KR950010164B1 - 시볼디아게닌 유도체 및 그 제조방법 - Google Patents

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Description

시볼디아게닌 유도체 및 그 제조방법

제1도는 본 발명에 의한 시볼디아게닌 유도체인 시볼디아게닌-3-0-β-D-글루코피라노실(1→2)-α-L-람노피라노사이드의 수소 헥자기 공명스펙트럼(300메가헬츠, 중수소화피리딘)을 보인 도표.

제2도는 제1도에서 사용된 시볼디아게닌 유도체의 탄소핵자기 공명스펙트럼(75메가헬츠, 중수소화피리딘)을 보인 도표.

제3도는 시볼디아게닌유도체인 베타-안하이드로 시볼디아게닌의 수소핵자기 공명스팩트럼(300메가헬츠, 중수소화 클로로포름)을 보인 도표.

제4도는 배타-안하이드로 시볼디아게닌의 탄소핵자기 공명스펙트럼(75메가헬츠, 중수소화 클로로포름)을 보인 도표.

제5도는 시볼디아게닌-3-0-α-L-람노피라노사이드의 수소핵자기 공명스펙트럼(300메가헬츠, 중수소화피리딘)을 보인 도표.

본 발명은 노박 덩굴과에 속하는 참빗살나무(Euonymus Sieboldianus Blume)의 수피로부터 분리한 인체암세포 증식을 억제하는 다음 구조식(I)의 신규 물질인 시볼디아게닌-3-0-β-D-글루코피라노실(1→2)-α-L-람노피라노사이드(이하 참빗살나무의 학명중 속명을 따 “유니모사이드A”라 약칭함) 및 유니모사이드A로부터 제조된 일반식(II)의 베타-안하이드로시볼디아게닌과 구조식(III)의 시볼디아게닌-3-0-α-L-람노피라노사이드에 관계되는 것이다.

암을 치료하기 위하여 각종의 항암제가 사용되고 있으나 기존의 항암제는 정상 세포의 공격, 탈모, 빈형 등의 부작용이 많아서 항암제의 사용에 따른 후유증이 심각하게 나타나고 있다. 따라서 의약업계에서는 부작용이 없는 항암제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다. 최근에는 정상 세포에는 독성이 없으면서 암세포에만 선택적으로 작용하는 항암제를 개발하기 위하여 천연물이나 생약으로부터 항암 성분을 찾으려는 노력이 활발히 진행되고 있고, 실질적으로 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine)등 수종의 천연물 성분이 실용화되고 있으나 이러한 성분들도 요구하는 효과를 얻을 수 없었다.

본 발명자 등은 인체에 약해가 없는 천연물로부터 항암제를 개발하기 위하여 수백종의 약용식물에 대하여 인체암세포, 특히 폐암(A-549)과 자궁암(SKOV-3)에 대한 세포 독성이 있는 식물을 검색한 결과 참빗살 나무의 수피로부터 분리한 부탄을 분획이 암세포에 대한 강한 억제 효과를 나타냄을 알게되어 본 발명을 완성하게 된 것이다. 본 발명의 목적은 인체 암세포에 선택적으로 작용하면서 부작용이 없는 항암제로 사용되는 신규 물질을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 목적은 노박 덩굴과에 속하는 참빗살 나무의 수피의 부탄을 분획으로부터 얻어지는 유니모사이드A 및 그 유도체에 의하여 달성된다.

본 발명에 사용되는 참빗살나무는 노박 덩굴과에 속하는 약용식물로서 수피는 회색 또는 회갈색이고 어린가지에는 부드러운 털이 드문드문 나있으며 그 잎은 대생하고 추원형 또는 난형으로 끝이 뾰족하고 가장자리에는 톱니가 있으며 양면은 녹색이면서 털이 없는 나무이다. 또한 참빗살나무는 개화기가 5-6월이고 결실기는 9-10월이며 산이나 냇가에 자생하며 한방에서는 부인병 치료에 사용하고 있다.

