KR920002313B1 - 식물에 해충내성을 부여하는 재조합 dna분자 및 이를 이용한 식물 제조방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

식물에 해충내성을 부여하는 재조합 DNA분자 및 이를 이용한 식물 제조방법

제1도는 CaMV 35S-억제제 Ⅰ키메라 유전자(chimeric gene)의 제조 및 pGA 482 플라스미드와의 클로닝 과정을 나타내는 개략도이다.(여기서, B는 Bam HI, BL은 T-DNA의 왼쪽경계, BR은 T-DNA의 오른쪽 경계, E는 EcoR Ⅰ, H는 Hind Ⅲ, P는 Pst Ⅰ을 각각 나타낸다.)

제2도는 35S-억제제 Ⅰ 키메라 유전자의 뉴클레오티드 배열이다.(여기서, 인헨서(enhancer)인 GTGGATTG, 프로모터 요소인 TATATAA와 CAAT, 그리고 폴리(A) 부가신호 서열(poly(A) addition signal)인 AATAAG는 박스로 표시되어 있다. 이 유전자의 구축에 사용된 BamH Ⅰ과 Hind Ⅲ의 제한효소 부위는 밑줄이 쳐져있으며, 화살표는 전자개시 신호를 나타내고, ***는 정지코돈(stop codon)을 나타낸다.

제3도는 토끼혈청으로 제조한 억제제 Ⅰ의 항체를 함유한 한천 배지에서 트랜스제닉 담배잎의 추출물을 반응시킨 결과사진이다. (여기서 A는 억제제 Ⅰ 단백질, B는 트랜스제닉 담배잎의 추출물, C는 형질전환되지 않은 담배잎의 추출물과 반응시킨 것이다.)

제4도는 담배 거세미 나방 애벌레를 사용한 생물검정 결과사진이다. (A는 억제제 Ⅰ 단백질을 합성하는 트랜스제닉 담배이며, B는 형질전환되지 않은 담배이다.)

본 발명은 해충에 저항성을 가지는 재조합 DNA분자에 관한 것이며, 또한, 곤충에 대한 자연적인 살충제로 알려진 단백질 분해효소 억제제 유전자(proteinase inhibitor gene)를 유용작물에 도입함으로써 곤충에 대해 저항성을 갖는 식물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

현재까지 곤충을 제어하기 위해서는 주로 화학적 살충제를 사용하여 왔으나, 화학적 살충제는 비용이 많이 들고, 공해 요인중 하나로 토양을 오염시키며, 인간에게까지 해를 미치는 것으로 알려지고 있기 때문에 작물 스스로 곤충에 대한 저항성을 간직함으로써 살충제 살포가 불필요하거나 적은양의 살충제만을 요하는 작물의 개발이 요구되어 왔다.

한편, 재조합 DNA기술과 함께 유효한 유전자 벡터 체계와 다양한 유전자 형질 전환기술의 개발로 과거 5년동안 식물 유전공학의 빠른 진보를 가져왔으며, 이것을 유전자 조절에 대한 연구나 작물의 양적 질적 개선에도 응용할 수 있게 되었다.

해충에 저항성을 가진 식물의 생산은 식물 유전공학이 가장 잘 응용되고 있는 것 중 하나이며, 곤충에 대한 저항성 작물의 개발에 관한 연구는 바실러스 쑤린지엔시스(Bacillus thuringiensis)의 독소 유전자 또는 단백질 분해 효소 억제제 유전자를 식물에 도입하는 방향으로 진행되어 왔으며, 바실러스 쑤린지엔시스의 독소는 강력한 살충력을 나타내지만 대상 곤충이 제한되어 있는 반면, 단백질 분해 효소 억제제는 강력하지는 않지만 광범위한 곤충에 작용한다는 장점이 있다.

