Claims (70)
조절될 수 있는 촉진제가 이러한 촉진제로부터의 복사가 복제를 조절하는 방식으로 삽입되는 플라스미드.A plasmid in which modulators that can be regulated are inserted in such a way that radiation from such promoters controls replication.
조절될 수 있는 촉진제가 이러한 촉진제로부터의 복사가 복제를 조절하고 그래서 복사는 실제적으로 증가되거나 조절되지 않는 복사수를 나타내는 방식으로 삽입된 플라스미드.Plasmids that can be regulated are inserted in such a way that radiation from these promoters controls replication so that the radiation exhibits an increased or unregulated copy number.
촉진제가 촉진제의 범위내에서 특별한 DNA구조 때문에 본래 조절되는 것인 청구범위 1항 또는 2항에 따른 플라스미드.Plasmid according to claim 1 or 2, wherein the promoter is inherently regulated within the scope of the promoter due to the particular DNA structure.
촉진제가 조절팩터에 의해서 조절되는 것인 청구범위 1항 또는 2항에 따른 플라스미드.Plasmid according to claim 1 or 2, wherein the promoter is controlled by a control factor.
조절팩터가 적극적인 조절을 나타내는 것인 청구범위 4항에 따른 플라스미드.Plasmid according to claim 4, wherein the factor of control indicates active regulation.
조절팩터가 소극적인 조절을 나타내는 것인 청구범위 4항에 따른 플라스미드.Plasmid according to claim 4, wherein the control factor exhibits passive regulation.
실제적으로 증가되거나 조절되지 않는 플라스미드 복사수를 나타내는 조절할 수 있는 촉진제로부터 증가된 복사는 상기 촉진제의 억제해제 때문인 청구범위 2항에 따른 플라스미드.The plasmid according to claim 2, wherein the increased radiation from the controllable promoter exhibiting a substantially increased or unregulated plasmid copy number is due to the deactivation of the promoter.
촉진제가 화학적으로 조절될 수 있는 것인 앞의 청구범위의 어떠한 것에 따른 플라스미드.Plasmid according to any of the preceding claims, wherein the promoter can be chemically controlled.
촉진제가 lac촉진제, trp촉진제 또는 deo촉진제인 청구범위 8항에 따른 플라스미드.The plasmid according to claim 8, wherein the promoter is a lac promoter, trp promoter or deo promoter.
촉진제의 활동이 온도의 존형이거나 온도에 민감한 조절할 수 있는 팩터에 의해 조절되는 청구범위 1-7항의 어떠한 것에 따른 플라스미드.Plasmid according to any of claims 1-7, wherein the promoter's activity is controlled by temperature-dependent or temperature sensitive control factors.
촉진제가 λ촉진제이고 상기 촉진제로부터 복사를 조절하는 온도에 민감한 C1억제제에 대한 유전자가 존재하는 청구범위 10항에 따른 플라스미드.The plasmid according to claim 10, wherein the promoter is a λ promoter and a gene for a temperature sensitive C1 inhibitor that modulates radiation from the promoter is present.
λ촉진제가 λPR또인 λPL의 하나인 청구범위 11항에 따른 플라스미드.The plasmid according to claim 11, wherein the λ promoter is one of λP R or λP L.
λ촉진제가 λPR인 청구범위 12항에 다른 플라스미드.A plasmid according to claim 12, wherein the λ promoter is λP R.
언급한 조절할 수 있는 촉진제로부터 복사는 낮은 온도에서 플라스미드를 일정한, 낮은 복사수를 나타내게 하고 실제적적으로 높은 온도에서 증가되거나 조절되지 않는 복사수를 나타내게 하는 앞의 청구범위의 어떠한 것에 따른 플라스미드.Radiation from the aforementioned controllable promoters causes the plasmid to exhibit a constant, low copy number at low temperatures and to exhibit a copy number that is not substantially increased or controlled at high temperatures.
