KR800001596B1

KR800001596B1 - Recovery method of cephalosporin c using multiion exchange column

Info

Publication number: KR800001596B1
Application number: KR7903690A
Authority: KR
Inventors: 배종찬; 문화식; 이계하
Original assignee: 경주현; 제일제당 주식회사
Priority date: 1979-10-24
Filing date: 1979-10-24
Publication date: 1980-12-29

Abstract

Cephalosporin C(I) was isolated from fermentation broth contg. I by washing it with water adjusted to pH 3-5 through the microporous non-ionic multi-beds exchange resin having a 200-1, 000A and a 40-20A pore diameter. After primary eluting I with aq. soln. of alkaline metal salt, I was eluted with lower alcohol to obtain selectively I from pigment, protein, polysaccharide, etc.

Description

Separation and Recovery of Sepharosporin C Using a Double Resin Column

본 발명의 균체가 제거된 세파로스포린 C의 함유액을 마크로포러스형 비이온성 교환수지를 이용하여 흡착, 용리시, 200-1,000Å의 세공경 및 40-200Å의 세 공경을 가진 마크로포러스형 비이온성 교환수지를 복상으로 연결 사용하여 흡착하므로써 색소, 단백질 다당류 등 불순물과 선별적으로 세파로스포린 C를 분리 회수하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.Separation of the cephalosporin C containing the cells of the present invention using a macroporous nonionic exchange resin when adsorbed and eluted, the macroporous type B with a pore size of 200-1,000 mm and a pore size of 40-200 mm The present invention relates to a method for separating and recovering sephalosporin C selectively from impurities such as pigments and protein polysaccharides by adsorption using a plural phase exchange resin.

종래 발효여액으로부터 세파로스포린 C를 분리 정제하는 방법으로는 발효여액을 활성탄에 흡착시킨 후 친수성 유기용매와 물의 혼합액 등으로 용리하는 정제 방법인 영국 특허 제1,422,241호나, 음이온 교환수지에 흡착시킨 후 산 완충액으로 용리하는 방법인 미국특허 제3,467,654호 및 비이온성 흡착제에 흡착시킨 후 유기용매로 용리하는 방법인 일본공개특허 소화 제51-32,791호 그리고 양이온 교환수지와 약염기성 및 중염기성 음이온 교환수지를 이용하여 전 처리한 후 음이온 교환수지나 합성흡착제, 활성탄 등에 흡착한 후 용리하는 방법인 일본특허 소화 제52-76,486호,또한 비이온성 흡착수지에 흡착 후 음이온성 계면활성제로 용리하는 방법인 일본특허 소화 제52-128,294호 등의 여러 방법처럼 발효여액으로부터 직접 세파로스포린 C를 정제하는 방법과, 신규 유도체로 변환시켜 배양액 중에 포함된 색소, 단백질, 다당류 등과의 용해도의 차이를 이용하여 유도체의 형태로 변환시켜 유기용매 등으로 추출하는 방법인 일본특허 소화 제51-26,889호 제53-53,689호 미국특허 제3,160,631, 3,573,295, 3,573,296, 3,641,018, 3,739,002, 3,821,208, 3,853,863, 3,835,129, 3,923,798, 3,983,109 등이 있으나, 우선 유도체로 변환 추출하는 방법인 미국특허 제3,853,863호나 3,853,129호 등을 살펴보면, 그 방법은 단백질 다당류 등의 불순물과 용해도의 차가 현저한 신규 유도체의 형태로 세파로스포린 C를 변환시켜 유기용매로 추출하기 때문에 제품의 순도가 높아지는 장점은 있으나, 공정이 간단하지 않고 유기용매를 사용하므로 별도로 유기용매회수공정이 필요하거나, 용매회수가 불가능한 경우도 있으며, 또한 상기 경우에 있어서도 이온교환수지를 사용하여 전처리된 수지용리액을 사용하므로 결국은 수지를 사용해야 하는 단점이 있다고 할 것이다.Separation and purification of sephalosporin C from the fermentation filtrate in the prior art, the fermentation filtrate is adsorbed on activated carbon and eluted with a mixture of a hydrophilic organic solvent and water or the like in British Patent No. 1,422,241 or anion exchange resin and then acid US Pat. No. 3,467,654, a method of eluting with a buffer solution, and Japanese Patent Laid-Open No. 51-32,791, a method of eluting with an organic solvent after adsorbing to a nonionic adsorbent, and a cation exchange resin and a weakly basic and heavy base anion exchange resin. Japanese Patent No. 52-76,486, which is a method of eluting an anion exchange resin, a synthetic adsorbent, activated carbon, and then eluting with an anionic surfactant, followed by elution with an anionic surfactant. Purifying cephalosporin C directly from the fermentation filtrate, as in various methods such as Nos. 52-128,294; Japanese Patent Digestion No. 51-26,889 No. 53-53,689, which is a method of converting a derivative into a derivative form by using a difference in solubility with pigments, proteins, and polysaccharides contained in the culture medium and extracting the same into an organic solvent. Patent Nos. 3,160,631, 3,573,295, 3,573,296, 3,641,018, 3,739,002, 3,821,208, 3,853,863, 3,835,129, 3,923,798, 3,983,109, etc. Although the purity of the product is increased because the conversion of cephalosporin C in the form of a novel derivative with a significant difference in impurities and solubility is extracted with an organic solvent, the organic solvent recovery process is not simple because the process is not simple. In some cases, solvent recovery may not be possible, and in such cases, ion exchange resins may also be used. Use the resin using eluent pretreatment, so that the end will be a disadvantage to use a resin.

