LT5701B - Fitocheminė kompozicija, jos gavimo būdas ir panaudojimas - Google Patents

Abstract

Išradimas priklauso sveikatos apsaugos sričiai, būtent vaistiniams preparatams, savo sudėtyje turintiems organinių veikliųjų ingredientų. Jis pagrįstas fitocheminių junginių, kaip terapinio preparato, gavimu ir panaudojimu gydant cistinę fibrozinę krūties ligą – mastopatiją. Fitocheminių junginių kompozicija, apima eterinius aliejus ir tirpiklį, kur kompoziciją ir jos eterinius aliejus sudaro fitocheminių junginių karvono, limoneno, steroidų, flavonoidų, esančių vaistinio augalo Carum carvi (kmyno) vaisiuose kompleksas, tirpikliu naudojant 60-96 % etilo alkoholį. Kompozicijos komponentų masės dalių santykis: Carum carvi vaisiai ir 60-96 % etilo alkoholis maždaug 1:5.

Description

Išradimas priklauso sveikatos apsaugos sričiai, būtent vaistiniams preparatams, savo sudėtyje turintiems organinių veikliųjų ingredientų. Jis pagrįstas fitocheminių junginių, kaip terapinio preparato, gavimu ir panaudojimu gydant cistinę fibrozinę krūties ligų- mastopatiją.

Mastopatijos patogenezę sudaro nuo fiziologinės normos nukryps.tantys būties audinio pokyčiai. Šie pokyčiai yra proliferacinio (vešėjimo) ir neproliferacinio (regresinio) pobūdžio. Liga prasideda difuzine ir progresuoja į mazginę (židininę) formų. Supiktybėti gali visiį rūšių proliferacinė ir kai kurių rūšių neproliferacinė mastopatija. Įvairių formų mastopatija serga iki 45 % (ypač vyresnio amžiaus) moterų.

Mastopatijai gydyti (proliferacinė operuojama) vis labiau naudojami nespecifiniai fitoterapiniai preparatai. Pastaruoju metu (XXI a. pirmajame dešimtmetyje) fitocheminių junginių paieškomis ypač aktyviai užsiima kinų specialistai. Jie naudojasi per ilgą laiką sukaupta kinų tradicinės medicinos patirtimi ir sudaro įvairias vaistinių augalų kompozicijas mastopatijai gydyti. Žinomos 4-6 vaistinių augalų kompozicijos [patentai: CN 101129527 (A), CN 1657069 (A), CN 1757297 (A), CN 1895441 (A)]. Į šių kompozicijų sudėtį įeina Bupleurum, Jasminum, Reynotria, Polygonatum, Ziziphus, Carthamus genčių vaistiniai augalai. Taip pat žinomos 7-10 vaistinių augalų kompozicijos [patentai CN 101214298 (A); CN 1861183 (A); CN 1493349 (A); CN 1726989 (A); CN 1385202 (A); CN 1883552 (A); CN 101361805 (A); CN 101224249 (A); CN 100998845 (A)]. Šiose kompozicijose vyrauja tokie vietinių vaistinių augalų genčių augalai: Angelica, Amygdalus, Scrophularia, Forsythia, Cinnamomum, Pistacia, Myrrhis, Cyperus, Paeonia, Diervilla, Salvia, Philodendron, Rheum, Silphium, Scutellaria, Sesamum, Xeranthemum augalai. Pastaraisiais metais Kinijoje patentuotos 24-35 vaistinių augalų rūšių kompozicijos įvairiems mastopatijos tipams gydyti [patentai: CN 101485862 (A), 2009-07-22 (A); CN 1695694 (A); CN 1759899 (A)]. Šiose kompozicijose be jau paminėtų augalų randame Polygonum, Astragalus, Ραηαχ, Corydalis, Fritillaria, Prunella, Brassica ir kitų genčių vaistinius augalus.

Sukurtos kompozicijos pasižymi mastopatiją inhibuojančiomis savybėmis, tačiau jų trūkumas yra tas, kad šis inhibavimas yra vertinamas tik patenkinamai (vidutinis inhibavimo lygis).