상기조절될 수 있는 촉진제로부터 복사는 약 30℃의 온도에서 플라스미드를 일정한, 낮은 복사수를 나타내게 하고 실제적으로 약 36-42℃ 범위의 온도에서 증가된 복사수를 나타내게 하는 청구범위 14항에 따른 플라스미드.Radiation from the controllable promoter results in a plasmid according to claim 14 which causes the plasmid to exhibit a constant, low copy number at a temperature of about 30 ° C. and substantially increased copy number at a temperature in the range of about 36-42 ° C. .
약 39℃의 이상의 온도에서 조절되지 않는 플라스미드 복사수를 나타내는 청구범위 15항에 따른 플라스미드.Plasmid according to claim 15, which shows an uncontrolled plasmid copy number at a temperature of at least about 39 ° C.
원재의 복재 조절하는 세균의 부분이 빠지고 조절될 수 있는 촉진제를 대치된 앞의 청구범위의 어떠한 것에 따른 플라스미드.Plasmid according to any of the preceding claims substituting a facilitating controllable portion of the bacterium that regulates the co-regulation of the raw material.
플라스미드를 포함한 숙주 미생물은 일정한, 낮은 플라스미드를 복사수를 안전하게 하는 조건하에서 자랄때 세포당 20-40, 좋기로 20-30, 특히 20-25의 범위에서 하나의 복사수를 가지고 숙주 미생물이 실제적으로 증가된 또는 조절되지 않는 플라스미드 복사수를 나타내는 다른 조건에서 자랄때 적어도 세포당 약500-1000 복사의 범위에서 하나의 복사수를 가지는 청구범위 17항에 따른 플라스미드.Host microorganisms, including plasmids, have a single copy number in the range of 20-40 per cell, preferably 20-30, especially 20-25, when a constant, low plasmid is grown under conditions that make copy number safe. Plasmid according to claim 17, wherein the plasmid has one copy number in the range of at least about 500-1000 copies per cell when grown in other conditions indicating increased or unregulated plasmid copy number.
약 30℃의 온도와 같은 한 온도에서 세포당 약 20-40 좋기로 20-30 과 특히 20-25 복사의 범위에서 하나의 플라스미드 복사를 가지고, 약 42℃의 온도와 같은 높은 온도에서 세포당 적어도 500-1000복사의 범위에서 하나의 조절되지 않는 플라스미드 복사수를 갖는 청구범위 18항에 따른 플라스미드.Have one plasmid copy in the range of 20-30 and in particular 20-25 radiation at one temperature, such as at a temperature of about 30 ° C., at least per cell at a high temperature such as about 42 ° C. Plasmid according to claim 18 having one uncontrolled plasmid copy number in the range of 500-1000 radiation.
copB세균이 빠지고 조절될 수 있는 촉진제로 대치된 R1형 플라스미드인 청구범위 17-19항의 어떠한 것에 따른 플라스미드.Plasmid according to any one of claims 17-19, which is a R1 plasmid replaced with a promoter which can be eliminated and controlled by copB bacteria.
플라스미드를 포함한 숙주미생물이 일정한, 낮은 플라스미드 복사수를 안전하게 하는 조건하에서 자랄때 세포당 3-5 복사의 범위에서 하나의 복사수를 가지고 숙주미생물이 실제적으로 증가된 도는 조절되지 않는 플라스미드 복사수를 나타내는 다른 조건에서 자랄때 세포당 적어도 500-1000 복사의 범위에서 하나의 복사를 가지는 플라스미드.When host microorganisms, including plasmids, grow under conditions that ensure a constant, low plasmid copy number, one host has a copy number in the range of 3-5 copies per cell, indicating that the host microorganism has an increased or unregulated plasmid copy number. A plasmid having one copy in the range of at least 500-1000 copies per cell when grown in different conditions.
