LT5328B

LT5328B - Sythetic peptides and uses therof for the prevention and therapy of cancer invasion and metastasis

Info

Publication number: LT5328B
Application number: LT2004079A
Authority: LT
Inventors: Matthias Rath; Shrirang Netke; Aleksandra Niedzwiecki
Original assignee: Matthias Rath
Priority date: 2004-08-23
Filing date: 2004-08-23
Publication date: 2006-03-27
Also published as: LT2004079A

Abstract

The present invention relates to synthetic peptides of the invention comprises PRKPKWDK (SEQ ID:2) peptide corresponding to amino acids of 85 to 92 of the matrix metalloproteinase (MMP-2), and fragments, analogs and homologs to SEQ ID:2. The invention also relates to the uses of such peptides as inhibitory of human cancer invasion and metastasis and further to the therapeutic use in preventing and treating cancer and other pathological conditions related to the degradation of extracellular matrix by MMPs.

Description

Šis išradimas yra susijęs su sintetiniais peptidais, kurie rodo inhibicinį aktyvumą prieš vėžio atsiradimą ir metastazavimą. Šio išradimo peptidai turi savyje PRKPKVVDK (SEQ ID:2) peptidą, atitinkantį matricines metalproteinazės-2 (MMP-2) 85-92 aminorūgštis, ir SEQ ID:2 fragmentus, analogus ir homologus. Šis išradimas taip pat yra susijęs su tokių peptidų, kaip žmogaus vėžio atsiradimo ir metastazavimo inhibitorių, panaudojimu, o taip pat ir su panaudojimu vėžio ir kitų su ekstraląstelinės matricos degradacija MMP poveikyje susijusių patologinių būklių prevencijai ir gydymui.The present invention relates to synthetic peptides which exhibit inhibitory activity against cancer onset and metastasis. The peptides of the present invention contain the PRKPKVVDK (SEQ ID: 2) peptide corresponding to amino acid 85-92 of the matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and fragments, analogs and homologues of SEQ ID: 2. The present invention also relates to the use of peptides such as inhibitors of the onset and metastasis of human cancer, as well as to the prevention and treatment of cancer and other pathological conditions associated with MMPs associated with extracellular matrix degradation.

Išradimo prielaidosPreconditions of the invention

Įvairios patologinės būklės, įskaitant neoplazines ligas, yra susijusios su padidintu matricinių metalproteinazių (MMP) aktyvumu. MMP yra grupė serino proteinazių, kurios gali ardyti ekstraląstelinę matricą (ECM). MMP yra išskiriamos ekstraląstelinėje matricoje jų zimogeninėje formoje. Aktyvacijos metu MMP fermentinis aktyvumas padidėja ir yra skaldoma ECM - procesas, kuris, kaip yra parodyta, vaidina pagrindinį vaidmenį vėžio metastazių susidaryme.Various pathological conditions, including neoplastic diseases, are associated with increased matrix metalloproteinase (MMP) activity. MMP is a group of serine proteinases that can disrupt extracellular matrix (ECM). MMPs are secreted in the extracellular matrix in their zymogenic form. During activation, MMPs increase their enzymatic activity and cleave ECM, a process that has been shown to play a key role in the formation of cancer metastases.

MMP šeimoje yra bent keletas proteinazių; į jų tarpą patenka MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9 ir MMP-13. Vėžio atveju MMP-2 yra susijusi su pirminio auglio augimu, o taip pat ir su auglio metastazavimu. Ši konkreti MMP gali skaldyti kolageną ir kitus ekstraląstelinės matricos (ECM) baltymus ir tai yra pirminė sąlyga vystytis vėžiui, jam atsirandant ir susidarant metastazėms.The MMP family contains at least some proteinases; these include MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9 and MMP-13. In cancer, MMP-2 is associated with primary tumor growth as well as tumor metastasis. This particular MMP can cleave collagen and other extracellular matrix (ECM) proteins and is a prerequisite for the development of cancer as it develops and metastases.

Nors buvo padėta daug pastangų priešvėžiniams agentams sukurti ir išbandyti, (žiūr., pavyzdžiui, Tarptautinės paraiškos publikaciją WO 90/10228), išlieka pastovus poreikis netoksiško terapinio agento, kuris galėtų efektyviai blokuoti MMP tarpininkaujamą ECM skaldymą, tokiu būdu sumažindamas vėžio ir kitų ligų plitimą.Although great efforts have been made to develop and test anticancer agents (see, e.g., International Application Publication WO 90/10228), there remains a constant need for a non-toxic therapeutic agent that can effectively block MMP-mediated ECM degradation, thereby reducing the spread of cancer and other diseases. .

Išradimo santraukaSummary of the Invention

Šis išradimas apima sintetinius peptidus, kurie gali efektyviai blokuoti vėžinių ląstelių atsiradimą. Šių agentų ir antikūnų prieš juos nauda yra galimybė juos panaudoti klinikoje vėžio atsiradimo ir metastazių blokavimui.The present invention includes synthetic peptides that can effectively block the appearance of cancer cells. The benefit of these agents and the antibodies against them is their potential for clinical use in blocking the onset of cancer and metastasis.

Šio išradimo tikslas yra pateikti sintetinį oligopeptidą, kurio aminorūgščių seka yra analogiška matricinei metalproteinazei 2 būdingai aminorūgščių sekai (85-92), kuri efektyviai blokuoja vėžio atsiradimą ir vėžio metastazes.It is an object of the present invention to provide a synthetic oligopeptide having an amino acid sequence analogous to that of matrix metalloproteinase 2 (85-92) which effectively blocks cancer onset and cancer metastasis.

Šio išradimo tikslas yra pateikti sintetinius peptidus, kurie tinka vėžio atsiradimui ir metastazavimui blokuoti, turinčius aminorūgščių seką PRKPKVVEDK.It is an object of the present invention to provide synthetic peptides having the amino acid sequence PRKPKVVEDK for blocking the onset and metastasis of cancer.

Kitas šio išradimo tikslas yra sintetinių peptidų, aprašytų šioje paraiškoje, panaudojimo būdas vėžinių susirgimų prevencijai ir gydymui. Dar kitas šio įgyvendinimo aspektas yra tai, kad sintetinių peptidų efektyvus kiekis yra naudojamas vėžio atsiradimo ir metastazavimo blokadai.Another object of the present invention is the use of the synthetic peptides described in this application for the prevention and treatment of cancers. Yet another aspect of this embodiment is that an effective amount of synthetic peptides is used to block cancer onset and metastasis.

Kitas šio išradimo tikslas yra pateikti oligopeptidą, turintį PRKPKVVDK (SEQ ID: Nr.2).Another object of the present invention is to provide an oligopeptide containing PRKPKVVDK (SEQ ID NO: 2).

Pageidautina, kad polipeptidas būtų iš maždaug 6-20 liekanų. Geriausia, kai polipeptidas yra iš maždaug 8-10 liekanų.Preferably, the polypeptide is from about 6-20 residues. Preferably, the polypeptide is from about 8-10 residues.

Pageidautina, kad sintetinio peptido koncentracija būtų nuo 1 μιτι iki 500 μΜ. Geriausia, kai sintetinio peptido koncentracija yra nuo 50 μιτι iki 200 μΜ.The concentration of the synthetic peptide is preferably from 1 μιτι to 500 μΜ. Preferably, the concentration of the synthetic peptide is from 50 μιτι to 200 μΜ.

