KR920009497B1 - Method for purifying aujeszkys virus protein - Google Patents
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Abstract
Description
제1도는 셀룰로오스 설페이트 겔에 의한 오제스키 바이러스 항원단백질의 정제곡선.1 is a purification curve of Ozeski virus antigen protein by cellulose sulfate gel.
제2도는 세파덱스 G-10 컬럼에 의한 탈염하는 정제곡선이다.2 is a desalting purification curve by Sephadex G-10 column.
본 발명은 오제스키 바이러스(Aujeszky's Virus) 항원단백질의 분리방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 한국형 오제스키 바이러스로부터 간단한 공정으로 항원단백질을 분리해 내는 방법과 이를 이용하여 오제스키병의 감염여부를 진단하는 방법 및 그 진단킷에 관한 것이다.The present invention relates to a method for isolating Aujezky virus (Aujeszky's Virus) antigen protein, and more particularly, a method for isolating the antigenic protein from the Korean type Ozesky virus by a simple process, and a method for diagnosing the infection of Ojesky disease using the same and It is about the diagnostic kit.
오제스키 바이러스는 허피스비리데(Herpesviridae)속에 속하는 슈도레비스 바이러스(Pseudorabies virus)의 일종으로서, 돼지, 소, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축이나 여우, 들쥐 및 토끼 등의 야생동물, 또는 닭, 오리, 거위 등에 인공감염되거나, 자연발생이 되기도 하는 것으로서, 특히 자연숙주인 돼지가 이 바이러스를 유지 및 전파시키는 근원이 되는 것으로 알려져 있다. [Wright et. al : Am. J. Vet. Res., 41; 581-583(1980)]Ozeski virus is a type of Pseudorabies virus belonging to the genus Herpesviridae, which is a domestic animal such as pigs, cattle, sheep, horses, dogs and cats, or wild animals such as foxes, mice and rabbits, or chickens. It is known to be artificially infected with ducks, ducks, geese, etc., or to be naturally occurring. In particular, pigs, which are natural hosts, are known to be a source for maintaining and spreading the virus. Wright et. al: Am. J. Vet. Res., 41; 581-583 (1980)]
돼지에 대한 주요 감염증상은 근육경련, 전신마비, 보행장애, 횡와자세 등의 신경장애와 고열이 주요임상증상으로 나타난다. 오제스키병에 감염된 돼지는 자돈(仔豚)의 경우 주로 폐사하지만, 성돈(成豚)의 경우는 감염 후 내과내고, 내과된 성돈은 자연숙주로 남아서 계속적으로 오제스키병을 감염시키기 때문에 내과된 돼지 및 감염된 돼지는 반드시 색출해 내어 도태시켜야 한다.The major symptoms of infection in pigs are neurological disorders such as muscle spasms, paralysis, gait disturbances, transverse position and high fever. Pigs infected with Ozeski's disease usually die in piglets, but in the case of adult pigs, they are internally treated after infection, and internalized pigs remain natural and continue to infect Ozeski's disease. Pigs must be extracted and culled.
이러한 오제스키병은 캐나다, 호주 및 핀란드 등 몇개국을 제외하고는 우리나라와 주요 축산물 교역국인 미국, 영국, 덴마크 등을 포함한 거의 전세계에서 발생되고 있다. 아시아 지역에서도 일본과 대만에서는 이미 오래전부터 발병된 것으로 보고되어 있고, 우리나라에서는 1987년 6월 경남 양산국에서 처음으로 오제스키병이 발생한 바 있다.Ozeski's disease occurs almost all over the world, including Korea, major livestock trade countries such as the United States, the United Kingdom, and Denmark, except for a few countries, such as Canada, Australia, and Finland. In Asia and Japan, it has been reported for a long time in Japan and Taiwan. In Korea, the first Ozesky disease occurred in June 1987 in Yangsan.
