KR920008370B1

KR920008370B1 - Method for purification of epidermal growth factor

Info

Publication number: KR920008370B1
Application number: KR1019900023103A
Authority: KR
Inventors: 조중명; 강일구
Original assignee: 주식회사 럭키; 최근선
Priority date: 1990-12-31
Filing date: 1990-12-31
Publication date: 1992-09-26
Also published as: KR920012426A

Abstract

A human epidermal growth factor (EGF) is purifyed by (a) culturing recombinant yeast contg. human EGF gene, (b) concentrating the obtd. culture broth and centrifuging to obtain the supernatent, (c) diluting the supernatant with D.W. and adjusting the pH 7.0, (d) absorbing the obtd. soln. into anion exchange resin, (e) dissolving human EGF fraction with 10 mM tris buffer soln. contg. NaCl, (f) concentrating the obtd. fraction by using YC05 ultra filtrating membrane, and (g) filtering the concentrated soln. with 0.2 m filter membrane to obtain the final product. The method is useful for the prodn. of human EGF with a high purity.

Description

Purification method of human epidermal growth factor

제1도는 효모에서 발현된 인간 표피 성장 인자를 본 발명의 정제단계에 따라 전기영동한 결과를 나타낸 것으로, 제1레인과 제5레인은 단백질 마커이고, 제2레인은 20배 농축한 인간 표피 성장 인자를 함유한 효모 배양액이며, 제3레인은 DE52 음이온 교환수지로 정제한 인간 표피 성장 인자이고, 제4레인은 최종 정제된 인간 표피 성장 인자이다.Figure 1 shows the results of electrophoresis of the human epidermal growth factor expressed in yeast according to the purification step of the present invention, the first and fifth lanes are protein markers, the second lane is 20 times concentrated human epidermal growth Factor is a yeast culture containing factor 3, lane 3 is a human epidermal growth factor purified with DE52 anion exchange resin, and lane 4 is a final purified human epidermal growth factor.

본 발명은 인간 표시 성장 인자(Epidermal Growth Factor, 이하 EGF라 칭함)의 정제 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 유전공학적인 방법에 의해 효모에서 대량 발현된 순도가 낮은 인간 표피 성장 인자를 고순도의 인간 표피 성장 인자로 정제하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for purifying human labeled growth factor (hereinafter referred to as EGF), and more particularly to a low purity human epidermal growth factor expressed in yeast by genetic engineering method. A method for purifying epidermal growth factor.

우로가스트론으로도 알려져 있는 사람의 EGF는 53개의 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드로서 상피, 표피 등의 피부 세포를 성장 촉진시키는 외에 각막, 폐, 기관의 상피 세포의 성장과 분화를 촉진하는 것으로 알려져 있다(Carpenter, G., Handbook of Experimental Pharmacology, 57, 89(1981)). 다른 알려진 작용으로 단백질과 DNA 합성의 촉진(Carpenter. G Cohen, S., Annu. Rev. Biochem. 48, 193(1979)) 및 포도당 흡수촉진(Barns, D. Colowich, S.P., J. Cell. Physiol. 89, 633(1976))등의 대사 작용에 관여 한다. 또한, 인간 EGF는 위산과 펩신의 분비를 억제하고 위장 내벽세포의 성장을 촉진시키는 작용(Dembinski, A. et al, J. Physiol., 325, 35(1982))으로 알려져 있어 위궤양 등의 치료에 응용할 수 있을 것으로 보인다.Human EGF, also known as urogastron, is a polypeptide consisting of 53 amino acids that promotes the growth and differentiation of epithelial cells of the cornea, lungs and organs, as well as promoting the growth of epithelial and epidermal skin cells. Carpenter, G., Handbook of Experimental Pharmacology, 57, 89 (1981)). Other known actions include promoting protein and DNA synthesis (Carpenter. G Cohen, S., Annu. Rev. Biochem. 48, 193 (1979)) and promoting glucose uptake (Barns, D. Colowich, SP, J. Cell. Physiol 89, 633 (1976), etc.). In addition, human EGF is known to inhibit the secretion of gastric acid and pepsin and to promote the growth of gastric lining cells (Dembinski, A. et al, J. Physiol., 325, 35 (1982)). It seems to be applicable.