단백질 분해 효소 억제제 유전자를 식물에 도입하여 발현시킨 예로는 감자의 단백질 분해 효소 억제제 Ⅱ 유전자를 담배 식물에 도입하여 발현이 확인된 것(EMBO Journal 6, 303~306, 1987)과 돔부(cowpea)의 트립신 억제제(trypsin inhibitor)를 담배 식물에 도입하여 발현이 확인된 것(Nature 300, 160~163, 1987)이 있으나, 토마토의 단백질 분해 효소 억제제 Ⅰ 유전자를 담배 식물에 도입한 것은 아직 보고된 바 없다.

따라서, 본 발명은 키모트립신(chymotrypsin)의 분해활성 억제제인 토마토의 단백질 분해 효소 억제제Ⅰ 유전자의 cDNA와 게놈 DNA를 조작하여 강력한 진핵 식물의 프로모터(promotor)로 알려진 CaMV의 35S 프로모터에 부착한 후 식물에 도입하여 발현시킴으로써 곤충에 대한 저항성을 갖는 작물을 개발하기 위한 것이다.

종래의 식물세포 게놈에 재조합 DNA를 도입시키는 방법으로는 DNA 직접 도입방법으로 원형질 나출세포에 폴리에틸렌 글리콜과 같은 화학물질과 함께 도입시키는 방법(Paszkowski, J., 등 EMBO J. 3: 2717~2722, 1984)과 전기적인 충격을 가하여 도입시키는 방법(Fromm ME등, Nature 319 : 791~793, 1988)이 있으며, 아그로 박테리움을 매개체로 이용하는 방법(An G., 등, EMBOJ 4 : 277~288, 1985) 등이 있다.

식물은 일상의 환경에 존재하는 수많은 해충과 병원성 물질로부터 자신을 보호하기 위한 다양한 방법들을 가지고 있으며, 그 보호방법은 종에 따라 다르고, 여러가지 화학물질들이 관여하며(Sequeira, L. (1983) Ann. Rev. Microbiol. 37, 51~79), 이 방어용 화학물질들은 식물의 구성성분으로서 합성되어지던지, 해충에 의해 공격될때 합성되도록 유도된다. 트립신(trypsin), 키모트립신(chymotrypsin)과 같은 단백질 분해 효소(proteinase)의 억제제는 식물에서 대개 씨(seeds)와 괴경(tubers) 등에 다량 존재한다.

또한, 단백질 분해 효소 억제제는 기계적으로 손상을 입을때 또는 곤충이 식물의 잎에 상처를 줄때, 토마토와 감자의 모든 잎에서 체계적으로 합성되는 것으로 알려져 있다. (Green, T. and Ryan, C.A. (1972) Science 175, 776~777)

대부분의 식물 단백질 분해 효소 억제제들은 주로 미생물과 동물에 존재하는 단백질 분해 효소의 활성을 억제하고 식물에서 생산하는 단백질 분해 효소에 대해서는 거의 작용하지 않기 때문에(Richardson, M. Phytochemistry 16, 159~167, 1977), 식물은 해충에 대항해서 그들 자신을 방어하기 위해 단백질 분해 효소 억제제를 합성하고 저장하리라 생각되어지고 있다.

그 가능성을 증명하기 위해서 힐더등(Hilder, V.A., Gatehouse, A.M.R., Sheerman, S.E., Barker, R.F. and Boulter, D. Nature 300 : 160~163, 1987)은 꽃양배추 모자이크 비루스(cauliflower mosaic virus, CaMV) 35S 프로모터의 조절하에서 트립신 억제제 유전자를 담배에 도입하여 발현시켰으며, 그 결과, 어린 담배 나방의 애벌레(tobacco budworm)에 대한 저항성이 현저하게 증가함을 밝혀내었다.

본 발명자들은 담배 식물에서 CaMV 35S 프로모터의 조절하에 토마토의 단백질 분해 효소 억제제 Ⅰ 유전자를 발현하려고 시도하였다.

즉, 발명자들은 꽃양배추 모자이크 비루스 35S 전사체(cauliflower mosaic virus 35S transcript) 프로모터와 토마토 단백질 분해효소 억제제 Ⅰ의 cDNA 및 게놈 DNA를 재조합한 키메라 유전자(chimeric gene)를 아그로박테리움을 매개로한 형질 전환방법에 의해 담배 세포로 도입하였다.

