KR20240105656A - Microorganism having enhanced activity of anion symporter and uses thereof - Google Patents
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Abstract
본 출원은 음이온 수송 단백질의 활성이 강화된 미생물, 상기 미생물을 포함하는 판토텐산 및/또는 판토산 생산용 조성물, 및 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 판토텐산 및/또는 판토산 생산방법을 제공하며, 판토텐산 및/또는 판토산의 생산능이 우수하다. The present application provides a microorganism with enhanced anion transport protein activity, a composition for producing pantothenic acid and/or pantoic acid containing the microorganism, and a method for producing pantothenic acid and/or pantoic acid comprising culturing the microorganism, The production capacity of pantothenic acid and/or pantoic acid is excellent.
Description
음이온 수송 단백질의 활성이 강화된 미생물, 상기 미생물을 포함하는 판토텐산 및/또는 판토산 생산용 조성물, 및 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 판토텐산 및/또는 판토산 제조방법이 제공된다.Microorganisms with enhanced anion transport protein activity, a composition for producing pantothenic acid and/or pantoic acid containing the microorganisms, and a method for producing pantothenic acid and/or pantoic acid comprising culturing the microorganisms are provided.
판토텐산(pantothenic acid)은 비타민 B 복합체에 속하는 물질로 비타민 B5라고도 불리며, 화장품, 의약, 사람 영양물, 동물 영양물 등에 다양하게 응용되고 있는 상업적으로 중요한 물질 중 하나이다. 판토텐산은 판토산(pantonic acid)에 베타-알라닌이 아미드 결합으로 연결된 구조이다.Pantothenic acid is a substance belonging to the vitamin B complex and is also called vitamin B5. It is one of the commercially important substances with various applications in cosmetics, medicine, human nutrition, and animal nutrition. Pantothenic acid is a structure in which beta-alanine is linked to pantonic acid through an amide bond.
판토텐산 또는 판토산은 화학적으로 합성하여 제조하거나, 적합한 배지에서 적합한 미생물을 발효시킴으로써 생물공학적으로 제조할 수 있다. 미생물을 이용하는 생물공학적 제조 방법의 이점은 목적하는 입체-이성체성 D-형태의 판토텐산 또는 판토산이 형성된다는 것이다.Pantothenic acid or pantoic acid can be manufactured chemically synthetically or biotechnologically by fermenting suitable microorganisms in a suitable medium. The advantage of biotechnological production methods using microorganisms is that the desired stereo-isomeric D-form of pantothenic acid or pantoic acid is formed.
이에, 생물공학적으로 판토텐산 및/또는 판토산을 제조하는데 유리한 효과를 갖는 미생물 및 이를 이용하여 판토텐산 및/또는 판토산을 고효율로 제조하는 기술의 개발이 요구된다.Accordingly, there is a need for the development of microorganisms that have an advantageous effect in biotechnologically producing pantothenic acid and/or pantoic acid and technology for producing pantothenic acid and/or pantoic acid with high efficiency using the same.
본 출원의 일 예는 음이온 수송 단백질의 활성이 강화된, 판토텐산 또는 판토산을 생산하는 미생물을 제공한다.An example of the present application provides a microorganism that produces pantothenic acid or pantoic acid with enhanced anion transport protein activity.
본 출원의 다른 예는 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 판토텐산 또는 판토산의 제조방법을 제공한다.Another example of the present application provides a method for producing pantothenic acid or pantoic acid comprising culturing the microorganism in a medium.
본 출원의 또 다른 예는 상기 미생물을 포함하는 판토텐산 또는 판토산 생산용 조성물을 제공한다.Another example of the present application provides pantothenic acid or a composition for producing pantosan containing the above microorganisms.
본 출원의 또 다른 예는 상기 미생물을 판토텐산 또는 판토산 생산에 사용하기 위한 용도를 제공한다.Another example of the present application provides the use of said microorganism for the production of pantothenic acid or pantoic acid.
본 출원의 또 다른 예는 상기 미생물을 판토텐산 또는 판토산 생산용 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.Another example of the present application provides the use of the microorganism for the production of pantothenic acid or a composition for producing pantoic acid.
일 양상은 음이온 수송 단백질의 활성이 강화된 판토텐산 또는 판토산을 생산하는 미생물을 제공한다.One aspect provides pantothenic acid or a microorganism producing pantoic acid with enhanced activity of anion transport proteins.
본 명세서에서 용어 "음이온 수송 단백질"은 세포 내로 음이온을 수송하는 기능을 갖는 단백질이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 상기 음이온 수송 단백질은 음이온 수송 단백질 활성을 갖는 폴리펩타이드, 단백질 등을 의미할 수 있다.As used herein, the term “anion transport protein” may include without limitation any protein that has the function of transporting anions into cells. The anion transport protein may refer to a polypeptide or protein having an anion transport protein activity.
상기 음이온은 1가 음이온, 2가 음이온, 3가 음이온 또는 4가 음이온일 수 있다.The anion may be a monovalent anion, a divalent anion, a trivalent anion, or a tetravalent anion.
일 예에서 상기 음이온은 유기산의 짝염기일 수 있다. 상기 유기산은 카복실산, 설핀산, 설폰산, 페놀, 싸이오페놀, 옥심, 엔올, 이미드, 방향족 설폰아마이드, 일차 니트로 화합물 또는 이차 니트로 화합물 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예에서 상기 음이온은 카복실산의 짝염기일 수 있다. 상기 카복실산은 메탄산, 에텐산, 락트산, 아미노산, 구연산, 지방산 (예컨대, 아세트산, 프로피온산, 뷰탄산, 팔미트산, 또는 올레산), 또는 방향족 카복실산 (예컨대, 벤조산, 살리실산)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 카복실산은 2 이상의 카복실산을 포함하는 다이카복실산, 트리카복실산 등을 포함할 수 있다. 상기 다이카복실산은 옥살산, 말론산, 석신산, 글루타르산, 아디프산, 피멜산, 서버산, 아젤라산, 세박산, 프탈산, 이소프탈산 또는 테레프탈산 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 카복실산은 C1 카복실산, C2 카복실산, C3 카복실산, C4 카복실산, C5 카복실산, 또는 C6 카복실산일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.In one example, the anion may be the conjugate base of an organic acid. The organic acid may be carboxylic acid, sulfinic acid, sulfonic acid, phenol, thiophenol, oxime, enol, imide, aromatic sulfonamide, primary nitro compound or secondary nitro compound, but is not limited thereto. In one example, the anion may be the conjugate base of carboxylic acid. The carboxylic acid may be, but is not limited to, methanoic acid, ethenoic acid, lactic acid, amino acid, citric acid, fatty acid (e.g., acetic acid, propionic acid, butanoic acid, palmitic acid, or oleic acid), or aromatic carboxylic acid (e.g., benzoic acid, salicylic acid). That is not the case. The carboxylic acid may include dicarboxylic acid, tricarboxylic acid, etc. containing two or more carboxylic acids. The dicarboxylic acid may be oxalic acid, malonic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid, pimelic acid, serberic acid, azelaic acid, sebacic acid, phthalic acid, isophthalic acid, or terephthalic acid, but is not limited thereto. The carboxylic acid may be C1 carboxylic acid, C2 carboxylic acid, C3 carboxylic acid, C4 carboxylic acid, C5 carboxylic acid, or C6 carboxylic acid, but is not limited thereto.
상기 음이온 수송 단백질은 상기 음이온과 나트륨 이온 또는 칼륨 이온 등의 양이온을 함께 세포 내로 수송하는 활성을 갖는 것일 수 있다.The anion transport protein may have the activity of transporting the anion and the cation such as sodium ion or potassium ion into the cell.
상기 음이온 수송 단백질은 2가 음이온 및 나트륨 이온을 세포 내로 수송하는 활성을 갖는 것일 수 있다.The anion transport protein may have the activity of transporting divalent anions and sodium ions into cells.
상기 음이온 수송 단백질은 DASS (Divalent anion:Na+ symporter, 2가 음이온:나트륨 이온 수송 단백질) 계열-결합 음이온 수송 단백질 (DASS family sodium-coupled anion symporter)일 수 있다.The anion transport protein may be a DASS (Divalent anion:Na+ symporter) family-coupled anion transport protein (DASS family sodium-coupled anion symporter).