Mastopatįjai gydyti vartojamos ir vidutinio klimato zonos vaistinių augalų kompozicijos (RU patentas 2 066 168 Cl). Šią kompoziciją sudaro Matricaria recutita, Melilotus officinale, Leonurus cardiaca, Padus avium, Epilobium angustifolium, Achillea. millefolium, Origanum vulgare, Betula pendula (pumpurai). Šios paskirties preparatui gauti taip pat naudojamos kerpės Cetraria islandica (RU patentas 2034561 Cl). Žinomas gydymo būdas, kai naudojamos (RU patentas 2 234 958 C2) radono procedūros (vonia) su kintančių bangų lazerio terapija (veikiant pieno liaukas), o taip pat milimetrinio diapazono elektromagnetinės bangos, veikiant jomis biologiškai aktyvius VC-17 ir RP-6 taškus (RU patentas 2 257 921 C2). Šiomis priemonėmis padidinamas nespecifinis organizmo atsparumas bei patogenezė, tačiau šis poveikis yra ribotas.

Taip pat žinomas Indijos Mokslinio ir taikomojo tyrimo tarybos (Council of scientific and industrial research) specialistų grupės (sudaryta iš 12 tyrėjų) ištirtas vaistinių augalų Carum carvi (paprastasis kmynas), Zingiber officinale (imbieras tikrasis), Cuminum cyminum (kmyninis kuminas) ir Piper nigrum (juodasis pipiras) kompozicijos ekstrakto sinergetinis poveikis įvairiems gydomiesiems preparatams, padidinantis jų veikimo efektyvumą (WO 2004/067018 Al). Į šių preparatų sąrašą buvo įtraukti onkologijos praktikoje naudojami metotreksatas (methotrexate) ir 5-fluoruracilas (5-fluorouracil).

Šio sprendimo trūkumas yra tas, kad kompozicija tik pagerina cheminių gydomųjų preparatų veikimą.

Artimiausia siūlomam techniniam sprendimui yra farmacinė kompozicija, kuriai gaminti panaudojami aromatinių augalų eteriniai aliejai (WO 9 637 210 (A2) patentas). Kompoziciją sudaro Origanum vulgaris, Thymus vulgaris, Thymus zugis, Mentha piperita, Thymus serpilum, Saturea hortensis, Saturea montana, Saturea subricata, Carum corticum, Ocimum gratissimum, Moranda punctata, Mosią japonica ir Salvia officinalis augalų eteriniai aliejai. Kompozicija naudojama kolibaciliozės, dermatomikozės, , burnos gleivinės uždegimo, pūliuojančių žaizdų gydymui ir kt. atvejais.

Šio sprendimo trūkumas yra tas, kad palyginti sudėtingos vaistinių augalų kompozicijos ekstraktas pasižymi siauru veikimo spektru, nerodo biologinio aktyvumo gydant mastopatiją.

Siūlomo išradimo užduotis - sukurti preparatą - fitocheminių junginių derinį, kuris užtikrintų preparato biologinį aktyvumą gydant mastopatiją, būtų stabilus, pasižymėtų teigiamu veikimu žmogaus organizmui, būtų pranašesnis, palyginti su kitais žinomais analogiškais preparatais bei gydymo priemonėmis ir kurio gamyba būtų nesudėtinga bei preparatas būtų nebrangus.

Užduotis išsprendžiama fitocheminių junginių kompozicija, apimančia eterinius aliejus ir tirpiklį, kurioje eterinius aliejus sudaro fitocheminių junginių karvono, limoneno, steroidų, flavonoidų, esančių vaistinio augalo Carum carvi (kmyno) vaisiuose kompleksas, o tirpiklis yra 60-96 % etilo alkoholis, kur kompozicijos komponentai įeina tokiu masės dalių santykiu: Carum carvi vaisiai ir 60-96 % etilo alkoholis maždaug 1:5.

Kompozicija apima visą fitocheminių gydomųjų junginių kompleksą. Jį sudaro 5-7 % eterinio aliejaus, kuriame randame teipeno darinių: 50-60 % karvono, 30-40 % limoneno ir mažesniais kiekiais - dihidrokarvono, dihidrokarveolio, karveolio, linaloolio; komplekso sudėtyje taip pat yra flavonoidų - kvercetino ir kamferolio, taninų, dervingų medžiagų, baltymų, riebalų rūgščių. Šios farmakologiniu požiūriu aktyvios gydomosios medžiagos telkiasi vaistinio augalo Carum carvi (paprastojo kmyno) vaisiuose.

