KR810000882B1 - 고정화(固定化) 햅토글로빈의 제조법 - Google Patents

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Description

고정화(固定化) 햅토글로빈의 제조법

제1도는 본 발명에 의한 고정화 햅토글로빈과 종래품의 물리적 강도에 대한 비교 실험에 사용한 순환장치의 설명도.

제2도는 비교 실험의 결과에 있어 햅토글로빈의 입자수와 순환 시간의 관계를 나타내는 선도.

제3도는 재생 이용 실험에 있어 잔존 Hb의 결합능과 재생 회수의 관계를 나타내는 선도.

본 발명은 의료용의 수불용성(水不溶性)의 고정화 햅토글로빈 제제(製劑)의 제조법에 관한 것이다.

햅토글로빈(이하 Hb라 약칭할 수도 있음)은 혈중에 존재하는 분자량 86,000 내지 400,000의 혈장(血漿)단백질로서 혈중에 유리된 헤모글로빈의 대사에 중요한 역할을 한다. 혈중에 유리된 헤모글로빈(이하 Hb라 약칭할 수도 있음)은 과잉으로 되면 신사구체(

)를 통해서 뇨중에 배설되는데 이는 철분을 소모할 뿐만 아니라 신뇨세관(腎尿細管)의 장해를 야기한다. 햅토글로빈은 생체내에서 헤모글로빈과 선택적으로 경고히 결합하여 헤모글로빈-햅토글로빈 복합체를 형성하고 주로 간실질세포(肝實質細胞)에 용이하게 수용되어 여기서 대사됨으로써 철분의 회수와 함께 신장해(腎障害)의 방지에 관한 중요한 기능을 가지고 있다.

오늘날 이형 수혈(異形輸血), 중증화상(重症火傷), 십장수술, 용혈성(溶血性) 질환 등으로 인한 용혈, 즉 혈모글로빈의 유리가 일어났을 경우, 흔히 신장해를 병발하여 신부전(腎不全)을 일으켜 사망하는 일이 많아 중대한 문제로 되어 있다.

본 발명자들은 이와 같은 용혈성 신장해의 치료약으로서 햅토글로빈의 가능성에 착안하여 전에 햅토글로빈의 고도 정제법 [일본국 특허 공개 소 75-77516호; 영국특허 제1,426,039호; 독일연방 공화국 특허출원 번호 제2,409,650(공개); 프랑스 공화국 특허출원 제2,251,314호(공개)]을 개발하여 이들의 원인요법적 주사약제로서 햅토글로빈 제제를 제공한 바 있다. 이 햅토글로빈 제제는 생체내에 투여되면 유리된 헤모글로빈과 결합함으로써 헤모글로빈의 대사 배설을 정상화하는 역할을 하게 된다.

한편, 인공 심폐(心肺)나 인공 신장과 같은 혈액의 체외순환계(體外循環系)를 사용하여 환자를 치료하는 면에서 근래 괄목할 발전이 이루어지고 있는데, 이와 같은 체외 순환계를 사용하여 장시간 혈액을 순환시키면 용혈이 일어나기 쉬우며 헤모글로빈이 유리를 야기하게 된다. 이와 같이 유리된 헤모글로빈은 흔히 신장해를 초래하여 체의 순환계의 지속적 치료를 곤란케하는 것이다. 이러한 체의 순환계의 지속적 사용에 유래되는 용혈의 치료약으로도 햅토글로빈제제는 유효하지만, 햅토글로빈 제제를 그대로 치료약으로서 생체내에 투여하면 반응 후 햅토글로빈의 회수가 되지 않아 활성을 가지는 햅토글로빈을 단 한번의 사용으로 무위로 버리는 결과가 된다. 더욱이 햅토글로빈을 생체내에 주사했을 경우 햅토글로빈에 의하여 처리되는 헤모글로빈, 즉 헤모글로빈-햅토글로빈 복합체가 간장에 이송되어서 거기에서 대사되기 때문에 간기능이 저하되어 있는 환자에게 햅토글로빈 제제를 주사하는 것은 간장의 부담을 증대시키는 결과가 된다. 따라서 이와 같은 환자에게는 햅토글로빈을 직접 주사할 수 없는 것이다.