일 예에서 상기 음이온 수송 단백질은 Ncam0154 단백질일 수 있다.In one example, the anion transport protein may be the Ncam0154 protein.
일 예에서 상기 음이온 수송 단백질의 활성 강화는 음이온 수송 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 도입에 의한 것일 수 있으나 이에 제한되지 않고 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하다. 일 예에서 상기 음이온 수송 단백질은 도입될 미생물 내재의 단백질이거나 외래의 단백질일 수 있다.In one example, the activity of the anion transport protein may be enhanced by introducing an anion transport protein or a polynucleotide encoding it, but is not limited thereto, and various methods well known in the art can be applied. In one example, the anion transport protein may be a protein native to the microorganism to be introduced or a foreign protein.
본 명세서에서, 외래의 단백질 및/또는 유전자 도입은, 상기 단백질 및/또는 유전자가 도입되는 미생물(숙주세포)과 다른 속에 속하는 미생물(숙주세포), 다른 종에 속하는 미생물(숙주세포), 또는 동종의 다른 미생물(숙주세포)에서 유래하는 단백질 및/또는 유전자의 도입을 의미하는 것일 수 있다.In the present specification, introduction of a foreign protein and/or gene refers to a microorganism belonging to a different genus (host cell), a microorganism belonging to a different species (host cell), or the same species as the microorganism into which the protein and/or gene is introduced (host cell). It may mean the introduction of proteins and/or genes derived from other microorganisms (host cells).
상기 음이온 수송 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자는 코리네박테리움 스테이셔니스로부터 유래한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 코리네박테리움 스테이셔니스 유래의 음이온 수송 단백질은 공지의 데이터 베이스인 NCBI에서 그 서열을 얻을 수 있다 (예를 들면 WP_066797267.1 또는 WP_075723752.1). 일 예에서 상기 코리네박테리움 스테이셔니스 유래의 음이온 수송 단백질은 Ncam0154 단백질일 수 있다.The anion transport protein and/or the gene encoding it may be derived from Corynebacterium stasis, but is not limited thereto. The sequence of the anion transport protein derived from Corynebacterium stationanis can be obtained from NCBI, a known database (for example, WP_066797267.1 or WP_075723752.1). In one example, the anion transport protein derived from Corynebacterium stasis may be the Ncam0154 protein.
일 예에서, 상기 코리네박테리움 스테이셔니스 유래의 음이온 수송 단백질은 서열번호 14 또는 서열번호 23의 아미노산 서열을 가지거나, 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다.In one example, the anion transport protein from Corynebacterium stasis has, includes, consists of, or consists essentially of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 23. (essentially consisting of) can.
일 예에서, 상기 음이온 수송 단백질은 서열번호 14 또는 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 97.19% 이상, 97.37% 이상, 97.56% 이상, 97.75% 이상, 97.94% 이상, 98% 이상, 98.12% 이상, 98.31% 이상, 98.50% 이상, 98.69% 이상, 98.87% 이상, 99% 이상, 99.06% 이상, 99.25% 이상, 99.44% 이상, 99.62% 이상, 99.5% 이상, 99.7% 이상, 99.81% 이상 또는 99.9% 이상의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 음이온 수송 단백질 활성을 나타내는 단백질이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 음이온 수송 단백질의 변이체도 상기 음이온 수송 단백질에 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단, C-말단 및/또는 내부에 음이온 수송 단백질 활성을 변경하지 않는 서열 추가 또는 결실, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 잠재성 돌연변이(silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.In one example, the anion transport protein has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 23. % or more, 97.19% or more, 97.37% or more, 97.56% or more, 97.75% or more, 97.94% or more, 98% or more, 98.12% or more, 98.31% or more, 98.50% or more, 98.69% or more, 98.87% or more, 99% or more , contains or consists of an amino acid sequence having 99.06% or more, 99.25% or more, 99.44% or more, 99.62% or more, 99.5% or more, 99.7% or more, 99.81% or more, or 99.9% or more sequence homology or sequence identity. You can. In addition, if a protein has such homology or identity and exhibits anion transport protein activity, a variant of the anion transport protein having an amino acid sequence in which some sequences are deleted, modified, substituted, conservatively substituted, or added may also be included in the anion transport protein. there is. For example, addition or deletion of sequences at the N-terminus, C-terminus and/or within the amino acid sequence that do not alter anion transport protein activity, mutations that may occur naturally, silent mutations or conservative substitutions. This is the case with .
상기 “보존적 치환(conservative substitution)”은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 통상적으로, 보존적 치환은 단백질 또는 폴리펩타이드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.The “conservative substitution” means replacing one amino acid with another amino acid having similar structural and/or chemical properties. These amino acid substitutions may generally occur based on similarities in the polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residues. Typically, conservative substitutions may have little or no effect on the activity of the protein or polypeptide.
상기 음이온 수송 단백질 유전자는 상기 음이온 수송 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 의미할 수 있다. 상기 음이온 수송 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 음이온 수송 단백질의 아미노산 서열, 당업계에 공지된 코돈 정보 및 도입될 호스트 미생물(세포)에서 선호되는 코돈에 기초하여 제조될 수 있으며, 일 예에서 코리네박테리움 스테이셔니스 유래의 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. The anion transport protein gene may refer to a polynucleotide encoding the anion transport protein. The polynucleotide encoding the anion transport protein can be prepared based on the amino acid sequence of the anion transport protein, codon information known in the art, and codons preferred in the host microorganism (cell) to be introduced, and in one example, corynebacterium It may be from Bacterium stasis, but is not limited thereto.
일 예에서, 상기 코리네박테리움 스테이셔니스 유래의 음이온 수송 단백질을 암호화하는(코딩하는) 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 13의 핵산 서열을 가지거나, 포함하거나, 상기 핵산 서열로 이루어지거나, 또는 상기 핵산 서열로 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다.In one example, the polynucleotide encoding (encoding) an anion transport protein derived from Corynebacterium stasis has, includes, consists of, or consists of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 13, or the nucleic acid It may essentially consist of a sequence.
일 예에서, 상기 코리네박테리움 스테이셔니스 유래의 음이온 수송 단백질은 서열번호 13의 핵산 서열을 가지거나, 포함하거나, 상기 핵산 서열로 이루어지거나, 또는 상기 핵산 서열로 필수적으로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.In one example, the anion transport protein derived from Corynebacterium stasis has, includes, consists of, or consists of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 13, or is produced by a polynucleotide consisting essentially of the nucleic acid sequence. It may be coded.
일 예에서, 상기 음이온 수송 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 13의 핵산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 가지는 핵산 서열을 포함하거나 상기 핵산 서열로 이루어진 것일 수 있다.In one example, the polynucleotide encoding the anion transport protein is at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 13. %, 99.5%, 99.7%, or 99.9% or more sequence homology or sequence identity may include or consist of a nucleic acid sequence.