Kitas šio išradimo tikslas yra imunogeninis oligopeptidas, kuris įeina į farmacinę kompoziciją, sudarytą iš farmaciniu požiūriu priimtino nešiklio ir oligopeptidą. Šis oligopeptidas gali būti naudojamas kaip vakcina. Oligopeptido turinti farmacinė kompozicija gali būti naudojama imuniniam atsakui prieš baltymo epitopą, kuriame yra šio oligopeptido seka (pvz. SEO.ID.2), sukelti.Another object of the present invention is an immunogenic oligopeptide which is included in a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier and an oligopeptide. This oligopeptide can be used as a vaccine. An oligopeptide-containing pharmaceutical composition can be used to elicit an immune response against a protein epitope containing the oligopeptide sequence (e.g., SEO.ID.2).

Kitas šio išradimo tikslas yra tai, kad kompozicijos ir būdai būtų realizuojami ir in vivo, ir in vitro.Another object of the present invention is to provide the compositions and methods both in vivo and in vitro.

Šiame išradime pateikiamas sintetinis oligopeptidas, turintis žmogaus MMP-2 analogišką aminorūgščių seką.The present invention provides a synthetic oligopeptide having an analogous amino acid sequence of human MMP-2.

Šiame išradime taip pat pateikiama oligopeptidą, kurie blokuoja vėžinių ląstelių atsiradimą ir metastazavimą, modifikacija išimant vieną arba daugiau aminorūgščių liekanų N-baigmės gale.The present invention also provides a modification of an oligopeptide that blocks the appearance and metastasis of cancer cells by removing one or more amino acid residues at the N-terminus.

Šiame išradime pateikiama oligopeptidų, kurie blokuoja vėžinių ląstelių atsiradimą ir metastazavimą, modifikacija išimant vieną arba daugiau aminorūgščių liekanų C-baigmės gale.The present invention provides a modification of oligopeptides that block the appearance and metastasis of cancer cells by removing one or more amino acid residues at the C-terminus.

Šiame išradime pateikiama oligopeptidų, kurie blokuoja vėžinių ląstelių atsiradimą ir metastazavimą, modifikacija išimant vieną arba daugiau aminorūgščių liekanų N-baigmės ir C-baigmės galuose.The present invention provides a modification of oligopeptides that block the appearance and metastasis of cancer cells by removing one or more amino acid residues at the N-terminus and C-terminus.

Šiame išradime pateikiama oligopeptidų, kurie blokuoja vėžinių ląstelių atsiradimą ir metastazavimą, modifikacija pakeičiant vieną arba daugiau aminorūgščių liekanų duotoje sekoje, neatsižvelgiant į pakeistos liekanos krūvį ir poliškumą.The present invention provides a modification of oligopeptides that block the appearance and metastasis of cancer cells by replacing one or more amino acid residues in a given sequence, regardless of the charge and polarity of the altered residue.

Šiame išradime pateikiama oligopeptidų, kurie blokuoja vėžinių ląstelių atsiradimą ir metastazavimą, modifikacija pakeičiant vieną arba daugiau aminorūgščių liekanų duotoje sekoje panašaus krūvio ir(arba) poliškumo aminorūgščių liekanomis.The present invention provides a modification of oligopeptides that block the appearance and metastasis of cancer cells by replacing one or more amino acid residues in a given sequence with amino acid residues of similar charge and / or polarity.

Šiame išradime pateikiama oligopeptidų, kurie blokuoja vėžinių ląstelių atsiradimą ir metastazavimą, modifikacija išimant vieną arba daugiau aminorūgščių liekanų iš duotos sekos.The present invention provides a modification of oligopeptides that block the appearance and metastasis of cancer cells by removing one or more amino acid residues from a given sequence.

Šiame išradime pateikiama oligopeptidų, kurie blokuoja vėžinių ląstelių atsiradimą ir metastazavimą, modifikacija įvedant dvi arba daugiau modifikacijas.The present invention provides a modification of oligopeptides that block the appearance and metastasis of cancer cells by introducing two or more modifications.

Šiame išradime pateikiama oligopeptidų, kurie blokuoja vėžinių ląstelių atsiradimą ir metastazavimą, modifikacija pakartojant oligopeptidų sekas vieną arba daugiau kartų, kur kiekviena iš jų yra kovalentiškai prijungta prie vienos arba daugiau kartojamų oligopeptidinių sekų.The present invention provides a modification of oligopeptides that block the appearance and metastasis of cancer cells by repeating the oligopeptide sequences one or more times, each of which is covalently linked to one or more repeat oligopeptide sequences.

Kitas šio išradimo tikslas yra sintetinių peptidų panaudojimas imunogenais antikūnams gaminti, kad tokie pasigaminę antikūnai galėtų efektyviai blokuoti vėžio atsiradimą ir metastazes.Another object of the present invention is the use of synthetic peptides as immunogens for the production of antibodies so that such produced antibodies can effectively block the onset of cancer and metastasis.

Šiame išradime yra pateikiamas vieno arba daugiau oligopeptidų prevencinis arba terapinis panaudojimas tiesioginiam arba konkurenciniam MMP-2 metabolinio veikimo arba sąveikos sumažinimui arba blokavimui, įvedant juos į veną arba kitu terapiniu požiūriu priimtinu būdu.The present invention provides the prophylactic or therapeutic use of one or more oligopeptides to directly or competitively reduce or block the metabolic action or interaction of MMP-2 by intravenous or other therapeutically acceptable route.

Šiame išradime yra pateikiamas vieno arba daugiau oligopeptidų prevencinis arba terapinis panaudojimas netiesioginiam MMP metabolinio veikimo arba sąveikos blokavimui, panaudojant juos kaip vakcinas poodiniu arba kitu terapiniu požiūriu priimtinu būdu specifiniam imuniniam atsakui, kuris gali dalinai arba pilnai blokuoti MMP metaboiinę sąveiką, stimuliuoti. Tinkamiausias įgyvendinimo variantas apima MMP-2.The present invention provides the preventive or therapeutic use of one or more oligopeptides to indirectly block the metabolic action or interaction of MMPs as vaccines by subcutaneous or other therapeutically acceptable route to stimulate a specific immune response that may partially or completely block MMP metabolic interaction. A preferred embodiment includes MMP-2.

Šiame išradime yra pateikiamas vieno arba daugiau oligopeptidų prevencinis arba terapinis panaudojimas, kur oligopeptidai yra kopuliuoti su haptenais imuniniam atsakui, o tuo pačiu ir terapiniam efektyvumui, sustiprinti.The present invention provides a preventive or therapeutic use of one or more oligopeptides, wherein the oligopeptides are coupled to hapten to enhance the immune response and thereby therapeutic efficacy.

Šiame išradime yra pateikiamas vieno arba daugiau oligopeptidų prevencinis arba terapinis panaudojimas, kad oligopeptidai funkcionuotų kaip grįžtamojo ryšio reguliatoriai specifiniam MMP-2 baltymų sintezės ląsteliniame lygyje sustabdymui arba jos greičio sumažinimui.The present invention provides the preventive or therapeutic use of one or more oligopeptides to function as feedback regulators for specifically stopping or reducing the rate of MMP-2 protein synthesis at the cellular level.

Šiame išradime yra pateikiamas vienas arba daugiau oligopeptidų, kurie gali blokuoti vėžinių ląstelių atsiradimą ir metastazavimą, kaip vakcina specifiniams antikūnams, skirtiems ligos, kuri yra susijusi su MMP-2, diagnozavimui arba klinikiniam šios ligos progresavimo arba regresijos monitoringui, produkuoti.The present invention provides one or more oligopeptides that can block the appearance and metastasis of cancer cells as a vaccine for the production of specific antibodies for the diagnosis or clinical monitoring of the progression or regression of MMP-2-associated disease.