혈액중에 유리된 헤모글로빈을 소위 친화성(親和性) 크로마토그래파법을 이용하여 혈액에서 제거하는 방법이 제안된바 있는데, 이것은 아가토오즈로 되는 담체에 햅토글로빈을 결합시켜서 햅토글로빈을 고정화 및 불용성화하는 것으로 그 결과 생성물을 흡착제로 사용하는 것이다. [Michel Klein and Constantin Mihaesco, Biochemical and Bioprisical Research Communications, Vol. 52. No.3(1973)].

본 발명자의 한 사람과 그의 공동 연구자들은 상기 기술을 치료상으로 전진시켜서 혈액 여과 장치라고도 불리울 것을 발명하였는데, 이것은 순환 혈액 중의 헤모글로빈을 각종 담체에 지지된 불용성화 햅토글로빈에 결합시켜서 인공 심폐 등의 체외 순환계에 포함시키는 것으로, 이 방법에 의하여 햅토글로빈을 간장에 부담을 주는 일 없이 직접 생체에서 제거하는데 성공한 것이다. [일본국 특허공개 제76-105, 186호, 제76-79, 717호 및 제76-79, 718호 참조]. 그러나, 상술한 바와 같은 선행 발명에 소개된 수불용성의 고정화 햅토글로빈은 모두가 Hp의 고정화량(固定化量), Hb결합능(結合能), 물리적 강도, 재이용성(再利用性) 등에 관하여 반드시 실용적인 가치가 높은 것은 아니었다.

본 발명의 목적은 활성 햅토글로빈 함유량이 높은 불용성의 고정화 햅토글로빈 제제의 제조법을 제공하려는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 고도의 헤모글로빈 결합능을 갖는 불용성의 고정화 고도의 햅토글로빈 제제의 제조법을 제공하려는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 체외 순환계에 있어 헤모글로빈의 흡착매(吸着媒)로서 사용할 수 있을만큼 충분히 높은 물리적 강도를 갖는 고정화 햅토글로빈 제제를 제공하려는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 체외순환계에 있어 헤모글로빈의 흡착매로서 사용시에 재생후에도 기능도가 높은 고정화 햅토글로빈 제제를 제공하려는 것이다.

본 발명자들은 상기한 바와 같은 목적 달성을 위해 광범위한 연구를 거듭한 결과 햅토글로빈의 고정화를 위한 담체로서는 피브린(fibrin)이 특히 유효하다는 사실을 밝혀내고 이를 토대로하여 본 발명을 달성하게 된 것이다.

즉, 본 발명에 의하면 피브린과 이를 담체로 하여 거기에 활성 햅토글로빈을 고정시킴으로써 불용성화된 햅토글로빈 제제가 제공되는 것이다.

또한, 본 발명에 의하면 피브리노겐, 햅토글로빈, 트롬빈 그리고 이관능성(二官能性) 화합물을 서로 반응시킴으로써 불용성의 고정화 햅토글로빈 제제를 제조하는 제조법이 제공되는 것이다.

이와 같은 본 발명의 제조법에 의한 고정화 햅토글로빈 제제는 그 헤모글로빈 결합능이 높고 또 그 활성을 장기간에 걸쳐 유지하여 연속사용을 가능케 하므로 종래의 고정화 Hp 제제나 주사용 제제에 비하여 현저히 실용에 적합한 것이다.

본 발명에 의한 불용성 고정화 햅토글로빈 제제의 제조법은 피브린에 햅토글로빈을 포매(包埋)하고 이어 효소의 불용성화에 사용하는 방법을 시행하거나 햅토글로빈과 피브린 또는 피브리노겐을 이관능성 화합물과 반응시켜서 이들을 가교화(架橋化)함으로써 간편하게 이루어지는데, 만약 피브리노겐을 사용할 시에는 반응 생성물을 트롬빈과 반응시켜서 피브리노겐 부분을 피브린 부분으로 전환시킨다.

본 발명에서 사용되는 햅토글로빈의 종류에는 특별한 제한은 없고 그 제제의 사용 목적에 따라 달라지는데, 예를 들어 인체의 순환계에 포함되는 헤모글로빈 제거 장치에 사용하려는 경우는 상기한 선행 발명인 햅토글로빈 수용액의 제조법에 의하여 제공된 인유래(人由來)의 주사용 정제 햅토글로빈을 사용하는 것이 바람직하다.

