LT5705B - Monoclonal antibodies against vaginolysin - Google Patents
Monoclonal antibodies against vaginolysin Download PDFInfo
- Publication number
- LT5705B LT5705B LT2009012A LT2009012A LT5705B LT 5705 B LT5705 B LT 5705B LT 2009012 A LT2009012 A LT 2009012A LT 2009012 A LT2009012 A LT 2009012A LT 5705 B LT5705 B LT 5705B
- Authority
- LT
- Lithuania
- Prior art keywords
- vaginolysin
- monoclonal antibodies
- hybridoma
- monoclonal antibody
- hybridomas
- Prior art date
Links
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 57
- 241000207201 Gardnerella vaginalis Species 0.000 claims abstract description 29
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 17
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 9
- 208000004926 Bacterial Vaginosis Diseases 0.000 claims description 5
- 208000037009 Vaginitis bacterial Diseases 0.000 claims description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 9
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 abstract description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 22
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 22
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 22
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 17
- 101710183389 Pneumolysin Proteins 0.000 description 17
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 16
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 13
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 10
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 6
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 6
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 5
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 5
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 4
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 3
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 3
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000003508 Botulism Diseases 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700027766 Listeria monocytogenes hlyA Proteins 0.000 description 2
- 108010011834 Streptolysins Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 2
- 108010075210 streptolysin O Proteins 0.000 description 2
- HYCKBFLTZGORKA-HNPMAXIBSA-N 3,7-dihydropurin-6-one;1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2.O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 HYCKBFLTZGORKA-HNPMAXIBSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 101000654311 Androctonus australis Alpha-mammal toxin AaH2 Proteins 0.000 description 1
- 101000583076 Anemonia sulcata Delta-actitoxin-Avd1c Proteins 0.000 description 1
- 241001135699 Arcanobacterium Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100022002 CD59 glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 208000004145 Endometritis Diseases 0.000 description 1
- 206010017711 Gangrene Diseases 0.000 description 1
- 241000207202 Gardnerella Species 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 101000761697 Hemachatus haemachatus Short neurotoxin 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000588937 Heteractis magnifica Delta-stichotoxin-Rpa1a Proteins 0.000 description 1
- 101000897400 Homo sapiens CD59 glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- 206010024641 Listeriosis Diseases 0.000 description 1
- 208000004852 Lung Injury Diseases 0.000 description 1
- 208000032376 Lung infection Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000029082 Pelvic Inflammatory Disease Diseases 0.000 description 1
- 108010056995 Perforin Proteins 0.000 description 1
- 102000004503 Perforin Human genes 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 201000007100 Pharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 241001674048 Phthiraptera Species 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 208000005107 Premature Birth Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108010079723 Shiga Toxin Proteins 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- 101000640206 Tityus serrulatus Alpha-mammal toxin Ts2 Proteins 0.000 description 1
- 206010069363 Traumatic lung injury Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000011997 immunoflourescence assay Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 231100000515 lung injury Toxicity 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 231100000255 pathogenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 201000003068 rheumatic fever Diseases 0.000 description 1
- 239000002795 scorpion venom Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Šis išradimas priskirtinas baltymų biotechnologijos sričiai. Jo esmė - naujų monokloninių antikūnų prieš vaginoliziną, kurie neutralizuoja vaginolizino biologinį aktyvumą, sukūrimas.
Nuo cholesterolio priklausantys citolizinai priklauso didelei poras formuojančiai toksinų šeimai, kuriuos gamina daugiau negu 20 rūšių mikroorganizmų iš Clostridium, Streptococcus, Listeria, Arcanobacterium, Bacillus ir kitų genčių. Šie toksinai (dažnai vadinami citolizinais ar hemolizinais) susiję su dermatologinėmis infekcijomis (streptolizinas O, piolizinas), ūmia karštine, reumatine karštine, faringitu (streptolizinas O), plaučių infekcijomis (pneumolizinas), listerioze (listeriolizinas O), dalyvauja įvairių pneumokokinių sindromų patogenezėje (pneumolizinas) bei pirminiame audimų pažeidimo etape, kuris vėliau vystosi į dujinę gangreną (perfingolizinas O). Manoma, jog šie toksinai rišasi su šeimininkų ląstelių membranose esančiu cholesteroliu, oligomerizuojasi, įsiterpia į membranas, ir membrana tokiu būdu pažeidžiama. Be to, šie citolizinai dalyvauja procesuose, susijusiuose su citokinų sekrecijos ir kitų imuninės sistemos moduliatorių indukcija. Taigi, šie citolizinai yra vieni pagrindinių virulentiškumo faktorių, vystantis infekcijai, sukeltai minėtų bakterijų [Tweten R. K. Infect. Immun., 2005, 73, pp. 6199— 6209].
Vaginolizinas (VLY) yra baltyminis toksinas, kurį gamina bakterijos Gardnerella vaginalis. Šis baltymas priskiriamas nuo cholesterolio priklausančių citolizinų šeimai. Vaginolizino toksinis poveikis pasireiškia tuo, kad jis, kaip ir kiti šios šeimos toksinai suformuoja poras ląstelės membranoje ir lizuoja žmogaus ląsteles.
Gardnerella vaginalis yra žinomas kaip bakterinės vaginozės (BV) sukėlėjas, o vaginolizinas yra vienas pagrindinių šios bakterijos virulentiškumo faktorių [Cauci S, Monte M, Ropele C et ak, Mol Microbiol, 1993, 9, pp. 53-58]. BV yra dažnai pasitaikantis susirgimas, susijęs su daugeliu sveikatos problemų, pvz., priešlaikiniu gimdymu, o tai susiję su mažesniu naujagimių svoriu, įtakojančiu naujagimių mirštamumą ir sergamumą. B V taip pat susijusi su dubens organų uždegimais, pogimdyminiais endometritais ir kitais infekciniais susirgimais. Taigi, vaginolizino neutralizacija naudojant antikūnus gali būti efektyvus terapijos būdas, kovojant su Gardnerella vaginalis infekcijos patogeniniu poveikiu.