그리고, 배양 여액을 직접 합성흡착제인 다이아이온 HP계 수지에 흡착용리하는 방법인 일본특허 소화 제51-32,791호 방법은 HP계 수지가 암버라이트 XAD 수지보다 세파로스포린 C의 흡착량이 많은 것은 사실이나, 용리시 단백질, 다당류 등과의 분리가 어렵기 때문에 제품의 순도가 떨어지는 결점이 있으며, 흡착시 발효여액의 pH가 세파로스포린 C의 등전점 부근일수록 흡착량이 증가되므로 함유액의 pH를 2.5부근까지 낮추어야 하나 이 경우 세파로스포린 C가 산에 불안정하므로 세파로스포린 C의 구조 중 아세틸기 등의 분해 위험성이 증가되며, 따라서 흡착시 흡착 폐액의 농도가 낮다고 하여 흡착율이 높다고 단정할 수는 없는 바, 이는 산성 pH에서 흡착하므로 산에 의한 분해에 의하여 세파로스포린의 활성이나 농도가 감소될 수도 있기 때문이다.In addition, Japanese Patent Digestion No. 51-32,791, which is a method of eluting the culture filtrate directly with a diaion HP resin, which is a synthetic adsorbent, shows that HP-based resin has a higher adsorption amount of cephalosporin C than Amberlite XAD resin. In case of elution, it is difficult to separate proteins and polysaccharides, so the purity of the product is low.As the pH of fermentation filtrate is increased near the isoelectric point of sephalosporin C during adsorption, the pH of the solution must be lowered to around 2.5. However, in this case, since cephalosporin C is unstable in acid, the risk of decomposition of acetyl groups in the structure of cephalosporin C increases. Therefore, low adsorption waste concentration during adsorption does not mean that the adsorption rate is high. This is because the adsorption at acidic pH may decrease the activity or concentration of sephalosporin by decomposition by acid.

또한 용리시 희박한 수산화 나트륨 용액이나 알카리 금속염을 사용하여 pH가 알카리성이므로 분해 위험성이 증가되어 수율이 낮은 단점이 있는 것이다.In addition, since the pH is alkaline using a dilute sodium hydroxide solution or an alkali metal salt during elution, there is a disadvantage in that the yield is low due to an increased risk of decomposition.