본 출원에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 "특정 핵산 서열(염기서열) 또는 아미노산 서열을 가진다, 포함한다, 상기 서열로 이루어진다, 또는 상기 서열로 필수적으로 이루어진다(essentially consisting of)" 라 함은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 상기 특정 핵산 서열(염기서열) 또는 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 것을 의미할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 범위에서 상기 특정 핵산 서열(염기서열) 또는 아미노산 서열에 변이(결실, 치환, 변형, 및/또는 부가)가 가해진 "실질적으로 동등한 서열"을 포함하는 것(또는 상기 변이를 배제하지 않는 것)으로 해석될 수 있다. 일 예에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 "특정 핵산 서열(염기서열) 또는 아미노산 서열을 가진다, 포함한다, 상기 서열로 이루어진다, 또는 상기 서열로 필수적으로 이루어진다" 라 함은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 (i) 상기 특정 핵산 서열(염기서열) 또는 아미노산 서열을 필수적으로 포함하거나, 또는 (ii) 상기 특정 핵산 서열(염기서열) 또는 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하고 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 것을 의미할 수 있다. 일 예에서, 상기 목적하는 기능은 미생물의 판토텐산 및/또는 판토산 생산능을 증가(향상)시키거나 부여하는 기능을 의미할 수 있다.In the present application, the term "polynucleotide or polypeptide" refers to "having, comprising, consisting of, or consisting essentially of a specific nucleic acid sequence (base sequence) or amino acid sequence". This may mean that a nucleotide or polypeptide essentially includes the specific nucleic acid sequence (base sequence) or amino acid sequence, and the specific nucleic acid sequence (base sequence) or amino acid sequence may be used to It can be interpreted as including (or not excluding) a “substantially equivalent sequence” in which mutations (deletions, substitutions, modifications, and/or additions) are made to the nucleic acid sequence (base sequence) or amino acid sequence. . In one example, a polynucleotide or polypeptide "has, includes, consists of, or consists essentially of a specific nucleic acid sequence (base sequence) or amino acid sequence" means that the polynucleotide or polypeptide is (i) essentially comprising the specific nucleic acid sequence (base sequence) or amino acid sequence, or (ii) at least 70%, 80%, 85%, or 90% of the specific nucleic acid sequence (base sequence) or amino acid sequence. or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 98% or more, 99% or more, 99.5% or more, or 99.9% or more. It may mean that it consists of or essentially includes a nucleic acid sequence or amino acid sequence having homology or identity and maintains its original function and/or desired function. In one example, the desired function may mean a function that increases (improves) or imparts the pantothenic acid and/or pantoic acid production ability of microorganisms.
본 출원에서, ‘상동성(homology)’ 또는 ‘동일성(identity)’은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.In this application, ‘homology’ or ‘identity’ refers to the degree of similarity between two given amino acid sequences or base sequences and can be expressed as a percentage. The terms homology and identity can often be used interchangeably.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오타이드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오타이드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.The sequence homology or identity of a conserved polynucleotide or polypeptide is determined by standard alignment algorithms, and may be used with a default gap penalty established by the program used. Substantially homologous or identical sequences are generally capable of hybridizing to all or part of a sequence under moderate or high stringent conditions. It is obvious that hybridization also includes hybridization of polynucleotides with polynucleotides containing common codons or codons taking codon degeneracy into account.
임의의 두 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.Whether any two polynucleotide or polypeptide sequences have homology, similarity or identity can be determined, for example, by Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: It can be determined using a known computer algorithm such as the "FASTA" program using default parameters as in 2444. Or, as performed in the Needleman program in the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) (version 5.0.0 or later), It can be determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) (GCG program package (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop , [ed.,] Academic Press, San Diego, 1994, and [CARILLO ETA/.] (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073), or BLAST from the National Center for Biotechnology Information Database. ClustalW can be used to determine homology, similarity, or identity.
폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오타이드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스(또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티(또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.Homology, similarity or identity of polynucleotides or polypeptides is defined in, for example, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482, see, for example, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. This can be determined by comparing sequence information using a GAP computer program such as 48:443. In summary, a GAP program can be defined as the number of similarly aligned symbols (i.e. nucleotides or amino acids) divided by the total number of symbols in the shorter of the two sequences. The default parameters for the GAP program are (1) a binary comparison matrix (containing values 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation , pp. 353-358 (1979), Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: Weighted comparison matrix of 6745 (or EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4) permutation matrix); (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional 0.10 penalty for each symbol in each gap (or a gap opening penalty of 10 and a gap extension penalty of 0.5); and (3) no penalty for end gaps.
상기 음이온 수송 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 재조합 벡터를 사용하여 미생물에 도입될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 재조합 벡터는 삽입 벡터 또는 발현 벡터로 사용될 수 있다. 상기 음이온 수송 단백질을 미생물에서 발현시키는 것은, 상기 음이온 수송 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 미생물을 배양하는 것에 의하여 수행될 수 있다.The polynucleotide encoding the anion transport protein can be introduced into a microorganism using a recombinant vector, but is not limited thereto. The recombinant vector can be used as an insertion vector or an expression vector. Expressing the anion transport protein in a microorganism can be performed by culturing a recombinant microorganism containing a polynucleotide encoding the anion transport protein or a recombinant vector containing the same.
상기 음이온 수송 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 미생물로의 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있다. 상기 형질전환 방법은 핵산을 숙주 세포(미생물) 내로 도입하는 어떠한 방법으로도 수행 가능하며, 숙주 세포에 따라 당 분야에서 공지된 형질전환 기술을 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 상기 공지된 형질전환 방법으로 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전법, 염화칼슘 (CaCl2) 침전법, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake), DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 리포펙션(lipofection), 초산 리튬-DMSO법 등이 예시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The introduction of a polynucleotide encoding the anion transport protein or a recombinant vector containing the same into a microorganism can be performed by a person skilled in the art by appropriately selecting a known transformation method. The transformation method can be performed by any method of introducing a nucleic acid into a host cell (microorganism), and can be performed by appropriately selecting transformation techniques known in the art depending on the host cell. The known transformation methods include electroporation, calcium phosphate (CaPO4) precipitation, calcium chloride (CaCl2) precipitation, microinjection, polyethylene glycol (PEG) precipitation (polyethylene glycol-mediated uptake), Examples may include the DEAE-dextran method, cationic liposome method, lipofection, and lithium acetate-DMSO method, but are not limited thereto.
상기 형질전환된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주 세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 그 도입되는 형태는 제한이 없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주 세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및/또는 번역 종결신호 등의 발현 조절 요소를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다. 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 상기 폴리뉴클레오타이드의 전사 조절 (예, 전사 개시)을 수행할 수 있도록 발현조절 요소 (예, 프로모터)와 폴리뉴클레오타이드가 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미할 수 있다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 수행할 수 있다.As long as the transformed polynucleotide can be expressed within the host cell, it may be inserted into and located within the chromosome of the host cell or may be located outside the chromosome. As long as the polynucleotide can be introduced and expressed into a host cell, the form in which it is introduced is not limited. For example, the polynucleotide can be introduced into the host cell in the form of an expression cassette, which is a genetic structure containing all elements necessary for self-expression. The expression cassette may typically include expression control elements such as a promoter, transcription termination signal, ribosome binding site, and/or translation termination signal that are operably linked to the polynucleotide. The expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication. Additionally, the polynucleotide may be introduced into the host cell in its own form and operably linked to a sequence required for expression in the host cell. As used herein, the term "operably linked" may mean that an expression control element (e.g., promoter) and a polynucleotide are functionally connected to perform transcriptional regulation (e.g., transcription initiation) of the polynucleotide. . Operable linkage can be accomplished using genetic recombination techniques known in the art.
본 출원에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 또는 숙주 세포내로 목적 폴리뉴클레오티드를 전달하기 위한 DNA 제조물을 의미한다. 일 예로 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 일례로 목적 폴리뉴클레오티드는 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내로 삽입될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩타이드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.As used in this application, the term “vector” refers to a DNA preparation for delivering a polynucleotide of interest into a suitable host or host cell. As an example, it may include a base sequence of a polynucleotide encoding the target polypeptide operably linked to a suitable expression control region (or expression control sequence) so that the target polypeptide can be expressed in a suitable host. The expression control region may include a promoter capable of initiating transcription, an optional operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation. After transformation into a suitable host cell, the vector can replicate or function independently of the host genome and can be integrated into the genome itself. For example, a polynucleotide of interest can be inserted into a chromosome through a vector for chromosome insertion. Insertion of the polynucleotide into the chromosome may be accomplished by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto. A selection marker may be additionally included to confirm whether the chromosome has been inserted. The selection marker is used to select cells transformed with a vector, that is, to confirm the insertion of the target nucleic acid molecule, and is used to determine selectable phenotypes such as drug resistance, auxotrophy, resistance to cytotoxic agents, or expression of surface polypeptides. Markers that give may be used. In an environment treated with a selective agent, only cells expressing the selection marker survive or show other expression traits, so transformed cells can be selected.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pDC계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 일 예로, pDZ, pDC, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.The vector used in this application is not particularly limited, and any vector known in the art can be used. Examples of commonly used vectors include plasmids, cosmids, viruses, and bacteriophages in a natural or recombinant state. For example, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, and Charon21A can be used as phage vectors or cosmid vectors, and pDZ-, pDC-, and pBR-based plasmid vectors can be used. , pUC-based, pBluescriptII-based, pGEM-based, pTZ-based, pCL-based, pET-based, etc. can be used. For example, pDZ, pDC, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vector, etc. can be used.