1993 m. aprašytas apsaugančių, toksinus neutralizuojančių žmogaus monokloninių antikūnų sukūrimas. Buvo pagaminta keletas monokloninių antikūnų prieš stabligės toksiną ir buvo stebėtas jų apsaugojamasis efektas [Lang et ei., J. Immunol. 1993,151, pp. 466-472], Tačiau skiriant šių toksinų kombinacijas, buvo pastebėtas sinergistinis efektas. Toks pats efektas buvo nustatytas, neutralizuojant botulizmo toksiną. Antikūnai prieš botulizmo toksiną buvo gauti, panaudojant fagų eksponavimo (angį. phage-display) bibliotekas, pagamintas iš žmogaus ar imunizuotos pelės ląstelių DNR [Brekke and Sandlie, Nat.Rev. Drug Discov. 2002, 2, pp. 52-62], Neseniai buvo gauti pelės monokloniniai antikūnai prieš pneumoliziną ir patikrintas jų efektyvumas, panaudojant gyvūnų modelius [Garsia-Suarez et ak, Infect. Immun. 2004, 72, pp. 4534-4540], Ispanų mokslininkų grupė paskelbė, jog pagamino pelės neutralizuojančius antikūnus PLY5, kurie atpažįsta daugelį citolizinų. Parodyta, jog pastarieji antikūnai gauti prieš specifinį epitopą - undekapeptidą. Šis antikūnas inhibuoja toksinų susirišimą su ląstelės membranomis, nes epitopas tampa „neprieinamas“ [Jacobs et ak, FEBS Lett. 1999,459, pp. 463-466],
Antikūnai tapo patrauklūs kaip biofarmaciniai preparatai, kadangi įvyko žymūs technologiniai poslinkiai antikūnų konstravimo, jų humanizavimo srityje. Pastaruoju metu buvo labai supaprastintos tokios technologijos, kaip genų, koduojančių žmogaus imunoglobulinų variabiliąsias sritis, klonavimas, jų ekspresija E. coli ir fagų eksponavimo panaudojimas imunoglobulinų variabiliųjų rajonų selekcijai. Maynard ir kolegos pagamino didelio afiniškumo antikūnus prieš Bacillus anthracis [Maynard et ak, Nature Biotechnol. 2002, 30, pp. 597-601], Šie antikūnai buvo sudaryti iš fragmentų, gautų iš pelės imunoglobulino (IgG) variabiliosios srities ir ekspresuotų E. coli kaip viengrandžiai Fv fragmentai (scFv). Jei scFv buvo leidžiami pelei, prieš juodligės toksino injekciją, tai buvo stebėtas apsauginis efektas prieš šį toksiną. Neutralizuojantys žmogaus antikūnai prieš Shiga toksiną 1 buvo neseniai gauti, panaudojant transgenines peles [Mukherjee et ai., Infect. Immun. 2002, 70, pp. 5896-5899]. Dešimt skirtingų IgM ir IgGl klasės antikūnų, kurie buvo specifiški skirtingiems subvienetams, efektyviai neutralizavo toksiną. Taip pat buvo sukurtas viengrandis scFv antikūnas, kuris neutralizavo skorpiono nuodų toksiną II [Mousli et.al., FEBS Lett. 1999,442 pp. 183-188],
Naudojant genų inžinerijos metodus, buvo gautas rekombinantinis vaginolizinas, kuris buvo panaudotas šio toksino veikimo mechanizmo tyrimams [Gelber SE, Aguilar JL, Lewis KLT et ai., J Bacterioį, 2008, 190, pp. 3896-3903].
Yra aprašyti monokloniniai antikūnai prieš bakterijų Streptococcus pneumoniae toksiną pneumoliziną (PLY) [EP0687688, publ. 1995; Toyos JR, Mendez FJ, Aparico JF et ai., Infect Immun, 1996, 64, pp.480-484; Garcia-Suarez MM, Cima-Cabal MD, Florez N et ai., lnfect Immun, 2004, 72, pp. 4534-4540], Šis toksinas, kaip ir vaginolizinas, yra nuo cholesterolio priklausančių citolizinų šeimos narys, tačiau jis skiriasi nuo vaginolizino pagal struktūrą veikimo mechanizmą ir kitas savybes. Buvo sukurti 9 monokloniniai antikūnai prieš pneumoliziną (PLY-1 - PLY-9), iš kurių 3 pasižymėjo neutralizuojančiu aktyvumu, t.y. šie antikūnai blokavo pneumolizino biologinį veikimą tiek in vitro, tiek in vivo. Naudojant pelių modelį buvo parodyta, kad 2 iš minėtų neutralizuojančių antikūnų (PLY-4 ir PLY-7) apsaugojo peles nuo bakteriemijos ir plaučių pažeidimo Streptococcus pneumoniae infekcijos metu bei neutralizavo išgryninto pneumolizino letalų toksinį poveikį. Aprašyti PLY-1 - PLY-9 analogai - monokloniniai antikūnai 26-5F12, 26-23C2, 22-6E6 prieš pneumoliziną kurie neutralizavo pneumolizino hemolitinį aktyvumą [W02006021210, publ. 2006],
Aprašyti monokloniniai antikūnai prieš streptoliziną (SLO) ir jo variantus [WO9305152, publ. 1993],
Literatūroje taip pat aprašyti monokloniniai antikūnai prieš bakterijų Listeria monocytogenes toksinąlisterioliziną(LLO) [Edelson TB, Cossart P, Unanue ER, J Immunol, 1999, 163, pp. 4087-4890; Edelson TB, Unanue ER, Immunity, 14, pp. 503-512]. Listeriolizinas yra toksinas, formuojantis poras ląstelės membranoje. Tai pagrindinis bakterijų Listeria monocytogenes virulentiškumo faktorius, kurio dėka šios bakterijos išvengia fagocitozės, t.y. šeimininko imuninio atsako. Buvo sukurti monokloniniai antikūnai A4-8 prieš listerioliziną kurie neutralizavo jo biologinį veikimą in vitro (porų formavimą ląstelės membranoje) ir in vivo. Naudojant pelių modelį buvo parodyta, kad antikūnai A4-8 padidino pelių atsparumą Listeria monocytogenes infekcijai, stabdė šių bakterijų replikaciją ir apsaugojo nuo letalios infekcijos.
Aprašytieji pavyzdžiai iliustruoja, kad neutralizuojantys monokloniniai antikūnai prieš bakterijų citolizinus gali turėti potencialų terapinį pritaikymą gydant pavojingas bakterines infekcijas.
Literatūroje nėra rasta duomenų apie monokloninius antikūnus prieš bakterijų Gardnerella vaginalis toksiną vaginoliziną Aprašytieji analogai buvo sukurti prieš kitus toksinus, kurie priskiriami tai pačiai poras formuojančių citolizinų šeimai, tačiau funkciškai ir struktūriškai skiriasi nuo vaginolizino.