Carum carvi (paprastasis kmynas) yra dvimetis arba daugiametis žolinis augalas. Jo aukštis 50-100 cm. Stiebas status, šakotas. Žiedynas - sudėtinis skėtis. Žiedai maži, balti arba kiek rausvi. Žydi vidutinio klimato juostoje gegužės-birželio mėn. Vaisiai subręsta birželio-liepos mėn. Jie 3-7 mm ilgio ir 1,0-1,5 mm pločio. Paplitęs Europoje ir Azijoje. Kultivuojamas.

Augalo vaisiai naudojami maisto ir konditerijos pramonėje, parfumerijoje. Buityje - rauginant kopūstus, sūrių gamyboje, kepant duoną, kulinarijoje (KomeeB A. K., JĮnKopacTymue CT»eao6HMe pacTeHHH b HameM πητβηηη, M., 1980, 256 c.; Food technol. Abstr., 1974, N 93, p. 470) Jų dedama į giras ir kitus nealkoholinius ir alkoholinius gėrimus. Jauni lapai tinka salotoms, sriuboms. Iš žiedų bitės prineša per 100 kg/ha nektaro.

Carum carvi kaip vaistinis augalas yra įtrauktas į daugelio šalių farmakopėjas. Vaisių antpilas (mokslinėje medicinoje) vartojamas skrandžio hipofunkcįjos (atonijos) atveju, esant meteorizmui (JleKapcTBeiiHbie npenapaTM, pa3pemeHHtie κ npHMeHemno b CCCP, M., 1979, 351 c.). Tibeto medicinoje - esant neurozėms, medžiagų apykaitos sutrikimams, intoksikacijoms, akių skausmams (AaKopaciynme nojie3HBie pacTemoi ψ/ιορω Μοηγολβοκοη HapoAHofi PecnySnHKH, JI., 1985, 235 c.). Kinų ir indų medicinoje - esant įvairioms skrandžio-žarnyno ligoms, chroniškam cholecistitui, kaip laktogeninė priemonė (lllpeTep A. H., HnMeHOB M. Γ. Pecypcu Ba>KHenmex neKapcTBeHHBix pacTeHHH coBeTCKoro Jjajibiiero BoeroKa // Pecypcu i(HKOpacTyuĮnx jieKapcTBeHHBix pacTeHHH CCCP, JI., 1968, c. 66-79; Chopra R. N., Nayr S. L., Chopra S. C., Glossary of Indian medicinai plants, New Delhi, 1956, 330 p.). Liaudies medicinoje įvairūs kmynų vaisių ekstraktai - diuretinė, atsikosėjimą gerinanti, apetitą žadinanti, virškinimą gerinanti priemonė, esant meteorizmui (3aBpa>KHOB B. H., KuTaeBa P. H., ΧΜβπβΒ K. Φ., JleKapcTBeHHEie pacTemia IĮeHTpajitHoro TepnoseMM, 3-e Η3Λ., BopoueJK, 1977, 447 c.). Esant bronchų astmai, ascitui, egzemai, kaip antihelmintinė priemonė (Pojijiob A. X. /ĮnKopacTymae pacreHHH KaBKa3a, hx pacnpocTpaHenne, CBO&TBa n npuMeHeitue, Th(Į>jihc, 1908, 599 c.; Caxo6nAHHHOB C. C. AnKopacTymne jieKapcTBenHbie pacTeHna CpeąHen A3hh, TauiKeHT, 1984, 199 c.). Ekstraktas (eterinis aliejus) eksperimento sąlygomis rodo antibakterinį aktyvumą (EoHjĮapeHKO A. C. h ąp., AuTiiMniipoGnaa aKTHBHOCTB HeK0T0pUX paCTeHHH // ΦΗΤΟΗΙίΗΛΜ B HapOJĮHOM XO3HHCTBe, Knen, 1964, c. 170179). Eterinis aliejus pasižymi antituberkulioziniu veikimu (MmųeHKOBa E. JI. h ąp., HeucTBue aHTH6H0THHecKnx BeiųecTB H3 bbiciuhx pacTenuu Ha MHKoSaKTepini // Μκκροδ. arypHaji, 1985, t. 47, N 1, c. 77-80).