본 출원에서 용어, 폴리펩타이드 활성의 “강화”는, 폴리펩타이드의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 강화는 활성화(activation), 상향조절(up-regulation), 과발현(overexpression), 증가(increase) 등의 용어와 혼용될 수 있다. 여기서 활성화, 강화, 상향조절, 과발현, 증가는 본래 가지고 있지 않았던 활성을 나타내게 되는 것, 또는 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타내게 되는 것을 모두 포함할 수 있다. 상기 “내재적 활성”은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩타이드의 활성을 의미한다. 이는 “변형 전 활성”과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩타이드의 활성이 내재적 활성에 비하여 “강화”, “상향조절”, “과발현” 또는 “증가”한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩타이드의 활성 및/또는 농도(발현량)에 비하여 향상된 것을 의미한다. In this application, the term “enhancement” of polypeptide activity means that the activity of the polypeptide is increased compared to the intrinsic activity. The enhancement may be used interchangeably with terms such as activation, up-regulation, overexpression, and increase. Here, activation, enhancement, upregulation, overexpression, and increase may include showing an activity that it did not originally have, or showing improved activity compared to the intrinsic activity or activity before modification. The “intrinsic activity” refers to the activity of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain or unmodified microorganism before the change in trait when the trait changes due to genetic mutation caused by natural or artificial factors. This can be used interchangeably with “activity before modification.” “Enhanced,” “upregulated,” “overexpressed,” or “increased” in the activity of a polypeptide compared to its intrinsic activity means that the activity and/or concentration of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain or unmodified microorganism before the transformation. It means improved compared to (expression amount).
상기 강화는 외래의 폴리펩타이드를 도입하거나, 내재적인 폴리펩타이드의 활성 강화 및/또는 농도(발현량) 증가를 통해 달성할 수 있다. 상기 폴리펩타이드의 활성의 강화 여부는 해당 폴리펩타이드의 활성 정도, 발현량 또는 해당 폴리펩타이드 활성에 의한 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.The enhancement can be achieved by introducing an exogenous polypeptide, enhancing the activity and/or increasing the concentration (expression amount) of the intrinsic polypeptide. Whether the activity of the polypeptide is enhanced can be confirmed from the level of activity of the polypeptide, the expression level, or an increase in the amount of products due to the activity of the polypeptide.
상기 폴리펩타이드의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 폴리펩타이드의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 구체적으로, 분자생물학의 일상적 방법인 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 유전자 공학 및/또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다(예컨대, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).Enhancement of the activity of the polypeptide can be done by applying various methods well known in the art, and is not limited as long as the activity of the target polypeptide can be enhanced compared to that of the microorganism before modification. Specifically, genetic engineering and/or protein engineering well known to those skilled in the art, which are routine methods of molecular biology, may be used, but are not limited thereto (e.g., Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology 2010, Vol. 2. 1-16, Molecular Cloning 2012, etc.
구체적으로, 본 출원의 폴리펩타이드의 강화는Specifically, the reinforcement of the polypeptide of the present application is
1) 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가; 1) Increased intracellular copy number of the polynucleotide encoding the polypeptide;
2) 폴리펩타이드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역을 활성이 강력한 서열로 교체; 2) Replacement of the gene expression control region on the chromosome encoding the polypeptide with a highly active sequence;
3) 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형; 3) Modification of the base sequence encoding the start codon or 5'-UTR region of the gene transcript encoding the polypeptide;
4) 폴리펩타이드 활성이 강화되도록 상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 변형;4) modification of the amino acid sequence of the polypeptide to enhance polypeptide activity;
5) 폴리펩타이드 활성이 강화도록 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩타이드의 활성이 강화되도록 변형된 폴리펩타이드를 코딩하도록 상기 폴리펩타이드 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형);5) modification of the polynucleotide sequence encoding the polypeptide to enhance the polypeptide activity (e.g., modification of the polynucleotide sequence of the polypeptide gene to encode a polypeptide modified to enhance the activity of the polypeptide);
6) 폴리펩타이드의 활성을 나타내는 외래 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입; 6) Introduction of a foreign polypeptide exhibiting the activity of the polypeptide or a foreign polynucleotide encoding the same;
7) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화; 7) Codon optimization of the polynucleotide encoding the polypeptide;
8) 폴리펩타이드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식; 또는8) Analyzing the tertiary structure of the polypeptide, select exposed sites and modify or chemically modify them; or
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.9) It may be a combination of two or more selected from 1) to 8) above, but is not particularly limited.
보다 구체적으로,More specifically,
상기 1) 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가는, 해당 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터의 숙주세포 내로의 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 또는, 해당 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내의 염색체 내에 1 카피 또는 2 카피 이상 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 상기 염색체 내에 도입은 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 전술한 바와 같다.1) The increase in the intracellular copy number of the polynucleotide encoding the polypeptide is due to the introduction into the host cell of a vector capable of replicating and functioning independently of the host to which the polynucleotide encoding the polypeptide is operably linked. It may be achieved by Alternatively, this may be achieved by introducing one or more copies of the polynucleotide encoding the polypeptide into the chromosome of the host cell. The introduction into the chromosome may be performed by introducing a vector capable of inserting the polynucleotide into the chromosome of the host cell into the host cell, but is not limited to this. The vector is the same as described above.
상기 2) 폴리펩타이드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역(또는 발현조절서열)을 활성이 강력한 서열로 교체는, 예를 들면, 상기 발현조절영역의 활성을 더욱 강화하도록 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 가지는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 그리고 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 일 예로, 본래의 프로모터를 강력한 프로모터로 교체시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.2) Replacement of the gene expression control region (or expression control sequence) on the chromosome encoding the polypeptide with a highly active sequence, for example, deletion, insertion, or non-conservative use to further enhance the activity of the expression control region. Alternatively, it may be a mutation in the sequence due to conservative substitution or a combination thereof, or replacement with a sequence with stronger activity. The expression control region is not particularly limited thereto, but may include a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence that regulates the termination of transcription and translation. As an example, the original promoter may be replaced with a strong promoter, but the method is not limited thereto.
공지된 강력한 프로모터의 예에는 CJ1 내지 CJ7 프로모터(미국등록특허 US 7662943 B2), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터(미국등록특허 US 10584338 B2), O2 프로모터(미국등록특허 US 10273491 B2), tkt 프로모터, yccA 프로모터 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.Examples of known strong promoters include CJ1 to CJ7 promoters (US Patent US 7662943 B2), lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lambda phage PR promoter, PL promoter, tet promoter, gapA promoter, SPL7 promoter, SPL13. (sm3) promoter (US Patent US 10584338 B2), O2 promoter (US Patent US 10273491 B2), tkt promoter, yccA promoter, etc., but is not limited thereto.
상기 3) 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩타이드 발현율이 더 높은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기 서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.3) The base sequence modification encoding the start codon or 5'-UTR region of the gene transcript encoding the polypeptide is, for example, a base encoding another start codon with a higher polypeptide expression rate than the internal start codon. It may be a substitution by sequence, but is not limited thereto.
상기 4) 및 5)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 폴리펩타이드의 활성을 강화하도록 상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 증가하도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 염색체내로 삽입함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다.The modification of the amino acid sequence or polynucleotide sequence of 4) and 5) includes deletion, insertion, non-conservative or conservative amino acid sequence of the polypeptide or polynucleotide sequence encoding the polypeptide to enhance the activity of the polypeptide. It may be a mutation in the sequence due to a substitution or a combination thereof, or a replacement with an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have stronger activity, or an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to increase activity, but is limited thereto. no. The replacement may be specifically performed by inserting a polynucleotide into a chromosome by homologous recombination, but is not limited thereto. The vector used at this time may additionally include a selection marker to check whether chromosome insertion has occurred.