그결과, 형질 전환된 세포가 완전한 식물로 재생되었으며, 형질 전환된 담배식물로부터 얻은 잎 추출물의 면역학적 분석으로 형질 전환된 식물에서 토마토의 단백질 분해효소 억제제 Ⅰ 단백질이 합성되는 것을 확인하였다.

또한, 형질 전환된 담배 식물(transgenic tobacco plants)은 담배 거세미 나방의 애벌레에 대해 높은 저항성을 보여주었다.

본 발명 결과 생산된 단백질 분해 효소 억제제 Ⅰ을 합성하는 담배 식물은 곤충의 공격으로부터 보호되었고, 형질 전환되지 않은 대조식물에서는 그렇지 아니하였다.

본 발명은 재조합 DNA분자에 의해 만들어진 단백질 분해 효소 억제제 Ⅰ이 형질전환 식물에서 방어성 화학물질로서 합성된다는 증거를 제시할 뿐만 아니라, 본 발명을 이용하여 해충내성 작물을 생성할 수 있음을 증명하는 것이었다.

다음의 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위한 것이며, 각 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

35S-억제제 Ⅰ(35S-inhibitor Ⅰ) 유전자 조작

CaMV 35S-억제제 Ⅰ의 재조합 DNA조작은 제1도에 도해된 방법으로 수행되었다.

1.CaMV의 35S 프로모터(35S promoter)의 클로닝

CaMV의 전체 게놈(genome)을 간직하고 있는 pCaMV 10을 제한효소 Bg1 Ⅱ로 절단하여 BamH Ⅰ으로 절단된 pUC 18에 클로닝하였다. 이들 중에서 프로모터를 간직하고 있는 1.15kb Bg1 Ⅱ절편을 함유한 클론을 선별하여 이 절편이 플라스미드에 어떠한 방향으로 삽입되어 있는지 Hinc Ⅱ로 절단하여 확인하였다.

정방향으로 삽입된 플라스미드를 pJSL 200이라고 명명하였으며, 이는 pUC 18의 BamH Ⅰ 절단부위에 CaMV 35S 프로모터를 포함하는 1.15kb의 Bg1 Ⅱ절편이 클로닝된 것이다.

2. CaMV 35S 프로모터의 조작

pJSL 200에는 1.5kb Bg1 Ⅱ절편에는 프로모터 부위 뿐만 아니라 억제제 Ⅰ 유전자에 부착하기에 불필요한 부위가 존재함으로 이 부위를 제거하기 위하여 엑소뉴클레어제 Ⅲ(exonuclease Ⅲ)와 S1 뉴클레아제를 사용하여 한방향만으로의 제거를 유도하였다.

이들에서 제거 정도를 확인한 후에 프로모터 부위 가까이에까지 이르른 것(처리시간 : 1분과 2분)을 선택하여 클레노우 효소(Klenow enzyme)로 끝부위를 채운후 BamH Ⅰ 링커 DNA(BamH Ⅰ linker : CGGATCCG)와 함께 연결하였다.

이를 E.coli JM 101에 도입시킨후 형성된 클로니로부터 플라스미드 DNA를 순수분리하고 EcoR Ⅰ과 BamH Ⅰ으로 절단하여 제거정도와 BamH Ⅰ링커 존재여부를 확인하였다.

이들 중에서 BamH Ⅰ 링커 DNA가 삽입되고 적절히 제거된 변이제를 선별하여 제거정도를 결정하고 제거된 종말점을 Sanger의 방법을 사용하여 염기성을 결정하였다.

BamH I 링커 삽입부위가 확인된 것들은 pJSL 207,208,210,212라고 명명되었다. 이들 중에서 pJSL 212를 억제제 Ⅰ 유전자와 연결하는데 사용하였다.

