KR820001148B1 - 간염 b핵 항원의 제조방법 - Google Patents

간염 b핵 항원의 제조방법

Info

Publication number
KR820001148B1
KR820001148B1 KR7801341A KR780001341A KR820001148B1 KR 820001148 B1 KR820001148 B1 KR 820001148B1 KR 7801341 A KR7801341 A KR 7801341A KR 780001341 A KR780001341 A KR 780001341A KR 820001148 B1 KR820001148 B1 KR 820001148B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
polyoxyethylene
rotor
dane particles
dane
hepatitis
Prior art date
Application number
KR7801341A
Other languages
English (en)
Inventor
조셉 맥알리어 윌리암
존 밀러 윌리암
헨리 워스무스 에드워드
Original Assignee
제임스 에프 · 너우톤
맬크 앤드 캄파니, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 제임스 에프 · 너우톤, 맬크 앤드 캄파니, 인코포레이티드 filed Critical 제임스 에프 · 너우톤
Priority to KR7801341A priority Critical patent/KR820001148B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR820001148B1 publication Critical patent/KR820001148B1/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

내용 없음.

Description

간염 B핵 항원의 제조방법
본 발명은 간염 B핵 항원(hepatitis B core antigen)의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 정제 간염 B핵 항원(HBcAg)의 출발물질은 HBsAg에 양성인 공여체(donor)로부터 얻어진 혈장(plasma)이며, 이 혈장은 예컨대 혈장 반출법(plasma phoresis)과 같은 통상 방법으로 얻어진다.
HBsAg의 농도는 예컨데 가역수동 혈구 응집반응 또는 보체결합과 같은 어떤 적당한 방법에 의하여 공지방법으로 측정할 수 있다. 필요한 경우, 혈장을 냉각시켜 형성되는 한냉침전물을 가벼운 원심분리를 하여 제거시킨다. 얻어진 혈장내의 데인입자는 동밀도 결합에 의하여 유리시킨다.
데인 입자(Dane particle)가 풍부한 유분을 처리하여 바람직하기로는 펠렛팅(pelleting)하여 데인 핵 항체를 제거한 다음 처리하여 표면항원을 제거하고 핵항원을 유리시킨다. 표면항원의 제거는 데인 입자를 예컨데 메르캅토에탄올, 디티오트레이톨, 디티오에리트리톨 및 디티오옥타논산 같은 메르캅탄(mercaptan)환원제의 존재하에 분자내에 약 15-35, 바람직하기로는 약 18-33옥시에틸렌 단위를 가진 비이온 계면활성제와 접촉시켜 수행한다. 적당한 비이온계면 활성제는 옥시에틸화알킬페놀, 폴리옥시에틸렌 소르비탄지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌산, 폴리옥시에틸렌 알코올, 폴리옥시에틸렌 오일 및 폴리옥시에틸렌 옥시프로필렌 지방산이다. 몇 가지 특정예를 들면 다음과 같다.
알킬펜옥시폴리에톡시 (30) 에탄올
폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트
폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노팔미테이트
폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노스테아레이트
폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 트리스테아레이트
폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트
폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 트리올레에이트
폴리옥시에틸렌 (20) 팔미테이트
폴리옥시에틸렌 (20) 라우릴 에테르
폴리옥시에틸렌 (20) 세틸 에테르
폴리옥시에틸렌 (20) 스테아릴 에테르
폴리옥시에틸렌 (20) 올에일 에테르
폴리옥시에틸렌 (20) 하이드로겐화 피마자유
폴리옥시에틸렌 (20) 옥시프로필렌 모노스테아레이트.