피브리노겐은 트롬빈의 작용에 의하여 수불용성인 피브린으로 전환된다. 본 발명에 사용되는 피브리노겐은 사용 목적에 따라 달라지는 것으로 특히 한정되는 것은 아니지만, 인체의 순환계에 사용하려는 경우는 인유래의 것이 바람직하며 공지의 방법, 예를 들면 코온(Cohn)의 냉 에타놀 분획(分劃)에 의하여 얻어지는 분획 1에서 제공된다. 그리고, 햅토글로빈, 피브리노겐 및 트롬빈은 반응에 사용하기에 앞서 가열처리, 자외선 처리 등의 공지의 방법에 의하여 간염(肝炎)바이러스의 불활성화를 시행하는 것이 바람직하다. 이와 같이 처리된 출발 물질을 선택함으로써 간염 바이러스에 감염될 우려가 없는 생성물을 얻을 수 있는 것이다.

본 발명의 방법에서 사용되는 가교화제인 이 관능성 화합물로서는 글루타르알데히드, 히드라진, 에틸렌디아민, 이 취화메틸렌, 비스디아조-0-디아니시딘, 비스디아조벤지딘, 카르보디이미드 등의 효소의 불용성화 가교화제를 들 수 있는데, 특히 바람직한 가교화제로서는 가교화율이 좋으며 Hb 결합능을 충분히 유지하는 등의 이유로 글루타르알데히드와 카르보디이미드를 들 수 있다.

본 발명에 있어 햅토글로빈, 피브리노겐, 이관능성화합물 그리고 트롬빈의 반응은 수성 용매 중에서 시행된다. 반응물간의 반응 순서는 중요한 것이 아니고, 피브리노겐 또는 피브린과 햅토글로빈 사이에 가교화가 이루어지는 한 어떠한 순서를 택해도 좋다. 즉, 이관능성 화합물을 피브리노겐과 햅토글로빈으로 되는 혼합물과 반응시키고 다음에 이 반응 혼합물을 트롬빈과 반응시켜서 피브리녹네 부분을 피브린 부분으로 전환시키는 절차와, 먼저 피브리노겐을 트롬빈과의 반응으로 피브린으로 전환시킨 다음, 이 결과 생성된 피브린 혼합물과 햅토글로빈을 이 관능성 화합물과 반응시키는 절차와, 햅토글로빈과 이관능성화합물의 혼합물을 피브린과 반응시키거나 혹은 햅토글로빈을 피브린과 이관능성 화합물의 혼합물과 반응시키는 절차의 어느것에 의하더라도 유사한 결과를 얻을 수 있다. 그러나, 피브노겐, 햅토그로빈, 이관능성 화합물 및 트롬빈의 4종의 반응물을 동시에 상호 반응케하는 것이 가장 바람직한 방법이다.

관능성 화합물의 관능성 기는 피브린과 햅토글로빈 중에서 아미노산류의 아미노기, 카르복실기, 페놀기 등의 관능기와 결합되어 불용성의 피브린-햅토글로빈 결합 생성물을 형성하는 것이다.

반응 조건으로서의 조성은 피브리노겐과 햅토글로빈은 중량비로 0.5∼3.0 : 1이고 피브리노겐을 피브린으로 전환시키는 트롬빈의 첨가량은 피브리노겐 1g에 대하여 30-100 NIH 단위이고, 이관능성 화합물의 첨가량은 햅토글로빈 1g당 1-50mM이 바람직하다. 반응 온도는 전반적으로 0-40℃ 범위내일 수 있으나, 가교의 단계에서는 0-10℃, 바람직하게는 0-5℃이고, 피브린으로 전환시킬 무렵에는 20-40℃, 바람직하게는 28-32℃이다. 반응액의 pH는 중성 부근(pH 6-8)이 바람직하고, 반응 용매로서는 생리식염수나 0.1M인산 완충액 등이 좋다. 반응 시간은 약 30분 내지 3시간 정도이나, 대개의 경우 반응 종료는 2시간이면 충분하다.