본 발명의 한 형태는 참빗살나무 수피 추출액의 부탄을 분획으로부터 분리한 구조식(I)의 유니모사이드A로 구성된다.

유니모사이드A는 참빗살나무 수피를 메탄올로 추출하고 추출액을 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 용매분획하여 부탄을 분획으로부터 분리한다.

이 유니모사이드A는 항암제의 개발가능성이 있는 카르데노라이드를 아글리콘으로 하는 물질로 확인되었고 분광학적 및 화학적방법에 의하여 검색한 결과 신규물질로 확인되었으며 산가수분해결과 D-글루코즈와 L-람노즈를 함유하고 있음이 확인되었고 공지문헌[Helv. Chim. Acta. 52(7). 196(1969)]에 기술된 탄소핵자기 공명 스펙트럼에 의하여 관찰한 결과 아글리콘이 트리하이드록시 카르테노라이드로 판명되었다. 따라서 유니모사이드A는 트리하이드록시 카르테노라이드의 아글리콘에 D-글루코즈와 L-람노스가 결합된 강심 배당체로 확인되었다.

종래 알려진 트리하이드록시 카르데노라이드는 3,14-위치에 2개의 하이드록시기를 가지고 있고 나머지 하나의 하이드록시기는 4,8,11,12,16-위치에 결합되어 있으나, 본 발명의 트리하이드록시 카르데노라이드는 1-위치에 하이드록시를 갖고 있어서 새로운 물질로 동정되었다.

본 발명에 의한 유니모사이드A의 물리화학적 성상은 다음과 같다.

1) 결정형태 : 무색미세결정(메탄올)

2) 융점 : 172-173℃

3) 비산광도 ; [α] D+33.9(c=2.42 클로로포름-메탄올=4 : 1)

4) 자외선 분광스펙트럼 :

5) 적외선 분광스펙트럼 :

6) Rf값 :키셀겔 F₆₀박층크로마토그라피를 이용하여 클로로포름-메탄올-물=7 : 3 : 1(아래층)으로 전개하였을 때 0.46임.

7) 6)의 박층크로마토그라피에서 20% 수용성 황산으로 분무하고 가열발색시켜면 청록색을 나타냄.

8) 원소분석 C₃₅H₅₄O₁₄계산치 탄소 : 60.65, 수소 : 7.79%, 분석치 탄소 : 60.32, 수소 : 7.67%

9) 수소핵자기 공명스펙트럼 : 제1도와 같음.

10) 탄소핵자기 공명스펙트럼 : 제2도와 같음.

본 발명자 등은 전술한 유니모사이드A의 정확한 화학구조를 동정하기 위하여 가수 분해한 결과 비당부로서 진정아글리콘의 유도체인 구조식(II)로 표시되는 물질이 생성됨을 알게 되었고, 이 구조식(II)의 물질도 신규 물질임을 알게 되었다.

따라서 본 발명을 구조식(II)의 물질에도 관계된다.

이 구조식(II)로 표시되는 물질은 아글리콘의 14-위치의 수산기와 15-위치의 수소가 탈수하여 이중결합이 생성된 것으로 밝혀져 진정 아글리콘으로 명명한 시볼디아게닌의 유도체인 베타-안하이드로 시볼디아게닌으로 명명하였다.

이 물질의 물리화학적 성상은 다음과 같다.

베타안하이드로 시볼디아게닌의 물리화학적 성상

1) 무색미세결정(클로로포름)

2) 융점 : 115-116℃

3) 비서광도 : [α]D-12.1(C=0.66 클로로포름)

4) 자외선 분광스펙트럼 :

5) 적외선 분광스펙트럼 :

6) 잘량스펙트럼 : m/z(%) : 372, 354, 298, 284, 269, 233, 163, 140, 111, 105, 91, 81, 67, 55

7) Rf값 : 키셀겔 F₆₀박층크로마토그라피를 이용하여 클로로포름-메탄올=10 : 1로 전개하였을때 0.5임.