Išradimo uždavinys buvo sukurti efektyvią priemonę, skirtą vaginolizino nustatymui bei vaginolizino citolitinio aktyvumo blokavimui. Problema gali būti išspręsta, gavus naujus monokloninius antikūnus prieš bakterijų Gardnerella vaginalis toksiną vaginoliziną, kurie reaguotų su natyviu vaginolizinu ir neutralizuotų jo sugebėjimą sukelti ląstelių ližę. Tokie antikūnai galėtų būti panaudoti diagnostiniais tikslais, o jų pagrindu sukurti biofarmaciniai preparatai - profilaktiniais bei terapiniais tikslais.
Išradime siūlomos sukurtos naujos 3 hibridomų linijos, produkuojančios monokloninius antikūnus prieš vaginoliziną. Atlikti tyrimai parodė, kad sukurtieji monokloniniai antikūnai reaguoja tiek su rekombinantiniu vaginoiizinu sintetinamu E.coli bakterijose, tiek su natyviu vaginolizinu iš bakterijų Gardnerella vaginalis. Taip pat buvo parodyta, kad sukurtieji monokloniniai antikūnai neutralizuoja vaginolizino biologinį veikimą in vitro - blokuoja vaginolizino sukeltą žmogaus eritrocitų ližę. Du iš naujai sukurtų monokloninių antikūnų (9B4 ir 23A2) pasižymėjo stipresniu neutralizuojančiu poveikiu, vienas - silpnesniu (3G1). Šiame išradime siūlomi monokloniniai antikūnai yra nauji ir skiriasi nuo analogų iš kitų šaltinių bei aukščiau aprašytų monokloninių antikūnų.
Siekiant sukurti naujus monokloninius antikūnus prieš vaginoliziną, buvo panaudotas rekombinantinis vaginolizinas ir atliktos įprastos, žinomos šios srities specialistams procedūros, būtent:
1) atliekama imunizacija - rekombinantinis vaginolizinas (antigenas) buvo suleidžamas BALB/c linijos pelėms po oda. Prieš injekciją antigeno tirpalas buvo lygiu tūriu sumaišomas su pilnu Freund'o adjuvantu;
2) atliekama pakartotinė imunizacija - po 4 savaičių pelėms dar kartą buvo suleidžiama tokia pat antigeno dozė po oda, prieš tai antigeno tirpalą sumaišius su nepilnu Freund'o adjuvantu;
3) dar po 4 savaičių buvo suleidžiama tokia pat antigeno dozė be adjuvanto. Imunizacijų metu buvo keletą kartų tikrinama, ar imunizuotų pelių kraujo serume atsirado antikūnų prieš antigeną. Patikrinimui buvo naudojamas žinomas metodasimunofermentinė analizė (IFA);
4) praėjus 3 dienoms po trečiosios imunizacijos, buvo atliekama blužnies ląstelių hibridizacija, suliejant jas su vėžinėmis ląstelėmis, būtent, mieloma Sp2/0, suliejimo agentu buvo naudotas polietilengilikolis (PEG) [Sigma, JAV], Ši ir kitos procedūros buvo atliekamos pagal žinomą procedūrą, naudojamą hibridomų gavimui [Kohler, Milstein, Nature 1975; 256:495-497].
5) gavus hibridinių ląstelių klonus (hibridomas) buvo tikrinamas jų specifiškumas, t.y. nustatoma, ar jie gamina antikūnus prieš vaginoliziną. Tam buvo naudojamas IFA metodas;
6) gautos hibridomos buvo charakterizuojamos pagal įvairius požymius:
- nustatant jų gaminamų monokloninių antikūnų izotipą
- ištiriant antikūnų specifiškumą IFA ir imunoblotingo metodais,
7) identifikavus hibridomas, kurios gamina monokloninius antikūnus prieš vaginoliziną, jos buvo klonuojamos, padauginomos ir užšaldomos tolesniam saugojimui;
8) hibridomų gaminami monokloniniai antikūnai buvo charakterizuojami anksčiau aprašytais būdais:
- IFA bei imunoblotingu, naudojant kaip antigeną rekombinantinį vaginoliziną
- imunoblotingu, naudojant bakterijų Gardnerella vaginalis lizatą
- tikrinamas monokloninių antikūnų neutralizuojantis poveikis, naudojant žmogaus eritrocitus.
Taigi, atlikus pelių BALB/c imunizacijas rekombinantinių vaginolizinu ir suliejus imunizuotų pelių blužnies ląsteles su mielomos ląstelėmis, buvo gautos hibridomos, gaminančios monokloninius antikūnus prieš vaginoliziną. Ištyrus gautų monokloninių antikūnų savybes, buvo nustatyta, kad jie reaguoja su natyviu vaginolizinu iš bakterijų Gardnerella vaginalis ir neutralizuoja vaginolizino citolitinį veikimą in vitro.
Aprašytu būdu buvo gautos ir ištirtos 3 naujos hibridomos, kurios deponuotos Biotechnologijos instituto (Vilnius) Imunologijos ir ląstelės biologijos laboratorijoje:
1) Hibridoma 9B4, deponavimo numeris VLY001, kuri gamina IgGl poklasio (subtipo) monokloninius antikūnus prieš vaginoliziną
2) Hibridoma 23A2, deponavimo numeris VLY002, kuri gamina IgGl poklasio (subtipo) monokloninius antikūnus prieš vaginoliziną;
3) Hibridoma 3G1, deponavimo numeris VLY003, kuri gamina IgGl poklasio (subtipo) monokloninius antikūnus prieš vaginoliziną.
Bet kuri iš minėtų naujų hibridomų - 9B4, 23A2 ir 3G1 - produkuoja monokloninį antikūną prieš vaginoliziną ir yra šio išradimo objektas.
Hibridomas 9B4, 23A2 ir 3G1 apibūdina šie požymiai.
Morfologiniai požymiai. Hibridomos yra sferinės formos, lygiais kraštais, turi stambų branduolį. Dauginasi suspensijoje, pasižymi silpna adhezįja ant stiklo arba plastiko paviršiaus.