상기 6) 폴리펩타이드의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 상기 폴리펩타이드와 동일/유사한 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 숙주세포 내 도입일 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩타이드와 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한이 없다. 상기 도입에 이용되는 방법은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 폴리펩타이드가 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.6) Introduction of a foreign polynucleotide showing the activity of the polypeptide may be introduction into the host cell of a foreign polynucleotide encoding a polypeptide showing the same/similar activity as the polypeptide. There are no restrictions on the origin or sequence of the foreign polynucleotide as long as it exhibits the same/similar activity as the polypeptide. The method used for the introduction can be performed by appropriately selecting a known transformation method by a person skilled in the art, and by expressing the introduced polynucleotide in the host cell, a polypeptide can be produced and its activity can be increased.
상기 7) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화는, 내재 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 전사 또는 번역이 증가하도록 코돈 최적화한 것이거나, 또는 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화한 것일 수 있다.7) Codon optimization of the polynucleotide encoding the polypeptide is codon optimization of the native polynucleotide to increase transcription or translation within the host cell, or codon optimization of the foreign polynucleotide to increase transcription or translation within the host cell. The codon may have been optimized to achieve this.
상기 8) 폴리펩타이드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 것은, 예를 들어 분석하고자 하는 폴리펩타이드의 서열정보를 기지 단백질들의 서열정보가 저장된 데이터베이스와 비교함으로써 서열의 유사성 정도에 따라 주형 단백질 후보를 결정하고 이를 토대로 구조를 확인하여, 변형하거나 화학적으로 수식할 노출 부위를 선택하여 변형 또는 수식하는 것일 수 있다.Above 8) Analyzing the tertiary structure of a polypeptide and selecting exposed sites to modify or chemically modify the sequence information, for example, by comparing the sequence information of the polypeptide to be analyzed with a database storing the sequence information of known proteins to determine sequence similarity. Depending on the degree, a template protein candidate may be determined, the structure may be confirmed based on this, and an exposed site to be modified or chemically modified may be selected and modified or modified.
이와 같은 폴리펩타이드 활성의 강화는, 상응하는 폴리펩타이드의 활성 또는 농도 발현량이 야생형이나 변형 전 미생물 균주에서 발현된 폴리펩타이드의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 폴리펩타이드로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Such enhancement of polypeptide activity means that the activity or concentration of the corresponding polypeptide is increased based on the activity or concentration of the polypeptide expressed in the wild type or unmodified microbial strain, or the amount of product produced from the polypeptide is increased. may be increased, but is not limited to this.
본 출원에서 용어, 폴리펩타이드의 “약화”는 내재적 활성에 비하여 활성이 감소되거나 또는 활성이 없는 것을 모두 포함하는 개념이다. 상기 약화는 불활성화(inactivation), 결핍(deficiency), 하향조절(down-regulation), 감소(decrease), 저하(reduce), 감쇠(attenuation) 등의 용어와 혼용될 수 있다.In this application, the term “weakening” of a polypeptide is a concept that includes both reduced activity or no activity compared to the intrinsic activity. The attenuation may be used interchangeably with terms such as inactivation, deficiency, down-regulation, decrease, reduce, and attenuation.
상기 약화는 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 변이 등으로 폴리펩타이드 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 폴리펩타이드의 활성에 비해 감소 또는 제거된 경우, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 유전자의 발현 저해 또는 폴리펩타이드로의 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 폴리펩타이드 활성 정도 및/또는 농도(발현량)가 천연형 균주에 비하여 낮은 경우, 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현이 전혀 이루어지지 않은 경우, 및/또는 폴리뉴클레오타이드의 발현이 되더라도 폴리펩타이드의 활성이 없는 경우 역시 포함할 수 있다. 상기 “내재적 활성”은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주, 야생형 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩타이드의 활성을 의미한다. 이는 “변형 전 활성”과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩타이드의 활성이 내재적 활성에 비하여 “불활성화, 결핍, 감소, 하향조절, 저하, 감쇠”한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩타이드의 활성에 비하여 낮아진 것을 의미한다. The weakening occurs when the activity of the polypeptide itself is reduced or eliminated compared to the activity of the polypeptide originally possessed by the microorganism due to mutation of the polynucleotide encoding the polypeptide, inhibition of expression of the gene of the polynucleotide encoding the polypeptide, or polypeptide When the overall polypeptide activity level and/or concentration (expression level) in the cell is lower than that of the native strain due to inhibition of translation into peptide, etc., when the polynucleotide is not expressed at all, and/or Even if the polynucleotide is expressed, the case where the polypeptide is not active may also be included. The “intrinsic activity” refers to the activity of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain, wild type, or unmodified microorganism before the change in trait when the trait changes due to genetic mutation caused by natural or artificial factors. This can be used interchangeably with “activity before modification.” The fact that the activity of a polypeptide is “inactivated, deficient, reduced, down-regulated, lowered, or attenuated” compared to the intrinsic activity means that the activity of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain or unmodified microorganism before the transformation was lowered. do.
이러한 폴리펩타이드의 활성의 약화는, 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 수행될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니며, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다(예컨대, Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).Attenuation of the activity of such a polypeptide may be performed by any method known in the art, but is not limited thereto, and may be achieved by applying various methods well known in the art (e.g., Nakashima N et al. , Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Molecular Cloning 2012, etc.
구체적으로, 폴리펩타이드의 약화는Specifically, the weakening of the polypeptide
1) 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 전체 또는 일부의 결손;1) Deletion of all or part of the gene encoding the polypeptide;
2) 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형;2) Modification of the expression control region (or expression control sequence) to reduce the expression of the gene encoding the polypeptide;
3) 폴리펩타이드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩타이드를 구성하는 아미노산 서열의 변형(예컨대, 아미노산 서열 상의 1 이상의 아미노산의 삭제/치환/부가);3) modification of the amino acid sequence constituting the polypeptide (e.g., deletion/substitution/addition of one or more amino acids on the amino acid sequence) such that the activity of the polypeptide is eliminated or weakened;
4) 폴리펩타이드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 서열의 변형(예를 들어, 폴리펩타이드의 활성이 제거 또는 약화되도록 변형된 폴리펩타이드를 코딩하도록 상기 폴리펩타이드 유전자의 핵산 염기 서열 상의 1 이상의 핵산염기의 삭제/치환/부가);4) Modification of the gene sequence encoding the polypeptide so that the activity of the polypeptide is removed or weakened (e.g., the nucleic acid base sequence of the polypeptide gene to encode a polypeptide modified to eliminate or weaken the activity of the polypeptide) deletion/substitution/addition of one or more nucleotide bases);
5) 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;5) Modification of the base sequence encoding the start codon or 5'-UTR region of the gene transcript encoding the polypeptide;
6) 폴리펩타이드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입;6) Introduction of an antisense oligonucleotide (eg, antisense RNA) that binds complementary to the transcript of the gene encoding the polypeptide;
7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가;7) Addition of a sequence complementary to the Shine-Dalgarno sequence in front of the Shine-Dalgarno sequence of the gene encoding the polypeptide to form a secondary structure to which ribosome attachment is impossible;
8) 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE); 또는8) Addition of a promoter transcribed in the opposite direction to the 3' end of the open reading frame (ORF) of the gene sequence encoding the polypeptide (reverse transcription engineering, RTE); or
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.9) It may be a combination of two or more selected from 1) to 8) above, but is not particularly limited.
예컨대, for example,
상기 1) 폴리펩타이드를 코딩하는 상기 유전자 일부 또는 전체의 결손은, 염색체 내 내재적 목적 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 전체의 제거, 일부 뉴클레오타이드가 결실된 폴리뉴클레오타이드로의 교체 또는 마커 유전자로 교체일 수 있다.1) Deletion of part or all of the gene encoding the polypeptide may be removal of the entire polynucleotide encoding the target polypeptide endogenous in the chromosome, replacement with a polynucleotide in which some nucleotides have been deleted, or replacement with a marker gene. .
또한, 상기 2) 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형은, 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절영역(또는 발현조절서열) 상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, the above 2) modification of the expression control region (or expression control sequence) is a mutation in the expression control region (or expression control sequence) caused by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof, or a weaker mutation. It may be replacement with an active sequence. The expression control region includes, but is not limited to, a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence that regulates the termination of transcription and translation.