8) 7)의 박층크로마토그라피에서 20% 수용성 황산으로 분무하고 가열발색시키면 청록색을 나타냄.

9) 고분해능 질량스펙트럼 : 계산치 탄소 : C_+-H₃₂O₄, 372, 5091

분석치 탄소 : C₂₃H₃₂O₄, 372. 5114

10) 수소핵자기 공명스펙트럼 : 제3도와 같음.

11) 탄소핵자기 공명스펙트럼 : 제4도와 같음.

또한 본 발명자들은 유니모사이드A를 베타-글루코시다아제 효소를 사용하여 가수분해시키면 말단의 D-글루코오스가 분리된 구조식(III)의 시볼디아게닌-3-0-α-L-람노피라노사이드가 생성됨을 확인하였는바, 이 물질도 신규물질이다.

따라서 본 발명은 전술한 구조식(III)의 시볼디아게닌-3-0-α-L-람노피라노사이드에도 관계된다.

구조식(III)의 시볼디디아게닌-3-0-α-L-람노피라노사이드의 물리화학적 성상은 다음과 같다.

시볼디아게닌-3-0-α-L-람노피라노사이드의 물리화학적 성상

1) 무색미세결정(메탄올)

2) 융점 : 116-157°

3) 비선광도 :[α]²⁵-20(C=0.42, 클로로포름-메탄올=4 : 1)

4) 자외선 분광스펙트럼 :

5) 적외선 분광스펙트럼 :

6) 수소핵자기 공명스펙트럼 : 제5도와 같음.

전술한 본 발명에 의한 화합물(I) (II) (III)인 인체 암세포에 대한 세포독성을 검색한 결과 표 1 에서 보는 바와같이 화합물(I)은 A 549 및 SKOV-3에 대한 IC₅₀이 각각 0.06㎍/ml, 0.4㎍/ml, 화합물(III)은 0.0035㎍/ml, 0.015㎍/ml로 나타나 항암제로서의 개발 가능성을 보여주었다. 특히 화합물(III)은 매우 강력한 세포독성을 보여주었다.

그러나 화합물(I)의 진정아글리콘 유도체인 화합물(II)는 80㎍/ml 이상으로 나타나 암세포 증식억제를 보여주지 않았다.

[표 1]

본 발명 화합물들의 시험관내 인체암세포 증식억제작용에 대한 시험결과

* : 암세포증식에 대한 50%의 억제 농도를 나타냄.

주 : 세포독성의 평가 SRB법을 사용하였다.

본 발명은 전술한 화합물(I) (II) (III)의 제조방법에도 관계되는바, 본 발명의 방법은 참빗살나무 수피를 메탄올로 용매 추출하고 부탄올로 용매 분획화하여 부탄올 엑기스를 얻고 이를 실리카겔 칼람크로마토 그래피 및 역상 실리카겔크로마토그래피를 통하여 유미노사이드A를 분리하는 방법으로 구성된다.

본 발명의 또하나의 방법은 분리된 유니모사이드A를 산 가수분해하고 실리카겔 칼람 크로마토그라피를 이용하여 진정 아글리콘의 유도체인 구조식(II) 베타-안하이드로 시볼디아게닌을 분리하는 방법으로 구성된다.

본 발명의 또 다른 방법은 유니모사이드A를 베타-글루코시다아제 효과를 사용하여 가수분해시키고 실리카겔 칼람 크로마토그라피를 이용하여 구조식(III)의 시볼디아게닌-3-0-α-L-람노피라노사이드를 제조하는 방법으로 구성된다.

