KR950005424B1 - Process for producing l-aspartyl-l-phenylalanine and its diketo piperazine - Google Patents
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Abstract
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Description
본 발명은 L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸에스테르(이하에서는 "AMP"이라 약칭하다)의 전구물질인 L-아스파르틸-L-페닐알라닌(이하에서는 "AP"이라 약칭한다)의 제조 방법에 관한 것이다. AMP은 최근 수년간 주의를 끌어온 디펩타이드 감미제이다.The present invention provides a method for producing L-aspartyl-L-phenylalanine (hereinafter abbreviated as "AP") which is a precursor of L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester (hereinafter abbreviated as "AMP"). It is about. AMP is a dipeptide sweetener that has attracted attention in recent years.
미생물 또는 효소를 이용한 공지의 디펩타이드 합성방법은 2개의 아미노산 사이의 축합반응에 관여하지 않는 작용성 그룹에 적절한 보호 그룹을 도입시켜 축합 반응의 위치는 한정시키는 공정을 포함한다. 다음에는, 이들 아미노산 유도체 사이에 팝타이드 결합을 형성시킬 수 있는 미생물 또는 효소를 사용하여 측정항 축합 생성물을 수득하고, 계속해서 축합 생성물로부터 블필요한 보호 그룹을 제거하여 디펩타이드 생성물을 수득한다. 이러한 방법을 사용하면, 만족할만한 수율을 얻을 수 있지만 보호 그룹을 도입시키고 제거하는 단계가 요구된다. 따라서, 값비싼 보호 그룹이 필요하며 블폴요하고 복잡한 반응 단계가 요구된다.Known dipeptide synthesis methods using microorganisms or enzymes include introducing a suitable protecting group to a functional group that is not involved in the condensation reaction between two amino acids to limit the location of the condensation reaction. Next, the microantigen condensation product is obtained using a microorganism or an enzyme capable of forming a poptide bond between these amino acid derivatives, and then the unnecessary protecting group is removed from the condensation product to obtain a dipeptide product. Using this method, a satisfactory yield can be obtained but a step of introducing and removing the protecting group is required. Therefore, expensive protection groups are needed and complicated and complex reaction steps are required.
AMP의 생화학적 합성방법에 대해서는 예를들어 아스파르트산의 아미노 그룹에 대한 보호 그룹으로서 벤질옥시 그룹(-Z)을 사용하고, 엔도형 프로테아제의 작용에 의해 N-벤질옥시-L-아스파르트산과 페닐알라닌 메틸 에스테르를 축합시키는 방법이 알려져 있다. 이들 방법은 상술한 결점을 갖는다.For the biochemical synthesis method of AMP, for example, benzyloxy group (-Z) is used as a protecting group for the amino group of aspartic acid, and N-benzyloxy-L-aspartic acid and phenylalanine methyl by the action of an endotype protease. Methods of condensing esters are known. These methods have the drawbacks described above.
또한, 보호 그룹이 상요되지 않고 AMP의 생화학적 합성방법도 또한 공지되었다[참조 : 일본국 공개특허 공보 제 129796/83호]. 이러한 형태의 방법은 보호 그룹을 필요로 하지는 않지만, 수율이 나쁘며 APM의 합성에 문제점이 따른다.In addition, no protecting group is necessary and a biochemical synthesis method of AMP is also known (Japanese Patent Laid-Open No. 129796/83). This type of method does not require protection groups, but yields poorly and poses a problem in the synthesis of APM.
한편, APM의 화학적 합성에 있어서, 감미제 APM을 제조하기 위해서 L-아스파르트산과 L-페닐알라닌을 사용하는 것이 필요하다. 이는 아스파트틸-페닐알라닌의 광학 이성체 4개 중에서, L-아미노산으로만 이루어진 L-아스파르틸-L-페닐일라닌 메틸 에스테르(APM)만이 감미가 있기 때문이다.On the other hand, in the chemical synthesis of APM, it is necessary to use L-aspartic acid and L-phenylalanine to prepare a sweetener APM. This is because of the four optical isomers of aspartyl-phenylalanine, only L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester (APM) consisting solely of L-amino acids is sweet.