한편, 오제스키 바이러스의 항원단백질을 분리하는 고전적인 방법[Mahy : ＂Virology＂ IRL PRESS : 207-236]으로는 폴리 에티렌글리콜(Polyethylene glycol)에 흡착 후 원심분리하는 방법, 슈크로스 그라디언트(sucrose gradient)에 의한 초원심 분리방법, 세슘클로라이드(Cesium chloride)을 이용한 초원심 분리방법 등이 알여져 있고, 근래에 특허출원된 방법(유럽특허 제853075927호)으로는 배양액을 여과농축 후, 하이드록시 아파타이트(hydroxyl apatite surry)로 비바이러스 단백질을 제거하고, 설탕, 글리세롤, 세시움클로라이드 등을 이용하여 초원심분리를 행하여 항원분리하는 방법이 있다.Meanwhile, the classical method of separating the antigenic protein of Ozeski virus [Mahy: ＂Virology＂ IRL PRESS: 207-236] is a method of centrifugation after adsorption on polyethylene glycol, sucrose gradient The ultracentrifugation method by) and the ultracentrifugation method using cesium chloride are known. Recently, the patented method (European Patent No. 853075927) is used to filter and concentrate the hydroxyapatite. (hydroxyl apatite surry) to remove the non-viral protein, there is a method for antigen separation by ultracentrifugation using sugar, glycerol, sesium chloride and the like.
그러나, 이러한 종래의 방법들은 시간이 많이 소요되고, 분리비용이 과다하며 분리수율이 낮은 단점이 있었다.However, these conventional methods are disadvantageous in terms of time-consuming, high separation cost and low separation yield.
특히, 상기 유럽특허출원 제853075927호에 소개된 방법은 항원분리시 바이러스를 분리하고 난 다음 계면활성제를 사용하여 항원단백질을 분리하게 되는데, 이렇게 하면 바이러스의 노출로 인한 오염의 위험성이 있고, 항원단백질 분리시 분리효율이 낮은 단점이 있었다.In particular, the method described in European Patent Application No. 853075927 separates the virus during antigen separation and then uses a surfactant to separate the antigen protein, which is a risk of contamination due to exposure to the virus. There was a disadvantage in that the separation efficiency was low.
이에 본 발명은 보다 짧은 시간내에 간편한 방법으로 고수율의 오제스키 바이러스 항원단백질을 분리해 낼 수 있는 방법과 이를 이용한 오제스키병의 진단방법 및 그 진단킷을 제공하는데 그 목적이 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for isolating a high yield of Ozeski virus antigen protein in a short time and a simple method, a method for diagnosing Ozeski's disease using the same, and a diagnostic kit thereof.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 오제스키 바이러스 AJHK 3(KCTC VR 15001) 주를 용액화시킨 후 농축없이 일단계의 셀룰로오스 설페이트 겔을 이용하여 항원단백질을 분리하는 방법을 그 특징으로 한다.The present invention is characterized by a method of separating antigenic proteins using a cellulose sulfate gel of one step without concentration after solution of the strain of Ozeski virus AJHK 3 (KCTC VR 15001).
또한, 본 발명은 유리컬럼내에 폴리에틸렌글리콜, 카제인 및 오제스키 바이러스 AJHK 3(KCTC VR 15001)의 항원단백질이 충전되어 있는 오제스키병의 CSID(Column Single Immuno Diffusion) 진단킷을 포함한다.The present invention also includes a CSID (Column Single Immuno Diffusion) diagnostic kit for Ozeski's disease in which the antigenic proteins of polyethylene glycol, casein and Ozeski virus AJHK 3 (KCTC VR 15001) are filled in a glass column.
또한, 본 발명은 오제스키 바이러스 AJHK 3(KCTC VR 15001)의 항원단백질을 흡착시킨 라텍스 진단액을 제조하고, 공지의 방법으로 동물의 혈액으로 부터 채취된 항혈청에다 상기 라텍스 진단액을 가하여 응집여부를 판단하므로써 오제스키병의 감염여부를 진단하는 방법을 포함한다.In addition, the present invention is to prepare a latex diagnostic solution adsorbed the antigenic protein of Ojesky virus AJHK 3 (KCTC VR 15001), and to determine the aggregation by adding the latex diagnostic solution to the antiserum collected from animal blood by a known method. Therefore, it includes a method of diagnosing the infection of Ozeski disease.
또한, 본 발명은 상기 분리된 항원단백질로부터 제조된 오제스키병 진단백신을 포함한다.In addition, the present invention includes a diagnosis vaccine of Ozeski disease prepared from the isolated antigenic protein.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.Referring to the present invention in more detail as follows.