Ląstelių kultūros kilmė. Hibridomos gautos, suliejus imunizuotų BALB/c linijos pelių (Mus.musculus) blužnies ląsteles su pelės (Mus.musculus) mielomos ląstelių linija Sp2/0. Ląstelių kultūros požymiai. Hibridomų kultivavimo sąlygos standartinės: augimo terpė Dubecco modifikuota Eagl’o terpė (DMEM) su 2mM L-glutamino, 200 pg/mL gentamicino ir 10% embrionininio veršiuko serumo. Hibridomos auginamos stiklo arba plastiko induose, skirtuose ląstelių kultūroms. Ląstelės persėjamos kas 3-4 dienos, peršėjimo dozė - 50-100 tūkstančių ląstelių mililitre terpės. Hibridomos auginamos inkubatoriuje, kurio atmosferoje yra 5% CO2, esant 37°C temperatūrai. Ilgalaikiam saugojimui hibridomos užšaldomos embrioniniame serume su 10% DMSO ir laikomos skystame azote. Užšaldymo sąlygos: ί χ 106 - 2x106 ląstelių mililitre, temperatūros režimas - 1°C per minutę iki -70°C. Po paros ampulės su ląstelėmis perkeliamos į skystą azotą. Kultūrų atgaivinimui ampulės atšildomos 37°C temperatūros vandens vonioje. Ląstelių gyvybingumas po atšildymo - 70-80%. Kontaminacija. Bakterijų ir grybelių hibridomų kultūrose nerasta, mikoplazmos testas neigiamas.
Hibridomų produktyvumas. Monokloninių antikūnų sekrecijos lygis augimo terpėje - 10-30 pg/ml. Monokloninių antikūnų produkcija išlieka iki 15 pasažų (ląstelių kultūros peršėjimų). Produktų charakteristika. Hibridomos 9B4, 3GI ir 23A2 gamina IgG klasės, IgGl poklasio monokloninius antikūnus, specifiškus vaginolizinui iš bakterijų Gardnerella vagmalis. Hibridomos 9B4 gaminami monokloniniai antikūnai visiškai neutralizuoja vaginolizino biologinį aktyvumą esant reakcijos mišinyje 5 ng/ml vaginolizino ir 20 ng/ml monokloninių antikūnų. Hibridomos 23A2 gaminami monokloniniai antikūnai visiškai neutralizuoja vaginolizino biologinį aktyvumą esant reakcijos mišinyje 5 ng/ml vaginolizino ir 200 ng/ml monokloninių antikūnų. Hibridomos 3G1 gaminami monokloniniai antikūnai visiškai neutralizuoja vaginolizino biologinį aktyvumą esant reakcijos mišinyje 5 ng/ml vaginolizino ir 1000 ng/ml monokloninių antikūnų.
Hibridomų 9B4, 3G1 ir 23A2 gaminami monokloniniai antikūnai skiriasi nuo aprašytų analogų - monokloninių antikūnų prieš kitus bakterijų citolizinus - pagal tą požymį, kad jie yra specifiški vaginolizinui (VLY), kuris funkciškai ir struktūriškai skiriasi nuo kitų citolizinų. VLY skiriasi nuo kitų citolizinų pagal šiuos požymius:
t
1) Baltymo pirminę struktūrą (aminorūgščių seką);
2) Kilmę - VLY yra gaminamas bakterijų Gardnerella vaginalis,
3) Biologinį veikimą - VLY lizuoja tik žmogaus eritrocitus;
4) Atpažįstamus ląstelių paviršiaus receptorius - VLY jungiasi prie žmogaus eritrocitų per CD59 molekulę.
Tyrimai parodė, kad hibridomų 9B4, 3G1 ir 23A2 gaminami monokloniniai antikūnai atpažįsta aminorūgščių seką SEQID:Nr.l:
MNNTKFYRNAAMLLLAGATIIPOCLAAPAMAAPAAKDSEPTASC
AAKKDSLNNYLWDLQYDKTNILARHGETIDNKFSSDSFNKGDEFVWEHQKKNITNTT
SNLSVTSANDDRVYPGALFRADQNLMDNMPSLISANRAPITLSVDLPGFHGGESAVTV
QRPTKSSVTSAVNGLVSKWNAQYAASHHVAARMQYDSASAQSMSQLKAKFGADFAKIG
VPLKIDFDAVHKGEKQTQIVNFKQTYYTVSVDAPDSPADFFAPCTTPESLKSRGVDSK
RPPVYVSNVAYGRSMYVKFDTRSKSTDFQAAVEAAIKGVE1KPNTEFHRILQNTSVTA
VILGGSANGAAKVITGNVDTLKALIQEGANLSTSSPAVPIAYTTSFVKDNEVATLQTN
SDYVETKVSSYRDGYLTLDHRGAYVARYYIYWDEYGTEIDGTPYVRSRAWEGNGKYRT
AHFNTTIQFKGNVHNLRIKLVEKTGLVWEPWRTVYDRSDLPLVRQRTIKNWGTTLWPR
VAETVKND
Ši aminorūgščių seka atitinka vaginolizino iš Gardnerella vaginalis aminorūgščių seką, kuri buvo nustatyta anksčiau ir publikuota (GenBank Nr. EU697812, EU 697811). Skirtingi Gardnerella vaginalis kamienai gali ekspresuoti vaginolizino variantus, kurių pirminė seka gali skirtis viena ar keliomis aminorūgščių liekanomis nuo sekos SEQ ID: Nr.l.
Anksčiau aprašytieji monokloniniai antikūnai PLY-5, PLY-7, 26-5F12, 26-23C2, 22-6E6 skiriasi nuo hibridomų 9B4, 3G1 ir 23A2 gaminamų antikūnų tuo, kad jie yra specifiški bakterijų Streptococcus pneumoniae toksinui pneumolizinui (PLY) ir neutralizuoja jo citolitinį aktyvumą [EP0687688, W02006021210].
Anksčiau aprašytieji monokloniniai antikūnai prieš streptoliziną (SLO) skiriasi nuo hibridomų 9B4, 3G1 ir 23A2 gaminamų antikūnų tuo, kad jie yra specifiški SLO ir jo variantams [WO9305152],
Anksčiau aprašytasis monokloninis antikūnas A4-8 - skiriasi nuo hibridomų 9B4, 3G1 ir 23A2 gaminamų antikūnų tuo, kad jis yra specifiškas bakterijų Listeria monocytogenes toksinui Iisteriolizinui (LLO) ir neutralizuoja jo biologinį aktyvumą.
