KR890003085B1

KR890003085B1 - 바실러스(Bacillus)속의 카복시메틸 셀룰레이스(carboxymethyl cellulase, CMCase)를 코딩(coding)하는 유전자

Info

Publication number: KR890003085B1
Application number: KR1019860009291A
Authority: KR
Inventors: 유주현; 김진만
Original assignee: 유주현
Priority date: 1986-11-04
Filing date: 1986-11-04
Publication date: 1989-08-21
Also published as: KR880006361A

Abstract

내용 없음.

Description

바실러스(Bacillus)속의 카복시메틸 셀룰레이스(carboxymethyl cellulase, CMCase)를 코딩(coding)하는 유전자

제1도는 콩고레드(congo red)염색방법으로 재조합 씨엠씨에이스(CMCase)유전자를 포함하고 있는 에스케치아 콜라이 MB1000(E. coli MB1000)의 선별과 이로부터 분리한 재조합 플라스미드 (plasmid)디엔에이(DNA)를 재형질전환(retransformation)시켜 선별을 한 사진도해이다.

제2도는 바실러스 스페시스 스트레인 N-4(Bacillus sp.stranin N-4)의 씨엠씨에이스유전자를 지니고 있는 재조합 플라스미드의 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)사진도해이다.

제3도는 플라스미드 DNA pYBC107을 여러가지 제한효소(restriction enzyme)으로 절단한 단편들의 아가로스 겔 전기영동 사진도해이다.

제4도는 플라스미드 DNA pYBC107을 여러가지 제한효소로 이중분해한 단편들의 아가로스 겔 전기영동 사진도해이다.

제5도는 제3도, 제4도의 DNA 단편의 전기영동 결과를 바탕으로 재조합 플라스미드 DNA pYBC107의 제한효소 지도를 나타내는 그림이다.

제6도, 제7도는 플라스미드 DNA pYBC107을 포함하는 에스케치아 콜라이 MB1000과 바실러스 스페시스 N-4의 씨엠씨에이스 활성과 안정성에 대한 pH의 영향을 나타내는 그림이다.

본 발명은 셀룰레이스(cellulase)의 다성분(multicomponent)에 대한 유전적 정보를 분석하고 생산성향상, 분비벡터의 제조 및 숙주세포를 달리했을때의 유전자 조절 및 발현을 목적으로 알칼리 조건하에서 생육하며 적어도 4가지 이상의 셀룰레이스를 생산하는 바실러스 스페시스 스트레인 N-4(Bacillus sp. strain N-4)(ATCC21833, Horikoshi et al. : United States Patent 3,844,890)으로부터 1984년 호리코시등이 밝힌 2.0, 2.8킬로베이스(kb)의 씨엠씨에이스 유전자(Sashihara, N.,T. kudo and K. HOrikoshi : J. Bacteriol.,158,503,1984)이외의 새로운 씨엠씨에이스를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조함 플라스미드의 제조에 대한 것이다.(바실러스 스페시스 스트레인 N-4 균주는 한국종균협회에도 보관중이며 1985년부터 분양가능함) 섬유소성 바이오매스는 지구상에서 가장 풍부하고 재생산성 자원이며 이로부터 에너지, 식량, 화학물질등의 효율적인 생산을 위하여 셀룰로우스 분해능이 강한 효소의 연구가 세계 여러국가에서 활발하게 진행되고 있는 실정이다.

현재까지 셀룰레이스 생산량이 많고 천연 셀룰로우스에 대한 분해능이 강한 곰팡이로는 아스퍼질러스(Aspergillus), 페니실리움(Penicillium), 퓨자리움(Fusarium), 스토로트리컴(Sporotricum)등에 관하여 연구된바 있다.

셀룰로우스 분해요소를 생산하는 세균류로는 셀로비브리오(Cellovibrio), 클로스트리디움(Clostridium), 아세토비브리오(Acetovibrio), 박테리오데스(Bacteiodes), 셀룰로모나스(Cellulomonas) 슈도모나스(Pseudomonas), 또한 방선균인 써머액티노마이세테스(Thermoactinomycetes), 써머모노스포라(Thermomonospora)와 스트렙토 마이세스(Streptomyuces)등에 대한 효소학적 연구가 지속적으로 행하여져 왔다. 아비셀(Avicell)과 같은 결정성 셀룰로우스 분해에 대한 확실한 연구결과는 보고되어 있지 않으나 카복시메틸 셀룰로우스(CMC)의 베타-1,4-글루코시딕 링케이지(β-1, 4-glucosidic linkage)를 가수분해 할 수 있는 바실리(Bacilli)로는 바실러스 브레비스(B. brevis), 바실러스 퍼미스(B. firmis), 바실러스 퓨밀러스(B.pumilus), 바실러스 폴리믹사(B. polymyxa), 바실러스 세리우스(B. cereus)등이 있는 것으로 알려지고 있다.