Šiame išradime yra pateikiamas vieno arba daugiau oligopeptidų, kurie blokuoja vėžinių ląstelių atsiradimą ir metastazavimą, panaudojimas vėžio prevencijai ir gydymui.The present invention provides the use of one or more oligopeptides that block the appearance and metastasis of cancer cells for the prevention and treatment of cancer.

Šiame išradime yra pateikiamas vieno arba daugiau oligopeptidų, kurie blokuoja vėžinių ląstelių atsiradimą ir metastazavimą, panaudojimas, kur šie oligopeptidai gali būti duodami pacientui kaip vakcina, injekcijomis, infuzija, inhaliaciniu būdu, kaip žvakutės arba su kitais farmaciniais nešikliais ir(arba) kitais įvedimo būdais.The present invention provides the use of one or more oligopeptides that block the appearance and metastasis of cancer cells, wherein the oligopeptides may be administered to a patient as a vaccine, injection, infusion, inhalation, suppositories or other pharmaceutical carriers and / or other modes of administration. .

Trumpas brėžinių aprašymasBrief description of the drawings

FIG.1 pavaizduota MMP2 fermento aminorūgščių seka. Lengvesniam identifikavimui inhibicinio aktyvumo tyrimams pasirinktos aminorūgščių sekos apvestos rėmeliais. Etalonu buvo naudojama aminorūgščių seka TMRKPRCGNPDVAN (taip pat apvesta rėmeliu), kuri, kaip parodė kiti (Loitta and Associates), inhibuoja MMP2 aktyvumą.Figure 1 shows the amino acid sequence of the MMP2 enzyme. For easier identification of inhibitory activity assays, the selected amino acid sequences are framed. The standard used was the amino acid sequence TMRKPRCGNPDVAN (also framed), which has been shown to inhibit MMP2 activity by others (Loitta and Associates).

FIG.2 parodytas įvairių tirtų oligopeptidų inhibicinių efektų palyginimas. Oligopeptidas PRKPKVVDK labai efektyviai blokuoja vėžinių ląstelių įsiskverbimą naudojant matrigelio testą su žmogaus melanomos vėžinėmis ląstelėmis A2058.Figure 2 shows a comparison of the inhibitory effects of the various oligopeptides tested. The oligopeptide PRKPKVVDK is very effective at blocking cancer cell invasion using the matrigel assay with human melanoma cancer cells A2058.

FIG.3 parodytas oligopeptido PRKPKVVDK inhibicinis poveikis blokuojant vėžinių ląstelių įsiskverbimą, naudojant matrigelio testą su žmogaus melanomos vėžinėmis ląstelėmis A2058.Figure 3 shows the inhibitory effect of the oligopeptide PRKPKVVDK on blocking cancer cell invasion using the matrigel assay on human melanoma cancer cells A2058.

FIGA parodytas oligopeptido PRKPKVVDK inhibicinis poveikis blokuojant vėžinių ląstelių įsiskverbimą, naudojant matrigelio testą su žmogaus krūties vėžinėmis ląstelėmis MCF7.FIGA shows the inhibitory effect of the oligopeptide PRKPKVVDK on blocking cancer cell invasion using the matrigel assay with human breast cancer cells MCF7.

Smulkus išradimo aprašymasDetailed Description of the Invention

Apibrėžimai: Čia naudojamas terminas “peptidas” reiškia organinius junginius, susidedančius iš dviejų arba daugiau aminorūgščių, kovaientiškai sujungtų peptidinėmis jungtimis; peptidais gali būti dipeptidas (kuris turi dvi aminorūgščių liekanas), tripeptidas (tris aminorūgščių liekanas) ir t.t.Definitions: As used herein, the term "peptide" means an organic compound consisting of two or more amino acids covalently linked by peptide bonds; peptides may be a dipeptide (which has two amino acid residues), a tripeptide (three amino acid residues) and the like.

Čia naudojamas terminas “oligopeptidas” reiškia peptidą, kurio ilgis yra paprastai mažesnis nei 30 liekanų. Oligopeptidų ilgis šiam išradimui nėra lemiamas tol, kol yra išlaikomas tinkamas epitopas. Pageidautina, kad oligopeptidas būtų kaip galima mažesnis, kol dar išsilaiko iš esmės pilnas didelio oligopeptido biologinis aktyvumas ir kol jis veiksmingai blokuoja vėžinių ląstelių atsiradimą ir metastazes.As used herein, the term "oligopeptide" refers to a peptide typically less than 30 residues in length. The length of the oligopeptides of the present invention is not critical as long as a suitable epitope is maintained. Preferably, the oligopeptide should be kept as low as possible while substantially full biological activity of the large oligopeptide is maintained, and as long as it effectively blocks the appearance of cancer cells and metastasis.

Šioje paraiškoje “oligopeptidas” yra naudojamas pakaitomis su “sintetinis peptidas”. Šiame išradime naudojami oligopeptidai yra “izoliuoti”, bet “biologiškai gryni” sintetiniai peptidai.In this application, "oligopeptide" is used interchangeably with "synthetic peptide". The oligopeptides used in the present invention are "isolated" but "biologically pure" synthetic peptides.

Čia naudojami vienos raidės simboliai aminorūgščių liekanoms pažymėti yra: A (alaninas), R (argininas), N (asparaginas), D (asparto rūgštis), C (cisteinas), Q (glutaminas), E (glutamo rūgštis), G (glicinas), H (histidinas), I (izoleucinas), L (leucinas), K (lizinas), M (metioninas), F (fenilalaninas), P (prolinas), S (serinas), T (treoninas), W (triptofanas) ir Y (tirozinas).The one-letter symbols used here to denote amino acid residues are: A (alanine), R (arginine), N (asparagine), D (aspartic acid), C (cysteine), Q (glutamine), E (glutamic acid), G (glycine) ), H (histidine), I (isoleucine), L (leucine), K (lysine), M (methionine), F (phenylalanine), P (proline), S (serine), T (threonine), W (tryptophan) ) and Y (tyrosine).

Aminorūgščių pakeitimai yra paprastai vienos liekanos pakeitimas. Oligopeptidui gauti gali būti daromi pakeitimai, iškirpimai, įterpimai arba bet koks jų derinys. Konservatyvius aminorūgščių pakeitimus sudaro vienos aminorūgšties pakeitimas kita panašaus krūvio, dydžio ir/arba hidrofobiškumo aminorūgštimi, toks kaip, pavyzdžiui, glutamo rūgšties (E) pakeitimas asparto rūgštimi (D). Nekonservatyvius pakeitimus sudaro vienos arba daugiau aminorūgščių pakeitimas aminorūgštimis, turinčiomis nepanašų krūvį, dydį ir/arba hidrofobiškumą, toks kaip, pavyzdžiui, glutamo rūgšties (E) pakeitimas valinu (V). Šis išradimas apima konservatyvius oligopeptido pakeitimus pakeitimų, iškirpimų, įterpimų arba bet kokio jų derinio požiūriu tol, kol iš esmės nepakinta jo vėžinių ląstelių atsiradimo ir metastazių blokavimo efektyvumas.Amino acid substitutions are usually substitutions of one residue. Modifications, excavations, insertions, or any combination thereof may be used to obtain the oligopeptide. Conservative amino acid substitutions include the replacement of one amino acid with another with similar charge, size and / or hydrophobicity, such as, for example, the replacement of glutamic acid (E) with aspartic acid (D). Non-conservative modifications include the replacement of one or more amino acids with amino acids of unequal charge, size, and / or hydrophobicity, such as, for example, the replacement of glutamic acid (E) with valine (V). The present invention encompasses conservative alterations of the oligopeptide in terms of alterations, excision, insertion, or any combination thereof, as long as its efficacy in blocking cancer cells and blocking metastasis is not substantially altered.