본 발명은 오제스키 바이러스로부터 항원단백질을 분라하고, 이를 이용하여 오제스키병을 진단하고자 하는 것으로서, 본 발명에서 사용된 오제스키 바이러스 AJHK 3주(KCTC VR 15001)는 1990년 11월 28일자로 한국과학기술원 유전공학센타 유전자은행에 기탁된 것을 이용하였다.The present invention is to separate the antigenic protein from the Ozesky virus, and to diagnose the Ozeski disease using the same, the Ojesky virus AJHK 3 weeks (KCTC VR 15001) used in the present invention, as of November 28, 1990 The deposit in the Engineering Center Gene Bank was used.
본 발명에 따른 오제스키 바이러스 항원단백질 분리과정을 설명해 보면 (가) 돼지콩팥 세포주에다 오제스키 바이러스 AJHK 3주(KCTC VR 15001)를 소혈청이 함유된 이글배지(Eagle's medium)에 접종하고, 이를 35∼38℃에서 48∼72시간동안 배양하여 원심분리하는 공정과, (나) 원심분리된 상등액에 인산완충액과 소디움도데실 설페이트를 가하여 배양액을 용액화시키는 공정과, (다) 용액화된 배양액을 셀룰로오스 설페이트 겔 컬럼으로 정제하여 탈염시키는 공정을 거치면 항원단백질을 분리할 수 있다.Referring to the process for isolating the Ozeski virus antigen protein according to the present invention (A) inoculated in the Eagle's medium containing bovine serum three AJHK virus AJHK 3 strains (KCTC VR 15001) to pig kidney cells, 35 to 38 Centrifugation by incubating at 48 ° C. for 48 to 72 hours, (b) adding a phosphate buffer solution and sodium dodecyl sulfate to the centrifuged supernatant to liquefy the culture solution, and (c) solution solution to the cellulose sulfate gel. Antigen proteins can be separated by purification by column desalination.
또한, 본 발명에 따르면 다음 (가) 내지 (다) 공정으로 오제스키병을 라텍스 또는 CSID를 이용하여 진단할 수 있다. 즉, 라텍스 진단은 (가) 오제시키 바이러스의 항원단백질을 흡착시킨 라텍스에 폴리 비닐피롤리돈, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노라우레이트(Polyoxyethylene sorbitan monolaurate, Tween 20), 폴리에틸렌글리콜, 카제인 및 소디움 아자이드를 가하고, 인산 완충식염수로 0.6%가 되도록 하여 라텍스 진단액을 제조한 다음, (나) 별도로 동물의 혈액을 모세관에 흡입시키고, 이 모세관을 3000rpm으로 10-15분간 원심분리하여 진단용 항혈청을 제조하고, (다) 검은색 유리판 위에 상기 라텍스 진단액과 진단용 항혈청을 가하여 그 응집 여부를 판단하므로써, 오제스키병의 감염여부를 진단한다.In addition, according to the present invention, Ozesky's disease can be diagnosed using latex or CSID in the following steps (a) to (c). In other words, latex diagnosis is based on: (A) polyvinylpyrrolidone, polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween 20), polyethylene glycol, casein and sodium azide Was added to make a latex diagnostic solution to 0.6% with phosphate buffered saline, and (b) separately inhaled animal blood into the capillary, centrifuged for 10-15 minutes at 3000rpm to prepare a diagnostic antiserum. (C) The presence of Ozeski's disease is diagnosed by adding the latex diagnostic solution and diagnostic antisera on a black glass plate to determine whether the agglomerates are present.
이때 라텍스의 응집은 항원단백질과 피검 동물의 오제스키병에 감염되었을 때 생성되는 항체의 상호 작용에 의하여 일어나는데 라텍스가 이러한 미세한 반응을 육안으로 관찰할 수 있을 만큼 증폭시킨다. 즉, 항원, 항체, 라텍스의 복합체가 침전되어 응집하고 만약 피검 동물이 오제스키병에 감염되지 않았을 때는 항체생성이 되지 않기 때문에 항원단백질과 항체의 상호 작용이 일어나지 않아 응집반응도 나타나지 않는 원리를 이용한다. CSID 진단은 (가) 오제스키 항원단백질을 폴리에틸렌 글리콜, 카제인, 인산완충 식염수에 용해하여 0.2ψ×50mm 유리칼럼에 채운 후 바닥을 밀봉하여 CSID 진단킷을 제조한 다음, (나) 라텍스 진단의 (나) 항에서 제조된 진단용 항혈청을 CSID 진단킷 상단에 10μl 주입 후, (다) 37℃ 습윤화된 인큐베이트에서 10∼12시간 확산하여 흰색 면역침천이 생긴 것을 양성으로 판정하여 오제스키병 감염여부를 진단한다.The aggregation of latex is caused by the interaction of antigenic proteins and antibodies produced when infected with Ozeski's disease in the test animal. Latex amplifies the microscopic reaction to the naked eye. In other words, the antigen, antibody, and latex complex precipitates and aggregates. If the test animal is not infected with Ozeski's disease, the antibody is not produced. Therefore, the interaction between the antigen protein and the antibody does not occur, and thus the aggregation reaction is not used. For CSID diagnosis, (A) Ozesky antigen protein is dissolved in polyethylene glycol, casein, phosphate buffered saline, filled into 0.2ψ × 50mm glass column, and the bottom is sealed to manufacture CSID diagnostic kit. Inject 10μl of the diagnostic antiserum prepared in the above section into the top of the CSID diagnostic kit, and then (c) spread it for 10 to 12 hours in a 37 ° C wetted incubate to determine that white immunization has occurred. do.
