KR890003084B1

KR890003084B1 - 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)의 풀루라네이즈(Pullulanase)를 코딩(coding)하는 유전자

Info

Publication number: KR890003084B1
Application number: KR1019860009290A
Authority: KR
Inventors: 유주현; 공인수; 백운화; 이정기
Original assignee: 유주현
Priority date: 1986-11-04
Filing date: 1986-11-04
Publication date: 1989-08-21
Also published as: KR880006360A

Abstract

내용 없음.

Description

클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)의 풀루라네이즈(Pullulanase)를 코딩(coding)하는 유전자

제1도는 에탄올(ethanol)침전 방법으로 재조합 풀루라네이즈(Pullulanase)유전자를 포함하고 있는 에스케리치아콜라이 HB101(E. coli HB101)의 선별과 이로부터 분리한 재조합 플라스미드(plasmid)디엔에이(DNA)를 제형질절환(retransformation)시켜 선별을 한 사진 도해이다.

제2도는 클렙시엘라 뉴모니아NFB320(K. pneumoniae NFB320)의 풀루라네이즈 유전자를 가지고 있는 재조합 플라스미드의 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)사진 도해이다.

제3도는 플라스미드 디엔에이 pYKL451을 여러가지 제한효소(restriction enzyme)로 절단한 단편들의 아가로스 겔 전기영동 사진 도해이다.

제4도는 플라스미드 디엔에이(plasmid DNA) pYKL451을 여러가지 제한효소로 이중 절단한 단편들의 아가로스 겔(agarose gel)전기영동 사진 도해이다.

제5도는 제3도, 제4도의 디엔에이(DNA)단편의 전기영동 결과를 바탕으로 재조합 플라스미드 디엔에이(Plasmid DNA) pYKL451의 제한효소 지도를 나타내는 그림이다.

본 발명은 그람 음성(gram negative)균주에서 특이적으로 세포외로 분비되는 효소인 풀루라네이즈에 대한 유전적 정보를 분석하고 생산성향상, 숙주세포를 달리했을때의 유전자 조절 및 발현을 목적으로 토양으로부터 분리한 질소고정균인 클렙시엘라 뉴모니아 NFB320(K. pneumoniae NFB320)으로부터 풀루라네이즈를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 디엔에이(DNA)의 제조에 대한 것이다. (클렙시엘라 뉴모니아 NFB320 균주는 KFCC11426 으로 한국종균협회에 보관중이며 1985년도부터 분양 가능함)

아밀레이즈(amylase)에는 알파-(1→6)결합만을 분해하는 효소로 풀루라네이즈(EC 3.2.1.41. 풀루란(Pullulan)6-글루카노하이드로레이즈(6-glucanohydrolase), 알-엔자임(R-enzyme), 디브렌칭 엔자임(debranching enzyme)과 이소아밀레이즈(3.2.1.68, 글리코겐 6-글루카노하이드로레이즈(glycogen 6-glucanohydrolase), 디브렌칭 엔자임(debranching enzyme)등이 있다. 풀루라네이즈는 아밀로펙틴(amylopectin), 글리코겐(glycogen), 알파와 베타 아밀레이즈 리미트 덱스트린(α-and β-amylase limit dextrins)등과 알파-(1-6) 결합을 분해하여 말토덱스트린(maltodextrin)과 아밀로오스(amylose)와 같은 직쇄분자를 생성하는 효소이며 공팡이인 풀루라리아 풀루란스(Pullularia pullualns)에 의해 생산되는 세포의 알파글루칸(α-glucan)인 풀루란에 특이적으로 작용해서 최종적으로 말토트리오스(maltotriose)까지 분해시킨다.