또, 비이온성 흡착수지에 흡착 후 음이온 계면활성제로 용리하는 방법인 일본특허 소화 제52-128,294호는 유기용매를 사용할 필요가 없고, 분리가 좋은 장점은 있으나 흡착시 세파로스포린 C의 흡착력이 적고 흡착 및 용리시 유속이 느리므로 인하여 후에 연결되는 농축공정의 능력이 커져야 하는 공정상의 문제가 있으며 농축시간이 길어지므로 수율이 낮아지는 단점이 있다. 그리고 세파로스포린 C의 발효여액을 활성탄에 흡착시킨 후 친수성 유기용매와 물의 혼합액 등으로 용리하는 방법으로서는 영국특허 제1,422,241호가 있으나, 이는 활성탄의 입자 크기가 작기 때문에 발효액에 여과 보조제를 첨가하여 휠타프레스(filter press) 등으로 세밀하게 불순물을 여과하여야 하는 등 공정상의 번거로움이 필요할 뿐 아니라, 활성탄에 흡착된 세파로스포린 C를 용리하기 위하여 유기용매를 사용하므로 입자가 작은 활성탄에 영향을 미쳐 재생을 하여 사용한다 하더라도 수지와 같이 많은 횟수를 사용할 수 없다는 단점이 또한 있는 것이다. 따라서 본 발명자들은 이와같은 종래의 여러 가지 단점들을 해결하기 위해서는, 세파로스포린 C만을 많은 량 흡착시킬 수 있고, 세파로스포린 N 및 색소, 단백질, 다당류 등의 불순물과의 분리가 용이하며 공정을 단축하고 수율 및 순도를 증가시킬 수 있는 방법에 주안점을 두어 연구한 결과, 이미 사용되고 있는 비이온성 흡착수지인 다이아이온 HP계 수지와 암버라이트 XAD계 수지의 특성을 이용하여 두 수지를 단독 사용한 경우에 비하여 좋은 결과를 얻을 수 있음을 발견하게 된 것이다.In addition, Japanese Patent No. 52-128,294, which is a method of eluting an anionic surfactant after adsorption on a nonionic adsorption resin, does not require the use of an organic solvent and has a good separation, but has a low adsorption capacity of sephalosporin C upon adsorption. Due to the slow flow rate during adsorption and elution, there is a process problem in which the capacity of the subsequent condensation process must be increased and the yield time is lowered because the condensation time is longer. The method of eluting the fermentation filtrate of cephalosporin C on activated carbon and eluting with a mixture of a hydrophilic organic solvent and water is British Patent No. 1,422,241. However, since the particle size of the activated carbon is small, a filter aid is added to the fermentation broth to filter the pressta press. In addition to the cumbersome process of filtering impurities such as (filter press), organic solvents are used to elute the sephalosporin C adsorbed on the activated carbon. Even if used, there is also a disadvantage that can not be used as many times as the resin. Accordingly, the present inventors can adsorb a large amount of cephalosporin C only to solve the various disadvantages of the related art, and it is easy to separate the sephalosporin N and impurities such as pigments, proteins, and polysaccharides, and shorten the process. The study focuses on the method of increasing the yield and purity, and compared with the case of using the two resins alone using the characteristics of the diionic HP resin and the Amberlite XAD resin, which are already used nonionic adsorptive resins. You find that you can get good results.

이를 자세히 설명하면, 세파로스포린 C의 흡착량이 증가함은 물론, 흡착 후 pH를 조정한 처리수로 수세를 하여도 세파로스포린 C는 제거되지 않고 불순물만이 제거될 뿐 아니라, 용리시 알카리 금속염으로 일차 용리하여 불순물을 제거하고 이소프로판 알코홀 등 저급 알코홀로 용리하면 순도도 높으면서 높은 농도의 세파로스포린 C를 얻을 수 있을 뿐 아니라 수지에 의한 농축효과 또한 얻을 수 있는 방법을 개발하게 된 것이다.To explain this in detail, the adsorption amount of cephalosporin C is increased, and even if the water is washed with adjusted pH after adsorption, the cephalosporin C is not removed but only impurities are removed. By eluting the impurities by primary elution and eluting with lower alcohols such as isopropane alcohol, high purity and high concentrations of sephalosporin C can be obtained, as well as a method of obtaining resin enrichment effect.

이를 좀더 상세히 설명하면 다음과 같다.This will be described in more detail as follows.

다이아이온 HP계 수지는 200Å 이상 1000Å 이하의 세공경을 갖고 있어 세공 용적이 0.6-1.1ml/g인데 비하여, 암버라이트 XAD계 수지는 40-200Å의 작은 세공경을 갖고 있고 세공 용적도 0.3-0.6ml/g으로 작으므로 HP계 수지에 비하여 흡착량이 떨어지는 단점이 있다. 그러나 HP계 수지는 산성 pH에서 흡착해야만 흡착율이 증가하는데 비하여 XAD계 수지는 HP계 수지보다 높은 pH 범위에서도 흡착이 가능할 뿐 아니라, 용리시 HP계 수지에 비하여 불순물의 혼입이 적은 장점을 갖고 있다.Diaion HP-based resins have a pore size of 200-1000 mm and a pore volume of 0.6-1.1 ml / g, whereas Amberlite XAD resins have a small pore diameter of 40-200 mm and a pore volume of 0.3-0.6. Since it is small in ml / g, there is a disadvantage in that the adsorption amount is lower than that of the HP resin. However, HP-based resins have an advantage in that the adsorption rate increases only when they are adsorbed at an acidic pH, whereas XAD-based resins are capable of adsorbing even at a higher pH range than HP-based resins, and have fewer impurities compared to HP-based resins during elution.