이하, 본 발명을 실시예로서 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail as examples.
본 발명에 사용된 오제시키 바이러스는 1987년 6월, 경남 양산군 하북면에서 분리한 오제스키 바이러스 AJHK 3주(KCTC VR 15001)를 돼지 콩팥세포에서 3대 계대한 것이다.The Ozeki virus used in the present invention is three generations of Ojesky virus AJHK strain (KCTC VR 15001) isolated from Hebuk-myeon, Yangsan-gun, Gyeongnam, Korea in June 1987.
오제스키 바이러스 항원단백질의 분리방법Isolation of Ozeski Virus Antigen Protein
(가) 배양 및 회수(A) Culture and recovery
오제스키 바이러스를 배양하기 위해서는 먼저, 돼지콩팥 세포주를 이글배지에 소혈청이 포함된 배지(pH 7.2)에서 2일 동안 회전 배양병에서 부유시켜 증식한다. 세포증식 후, 배지를 제거하고 소혈청의 함량이 낮은 유지배지(pH 7.6)을 주입한다. 세포당 0.01PEU의 오제스키 바이러스를 접종하고 37℃에서 60시간 배양한다. 이렇게 해서 얻어진 바이러스의 역가(titer)는 108TCID 50/ml정도 얻을 수 있다.In order to culture the Ozeski virus, the pig kidney cell line is first propagated by floating in a rotating culture bottle for 2 days in a medium containing a small serum in eagle medium (pH 7.2). After cell proliferation, the medium is removed and a low serum maintenance medium (pH 7.6) is injected. Inoculate 0.01PEU of Ozeski virus per cell and incubate at 37 ° C. for 60 hours. The titer of the virus thus obtained can be obtained about 10 8 TCID 50 / ml.
배양된 오제스키 바이러스와 돼지콩팥 세포주를 분리하기 위해서 10,000g에서 15분간 원심분리하고, 70℃의 냉동기(Deep freezer)에 냉동하여 보관한다.In order to separate the cultured Ozeski virus and porcine kidney cell line, centrifuged at 10,000g for 15 minutes, and frozen and stored in a deep freezer at 70 ℃.
(나) 바이러스의 용액화(B) solution of the virus
상기 (가) 공정에서 제조된 바이러스의 원심분리된 상징액을 37℃로 맞춘 후, 여기에다 바이러스 배양상징액과 같은 양의 인산완충액(pH 7.6)을 가하고 배양액중 단백질 1g에 소디움도데실 설파이트(SDS)를 가하여 37℃에서 50분간 용액화 시킨다.After adjusting the centrifuged supernatant of the virus prepared in step (A) to 37 ° C., the same amount of phosphate buffer (pH 7.6) as the virus culture supernatant was added thereto, and sodium dodecyl sulfite (SDS) was added to 1 g of the protein in the culture. The solution was added at 37 ° C. for 50 minutes.
(다) 항원단백질의 정제및 농축(C) Purification and concentration of antigenic proteins
용액화된 배양액을 셀룰로오스 설페이트(Cellulose Sulfate)겔 컬럼에 흡착시키되, 셀룰로오스 설페이트겔 1ml에 배양액 35ml의 비율로 흡착시키고, 이때 컬럼의 용출속도는 분당 1ml/column 면적(cm2)의 속도로 한다.The solution cultured is adsorbed on a cellulose sulfate gel column, but adsorbed at a rate of 35 ml of the culture solution to 1 ml of cellulose sulfate gel, wherein the elution rate of the column is 1 ml / column area (cm 2 ) per minute.