Pastaruoju metu kmynai naudojami medicinoje kaip priemonė nuo meteorizmo, spazminių skrandžio bei žarnyno negalavimų esant virškinimo sutrikimams (Holtmann G. S., Haag B. et ai., 2003, Effects of a fixed combination of pipermint oil and caraway oil on symptoms and ąuality of life in patients suffering from functional dyspepsia. Phytomedicine 10 (suppl. 4): 56-57; Medisch A. G., Holtmann G. S. ei ai., 2004, Treatment of functional dyspepsia with a herbai preparation: a double blind, randomized, placebo controlled, multicenter trial. Digestion 69: 45-52). Kmynų ekstraktas ir eterinis aliejus naudojami skrandžio opų gydymui (Khayyal M. T., El-Ghazaly M. A. et ai., 2001. Antiulcerogenic effect of some gastrointestinally acting plant extracts and their combination. Arzneimittelforschung 51: 545-553).Kmynai pasižymi fungicidiniu veikimu - slopina Candida albicans - tai vienas labiausia paplitusių žmogaus patogeninių mikromicetų (Deeptha K. M. et ai., 2006. Dose dependent inhibitory effect of dietary caraway on 1,2-dimethylhydrazine induced colonic aberrant crypt foci and bacterial enzime activity in rats, Invest. New Drugs 24(6): 479-488).

Pateikiame detalesnę kmynų (Carum carvi) vaisių biologiškai aktyvių cheminių junginių charakteristiką.

Kmynų vaisiuose eterinių aliejų randama nuo 2,6 iki 7,67 % (KapptieB M. O., ΦαρΜδκοχηΜΜ κβκοτορωχ 3$HpoMacjiHHHtix pacTeHHH φπορΒΐ TypKMeHHH, Auixa6a& 1973, 154 c.; CoSoJieBCKaa JI. A., TiopHHa E. B., TycaKOBa H. H. DtJmpoMacJimiHbie pacTeims jjajibiiero BocTOKa, Hoboch6hpck, 1972, c. 188; Karrer W. Konstitution und Vorkommen der organischen Pflanzenstoffe, Basei; Stuttgart, 1958, 1207 s). Eterinių aliejų sudėtyje randama procentais (%): karvono 41-60, limoneno 30, trans-dihidrokarvono, eis- dihidrokarvono, izodihidrokarvono, dihidrokarveolo, cis-karveolo, trans-karveolo, γ-terpineno, karvakrolo, izodihidrokarveolo, neodihidrokarveolo, neoizodihidrokarveolo, perilo alkoholio, dihidropinolo, acetaldehido, diacetilo, a-pineno, β-pineno, sabineno, mirceno, a-fenandreno, menteno, linaloolo, tricikleno, a-tuijono, β-tuijono, β-fencheno, kamieno, kareno, aterpineno, β-felandreno, β-kariofileno, β-kadineno, terpinoleno, timolo, trans-anetolo, kamforos, terpinenolo-4, petrozelino rūgšties (Embong M. B., Hudziger D. Molnar S., Essential oils irom species grown in Alberta: Caraway oil (Carum carvi) H Can J. Plant. Sci., 1977, vol. 57, N 2, p. 543-549; Ikeda R. M.et ai. The monoterpene hydrocarbon composition on some essential oils // J. Food, Sci., 1962, vol 27, N5, p. 455-458; Karrer W. Konstitution und Vorkommen der organischen Pflanzenstoffe, Basei, Stuttgart, 1958, 1207 s.; Masada Y. Analysis on essential oils by gas chromatography and mass-spektrometry, New York, 1976, 334 p.; Rothbacher H., Suten F. Ūber Hydroxylverbindungen dės Kūmmel - oils //Planta med., 1975, Bd. 28, H. 2, s. 112-123; Salveson A., Baerheim Svendsen A. Gas liąuid chromatographic separation and indication of the constituents of caraway seed oil // Planta med., 1976, Bd 30, H.l, p. 93-96; Schantz M., Huhtikengas A. Ūber die Bildung von Limonen und Carvon in Kūmmel - Carum carvi // Phytochemistry, 1971, vol 10, .N8, p. 1787-1793; Zderkiewicz T. Zawartošč oleiku w r6žnych fazach dojrzalosci owocow kminku di-i tetraploidalnego - Carum carvi L. //Actą agrobot., 1971, vol. 24, Nl, p. 121-122).