이들 4개의 광학 이성체를 분리하는 우수한 방법은 지금까지 알려져 있지 않기 때문에, L-아미노산보다 저렴한 DL-아미노산을 원료로 사용될 수 없다.Since no superior method for separating these four optical isomers is known until now, DL-amino acids which are cheaper than L-amino acids cannot be used as raw materials.
또한, 반응을 진행시키기 위해서는,반응 평행이 AP합성에 수반되는 불리한 축합반응 쪽으로 이루어지도록 해야 한다. L-아스파르트산과 L-페닐알라닌의 효소적 축합 반응에 있어서, 반응계로부터 AP를 제거하여 합성 평형 반응이 AP합성쪽으로 진행되도록 해야 한다.이러한 이유를, 이들 축합반응이 이용되는 공정에서는, 제도된 AP를 이온 교환 수지상에 흡착시키거나, AP가 선택적으로 불용성이 되도록 하는 방법으로 침전제를 혼입시킴으로써 AP를 제거한다.In addition, in order for the reaction to proceed, the reaction parallel must be directed towards the adverse condensation reaction accompanying the AP synthesis. In the enzymatic condensation reaction of L-aspartic acid and L-phenylalanine, the AP should be removed from the reaction system so that the synthetic equilibrium reaction proceeds to the AP synthesis. For this reason, in the process where these condensation reactions are used, The AP is removed by adsorbing onto the ion exchange resin or by incorporating a precipitant in such a way that the AP is selectively insoluble.
이들 선행분야에서의 방법들은 몇가지 심각한 결점을 가지고 있으며, 즉 보호 그룹을 필요로 하지 않는 통상의 생리적인 합성방법은 수율이 나쁘고, 작용성 그룹의 보호를 포함하는 방법에는 값비싼 보호 그룹 시약 및 불필요한 반응 단계가 사용되는 점이다.The methods in these prior arts have some serious drawbacks: conventional physiological synthetic methods that do not require protecting groups are poor in yield, and expensive protective group reagents and unnecessary methods for methods involving the protection of functional groups The reaction step is used.
따라서, 본 발명의 목적은 작용성 그룹의 보호에 따르는 값비싼 보호 그룹 사약 또는 반응 단계의 사용을 필요로 하지 않는 AP 제조방법을 제공하는데 있다.It is therefore an object of the present invention to provide a method for preparing AP that does not require the use of expensive protective group drugs or reaction steps following the protection of functional groups.
본 발명의 제2의 목적은 보호 그룹을 사용하지 않고 고수율로 AP를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.It is a second object of the present invention to provide a method for producing an AP in high yield without using a protecting group.
본 발명의 목적은 또한 우수한 효율의 값비싼 APM 및 AP를 대규모적으로 제조하는 신규 방법을 제공하는데 있다.It is also an object of the present invention to provide a novel method of producing expensive APM and AP on a large scale with good efficiency.
본 발명의 이러한 목적 및 기타의 목적은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이며, L-아스파르틸-L-페닐알라닌 디케토피페라진을 가수분해하여 L-아스파르틸-L-페닐알라닌을 생성할 수 있는 미생물의 배양물, 세포 또는 세포-처리물질을 수성 배지중에서 L-아스파르틸-L-페닐알라닌디케토피페라진과 접촉시킴을 특징으로 하는 본 발명의 AP제조 방법에 의해 이루어졌다.These and other objects of the present invention will become apparent from the following detailed description, which can hydrolyze L-aspartyl-L-phenylalanine diketopiperazine to produce L-aspartyl-L-phenylalanine. A method for producing an AP of the present invention is characterized by contacting a culture, cell or cell-treatment material of a microorganism with L-aspartyl-L-phenylalanine diketopiperazine in an aqueous medium.
본 발명의 방법은 또한, L-아스파르틸-L-페닐알라닌을 분자간 축합시켜 L-아스파르틸-L-페닐알라닌 디케토피페라진을 생성할 수 있는 미생물의 배양물, 세포 또는 세포-처리물질을 수성 배지내에서 L-아스파르틸-L-페닐알라닌 과 접촉시킴을 특징으로 하는 L-아스파르틸-L-페닐알라닌 디케토피페라진의 제조 방법도 포함한다.The method of the present invention also provides a culture, cell or cell-treatment material of a microorganism capable of intermolecular condensation of L-aspartyl-L-phenylalanine to produce L-aspartyl-L-phenylalanine diketopiperazine. Also included are methods for preparing L-aspartyl-L-phenylalanine diketopiperazine characterized by contacting with L-aspartyl-L-phenylalanine in an aqueous medium.