Rath ir kt. (J. Applied Nutr. 44:62-69, 1992; J. Orthomolecular Med. 8:11-20, 1993) padarė prielaidą, kad didelio hidrofiliškumo maksimumo ir konformacijos bei elektrinio krūvio oligopeptidų sekos gali tarpininkauti įvairių ligų patogenezėje. Pagal šią prielaidą, pasirinktos MMP fermento aminorūgščių sekos gali blokuoti fermento poveikį prisijungdamos prie substrato komplementarios sekos. Ši koncepcija visiškai skiriasi nuo koncepcijos, kurią detalizavo Liota ir bendraautoriai (U.S. Pat. No. 5,372,809), kurioje oligopeptidas blokuoja cinko molekulę fermente. Eksperimentiniai duomenys, rodantys, kad įvairių tipų baltymų kompleksai ląstelėse gali modifikuoti baltymų aktyvumą ląstelėje (Gavin ir bendraautoriai, Nature 415:141-147, 2002) iš esmės patvirtina šį postulatą. Čia cituoti literatūros šaltiniai yra pridedami pilnos apimties.Rath et al. (J. Applied Nutr. 44: 62-69, 1992; J. Orthomolecular Med. 8: 11-20, 1993) have suggested that high hydrophilicity maxima and conformations and electrical charge oligopeptide sequences may mediate the pathogenesis of various diseases. Under this assumption, selected amino acid sequences of the MMP enzyme can block the enzyme's effects by binding to the complementary sequence of the substrate. This concept is completely different from the concept detailed by Liota and co-authors (U.S. Pat. No. 5,372,809), in which an oligopeptide blocks a zinc molecule in an enzyme. Experimental data showing that various types of protein complexes in cells can modify cellular protein activity (Gavin et al., Nature 415: 141-147, 2002) largely confirm this postulate. References cited herein are attached in their entirety.

Šiame išradime mes identifikavome galimas oligopeptidų sekas MMP-2 aminorūgščių sekoje ir radome, kad šios oligopeptidų sekos veiksmingai stabdo MMP-2 funkcinį aktyvumą, naudojant in vitro vėžinių ląstelių įsiskverbimą į ECM kaip tyrimo modelį.In the present invention, we identified potential oligopeptide sequences in the amino acid sequence of MMP-2 and found that these oligopeptide sequences effectively inhibited the functional activity of MMP-2 using in vitro cancer cell penetration into the ECM as a model of study.

Neapsiribojant kokia nors teorija arba mechanizmu, šiame išradime yra pateikiami oligopeptidai, kurie gali efektyviai blokuoti vėžinių ląstelių atsiradimą ir metastazes.Without being limited by theory or mechanism, the present invention provides oligopeptides that can effectively block the appearance of cancer cells and metastasis.

Vienas veikimo mechanizmas gali būti tai, kad MMP-2 prisijungia prie tikslinių ECM molekulių per specifines surišimo vietas. Tokiu būdu blokuojant šias surišimo vietas galima išvengti MMP-2 susirišimo su ECM substrato molekulėmis, sulaikyti ECM destrukciją ir taip išvengti vėžio ir kitų ligų išpūtimo organizme.One mechanism of action may be that MMP-2 binds to target ECM molecules through specific binding sites. In this way, blocking these binding sites can prevent the binding of MMP-2 to ECM substrate molecules, prevent ECM destruction, and thus prevent the outbreak of cancer and other diseases in the body.

MMP-2 fermente buvo identifikuota keletas surišimo vietų; šiame išradime pateikiama, kad sintetiniai šių oligopeptidų sekų analogai veiksmingai apsaugo nuo ECM destrukcijos. Buvo parodyta, kad vienas iš terapinių oligopeptidų yra PRKPKVVDK, kuris inhibuoja vėžinių ląstelių įsiskverbimą maždaug 90 %.Several binding sites have been identified in the MMP-2 enzyme; the present invention provides that synthetic analogs of these oligopeptide sequences effectively protect against ECM destruction. One of the therapeutic oligopeptides has been shown to be PRKPKVVDK, which inhibits cancer cell invasion by about 90%.

Be to, šiame išradime pateikiamas šio oligopeptido terapinis panaudojimas kitoms su MMP susijusioms ligoms. Kadangi MMP-2 gali naudoti tas pačias vietas susirišimui su jos tikslinėmis molekulėmis ECM-oje, šiame išradime aprašytas oligopeptidas gali taip pat stabdyti kitas ligas. Taigi, čia aprašytų oligopeptidų prevencinis ir terapinis panaudojimas neapsiriboja vėžiu, bet jie taip pat gali būti naudojami širdies ir kraujagyslių ligos ir kitų patologinių būklių, kurios yra susiję su ECM destrukcija veikiant MMP, atveju. Šie oligopeptidai gali būti įvedami pacientams kaip vakcina, injekcijų, infuzijų, inhaliacijų, žvakučių pavidalu arba su kitais farmaciškai priimtinais nešikliais ir/arba naudojant kitas įvedimo priemones.Furthermore, the present invention provides therapeutic use of this oligopeptide in other MMP-related diseases. Because MMP-2 can use the same sites for binding to its target molecules in the ECM, the oligopeptide of the present invention may also stop other diseases. Thus, the preventive and therapeutic uses of the oligopeptides described herein are not limited to cancer, but may also be used in cardiovascular disease and other pathological conditions that are associated with ECM destruction by MMPs. These oligopeptides may be administered to patients in the form of a vaccine, injection, infusion, inhalation, suppository, or other pharmaceutically acceptable carriers and / or other delivery vehicles.

Šio išradimo peptidų ir kompozicijų įvedimo būde yra naudojama daugybė žinomų vartojimo būdų, tokių kaip peroralinis, i.v., subkutaninis, transkutaninis ir vietinis vartojimo būdai. Tinkamiausiame šio išradimo būde yra naudojamos farmacinės kompozicijos parenteriniam įvedimui.Many known routes of administration, such as oral, i.v., subcutaneous, transcutaneous and topical, are used in the method of administering the peptides and compositions of the present invention. Most preferably, the present invention provides pharmaceutical compositions for parenteral administration.

Šiame išradime yra pateikiami oligopeptidai, kurie taip pat gali būti naudojami kaip vakcinos sukelti antikūnams, skirtiems panaudoti ligų, kuriose dalyvauja MMP (ypatingai MMP-2), diagnozei, o taip pat klinikinei tokios ligos progresavimo arba regresijos kontrolei analizuojant kraują arba naudojant kitus tinkamus diagnostinius testus.The present invention provides oligopeptides which can also be used as vaccine-induced antibodies for use in the diagnosis of diseases in which MMPs (particularly MMP-2) are involved, as well as for clinical control of the progression or regression of such disease by blood analysis or other suitable diagnostic methods. tests.

Šiame išradime realizuojami sintetiniai peptidai, kurie veiksmingai blokuoja vėžinių ląstelių atsiradimą. Tokių agentų ir antikūnų prieš juos privalumai yra galimybė juos pritaikyti klinikoje vėžio atsiradimo ir metastazių prevencijai ir gydymui. Geriau, kai vėžio atsiradimo ir metastazių blokavimui yra naudojami sintetiniai oligopeptidai, kurie turi SEQ ID.2 aminorūgštis. Dar geriau, kai vėžio atsiradimo ir metastazių blokavimui naudojami sintetiniai oligopeptidai yra įterpti farmacinėje kompozicijoje.The present invention provides synthetic peptides that effectively block the appearance of cancerous cells. The advantages of such agents and antibodies against them are their potential clinical application in the prevention and treatment of cancer and metastasis. Preferably, synthetic oligopeptides having the amino acids of SEQ ID.2 are used to block cancer onset and metastasis. More preferably, the synthetic oligopeptides used to block cancer onset and metastasis are incorporated into a pharmaceutical composition.