1975년 코헨과 카펜터(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 72, 1317(1975))가 농축된 소변에서 처음 인간 EGF를 정제하여 그 성질을 발표한 이후 25 내지 250ng/ml의 농도로 소변에 녹아 있는 인간 EGF를 정제하여 얻어 왔으나 그 수율이 낮은 이유로 여러 용도의 응용 연구가 한계에 도달해 있었다.In 1975, Cohen and Carpenter (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 1317 (1975)) first purified human EGF from concentrated urine and published its properties. Purified molten human EGF has been obtained, but due to its low yield, application research for various applications has reached its limit.

이후 화학적으로 합성된 인간 EGF 유전자를 박테리아(Smith, J. et al, Nucleic Acid Res., 10, 4467(1982))와 효모(Urdea, M.S. et al. P.N.A.S. 86, 7461(1983))에서 발현하였었다.The chemically synthesized human EGF gene was then expressed in bacteria (Smith, J. et al, Nucleic Acid Res., 10, 4467 (1982)) and yeast (Urdea, MS et al. PNAS 86, 7461 (1983)). .

종래, 인간 EGF의 정제는 인간의 뇨를 재료로 하는 경우 12단계의 과정을 거쳐 얻어지는데 이때 얻어지는 양은 뇨 1000리터에서 1 밀리그람 정도였다(Gregoli, H. Willshure. I.R.U.K., Patent Specification No, 1394846(1974)).Conventionally, the purification of human EGF is obtained through a 12-step process using human urine as a material. The amount obtained at this time was about 1 milligram to 1,000 liters of urine (Gregoli, H. Willshure.IRUK, Patent Specification No, 1394846 (1974). )).

또한 재조합 대장균으로부터 인간 EGF를 얻어 정제한 방법도 알려져 있는데(Shimizu, N. et al, European Patenmt No. 0335400, A2), 이 방법은 수율은 높일 수 있으나 내독소의 제거 및 3차 구조로의 활성을 갖는 제조공정이 필요한 단점이 있고 특히 정제공정중 농축 및 투석과정을 거치고 컬럼을 이용, 흡착 용출시키는 공정에서 소요되는 시간 및 장치 등으로 인해 대량 생산공정에 사용하기에는 문제점이 있었다.In addition, a method for purifying human EGF from recombinant E. coli is known (Shimizu, N. et al, European Patenmt No. 0335400, A2). This method can increase yields but eliminates endotoxins and activates tertiary structure. There is a disadvantage in that the manufacturing process having a, and in particular, due to the concentration and dialysis process in the purification process, using the column, the time and equipment required in the process of adsorption and elution, there was a problem to use in the mass production process.

이에 본 발명은 이러한 문제점을 제거하기 위하여 배지에서 분비된 인간 EGF를 증류수로 희석하여 음이온 교환수지에 뱃치방법으로 흡착시킨 후, pH 7.0의 트리스 완충용액에서 염화나트륨의 농도를 높혀 고순도의 인간 EGF를 용출시키는 인간 EGF의 정제방법을 고안하였다.In order to solve this problem, the present invention dilutes the human EGF secreted in the medium with distilled water and adsorbs it to the anion exchange resin by a batch method, and elutes the high-purity human EGF by increasing the concentration of sodium chloride in Tris buffer solution at pH 7.0. To purify the human EGF.