약 30℃의 온도에서와 같은 한 온도에서 세포당 약 3-5 복사의 범위에서 하나의 플라스미드 복사수를 가지고 약 42℃의 온도에서 처럼 더 높은 온도에서 세포당 적어도 500-1000 복사의 범위에서 하나의 조절되지 않는 플라스미드 복사수를 가지는 청구범위 21항에 따른 플라스미드.Have one plasmid copy number in the range of about 3-5 radiation per cell at one temperature, such as at a temperature of about 30 ° C. and at least in the range of at least 500-1000 radiation per cell at a higher temperature as at about 42 ° C. Plasmid according to claim 21 having an uncontrolled plasmid copy number of.
조절할 수 있는 촉진제가 플라스미드의 본래 복제 조절유전자의 상부 흐름에 삽입된 청구범위 1-16항의 어떤것에 따른 플라스미드.A plasmid according to any of claims 1-16, wherein a controllable promoter is inserted in the upstream of the original replication regulator of the plasmid.
플라스미드를 포함한 숙주 미생물이 일정한 낮은 플라스미드 모사수를 확실하게 하는 조건하에서 자랄때 세포당 약 3-5 복사의 범위에서 하나의 복사수를 가지고 숙주 미생물이 실제적으로 증가된 또는 조절되지 않는 플라스미드 모사수를 나타내는 다른 조건하에서 자랄때 세포당 적어도 약 500-1000 복사수의 범위에서 하나의 복사수를 가지는 청구범위 23항에 따른 플라스미드.When the host microorganism, including the plasmid, grows under conditions that ensure a constant low plasmid copy number, the host microorganism has a single copy number in the range of about 3-5 copies per cell and the host microorganism does not actually increase or control the plasmid copy number. A plasmid according to claim 23 having one copy number in the range of at least about 500-1000 copies number per cell when grown under different conditions indicated.
약 30℃의 온도에서 처럼 한 온도에서 세포당 약 3-5 복사수의 범위에서는 나의 복사수를 가지고, 약 42℃와 같은 높은 온도에서 세포당 적어도 약 500-1000 복사의 범위에서 하나의 조절되지 않는 플라스미드 복사수를 가지는 청구범위 24항에 따른 플라스미드.I have my radiation in the range of about 3-5 radiations per cell at one temperature, like at a temperature of about 30 degrees Celsius, and at one temperature in the range of at least about 500-1000 radiations per cell at high temperatures like about 42 degrees Celsius. A plasmid according to claim 24 having a plasmid copy number.
조절될 수 있는 촉진제에서 R1-형 플라스미드가 copB와 copA 유전자의 상부흐름에 삽입된 청구범위 23-25항의 어떠한 것에 따른 플라스미드.Plasmid according to any of claims 23-25, wherein the R1-type plasmid in the modulator can be inserted in the upstream of the copB and copA genes.
플라스미드를 포함한 숙주미생물이 일정한, 낮은 플라스미드 복사수를 안전하게 하는 조건하에서 자랄때 세포당 약 0.5-1 복사의 범위에서 하나의 복사수를 가지고 숙주 미생물이 실제적으로 증가된 또는 조절되지 않는 플라스미드 복사수를 나타내는 다른 조건하에서 자랄때 세포당 적어도 500-1000 복사수의 범위에서 하나의 복사수를 가지는 플라스미드.When host microorganisms, including plasmids, grow under conditions that ensure a constant, low plasmid copy number, the host microorganism has a single copy number in the range of about 0.5-1 radiation per cell, and the host microorganism does not actually increase or control the plasmid copy number. A plasmid having one copy number in the range of at least 500-1000 copies per cell when grown under different conditions.
약 30℃의 온도에서 처럼 한 온도에서 세포당 0.5-1 복사의 범위에서 하나의 플라스미드 복사수를 가지고, 약 42℃의 온도에서 처럼 높은 온도에서 세포당 적어도 약 500-1000 복사의 범위에서 하나의 조절되지 않는 복사수를 가지는 청구범위 27항에 따른 플라스미드.One plasmid copy number in the range of 0.5-1 radiation per cell at one temperature as at a temperature of about 30 ° C., and one in the range of at least about 500-1000 radiation per cell at a high temperature as at a temperature of about 42 ° C. Plasmid according to claim 27 having an uncontrolled copy number.