Oligopeptidas gali būti iš maždaug 6-20 liekanų. Geriau, kad oligopeptidas būtų iš maždaug 8-10 liekanų. Visų geriausia, kad sintetinis oligopeptidas būtų 8 aminorūgščių liekanų ilgio.The oligopeptide can be from about 6-20 residues. Preferably, the oligopeptide is from about 8-10 residues. Most preferably, the synthetic oligopeptide should be 8 amino acid residues in length.

Pageidautina, kad sintetinių peptidų koncentracija būtų nuo 1 μΜ iki 500 μΜ. Geriausia, kai sintetinių peptidų koncentracija yra nuo 50 μΜ iki 200 μΜ.The concentration of synthetic peptides is preferably from 1 μΜ to 500 μΜ. Preferably, the concentration of synthetic peptides is between 50 μΜ and 200 μΜ.

Kitas šio išradimo tikslas yra šių sintetinių peptidų panaudojimas imunogenais antikūnams generuoti taip, kad tokie generuoti antikūnai galėtų efektyviai blokuoti vėžio atsiradimą ir metastazes.Another object of the present invention is the use of these synthetic peptides as immunogens to generate antibodies such that such generated antibodies can effectively block the onset of cancer and metastasis.

Pageidautina, kad sintetinio oligopeptido ilgis būtų 8 aminorūgščių liekanos. Kitas šio išradimo tikslas yra imunogeninis oligopeptidas, kuris yra įterptas į farmacinę kompoziciją, susidedančią iš farmaciniu požiūriu priimtino nešiklio ir oligopeptidų. Oligopeptidas gali būti naudojamas kaip vakcina. Oligopeptido turinti farmacinė kompozicija gali būti naudojama imuniniam atsakui sukelti prieš baltymą, kuris apima epitopą, turintį šio oligopeptido seką (pvz. SEQ.ID.2).Preferably, the synthetic oligopeptide has a length of 8 amino acids. Another object of the present invention is an immunogenic oligopeptide which is incorporated into a pharmaceutical composition consisting of a pharmaceutically acceptable carrier and oligopeptides. The oligopeptide can be used as a vaccine. An oligopeptide-containing pharmaceutical composition can be used to elicit an immune response against a protein comprising an epitope having the sequence of that oligopeptide (e.g., SEQ.ID.2).

Šiame išradime yra pateikiamas sintetinis oligopeptidas, turintis aminorūgščių seką, analogišką aminorūgščių sekai, esančiai žmogaus MMP-2 baltyme.The present invention provides a synthetic oligopeptide having an amino acid sequence analogous to the amino acid sequence present in human MMP-2 protein.

Sintetinio oligopeptido amino- ir(arba) karboksi-gale gali būti atitinkamai aminogrupė (-NH2) arba karboksigrupė (-COOH). Kitu atveju oligopeptido aminogalas gali, pavyzdžiui, reikšti hidrofobinę grupę, įskaitant, bet neapsiribojant, karbobenzilo, dansilo, t-butoksikarbonilo, dekanoilo, naftoilo arba kitą karbohidrato grupę; acetilo grupę, 9-fluorenilmetoksikarbonilo (FMOC) grupę; arba modifikuotą, negamtinės aminorūgšties liekaną. Kitu atveju oligopeptido karboksi-galas gali, pavyzdžiui, reikšti amidogrupę; t-butoksikarbonilo grupę; arba modifikuotą, negamtinės aminorūgšties liekaną. Kitu atveju, šis išradimas apima sintetinius oligopeptidus, kurie blokuoja vėžinių ląstelių atsiradimą ir metastazes, su išimta amino liekana N-baigmės gale arba C-baigmės gale. Šiame išradime taip pat pateikiama oligopeptidų, kurie blokuoja vėžinių ląstelių atsiradimą ir metastazes, modifikacija pakeičiant aminorūgšties liekaną duotoje sekoje neatsižvelgiant į pakeičiamos liekanos krūvį ir poliškumą.The amino and / or carboxy terminus of the synthetic oligopeptide may be an amino group (-NH 2) or a carboxy group (-COOH), respectively. Alternatively, the aminogal of an oligopeptide may, for example, represent a hydrophobic group including, but not limited to, carbobenzyl, dansyl, t-butoxycarbonyl, decanoyl, naphthoyl, or other carbohydrate group; an acetyl group, a 9-fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC) group; or a modified, non-natural amino acid residue. Alternatively, the carboxy terminus of the oligopeptide may, for example, represent an amido group; a t-butoxycarbonyl group; or a modified, non-natural amino acid residue. Alternatively, the present invention encompasses synthetic oligopeptides that block the appearance of cancer cells and metastases with an amino residue removed at the N-terminus or at the C-terminus. The present invention also provides a modification of oligopeptides that block the appearance and metastasis of cancer cells by replacing an amino acid residue in a given sequence without regard to the charge and polarity of the substituted residue.

Reikėtų suprasti, kad šis išradimas taip pat apima peptidinius analogus, kuriuose vienas arba daugiau amidinių ryšių gali būti pakeisti neamidiniu ryšiu, geriausia pakeistu amidu arba amido izostere. Taigi, nors aminorūgščių liekanos peptiduose paprastai yra aprašomos išreiškiant aminorūgštimis ir tinkamiausiuose šio išradimo įgyvendinimo variantuose duodami peptidų pavyzdžiai, specialistas supras, kad neamidiniu ryšių turinčiuose įgyvendinimo variantuose čia naudojamas terminas “aminorūgštis” arba “liekana” reiškia kitas bifunkcines liekanas, turinčias grupes, kurių struktūra yra panaši į šonines aminorūgščių grandines. Be to, aminorūgščių liekanos gali būti blokuotos arba neblokuotos.It is to be understood that the present invention also encompasses peptide analogs in which one or more amide linkages may be replaced by a non-amide linkage, preferably an amide or amide isostere. Thus, while amino acid residues in peptides are generally described in terms of amino acids and most preferred embodiments of the present invention provide examples of peptides, one skilled in the art will appreciate that the term "amino acid" or "residue" as used herein in non-amidic linkages implies other bifunctional residues having is similar to the side chains of amino acids. In addition, amino acid residues may be blocked or unblocked.

Šiame išradime pateikiama oligopeptidų, kurie blokuoja vėžinių ląstelių atsiradimą ir metastazes, modifikacija pakartojant oligopeptidų sekas vieną arba daugiau kartų, kur kiekviena iš jų yra kovalentiškai prijungta prie vienos arba daugiau kartojamų oligopeptidinių sekų.The present invention provides a modification of oligopeptides that block the appearance and metastasis of cancer cells by repeating the oligopeptide sequences one or more times, each of which is covalently linked to one or more repeat oligopeptide sequences.

Šiame išradime yra pateikiamas vieno arba daugiau oligopeptidų prevencinis arba terapinis panaudojimas netiesioginiam MMP metabolinio veikimo arba sąveikos blokavimui, panaudojant juos kaip vakcinas poodiniu arba kitu terapiniu požiūriu priimtinu būdu specifiniam imuniniam atsakui, kuris gali dalinai arba pilnai blokuoti MMP metabolinę sąveiką, stimuliuoti. Tinkamiausias įgyvendinimo variantas apima MMP-2.The present invention provides the preventive or therapeutic use of one or more oligopeptides to indirectly block the metabolic action or interaction of MMPs as vaccines by subcutaneous or other therapeutically acceptable route to stimulate a specific immune response that may partially or completely block MMP metabolic interaction. A preferred embodiment includes MMP-2.