Kmynų eteriniame aliejuje randami steroidai (organiniai junginiai, jų molekulės pagrindą sudaro ciklopentanoperhidrofenantreno žiedai): stigmasterinas, palmitatas ir stigmasterino stearatas (Kartnig Th., Scholz G. Ūber einige Lipoid-Inhaltstoffe aus den Frūchten von

Pimpinella anisum und Carum carvi L. H Fette, Seifen, Anstrich mittel, 1969, Bd 71, H. 4, s.

276-280).

Fenolkarboninės rūgštys ir jų dariniai: 4-P-D-gliukopiranoziloksibenzoinė rūgštis (Dirks V.,

Hermann K., 4-(p-Glukopyranosyloxy)-benzoic acid, a characteristic phenolic constituent of the Apiaceae // Phytochemistry, 1984, vol. 23, N 8, p. 1811-1812).

Kumarinai (heterocikliniai deguonies junginiai, augaluose esantys glikozidų pavidalo kumarinai vadinami laktonais) - 0,02-0,48 % (BajiyųKaa A. Γ., rycbKOBa H. A., CoaepiKaHue KyMapuHOB b ch6hpckhx npencTaBHTenax ceM. 3ohtiihhhx // PacT. pecypcbi, 1972, t. 8, ββιπ. 4, c. 547-554; KapptueB M. O. <&apMaKOXHMHS ΗβκοτορΒίχ 3(įmpoMacjiHHHi>ix pacTenun φπορΒΐ TypKMeHHH, Auixa6ąn, 1973,154 c.): umbeliferonas, skopolitinas, herniarinas.

Flavonoidai (įvairios spalvos augaliniai pigmentai, priklauso glikozidams) - 0,98-1,24 % (Kunzemann J., Hermann K. Isolierung und Identifizierung der Flavon(ol)-0-glykoside in Kūmmel (Carum carvi L.), Fenchel (Foeniculum vulgare Mill,), Anis (Pimpinella anisum L.) und Koriander (Coriandrum sativum L.) und von Flavon-C-glykosiden im Anis, Z. Lebensmitteluntersuch. und Forsch., 1977, Bol 164, H. 3, s. 194-200): kvercetino 3gliukoronidas, izokvercizinas, rutinas, kvercetino 3-0-kofeoilgliukozidas, kempferolio 3glikozidas.

Riebalai (vienas svarbiausių ląstelės komponentų, glicerino ir riebalų rūgščių esteriai) - 18,421,18 %. Jų sudėtyje (%): angliavandeniliai 0,2; trigliceridai 66; laisvosios riebalų rūgštys 5,1 (petrozelino, palmitino, stearino, linoleno,oleino). (3apaflcKa» E. H., EopucioK K). Γ. HccJienoBaHHe χαίρΗΒΐχ khcjiot πλολοβ τμηηη - Carum carvi L. h araca Pimpinella anisum L. /HeKOTopue Bonpocw įapMaunn, KneB, 1956, c. 185-189; CTenaHeHKO Γ. A., TycaKOBa C. ĮĮ., YMapoB A. Y., Jlunuųbi ceMaii Carum carvi h Foeniculum vulgare // Xhmm npnpoą. coeflHH., 1980, N 6, c. 827-828; Hondelmann W. Das Vorkommen einer ungewohlingen Fettsaure, der Petroselinsaure, in der Familie der Doldengewachse als Ausganspunkt fur die Entwicklung neuer Olfruchte H Landbauforsch. Volkenrode, 1985, Jd 35, H. 4/, s. 185-190; Kleiman R., Spencer C. F., Search for new industrial oils: Umbelliferae seed oils rich in petroselinic acid H J. Americ. Oil Chem. Soc, 1982, vol. 59, N 1, p. 29-38).

Kompoziciją gaunama tokiu būdu: sausus Carum carvi (paprastojo kmyno) vaisius, kaip vaistinę žaliavą turinčius ne daugiau kaip 12 % drėgmės, ne mažiau kaip 5-6 % eterinių aliejų ir ne daugiau kaip 8-9 % mineralinių medžiagų, o pelenų, netirpstančių 10 % druskos rūgštyje, ne daugiau kaip 1,5-2,0 %, susmulkina ir ekstrahuoja 60-96 % etilo alkoholiu, geriau 96 % etilo alkoholiu, per 24-72 vai. 18-20 °C temperatūroje kratant, gaunama fitocheminių junginių tinktūra.