하나의 본래 복제 조절하는 유전자의 부분이 삭제되고 거기에 본래 복제조절된 유전자가 자연적으로 위치하지 않는 지역에 삽입됨으로서 복제지역에 조절할 수 있는 촉진제를 운반하는 청구범위 1-16항의 어떠한 것에 따른 플라스미드.A plasmid according to any one of claims 1-16 which carries a promoter that can be regulated in a replication site by deleting a portion of one original replication regulatory gene and inserting it in a region where the original replication control gene is not naturally located.
플라스미드를 포함한 숙주 미생물이 일정한, 낮은 복사수를 안전하게 하는 조건하에서 자랄때 세포당 0.5-1 복사의 범위에서 하나의 복사수를 가지고 숙주 미생물이 실제적으로 증가된 또는 조절되지 않는 플라스미드 복사수를 나타내는 다른 조건하에서 세포당 적어도 약 500-1000 복사의 범위에서 하나의 복사수를 갖는 청구범위 29항에 따른 플라스미드.When host microorganisms, including plasmids, grow under conditions that ensure constant, low copy number safety, one host has a copy number in the range of 0.5-1 radiation per cell, and the host microorganisms exhibit a substantially increased or unregulated plasmid copy number. A plasmid according to claim 29 having one copy number in the range of at least about 500-1000 copies per cell under conditions.
약 30℃의 온도처럼 한 온도에서 세포당 약 0.5-1 복사의 범위에서 하나의 플라스미드 복사수를 가지고 약 42℃의 온도에서 처럼 다른 온도에서 세포당 적어도 500-1000 복사의 범위에서 하나의 조절되지 않는 플라스미드 복사수를 갖는 청구범위 30항에 따른 플라스미드.One plasmid copy number in the range of about 0.5-1 radiation per cell at one temperature, such as temperature of about 30 ° C., and one uncontrolled in the range of at least 500-1000 radiation per cell at another temperature, such as at a temperature of about 42 ° C. A plasmid according to claim 30 having a plasmid copy number.
copB에서 R1형 플라스미드가 플라스미드의 복제 지역외부에 있는 EcoR1면에 삽입된 청구범위 29-31항의 어떠한 것에 따른 플라스미드.Plasmid according to any of claims 29-31, wherein the R1-type plasmid in copB is inserted on the EcoR1 side outside the replication region of the plasmid.
처음에 복제지역으로부터 모사를 조절하는 조절할 수 있는 촉진제에 부가하고, 두번째 촉진제가 이것으로부터 조절된 구조적 유전자의 삽입을 허용하는 방식으로 삽입된 앞의 청구범위의 어떠한 것에 따른 플라스미드.The plasmid according to any of the preceding claims, wherein the second promoter is added in a manner that permits the insertion of a regulated structural gene therefrom, in addition to a controllable promoter that modulates the replica from the replication site.
상기 유전자의 표현을 조절하는 두번째 촉진제가 조절될 수 있는 청구범위 33항에 따른 플라스미드.A plasmid according to claim 33, wherein a second promoter which modulates the expression of said gene can be regulated.
구조적 유전자의 표현을 조절하는 상기 두번째 삽입된 촉진제가 PL촉진제인 청구범위 33항 또는 34항에 따른 플라스미드.The plasmid according to claim 33 or 34, wherein said second inserted promoter which regulates the expression of a structural gene is a P L promoter.