즉, 본 발명은 인간 EGF를 효모내에서 발현하여 정제하므로써 내독소에 의한 오염문제와 활성을 갖는 3차 구조상의 문제를 해결하고 고순도의 인간 EGF를 대량으로 제조하는 인간 EGF의 간편화된 정제방법을 제공하는데 그 목적이 있다.In other words, the present invention solves the problems of endotoxin contamination and tertiary structural problems by activity by expressing and purifying human EGF in yeast, and simplified purification method of human EGF for producing high purity human EGF in large quantities. The purpose is to provide.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 인간 표피 성장 인자의 정제 방법으로, 보다 상세하게는 인간 EGF 유전자를 함유하는 효모를 최소 영양배지 내에서 배양하여 얻은 종자 배양액을 영양배지 내에서 배양하여 인간 EGF를 배지 속으로 분비시키고, 조정제 및 농축, 역상 크로마토그래피에 의한 정제, 한외여과막에 의한 정제공정을 거쳐 인간 EGF를 정제하는 방법에 있어서, 조정제 및 농축공정내에 배지 속에 분비되어 원심분리시켜 얻은 상등액의 증류수로 묽히고 pH 7.0으로 유지시킨 다음 음이온 교환수지에 뱃치방법으로 흡착시킨 후, 이를 10밀리몰 pH 7.0 트리스 완충용액 속에서 염화나트륨의 농도를 높혀 주므로써 용출시키는 것임을 특징으로 하는 인간 표피 성장 인자의 정제방법인 것이다.The present invention is a method for purifying human epidermal growth factor, more specifically, seed culture medium obtained by culturing yeast containing human EGF gene in minimal nutrient medium is cultured in nutrient medium to secrete human EGF into the medium, A method for purifying human EGF through a crude agent, a concentration, a reverse phase chromatography, a ultrafiltration membrane, and diluting with supernatant obtained by centrifugation in a medium in a crude agent and a concentration step to pH 7.0. After maintaining and adsorbing to the anion exchange resin by a batch method, it is a method of purifying human epidermal growth factor, characterized in that it is eluted by increasing the concentration of sodium chloride in 10 mmol pH 7.0 Tris buffer solution.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명은 인간 EGF 유전자를 함유하는 효모를 최소 영양배지 내에서 배양하여 얻은 종자 배양액을 영양배지 내에서 배양하여 인간 EGF를 배지 속으로 분비시키고, 배양액을 증류수로 희석하여 수산화나트륨 용액으로 pH를 7.0으로 조절하고 DE52 음이온 교환수지를 가하여 단백질을 흡착시켜 컬럼에 충진한 후 10밀리몰 pH 7.0 트리스 완충액으로 세척하여 0.4몰의 염화나트륨을 함유하는 10밀리몰 트리스 완충액으로 용출시킨다. 상기 용출액을 YC05 한외여과막을 사용하여 50밀리미터까지 농축하여 아세토니트릴과 트릴플루오로아세트산을 가하고 아세토니트릴과 물, 트리플루오로아세트산 혼합용액으로 평형시킨 C₁₈역상 크로마토그라피 컬럼에 흡착시킨 후 아세토니트릴 농도 구배로 용출시키고 아세토니트릴 농도 22, 32, 45%에서 용출된 용액들을 수합하여 아세토니트릴을 제거하기 위해 식염을 함유하는 인산 완충액에 100배씩 3회 투석한 후 YC05 한외여과막으로 농축하고 다시 0.2㎛ 여과막으로 여과하여 최종 인간 EGF를 얻는다.In the present invention, seed culture medium obtained by culturing yeast containing human EGF gene in minimal nutrient medium is cultured in nutrient medium to secrete human EGF into the medium, and the culture solution is diluted with distilled water to pH 7.0 with sodium hydroxide solution. After adsorbing, DE52 anion exchange resin was added to adsorb the protein, the column was packed in a column, washed with 10 mmol pH 7.0 Tris buffer, and eluted with 10 mmol Tris buffer containing 0.4 mol sodium chloride. The eluate was concentrated to 50 millimeters using a YC05 ultrafiltration membrane, acetonitrile and trifluoroacetic acid were added, adsorbed onto a C ₁₈ reversed phase chromatography column equilibrated with acetonitrile, water and trifluoroacetic acid mixed solution, and then acetonitrile concentration. To elute with gradient and eluted at acetonitrile concentrations of 22, 32 and 45%, the solution was dialyzed three times in phosphate buffer containing saline 100 times to remove acetonitrile, and then concentrated by YC05 ultrafiltration membrane and 0.2 μm filtration membrane. Filtered to obtain final human EGF.