Naujų hibridomų ir jų gaminamų monokloninių antikūnų savybes iliustruoja informacija, pateikta Fig. 1-3.
Fig.1 atkartoja imunoblotingo vaizdą, gautą su rekombinantinių vaginolizinu ir bakterijų Gardnerella vaginalis bei E.coli lizatais, naudojant hibridomų 9B4, 23A2 ir 3G1 gaminamus monokloninius antikūnus.
Fig.2 atkartoja imunoblotingo vaizdą, gautą su rekombinantinių vaginolizinu ir rekombinantiniais citolizinais SLY, LLO ir PLY, naudojant hibridomų 9B4 ir 23A2 gaminamus antikūnus.
Fig.3 iliustruoja hibridomų 9B4 ir 23A2 gaminamų monokloninių antikūnų neutralizuojantį aktyvumą.
Naujų monokloninių antikūnų gavimo būdas, jų savybės detaliau aprašomi toliau pateiktuose 1-4 pavyzdžiuose ir 1 lentelėje, kurie iliustruoja, bet neapriboja išradimo esmės.
pavyzdys
Hibridomų, gaminančių monokloninius antikūnus prieš Gardnerella vaginalis vaginolizinu, sukūrimas
BALB/c linijos pelės buvo imunizuojamos išgrynintu rekombinantinių vaginolizinu, ekspresuotu bakterijose E.coli. Pelės buvo imunizuojamos, suleidžiant 50 pg vaginolizino (antigeno) su pilnu Freund‘o adjuvantu po oda. Praėjus 4 savaitėms po pirmosios imunizacijos, tuo pat būdu pelės buvo imunizuojamos pakartotinai, suleidžiant 50 pg antigeno su nepilnu Freund‘o adjuvantu. Dar po 4 savaičių pelės buvo imunizuojamos, suleidžiant 50 pg antigeno be adjuvanto. Imunizacijų metu buvo tikrinamas antigenui specifiškų antikūnų titras imunofermentinės analizės (IFA) metodu. Praėjus 3 dienoms po paskutinės imunizacijos, buvo atliekama hibridizacija.
Hibridizacijai buvo naudojamos imunizuotos pelės blužnies ląstelės ir pelių mielomos ląstelės Sp 2/0, neturinčios fermento hipoksantin-guanin-fosforiboziltransferazės, neaugančios selektyvioje hipoksantino-aminopterino-timidino (HAT) terpėje (10'4M hipoksantino, 1,6 χ 10’5M timidino, 4 χ 10‘7M aminopterino) ir negaminančios imunoglobulinų ar jų grandinių. Prieš hibridizaciją ląstelės turi būti logaritminėje augimo fazėje. Hibridizacija buvo atliekama, 2 minutes veikiant ląsteles 50% polietilenglikolio (PEG-4000) tirpalu Dubecco modifikuotoje Eagl’o terpėje (DMEM) su 10% dimetilsulfoksido (DMSO). Mielomos ir blužnies ląstelių santykis hibridizacijos metu - 1:5. Po hibridizacijos ląstelės buvo atplaunamos beserumine DMEM terpe, suspenduojamos selektyvioje HAT terpėje ir išsėjamos į plokšteles (po 5x105 ląstelių į šulinėlį).
Hibridiniai klonai pasirodė 5-10 dieną po hibridizacijos. Testuojant terpę netiesioginės IFA metodu, buvo tikrinama, ar klonai gamina antikūnus prieš vaginoliziną. Kas 4-5 dienos buvo pakeičiama pusė ląstelių augimo terpės. Pirmą kartą HAT terpė buvo keičiama į hipoksantino-timidino (HT) terpę, turinčią 10'4 M hipoksantino ir 1,6 χ 10'4 M timidino. Vėliau HT terpė buvo palaipsniui keičiama į įprastą augimo terpę. Hibridiniai klonai, gaminantys antikūnus prieš vaginoliziną buvo klonuojami ribinio praskiedimo metodu. Klonai pasirodė po 4-7 dienų. Jie buvo testuojami netiesioginės IFA metodu. Atrinkti klonai buvo padauginami ir toliau auginami kultūroje arba užšaldomi ir saugomi skystame azote.
Buvo gauta keletas hibridomų klonų, gaminančių monokloninius antikūnus prieš vaginoliziną. Buvo ištirta jų specifiškumas, neutralizuojantis aktyvumas, nustatyti antikūnų izotipai.
Hibridomos, gaminančios neutralizuojančius monokloninius antikūnus prieš vaginoliziną buvo pavadintos 9B4, 23A2 ir 3G1 ir deponuotos Biotechnologijos instituto (Vilnius, LT) kolekcijoje. Joms suteikti atitinkami deponavimo numeriai: 9B4 - VLY001, 23A2 VLY002, 3G1 - VLY003.
pavyzdys.
Monokloninių antikūnų specifiškumo tyrimas ir izotipų nustatymas.
Hibridomų 9B4, 3GI ir 23A2 gaminamų antikūnų specifiškumas buvo nustatomas imunofermentinės analizės (IFA) bei imunoblotingo metodais. Imunoglobulinų izotipai buvo nustatomi IFA metodu, naudojant izotipų nustatymo rinkinį [Sigma, JAV].
Šiais metodais buvo nustatyta, kad gautieji monokloniniai antikūnai yra IgG ižo tipo, IgGl subtipo ir reaguoja su rekombinantiniu vaginolizinu (Fig. 1). Imunoblotingo metodu buvo nustatyta, kad monokloniniai antikūnai reaguoja su 57 kDa dydžio baltymu bakterijų Gardnerella vaginalis lizatuose, kuris atitinka vaginoliziną (VLY), tačiau nereaguoja su bakterijų E.coli lizato baltymais (Fig. 1). Tai rodo, kad gautieji monokloniniai antikūnai yra specifiški vaginolizinui iš bakterijų Gardnerella vaginalis.
lentelėje pateikiami duomenys apie hibridomų 9B4, 3G1 ir 23A2 gaminamų antikūnų specifiškumą ir poklasius.
lentelė
| Hibridomų klonas | Subtipas (poklasė) | Reakcija su skirtingais antigenais: | ||
| Rekombinantinis VLY | Gardnerella vaginalis lizatas | E.coli lizatas | ||
| 9B4 | IgGl | + | 4- | - |
| 23A2 | IgGl | + | + | - |
| 3G1 | IgGl | + | + | - |
Fig. 1 atkartoja imunoblotingo vaizdą gautą su rekombinantinių VLY ir bakterijų Gardnerella vaginalis bei E.coli lizatais, naudojant hibridomų 9B4,23A2 ir 3G1 gaminamus antikūnus. Virš imunoblotingo vaizdo nurodyti antikūnų pavadinimai.
takelis - rekombinantinis išgrynintas VLY;
takelis - bakterijų E.coli lizatas;
takelis - bakterijų Gardnerella vaginalis lizatas;
M - baltymų molekulinio svorio standartas.
pavyzdys.