AP는 간단한 메틸 에스테르화 반응에 의해 APM으로 전환시킬 수 있다. 본 발명은 AP의 제조 방법, 더욱 특히, L-아스파르틸-L-페닐알라닌 디케토피페라진(이하에서는 "DKP"라 약칭함)으로부터 AP를 제조하는 방법에 관한 것이다.AP can be converted to APM by a simple methyl esterification reaction. The present invention relates to a process for producing AP, more particularly to a process for producing AP from L-aspartyl-L-phenylalanine diketopiperazine (hereinafter abbreviated as "DKP").
상기 언급한 반응은 평형반응이므로, 역반응에 의해 AP로부터 DKP를 합성할 수도 있다. DKP는 또한 APM전구물질로부터 중요한 물질이다. AP를 화학적으로 합성한 후에, AP를 DKP로 전환시킬 수 있다. 이러한 방법에 있어서, 광학적으로 활성이 있는 AP는 반응 혼합물중에서 예를 들면 D-아미노산-혼재된 아스파르틸페닐알라닌으로부터 분리할 수 있으며, 따라서 광학적으로 활성이 있는 AP가 쉽게 수득된다.Since the above-mentioned reaction is an equilibrium reaction, it is also possible to synthesize DKP from AP by reverse reaction. DKP is also an important material from APM precursors. After chemically synthesizing the AP, the AP can be converted to DKP. In this method, optically active AP can be separated from the reaction mixture, for example D-amino acid-mixed aspartylphenylalanine in the reaction mixture, so that optically active AP is easily obtained.
AP의 분자간 축합을 일으켜 AP를 DKP로 전환시킬 수 있는 미생물을 사용함으로써 수율을 증가시킬 수 있다. 이 방법에는 AP합성에 대단히 불리한 평형 반응계가 사용되기 때문에, 예를들어 효소에 의한 아스파르트산과 페닐알라닌과의 직접 결합 때문에, 생성된 미량의 AP는 DKP로 전환되고 평형은 합성이 이루어지는 쪽으로 변경된다.The yield can be increased by using microorganisms that can induce intermolecular condensation of the AP and convert the AP into DKP. Because this method uses an equilibrium reaction system that is very disadvantageous for AP synthesis, for example, due to the direct binding of aspartic acid with phenylalanine by enzymes, the traces of AP produced are converted to DKP and the equilibrium is changed towards synthesis.
DKP의 가수분해는 특정 위치에서 이루어지며, 하기에 도시된 바와 같이 역반응을 사용하여 AP를 합성할 수 있는 것으로 밝혀졌다It has been found that the hydrolysis of DKP takes place at specific locations and can be used to synthesize AP using reverse reactions as shown below.
[반응식 1]Scheme 1
L-아스파르틸-L-페닐알라닌 디케토피페라진(DKP) 아스파르틸-L-페닐알리닌(AP)L-aspartyl-L-phenylalanine diketopiperazine (DKP) Aspartyl-L-phenylalanine (AP)
본 발명에 사용될 수 있는 미생물의 예는 다음과 같으며, 이들로만 제한되는 것은 아니다 : 스트렙토아미세스플라보비렌스(Streptomyces flavovirens) IFO 3197[한국기탁번호 : KFCC-10287, 기탁기간 : 한국공균협회, 기탁일 : 1986. 10. 17], 스트렙토마이세스 파르불루스(Streptomyces parvulus) AJ 9037 FERM-P 8920 FERM BP 1168[한국기탁번호 : KFCC-10288, 기탁기간 : 한국공균협회, 기탁일 : 1986. 10. 17], 아크코모박터 락티콤(Achromobacter lacticum) AJ 2394 FERM-P 7401, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) ATCC 4452, 알칼리게네스 페칼리스(Alcaligenes faecails) AJ 2565 FERM-P 8460, 바실루스 t서큘란스(Bacillus circulas) ATCC 9966, 엔테로박터 아글로머란스(Enterobacter agglomerans) ATCC 12287, 에르비니아 아밀로보로라(Ervinia amylovora) FERM-P 7056, 플라보박테리움 레나눔(Flavobacterium rhenanum) AJ 2468 FERM-P 8459, 마이크로코쿠스 배리안스(Micrococcus varians) ATCC 339, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescence) AJ 2763 FERM-P 8461, 크산토모나스 시트리(Xanthomonas citri) AJ 2797 FERM-P 8462.Examples of microorganisms that can be used in the present invention include, but are not limited to: Streptomyces flavovirens IFO 3197 [Korea Accession No .: KFCC-10287, Deposit period: Korea Communist Association, Deposition date: October 17, 1986], Streptomyces parvulus AJ 9037 FERM-P 8920 FERM BP 1168 17], Achromobacter lacticum AJ 2394 FERM-P 7401, Agrobacterium tumefaciens ATCC 4452, Alcaligenes faecails AJ 2565 FERM-P 8460, Bacillus Bacillus circulas ATCC 9966, Enterobacter agglomerans ATCC 12287, Ervinia amylovora FERM-P 7056, Flavobacterium rhenanum AJ 2468 -P 8459, microphone Micrococcus varians ATCC 339, Serratia marcescence AJ 2763 FERM-P 8461, Xanthomonas citri AJ 2797 FERM-P 8462.