이렇게 하면 첨부한 도면 제1도에서 보는 바와 같이 초기 용출에서는 항원단백 이외에 단백질, 핵산 등이 용출되고, 항원이 포함되어 있는 항원단백질은 셀룰로오 설페이트 겔에 흡착되었다가 1M NaCl이 포함된 0.01M 인산완충용액에서 용출되어 나온다. 용출된 단백질에는 NaCl이 과량 포함되어 있기 때문에 이를 탈염시키기 위해서 세파덱스 G-10 컬럼으로 탈염시키면 제2도에서와 같이 탈염된 항원단백질을 정제할 수 있다. 이와 같이 정제된 항원단백질의 정제및 농축도를 비교하면 표 1과 같다.In this case, as shown in FIG. 1, in the initial elution, proteins, nucleic acids, and the like are eluted in addition to the antigenic protein, and the antigenic protein containing the antigen is adsorbed on the cellulose sulfate gel and then 0.01M containing 1M NaCl. It is eluted from phosphate buffer solution. Since the eluted protein contains an excess of NaCl, desalting with a Sephadex G-10 column to desalinate it can purify the desalted antigenic protein as shown in FIG. Comparing the purification and concentration of the purified antigenic protein as described above is shown in Table 1.
[표 1]TABLE 1
* 항체에 응집되는 희석 배수Dilution factor that aggregates to the antibody
** 셀룰로오스 설페이트 겔에 비흡착된 액** Liquid not adsorbed on cellulose sulfate gel
상기 표 1에서와 같이 초기 셀룰로오스 설페이트 겔에서 흡착되지 않은 단백질이나 뉴클레오티드 계통은 면역가를 나타내지 않았고 흡착 후 NaCl로 용출, 세파덱스 G-10에서 탈염된 최종정제액에는 46배의 정제도와 32배 농축 항원단백질을 얻을 수 있었다. 이런 결과는 정제와 농축을 동시에 할 수 있는 획기적인 방법인 것이다. 또한, 이렇게 얻어진 항원단백질로부터 통상의 방법으로 오제스키병의 백신을 제조할 수 있었다.As shown in Table 1, the protein or nucleotide line which was not adsorbed in the initial cellulose sulfate gel did not show an immunity value and was eluted with NaCl after adsorption, and 46-fold purity and 32-fold concentration of antigen were desalted from Sephadex G-10. Protein could be obtained. This result is an innovative way to purify and concentrate simultaneously. Moreover, the vaccine of Ozeski's disease could be manufactured from the antigenic protein thus obtained by a conventional method.
한편, 어떤 동물에 오제스키병이 감염되면 동물은 면역학적 방어기작에 의해서 항체를 생산하는데, 오제스키병의 감염여부는 이항체의 생성유무로 진단할 수 있다.On the other hand, when an animal is infected with Ozeski's disease, the animal produces antibodies by immunological defense mechanisms. The infection of Ozeski's disease can be diagnosed by the presence of an antibody.
오제스키병의 진단방법Diagnosis Method of Ozeski's Disease
(가) 라텍스 진단액의 제조(A) Preparation of Latex Diagnostic Solution
라텍스(Carboxylate-Modified Polystyrne, 직경. 0.885μ, Sigma 제품)를 50배 희석된 0.01M 카보네이트 완충액(pH 9.5)으로 4차례 세척하고, 동일한 완충액으로 라텍스를 부유시킨다. 부유된 라텍스에 분리된 항원단백질을 가한 후, 4℃에서 24시간 진탕시키면서 라텍스에 항원단백질을 흡착시킨다. 항원단백질이 흡착된 라텍스를 동일한 용량의 인산완충식염수에 희석하여 미흡착된 항원단백질을 원심분리해서 제거한다. 항원단백질이 감지된 라텍스에 폴리비닐프롤리돈, 트윈-20, 폴리 에틸렌글리콜 카제인, 및 소디움 아자이드를 가하고, 인산완충식염수로 라텍스가 0.6%되도록 재부유시킨 다음, 이것을 진단액으로 사용한다.Latex (Carboxylate-Modified Polystyrne, 0.885μ diameter, manufactured by Sigma) is washed four times with 50-fold diluted 0.01M carbonate buffer (pH 9.5) and the latex is suspended with the same buffer. After adding the separated antigen protein to the suspended latex, the antigen protein is adsorbed onto the latex while shaking at 4 ° C. for 24 hours. The latex to which the antigen protein is adsorbed is diluted in the same volume of phosphate buffered saline to remove unadsorbed antigen protein by centrifugation. Polyvinylprolidone, tween-20, polyethylene glycol casein, and sodium azide are added to the latex on which the antigenic protein is detected, resuspended in phosphate buffered saline to 0.6%, and then used as a diagnostic solution.