Monokloninių antikūnų kryžminio specifiškumo tyrimas
Imunoblotingo metodu buvo ištirtas hibridomų 9B4, 23A2 ir 3G1 gaminamų antikūnų kryžminis specifiškumas, t.y., reakcija su kitais rekombinantiniais citolizinais: SLY, LLO ir
PLY. Tyrimui buvo naudojami rekombinantiniai citolizinai, susintetinti E.coli bakterijose. Kaip teigiama kontrolė buvo naudojamas rekombinantinis VLY, o kaip neigiama kontrolė bakterijų E. coli lizatai be citolizinų.
Atlikus šį tyrimą, buvo nustatyta, kad gautieji monokloniniai antikūnai reaguoja tik su VLY, bet nereaguoja su kitais rekombinantiniais citolizinais - nei su SLY, nei su LLO, nei su PLY (Fig. 2). Tai rodo, kad gautieji monokloniniai antikūnai yra specifiški tik vaginolizinui iš bakterijų Gardnerella vaginalis ir skiriasi nuo anksčiau aprašytų analogų.
Fig. 2 atkartoja imunoblotingo vaizdą gautą su rekombinantinių VLY ir rekombinantiniais citolizinais SLY, LLO ir PLY, naudojant hibridomų 9B4 ir 23A2 gaminamus antikūnus.
Virš imunoblotingo vaizdo nurodyti antikūnų pavadinimai. 1 takelyje matoma juostelė atitinka VLY, kuris išryškėja po inkubacijos su antikūnais.
takelis - rekombinantinis išgrynintas VLY;
takelis - bakterijų E.coli lizatas;
takelis - bakterijų E.coli lizatas su SLY;
takelis - bakterijų E.coli lizatas;
takelis - bakterijų E.coli lizatas su LLO;
takelis - bakterijų E.coli lizatas;
takelis - bakterijų E.coli lizatas su PLY;
M - baltymų molekulinio svorio standartas.
pavyzdys.
Monokloninių antikūnų neutralizuojančio aktyvumo tyrimas
Hibridomų 9B4, 23A2 ir 3G1 gaminamų antikūnų sugebėjimas neutralizuoti VLY citolizinį aktyvumą buvo ištirtas, naudojant žinomą metodą [Walker JA, Allen RL, Falmagne P et ai., Infect Immun, 1987, 55, pp. 1184-1189; Cauci S, Monte R, Ropele M et ai., Mol Microbiol, 1993, 9, pp. 1 143-1155.]. Žmogaus eritrocitų suspensija (1 ml) buvo inkubuojama 15 min 22°C temperatūroje tokiuose inkubacijos mišiniuose:
1) Fosfatiniame buferiniame tirpale (PBS), pH 7,4 (0% hemolizė);
2) Dejonizuotame vandenyje (100% hemolizė);
3) PBS su 5 ng/ml VLY (100% hemolizė);
4) PBS su 5 ng/ml VLY ir 20 ng/ml antikūno 9B4;
5) PBS su 5 ng/ml VLY ir 200 ng/ml antikūno 9B4;
6) PBS su 5 ng/ml VLY ir 1000 ng/ml antikūno 9B4;
7) PBS su 5 ng/ml VLY ir 20 ng/ml antikūno 23A2;
8) PBS su 5 ng/ml VLY ir 200 ng/ml antikūno 23A2
9) PBS su 5 ng/ml VLY ir 1000 ng/ml antikūno 23A2,
10) PBS su 5 ng/ml VLY ir 20 ng/ml antikūno 3G1;
11) PBS su 5 ng/ml VLY ir 200 ng/ml antikūno 3G1
12) PBS su 5 ng/ml VLY ir 1000 ng/ml antikūno 3G1.
Po inkubacijos eritrocitų suspensija buvo centrifuguojama (3 min, 1000xg) ir matuojamas optinis tankis, esant bangos ilgiui 415 nm. Didelės optinio tankio reikšmės (OT>2.0) rodo, kad įvyko eritrocitų ližė (hemolizė). Mažos optinio tankio reikšmės (OT<0.2) rodo, kad hemolizė nevyko. Esant inkubacijos mišinyje 5 ng/ml rekombinantinio VLY, įvyko eritrocitų ližė (OT = 2,5). Esant inkubacijos mišinyje 20 ng/ml antikūno 9B4 arba 200 ng/ml antikūno 23A2, eritrocitai buvo visiškai apsaugoti nuo VLY sukeltos ližės (Fig.3), Esant inkubacijos mišinyje 20 ng/ml arba 200 ng/ml antikūno 3G1, eritrocitai nebuvo apsaugoti nuo VLY sukeltos ližės, tačiau jie buvo apsaugoti, esant 1000 ng/ml antikūno 3G1. Tai rodo, kad visi antikūnai blokuoja VLY citolitinį aktyvumą tačiau 9B4 yra aktyviausias - jis veikia esant 10 kartų mažesnei koncentracijai nei 23A2 ir 50 kartų mažesnei koncentracijai, nei
3G1. Antikūnas 3G1 pasižymi silpnesniu neutralizuojančiu poveikiu, nei 9B4 ir 23A2.
Fig.3 iliustruoja hibridomų 9B4 ir 23A2 gaminamų monokloninių antikūnų neutralizuojantį aktyvumą Y ašyje atidėtos optinio tankio (OT) reikšmės; X ašyje nurodyti eritrocitų suspensijos mėginių numeriai, kurie atitinka šiuos inkubacijos mišinius:
1) Fosfatinis buferinis tirpalas (PBS),
2) Dejonizuotas vanduo;
3) PBS su 5 ng/ml VLY;
4) PBS su 5 ng/ml VLY ir 20 ng/ml antikūno 9B4;
5) PBS su 5 ng/ml VLY ir 200 ng/ml antikūno 9B4;
6) PBS su 5 ng/ml VLY ir 1000 ng/ml antikūno 9B4;
7) PBS su 5 ng/ml VLY ir 20 ng/ml antikūno 23A2;
8) PBS su 5 ng/ml VLY ir 200 ng/ml antikūno 23A2
9) PBS su 5 ng/ml VLY ir 1000 ng/ml antikūno 23A2.