이들 미생물을 DKP 또는 AP에 작용시키기 위해, 미생물을 배양시키고, 미생물의 배양액 또는 세포나 세포 처리물질을 수성 배지내에서 DKP 또는 AP와 접촉시킨다.In order for these microorganisms to act on the DKP or AP, the microorganisms are cultured and the culture medium or cell or cell treatment material of the microorganism is contacted with the DKP or AP in an aqueous medium.
상기 언급한 미생물의 배양 배지은 통사의 탄소 공급원, 질소 공급원 및 무기 이온을 함유하는 통상의 배지이다. 때때로, 비타민, 아미노산 등과 같은 유기 미량 영양소를 추가로 혼입시킴으로써 바람직한 결과가 얻어진다.The culture medium of the above-mentioned microorganisms is a conventional medium containing a crude carbon source, a nitrogen source and inorganic ions. Sometimes desirable results are obtained by further incorporation of organic micronutrients such as vitamins, amino acids and the like.
탄소 공급원으로는 포도당, 자당 등과 같은 탄수화물, 아세트산, 알코올과 같은 유기산 및 기타를 적절히 사용할 수 있다. 질소 공급원으로는, 암모니아 개스, 암모니아수, 암모늄염 및 기타를 사용할 수 있다. 무기 이온으로는 마그네슘 이온, 포스페으트 이온, 칼륨 이온, 철이온 및 기타를 필요에 따라 적절히 이용할 수 있다.As the carbon source, carbohydrates such as glucose, sucrose and the like, organic acids such as acetic acid and alcohol, and the like can be appropriately used. As the nitrogen source, ammonia gas, ammonia water, ammonium salt and the like can be used. As the inorganic ions, magnesium ions, phosphate ions, potassium ions, iron ions and the like can be appropriately used as necessary.
배양은 pH와 온도를 각기 2 내지 8과 15 내지 30℃의 적절한 범위로 조정하면서 호기적 조건하에 1 내지 30일간 수행한다.Cultivation is carried out for 1 to 30 days under aerobic conditions, adjusting the pH and temperature to appropriate ranges of 2 to 8 and 15 to 30 ° C, respectively.
미생물의 배양액, 세포 또는 세포-처리물질을 수성 배지내에서 DKP 또는 AP에 작용시키기 위해서, 세포 또는 세포-처리물질을 DKP 또는 AP가 함유되어 있는 수성 배지내에 현탁시키거나 용해시킬 수 있으며, 수성 배지는 온도를 10 내지 70℃의 바람직한 범위로 조정하면서 단시간 동안 교반시키거나 침강시킬 수 있다.In order for the culture, cells or cell-treatment of the microorganism to act on the DKP or AP in an aqueous medium, the cell or cell-treatment may be suspended or lysed in an aqueous medium containing DKP or AP, and the aqueous medium Can be stirred or allowed to settle for a short time while adjusting the temperature to a preferred range of 10 to 70 ° C.
DKP로부터 AP를 생성하는 반응에 있어서, 사용된 DKP의 양은 특별히 제한하는 것은 아니나, 벳취 시스템의 경우에는 사용량이 일반적으로 대략 0.01 내지 2.0M, 바람직하게는 0.01 내지 1.0M이다.In the reaction to generate AP from DKP, the amount of DKP used is not particularly limited, but in the case of a Batch system, the amount of use is generally about 0.01 to 2.0M, preferably 0.01 to 1.0M.
