KR950011548B1 - 항-헤르페스 심플렉스 바이러스 항체 검출용 진단키트 - Google Patents

항-헤르페스 심플렉스 바이러스 항체 검출용 진단키트 Download PDF

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Abstract

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Description

항-헤르페스 심플렉스 바이러스 항체 검출용 진단키트
제1도는 헤르페스 바이러스의 아형 별로 정제된 항원을 폴리스틸렌 웰에 코팅하고 6월간 냉장보관 중 항 혈청(IgM)에 대한 항원성이 유지되는 추이를 나타낸다.
제2도는 헤르페스 심플렉스 바이러스의 아형 별로 정제된 항원을 폴리스틸렌 웰에 코팅하고 6월간 냉장보관 중 항-혈청(IgM)에 대한 항원성이 유지되는 추이를 나타낸다.
본 발명은 1992년 특허출원 제1820호의 분할출원으로서 항-헤르페스 심플렉스 바이러스 항체 검출용 진단키트에 관한 것이다.
사람에게 병원성을 나타내는 헤르페스 심플렉스 바이러스(이하 "HSV"라 한다)는 헤르페스바이러스과의 알파 아군에 속하며 이중나선 DNA를 갖고 162개 캡소머로 이루어진 직경 100nm의 캡시드와 외각의 외피(envelope)로 구성된다. 헤르페스 심플렉스 바이러스 제1형(HSV-type 1)과 헤르페스 심플렉스 바이러스 제2항(HSV-type 2)으로 크게 구분되며, 제1형은 구강 및 얼굴 등에 주로 피진상태의 병변을 나타내고 제2형은 성기 및 항문등에 병을 일으키는데, 아주 약한 병변으로 부터 치명적인 병변 현상까지 폭넓게 나타난다. 주요 특징적인 발명으로는 구내염 및 치육염, 포진성 습진, 비균성 수막염, 헤르페스성 각결막염, 급성 궤양-식도염, 원발성 비정형 폐렴, 태아의 뇌염 및 신생아의 전신성 감염으로 인한 치명적 결과, 헤르페스성 외음질염 및 성병 등이다. HSV는 사람의 분비물과 이성간의 밀접한 접촉에 의한 전염 이외에 식생활에 필요한 가사도구 등의 간단한 오염으로 부터도 쉽게 전염되며, 성인의 85% 이상이 체내에 잠복기 상태로 있어서 면역이 약한 태아와 신생아에게 쉽게 감염되고, HSV에 대한 백신의 개발은 오늘날까지 확실한 보장성을 내놓지 못하고 있다. 그러므로 HSV에 대한 면역글로블린G의 진단 뿐만 아니라 활성이 있는 감염된 상태의 조기진단을 위한 면역글로블린M에 대한 항체여부의 검사는 매우 필요하다. 또한 여성의 질내에 발생한 경부암 환자는 80% 이상이 HSV 제2형에 대한 항체를 지니고 있다. [참고문헌 : 가] Dressman G. R. Burek J. Adam E. Kaufama R. H. Melnick J. L. Powell K. L. and Purifoy D. J. M : Nature(Lond.), 283; 591 593(1980), 나)Gupta P. K. Aurelean L. Frost, J. K. Carpenter J. M. Klacsmann K. T. Rosenshein N. B. Nd Tyrer H. W. : Gynecol. Oncol. 12; S5232-S5258(1981), 다) McDougall J. K. Crum C. P. Fenoglio C. M. Goldstein L. C. and Golloway D. A : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79; 3853-3857(1982)].
바이러스 감염에 대한 혈청학적 검사는 비교적 짧은 시간에, 검사시약의 취급이 안전하고, 간편하게 검사하는 방법이 효소면역분석법(EIA)이며, 본 발명은 바이러스에대한 항체검출을 위하여 EIA 방법 중 효소-표지 면역흡착분석법(ELISA;Enzyme linkde immounsorbent assay)에 관한 것이다.