미생물을 이용하여 셀룰로우즈로부터 유용한 물질을 생산하기 위해서는 먼저 당화 과정인 셀룰로우스의 분해가 필요하다. 셀룰로우스의 효소적 가수분해는 산이나 알칼리 가수분해와 비교할 때 회수성, 특이성, 적은 에너지 소비, 비오염성등의 장점을 가지고 있으나 공정의 경제성 및 셀룰로우스성 물질(cellulosic material)의 대량 당화를 위한 적용효과에는 많은 문제점이 있다. 현재까지는 효소 생산을 위하여 생산능이 매우 높은 균주나 콘스티튜티브 변이주(constitutive mutant)를 분리하므로서 바이오컨버젼(bioconversion)의 효율을 증진시키는 연구가 행해져 왔으나 최근 유전공학 기술을 이용하여 셀룰레이스 유전자를 분리하고 이를 강한 프로모터(strong promoter)에 연결시키거나 억제(repression)에 민감한 오퍼레이터(operator)를 제거시키는 등의 유전자 발현 기구를 변형시키므로서 대량의 효소를 생산하여 직접 이용 가능한 포도당으로 전환시키는 연구와 분리한 유전자를 자이모모나스 숙주벡터체계(Zymomonas host vector system)을 이용하여 형질전환시키므로서 셀룰로우스로부터 에탄올(ethanol)을 생산하는 연구가 진행되어 왔다.

또한 발효공업에 이용되는 산업용 미생물에 셀룰레이스 유전자를 도입시키므로서 아미노산(amino acids), 생리활성물질등의 유용한 물질의 생산이 가능하며, 셀룰로우즈분해능이 강한 균주를 개발하여 농산 폐기물등 셀룰로우스가 다량 포함된 유기폐기물을 기질로 사용하여 단세포 단백질, 연료용 개스등을 효율적으로 생산할 수 있을 것으로 기대되고 있다.

셀룰레이스는 유용물질의 생산을 위한 산업적인 면 이외에도 작용체계(action model)의 특이성 때문에 학문적으로 매우 중요한 의미를 가지고 있다. 이제까지의 셀룰레이스에 대한 가설 중에서도 셀룰레이스는 3가지 서로 다른 성분으로 구성되어 있으며 이들의 상호보완효과(synergistic effect)에 의하여 셀룰로우스가 가수분해 된다는 C₁-C_x가설을 뒷받침하는 많은 연구결과가 보고되고 있다. 이들 3가지 복합효소 중 베타-1, 3-글루칸 글루카노하이드롤레이스(β-1, 4-glucan glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1., 씨엠씨에이스(CMCase), Cx, 엔도글루카네이스(endoglucanase)가 셀룰로우즈의 아모포러스 영역(amorphorous region)을 공격하여 비 환원 말단을 가진 저분자의 셀룰로우즈 사슬(cellulose chain)을 생성하고 그 말단에 베타-1, 4-글루칸 셀로비오하이드롤레이스(β-1, 4-glucan cellobiohydrolase)(EC 3.2.1.91., 아비셀레이스(Avicellase), C₁, tpffhqldhgkdlemfhffpdltm(cellobiohydrolase)가 작용하여 사슬말단으로부터 연속적으로 셀로비오스 단위(cellobiose residue)로 전환시키므로서 셀룰로우스를 셀로미오스와 짧은 사슬의 셀로올리고삭카라이드(short chain cellooligosaccharide)로 분리한다. 생성된 셀로비우즈와 짧은 사슬의 셀로올리고삭카라이드(short chain cellooligosaccharide)는 최종적으로 베타-1, 4-글루코시데이스(β-1, 4-glucosidase)(EC3.2.1.21, 셀로비에이스(cellobiase), 베타-글루코시데이스(β-glucosidase)에 의하여 포도당(glucose)으로 가수분해된다. 최근들어 파지(phage)와 플라스미드 벡터(plasmid vector)를 이용하여 셀룰로우스 구조유전자를 대장균(E. coli)에 클로닝(cloning)시키는 연구가 진행되어 왔다.