동밀도 결합에서, 부분정제 농축물을 특정항원이 유리되는 농도를 포함하고 있는 농도구배를 가진 액체 매질과 접촉시킨 다음 액체매질을 초원심 분리시켜 그들 각각의 농도에 따른 농도 구매를 통하여 혈청성분의 평형분배를 얻었다. 매질의 연속유분을 제거한 다음 소기의 항원을 함유하는 유분, 즉 약 1.26-1.30g/cc의 농도를 가진 유분을 분리시킨다. 구배를 형성하는 용액의 농도는 약 1.0-1.41g/cc의 농도범위가 되도록 선택한다. 액체매질은 선형구배 또는 계단식 구배의 형태로 이용될 수 있는데, 분류에 대한 그의 본래의 높은 수용력으로 인하여 계단식 구배의 형태로 이용하는 것이 바람직하다.
동밀도 결합단계에 사용된 액체매질은 예컨데 서당, 포타슘 브로마이드, 세슘클로라이드, 포타슘타트레이트 또는 소디움 브로마이드 같은 적당한 범위에 있는 어떠한 농도구배일 수 있는데, 소디움 브로마이드가 바람직하다.
본 발명을 실시예에 의거 상세히 설명하면 다음과 같다.
[실시예 1]
A. 데인입자(Dane particle) (HBV)의 제조.
원심분리기 전자원자핵공학 K의 회전자에 8,400ml의 인산염 완충액을 채웠다. 회전자를 10,000rpm 속도로 가동시켜 시스템으로부터 가스를 제거한 후 다음과 같은 단계의 구배로 정지된 회전자 저부로 퍼부었다.
1. 2,400ml의 10% NaBr, ρ=1.08 3. 1,500ml의 30% NaBr, ρ=1.28
2. 1,000ml의 20% NaBr, ρ=1.17 4. 3,500ml의 40% NaBr, ρ=1.41
HBsAg 1,750ml을 함유하는 혈장을 회전자의 저부로부터 1,750ml의 40% NaBr을 제거하면서 정지 회전자의 상부로 퍼올렸다. 회전자를 30,000rpm까지 가속화시키고 이 속도에서 4시간 동안 가동한 다음 회전자를 멈추고 1,750ml의 40% NaBr을 혈장을 상부로 압상시키면서 회전자 저부로 퍼올렸다. 추가적으로 HBsAg를 함유하는 1,750ml의 신선한 혈장을 동량의 40% NaBr 회전자 저부로 제거하면서 회전자의 상부로 퍼올렸다. 회전자를 18시간 동안 30,000rpm속도로 가동시킨 다음 회전자를 중단시킨 후 1.26-1.30 농도범위인 데인 입자가 풍부한 물질 1,000ml을 수집하였다.
데인 입자(HBV)를 다음과 같은 공정으로 NaBr대역의 유분으로부터 분리하였다. 그 대역의 유분(1,000ml)을 인산염 완충염수를 사용하여 3,000ml까지 희석시킨 다음 이 물질을 20개의 형 19(type 19)회전자 플라스틱병(각각 250ml/병)에 넣었다. 그 다음 이 물질을 형 19 회전자(베크만)를 사용하여 원심분리하였다. 회전자를 24시간 동안 17,000 rpm(45,000×g) 속도로 회전시켜 데인 입자를 펠렛(pellet)으로 하였다. 회전자를 중단시킨 다음 각각의 병으로부터 상층액을 따라냈다. 12개의 병 전부로부터 총량이 5-7ml인 트리스-염수 완충액에서 회수하여 -70℃에서 저장하였다. 이 물질이 데인 입자 농축물이다.
B. 데인 입자의 정제
A로부터의 농축 데인입자 1ml를 1/2×2" 셀루로스 질산염관이 장착된 SW 65 회전자에서 트리스 완충액(pH 7.6)중의 20% 서당 4ml-소혈청 알부민(BSA) 1%상에 놓았다. 입자를 4시간동안 35,000rpm으로 원심분리한 다음 상층액을 따라내고 펠렛을 솜이 달린 면봉(완충액으로 미리 축였음)을 사용하여 1%의 BSA와 0.5ml의 트리스 완충액에서 다시 현탁시켰다. 면봉을 0.5ml의 완충액으로 씻어내었다. 데인입자 물질의 최종량은 1ml이었으며 이 데인입자를 -70℃에서 저장하였다.
C. HBsAg(핵 항원)의 제조
B로부터의 물질 1ml를 탈이온수에 용해시킨 2-메르캅토 에탄올의 1%(v/v)용액 1ml, 및 탈이온수에 용해시킨 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올레이트의 1%(v/v)용액 1ml에 가하였다. 얻어진 혼합물을 서서히 교반한 다음 수욕(37℃)에 놓았다. 1시간후 혼합물을 ml당 32IAHA 단위를 함유할 때까지 미리 계산한 양의 희석제를 사용하여 TMN-1% BSA(0.08M 트리스, 0.08M MaCl2및 0.14M NaCl, 및 1% BSA를 함유하는 용액)로 희석시켰다. 용액을 플라스틱제 2 ml 스크루-캠 혈정관(0.5ml/관)에 분배한 다음 액체 질소 냉동기에서 저장하였다.
[실시예 2]
12개의 6ml짜리 유리바이알(Vial)의 각각에 실시예 1에서 기술한 바와 같이 제조한 정제 데인입자 1ml, 탈이온수에 용해시킨 2-메르캅토 에탄올의 1%(v/v)용 1ml, 및 탈이온수에 용해시킨 하기한 물질들의 1% (v/v) 용액 1ml를 가하였다. 혼합물을 서서히 가한 다음 37℃ 수욕에 놓았다. 1시간 후 얻어진 혼합물을 면역고착 혈구응집반응에 의하여 HBsAg에 대한 분석을 하였다.
Figure kpo00001