또한, 상기 3) 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩타이드 발현율이 더 낮은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In addition, 3) the base sequence modification encoding the start codon or 5'-UTR region of the gene transcript encoding the polypeptide, for example, encodes another start codon with a lower polypeptide expression rate compared to the internal start codon. It may be a substitution with a base sequence, but is not limited thereto.
또한, 상기 4) 및 5)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열의 변형은 폴리펩타이드의 활성을 약화하도록 상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 활성이 없도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드 서열 내 변이를 도입하여 종결 코돈(stop codon)을 형성시킴으로써, 유전자의 발현을 저해하거나 약화시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 "종결 코돈(stop codon)"은 mRNA 상의 코돈 중 아미노산을 지정하지 않고 단백질 합성 과정이 끝났음을 알리는 신호로 작용하는 코돈으로, 일반적으로 UAA, UAG, UGA의 3가지가 종결코돈으로 사용될 수 있다. In addition, the modification of the amino acid sequence or polynucleotide sequence of 4) and 5) may include deletion, insertion, non-conservative or non-conservative modification of the amino acid sequence of the polypeptide or the polynucleotide sequence encoding the polypeptide to weaken the activity of the polypeptide. It may be a mutation in the sequence due to conservative substitution or a combination thereof, or a replacement with an amino acid sequence or polynucleotide sequence that has been improved to have weaker activity, or an amino acid sequence or polynucleotide sequence that has been improved to have no activity, but is limited thereto. no. For example, gene expression can be inhibited or weakened by introducing mutations in the polynucleotide sequence to form a stop codon, but is not limited to this. The "stop codon" is a codon that acts as a signal to signal the end of the protein synthesis process without specifying an amino acid among codons on mRNA. Generally, three types of stop codons, UAA, UAG, and UGA, can be used. .
상기 6) 폴리펩타이드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입은 예를 들어 문헌 [Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986]을 참고할 수 있다.6) Introduction of an antisense oligonucleotide (e.g., antisense RNA) that binds complementary to the transcript of the gene encoding the polypeptide is described, for example, in Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a molecule. tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986].
상기 7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가는 mRNA 번역을 불가능하게 하거나 속도를 저하시키는 것일 수 있다.7) In order to form a secondary structure to which ribosomes cannot attach, the addition of a sequence complementary to the Shine-Dalgarno sequence in front of the Shine-Dalgarno sequence of the gene encoding the polypeptide is mRNA. This may make translation impossible or slow it down.
상기 8) 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE)는 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자의 전사체에 상보적인 안티센스 뉴클레오타이드를 만들어 활성을 약화하는 것일 수 있다.8) The addition of a promoter transcribed in the opposite direction (Reverse transcription engineering, RTE) to the 3' end of the ORF (open reading frame) of the gene sequence encoding the polypeptide is complementary to the transcript of the gene encoding the polypeptide. It may be that the activity is weakened by creating antisense nucleotides.
본 출원의 미생물은 음이온 수송 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 활성이 강화되도록 벡터를 통해 유전적으로 변형된 미생물(예컨대, 재조합 미생물)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 전술한 바와 같다.The microorganism of the present application may be a microorganism (e.g., a recombinant microorganism) that has been genetically modified through a vector to enhance the activity of the anion transport protein or the gene encoding it, but is not limited thereto. The vector is the same as described above.
본 출원에서 용어, "미생물(또는, 균주)"은 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함할 수 있다. 상기 미생물은 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 약화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 강화되거나 약화된 미생물로서, 목적하는 폴리펩타이드, 단백질 또는 산물(예컨대, 판토텐산 및/또는 판토산)의 생산을 위한 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다.In this application, the term “microorganism (or strain)” may include both wild-type microorganisms and microorganisms that have undergone natural or artificial genetic modification. The microorganism is a microorganism in which a specific mechanism is strengthened or weakened due to reasons such as insertion of an external gene or strengthening or weakening of the activity of an intrinsic gene, and the desired polypeptide, protein, or product (e.g., pantothenic acid and/or pantoic acid) It may be a microorganism containing genetic modification for the production of.
본 출원의 미생물(또는 균주, 재조합 세포)은 판토텐산 및/또는 판토산 생산능(또는 생산량)을 가지거나, 판토텐산 및/또는 판토산 생산능이 향상(또는 증가)된 미생물일 수 있다.The microorganism (or strain, recombinant cell) of the present application may be a microorganism that has the ability to produce (or produce) pantothenic acid and/or pantoic acid, or may have an improved (or increased) ability to produce pantothenic acid and/or pantoic acid.
본 출원의 미생물은 자연적으로 판토텐산 및/또는 판토산 생산능이 없는 미생물, 또는 판토텐산 및/또는 판토산 생산능을 가지고 있는 미생물에 음이온 수송 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자가 도입되거나, 또는 강화되어 판토텐산 및/또는 판토산 생산능이 부여되거나, 또는 향상된 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 판토텐산 및/또는 판토산 생산능이 부여되거나 향상된 미생물은 음이온 수송 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자가 도입된 미생물일 수 있다.The microorganism of the present application is a microorganism that does not naturally have the ability to produce pantothenic acid and/or pantoic acid, or an anion transport protein or a gene encoding the same is introduced into a microorganism that has the ability to produce pantothenic acid and/or pantoic acid, or is enhanced to produce pantothenic acid and/or Alternatively, it may be a microorganism endowed with or improved in the ability to produce pantoic acid, but is not limited thereto. The microorganism endowed or improved with pantothenic acid and/or pantoic acid production ability may be a microorganism into which an anion transport protein or a gene encoding the same has been introduced.
상기 미생물이 판토텐산 및/또는 판토산 생산능이 증가(향상)되거나 판토텐산 및/또는 판토산 생산능을 갖는다는 것은 상기 미생물이 비변형 미생물, 재조합 전의 세포, 모균주, 야생형 균주, 및/또는 다른 미생물 유래의 음이온 수송 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자가 도입된 미생물보다 판토텐산 및/또는 판토산 생산능이 향상되거나, 판토텐산 및/또는 판토산 생산능이 없는 비변형 미생물, 재조합 전의 세포, 모균주 및/또는 야생형 균주와는 달리 판토텐산 및/또는 판토산 생산능이 부여된 것을 의미할 수 있다. That the microorganism has an increased (improved) ability to produce pantothenic acid and/or pantoic acid or has the ability to produce pantothenic acid and/or pantoic acid means that the microorganism is an unmodified microorganism, a cell before recombination, a parent strain, a wild-type strain, and/or another microorganism. Unmodified microorganisms with improved pantothenic acid and/or pantoic acid production ability or no pantothenic acid and/or pantoic acid production ability, cells before recombination, parent strain and/or wild type strain than microorganisms into which the derived anion transport protein or the gene encoding the same has been introduced. Unlike, it may mean that the ability to produce pantothenic acid and/or pantoic acid is granted.
일 양상은 음이온 수송 단백질의 활성이 강화된, 판토텐산 또는 판토산을 생산하는 미생물을 제공한다.One aspect provides pantothenic acid or a microorganism producing pantoic acid with enhanced activity of an anion transport protein.
일 예에 따른 음이온 수송 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자가 도입되거나 이의 활성이 강화된 미생물은 도입 전 미생물 또는 강화 전 미생물, 즉 동종의 비변형 미생물과 비교하여, 판토텐산 및/또는 판토산 생산능이 향상된 것일 수 있다. 본 출원에서, "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 야생형 균주 또는 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 비변형 미생물은 일 예에 따라 음이온 수송 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자가 도입되지 않거나, 이의 활성이 강화되지 않거나, 이의 활성이 강화되기 전의 균주를 의미할 수 있다. 상기 "비변형 미생물"은 “변형 전 균주”, “변형 전 미생물”, “비변이 균주”, “비변형 균주”, “비변이 미생물” 또는 “기준 미생물”과 혼용될 수 있다. 상기 음이온 수송 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 활성이 강화된다는 것은 전술한 바와 같다. According to one example, a microorganism in which an anion transport protein or a gene encoding it is introduced or its activity is enhanced has an improved ability to produce pantothenic acid and/or pantoic acid compared to a microorganism before introduction or a microorganism before enhancement, that is, an unmodified microorganism of the same type. You can. In this application, “unmodified microorganism” does not exclude strains containing mutations that may occur naturally in microorganisms, and is a wild-type strain or a natural strain itself, or whose characteristics change due to genetic mutation caused by natural or artificial factors. It may refer to a strain before becoming a strain. For example, the unmodified microorganism may refer to a strain in which an anion transport protein or a gene encoding the same is not introduced, its activity is not enhanced, or its activity is not enhanced. The “non-modified microorganism” may be used interchangeably with “pre-transformed strain”, “pre-transformed microorganism”, “non-mutated strain”, “non-modified strain”, “non-mutated microorganism” or “reference microorganism”. As described above, the activity of the anion transport protein or the gene encoding it is enhanced.