Taip paruošta kompoziciją naudojama mastopatijąi gydyti, kur kompozicijos terapinė dozė/dienai ligoniui skiriama 7,5-12,5 ml arba 150-250 lašų vartojimui per OS po 30-50 lašų 5 kartus per dieną ne mažiau kaip 30 min. prieš valgį, geriau vienodais laiko intervalais. Kompozicijos nešikliu yra vartojama sacharozę, kurios vienkartinę dozę sudaro 5-7 g sacharozės.

Ekstrakto aktyvumui įvertinti naudotos nelinijinės žiurkės ir pelės, o taip pat linijinės pelės DBA/2, BDF, C57B1 ir BALB/C. Eksperimentiniams gyvūnams buvo įskiepijami sarkomos (S-45), sarkomos (S-180) ir pieno liaukos adenokarcinomos (Ca 755) augliai. Tiriamasis ekstraktas eksperimentiniams gyvūnams buvo suleidžiamas į pilvo ertmę nuo kelių iki keliolikos ml/kg svorio. Ekstraktai žiurkėms buvo suleidžiami nuo eksperimentinio auglio ląstelių transplantacijos praėjus 3-5 paroms, pelėms - praėjus 1-2 paroms. Ekstraktai buvo leidžiami iki 5 kartų. Ekstrakto aktyvumo įvertinimo trukmė -10 parų.

Ekstrakto aktyvumas buvo vertinamas auglio ląstelių augimo slopinimu, išreiškiamu procentais (%), palyginus su kontroliniu variantu, o taip pat eksperimentinio gyvūno kūno ir blužnies masės pokyčiais (%). Gauti teigiami rezultatai. Kmyno vaisių ekstraktas (tinktūra) pieno liaukų adenokarcinomos (Ca 755) ląstelių augimą slopino 90 %.

Nustatyta terapinė dozė (TD) mg/kg. Ji yra 30-90 mg/kg per parą. Tuomet smulkaus svorio (50 kg) ligonei - 1500-2500 mg/50 kg per parą sausos kmyno vaisių masės, arba šį kiekį transformavus į 60 % etilo alkoholio ekstraktą (kai kmyno vaisių masės ir alkoholio santykis 1:5) turėsime (1,5 arba 2,5 g x 5) 7,5-12,5 ml alkoholio ekstrakto. Tai paros (tikriau, dienos norma). Ekstraktas naudotinas lašais (1 ml = 20 lašų). Taigi dienos norma (dozė) - 150-250 ekstrakto lašų. Ši dozė rekomenduojama per os vartoti 5 kartus per dieną po 30-50 ekstrakto lašų vienam kartui, mažiausiai pusę valandos prieš valgį. Tinkamiausias ekstrakto (tinktūros) nešėjas - sacharozę (cukrus), 5-7 g sacharozės, į kurią lašinama 30 arba 50 tinktūros lašų ir taip paruošiama vienkartinė dozė mastopatijai gydyti. Ši procedūra vienodais laiko intervalais per dieną atliekama 5 kartus.

Kmyno vaisių ekstrakto (tinktūros) efektyvumo vertinimas buvo atliktas ir kitu būdu vertinant citotoksinį kompozicijos poveikį piktybinių ląstelių kultūroje iri vitro. Tuo tikslu naudotas 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromidas (MTT). Tai vienas dažniausiai naudojamų būdų ląstelių proliferacijai ir citotoksiškumui vertinti (Mosmann T. 1983. Rapid calorimetric assay for cellular grovvth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assay. J. Immunol. Methods 65, 55-63). Tetrazolio druskos sudaro didelę heterociklinių organinių junginių grupę, kurios po redukcijos visada virsta spalvotais, dažnai netirpiais junginiais. Geltonos spalvos MTT redukuoja metaboliškai aktyvios ląstelės, veikiant mitochondrijų fermentams dehidrogenazėms. Šio proceso išdava - vandenyje netirpus, bet tirpstantis etanolyje, izopropanolyje bei rūgštiniame izopropanolyje, spalvotas formazanas. Vandenyje netirpus formazanas gali būti tirpinamas ir mineraliniame aliejuje, tačiau, šiuo atveju farmazano nuosėdos turi būti inkubuojamos iki 24 vai. 37 °C temperatūroje, kai dimetilsulfokside (DMSO) formazano nuosėdos ištirpsta nedelsiant (Kasagai S. N. et ai., 1990. A simple in vitro cytotoxicity tęst using the MTT (3-(4,5)dimethylyhiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) colometric assay; anglysis of angenol toxicity on dental pulp cells (RPC - C2A), Japan J. Pharmacol 52: 95-100). Gautas tirpalas vertinamas spektrometriškai 500-600 mm bangos ilgyje. Šis metodas visuotinai pripažintas, tinkamas priešvėžinių junginių tyrimams, svarbus klinikoje (Hatok J. E., Babusikova T., et ak, 2009. In vitro assays for the evaluation of drug resistance in tumor cells. Clin. Exp, Med. 9: 1-7).