구체적으로 본 발명은 항-헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV)에 감염된 사람에게서 생성된 항체를 간접성 효소-표시 면역흡착분석법(Indirect-ELISA)으로 검출하기 위하여 본 발명의 발명자 전원에 의하여 발명된 항-HSV 항체 검출 목적용으로 4종의 HSV[① HSV-type 1 아형(strain) MacIntyre (ATCC VR-539;이 미생물은 ATCC로 부터 용이하게 구입할 수 있음) ATCC 주소; 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 U. S. A, ② HSV-type 1 아형 F(ATCC VR 733; 이 미생물은 ATCC로 부터 용이하게 구입할 수 있음), ③ HSV type 2 아형 G(ATCC VR 734; 이 미생물은 ATCC로 부터 용이하게 구입할 수 있음), ④ HSV-type 2 아형 MS(ATCC VR-540; 이 미생물은 ATCC로 부터 용이하게 구입할 수 있음) 로부터 정제된 항원 및 HSV 숙주세포[MRC-5; ATCC CCL-171, 이 미생물은 ATCC로 부터 용이하게 구입할 수 있음]의 표준항원(control antigen)을 사용하여 진단용키트를 개시한다. 또한 간접성 효소-표지 면역흡식분석법에 의하여 검출한 HSV 항체는 "항 HSV 면역글로블린 G(Anti-HSV lgG)"와 "항 HSV 면역글로블린 M(Anti-HSV lgM)"이며, 이를 위해서는 매우 정제된 우수한 바이러스 항원이 필요한데, HSV 및 숙주세포의 배양기술과 그로부터 바이러스 단백질을 상세히는 기술이 요구되고, 그 다음 단계로 항원-항체 반응을 위한 ELISA 조건으로 항온시간, 온도, 시약의 활성도, 항원과 항체의 최적량, 2차 항체의 종류와 표시할 효소의 선택, 효소에 의하여 발색 반응할 기진의 조제법, 반응용기의 형태와 재질의 선택등이 이루어져야 한다. 본 발명은 이와같은 기술로 구성된 ELISA키트에 관하여 개시하며 다음과 같은 선명에 의하여 그 기술에 구체적 내용을 기술한다.
본 발명의 동일한 발명자와 동일 출원인에 의하여 최초 출원한 발명(대한민국 특허출원 92-1820호, 출원인자;1992. 2. 8)에 의한 항 HSV 항체 검출용 항원의 정제방법에 의하여 정제된 4종의 HSV 항원을 사용한다. 즉, 바이러스 항체 검사에서 폴리스틸렌으로 구성된 웰(well)에 코팅한 항원과 혈청의 항체를 반응시키고, 이 항체에 효소가 표지된 2차 항체를 결합시켜 그 효소의 촉매작용에 의한 특정 기질의 발색반응 정도를 측정하는 방법으로 비교적 짧은 시간에 수행할 수 있다.
본 발명은 16개 웰로 구성된 엘리자(ELISA)용 폴리스틸렌 모듈(polystylen module)에 HSV항원과 대조표준항원을 각각 8웰씩 코팅하기 위하여 50mM 카보네이트 완충액(pH 9.6)으로 HSV 항원은 0.7㎍/웰, 대조표준항원은 1.0㎍/웰의 양으로 36℃에서 80분간 항온처리한 후, 각 웰의 용액을 적당한 진공흡출장치를 이용하여 제거하면 폴리스틸렌 웰이 항원이 코팅되고, 항원 이외의 비특이성 흡착을 방지하기 위하여 코팅용 카보네이트 완충액에 유혈청 알부민이 1%로 용해된 분쇄용액을 각 웰이 15㎕씩 넣고 36℃에서 50분간 항온처리하고, 흡출제거 즉시 중성세제(Tween 20)가 0.1% 함유된 0.01M 인산염 완충액(세척액;pH 7.4)을 각 웰에 약 200㎕씩 넣고 흡출제거하는 세척과정을 1회 실시한 후, 건조용 밀폐용기에 60분간 진공 건조시킨다. 이 16웰이 구성된 폴리스틸렌의 6개(96웰)를 플라스틱 틀에 맞춘 일명 폴리스틸렌 판을 비닐봉에 진공 밀봉하여 냉장보관한다.