본 발명에 의한 불용성의 고정화 햅토글로빈을 제조하는 또 하나의 방법은 전술한 바와 같이 피브린 내에 햅토글로빈을 포매(包埋)하는 것인데, 이 방법은 피브리노겐과 햅토글로빈을 수성 용매 중에서 혼합하고 이 결과 혼합물에 트롬빈을 첨가하여 피브리노겐을 피브린으로 전환함으로써 이룩된다. 이 방법에 사용되는 출발 물질과 반응 조건은 상술한 바와 대체적으로 동일하다.

이와 같이하여 얻은 고정화 햅토글로빈 제제, 특히 가교화로 불용성 고정화된 제제는 Hp의 고정화량, Hb 결합능, 물리적 강도 및 재이용성 등에 관해서 시험에 1 내지 3에 나타내듯이 실용성 가치가 높은 것이 었다. 이들 실험예에서 비교한 결과 본 발명에 의한 햅토글로빈 제제는 종래품에 비하여 Hp의 고정화량이 2 내지 10배, Hb 결합능이 약 2 내지 9배, 물리적 강도가 약 2 내지 6배이고, 재이용 능력에 있어서도 약 3 내지 7배의 Hb 결합능을 갖고 있다. 또한, 본 발명 제제의 Hp의 고정화량은 약 100-600㎎/g건조 중량이었고, Hb 결합능은 약 20-115㎎ Hg/g 건조 중량이었다.

본 발명에 의한 햅토글로빈 제제는 인체의 순환계의 여과기내에 혈류 중으로의 유출을 방지하는 입자상 형태로 여과상(濾過床)으로 일체로 포함시키면 체의 순환계의 연속적 사용으로 인한 용혈성 신 장해의 예방이나 치료에 유용하다. 이 경우 입자경은 적어도 40μ이상으로 하되, 헤모글로빈과 효율적으로 결합시키기 위해서는 가급적 작은 것이 바람직하다.

본 발명에 의한 제제의 물리적 강도와 헤모글로빈 결합능을 높이기 위해서는 그 표면적을 확대함으로써 피브린을 2차적 담체를 매개(媒介)로 하여 막상(膜狀)으로 형성하는 것이 바람직하고, 이 2차적 담체에는 내열성 섬유가 적합하며 그것은 필라멘트상, 필름상 혹은 망상(網狀)의 어느 형태라도 좋다. 내열성 섬유로서는 천연 섬유나 합성 섬유를 그 용도에 맞추어 선택할 수 있는데, 예를 들면 폴리올레핀계 섬유, 폴리아크릴로니트릴계 섬유, 폴리에스테르계 섬유, 폴리아세테이트계 섬유, 폴리비닐알코올 계(Vinylon

)섬유 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면 2차적 담체에 지지된 막상 피브리노겐을 토롬빈으로 불용성화한 다음, 이 불용성화 피브린 막과 햅토글로빈과 이관능성 화합물 그리고 2차적 담체를 서로 반응케 하거나 혹은 피브리노겐과 햅토글로빈과 트롬빈 그리고 이 관능성 화합물로 되는 혼합물을 직접 2차적 담체의 존재하에 동시에 상호 반응시킴으로써 2차적 담체에 지지된 불용성의 고정화 햅토글로빈을 효율적으로 제조할 수 있다. 이 경우 이관능성 화합물 역시 2차적 담체의 활성기와 반응하여 고도의 물리적 강도를 갖는 활성 고정화 햅토글로빈을 생성한다.

이와 같은 본 발명의 방법에 의한 햅토글로빈 제제는 수용액 중에 유리된 헤모글로빈과 결합하므로 그 용도는 체외순환계에 있어서의 헤모글로빈의 제거 뿐만 아니라, 널리 혈액 분석면에도 이용할 수 있으며, 그 결합이 선택적이기 때문에 혈장의 분획 조작의 담체로서도 유용하고, 기타 헤모글로빈의 회수에도 이용된다.

상술한 바와 같은 본 발명에 의한 방법의 특징 및 그 이점을 더욱 명백히 하기 위하여 이하에 실시예를 들겠으나, 본 발명이 그들 실시예에 국한되는 것이 아님은 물론이다.