또한 종래 사용되던 단일 수지 칼럼을 이용하는 방법은 세파로스포린 C의 흡착량이 적었을 뿐 아니라 흡착시 흡착 폐액으로 빠지는 세파로스포린 C의 함유액의 처리가 곤란하여 관류점까지 밖에 흡착을 시키지 못하였기 때문에 수지의 흡착능력을 충분히 발휘할 수 없었다.In addition, the method of using a single resin column, which is used in the past, has not only a small amount of adsorption of sephalosporin C, but also difficult to process the separosporin C-containing liquid that falls into the adsorption waste liquid upon adsorption, so that only the adsorption point can be adsorbed to the perfusion point. Adsorption capacity of the resin could not be sufficiently exhibited.

따라서 본원 발명과 같이 두가지 수지를 복상으로 연결할 경우에는 세파로스포린 C의 산에 의한 분해 위험성을 줄이기 위하여 pH 4-5로 조정하여 흡착시에도, HP계 수지에 흡착되지 않은 세파로스포린 C는 XAD계 수지에 의하여 흡착시킬 수 있어 수지의 흡착능력을 향상시킬 수 있으며, 산성 pH에서의 세파로스포린 C의 분해 위험성이 없으며 또한 충분한 수세를 통하여 불순물을 제거할 수 있는 장점이 있는 것이다. 또한 복상식으로 탑을 연결할 경우에는 연결방법에도 여러 가지가 있을 수 있으나, 다이아이온 HP계 수지 하나와 암버라이트 XAD계 수지 하나를 연결하여 사용하는 방법이 가장 좋다. 그리고 흡착된 세파로스포린 C의 용리는 탑을 각각 용리하여도 좋으나, 분별 용리의 경우보다 연결 용리의 경우가 HP계 수지에서 세파로스포린 C와 같이 용리되는 불순물이 XAD계 탑에서 재흡착되게 되므로 순도가 향상되고 또한 연결 용리의 경우 불순물과 함께 소량씩 용리되어 나오는 세파로스포린 C의 량을 감소시킬 수 있어 회수율 또한 증가되므로 연결용리하는 방법이 바람직하다. 여기서 사용하는 다이아이온 HP계 수지는 HP-10,20,30,40,50 중 HP-40이 좋았으며 XAD계 수지는 XAD-2,4,7,8 등이 있으나 XAD-2가 좋았다. 더욱 상세한 것은 실시예에 의하여 설명하면 다음과 같다.Therefore, when connecting two resins in a double phase as in the present invention, even when adsorbed by adjusting the pH to 4-5 to reduce the risk of decomposition by the acid of cephalosporin C, cephalosporin C which is not adsorbed to the HP-based resin is XAD. It can be adsorbed by the system resin to improve the adsorption capacity of the resin, there is no risk of decomposition of the sephalosporin C at acidic pH and there is an advantage that can remove impurities through sufficient water washing. In addition, when the tower is connected in a fold type, there may be various connection methods, but it is best to use one of Aion HP-based resins and Amberlite XAD-based resins. In addition, the elution of adsorbed Sepharoseporin C may be eluted from the tower, respectively, but in the case of the connection elution, the impurities eluted like Sepharosporin C from the HP resin are resorbed in the XAD column. Since the purity is improved and the amount of sephalosporin C eluted in small amounts with impurities can be reduced in the case of linked elution, the recovery rate is also increased. Here, the Aion HP-based resin used in HP-10, 20, 30, 40, and 50 was good HP-40 and the XAD resin was XAD-2, 4, 7, and 8, but XAD-2 was good. More detailed description will be given as follows.

[실시예 1]Example 1

세파로스포린 C 10g/1를 함유하는 발효여액 20ℓ를 pH 4.5로 조정하여 다이아이온 HP-40 수지 1ℓ가 충진된 수지탑과 암버라이트 XAD-2수지 1ℓ가 충진된 수지탑을 연결하여 SV=2의 유속으로 흡착시켰다.20 liters of fermentation filtrate containing Sepharoseporin C 10g / 1 was adjusted to pH 4.5 to connect a resin column filled with 1 liter of Diaion HP-40 resin and a resin column filled with 1 liter of Amberlite XAD-2 resin, SV = 2 At a flow rate of.