일정한 낮은 플라스미드 복사수를 가지고 30℃에서 유전자가 매우 적거나 없고 실제적으로 증가된 또는 조절되지 않는 플라스미드 복사수를 가지고 약 36-42℃의 범위의 온도에서 유전자가 나타나는 청구범위 33-35항의 어떠한 것에 따른 플라스미드.Any of claims 33-35, wherein the gene appears at a temperature in the range of about 36-42 ° C. with a constant low plasmid copy number and very little or no gene at 30 ° C. and a substantially increased or unregulated plasmid copy number. According to plasmid.
39℃이상의 온도에서 조절되지 않는 복사수와 매우 높은 유전자 표현을 갖는 청구범위 36항에 따른 플라스미드.Plasmid according to claim 36 having an unregulated copy number and very high gene expression at temperatures above 39 ° C.
식별에 유용하거나 또는 플라스미드를 포함한 세포의 선택에 유용한 마아크를 운반하는 앞의 청구범위 어떠한 것에 따른 플라스미드.Plasmid according to any of the preceding claims carrying a mark useful for identification or useful for the selection of cells comprising the plasmid.
마아크가 숙주 미생물에서 항생물질의 저항을 완화하는 유전자인 청구범위 38항에 따른 플라스미드.Plasmid according to claim 38, wherein the mark is a gene that mitigates antibiotic resistance in the host microorganism.
용해로 부터 다른 유전자의 삽입이 되는데 표현을 알아차릴 수 있는 유전자 용해를 하는 유전자를 운반하는 앞의 청구범위의 어떠한 것에 따른 플라스미드.Plasmids according to any of the preceding claims, which carry genes that are lysed with genes whose expression can be discerned from lysis.
미니플라스미드인 것을 특징으로 하는 앞의 청구범위의 어떠한 것에 따른 플라스미드.Plasmid according to any of the preceding claims, characterized in that it is a miniplasmid.
유전자가 플라스미드와 본래 관계 없는 유전자를 부가적으로 운반하는 앞의 청구범위의 어떠한 것에 따른 플라스미드.A plasmid according to any of the preceding claims, wherein the gene additionally carries a gene not originally associated with the plasmid.
청구범위 1-42항에 따른 플라스미드가 삽입된 미생물.The microorganism into which the plasmid according to claims 1-42 is inserted.
박티리아인 청구범위 43항에 따른 미생물.Bacteria according to claim 43.
그람 음성적이고 중온 유전자인 청구범위 44에 따른 미생물.The microorganism according to claim 44, which is a gram negative and mesophilic gene.
대장균인 청구범위 45에 따른 미생물.A microorganism according to claim 45 which is E. coli.
조절할 수 있는 촉진제를 상기 촉진제로부터의 전사가 복제를 조절하는 방식으로 플라스미드로 삽입하고 상기 촉진제로부터 전사가 중가될 때 실제적으로 증가된 또는 조절되지 않는 플라스미드 복사수를 나타내는 그러한 플라스미드를 스크린함으로서 취급된 플라스미드를 동일시하는 것을 포함한 청구범위 1-42항에 따른 플라스미드를 제조하는 방법.Plasmids treated by inserting a controllable promoter into the plasmid in such a way that transcription from the promoter controls replication and screening such plasmids that exhibit substantially increased or unregulated plasmid copy number when transcription from the promoter is weighted A method for preparing a plasmid according to claims 1-42, including identifying.
하나의 본래 복제조절하는 유전자의 부분을 삭제하고 부분으로 삭제된 본래 복제 조절하는 유전자의 부위에 조절할 수 있는 촉진제를 포함한 DNA조각을 삽입하는 것을 포함한 청구범위 47항에 따른 방법.A method according to claim 47 comprising deleting a portion of a gene that controls one original replication and inserting a fragment of DNA comprising a modulator that is modifiable in a portion of the original replication regulatory gene that is deleted as a portion.