이 효소는 1961년 그람 음성(gram negative)세균인 에어로박터 에어로제네스(Aerobacter aerogenes)에서 발견한 이래 에스케리치아 인터미디아(Escherichia intermedia), 스트렙토코커스미티스(Streptococcusmitis), 바실러스 써모필러스(Bacillus thermotphilus), 스트렙토마이세스 플라보제네스(Streptomyces flavogenes)등의 세균에서도 발견되어 많이 연구되어 왔다. 풀루라네이즈는 다당류의 구조를 밝히는데 사용되어지며, 전분공업에서 알파-아밀레이즈(α-amylase), 베타-아밀레이즈(β-amylase)혹은 글루코 아밀레이즈와 함께 작용시켜 전분을 디브렌칭(debranching)함으로서 말토오스(maltose), 아밀로오스(amylose), 글루코오스(glucose)와 같은 유용한 물질을 생산하고 풀루란에 작용시켜 순도높은 말토트리오스를 생산하므로서 공업적으로 매우 유용한 효소로 알려져 있다. 1985년 일본의 노보루(Noboru Takizawa)등과 프랑스의 에스 미카엘리스(S.Michaelis)등이 클렙시엘라 뉴모니아로부터 풀루라네이즈 유전자를 에스케리치아 콜라이(E.coil)에 전이시켜 발현시켰다. 또한 최근에는 글루코오스 시럽(glucose syrup)제조에 있어 종래의 글루코 아밀레이즈(glucoamylase)에 풀루라네이즈(Pullulanase)를 함께 적용시켰을 경우 글루코오스 생산량이 최대에 이르는 반응시간도 48시간으로서 단독으로 사용했을 때의 72시간보다 빠른 시간에 효율적으로 작용함이 보고되었다.

본 발명은 공업적으로 유용한 풀루라네이즈를 생산하기 위해 활성이 높은 풀루라네이즈 생산균을 토양에서 분리하여 동정을 하여 클렙시엘라 뉴모니아 NFB320이라 명명하고 에스케리치아 콜라이 K12(E. coli K12)와 플라스미드 디엔에이(Plasmid DNA) pBR322의 숙주-벡터체계(host-vector system)를 이용하여 다음과 같은 방법으로 풀루라네이즈 유전자를 분리하였는데 본 풀루라네이즈 유전자는 1985년 Noboru 등이 제조한 K.aerogenes W70유래의 Pullulanase 유전자를 지니고 있는 재조합 plasmid DNA 인 14.9Kb의 pPB174와는 전혀 상이한 제한효소 지도를 보여주었다. 대량의 플라스미드 DNA는 타나까(Tanaka, T)등의 방법에 따라 박토 트립톤(Bacto trypton)1%, 이스트 익스트렉트(Yeastextract)0.5%와 소금 (NaCl)0.5%를 포함하는 루리아 브로스(L-broth)에서 배양 및 클로람페니콜(Chloramphenicol)로 플라스미드를 증폭시키고 클리어드 라이제이트(cleared lysate)를 제조한후 세슘 클로라이드 에티디움 브로마이드 구배 평형 초원심분리(Cesium chloride-Ethidium Bromide Gradients Ultracentrifugation)하였다. 풀루라네이즈를 코딩하고 있는 클렙시엘라 뉴모니아 NFB320(Klebsiella pneumoniae NFB320)의 크로모조말 디엔에이(chromosomal DNA)는 사이또(Saito, H)등의 페놀(phenol) 수출방법으로 조제하였다.

제한효소 BamHI으로 부분 절단한 클렙시엘라 뉴모니아 NFB320(K. pneumoniae NFB320)의 크로모조말 디엔에이(chromosomal DNA)를 자당밀도구배 원심분리(sucrose density gradient centrifugation)를 이용하여 5kb 에서 20kb 사이의 DNA 단편만을 얻어내 pBR322 플라스미드 DNA를 동일한 제한효소 밤에이취원(BamHI)으로 절단한후 세균 알칼리성 포스파레이스(bacterial alkaline phosphatase, BAP)로 탈 인산화(dephosphorylation)시켜 각각 3ug과 1ug 되게 섞고 T4-DNA 리게이스(ligase)로 연결(ligation)시켰다. 연결된 DNA를 컴피턴트 에스케리치아 콜라이 HB101(competent E. coli HB101)에 형질전환시켜 앰피실린(ampicillin)이 첨가된 엘-브로스(L-broth)한천평판배지에 도말하여, 생육하는 콜로니(colony)11,000주를 분리하였다. 이들 콜로니들을 앰피실린(ampicillin)50ug/㎖ 과 테트라싸이클린(tetracycline) 15ug/㎖이 각각 첨가된 엘-브로스(L-broth)한천평판배지에 리플리카(replica)하여 앰피실린 내성이며 테트라싸이클린 감수성인 콜로니들을 총 5,300주를 선별하였다.