1981년, 마멘트로우트(Armentrout, R.W)등은 에스케리치아 아데카목시레이타(E. adecarboxylata)의 셀로비에이스 유전자를 같은 속인 대장균에 클로닝시켜 셀룰레이스 유전자가 동일 속간에 클로닝 될 수 있다는 가능성을 제시하였으며, 1982년, 휘틀(Whittle, D.J)등은 셀룰로모나스 휘미(Cellulomonas fimi)셀룰레이스 유전자를 플라스미드 pBR322에 연결시켜 대장균에 클로닝하는데 성공하였다.

1983년, 코넬(Cornet)등은 클로스트리디움 써머셀럼(Clostridium thermocellum)의 2종류의 엔도글루칸네이스(endoglucanse)유전자를 코스미드 벡터(cosmiod vector)인 pHC9를 사용하여 클로닝하였으며 1984년, 콜머(Collmer)등은 써머모노스포라(Thermomonospora)의 엔도글루카네이스 유전자를 플라스미드 pBR322에 연결시켜 클로닝하는데 성공하였다. 또한 1985년, 벱부(T. Beppu)등은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 엔도라이틱 셀룰레이스(endolytic cellulase)유전자를 바실러스 서브틸리스에 플라스미드 pBD64로 클로닝시켜 유전자를 분리한후 플라스미드 pBR322을 사용하여 서브클로닝 하였다.

1973년, 호리코시(Horicoshi, K.)등은 알칼리 내성이며 셀룰레이스 믹스츄어(celluase amisture)를 생산하는 바실러스 스페시스(Bacillus sp.)를 토양으로부터 분리하여 균주특허를 획득하였다. 호리코시(Horicoshi)등이 분리한 미생물은 적어도 4종류의 셀룰레이스를 생산하는 것으로 밝혀졌으며 이둘중 2.1, 2.8kb의 분자량을 갖는 2종류의 카복시메칠 셀룰레이스(carboxymethylcellulase)유전자를 플라스미드 pBR322에 클로닝시켜 대장균에서 발현시켰다.

2종류의 셀룰레이스 유전자는 다른 제한효소 위치를 가지고 있으며 하이브리다이제이션(hybridization)에 의한 실험결과 부분적인 유사성이 있으나 서로 다른 셀룰레이스 유전자를 코드하고 있는 것으로 추측하고 있다. 그러나 바실러스 스페시스 스트레인 N-4(Bacillus sp. strain N-4)가 코딩(coding)하는 나머지 적어도 2종류의 씨엠씨에이스(CMCase)유전자는 아직까지 밝혀지지 않고 있다. 따라서 본 발명은 에스케리치아 콜라이 K12(E. coli K12)와 플라스미드 DNA pBR322의 숙주벡터체계(host vector system)를 이용하여 다음과 같은 방법으로 씨엠씨에이스 유전자를 분리하였다. 대량의 플라스미드 DNA는 타나까(Tanake, T)등의 방법에 따라 박토트립톤(Bactotrypton)1%, 이스트 익스트랙트(Yeast Extract)0.5%와 소금(NaCl)1%를 포함하는 류리아 브로스(L-broth)에서 배양및 클로랍페니콜(Chloramphenoicol)로 플라스미드를 증폭시키고 클리어드 라이제이트(Cleared lysate)를 제조한후 세슘클로라이드-에티디움 브로마이드 구배 평형 초원심분리(Cesium Chloride-Ethidium Bromide Vradients Ultracentrifugation)하였다. 씨엠씨에이스를 코딩하고 있는 바실러스 스페시스 N-4(Bacillus sp. N-4)의 크로모조말 DNA(chromosomal DNA)는 사이또(Soito, H)등의 페놀(phenol)추출 방법으로 조제하였다. 제한효소 HindIII로 절단한 호알칼리성 바실러스 스페시스 N-4(alkalophilic Bacillus sp. N-4)의 크로모조발 DNA와 동일한 제한효소로 절단한후 세균 알칼리성 포스파테이스(bacterial alkaline phosphatase, BAP)로 탈인산화(dephosphorylation)시킨 pBR322플라스미드 DNA를 각각 3ug 과 1ug되게 섞고 T-4DNA 라이게이스(ligase)로 연결(ligation)시켰다. 연결된 DNA를 컴피던트 에스케리치아 콜라이 MB1000(competent E. coli MB1000)에 형질전환(transformation)시켜 앰피실린(ampicillin)이 첨가된 엘-브로스(L-broth)한천 평판 배지에 도말하여, 생육하는 콜로니(colony)12,500주를 분리하였다. 이들 콜로니들을 앰피실린(ampicillin)50ug/㎖과 테트라싸이클린(tetracycline)15ug/㎖이 각각 첨가된 엘-브로스(L-broth) 한천 평판 배지에 리플리카(replica)하여 앰피실린 내성이며 테트라싸이클린 감수성인 콜로니들을 총 5,400주를 선별하였다. 1차 선별과정에서 얻어진 콜로니들을 항생물질이 첨가된 엘-브로스와 셀룰레이스 선택배지(cellulase selective medium, CSM, Na₂HPO₄0.6%, KH₂PO₄0.3%, NaCl 0.05%, NH₄Cl 0.1%, Bacto-Yeast Extract 0.1%, Bacto-peptone 1%)한천 평판 배지에 리플리카(replice)하여 셀룰레이스 선택 평판 배지에서 크로로포름 증기(chloroform vapor)와 라이소자임(lysozyme)처리고 용균(lysis) 시킨후 콩고레드 염색 용액으로 염색하였다. 이와같은 방법으로 앰피실린 내성, 테트라싸이클린 감수성 콜로니에 대한 씨엠씨에이스 활성(CMCase activity)를 검색한 결과 1주가 노란색환(yellow halo)를 형성하였다. (제1(a)도)에스케리치아 콜라이 클론(E. coli clone)으로부터 씨엠씨에이스 유전자를 포함하고 있는 재조합 플라스미드를 분리하여 에스케리치아 콜라이 MB1000에 재형질 전환시키고 앰피실린과 씨엠씨가 첨가된 엘-브로스 한천 평판 배지에서 씨엠씨에이스 활성을 조사한 결과 제1(b)도에 나탄나 바와같이 100% 재현성을 나타내었으며 재조합 플라스미드 DNA가 매우 안정성이 높음을 알 수 있다.