혈청 중의 항체를 진단하기 위하여 검사대상 혈청을 1:50으로 희석할 필요가 있으며, 희석용 용액은 0.1M 인산염용액(pH 7.2)에 우혈청 알부민이 1% 함유되고, 중성세제(Tween-20)가 2% 함유시켜 제조하며, 본 발명에서는 이 희석용액을 10배 농축하여 병입시킨다. 2차 항체는 산양의 플리클론 항체로서 항-사람면역글로블린G(IgG) 또는 항-사람면역글로블린 M(IgM)에 고추냉이 과산화효소(HRP) 또는 알카리 인산효소(Alkaline phosphatase)를 표지한 콘쥬게이트이며, 고추냉이과산화효소 콘쥬게이트는 0.01M 인산염용액(pH 7.2)에 우혈청알부민을 1%, 황산겐타마이신을 0.005% 되게 함유시킨 보관용액에서 냉장보관하며, 알카리 인산효소 콘쥬게이트는 0.02M 트리스 용액(pH 8.5)에 우혈청 알부민이 1%, 무수 염화마그네슘이 0.01%, 나트륨아지드가 0.02% 함유된 보관용액에서 냉장보관하여 1:100으로 희석하여 사용할 수 있도록 제조한다.
과산화수소에 의해 산화되는 화합물은 ABTS(2-2'-Azinovis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid, diammonium salt)와 OPD(ortho-Phenylendiamine)를 주로 사용하는데, 본 발명에서는 ABTS를 사용한다. 이 기질용액은 6mM 구연산용액에 ABTS를 1.2∼2.1mM 되게 용해시키고, 보존제로서 카코딜리산을 6.25mM 되게 함유시킨 A용액과 6mM 구연산용액 중 30% 과산화수용액의 희석용량비율이 10,000:7로 조제한 B용액으로 구성되며, A용액과 B용액은 과산화효소의 촉매반응의 최적조건인 pH 4.0으로 조정하여 A용액과 B용액을 1:1의 용적비로 혼합하여 사용한다. 기질은 청록색의 발색반응을 하며 기질 첨가후 30분 간 실온(25℃)에서 빛을 차단하여 발색시키고, 발색반응을 정지시켜 가시적으로 판단할 수 있으되, 흡광측정기(ELISA reader)를 이용하여 ABTS를 사용하면 405nm의 파장에서, OPD를 사용하면 492nm의 파장에서 측정한다. 반색반응의 정지는 ABTS를 기질로 사용하는 본 발명에서는 0.50∼0.65mM 나트륨아지드 용액을 사용한다. 알카리인산화효소의 기질은 p-NPP(para-Nitrophenyl phosphate)를 사용하는데, 흡광측정한 결과 HSV 항원이 코팅된 웰과 대조표준항원이 코팅된 웰의 흡광도 차이가 기준치(본 발명에서는 ABTS를 발색기질로 사용하고 면역글로블린 G를 검출할 경우는 0.2, 면역글로블린 M을 검출할 경우는 0.3) 이상일 때 항체양성, 그 이하일 때는 음성으로 판단한다.
[실시예 1]
간접성 표소 표지 면역흡착분석법을 실시하기 위하여 검사대상 혈청을 희석용 완충용액에 1:50으로 희석하고 미리 봉입된 폴리스틸렌 판의 HSV 항원 웰과 대조 표준항원웰에 100㎕씩 분주한다. 가령, 16개 웰이 구성된 경우 8가지 검사시료를 실시할 수 있다. 이 플레이트는 점착용 셀로판지로 각 웰을 덮고 37℃에서 30분간 항온처리한 후, 각 웰의 검사시료액을 흡출제거하고 10배 농축된 세척액을 희석하여 각 웰에 200㎕ 정도 분주하고 즉시 제거하는 세척과정을 3회 실시한다. 2차항체-효소 표지액을 1:100으로 희석용완충액에 희석하여 각 웰에 100㎕씩 분주한 후 접착용 셀로판지를 덮고 37℃에서 30분간 항온처리한다. 이어서 상기 세척과정과 동일한 과정을 5회 실시하고 효소기질 A용액(ABTS)과 B용액(과산화수소 용액)을 1 : 1의 용적비로 혼합한 즉시 각 웰에 100㎕씩 분주한다. 30분간 실온에서 광을 차단시켜 방치한 후, 반응정지액을 각 웰에 100㎕씩 넣고 흡광측정기(ELISA reader)의 파장 405nm에서 측정한다. 실시예 1에 의한 결과는 표 1과 같다.