1차 선별과정에서 얻어진 콜로니들을 항생물질이 첨가된 엘-브로스와 풀루라네이즈 선택배지(Pullulanase selective mediun ; yeast extract 0.5%, tryptone 1%, NaCl .5%, maltose 0.5%, Pullulan 1%)한천평판배지에 리플리카(replica)하여 풀루라네이즈 선택평판배지에서 클로로포름 증기(chloroform vapor)와 라이소자임(lysozyme)처리로 용균(lysis)시킨후 에탄올(ethanol)로 처리하였다. 이와같은 방법으로 앰피실린 내성, 테트라싸이클린 감수성 콜로니에 대한 풀루라네이즈 활성(Pullulanase activity)을 검색한 결과 1주가 투명환(clear zone)을 형성하였다.

(제1(a)도)

에스케리치아 콜라이 클론(E. coli clone)으로부터 풀루라네이즈 유전자를 포함하고 있는 재조합 플라스미드를 분리하여 에스케리치아 콜라이 HB101에 재형질전환시키고 앰피실린과 풀루란이 첨가된 엘-브로스 한천평판배지에서 풀루라네이즈 활성을 조사한 결과 제1(b)도에 나타난 바와같이 100%의 재현성을 나타내었으며 재조합 플라스미드 디엔에이(plasmid DNA)가 매우 안정성이 높음을 알 수 있다. 계대배양후 투명환(clear zone)이 크게 나타나는 콜로니로부터 재조합 플라스미드를 분리하여 외래 DNA 를 전기영동으로 분석한 결과 약 10kb의 유전자 단편이 삽입되었으며(제2도), 이 풀루라네이즈 유전자를 함유하고 있는 크로모조말 디엔에이 단편(chromosomal DNA fragment)을 가진 풀라스미드 디엔에이를 pYKL451로 명명하였다. pYKL451이 함유된 E. coli HB101 숙주세포는 1986년 10월 14일 한국종균협회에 KFCC-10283호로 기탁되어 적법한 절차에 의하여 분양될 수 있다.

본 발명의 재조합 플라스미드 pYKL451을 벡터 플라스미드 pBR322에서 단일위치 제한효소인 BamHI, HindIII, EcoRI, PvuI, AvaI, PstI, SaII괄 PvuII으로 단일 절단하고 그밖에 XhoI과 SmaI으로 단일 절단하여 아가로스 겔 전기영동하였을때 제3도에 나타난 바와같이 제한효소 에코알원(EcoRI)을 제외하고 삽입된 디엔에이내에 나머지 사용한 제한효소의 인식 부위가 존재함을 알 수 있다. 이들 제한효소위치를 알기 위하여 이중절단하여 아가로스 겔 전기 영동을 행하고(제4도)벡터부위의 기존 제한효소위치를 기점으로 DNA 단편의 크기를 산출하여 제5도에 제한효소지도를 나타내었다. 풀루라네이즈 유전자를 함유하고 있는 재조합 플라스미드 디엔에이는 이제까지는 밝혀지지 않은 새로운 유전자이다.

Claims

토양으로부터 분리한 클렙시엘라 뉴모니아 NFB320(Klebsiella pneumoniae NFB320의 풀루라네이즈(pullulanase)를 코딩(coding)하는 10.0킬로베이스(kb)의 유전자단편 또는 이를 부분절단한 유전자단편을 함유한 플라스미드(plasmid)를 이용하여 풀루라네이즈(pulllanase)를 제조하는 방법.