제한 앙도뉴클리아제 Bg111를 분열함으로써 플라스미드로 부터 copB 유전자를 삭제하고 이 부위에 조절된 촉진제를 포함한 Bg111 조각을 삽입하는 것을 포함한 청구범위 48항에 따른 방법.The method according to claim 48, comprising deleting the copB gene from the plasmid by cleaving the restriction endonuclease Bg111 and inserting a Bg111 fragment containing a regulated promoter at this site.
조절할 수 있는 촉진제를 본래 복제 조절 유전자의 플라스미드 상부 흐름으로 삽입하는 것을 포함한 청구범위 47항에 따른 방법.A method according to claim 47 which comprises inserting a modulatory promoter into the plasmid upstream of the original replication regulatory gene.
조절할 수 있는 촉진제가 copB와 copA 유전자의 Bg111부위 상부 흐름에 삽입되는 것을 포함한 청구범위 50항에 따른 방법.The method according to claim 50, wherein the controllable promoter is inserted into the Bg111 region upstream of the copB and copA genes.
출발물질로서 본래 복제 조절하는 유전자가 부분적으로 삭제된 플라스미드를 사용함으로 모든 본래 복제 조절 유전자가 존재하는 플라스미드를 제조하기 위하여 그 원래의 부위에 본래 복제 조절하는 유전자를 재삽입하는 것을 포함한 청구범위 47항에 따른 방법.Claim 47, which includes reinserting the original replication control gene at its original site to produce a plasmid in which all original replication control genes are present by using a plasmid in which the original replication control gene is partially deleted as a starting material. According to the method.
출발물질로서 copB 유전자가 부분적으로 삭제된 플라스미드를 사용함으로 copB와 copA 유전자가 모두 존재하는 플라스미드를 제조하기 위하여 Bg111 부위에 copB 유전자를 재 삽입하는 것을 포함한 청구범위 52항에 따른 방법.A method according to claim 52 comprising reinserting the copB gene at the Bg111 site to produce a plasmid in which both the copB and copA genes are present by using a plasmid with a partial deletion of the copB gene as a starting material.
출발물질로서 본래 복제 조절하는 유권자가 부분적으로 삭제된 플라스미드를 사용함으로 플라스미드가 자연적으로 위치하지 않는 범위에서 하나의 본래 복제 조절하는 유전자를 삽입하는 것을 포함한 청구범위 47항에 따른 방법.A method according to claim 47 comprising inserting one original replication controlling gene in a range where the plasmid is not naturally located by using a plasmid in which the original replication regulating voter is partially deleted as a starting material.
출발물질로서 copB 유권자가 부분적으로 삭제된 플라스미드를 사용함으로 플라스미드의 복제구역 외부에 EcoR1 부위에 copB 유권자가 삽입하는 것을 포함한 청구범위 54항에 따른방법.The method according to claim 54, comprising inserting a copB voter at the EcoR1 site outside the replication zone of the plasmid by using a plasmid in which the copB voter is partially deleted as a starting material.
조절할 수 있는 촉진제의 삽입에 부가하여, 상기 두번째 촉진제로 부터 조절할 수 있는 구조적 유권자의 삽입을 허락하는 적당한 제한 부위에서 상기 두번째 촉진제가 삽입되는 것을 포함한 청구범위 33항에 따른 플라스미드를 제조하는 방법.A method of making a plasmid according to claim 33, wherein the second promoter is inserted at an appropriate restriction site that allows insertion of a controllable structural voter from the second promoter, in addition to the insertion of a controllable promoter.
상기 조절할 수 있는 촉진제로부터의 증가된 전사가 실제적으로 증가된 또는 조절되지 않는 플라스미드 복사수를 안전하게 하고 미생물 배양으로 부터 플라스미드의 유권자 생성을 하게 하는 조건하에서 적어도 한 세대의 배양을 포함한 청구범위 1-42 항에 따른 플라스미드를 운반하는 미생물을 배양하는 것을 포함한 플라스미드 DNA 의 유권자 생성을 생성하는 방법.Claims 1-42 including at least one generation of cultivation under conditions such that increased transcription from the modulators promotes safe and substantially increased or unregulated plasmid copy number and enables voter generation of plasmids from microbial cultures. A method for producing voter generation of plasmid DNA comprising culturing a microorganism carrying a plasmid according to claim.