흡착 폐액 20ℓ의 농도는 0.2g/1였으며 이때의 수지에 대한 흡착율은 98%였다. 이어서 pH가 4.5로 조정된 처리수 2ℓ를 이용하여 같은 통탑속도로 세척한 후 0.05N-수산화 나트륨 수용액 1ℓ로 용리하고 곧이어 10% 이소프로판 알코올 5ℓ로 용리하였다. 이 용리액을 500ml씩 분획으로 받은 결과 1-3의 분획 중에는 색소 및 다당류, 단백질 등의 불순물이 주로 검출되었고, 4-9 분획에서 세파로스포린 C의 대부분이 검수율은 93%였다. 또한 10-12의 분획에는 세파로스포린 C의 일부분만이 검출되었고 이를 합한 액의 농도는 4.2g/1였다.20 L of the adsorption waste liquid was 0.2 g / 1, and the adsorption rate for the resin was 98%. It was then washed at the same column rate using 2 liters of treated water adjusted to 4.5, eluted with 1 liter of 0.05N sodium hydroxide aqueous solution, followed by 5 liters of 10% isopropane alcohol. As a result of receiving 500 ml of this eluate in fractions, impurities of pigments, polysaccharides, proteins, and the like were mainly detected in the fractions of 1-3. Most of the cephalosporins C in the 4-9 fractions were 93%. In addition, only a part of cephalosporin C was detected in the fraction of 10-12, and the concentration of the combined solution was 4.2 g / 1.

따라서 이 액은 다음 시험의 용리제로 사용할 수 있다. 활성 분획 3ℓ를 공지의 방법에 의하여 조정하고 감압 농축 후 유기 용매를 사용하여 정석하고 건조 후 백색 결정 170g을 얻었다.Therefore, this solution can be used as eluent for the next test. 3 L of the active fractions were adjusted by a known method, concentrated under reduced pressure, crystallized using an organic solvent, and dried to obtain 170 g of white crystals.

순품과 비교한 제품의 순도는 99.4%였으며 수율은 84.5%였다.The purity of the product compared to the pure product was 99.4% and the yield was 84.5%.

[실시예 2]Example 2

세파로스포린 C 9.5g/1를 함유하는 발효여액 10ℓ를 pH 2.5로 조정하여 다이아이온 HP-40 수지 1ℓ가 충진된 수지탑에 SV=1의 유속으로 흡착시켰다.10 L of the fermentation filtrate containing Separoseporin C 9.5 g / 1 was adjusted to pH 2.5 and adsorbed at a flow rate of SV = 1 in a resin column filled with 1 L of diion HP-40 resin.

흡착 폐액 10ℓ중의 세파로스포린 C의 농도는 1.4g/1였으며 이때의 흡착율은 85.3%였다. 곧이어 pH 3.0으로 조정한 처리수 2ℓ로 세척한 후 0.05N-수산화 나트륨 수용액 1ℓ로 용리한 후 10% 이소프로판 알코올 4ℓ로 용리하여 500ml씩 분획으로 받았다. 이때 1-2 분획에서는 색소 등의 불순물이 다량 함유되어 있었고 3-8 분획에는 높은 활성의 세파로스포린 C가 검출되었다. 이 분획을 합한 액의 농도는 24g/1였고 이때의 수율은 75.8%였다. 9-10 분획을 합한 액의 농도는 5.8g/1였다. 활성 분획 3ℓ를 실시예 1과 같이 처리하여 백색 결정 65g을 얻었다. 순품과 비교한 순도는 94.2%였으며 이때 수율은 64.5%였다.The concentration of cephalosporin C in 10 L of the adsorption waste liquid was 1.4 g / 1, at which the adsorption rate was 85.3%. Immediately after washing with 2 L of treated water adjusted to pH 3.0, eluting with 1 L of 0.05N-sodium hydroxide aqueous solution, eluting with 4 L of 10% isopropane alcohol and receiving 500 ml fractions. At this time, the 1-2 fraction contained a large amount of impurities such as pigments, and the 3-8 fraction detected high activity cephalosporin C. The combined concentration of the fractions was 24 g / 1 and the yield was 75.8%. The concentration of the combined 9-10 fractions was 5.8 g / 1. 3 L of the active fractions were treated in the same manner as in Example 1 to obtain 65 g of white crystals. The purity was 94.2% compared to the pure product and the yield was 64.5%.

Claims

When the fermentation broth containing the separated cellulosporin C is eluted with a macroporous nonionic exchange resin, the macroporous nonionic exchange resin having a pore diameter of 200-1000 mm and a pore diameter of 40-200 mm Separation of sephalosporin C with impurities such as pigments, proteins, and polysaccharides is carried out by connecting with a double phase and washing with treated water adjusted to pH 3-5, eluting with a low alkali alcohol after primary elution with an aqueous alkali metal salt solution. Separation and recovery of the Separosporin C characterized in that the recovery.