Tyrimai atlikti tokia darbo tvarka.

Kmynų ekstrakto paruošimas.

Kmynų sėklos mechaniškai susmulkinamos (sumalamos). Susmulkinta masė ekstrahuojama 96 % etilo alkoholiu 24 vai. kambario temperatūroje kratant. Naudotas kmynų sėklų ir etilo alkoholio santykis 1:10 (1 g kmynų sėklų 10 ml 96 % etilo alkoholio).

Naudotos ląstelės bei jų auginimo sąlygos.

Darbe buvo vertintas spiritinio kmynų ekstrakto poveikis krūtų vėžio - MCF7, plaučių vėžio A549 bei neuroblastomos - N2A linijų ląstelėms. Ląstelių linijos gautos iš ATCC (American Type Culture Collection). Ląstelės augintos Iscove modifikuotoje Dulbeco terpėje (IMDM), praturtintoje 10 % fetalinių veršelių serumu ir antibiotikais - penicilinu (100 V V) ir streptomicinu (100ųg/ml). Ląstelės persėjamos 2-3 kartus per savaitę, jų monosluoksnį disperguojant EDTA-tripsino (4:1) mišiniu. Ląstelės auginamos 37 °C temperatūroje, aplinkoje esant 5 % CO₂ ir 95 % drėgmei.

Kmynų poveikio ląstelių gyvybingumui tyrimas.

Dieną prieš poveikį, tiriamos ląstelės išsėjamos maždaug 200 ląstelių/ml suspensijos tankiu į 96 duobučių polistirolinę plokštę. Po 24 vai. ląstelėms pradėjus daugintis, augimo terpė pakeičiama nauja terpe, kurioje yra skirtingos koncentracijos kmynų ekstraktai. Lygiagrečiai buvo tiriamas ir ekstragenįo- etilo alkoholio bei pavienio kmynų ekstrakto poveikis tiriamų ląstelių proliferacijai ir gyvybingumui. Abiem atvejais poveikio trukmė - 24 vai.

Ląstelių proliferacinio aktyvumo įvertinimas.

Tiriamų ląstelių proliferacija buvo vertinama naudojant MTT reagentą. Metodas paremtas gyvų ląstelių mitochondrijų fermentų gebėjimu tirpų geltonos spalvos MTT [3-(4,5dimetiltiazoI-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromidą] redukuoti iki violetinės spalvos netirpius kristalus formuojančio formazano. Gyvų ląstelių skaičius yra tiesiogiai proporcingas susidariusio produkto - formazano kiekiui, kuris įvertinamas spekrtofotometriškai 570 nm bangos ilgyje, gautus netirpius kristalus ištirpinus etanolyje. Proliferacijos įvertinimui naudojamas 0,2 mg/ml MTT tirpalas fosfatiniame buferyje, kurio 50 μΐ/cm² pilama ant ląstelių monosluoksnio prieš tai pašalinus auginimo terpę. Inkubuojama 1 vai., susidariusios nuosėdos tirpinamos etanoliu, kurio pilama 100 μΐ/cm². Optinis tankis matuojamas spekrtofotometriškai 570 nm bangos ilgyje.