세포의 바라는 수가 얻어지고 실제적으로 증가된 또는 조절되지 않는 플라스미드 복사수를 나타내는 조건하에서 숙주 미생물을 배양할 때까지 증식단계와 배양할 동안 일정한, 낮은 플라스미드 복사수를 초래하는 조건하에서 청구범위 1-42항에 따른 플라스미드가 변형되는 숙주 미생물을 배양하는 것을 포함한 청구범위 57항에 따른 방법.Claims 1-42 under conditions which result in a constant, low plasmid copy number during the growth stage and incubation until the host microorganism is cultivated under conditions in which the desired number of cells is obtained and exhibits substantially increased or unregulated plasmid copy number. A method according to claim 57 comprising culturing a host microorganism wherein the plasmid according to claim is modified.
촉진제로부터 어떠한 전사가 플라스미드의 복사수에 중요하게 영향을 미치지 않는 조건하에서 한세대의 배양후에 촉진제 활동성을 유도하는 물질이 실제적으로 증가된 또는 조절되지 않는 플라스미드 복사수를 나타내는 양으로 배양매체에 첨가되는 청구범위 57항 또는 58항에 따른 방법.Claims that a substance that induces promoter activity after a generation of culture under conditions where no transcription from the promoter has a significant effect on the copy number of the plasmid is added to the culture medium in an amount that represents a substantially increased or unregulated plasmid copy number. Method according to the scope 57 or 58.
플라스미드의 실제적인 확충을 얻기 위하여 충분한 한 세대의 시간동안 실제적적으로 증가된 또는 조절되지 않는 플라스미드 복사수를 나타내는 조건을 유지한 후에 미생물 배양의 실제적인 손상을 피하기 위하여 충분히 짧은 시간으로 유지하고, 촉진제 활동성을 유도하는 물질은 플라스미드 복사수에서 늦은 감소가 전 유도단계로 나타나는 배양 매체로 부터 제거된 청구범위 58항에 따른 방법.Maintain a condition that exhibits substantially increased or unregulated plasmid copy number for a generation of time sufficient to obtain substantial expansion of the plasmid, and then keep it short enough to avoid actual damage to the microbial culture. The method according to claim 58, wherein the substance inducing activity is removed from the culture medium in which a late decrease in plasmid copy number occurs in the previous induction stage.
실제적으로 촉진제 활동성을 금지하는 물질의 존재하에 한세대가 배양한 후, 물질의 농도가 촉진제의 활동성을 나타내거나 실제적으로 증가된 또는 조절되지 않는 플라스미드 복사수를 나타내는 정도로 감소된 청구범위 57항 또는 58항에 따른 방법.Claims 57 or 58 after a generation has been incubated in the presence of a substance that substantially inhibits promoter activity, so that the concentration of the substance has been reduced to a degree that indicates the activity of the promoter or indicates an increased or unregulated plasmid copy number. According to the method.
플라스미드의 실제적인 확충을 얻기 위하여 충분한 한 세대동안 실제적으로 증가된 또는 조졸되지 않는 복사수를 나타내는 조건을 유지한 후에 미생물 배양의 실제적 손상을 피하기 위하여 충분히 짧은 시간으로 유지하고 촉진제 활동성을 금지하는 물질은 플라스미드복사수에서 늦은 감소가 전 유도단계로 나타나는 양으로 첨가된 청구범위 61항에 따른 방법.Substances that maintain a short enough time to avoid actual damage to the microbial culture and to inhibit promoter activity after maintaining conditions that exhibit substantially increased or unsolvated radiant number for a generation sufficient to obtain substantial expansion of the plasmid The method according to claim 61, wherein the late reduction in plasmid copy number is added in such an amount that the previous induction stage occurs.