상기 정제방법에 의해 정제된 인간 EGF에 대해 각 단계에서 마다 전기영동을 실시하여 그 결과를 제1도에 나타내었다. 제1레인과 제5레인은 표준 분자량의 단백질 마커이며 제2레인은 정제되지 않은 인간 EGF를 함유하는 효모 배양액이고 제3레인은 DE52 음이온 교환수지를 통과시킨 후의 시료이며 제4레인은 최종 정제된 단백질 시료로써, 제1도에 나타난 바와 같이 각 정제단계마다 인간 EGF에 해당하는 단백질 띠가 분명하고 정제단계가 계속됨에 따라 그 띠가 더욱 선명한데 이는 정제단계가 계속 될수록 인간 EGF의 순도가 높아짐을 나타낸다.The electrophoresis was performed for each step of the human EGF purified by the above purification method, and the results are shown in FIG. 1. Lanes 1 and 5 are protein markers of standard molecular weight, lane 2 is a yeast culture containing unrefined human EGF, lane 3 is a sample after passing DE52 anion exchange resin, and lane 4 is finally purified. As a protein sample, as shown in FIG. 1, each purification step has a protein band corresponding to human EGF, and as the purification step continues, the band becomes clearer. As the purification step continues, the purity of human EGF increases. Indicates.

이하. 실시예의 의거하여 상세히 설명하면 다음과 같다.Below. When described in detail based on the embodiment as follows.

[실시예]EXAMPLE

1. 발효공정1. Fermentation process

유전자 재조합 방법에 의해 인간 EGF를 분비하도록 형질전환된 효모(본 출원인의 선출원 특허제90-16820호, 인간 EGF 유전자)를 4% 포도당을 함유하는 10밀리미터의 루이신 결핍배지에 하루동안 배양한 후, 이를 다시 4% 포도당을 함유하는 100밀리리터의 유라실 결핍배지에 접종하여 하루 동안 배양시켜 종자 배양액을 얻는다. 이 종자 배양액을 2%의 포도당을 함유하는 2리터의 영양배지(1% 효모추출액, 2% 펩톤, 2% 포도당)에 접종하고 30℃에서 48 내지 72시간 배양한다.Yeast transformed to secrete human EGF by genetic recombination method (Applicant's patent application No. 90-16820, human EGF gene) was incubated in a 10 mm leucine deficient medium containing 4% glucose for one day. Then, it is inoculated again in 100 ml of uracil deficient medium containing 4% glucose and cultured for one day to obtain seed culture. This seed culture was inoculated in 2 liters of nutrient medium (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose) containing 2% glucose and incubated at 30 ° C. for 48 to 72 hours.

2. 조정제 및 농축공정2. Control agent and concentration process

상기 실시예 1에서 얻어진 최종 배양액 2리터를 원심분리기(Beckman Co., JGB, 3500rpm×30분)로 원심분리하여 얻은 상등액으로 증류수로 희석하여 그 부피가 4리터가 되게 한 후, 이를 0.1몰 수산화나트륨용액으로 적정하여 pH를 7.0으로 맞추고 여기에 DE-52 음이온 교환수지(Whatman Co.,U.S.A.) 200그람을 가한 다음 4℃에서 30분간 교반하여 단백질을 흡착시킨다.2 liters of the final culture solution obtained in Example 1 was diluted with distilled water with a supernatant obtained by centrifugation with a centrifuge (Beckman Co., JGB, 3500 rpm x 30 minutes) to a volume of 4 liters, and then 0.1 mol of hydroxide. Titrate with sodium solution to adjust pH to 7.0, add 200 grams of DE-52 anion exchange resin (Whatman Co., USA), and stir at 4 ° C for 30 minutes to adsorb protein.

상기 과정에서 얻어진 수지를 2.5㎝×50㎝ 크기의 컬럼에 충진하고 2리터의 10밀리몰 pH 7.0 트리스 완충액으로 세척한 후 0.4몰의 염화나트륨을 함유하는 300밀리리터의 10밀리몰 트리스 완충액으로 용출시킨다.The resin obtained in the above process is packed into a 2.5 cm x 50 cm column, washed with 2 liters of 10 mmol pH 7.0 Tris buffer and eluted with 300 milliliters 10 mmol Tris buffer containing 0.4 mol sodium chloride.