Šiame išradime yra pateikiamas vienas arba daugiau oligopeptidų, kurie gali blokuoti vėžinių ląstelių atsiradimą ir metastazavimą, kaip vakcina specifiniams antikūnams, skirtiems susijusios su MMP-2 ligos diagnozavimui arba klinikiniam šios ligos progresavimo arba regresijos monitoringui, produkuoti.The present invention provides one or more oligopeptides that can block the appearance and metastasis of cancer cells, as a vaccine for the production of specific antibodies for the diagnosis or clinical monitoring of the progression or regression of a disease associated with MMP-2.

Šiame išradime yra pateikiamas vieno arba daugiau oligopeptidų, kurie blokuoja žmogaus ligą, įskaitant, bet neapsiribojant, vėžinių ląstelių atsiradimą ir metastazavimą, panaudojimas vėžio prevencijai arba gydymui; pavyzdžiui, infekcinių ligų, širdies ir kraujagyslių ligų ir degeneracinių ligų prevencijai arba gydymui.The present invention provides the use of one or more oligopeptides that block human disease, including, but not limited to, cancerous cell emergence and metastasis for the prevention or treatment of cancer; such as the prevention or treatment of infectious diseases, cardiovascular disease and degenerative diseases.

Šiame išradime yra pateikiamas vieno arba daugiau oligopeptidų, kurie blokuoja vėžinių ląstelių atsiradimą ir metastazavimą, panaudojimas ligų, kuriose dalyvauja MMP-2, prevencijai arba gydymui.The present invention provides the use of one or more oligopeptides which block the appearance and metastasis of cancer cells for the prevention or treatment of diseases involving MMP-2.

Šiame išradime yra pateikiamas vieno arba daugiau oligopeptidų, kurie blokuoja vėžinių ląstelių atsiradimą ir metastazavimą, panaudojimas, kur šie oligopeptidai gali būti įvedami pacientui kaip vakcina, injekcijomis, infuzijomis, inhaliacijomis, kaip žvakutės arba su kitais farmaciniais nešikliais ir(arba) kitais įvedimo būdais.The present invention provides the use of one or more oligopeptides which block the appearance and metastasis of cancer cells, wherein the oligopeptides may be administered to a patient as a vaccine, by injection, by infusion, by inhalation, as suppositories or by other pharmaceutical carriers and / or other modes of administration.

Šio išradimo kompozicijos gali būti peptido arba peptidų derinių su bent vienu kitu agentu, tokiu kaip stabilizuojantis junginys, formos, kurios gali būti įvedamos bet kokiame steriliame biosuderinamame farmaciniame nešiklyje, įskaitant, bet neapsiribojant, fiziologinį druskos tirpalą, buferinį druskos tirpalą, dekstrozę ir vandenį. Kompozicijas pacientas gali vartoti vienas arba derinyje su kitais agentais, vaistais arba hormonais. Farmaciniu požiūriu priimtini nešikliai taip pat gali apimti pagalbines ir papildomas medžiagas, kurios palengvina veikliojo junginio pavertimą preparatu, kuris gali būti naudojamas farmacijoje. Kitos receptūrų ir vartojimo metodikų detalės gali būti rastos vėliausiame “Remington’s Pharmaceutical Sciences” Mack Publishing Co., Easton, Pa. leidinyje, kurio turinys pridedamas kaip literatūros šaltinis. Farmacinės kompozicijos gali būti pateikiamos druskų pavidalu ir gali būti sudaromos su daugeliu rūgščių, įskaitant, bet neapsiribojant, hidrochlorido, sulfato, acto, pieno, vyno, obuolių, gintaro ir t.t. Druskos linkę geriau tirpti vandeniniuose arba kituose protoniniuose tirpikliuose nei atitinkamos laisvų bazių formos.The compositions of the present invention may be in the form of a peptide or peptide combinations with at least one other agent, such as a stabilizing compound, which may be administered in any sterile biocompatible pharmaceutical carrier including, but not limited to, saline, saline, dextrose and water. The compositions may be administered by the patient alone or in combination with other agents, drugs or hormones. Pharmaceutically acceptable carriers may also include adjuvants and adjuvants that facilitate the conversion of the active compound into a formulation for use in pharmacy. Further details of formulations and administration techniques can be found in the latest Remington's Pharmaceutical Sciences at Mack Publishing Co., Easton, Pa. in a publication whose content is attached as a source of literature. The pharmaceutical compositions may be in the form of salts and may be formulated with a wide variety of acids, including but not limited to hydrochloride, sulfate, vinegar, milk, tartaric, apple, amber and the like. Salts tend to be more soluble in aqueous or other protic solvents than their corresponding free base forms.

Toliau duodami pavyzdžiai yra skirti išradimo praktikai pailiustruoti ir nelaikoma, kad jie apriboja šį išradimą.The following examples are intended to illustrate the practice of the invention and are not to be construed as limiting the invention.

Oligopeptidu sekosSequences of oligopeptides

Didelio hidrofiliškumo maksimun\mo MMP-2 aminorūgščių seka, praturtinta krūvį turinčiomis aminorūgštimis, buvo identifikuota panaudojant kompiuterinę programą. Šio išradimo oligopeptidai gali būti sintezuojami arba pagaminami pagal specialistams gerai žinomas metodikas (Žr., pavyzdžiui, Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y.), kuris čia duodamas kaip literatūros šaltinis pilnos apimties. Šiame išradime pagaminti ir naudoti oligopeptidai yra išvardinti 1 lentelėje.The highly hydrophilic maximal MMP-2 amino acid sequence enriched with the charged amino acids was identified by a computer program. The oligopeptides of the present invention may be synthesized or prepared according to techniques well known to those skilled in the art (See, e.g., Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y.), which is hereby incorporated by reference. The oligopeptides produced and used in the present invention are listed in Table 1.

Šių oligopeptidų įsiskverbimas į matrigelį ir įvairių vėžinių ląstelių migracija per matrigelio membraną buvo įvertinta panaudojant “pagerintą skverbimosi per matrigelį kamerą” (Becton Dickinson, JAV). Etaloniniu standartu oligopeptidams buvo naudojamas oligopeptidas TMRKPRCONPDVAN, kuris, kaip parodė Liotta ir bendraautoriai, pasižymi anti-MMP-2 aktyvumu.Matrigel penetration of these oligopeptides and migration of various cancer cells across the matrigel membrane were assessed using an "enhanced matrigel permeation chamber" (Becton Dickinson, USA). The reference standard for oligopeptides was the oligopeptide TMRKPRCONPDVAN, which has been shown by Liotta and co-authors to possess anti-MMP-2 activity.

lentelė: Įvairios oligopeptidų sekos, identifikuotos ir naudotos šiuose tyrimuoseTable: Various oligopeptide sequences identified and used in these assays

Oligopeptidas Oligopeptide Sekos numeris Sequence number GDVAPKTDKE GDVAPKTDKE SEQ ID. 1 SEQ ID. 1 PRKPKVVDK PRKPKVVDK SEQ ID. 2 SEQ ID. 2 EDYDRDKKY EDYDRDKKY SEQ ID. 3 SEQ ID. 3 GRSDGLM GRSDGLM SEQ ID. 4 SEQ ID. 4 NYDDDRKVV NYDDDRKVV SEQ ID. 5 SEQ ID. 5 LPPDVORVD LPPDVORVD SEQ ID. 6 SEQ ID. 6th RYNEVKKKMDP RYNEVKKKMDP SEQ ID. 7 SEQ ID. 7th

Bendros eksperimento sąlygosGeneral experimental conditions

Identifikuoti oligopeptidai buvo sintezuoti įprastu būdu. Po to jie buvo naudojami skverbimosi per matrigelį tyrimuose.The identified oligopeptides were synthesized by conventional means. They were then used in matrigel penetration assays.