일 예에 따른 음이온 수송 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자가 도입되거나 이의 활성이 강화된 미생물에서 음이온 수송 단백질은 코리네박테리움 스테이셔니스 유래의 것일 수 있으나 동일한 활성을 나타내는 한 이에 제한되지 않는다. 상기 음이온 수송 단백질은 앞에서 설명한 바와 같다.In one example, in a microorganism into which an anion transport protein or a gene encoding the same is introduced or its activity is enhanced, the anion transport protein may be derived from Corynebacterium stasis, but is not limited thereto as long as it exhibits the same activity. The anion transport protein is the same as previously described.
일 예에서, 상기 미생물은 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 추가로 강화된 미생물일 수 있다. In one example, the microorganism may be a microorganism with additionally enhanced activity of 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase.
일 예에서 상기 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제는 대장균으로부터 유래한 것일 수 있다.In one example, the 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase may be derived from E. coli.
일 예에서, 상기 미생물은 외래의 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 또는 이를 암호화하는 유전자가 도입된 미생물일 수 있다.In one example, the microorganism may be a microorganism into which an exogenous 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase or a gene encoding the same has been introduced.
일 예에서, 상기 미생물은 대장균 유래의 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 또는 이를 암호화하는 유전자가 도입된 미생물일 수 있다.In one example, the microorganism may be a microorganism into which 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase derived from E. coli or a gene encoding the same has been introduced.
상기 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제는 panB 단백질일 수 있다.The 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase may be the panB protein.
일 예에서 상기 판토텐산 및/또는 판토산 생산능의 증가 여부를 비교하는 대상 균주는 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주 또는 상기 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 미생물(예컨대, 코리네박테리움 속 미생물, 코리네박테리움 글루타미쿰, 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.In one example, the target strain to compare whether the pantothenic acid and/or pantoic acid production ability is increased is the wild-type Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain or the 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase. It may be a microorganism with enhanced activity (e.g., a microorganism of the genus Corynebacterium, Corynebacterium glutamicum, or Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain), but is not limited thereto.
상기 미생물은 추가적으로 판토텐산 및/또는 판토산 생산이 증가되도록 하는 변이를 포함할 수 있고, 상기 변이의 위치 및/또는 변이 대상이 되는 유전자 및/또는 단백질의 종류는 판토텐산 및/또는 판토산 생산이 증가되도록 하는 것이면 제한 없이 포함될 수 있다. 상기 재조합 세포는 형질전환이 가능한 세포라면 제한 없이 사용할 수 있다.The microorganism may additionally contain a mutation that increases pantothenic acid and/or pantoic acid production, and the location of the mutation and/or the type of gene and/or protein subject to the mutation increase pantothenic acid and/or pantoic acid production. If possible, it can be included without limitation. The recombinant cells can be used without limitation as long as they are cells capable of transformation.
상기 미생물은, 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.) 미생물일 수 있다. 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 스테이셔니스 (Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스 (Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티 (Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스 (Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내 (Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 싱굴라레 (Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스 (Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼 (Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 폴루티솔리 (Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스 (Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스 (Corynebacterium testudinoris), 및 코리네박테리움 플라베스센스 (Corynebacterium flavescens)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The microorganism may be a Corynebacterium sp. microorganism. The microorganisms in the Corynebacterium genus include Corynebacterium stationis, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis, and Corynebacterium deser. Corynebacterium deserti, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium callunae, Corynebacterium singulare, Corynebacterium halotolerans ), Corynebacterium striatum, Corynebacterium pollutisoli, Corynebacterium imitans, Corynebacterium testudinoris, and It may be one or more types of microorganisms selected from the group consisting of Corynebacterium flavescens, but is not limited thereto.
일 예로, 상기 판토텐산 및/또는 판토산 생산능이 향상된 미생물은 변이 전 모균주, 비변형 미생물, 또는 다른 미생물 유래의 음이온 수송 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자가 도입된 미생물과 비교하여, 판토텐산 및/또는 판토산 생산능이 새롭게 부여되거나, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 100% 이상, 약 150% 이상, 약 200% 이상, 약 250% 이상, 약 300% 이상, 약 400% 이상, 약 500% 이상, 약 600% 이상, 약 700% 이상, 약 800% 이상, 약 900% 이상, 약 1,000% 이상, 약 1,500% 이상, 약 2,000% 이상, 약 2,500% 이상, 또는 약 3,000% 이상 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.As an example, the microorganism with improved pantothenic acid and/or pantoic acid production ability is compared to the parent strain before mutation, an unmodified microorganism, or a microorganism into which an anion transport protein from another microorganism or a gene encoding the same has been introduced. Local production capacity is newly granted, or about 10% or more, about 20% or more, about 30% or more, about 40% or more, about 50% or more, about 60% or more, about 70% or more, about 80% or more, about 90% or more. or more, about 100% or more, about 150% or more, about 200% or more, about 250% or more, about 300% or more, about 400% or more, about 500% or more, about 600% or more, about 700% or more, about 800% or more It may be an increase of about 900% or more, about 1,000% or more, about 1,500% or more, about 2,000% or more, about 2,500% or more, or about 3,000% or more, but is not limited thereto.
다른 예로, 상기 판토텐산 및/또는 판토산 생산능이 향상된 미생물은 변이 전 모균주, 비변형 미생물, 또는 다른 미생물 유래의 음이온 수송 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자가 도입된 미생물과 비교하여, 판토텐산 및/또는 판토산 생산능이 약 1.1배 이상, 약 1.2배 이상, 약 1.3배 이상, 약 1.4배 이상, 약 1.5배 이상, 약 1.6배 이상, 약 1.7배 이상, 약 1.8배 이상, 약 1.9배 이상, 약 2배 이상, 약 2.5배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 약 10배 이상, 약 15배 이상, 약 20배 이상, 약 25배 이상, 또는 약 30배 이상(상한값은 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 약 1,000배 이하일 수 있음)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In another example, the microorganism with improved pantothenic acid and/or pantoic acid production ability is compared to the parent strain before mutation, an unmodified microorganism, or a microorganism into which an anion transport protein derived from another microorganism or a gene encoding the same has been introduced. Local production capacity is about 1.1 times more, about 1.2 times more, about 1.3 times more, about 1.4 times more, about 1.5 times more, about 1.6 times more, about 1.7 times more, about 1.8 times more, about 1.9 times more, about 2 times more. More than twice, about 2.5 times more, about 3 times more, about 4 times more, about 5 times more, about 6 times more, about 7 times more, about 8 times more, about 9 times more, about 10 times more, about 15 times more It may be 2 times or more, about 20 times more, about 25 times more, or about 30 times more (the upper limit is not particularly limited, for example, may be about 1,000 times or less), but is not limited thereto.