AP로부터 DKP를 생성하는 역반응의 경우에, AP의 사용량을 특별히 제한되는 것은 아니지만 벳취 시스템의 경우에 그 양은 일반적으로 대략 0.00001 내지 2.0M, 바람직하게는 0.01 내지 1.0M이다.In the case of the reverse reaction producing DKP from the AP, the amount of AP used is not particularly limited but in the case of the Batch system, the amount is generally approximately 0.00001 to 2.0M, preferably 0.01 to 1.0M.
DKP 또는 AP는 또한 반응이 진행됨에 따라 나누어 가할 수도 있다.DKP or AP can also be added in portions as the reaction proceeds.
반응은 일반적으로 수성 베지중, 10 내지 60℃, 바람직하게는 20 내지 40℃에서 수행된다.The reaction is generally carried out at 10 to 60 ° C., preferably 20 to 40 ° C. in aqueous vegetation.
세균 세포를 사용하는 경우에, 세포를 함유하는 배양액을 또한 그대로 사용할 수 있다. 또한, 세포를 배양액으로부터 분리하여 세척한후에나, 또는 세척하지 않고서 사용할 수 있다.In the case of using bacterial cells, the culture solution containing the cells can also be used as it is. The cells can also be used after washing off from the culture or with or without washing.
적절한 세포-처리물질에는 기계적으로 분쇄한 세포, 초음파로 처리한 세포, 동결 건조된 세포, 아세톤으로 건조시킨 세포, 라이소자임과 같은 효소로 처리한 세포, 계면활성제, 톨루엔 등으로 처리한 세포, 세포의 단백질 분획, 그의 고정된 물질 및 기타가 포함된다.Suitable cell-treatments include, but are not limited to, mechanically ground cells, ultrasonically treated cells, lyophilized cells, cells acetone dried, cells treated with enzymes such as lysozyme, cells treated with surfactants, toluene, and the like. Protein fractions, immobilized materials thereof, and the like.
그러한 세포 균주를 수득하기 위해서는, 상기 언급한 배지 및 배양방법을 변형시키지 않고 적용할 수 있다.In order to obtain such cell strains, the above-mentioned media and culture methods can be applied without modification.
미생물을 배양한후, 소량의 DKP, AP 또는 DKP와 AP 둘다를 배지내에 혼힙시킴으로써 DKP로부터 AP를 생성하거나 AP로부터 DKP를 생성하는 고도의 능력을 갖는 세포를 수득할 수 있다.After culturing the microorganisms, a small amount of DKP, AP, or both DKP and AP can be mixed in the medium to obtain cells with high ability to produce AP from DKP or DKP from AP.
L-아스파르트산과 L-페닐알라닌의 생화학적 축합의 평형 반응에 있어서, 일반적으로 생성된 AP를 반응계로부터 제거하는 방법(예를들면, 이온 교환 수지로 처리, 침전제, 용매에 의한 추출, AP에 대한 특정반응을 사용한 전환 등)을 적용하여 반응을 축합 반응쪽으로 추진시킨다. 이들 방법은 또한 DKP를 AP로 전환시키는 반응을 이용하여 본 발명에 사용할 수 있다. 즉, AP를 DKP로 전환시킬 수 있는 미생물 또는 그의처리물질(상술한 바와 같음)을 혼입시킴으로써 반응을 축합 반응이 이루어지는 쪽으로 추진시킬 수 있다. 이들 미생물은 반응의 초기 단계에서나 반응이 일어나는 동안에 상기의 평형 반응계에 나누어 가할 수 있다. 이러한 경우에 AP를 DKPㄹ 전환시키는 반응에 대한 여러가지 조건은 상술한 바와 같은 조건을 따를 수 있다.In the equilibrium reaction of biochemical condensation of L-aspartic acid with L-phenylalanine, generally, a method for removing the generated AP from the reaction system (e.g., treatment with an ion exchange resin, extraction with a precipitant, a solvent, specific for AP Reaction, etc.) to drive the reaction towards the condensation reaction. These methods can also be used in the present invention using the reaction of converting DKP to AP. That is, by incorporating a microorganism capable of converting AP into DKP or a treatment material thereof (as described above), the reaction can be propagated toward the condensation reaction. These microorganisms can be added to the above equilibrium reaction system at the initial stage of the reaction or during the reaction. In this case, various conditions for the reaction for converting AP to DKPl may follow the conditions as described above.