상술한 결과는 9 또는 40옥시에틸렌 단위를 함유하는 비이온 계면활성제가 20-30옥시에틸렌 단위를 함유하는 비이온계면활성제보다 상당히 열등하며, 한편 어떠한 옥시 에틸렌 단위도 없는 비이온 계면활성제는 거의 전부 비효과적임을 보여주고 있다.
[실시예 3]
실시예 2에서 사용한 동일한 것으로부터 정제한 데인입자의 제1의 1ml시료에 폴리옥시 에틸렌(20) 소르비탄 모노올레이트 1ml 및 2-메르캅토에탄올 1ml를 가하였다. 2-메르캅토 에탄올 대신 탈이온수 1ml를 사용한 것 이외에 제2의 1ml시료를 유사하게 처리하였다. 각 시료를 혼합하여 37℃에서 1시간 동안 배양한 다음 면역 고착 혈구응집반응 분석에 의하여 HBsAg대한 분석을 하였다. 2-메르캅토 에탄올을 사용하지 않는 제2시료는 제1시료에서의 HBsAg양의 절반을 함유하고 있었다.
[실시예 4]
실시예 2에서 제조한 HBsAg를 다음과 같이 명반(alum)에 흡착시켰다. 16-32 lA 단위/ml를 함유하는 HBsAg(형 Ad) 10ml를 10% 명반용액 KAl(SO4)2·12H2O의 0.85ml와 혼합시켰다. 교반하면서 0.1N NaOH를 서서히 가하여 pH를 6.8로 조절하였다. 상온에서 1시간 동안 혼합을 계속하였다. 용액을 10분 동안 1,500×g에서 원심분리한 다음 상층액을 따라 버린 후 펠렛을 원래의 양(10ml)까지 염수용액으로 재현탁시킨 다음 용액을 항원으로서 사용하기 전에 5-10분 동안 혼합하였다.
[실시예 5]
10ml HBsAg(형 Ay)을 사용한 것 이외에 실시예 4의 공정을 사용하였다.
[실시예 6]
실시예 4 및 5에서 제조한 명반항원을 사용하여 고역가의 HBcAb 혈청을 제조하였다. 기니피그(guineapig)를 두 그룹으로 분할하여 HBcAb 혈청을 제조하는데 사용하였다. 제1그룹은 실시예 4의 생성물을 매달 0.5ml씩 3회 근육주사로 투여하였다. 제2그룹은 실시예 5의 생성물로 유사하게 처리하였다. 고역가의 간염 B항체혈청이 매 그룹에서 제조되었다.
[실시예 7]
효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)
실시예 1에서 얻은 HBcAg을 2.5시간 동안 200,000×g에서 20-60% 서당구배에서 원심분리하여 정제한 다음 HBcAg을 분석하여 단백질 함량을 측정하였다.
HBcAg를 ELISA 분석에 사용하기 위하여 0.1M 탄산염 완충액(pH 9.7)으로 1μg/ml까지 희석시켰다.
분석에 사용된 고체상은 96웰(Well), 쿠키 마이크로타이터(Cooke microtiter), u-버텀(bottom), 폴리스티렌 플레이트(plate)이다.
효소-결합물은 알카리성 포스페이타제 결합 염소 항-인간 면역 글로블린(엥발 등)(1)이다. 사용농도는 적정하여 측정하였다.
효소기질은 0.001M MgCl2를 함유하는 0.1M 탄산염 완충액(pH 9.8)중의 0.01% p-니트로페닐 포스페이트이다.
분석방법은 이·낫소 등(E. Nassau et al)(2)에 의하여 기술되어 있다. 이 방법은 혈장 및 혈청시료에서 HBcAb를 검지하는데 사용된다.
(1) 저널 오브 이뮤노러지(The Journal of Immunology 109, 129(1972)).
(2) 튜버클(Tubercle) 57, 67-70(1976).
[실시예 8]
실시예 1의 최종 생성물을 72시간 동안 1 : 4000 포르마린으로 무균상태하에서 처리하고, 과잉의 포르마린 소디움 비 설페이트 중성화 시킨 다음 핵항원을 실시예 4의 공정에 따라 명반상에서 흡착시켰다.
HBcAb에 대해 양성이며 32 IAHA 단위/ml 또는 그보다 큰 HBcAb 항체 역가(면역고착혈구응집반응분석, IAHA에 의하여 측정한 것임)를 가진 각각을 근육주사로 1ml(40μg)량의 왁진(vaccinc)을 투여하였다.
그 다음 1개월 및 3개월에 추가적으로 주사하였다. 세번째 주사를 실시한 일주일 후 각각을 혈장반출시키고 HBcAb역가를 면역고착 혈구응집반응분석을 사용하여 각각의 혈장에 대해 실시하였다. 각각의 대부분은 그들 초기역가에 비하여 그들의 HBcAb역가가 증가하였다. 2000 또는 그 이상의 항체역가를 가진 이들 현장을 처리하여 높은 HBcAb역가를 가진 감마(gamma)글로블린을 얻었다.
[실시예 9]
실시예 1의 B로부터의 물질 1ml을 탈이온수에 용해시킨 용액(v/v) 1ml, 및 탈이온수에 용해시킨 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올레이트의 1%(v/v) 용액 1ml에 가였다. 얻어진 혼합물을 서서히 교반한 다음 37℃ 수옥에 놓았다. 1시간 후 혼합물을 32IAHA/ml함유할 때까지 미리 계산한 양의 희석제를 사용하여 SPAG로 희석시켰다. 용액을 플라스틱제 2ml 스크루-캡 혈청관(0.5ml/관)에 분배한 다음 액체질소 냉동기에서 저장하였다.