Išradimo apibendrintam aiškinimui toliau pateikiami pavyzdžiai.

pavyzdys. Carum carvi alkoholinio ekstrakto (tinktūros) priešvėžinis aktyvumas (auglio ląstelių kultūros: Ca755, S-45, S-180)

Terapinė kmynų	Terapinė	Auglio	Auglio augimo	Kūno	Blužnies
tinktūros	kmynų	ląstelių	stabdymas,	biomasės	biomasės
dozė/dienai	dozė/dienai	kultūra (štamas)	%	kitimas, %	kitimas, %

pavyzdys. Carum carvi alkoholinio ekstrakto (tinktūros) priešvėžinis aktyvumas (auglio ląstelių linijos: MCF7, N2A, A549)

Dozė	Auglio ląstelių linija	Ląstelių augimo stabdymas, %
Kmynų	Tinktūros
	as lio ertinti	MCF7	Daugiau nei 80
> g ? F H 5	oo > S § ;a	N2A	Registruojamas
mg kmy 1 ml tini	.3 +3 o +-1 o 22 ·—! β w =L 3 į>		stabdymas
o g .?	A549	Registruojamas
O	~ O, U i		stabdymas

2-ojo pavyzdžio rezultatai gauti naudojant kitokią tyrimo metodiką, nei 1-ojo pavyzdžio atveju. Jie patvirtina 1-ojo pavyzdžio duomenis - Carum carvi tinktūra stabdo pieno liaukos adenokarcinomos vystymąsi (ląstelių dauginimąsi), ir tas stabdymas yra statistiškai patikimas.

Carum carvi vaisių tinktūra, atsižvelgiant įjoję esantį netoksinį fitocheminių junginių rinkinį ir jų gydomąjį efektą gali būti vertinama kaip nereceptinis fitoterapinis vaistinis preparatas. Jis tinka pieno liaukų adenokarcinomos profilaktikai ir gydymui. Taip pat gali būti naudojama pooperaciniu laikotarpiu bei chemoterapijos būdo taikymo atveju. Kmyno vaisių fitocheminiai junginiai tinktūros ar kitu pavidalu (milteliai, granulės) perspektyvūs derinyje su šiuolaikiniais vaistiniais preparatais, naudojamais vėžio įvairių formų chemoterapijoje, o taip pat derinyje su kitų vaistinių augalų produkuojamais junginiais, pasižyminčiais priešvėžinėmis savybėmis.

Claims (6)

IŠRADIMO APIBRĖŽTIS

1. Fitocheminių junginių kompozicija, apimanti eterinius aliejus ir tirpiklį, besiskirianti tuo, kad jos eterinius aliejus sudaro fitocheminių junginių karvono, limoneno, steroidų, flavonoidų, esančių vaistinio augalo Carum carvi (kmyno) vaisiuose kompleksas, o tirpiklis yra 60-96 % etilo alkoholis, kur kompozicijos komponentai įeina tokiu masės dalių santykiu: Carum carvi vaisiai ir 60-96 % etilo alkoholis maždaug 1:5.

2. Kompozicijos pagal 1 punktą gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad sausus Carum carvi vaisius, turinčius ne daugiau kaip 12 % drėgmės, ne mažiau kaip 5-6 % eterinių aliejų, ne daugiau kaip 8-9 % mineralinių medžiagų, iš kurių netirpstančiu 10 % druskos rūgštyje yra ne daugiau kaip 1,5-2,0 %, susmulkina ir ekstrahuoja 60-96 % etilo alkoholiu, geriau 96 % etilo alkoholiu, per 24-72 vai. 18-20 °C temperatūroje kratant, gaunant fitocheminių junginių tinktūrą.

3. Kompozicijos pagal 1 ir 2 punktą panaudojimas mastopatijai gydyti, besiskiriantis tuo, kad kompozicijos terapinė dozė/dienai skiriama 7,5-12,5 ml arba 150-250 lašų vartojimui per os po 30-50 lašų 5 kartus per dieną ne mažiau kaip 30 min. prieš valgį, geriau vienodais laiko intervalais.

4. Panaudojimas pagal 3 punktą besiskiriantis tuo, kad kompozicija vartoja su nešikliu.

5. Panaudojimas pagal 4 punktą besiskiriantis tuo, kad minėtas nešiklis yra sacharozė.

6. Panaudojimas pagal 4 punktą besiskiriantis tuo, kad minėtos sacharozės vienkartinę dozę sudaro 5-7 g sacharozės.