid pore-spanning lipid bilayers | |
| Labbé et al. | Electrode‐supported and free‐standing bilayer lipid membranes: Formation and uses in molecular electrochemistry | |
| US8821957B2 (en) | Method for depositing a nanometric thin film on a substrate | |
| JP2011185874A (en) | Kit for analyzing biomolecules and method for analyzing biomolecules using the same | |
| WO2003051506A1 (en) | Membrane | |
| Aleknavičienė et al. | Electrochemical properties of tethered lipid bilayers on thin film silver substrates | |
| EP4283305A1 (en) | Regenerable phospholipid biosensor and method for its fabrication on the surface of silanized oxides | |
| CN120254271A (en) | A confined composite nanozyme-enhanced electrochemiluminescence immunosensor for detecting tumor necrosis factor and its construction method and application | |
| JP2002346999A (en) | Functional nanostructure and molecular device using the same | |
| Ha et al. | Formation and characterization of supported hexadecanethiol/dimyristoyl phosphatidylcholine hybrid bilayers containing Gramicidin D | |
| Wieckowska et al. | Ultrasmall Au nanoparticles coated with hexanethiol and anthraquinone/hexanethiol for enzyme-catalyzed oxygen reduction | |
| Fliniaux et al. | Production of microporous aluminum oxide electrodes as supports for tethered lipid bilayers of large surface area |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB1A | Patent application published |
Effective date: 20230110 |
|
| FG9A | Patent granted |
Effective date: 20230425 |