계대 배양후 환(halo)이 크게 나타나는 코로니로부터 재조합 플라스미드를 분리하여 외래DNA를 전기영동으로 분석한 결과 약5.5킬로베이스(kb)의 유전자 단편이 삽입되었으며(제2도), 이 씨엠씨에이스 유전자를 함유하고 있는 크로모조말 DNA 단편을 가진 플라스미드 DNA를 pYBC107로 명명하였다. 본 발명의 재조합 플라스미드 pYBC107을 벡터 플라스미드 pBR322에서 단일 위치 제한효소인 EcoRI, BamHI, SalI, PvuII와 AvaI으로 단일 분해하여 아가로우스 겔 전기영동 하였을때 제3도에 나타난 바와같이 EcoRI, PstI, PvuII의 인식 부위가 삽입된 DNA 단편내에 존재함을 알 수 있다. 이들 제한효소 위치를 알기 위하여 이중 분해하고 아가로스 겔 전기영동을 행하고 (제4도) 벡터 부위의 기존 제한효소 위치를 기점으로 DNA 단편의 크기를 산출하여 제5도에 제한효소 지도를 나타내었다.

재조합 플라스미드 DNA pYBC107를 에스케리치아 콜라이 MB1000에 형질전환시킨 균주는 1986년 10월 14일 KFCC-10284호로 한국종균협회(서울.서대문구 신촌동 134번지)에 기탁되어 있다. 호리코시(Horikoshi.K)등은 바실러스 스페시스 N-4-(Bacillus sp. N-4)유래의 씨엠씨에이스 유전자를 지니고 있는 재조합 플라스미드 pNK1과 pNk2가 각각 2.0과 2.8킬로베이스의 DNA가 삽입되어 있는 것으로 보고하고 있으나 본 발명의 재조합 플라스미드 DNA pYBC107은 호리코시등이 보고한 와는 전혀 상이한 제한효소 지도를 보여주어 바실러스 스페시스 N-4(Bacillus sp. N-4)의 적어도 4가지의 셀룰레이스 유전자중 다른 하나의 유전자임을 알 수 있다.