(a). Skverbimos per matrigeli tyrimai(a). Studies on penetration through matrigel

Šie tyrimai buvo atlikti panaudojant “pagerintas skverbimosi per matrigelį kameras” (Becton Dickinson, JAV).These studies were performed using "improved matrigel penetration chambers" (Becton Dickinson, USA).

Tyrimuose su žmogaus melanomos ląstelėmis žmogaus fibroblastai - NHDF (Clonetics) buvo pasėti ant “Matrigel” įdėklo ir laikyti tol, kol buvo pasiektas susiliejimas. Tai buvo atlikta tam, kad būtų galima artimai imituoti in vivo sąlygas, apsupančias vėžines ląsteles organizme. Po to ant įdėklo buvo pasėtos žmogaus melanomos ląstelės A2058. į kamerą pridėta kondicionuotos terpės nuo fibroblastų kultūros su įvairiais pasirinkto oligopeptido kiekiais. Sistema buvo inkubuojama maždaug 24 valandas. Šio laikotarpio pabaigoje viršutinio dominančio paviršiaus ląstelės buvo nubraukiamos. Ląstelės, kurios įsiskverbė į matrigelio membraną ir nukeliavo į žemesnį įdėklo paviršių buvo nudažytos “quick stain” dažais ir suskaičiuotos po mikroskopu. Inhibicijos procentai buvo apskaičiuoti iš skaičiaus ląstelių, kurioms nepavyko pereiti per membraną, lyginant su kontrole (“0” kiekis oligopeptido). Kontrolės inhibicinis aktyvumas buvo priimamas už “0”. Šiek tiek terpės iš įsiskverbimo tyrimų buvo pasiliekama zimogramų tyrimams.In human melanoma cell assays, human fibroblasts NHDF (Clonetics) were seeded on Matrigel liner and stored until fusion was achieved. This was done to simulate closely the in vivo conditions surrounding the cancer cells in the body. The liner was then seeded with human A2058 melanoma cells. conditioned media from fibroblast culture with various amounts of selected oligopeptide was added to the chamber. The system was incubated for approximately 24 hours. At the end of this period, cells of the upper surface of interest were drawn. Cells that penetrated the matrigel membrane and traveled to the lower surface of the liner were stained with "quick stain" and counted under the microscope. Inhibition percentages were calculated from the number of cells that failed to cross the membrane relative to the control ("0" amount of oligopeptide). Control inhibitory activity was taken as "0". Some of the media from the penetration studies was retained for the zimogram studies.

Tyrimuose su žmogaus krūties vėžio ląstelėmis MCF7 metodika buvo iš esmės panaši į metodiką, naudotą melanomos ląstelių atveju, išskyrus tai, kad vietoj NHDF buvo naudojami MRC5 (ATCC) fibroblastai.In studies with human breast cancer cells, the MCF7 methodology was essentially similar to that used for melanoma cells, except that MRC5 (ATCC) fibroblasts were used in place of NHDF.

Tyrimuose su žmogaus krūties vėžio ląstelėmis MDA-MB 231 fibroblastų MRC5 (ATCC) ląstelės buvo paskleistos duobutėse. Likusi metodikos dalis buvo tokia pat, kaip ir tyrimuose su MCF7 ląstelėmis.In human breast cancer cell studies, MDA-MB 231 MRC5 (ATCC) fibroblasts were plated in wells. The remainder of the methodology was the same as in studies with MCF7 cells.

(a) Zimogramų tyrimai(a) Studies on zymograms

Terpė (25-30 μΙ) iš įvairių įsiskverbimo tyrimų duobučių buvo užpilta ant “Novex” zimogramų gelių (Invitrogen). Geliai buvo ryškinami ir nudažomi pagal gamintojo rekomendacijas. Matricinės metalproteinazės (MMP) buvo identifikuotos remiantis jų žinomomis molekulinėmis masėmis.Medium (25-30 μΙ) from various penetration wells was applied to Novex zymogram gels (Invitrogen). The gels were developed and stained according to the manufacturer's recommendations. Matrix metalloproteinases (MMPs) were identified based on their known molecular weights.

pavyzdysexample

Įvairiu oligopeptidiniu seku inhibicinis poveikis i melanomos ląstelių A2058 skverbimąsi ir migraciją per matrigeliInhibitory effects of various oligopeptide sequences on A2058 penetration and migration of melanoma cells via matrigel

Buvo tirtas 7 oligopeptidų (jų aminorūgščių sekos duotos 1 lentelėje) inhibuojantis poveikis į žmogaus melanomos vėžinių ląstelių įsiskverbimą. PRKPKVVDK aminorūgščių seką turintis oligopeptidas rodė blokavimo aktyvumą. TMRKPRCGNPDVAN seką turintis oligopeptidas rodė maždaug 11 % inhibavimą, lyginant su 73 %, kurį rodė PRKPKVVDK (Fig.1).The inhibitory effect of 7 oligopeptides (shown in Table 1 on their amino acid sequences) on human melanoma cancer cell invasion was investigated. The oligopeptide containing the amino acid sequence of PRKPKVVDK showed blocking activity. The oligopeptide containing the TMRKPRCGNPDVAN sequence showed approximately 11% inhibition compared with the 73% shown by PRKPKVVDK (Fig. 1).

Oligopeptidas VI, turintis aminorūgščių seką LPPDVORVD, taip pat turėjo tam tikrą blokavimo aktyvumą (t.y. apie 20 %). Oligopeptidas Ί”, turintis aminorūgščių seką GDVAPKTDKE, nerodė jokio aktyvumo iki 100 pm koncentracijos (Fig.2 neparodyta), lyginant su 63 %, kuriuos rodo tokios pat koncentracijos PRKPKVVDK.Oligopeptide VI, having the amino acid sequence LPPDVORVD, also had some blocking activity (i.e., about 20%). The oligopeptide Ί ”containing the amino acid sequence GDVAPKTDKE showed no activity up to a concentration of 100 µm (Fig. 2 not shown) compared to 63% indicated by the same concentrations of PRKPKVVDK.

pavyzdysexample

PRKPKVVDK oligopeptido inhibicinis poveikis į melanomos A2058 ląstelių skverbimąsi ir migraciją per matrigeliInhibitory effect of PRKPKVVDK oligopeptide on matrigel penetration and migration of melanoma A2058 cells

Šiuose tyrimuose PRKPKVVDK koncentracija terpėje buvo tarp 0 ir 150 μΜ. Matyti, kad oligopeptidas didėjančiai inhibuoja melanomos ląstelių įsiskverbimą (Fig.3) nuo maždaug 37 % esant 50 μΜ koncentracijai iki 73 %, esant 150 μΜ koncentracijai.In these studies, the concentration of PRKPKVVDK in the medium was between 0 and 150 μΜ. The oligopeptide was shown to inhibit increasingly the penetration of melanoma cells (Fig. 3) from about 37% at 50 μΜ to 73% at 150 μΜ.