3. 토마토 억제제 Ⅰ cDNA의 조작

토마토 억제제 Ⅰ cDNA에는 cDNA 클로닝 과정에서 불필요한 올리고(dC)가 부착되어 있으므로 이 부위를 제거하지 아니하면 아니된다. 억제제 Ⅰ cDNA 클론에서 226bp Hind Ⅲ 절편을 순수분리하여 pUC19에 클로닝하여 삽입여부를 확인하고 더 나아가서 Hinf Ⅰ으로 절단하여 방향을 결정하였다.

서로 다른 방향으로 삽입된 클론을 pJSL 205와 pJSL 206으로 명명하였다. 이중에서 반대방향으로 삽입된 클론인 pJSL 206을 가지고 엑소뉴클리아제 Ⅲ와 S1 뉴클리아제로 처리함으로써 올리고(dC) 제거를 유도하였다. 30초동안 엑소뉴클리아제 Ⅲ로 처리한 DNA를 클레노우 효소로 무딘끝(blunt end)을 만든 다음 BamH Ⅰ 링커와 함께 연결하고 E. coli JM 101에 도입하였다.

형성된 클로니에서 DNA를 추출한 후 BamH Ⅰ으로 절단하여 BamH Ⅰ링커 DNA가 삽입된 클론을 선별한 후 Hinf Ⅰ으로 절단하여 폴리아크릴아마이드 겔에서 분리함으로써 제거정도를 확인하였다.

토마토 억제제 Ⅰ cDNA ATG 코돈 다음에는 Hinf Ⅰ 제한부위(GAGTC)가 존재하는데 이 부위로부터 제거정도를 결정하여 후보를 선별한 후 유전자 서열을 확인함으로써 제거종말점을 결정하였다.

올리고(dC)가 제거된 변이체 중 하나인 pJSL 227은 억제제 Ⅰ cDNA의 번역되지 않는 부위(untranslation region)에 BamH Ⅰ 링커 DNA(CGGATCCGATCC)가 삽입되어 있음을 알 수 있었다.

4. 35S-억제제 Ⅰ 재조합 DNA 융합

35S-억제제 Ⅰ 재조합 DNA 융합은 지금까지 조작된 것들을 단계별로 연결함으로써 수행되었다. 우선 pJSL 227에서 BamH Ⅰ-Hind Ⅲ 절편을 겔로부터 정제(gel purification)하고 35S 프로모터를 간직한 pJSL 212를 BamH Ⅰ-Hind Ⅲ로 절단한 후 함께 연결하여 pJSL 228을 얻었다. 다음에 pJSL 228에서 EcoR Ⅰ-Hind Ⅲ절편을 순수분하고 토마토 단백질 분해 효소 억제제 Ⅰ의 게놈 유전자가 클로닝된 pUC 79을 EcoR Ⅰ-Hind Ⅲ로 절단한 후 함께 연결하여 pJSL 230을 얻었다.(제1도 참조)

pJSL 230에서는 35S-억제제 Ⅰ 융합이 형성되어 있으며, 융합된 재조합 DNA의 전사(transcription)는 35S 프로모터에서 시작하여 억제제 Ⅰ 유전자의 종말점(terminator)에서 끝나게 되며 원래 억제제 Ⅰ 유전자에 존재하고 있는 두개의 인트론(intron)은 제거되었다.

pJSL 230에서 35S-억제제 Ⅰ 융합부위를 간직하고 있는 3.6kb EcoR Ⅰ 절편은 Ti-플라스미드에서 유도된 벡터(vector)인 pGA 482의 EcoR Ⅰ 부위에 클로닝되어 pJSL 231이 얻어졌다.

[실시예 2]

[조작된 35S- 억제제 Ⅰ 유전자의 식물체로의 도입]

1. 트리-페어렌탈 메이팅(Tri-parental mating)

지금까지의 DNA조작은 E.coli를 숙주세포로 사용하여 수행되어 왔으나, 식물세포에 조작된 유전자를 도입시키기 위해서는 pJSL 231을 E.coli에서 아그로박테리움(Agrobacterium)으로 옮겨야 한다.