본 발명의 방법들에 있어서 화합물(I)의 추출에 사용되는 용매의 메탄올 외에 다른 유기 용매를 사용할 수도 있다. 그리고 화합물(I) (II) (III)의 제조공정중에 사용되는 유효 물질 분리 정제공정은 실리카겔 칼람 크로마토그라피외의 다른 정제방법을 이용할 수도 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세한 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1 : 부탄올 엑기스 제조]

참빗살 나무의 수피를 분쇄한 건조분말 3kg을 메탄올 10리터로 실온에서 3회 추출하고 다시 환류 추출한다. 추출액을 감압 농축하여 360g의 메탄올 엑기스를 얻고, 엑기스를 에틸아세테이트부탄올 및 물로 용매분획하여 39.2g의 부탄올 엑기스를 얻는다.

[실시예 2 : 유니모사이드A(I)의 분리]

부탄올 엑기스 39.2g을 실리카겔 칼람 크로마토그라피(1.1g, 용리액 : 클로로포름 : 메탄올=10 : 1→클로로로픔 : 메탄올 : 물 6 : 4 : 1, 아래층)을 이용하여 몇개의 소분획으로 나눈다. 인체 암세포에 대한 독성을 갖는 소분획(2.2g)으로부터 실리카겔 칼람 크로마토그라피(240g, 부탄올 : 에틸아세테이트=2 : 3) 및 본다팍 판소-18 칼람 크로마토그라피(60g, 메탄올 : 물=1 : 1)를 이용하여 암세포에 독성이 있는 화합물을 분리 정제하고 메탄올에서 재결정하여 무색미세결정인 구조식(I)의 유니모사이드A 380mg을 얻었다.

[실시예 3 : 베타-안하이드로 시볼디아게닌(II)의 제조]

유니모사이드(I) 100mg을 9% 염산-메탄올 5에 용해한 후 2시간동안 가열 환류한다. 반응액을 탄산으로 중화한 후 여과지로 여과하고 감압농축한다. 잔사를 실리카겔 칼람 크로마토그라피(5g, 용리액 : 헥산-에칠아세테이트=5 : 1)로 분리하고 클로로포름에서 재결하여 구조식(II)의 무색 미세결정 37.2mg을 얻었다.

[실시예 4 : 시볼디아게닌-3-0-α-L-람노피라노사이드(III)의 제조

유니모사이드A(I) 200mg을 소량의 메탄올 0.2에 용해한 후 베타-글로코시다아제 80mg을 가한다. 물 1.2을 가한후, 37℃에서 5일간 가수분해 하고 반응액을 메탄올 10ml을 가한후 여과지로 여과하고 여액을 감압 농축한다. 잔사를 실리카겔 크로마토그라피(10g, 벤젠-아세톤=3 : 1)로 분리 정제하고 메탄올에서 재 결정하여 구조식(III)의 무색 미세결정 2.2mg을 얻었다.

Claims (7)

1. 다음의 구조식(I)로 표시되는 시볼디아게닌-3-0-β-D-글루코피라노실(1→2)-α-L-람노피라노사이드(유니모사이드A라함)
2. 다음의 구조식(II)로 표시되는 베타-안하이드로시볼디아게닌.
3. 구조식(III)으로 표시되는 시볼디아게닌-3-0-α-L-람노피라노사이드.
4. 참빗살나무의 수피를 메탄올로 추출하여 부탄올로 분획하고 실리카겔 칼라 크로마토그라피에 의하여 분리 정제하는 시볼디아게닌-3-0-α-D-글루코피라노실(1→2)-α-L-람노피라노사이드(유니모사이드A라함)의 제조방법.
5. 청구범위 4항에서, 정제 공정이 본다팍 탄소-18칼람 크로마토그라피에 의함을 특징으로 하는 방법.
6. 구조식(I)의 유니모사이드A를 산으로 가수분해하여 구조식(II)의 진전아글리콘의 유도체인 베타-안하이드로 시볼디아게닌을 제조하는 방법.
7. 구조식(I)의 유니모사이드A를 효소를 사용하여 가수분해시켜 구조식(III)의 시볼디아게닌-3-0-α-L-람노피라노사이드를 제조하는 방법.