본 발명의 재조합 플라스미드 pYBC107에 의한 에스케리치아 콜라이(E.coli)세포로부터 씨엠씨에이스 유전자 산물의 위치를 확인하기 위하여 헤펠(L.A.Happel)등의 방법으로 세포내(intracellular), 페리플라즈믹(periplasmic), 세포의 (extracellular)효소로 분획하여 활성을 분석한 결과를 표(1)에 나타내었다. 그러나 씨엠씨에이스 활성의 60%이상이 세포내 효소로 존재하는 것으로 나타나, 에스케리치아 콜라이 HB101(E. coliHB101)의 pNK1과 pNK2가 생산하는 씨엠씨에이스의 상당량이 페리플라즈믹 스페이스(periplasmic space)에 존재한다는 호리코시의 결과와는 다소의 차이가 있음을 알수 있다. 또한 에스케리치아 코라이 클론(E. coli clone)이 생산하는 효소의 활성과 안정성에 미치는 pH의 영향을 검토하였다. 본 발명의 재조합 플라스미드 DNA pYBC107을 포함하고 있는 에스케리치아 콜라이(E. coliI)로부터 효소생산을 위하여 에스케리치아 콜라이 MB1000(pYBC107)을 앰피실린이 첨가된 엘-브로스(L-broth)에서 하룻밤 배양한 배양액을 원심분리하여 얻은 균체를 쏘니케이션(sonocation)을 행한 후, 원심분리하여 세포 파편(celldebris)를 제거한 상징액을 효소용액으로 하여 pH를 변화시켜 씨엠씨로부터 유리되는 환원당을 다이니트로 살리실릭산(dinitrosalisylic acid, DNS)방법으로 측정하였다.

[표 1]

플라스미드 DNA를 포함하고 있는 에스케리치아 콜라이

MB1000에서 씨엠씨에이스의 활성분포

(1) 대장균주들은 37℃에서 24시간동안 10㎖엘-브로스에서 호기적으로 생육하였다.

(2) 씨엠씨에이스 활성은 pH8.0에서 생육배지 밀리리터당 밀리유니트로 나타내었다. 효소활성 1유니트는 기질용액 1㎖, 효소용액 0.4㎖와 1㎖ 완충용액을 섞어 37℃에서 10분간 반응시킨후 반응액 0.25㎖를 취하여 DNS용액 1㎖를 혼합하고 100℃에서 10분간 처리하여 발색시킨후 540nm서 흡광도를 측정할 때 1분당 0.1㎎의 환원당(말토오스)를 생성하는 효소의 양이다. 씨엠씨에이스의 공여균주인 바실러스 스페시스 N-4(Bacillus sp. N-4)는 하룻밤 배양한 종 배양액을 알칼리성 바실러스 배지(alkaline Bacillus medium, ABM)에서 37℃에서 48시간동안 진탕 배양하여 배양상징액을 효소용액으로 하여 활성을 측정하였다.

0.1M 싸이트레이트-포스페이트 완충용액(citrate-phosphate buffer, pH 4-8), 0.1M 포스페이트 완충용액(phosphate buffer pH 6-8), 0.1M 트리스 완충용액 (Tris vuffer, pH8-9)와 0.1M 글라이신-수산화 나트륨 완충용액(Glycine-NaOH buffer, pH 9-10)을 사용하여 기질용액의 pH를 조절하여, 재조합 균주와 공여균주가 생산하는 씨엠씨에이스의 활성을 측정한 결과는 제6도와 같다. 바실러스 스페시스 N-4(Bacillus sp. N-4)가 생산하는 씨엠씨에이스는 최적 pH가 6이었는데 이것은 정제 효소액의 최적 pH는 10이나 배양 상징액을 효소용액으로 하였을때 pH6이 최적으로 나타난 호리코시등의 보고와 일치하였다. 그러나 에스 케리치아 콜라이 MB1000(pYBC107)가 생산하는 씨엠씨에이스는 최저 pH가 8.0이었으며, 알칼리성 완충용액에서 90%이상의 높은 활성을 나타내었다.

효소의 안전성에 미치는 pH의 영향은 각 pH의 완충용액, 효소용액을 1:1의 비율로 가하여 60℃에서 10분동안 처리한후, 잔존 활성을 측정하였을때 제7도에 나타난 바와같이 바실러스 스페시스 N-4(Bacillus sp, N-4)와 에스케리치아 콜라이 MB1000(E. coli MB1000, pYBC107)이 생산하는 씨엠씨에이스는 각각 산성과 알칼리성에서 안정함을 나타냈으나 두 균주 모두 대체로 넓은 범위의 pH(5-10)에서 50% 이상의 pH 안정성을 유지하였다.

Claims

호알칼리성 바실러스 스페시스 N-4(Bacillus sp. N-4)의 씨엠씨에이스(CMCase)를 코딩(coding)하는 5.5킬로베이스(kb)의 유전자단편 또는 이를 부분절단한 유전자단편을 함유한 플라스미드(plasmid)를 이용하여 씨엠씨에이스(CMCase)를 제조하는 방법.