[표 1]
[실시예 2]
헤르페스 심플렉스 제1형 바이러스와 제2형 바이러스 각각의 아형 바이러스 정제항원(4가지)을 폴리스틸렌 판의 웰에 각각 0.7㎍, 대표표준항원을 1.0㎍씩 코팅(가령, 8개의 웰로 구성된 모듈이면 4개 웰에 바이러스항원을 0.7㎍씩 코팅하고, 나머지 4개의 웰은 대조표준항원을 1.0㎍씩 코팅한다)하고 6월 각 냉장(2∼8℃) 보관하여 월 단위 별로 항원이 코팅된 폴리스틸렌 판의 일부를 봉출하고, 이 코팅된 항원의 항원성 유지 여부를 조사하기 위하여 "실시예 1"에 따라서 실시하였다. 본 실시예 2에서 사용한 항 - 혈청은 미리 준비된 항 - HSV 면역글로블린 G와 M이었으며, 이 면역글로블린 G와 M의 각각에 대한 정제 항원의 항원성은 약간의 감소 추세가 있었으나, 6월 간 사용 가능하였다(표 2, 제1도, 제2도 참조).
표 2 코팅된 HSV 정제항원 별 항 HSV 면역글로블린 M(IgM과 G(IgG))에 대한 항원성의 냉장보관중의 추이 경향.
* HSV 웰/대조표준항원 웰
* (HSV 웰의 흡광지 - 대조표준항원 웰의 흡광치)
* Mac; HSV - 1 아형 MacIntyre, F; HSV - 1 아형 F, G; HSV - 2 아형 G, MS; HSV - 2 아형 MS
[ 표 2]

Claims (5)

  1. 가) HSV-1 및 HSV-2 항원과 대조표준항원으로 피복된 폴리스틸렌 플레이트, 나) HSV 음성대조액과 HSV 양성대조액, 다) 사람면역글로블린 G와 M 각각에 대해 산양에서 생성된 플리클론 이차항체에 고추냉이과산화효소를 표지한 콘쥬게이트를 1 : 100으로 사용할 수 있도록 희석한 용액, 라) 10배 농축된 세척용 인산염 0.1% Tween 20 완충욕액, 마) 혈청 및 이차항체-효소 표지물의 희석용 완충용액, 바) 고추냉이 과산화수소효소 기질용액, 사) 효소반응 정지용 0.65mM 나트륨 아지드 용액으로 구성된 HSV 1 및 HSV 2형에 감염된 사람의 항체 검출용 효소-표지 면역흡착분석 키트.
  2. 제1항에 있어서, HSV 1 및 HSV 2항원은 HSV-1 Machlntyre, HSV-1F, HSV-2G, HSV-2MS로 부터 유래된 항원인 것을 특징으로 하는 간접성 효소-표지면역흡착 분석키트.
  3. 제1항에 있어서, 검출한 HSV 항체가 항-HSV 면역글로블린 G(Anti-HSV IgG)와 항-HSV 면역 글로블린M(Anti-HSV IgM)인 것을 특징으로 하는 간접성 효소-표지 면역흡착 분석키트.
  4. 제1항에 있어서, 가)의 피복된 HSV 항원은 폴리스틸렌 웰당 0.7㎍, 대조 표준항원은 폴리스틴렌 웰당 1.0㎍을 피복됨을 특징으로 하는 간접성 효소 - 표지 면역흡착 분석키트.
  5. 제1항에 있어서, 바) 고추냉이 과산화수소 기질용액은 6mM 구연산용액에 ABTS를 1.2∼2.1mM 용해한 A용액과 6mM 구연산용액에 30% 과산화수소용액의 희석용량비율이 10,000 : 7로 조제된 B용액으로 구성됨을 특징으로 하는 간접성 효소-표지 면역흡착 분석키트.
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