(나) 진단용 항혈청의 제조(B) Preparation of diagnostic antisera
감염이 예상되는 동물의 귀에서 바늘로 피를 뽑은 후, 응고되기 전에 헤파린이 처리된 모세관에 흡입시킨다. 혈액이 흡입된 모세관을 3000rpm에서 10-15분 원심분리하고, 그 상등액을 오제스키병 진단용 항혈청으로 사용한다.The blood is drawn with a needle from the ear of the animal to be infected, and then inhaled into the heparinized capillary prior to coagulation. The capillary inhaled with blood is centrifuged at 3000 rpm for 10-15 minutes, and the supernatant is used as an antiserum for diagnosing Ozeski's disease.
(나) 오제스키병의 진단방법(B) Diagnosis of Ozeski's Disease
직경 1.5cm의 원을 가진 검은색 유리관에 라텍스 진단액 20㎕와 진단용 혈청 1.0㎕을 가하여 회전시키며 응집여부를 판단한다. 이때, 5-10분 동안에 응집되는 것은 양성으로 판단한다.20 μl of latex diagnostic solution and 1.0 μl of diagnostic serum were added to a black glass tube with a diameter of 1.5 cm and rotated to determine agglomeration. At this time, the aggregation for 5-10 minutes is judged to be positive.
한편, 본 발명에 따르면 보다 간편한 방법으로 오제스키병을 진단하기 위하여 다음과 같은 CSID(Colum Single Immuno Diffusion) 진단킷을 사용할 수도 있다.Meanwhile, according to the present invention, in order to diagnose Ozeski's disease in a simpler method, the following CSID (Colum Single Immuno Diffusion) diagnostic kit may be used.
CSID 진단킷CSID Diagnostic Kit
(가) CSID 진단킷의 제조방법(A) Manufacturing method of CSID diagnostic kit
0.5% 아가가 포함된 인산완충식염수에 폴리 에틸렌글리콜, 카제인을 혼합하고, 100℃ 중탕남비에서 투명해질때 까지 가온한 후 40℃로 냉각하고 여기에 항원단백질을 참가하여 0.2ψ×50mm의 유리컬럼에 35mm까지 채운다음, 밑바닥은 밀봉한다. 이렇게 만들어진 유리칼럼을 CSID 진단킷으로 사용한다.Polyethylene glycol and casein are mixed with phosphate buffered saline containing 0.5% agar, warmed up to 100 ° C in a boiling pot, cooled to 40 ° C, and joined with the antigenic protein to form a glass column of 0.2ψ × 50mm. After filling up to 35mm, the bottom seals. This glass column is used as a CSID diagnostic kit.
(나) CSID 진단킷을 이용한 진단방법(B) Diagnosis method using CSID diagnostic kit
CSID 진단 킷상부에 주사기로 항혈청을 10㎕주입하고 37℃의 습기찬 인큐베이터에서 10∼12시간 확산시키면 양성반응을 나타내는 경우는 횐색침전이 막대기 형으로 생긴다. 이와 같은 CSID 진단킷을 라텍스에 의한 침전반응에 비해서 10배 정도 감도가 낮지만 양성, 음성 반응 확인시는 전혀 문제가 없다. 이때 상기 CSID 진단킷은 한꺼번에 수백점의 진단이 가능할 뿐 아니라 사용방법이 간편한 장점이 있다.Inject 10 µl of antiserum into the CSID diagnostic kit with a syringe and spread it in a humidified incubator at 37 ° C for 10 to 12 hours. Such a CSID diagnostic kit is about 10 times lower in sensitivity than the latex precipitation reaction, but there is no problem when confirming a positive or negative response. At this time, the CSID diagnostic kit is not only capable of diagnosing hundreds of points at a time, but also has an advantage of easy use.
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