본 발명의 다른 특징은 다음 실시예의 설명 과정 중에서 명백해질 것이며, 이들 실시예는 본 발명을 설명하는 것이지 본 발명은 제한하고자 하는 것은 아니다.Other features of the present invention will become apparent in the course of describing the following examples, which are intended to illustrate the invention, but not to limit it.
[실시예 ]EXAMPLE
[실시예 1]Example 1
500㎖들이 플라스크에 폴리펩톤 1.0g/dl, 효모즙 1.0g/dl, K2HPO40.3g/dl, KH2PO40.1g/dl, MgSO4·7H20 0.05g/dl 및 DKP 0.5g/dl을 함유하는 배지(pH 7.0) 50㎖를 넣고 115℃에서 15분간 살균시킨다.Polypeptone 1.0 g / dl, yeast juice 1.0 g / dl, K 2 HPO 4 0.3 g / dl, KH 2 PO 4 0.1 g / dl, MgSO 4 7H 2 0 0.05 g / dl and DKP 0.5 50 ml of medium (pH 7.0) containing g / dl was added and sterilized at 115 ° C for 15 minutes.
육즙 한천 배지중, 30℃에서 2일간 배양시킨, 표 1의 미생물로부터 수득한 배양물을 각기 I개의 백금이로 상술한 배지에 접종시킨다음 30℃에서 2일간 배양한다. 이들 배양액으로부터 여과에 의해 세포를 취한다. 동랴의 생리식염수로 1회 세척한후에 세포를 모은다.Cultures obtained from the microorganisms of Table 1, which were incubated at 30 ° C. for 2 days in the broth agar medium, were inoculated into the above-mentioned medium with I platinum each and then incubated at 30 ° C. for 2 days. Cells are harvested from these cultures by filtration. After washing once with saline saline, cells are collected.
이들 세균을 각각 1.0g/dl의 농도가 되도록 DKP(2.0g/dl)가 들어있는 0.1M 트리스-HCl완충액(pH 8.0) 100㎖에 가한다음 30℃에서 2시간 동안 반응시킨다. 각각의 세균으로부터 생성된 AP의 양은 표 1에 기재하였다.These bacteria are added to 100 ml of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing DKP (2.0 g / dl) to a concentration of 1.0 g / dl, respectively, and reacted at 30 ° C. for 2 hours. The amount of AP generated from each bacterium is listed in Table 1.
[표 1]TABLE 1
[실시예 2]Example 2
실시예 1에서와 유사한 방법으로 배양한 다음 취하여 세척한 스트렙토마이세스 플라보비렌스 IFO 3197(한국기탁번호 : KFCC-10287, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1986. 10. 17)을, 실시예 1에서와 같은 반응 용액을 사용하여 30℃에서 48시간동안 반응시킨다. 이러한 경우에 수득된 AP의 양은 420㎎/dl이다. 생성된 AP를 더 분해시켜 수득되는 L-Asp 및 L-Phe는 각기 43㎎/dl 및 57㎎/dl의 양으로 생성된다.Streptomyces flavovirens IFO 3197 (Korean Deposit No .: KFCC-10287, Deposit Organization: Korean spawn association, Deposit Date: October 17, 1986) was cultured and washed in a similar manner as in Example 1. Reaction was carried out at 30 ° C. for 48 hours using the same reaction solution as in Example 1. The amount of AP obtained in this case is 420 mg / dl. L-Asp and L-Phe obtained by further degradation of the produced AP are produced in amounts of 43 mg / dl and 57 mg / dl, respectively.