이하의 실시예에 있어, 고정화 햅토글로빈의 측정은 햅토글로빈을 피브린에 고정화한 후에 세척액에서 회수되는 미고정 햅토글로빈의 양을 일원면역확산법(一元免疫擴散法)[G. Mancini. A.O. Carbonara, and T. F. Heremans, Immunochem., 2,235(1965)]으로 정량함으로써 산출하였다. 그리고, Hb 결합능의 측정은 별도 표기가 없는 한, 고정화 햅토글로빈을 컬럼에 넣고 여기에 과잉의 헤모글로빈 용액을 가하여 헤모글로빈과 결합시켜 용액 중에 잔존하는 헤모글로빈의 양에서 결합한 헤모글로빈의 양을 시안메테모글로빈 법[E.J. Kampen, Clin. Chim. Acta. 6. 538(1961)]에 의하여 산출한 것으로 표시하였다.

[실시예 1]

인혈장(人血漿)에서 회수한 정제 피브리노겐의 2.0%(w/v) 용액(pH7:0.1M인산 완충액) 1ℓ에 인혈장에서 회수한 정제 햅토글로빈 20g을 가하고, 이어서 10NIH 단위/㎖의 트롬빈 200㎖를 첨가하였다. 이 혼합물을 30℃에서 2시간 동안 방치하여 피브린을 충분히 응집시켰다. 얻어진 피브린 괴(塊)를 세척한 후 동결 건조하여 입자를 균일화(50-150μ)하였다. 다시 세척하여 고정화 햅토글로빈 제제(製劑) 38g을 얻었다. 이 햅토글로빈의 고정화량은 1회째의 세척시에 약 390㎎/g 건조 중량, 2회째의 세척시에 약 100㎎/g 건조 중량이었고, 그 Hb 결합능은 약 20㎎ Hb/g 건조 중량이었다.

[실시예 2]

인혈장에서 회수한 정제 피브리노겐의 2.0%(w/v) 용액(pH7 : 0.1M 인산 완충액) 2ℓ에 인혈장에서 회수한 인 햅토글로빈 20g을 가하고, 이어서 교반하에 글루타르알데히드를 최종 농도가 10mM 되기까지 첨가하였다. 이 혼합물을 0-5℃의 온도에서 20분간 교반한 후 10NIH 단위/㎖의 트롬빈 200㎖를 가하여에서 30℃에서 2시간동안 방치하였다. 이리하여 얻어진 피브린 괴(塊)를 세척한 후 동결 건조하고 입자를 균질화(50-150μ) 하였다. 다시 세척하여 고정화 그 햅토글로빈 제제(52g)을 얻었다. 이 햅토글로빈의 고정화 량은 약 384㎎/g 건조 중량이었고, Hb 결합능은 약 115㎎ Hb/g 건조 중량이었다. 그런데, 제1회째의 세척시와 제2회째의 세척에 있어 햅토글로빈의 고정화량의 차이는 거의 인정되지 않았다.

[실시예 3]

약 100 메슈의 나이론 사(紗)를 165mmx 200mm로 제단하여 양단을 스테인레스 강의 철사에 용접하고 이것을 나선상으로 감아서 용량 90㎖(내경 28mm, 높이 145mm)의 파이렉스(Pyrex) 유리 컬럼에 넣고 20NIH 단위/㎖의 트롬빈 용액으로 적시고 과잉량의 트롬빈 액을 컬럼에서 제거한 후 인혈장에서 회수한 정제 피브리노겐의 2.0-%(w/v) 용액(생리식염액) 20㎖, 인혈장에서 회수한 정제 햅토글로빈 200㎎와 글루타르알데히드 5mM로 되는 혼합액을 급속히 컬럼에 주입하였다.

이 때의 고정화 장치 및 반응액의 온도를 모두 5℃로 유지하고, 이 혼합액이 상기 나일론 사의 전면에 충분히 분포한 후에 과잉량의 혼합액을 제거하고 30℃에서 2시간 회전시켜서 피브린을 나일론사에 전착(展着)시켰다. 다음에 4℃로 하룻밤 방치함으로써 피브린을 충분히 수축시킨후 생리식염액으로 철저히 세척하였다.

이리하여 얻은 고정화 햅토글로빈의 햅토글로빈 고정화량은 180㎎/고정화컬럼이었고, Hb 결합능은 62㎎ Hb/고정화컬럼이었다.

[실시예 4]

실시예 3에 기재한 절차를 글루타르알데히드 대신에 카르보디이미드 10mM를 사용하여 반복시행하였다.