이를 위해서 트리-페어렌탈 메이팅을 수행하였다.

pJSL 231을 간직하고 있는 E.coli 세포와 플라스미드 이동을 매개하는 헬퍼 E.coli 그리고 아그로박테리움 세포를 함께 섞어 하루 저녁 배양한 후 2μg/㎖(20ppm) 가나마이신과 10μg/㎖(10ppm) 테트라싸이클린이 함유된 고체 배지에서 이들 항생제에 저항성을 간직한 아그로박테리움을 선별하고 이들에서 추출된 플라스미드 DNA의 구조를 비교하여 봄으로써 pJSL 231의 존재유무와 그 구조를 확인하였다. 이 pJSL 231은 한국과학기술원(KTCT)에 기탁되었고 기탁번호는 KTCT 8478P을 부여받았다.

2. 35S -억제제 Ⅰ 유전자의 식물세포로의 도입

pJSL 231(KCTC 8478P)을 간직하고 있는 아그로박테리움과 식물잎 절편을 함께 배양함으로써 35S억제제 Ⅰ유전자를 식물세포로 도입시켰다.

대상식물은 우선적으로 담배 재배종(Nicotiana tabacum cv. Burley)을 사용하였으며 그 밖에 여러 다른 재배종을 대상으로 형질전환하고자 하였다.

담배잎 절편을 약 2cm 크기로 절단하여 액체 배양한 아그로박테리움과 액체 MS배지에서 2일동안 함께 배양을 수행한 후 아그로박테리움을 씻어내고 100μg/ml의 가나마이신을 포함하고 있는 슈트(shoot) 유도배지에 옮겨 슈트를 유도한 후, 뿌리를 유기시켜 완전한 식물체로 재생시켰다.

3. 35S-억제제 Ⅰ 유전자의 발현검정

완전한 식물체로 형성된 트랜스제닉 담배를 30cm 이상의 크기로 성장시킨 후 잎추출물을 단백질 분해 효소 억제제 Ⅰ의 항체와 반응시켜 본 결과 트랜스제닉 담배의 잎에서 단백질 분해 효소 억제제 Ⅰ이 합성되는 것을 확인하였다.(제4a도)

또한, 담배 거세미 나방의 애벌레를 사용하여 생물검정을 실시한 결과 트랜스제닉 담배식물은 담배 거세미 나방의 애벌레로부터 보호되었으나, 형질 전환시키지 않은 담배식물은 보호받지 못하였다.(제5b도)

Claims (11)

1. 식물이 키모트립신 억제제를 생산하게 하여 식물에 해충내성을 부여하는 재조합 DNA분자.
2. 제1항에 있어서, 키모트립신 억제제를 암호화하는 유전자 서열이 식물에서 유래한 재조합 DNA분자.
3. 제1항에 있어서, 키모트립신 억제제를 암호화하는 유전자 서열이 토마토로부터 유래한 재조한 DNA분자.
4. 제3항에 있어서, 토마토의 키모트립신 억제제를 암호화하는 유전자 서열이 하기 뉴클레오티드 염기 서열을 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 재조합 DNA분자.

   
5. 제1항, 제2항 또는 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 서열이 게놈 DNA, cDNA 또는 합성 DNA로 구성된 재조합 DNA분자.
6. 기능적으로 식물 프로모터에 연결된 키모트립신 억제제 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 재조합 DNA분자.
7. 제6항에 있어서, 유전자 서열이 식물 프로모터와 헤테로인 재조합 DNA분자.
8. 제6항에 있어서, 유전자 서열이 식물세포내에서 발현되는 재조합 DNA분자.
9. 제8항에 있어서, 발현 시그널이 꽃양배추 모자이크 비루스의 유전자로부터 유래하는 재조합 DNA분자.
10. 제9항에 있어서, CaMV게놈의 35S 발현시그널을 포함하는 재조합 DNA분자.
11. 플라스미드 pJSL 231(KTCT 8478P) 및 T-DNA 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 튜메파시엔스의 형질전환계를 이용한 해충내성 식물 제조방법.

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