플라스미드 복사수가 실제적으로 증가되거나 조절되지 않는 온도가까이에서나 근처에서 숙주 미생물이 적어도 한새대의 배양을 포함한 조건인 청구범위 57항 또는 58항에 따른 방법.The method according to claim 57 or 58, wherein the host microorganism comprises conditions of at least a single cultivation near or near a temperature at which the plasmid copy number is not substantially increased or controlled.
플라스미드 복사수가 생존하고 플라스미드의 유전자 생생성이 증가된 양과 동시에 숙주 미생물의 계속적인 성장을 하도록 실제적으로 증가되거나 조절되지 않는 온도 근처에서 생산스케일 배양이 연속적으로 행하여지고 유전자 생성이 연속적으로나 간헐적으로 배양되는 청구범위 63항에 따른 방법.Production scale cultivation is carried out continuously and the gene production is continuously or intermittently cultured at temperatures near which the plasmid copy number survives and the amount of gene production of the plasmid is increased and at the same time not substantially increased or controlled to allow for continuous growth of the host microorganism. Method according to claim 63.
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생산 사이즈에 도달하도록 미생물 배양이 전파된 후에 온도는 플라스미드 복사수가 실제적으로 증가되거나 조절되지 않는 온도나 그 온도 가까이로 바뀌며, 이 온도는 플라스미드의 실질적 확충을 얻기 위하여 충분히 한세대 동안 유지되고, 미생물 배양의 실질적 손상을 피하기 위하여 충분히 짧은 시간으로 유지되고, 일단 온도가 낮은 일정한 플라스미드 복사수를 안전하게 하는 온도로 변한 후에는 최초의 수준에 도달할때까지 플라스미드의 모사수에서 느린 감소를 나타내는 청구범위 63항에 따른 방법.After propagation of the microbial culture to reach the production size, the temperature is changed to or near the temperature at which the plasmid copy number is not actually increased or controlled, and this temperature is maintained for a generation enough to obtain substantial expansion of the plasmid, Claim 63, which is kept short enough to avoid substantial damage and which shows a slow decrease in the simulated number of plasmids until the initial level is reached once it has been changed to a temperature which makes constant plasmid copy water safe at low temperatures According to the method.
플라스미드가 일정한 낮은 복사수를 가지는 온도에서 보다 플라스미드 복사수가 실제적으로 증가된 또는 조절되지 않는 온도가 더 높은 청구범위 63-66항의 어떠한 것에 따른 방법.The method according to any one of claims 63-66, wherein the plasmid radiation number is substantially increased or uncontrolled at a temperature higher than the temperature at which the plasmid has a constant low radiation number.
일정한,낮은 복사수를 갖는 플라스미드의 온도가 약 30℃의 온도이고, 실제적으로 증가된 또는 조절되지 않는 복사수를 갖는 플라스미드의 온도가 약 36-42℃의 범위인 온도인 청구범위 67항에 따른 방법.According to claim 67, wherein the temperature of the plasmid with a constant, low radiation number is a temperature of about 30 ° C., and the temperature of the plasmid with substantially increased or uncontrolled radiation number is a temperature in the range of about 36-42 ° C. Way.
플라스미드를 포함한 세포의 식별 및/또는 선택에 유용한 마아크를 운반하는 DNA 조각을 삽입하는 것을 포함하는 청구범위 1-42항의 어떠한 것에 따른 플라스미드를 제조하는 방법.A method of making a plasmid according to any one of claims 1-42, comprising inserting a DNA fragment carrying a mark useful for identification and / or selection of cells comprising a plasmid.
마아크가 숙주 미생물에 대하여 항생물질 저항을 완화하는 세균인 청구범위 69항에 따른 방법.The method according to claim 69, wherein the mark is a bacterium that mitigates antibiotic resistance against the host microorganism.
※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.※ Note: The disclosure is based on the initial application.