Matrigelio membrana yra analogiška ECM ir vėžinių ląstelių sugebėjimas prasibrauti ir nukeliauti į kitą membranos pusę atvaizduoja vėžinių ląstelių sugebėjimą sukelti metastazes organizme. Šis oligopeptidas gali žymiai sumažinti trijų skirtingų tipų vėžinių ląstelių įsiskverbimą. Šioje tyrimų sistemoje aktyvumas yra nukreiptas prieš ECM. Mes darome išvadą, kad todėl mūsų tyrimai aiškiai rodo, kad oligopeptidas gali sulaikyti ECM degradaciją organizme ir tokiu būdu daryti priešingą poveikį į ligų, kuriose ECM suirimas yra pagrindinis pažeidimas, progresavimą.The matrigel membrane is analogous to the ECM and the ability of cancer cells to penetrate and travel to the other side of the membrane reflects the ability of cancer cells to induce metastasis in the body. This oligopeptide can significantly reduce the penetration of three different types of cancer cells. In this research system, activity is directed against the ECM. We conclude that, therefore, our studies clearly indicate that the oligopeptide can inhibit ECM degradation in the body and thus counteract the progression of diseases in which ECM degradation is the major lesion.

pavyzdysexample

Šiuose tyrimuose buvo nustatyti PRKPKVVDK inhibiciniai poveikiai į žmogaus krūties vėžinių ląstelių MCF7 (ATCC) įsiskverbimą į matrigelį ir migraciją. Kaip ir melanomos ląstelių atveju šis oligopeptidas inhibavo vėžinių ląstelių atsiradimą. Inhibicija, esant 150 μΜ koncentracijai, buvo apie 70 %. Ji padidėjo iki 90 %, esant 200 μΜ koncentracijai (fig.4).In these studies, inhibitory effects of PRKPKVVDK on matrigel penetration and migration of human breast cancer cell MCF7 (ATCC) were determined. As with melanoma cells, this oligopeptide inhibited the development of cancer cells. Inhibition at 150 μΜ was about 70%. It increased to 90% at a concentration of 200 μΜ (Fig.4).

pavyzdysexample

Šiuose tyrimuose buvo nagrinėjamas PRKPKVVDK inhibicinis aktyvumas bandyme su kita žmogaus krūties ląstelių linija MDA-MB-231. Inhibavimas, esant 150 μΜ koncentracijai, buvo apie 94 %.These studies examined the inhibitory activity of PRKPKVVDK in a test on another human breast cell line, MDA-MB-231. Inhibition at a concentration of 150 μΜ was about 94%.

pavyzdysexample

Toliau mes tyrėme, ar šie oligopeptidai gali trukdyti fermento poveikiui po jo sekrecijos. Zimogramų tyrimai neparodė jokio PRKPKVVDK inhibicinio poveikio į įvairių vėžinių ląstelių išskiriamos MMP-2 kiekį.We further investigated whether these oligopeptides may interfere with the effect of the enzyme upon its secretion. Zimogram studies did not show any inhibitory effect of PRKPKVVDK on the amount of MMP-2 secreted by various cancer cells.

Buvo aprašyta keletas šio išradimo įgyvendinimo variantų. Vis dėlto, reikėtų suprasti, kad gali būti padarytos įvairios modifikacijos nenukrypstant nuo išradimo prasmės ir sferos. Taigi, kiti įgyvendinimo variantai įeina į šio pateikiamo išradimo apimtį.Several embodiments of the present invention have been described. However, it should be understood that various modifications can be made without departing from the spirit and scope of the invention. Thus, other embodiments are within the scope of the present invention.

Nors pateiktas aprašymas yra gana smulkus, sekos yra pateiktos paaiškinimui, ir nėra apribojančios. Aukščiau aprašytos technologijos modifikacijos ir patobulinimai, įskaitant ekvivalentus, kurie įeina į veikimo sritį ir šios srities galimybes, yra pateikti pridedamoje apibrėžtyje. Specialistai turėtų suprasti, kad gali būti padaryta įvairiausių modifikacijų, pakeitimų ir atmainų aukščiau duoto aprašymo specifikos požiūriu nenukrypstant nuo čia aprašyto išradimo koncepcijos. Pavyzdžiui, čia aprašytų pagrindinių sekų modifikacijos (tiek cheminės, tiek ir fermentinės) taip pat patenka į išradimo sferą. Pavyzdžiui, aprašyta seka gali būti dipeptidas arba tripeptidas. Be to, aprašytos sekos gali būti modifikuotos įvedant šią liekaną peptidų amino- arba karboksi-gaiuose. Sekos taip pat gali būti chemiškai modifikuotos jų aktyvumui padidinti (pvz. sekos dalies karboksi-galo amidinimas). Peptidai gali būti chemiškai modifikuoti jų aktyvumui padidinti (pvz. sekos dalies karboksi-galo amidinimas arba glicino arba alanino liekanos įvedimas kuriame nors gale). Taigi, reikėtų suprasti, kad gali būti padarytos įvairios modifikacijos nenukrypstant nuo šio išradimo prasmės ir sferos, ir kad tokie pakeitimai turi būti laikomi įeinantys į šio išradimo apimtį, kaip išdėstyta toliau duodamoje apibrėžtyje.Although the description given is quite detailed, the sequences are provided for explanation and are not limiting. Modifications and improvements to the technology described above, including equivalents within the scope and capabilities of the art, are provided in the appended definition. Those skilled in the art will appreciate that various modifications, alterations and modifications may be made to the specifics of the foregoing description without departing from the concept of the invention described herein. For example, modifications (both chemical and enzymatic) of the key sequences described herein are also within the scope of the invention. For example, the sequence described may be a dipeptide or a tripeptide. Further, the described sequences may be modified by introducing this residue into the amino or carboxylic peptides. The sequences may also be chemically modified to increase their activity (e.g., carboxy-terminal amidation of a portion of the sequence). Peptides may be chemically modified to increase their activity (e.g., amidation of the carboxy-terminus of a sequence or introduction of a glycine or alanine residue at either end). It should be understood, therefore, that various modifications may be made without departing from the spirit and scope of the present invention, and that such modifications are to be considered within the scope of the present invention as set out below.

Claims

Definition of the Invention

An oligopeptide comprising an oligopeptide sequence selected from the group consisting of:

a) The oligopeptide sequences shown in SEQ ID NO. 2 or 6;

b) an oligopeptide capable of inducing an immune response against SEQ ID NO. Epitope 2;

c) an oligopeptide sequence of 8 to 10 amino acids in length comprising any of a) or

(b) sequences;

d) an oligopeptide sequence comprising an oligopeptide sequence from any of a) to c) wherein one or more amino acids are replaced by amino acids having similar charge, size and / or hydrophobicity characteristics, provided that the oligopeptide sequence is capable of blocking cancer cell invasion; metastases;

e) an oligopeptide sequence comprising an oligopeptide sequence from any of a) to c) wherein an amino acid residue is omitted at the N- or C-terminus, provided that the oligopeptide sequence is capable of blocking cancer cell invasion and metastasis; and

f) an oligopeptide sequence comprising one or more repeats of an oligopeptide sequence covalently linked to one another in one of the steps a) to e).

2. The oligopeptide of claim 1, wherein said oligopeptide is coupled to haptens enhancing the immune response.

3. A pharmaceutical composition comprising an oligopeptide according to claim 1 or 2.

4. A diagnostic composition comprising the oligopeptide of claim 1 or 2.

5. A vaccine comprising the oligopeptide of claim 1 or 2.

The use of an oligopeptide according to claim 1 or 2 in the preparation of a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of infectious diseases of the cardiovascular system, cardiovascular diseases, degenerative diseases or pathological conditions associated with the degradation of the ECM by MMPs.

Use according to claim 6, characterized in that said pharmaceutical composition is administered to a patient as a vaccine, as an injection, infusion, inhalation or suppository.

Use according to claim 6 or 7, characterized in that the concentration of said oligopeptide in the composition is in the range of 1-500 μΜ or 50-200 μΜ.