그 결과는 실시예 3에서 얻은 것과 대차없고, 그 햅토글로빈 고정화량은 175㎎/고정화컬럼였으며 Hb 결합능은 62㎎ Hb/고정화컬럼이었다.

[실험예 1]

실시예 1 및 2에서 얻은 고정화햅토글로빈과 종래품으로서 폴리아크릴아미드 겔 활성화 에스테르에 의하여 고정화된 햅토글로빈(PAE-HP)과, Sepharose

(Pharmacia Co., Ltd (스웨덴)에서 판매되는 아가로우즈)에 의하여 고정화된 햅토글로빈(S-Hp)의 각각의 Hp의 고정화량, Hb 결합능을 비교하였다. PAE-HP는 Schnaar과 Lee[Biochem., 14. 1535(1975)]의 방법에 의하여 폴리아크릴아미드 활성화 에스테르에 정제 휴먼 햅토글로빈을 반응시킴으로써 제자하였고, S-Hp는 Klein과 Mihaesco(Roc. Cit.)의 방법에 따라 제제하였다. 여기에 사용한 햅토글로빈의 양은 인혈장에서 회수한 정제 Hp20g였다.

[실험예 2]

실시예 1에서 불용성 고정화 햅토글로빈 이외에 실험에 1에서 사용된 각 불용성 고정화 햅토글로빈을 액의 유동으로 인한 물리적 강도를 비교하였다.

실험법은 이들 불용성 고정화 햅토글로빈 30㎖를 각각 내용적 50㎖의 배리어-필터(Johnson and Johnson Co. 제)에 충전하여 제1도에 도시한 순환장치에 장착하였다. 이 순환장치는 배리어

체의 혈액 필터(F)를 둘러싸는 밀폐용기(C)에 무단(無端)파이프 라인(L)을 접속하고, 이 파이프라인(L)에 마련한 펌프(P)에 의해 1ℓ의 생리, 식염액을 유속 500㎖/0.50㎤/분으로 순환시켜, 순환 후 5시간까지 1시간마다 시료 채취 액중의 입자수를 확대율 50배의 혈색소계로 측정하였다. 그리고 배리어-필터의 공직경(孔直徑)은 20∼40이고, 각 고정화 햅토글로빈의 입자경을 50-150μ으로 조정하였다. 제2도는 종축에 생리 식염액 1㎖당의 Hp 입자수를 취하고 횡축에 순환시간을 취하여 Hp 입자수의 시간적 변동을 나타내고 있는 것으로, 실시예 2의 불용성 고정화 햅토글로빈은 종래품에 비하여 약 2-7배의 물리적 강도를 갖고 있다는 것은 알 수 있다.

[실험예 3]

실험예 1에 있어서 얻은 각 고정화 햅토글로빈의 재이용성을 비교 시험하였다. 본 시험은 하기 방법으로 시행하였다. 각각의 고정화 햅토글로빈 5㎖에 헤모글로빈을 충분히 결합시킬 후 Hp-Hb 결합을 완전 절단하기 위하여 용매로서 5M MgCl₂수용액(pH 약 4.3) 30㎖를 혼합하고 용액중에 유리된 헤모글로빈을 정량(定量) 함으로써 고정화 햅토글로빈의 Hb 결합능을 산출하였다. 헤모글로빈의 유리시에 재생된 햅토글로빈을 다시 충분한 양의 헤모글로빈과 결합시킨 다음 상술한 바와 같이 처리하여 헤모글로빈을 유리시켰다. 이와 같은 처리를 반복 시행하여 이 처리의 반복에 따른 Hb 결합능의 변동을 조사하였다.

제3도는 이와 같은 실험의 결과를 나타내는 것으로 종축에 잔존 Hb 결합능(㎎ Hb/g 건조 중량)을 취하고 횡측에 재생 회수를 취하고 있는데, 이 표에서 실시예 2의 Hp는 4회의 재생후에도 종전품에 비하여 약 4-8배의 Hb 결합능을 보지하고 있음을 알 수 있다.

Claims (1)

1. 피브리노겐, 햅토글로빈, 트롬빈 및 이관능성(二官能性) 화합물을 상호 반응케하여 불용성으로하는 것을 특징으로하는 고정화 햅토글로빈의 제조법.

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