그 결과, 순도 80 내지 85% 정도의 인간 EGF가 150 내지 200밀리그람정도가 얻어졌다. 이때, 반응온도는 4℃를 유지하도록 한다.As a result, about 150-200 milligrams of human EGF about 80-85% of purity were obtained. At this time, the reaction temperature is to maintain 4 ℃.

3. 역상 크로마토그라피 컬럼에 의한 정제공정3. Purification by Reversed Phase Chromatography Column

상기 실시예 2의 조정제 단백질용액 300밀리리터를 YC05 한외여과막(Amicon, U.S.A.)으로 50밀리터까지 농축하여 20%(V/V)가 되게 아세토니트릴을 혼합하고 트리플루오로아세트산(TFA)을 0.1%가 되게 가한다. 상기 용액을 아세토니트릴 : 물 TFA= 20 : 80 : 0.1용액으로 미리 평형시킨 C₁₈역상 크로마토그라피 컬럼에 통과시켜 20% 아세토니트릴 : 0.1% TFA용액으로 충분히 세척한 다음 2시간 동안 아세토니트릴 농도 20 내지 50%까지 직사 농도 기울기로 용출시켜 인간 EGF를 얻는다.300 milliliters of the crude protein solution of Example 2 was concentrated to 50 milliliters with a YC05 ultrafiltration membrane (Amicon, USA) to mix acetonitrile to 20% (V / V) and trifluoroacetic acid (TFA) in 0.1% To be added. The solution was passed through a C ₁₈ reversed phase chromatography column previously equilibrated with acetonitrile: water TFA = 20: 80: 0.1 solution, washed thoroughly with 20% acetonitrile: 0.1% TFA solution, and then acetonitrile concentration of 20 to 2 hours. Human EGF is obtained by eluting with a direct concentration gradient up to 50%.

그 결과, 인간 EGF는 90%, 95% 이상, 95% 이상의 순도를 아세토니트릴 농도 22, 32, 45%에서 각각 다른 피크로 용출되었고, 얻어진 양은 각각 30, 20, 35밀리그람이었다.As a result, human EGF eluted at 90%, 95% or more, and 95% or more purity at different acetonitrile concentrations of 22, 32, and 45%, respectively, and the amounts obtained were 30, 20, and 35 milligrams, respectively.

상기 반응은 상온에서 실시하였다.The reaction was carried out at room temperature.

4. 최종 정제공정4. Final Purification Process

상기 공정 3에서 얻어진 3종류의 인간 EGF를 가각 식염을 함유하는 인산 완충액에 100씩 3회 투석한 후 YC05 한외여과막을 사용하여 농축하고 0.2㎛ 여과막으로 여과하여 최종적으로 인간 EGF를 얻는다.The three kinds of human EGF obtained in step 3 were dialyzed three times by 100 times in a phosphate buffer containing each salt, concentrated using a YC05 ultrafiltration membrane and filtered through a 0.2 μm filtration membrane to finally obtain human EGF.

이때, 최종적으로 얻어진 인간 EGF의 양은 22, 32, 45% 분획에 대해.At this time, the amount of human EGF finally obtained is for the 22, 32, 45% fraction.

Claims

Seed cultures obtained by culturing yeast containing human epidermal growth factor gene in minimal nutrient medium were cultured in nutrient medium to secrete human epidermal growth factor into the medium, purified by modulator and concentration, reverse phase chromatography, ultrafiltration membrane In the method for purifying human epidermal growth factor through a purification step, the supernatant obtained by centrifugation by secretion in a medium in a regulator and a concentration step is diluted with distilled water, maintained at pH 7.0 and adsorbed by an anion exchange resin by batch method. And then eluting the same by increasing the concentration of sodium chloride in 10 mmol pH 7.0 Tris buffer solution.