[실시예 3]Example 3
표 2에 기재된 미생물을 실시예 1에서와 유사한 방법으로 배양하여 세균 세포를 얻는다. 이들 세포를 각각 1.0g/dl의 농도가 되도록, AP(1.0g/dl)가 함유되어 있는 0.1M 인산염 완충액(pH 6.0) 100㎖에 가한다음 30℃에서 2시간 동안 반응시킨다. 수득된 DKP의 양은 표 2에 기재하였다 :The microorganisms described in Table 2 were cultured in a similar manner as in Example 1 to obtain bacterial cells. Each of these cells is added to 100 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0) containing AP (1.0 g / dl) to a concentration of 1.0 g / dl, followed by reaction at 30 ° C. for 2 hours. The amount of DKP obtained is listed in Table 2:
[표 2]TABLE 2
[실시예 4]Example 4
스트렙토마이세스 플라보비렌스 IFO 3197(한국기탁번호 : KFCC-10287, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1986. 10. 17)을, 실시예 1과 유사한 방법으로 생성시키고 이중 1g을 탈이온수 4㎖에 현탁시킨다. 빙냉시킨후에 아크릴아미드 750㎎과 메틸렌비스아크릴아미드 45㎎을 가한다. 질소 개스를 도입시켜 산소를 퍼지한 후에, 과황산 암모늄 3.5㎎ 및 N,N'-디메틸아미노프로피오니트릴 8㎕를 가하고 혼합물은 빙냉각시키면서 침강시킨다. 1시간 후에, 세포-함유 겔을 50메쉬의 금속 메쉬에 통과시키고 생리 식염수로 세척하여 겔-고정된 생성물을 제조한다. 고정된 생성물 2g을, 각기 실시예 1과 3에사와 유사한 방법으로 제조된 반응 용액에 가한다. 이러한 경웨 수득된 AP와 DKP의 양은 각각 370㎎/dl와 700㎎/dl이다.Streptomyces flavovirens IFO 3197 (Korea Deposit No .: KFCC-10287, Deposit Organization: Korean spawn association, Deposit Date: October 17, 1986) was produced in a similar manner to Example 1, and 1 g of deionized water 4 Suspension in ml. After ice cooling, 750 mg of acrylamide and 45 mg of methylenebisacrylamide were added. After introducing nitrogen gas to purge the oxygen, 3.5 mg of ammonium persulfate and 8 µl of N, N'-dimethylaminopropionitrile are added and the mixture is allowed to settle with ice cooling. After 1 hour, the cell-containing gel is passed through a 50 mesh metal mesh and washed with physiological saline to prepare a gel-fixed product. 2 g of immobilized product are added to the reaction solution prepared in a similar manner to Examples 1 and 3, respectively. The amount of AP and DKP obtained in these cases was 370 mg / dl and 700 mg / dl, respectively.
[실시예 5]Example 5
실시예 1에서와 유사한 방법으로 배양하고 수집하여 세척한 스트렙토마이세스 파르불루스 AJ 9037 FERM BP 1168(한국기탁번호 : KFCC-10288, 기탁기간 : 한국공균협회, 기탁일 : 1986. 10. 17) 또는 스트렙토마이세스 플라보비렌스 IFO 3197(한국기탁번호 : KFCC-10287, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1986. 10. 17)을 각기, DKP(2.0g/dl)가 함유되어 있는 0.1M 카본산 완충액(pH 9.8) 및 0.1M 트리스-HCl완충액 (pH 8.0) 각각 100㎖에 5g/dl의 농도가 되도록 가한다음 30℃에서 10시간 동안 반응시킨다. 수득된 결과는 표 3에 기재하였다.Streptomyces parbulus AJ 9037 FERM BP 1168 (Korean Deposit No .: KFCC-10288, Deposit Duration: Korean Communistant Association, Deposit Date: October 17, 1986) 0.1M carbon containing DKP (2.0 g / dl), each of Streptomyces flavovirens IFO 3197 (Korean Deposit No .: KFCC-10287, Deposit Organization: Korean spawn association, Deposit Date: October 17, 1986) Add 100 ml of each of the acid buffer (pH 9.8) and 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) to a concentration of 5 g / dl, and then react for 10 hours at 30 ° C. The results obtained are shown in Table 3.
[표 3]TABLE 3
상기 사실상 감안하여 본 발명을 여러가지로 변형 및 변경할 수 있음은 명백하가. 그러므로, 본 발명은 첨부된 특허청구 범위의 범위내에서 본 명세서의 상세하 설명에 기술된 것보다 달리 실시할 수 있음이 이해될 것이다.It is clear that the present invention can be variously modified and changed in view of the above fact. It is, therefore, to be understood that the invention may be practiced otherwise than as described in the detailed description herein within the scope of the appended claims.
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