Claims (1)

  1. 데인 입자(Dane particles)를 메르캅탄 환원제의 존재하에서 약 15-35 옥시에틸렌 단위를 가진 비이온성 계면활성제로 처리함을 특징으로 하는 간염 B핵항원(hepatitis B core antigen)의 제조방법.
KR7801341A 1978-05-03 1978-05-03 간염 b핵 항원의 제조방법 KR820001148B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR7801341A KR820001148B1 (ko) 1978-05-03 1978-05-03 간염 b핵 항원의 제조방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR7801341A KR820001148B1 (ko) 1978-05-03 1978-05-03 간염 b핵 항원의 제조방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR820001148B1 true KR820001148B1 (ko) 1982-06-28

Family

ID=19207592

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR7801341A KR820001148B1 (ko) 1978-05-03 1978-05-03 간염 b핵 항원의 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR820001148B1 (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPS6141897B2 (ko)
Müller-Eberhard et al. Two types of γ-globulin differing in carbohydrate content
AU575362B2 (en) Method of detecting immiune complexes in serium
Middleton JR Immunochemical relationship of human plasma beta-lipoprotein and chylomicrons
Mehta et al. Quantitation of measles virus-specific immunoglobulins in serum, CSF, and brain extract from patients with subacute sclerosing panencephalitis
Larsson et al. Cytotoxicity of human lymphocytes induced by rabbit antibodies to chicken erythrocytes: inhibition by normal IgG and by human myeloma proteins of different IgG subclasses
Laurell et al. Electrophoretic studies of the conversion products of serum β1C-globulin
Scanu et al. Studies on the antigenicity of β-and α1-lipoproteins of human serum
CN109384832A (zh) 重组型疫苗宿主蛋白抗体的制备方法及其应用
Lukanidin et al. Antigenic difference between informofers and protein bound to polyribosomal mRNA from rat liver
Maddison et al. Fractionation of Pneumocystis carinii antigens used in an enzyme-linked immunosorbent assay for antibodies and in the production of antiserum for detecting Pneumocystis carinii antigenemia
KR820001148B1 (ko) 간염 b핵 항원의 제조방법
Martin Separation of guinea pig IgG subclasses by affinity chromatography on protein A-Sepharose
US4234564A (en) Hepatitis B core antigen composition
Halonen et al. Non-specific serum inhibitors of activity of haemagglutinins of rabies and vesicular stomatitis viruses
Schneider Isolation and chemical composition of complement-fixing antigens from leptospires
Harvie et al. Studies on the heterogeneity of human serum Lp lipoproteins and on the occurrence of double Lp lipoprotein variants
Osterman et al. Rickettsial indirect hemagglutination test: isolation of erythrocyte-sensitizing substance
Shimada et al. Removal of neuraminic acid from H-2 alloantigens without effect on antigenic reactivity
Hoekstra et al. Simian sarcoma and feline leukemia virus antigens: isolation of species-and interspecies-specific proteins
EP0078734A1 (fr) Procédé de dosage immunologique mettant en oeuvre deux anticorps, le deuxième anticorps étant purifié par chromatographie d'affinité, supports pour sa mise en oeuvre
Jahani et al. A novel chromatographic method for the preparation of high density lipoproteins
Deheer et al. Characterization of rat liver subcellular membranes: Demonstration of membrane-specific autoantigens
Litman et al. Rapid purification of IgA from normal human serum
Christenson et al. Oligoclonal banding in cerebrospinal fluid assessed by electrophoresis on agarose after centrifugal sample concentration through a microconcentrator membrane.