Gauti duomenys rodo, kad naujai sukurtieji monokloniniai antikūnai 9B4, 23A2 ir 3G1 yra specifiški vaginolizinui (VLY) iš bakterijų Gardnerella vaginalis ir neutralizuoja jo citolitinį aktyvumą Todėl šie monokloniniai antikūnai galėtų būti taikomi VLY nustatymui imunocheminiais metodais, diagnozuojant Gardnerella vaginalis infekciją Pavyzdžiui, naudojant šiuos antikūnus galėtų būti atliekamas citologinių mėginių ištyrimas imunohistocheminiu, imunoblotingo arba IFA metodu. Nustačius, kad mėginiuose yra VLY, būtų patvirtinama Gardnerella vaginalis infekcija.
Naujai sukurtieji antikūnai 9B4 ir 23A2 pasižymi stipriu neutralizuojančiu poveikiu, todėl jie arba jų pagrindu sukurti rekombinantiniai antikūnų analogai gali būti taikomi ir profilaktiniais ar terapiniais tikslais, kovojant su Gardnerella vaginalis infekcijos sukelta patologija. Pavyzdžiui, naudojant hibridomų 9B4 ir 23A2 genetinę medžiagą (RNR) galėtų būti konstruojami viengrandžiai antikūnų fragmentai (scFv) arba humanizuoti antikūnai, neutralizuojantys VLY biologinį poveikį. Kadangi VLY yra pagrindinis Gardnerella vaginalis virulentiškumo faktorius, jo neutralizacija pašalintų infekcijos pasekmes.
Claims (12)
- IŠRADIMO APIBRĖŽTIS:1. Monokloninis antikūnas, atpažįstantis aminorūgščių seką SEQ ID: NO. 1MNNTKFYRNAAMLLLAGATIIPOCLAAPAMAAPAAKDSEPTASCAAKKDSLNNYLWDLQYDKTNILARHGETIDNKFSSDSFNKGDEFVWEHQKKNITNTTSNLSVTSANDDRVYPGALFRADONLMDNMPSLISANRAPITLSVDLPGFHGGESAVTVQRPTKSSVTSAVNGLVSKWNAQYAASHHVAARMQYDSASAQSMSQLKAKFGADFAKIGVPLKIDFDAVHKGEKQTQIVNFKQTYYTVSVDAPDSPADFFAPCTTPESLKSRGVDSKRPPVYVSNVAYGRSMYVKFDTRSKSTDFQAAVEAAIKGVEIKPNTEFHRILQNTSVTAVILGGSANGAAKVITGNVDTLKALIQEGANLSTSSPAVPIAYTTSFVKDNEVATLQTNSDYVETKVS$YRDGYLTLDHRGAYVARYYIYWDEYGTEIDGTPYVRSRAWEGNGKYRTAHFNTTIQFKGNVHNLRIKLVEKTGLVWEPWRTVYDRSDLPLVRQRTIKNWGTTLWPRVAETVKND arba į ją panašią seką, kurios identiškumas yra bent 95%.
- 2. Hibridomos 9B4 ląstelių linija, deponavimo numeris VLY001.
- 3. Hibridomos 23A2 ląstelių linija, deponavimo numeris VLY002.
- 4. Hibridomos 3G1 ląstelių linija, deponavimo numeris VLY003.
- 5. Hibridomos ląstelių linija, pasirinkta iš grupės, susidedančios iš 9B4 (deponavimo numeris VLY001), 23A2 (deponavimo numeris VLY002) ir 3G1 (deponavimo numeris VLY003), produkuojanti monokloninius antikūnus pagal 1 punktą prieš vaginoliziną.
- 6. Monokloninis antikūnas, produkuojamas hibridomos ląstelių linijos pagal bet kurį vieną iš 2-5 punktų, kuris yra IgG klasės.
- 7. Monokloninis antikūnas pagal 6 punktą, kuris yra pelės monokloninis antikūnas.
- 8. Monokloninio antikūno pagal 1 punktą arba 6 punktą panaudojimas, gaminant preparatus, skirtus infekcijos, pavyzdžiui, bakterinės vaginozės, sukeltos Gardnerella vaginalis, nustatymui.
- 9. Diagnostinis rinkinys Gardnerella vaginalis infekcijai nustatyti, apimantis mažiausiai monokloninį antikūną pagal 1 punktą arba 6 punktą.
- 10. Hibridomos pagal bet kurį iš 2-5 punktų panaudojimas, gaminant preparatus, skirtus neutralizuoti arba blokuoti vaginolizino biologinį aktyvumą.
- 11. Preparatas, gaunamas iš hibridomos pagal bet kurį iš 2-5 punktų, skirtas infekcijos, 5 pavyzdžiui, bakterinės vaginozės, sukeltos Gardnerella vaginalis, slopinimui.
- 12. Farmacinė kompozicija, apimanti preparato pagal 11 punktą efektyvų kiekį derinyje su farmaciniu požiūriu priimtinu nešikliu, skiedikliu, ekscipientų ir/arba pagalbinėmis medžiagomis, skirta Gardnerella vaginalis infekcijos sukeltų būklių (patologijų)10 profilaktikai ir/arba gydymui.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LT2009012A LT5705B (en) | 2009-02-23 | 2009-02-23 | Monoclonal antibodies against vaginolysin |
| EP09788100.7A EP2398823B1 (en) | 2009-02-23 | 2009-06-05 | Monoclonal antibodies against vaginolysin |
| PCT/LT2009/000005 WO2010095917A1 (en) | 2009-02-23 | 2009-06-05 | Monoclonal antibodies against vaginolysin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LT2009012A LT5705B (en) | 2009-02-23 | 2009-02-23 | Monoclonal antibodies against vaginolysin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| LT2009012A LT2009012A (lt) | 2010-08-25 |
| LT5705B true LT5705B (en) | 2011-01-25 |
Family
ID=41510777
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| LT2009012A LT5705B (en) | 2009-02-23 | 2009-02-23 | Monoclonal antibodies against vaginolysin |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP2398823B1 (lt) |
| LT (1) | LT5705B (lt) |
| WO (1) | WO2010095917A1 (lt) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2659543T3 (es) | 2010-11-01 | 2018-03-16 | Becton Dickinson And Company | Ensayo de Gardnerella vaginalis |
| LT5855B (lt) | 2010-12-07 | 2012-08-27 | Uab Profarma | Rekombinantinis viengrandžio antikūno fragmentas, neutralizuojantis vaginolizino citolitinį aktyvumą |
| DK3268380T3 (en) * | 2015-03-12 | 2019-02-18 | Zoetis Services Llc | PYOLYSIS METHODS AND COMPOSITIONS |
| EP3747903A1 (en) * | 2019-06-07 | 2020-12-09 | Biotest AG | Method and kit for testing potency of immunoglobulin compositions |
| PL444280A1 (pl) * | 2023-03-31 | 2024-10-07 | Sensdx Spółka Akcyjna | Kombinatoryczne aminokwasowe sekwencje 12merowe wiążące selektywnie patogeny wywołujące waginoze bakteryjną |
| CN119044487A (zh) * | 2024-10-30 | 2024-11-29 | 北京泰格科信生物科技有限公司 | 一种念珠菌阴道毛滴虫阴道加德纳菌抗原诊断试剂盒 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993005152A1 (en) | 1991-08-30 | 1993-03-18 | Beckman Instruments, Inc. | Antibodies to streptolysin o derivatives and variants |
| EP0687688A1 (en) | 1993-12-17 | 1995-12-20 | Universidad De Oviedo | Antibodies against pneumolysine and their applications |
| WO2006021210A2 (en) | 2004-08-23 | 2006-03-02 | Genesto A/S | Binding member towards pneumolysin |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009117373A2 (en) * | 2008-03-15 | 2009-09-24 | Columbia University | Treatment and prevention of gardnerella vaginalis infections |
-
2009
- 2009-02-23 LT LT2009012A patent/LT5705B/lt not_active IP Right Cessation
- 2009-06-05 WO PCT/LT2009/000005 patent/WO2010095917A1/en not_active Ceased
- 2009-06-05 EP EP09788100.7A patent/EP2398823B1/en not_active Not-in-force
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993005152A1 (en) | 1991-08-30 | 1993-03-18 | Beckman Instruments, Inc. | Antibodies to streptolysin o derivatives and variants |
| EP0687688A1 (en) | 1993-12-17 | 1995-12-20 | Universidad De Oviedo | Antibodies against pneumolysine and their applications |
| WO2006021210A2 (en) | 2004-08-23 | 2006-03-02 | Genesto A/S | Binding member towards pneumolysin |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| BREKKE OH, SANDLIE I.: "Therapeutic antibodies for human diseases at the dawn of the twenty-first century.", NAT REV DRUG DISCOV., 2002, pages 52 - 62 |
| GARCIA-SUAREZ MDEL M ET AL.: "Protection against pneumococcal pneumonia in mice by monoclonal antibodies to pneumolysin.", INFECT IMMUN., 2004, pages 4534 - 4540, XP002366576, DOI: doi:10.1128/IAI.72.8.4534-4540.2004 |
| JENNIFER A MAYNARD ET AL.: "Protection against anthrax toxin by recombinant antibody fragments correlates with antigen affinity", NATURE BIOTECHNOLOGY, 2002, pages 597 - 601, XP002390004, DOI: doi:10.1038/nbt0602-597 |
| T JACOBS ET AL.: "The conserved undecapeptide shared by thiol-activated cytolysins is involved in membrane binding", FEBS LETTERS, 1999, pages 463 - 466, XP004375880, DOI: doi:10.1016/S0014-5793(99)01297-1 |
| TWETEN RK: "Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins", INFECT. IMMUNOL., 2005, pages 6199 - 6209, XP002614082, DOI: doi:10.1128/IAI.73.10.6199-6209.2005 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2398823B1 (en) | 2016-03-23 |
| LT2009012A (lt) | 2010-08-25 |
| EP2398823A1 (en) | 2011-12-28 |
| WO2010095917A1 (en) | 2010-08-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2013370009B2 (en) | Anti-granulysin antibodies and methods of use thereof | |
| US10906989B1 (en) | Antibody specific to Staphylococcus aureus, therapeutic method and detection method using same | |
| CN107474133A (zh) | 特异性结合金黄色葡萄球菌α毒素的抗体以及使用方法 | |
| CN102089005A (zh) | 金黄色葡萄球菌特异性抗体制剂 | |
| US20220324949A1 (en) | Anti-alpha-hemolysin antibody and use thereof | |
| CA2420287A1 (en) | Anthrax specific antibodies | |
| CN113015745B (zh) | 针对金黄色葡萄球菌白细胞毒素的抗体 | |
| LT5705B (en) | Monoclonal antibodies against vaginolysin | |
| US11530256B2 (en) | Antibody specific to alpha-toxin of Staphylococcal aureus and uses thereof | |
| WO2008140487A2 (en) | Improved staphylococcal protein a mono- and bispecific antibodies and methods of their use | |
| US20140286960A1 (en) | Staphlococcus aureus alpha-hemolysin antibodies | |
| Li et al. | Isolation and characterization of a protective monoclonal antibody targeting outer membrane protein (OmpA) against tuberculosis | |
| US10981979B2 (en) | Human monoclonal antibodies to Staphylococcus aureus lukab toxin | |
| US20150259402A1 (en) | Human antibody specific to toxin produced from clostridium difficile, or antigen-binding fragment thereof | |
| EP3999851A1 (en) | Compositions and methods for the treatment of tuberculosis | |
| CN111205370A (zh) | 抗ptn抗体在抑制白血病干细胞以及治疗慢性粒细胞白血病中的应用 | |
| RU2525663C1 (ru) | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ Mus musculus 2F9-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К ЛИЗОСТАФИНУ И ИНГИБИРУЮЩИХ ЕГО ЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ | |
| Banerjee et al. | Inhibitory activities of monoclonal antibodies against Staphylococcus aureus Clumping factor A | |
| CN116761619A (zh) | 用于预防或治疗金黄色葡萄球菌感染性疾病的新型组合物 | |
| Oesterreich | Preclinical development of an immunotherapy against antibiotic-resistant Staphylococcus aureus | |
| US20160145324A1 (en) | Antibodies Directed to Bacillus Anthracis Protective Antigen |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM9A | Lapsed patents |
Effective date: 20240223 |