다른 예로, 상기 판토텐산 및/또는 판토산 생산능이 향상된 미생물은 변이 전 모균주, 비변형 미생물, 또는 다른 미생물 유래의 음이온 수송 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자가 도입된 미생물과 비교하여, 판토텐산 및/또는 판토산 생산능이 약 0.1 g/L 이상, 약 0.2 g/L 이상, 약 0.3 g/L 이상, 약 0.4 g/L 이상, 약 0.5g/L 이상, 약 0.6 g/L 이상, 약 0.7 g/L 이상, 약 0.8 g/L 이상, 약 0.9 g/L 이상, 약 1g/L 이상, 약 1.1 g/L 이상, 약 1.2 g/L 이상, 약 1.3 g/L 이상, 약 1.4 g/L 이상, 약 1.5g/L 이상, 약 1.6 g/L 이상, 약 1.7 g/L 이상, 약 1.8 g/L 이상, 약 1.9 g/L 이상, 약 2.0g/L 이상, 약 2.5g/L 이상, 약 3g/L 이상, 약 3.5g/L 이상, 약 4g/L 이상, 약 4.1g/L 이상, 약 4.2 g/L 이상, 약 4.3 g/L 이상, 약 4.4 g/L 이상, 약 4.5g/L 이상, 약 4.6 g/L 이상, 약 4.7 g/L 이상, 약 4.8 g/L 이상, 약 4.9 g/L 이상, 약 5g/L 이상, 약 5.5g/L 이상, 약 6g/L 이상, 약 7g/L 이상, 약 8g/L 이상, 약 9g/L 이상, 약 10g/L 이상, 약 15g/L 이상, 약 20g/L 이상, 약 25g/L 이상, 약 30g/L 이상(상한값은 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 약 100g/L 이하일 수 있음)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In another example, the microorganism with improved pantothenic acid and/or pantoic acid production ability is compared to the parent strain before mutation, an unmodified microorganism, or a microorganism into which an anion transport protein derived from another microorganism or a gene encoding the same has been introduced. Local production capacity is about 0.1 g/L or more, about 0.2 g/L or more, about 0.3 g/L or more, about 0.4 g/L or more, about 0.5 g/L or more, about 0.6 g/L or more, about 0.7 g/L or more, about 0.8 g/L or more, about 0.9 g/L or more, about 1 g/L or more, about 1.1 g/L or more, about 1.2 g/L or more, about 1.3 g/L or more, about 1.4 g/L or more, About 1.5 g/L or more, about 1.6 g/L or more, about 1.7 g/L or more, about 1.8 g/L or more, about 1.9 g/L or more, about 2.0 g/L or more, about 2.5 g/L or more, about 3 g/L or more, about 3.5 g/L or more, about 4 g/L or more, about 4.1 g/L or more, about 4.2 g/L or more, about 4.3 g/L or more, about 4.4 g/L or more, about 4.5 g/ L or more, about 4.6 g/L or more, about 4.7 g/L or more, about 4.8 g/L or more, about 4.9 g/L or more, about 5 g/L or more, about 5.5 g/L or more, about 6 g/L or more, About 7g/L or more, about 8g/L or more, about 9g/L or more, about 10g/L or more, about 15g/L or more, about 20g/L or more, about 25g/L or more, about 30g/L or more (the upper limit is There is no particular limitation, for example, it may be about 100 g/L or less), but it is not limited thereto.
상기 용어 “약(about)”은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.The term “about” is a range that includes ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1, etc., and includes all values in a range that are equivalent or similar to the value that appears after the term “about.” Not limited.
또 다른 양상은 본 출원의 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 판토텐산 및/또는 판토산의 생산방법 (또는 제조방법)을 제공한다.Another aspect provides a method for producing (or producing) pantothenic acid and/or pantoic acid, comprising culturing the microorganism of the present application in a medium.
본 출원의 판토텐산 및/또는 판토산의 생산방법은 본 출원의 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.The method for producing pantothenic acid and/or pantoic acid of the present application may include culturing the microorganism of the present application in a medium.
본 출원에서, "배양"은 본 출원의 음이온 수송 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자가 도입되거나 이의 활성이 강화된 미생물, 예컨대 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present application, “cultivation” means growing a microorganism into which the anion transport protein of the present application or the gene encoding the same is introduced or the activity of which is enhanced, such as a Corynebacterium glutamicum strain, under appropriately controlled environmental conditions. . The culture process of the present application can be carried out according to appropriate media and culture conditions known in the art. This culture process can be easily adjusted and used by a person skilled in the art depending on the strain selected. Specifically, the culture may be batch, continuous, and/or fed-batch, but is not limited thereto.
본 출원에서, "배지"는 본 출원의 음이온 수송 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자가 도입되거나 이의 활성이 강화된 미생물, 예컨대 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다. In the present application, "medium" is mainly composed of nutrients necessary for culturing microorganisms into which the anion transport protein of the present application or the gene encoding it has been introduced or whose activity has been enhanced, such as Corynebacterium glutamicum strain. It refers to mixed substances and supplies water, nutrients and growth factors that are essential for survival and development. Specifically, the medium and other culture conditions used for cultivating the microorganisms of the present application can be any medium used for cultivating ordinary microorganisms without particular restrictions, but the microorganisms of the present application can be grown with an appropriate carbon source, nitrogen source, personnel, and inorganic substances. It can be cultured under aerobic conditions in a typical medium containing compounds, amino acids, and/or vitamins while controlling temperature, pH, etc.
구체적으로, 본 출원의 미생물, 예컨대 코리네박테리움 속 균주에 대한 배양 배지는 문헌["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.Corynebacterium, USA, 1981)]에서 찾아볼 수 있다.Specifically, culture media for microorganisms of the present application, such as strains of the genus Corynebacterium, can be found in "Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.Corynebacterium, USA, 1981). You can.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올; 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 라이신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀 (예컨대 블랙스트랩 당밀), 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present application, the carbon source includes carbohydrates such as glucose, saccharose, lactose, fructose, sucrose, maltose, etc.; Sugar alcohols such as mannitol, sorbitol, etc.; Organic acids such as pyruvic acid, lactic acid, citric acid, etc.; Amino acids such as glutamic acid, methionine, lysine, etc. may be included. Additionally, natural organic nutrient sources such as starch hydrolyzate, molasses (e.g. blackstrap molasses), rice bran, cassava, bagasse and corn steep liquor can be used, specifically glucose and sterilized pretreated molasses (i.e. reducing sugars). Carbohydrates such as molasses (converted into molasses) can be used, and various other carbon sources in an appropriate amount can be used without limitation. These carbon sources may be used alone or in combination of two or more types, but are not limited thereto.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원, 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 이의 분해 생성물, 탈지 대두 케이크 또는 이의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.The nitrogen sources include inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium carbonate, ammonium nitrate, amino acids such as glutamic acid, methionine, and glutamine, peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, Organic nitrogen sources such as malt extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, fish or decomposition products thereof, defatted soybean cake or decomposition products thereof, etc. may be used. These nitrogen sources may be used alone or in combination of two or more types, but are not limited thereto.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.The agent may include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, or a corresponding sodium-containing salt. Inorganic compounds may include sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate, etc. In addition, amino acids, vitamins, and/or appropriate precursors may be included. These components or precursors can be added to the medium batchwise or continuously. However, it is not limited to this.
또한, 본 출원의 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, during the cultivation of the microorganism of the present application, compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, sulfuric acid, etc. can be added to the medium in an appropriate manner to adjust the pH of the medium. Additionally, during culturing, foam generation can be suppressed by using an antifoaming agent such as fatty acid polyglycol ester. In addition, to maintain the aerobic state of the medium, oxygen or oxygen-containing gas can be injected into the medium, or to maintain the anaerobic and microaerobic state, nitrogen, hydrogen, or carbon dioxide gas can be injected without gas injection, and is limited thereto. That is not the case.
본 출원의 배양에서 배양온도는 20 내지 45℃ 구체적으로는 25 내지 40℃ 를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. In the culture of the present application, the culture temperature can be maintained at 20 to 45°C, specifically 25 to 40°C, and culture can be performed for about 10 to 160 hours, but is not limited thereto.
본 출원의 배양에 의하여 생산된 판토텐산 및/또는 판토산은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.Pantothenic acid and/or pantoic acid produced by the culture of the present application may be secreted into the medium or remain within the cells.
본 출원의 판토텐산 및/또는 판토산 생산방법은, 본 출원의 미생물을 준비하는 단계, 상기 미생물을 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관, in any order)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다. The method for producing pantothenic acid and/or pantoic acid of the present application includes preparing the microorganism of the present application, preparing a medium for culturing the microorganism, or a combination thereof (regardless of order, in any order), e.g. For example, it may be additionally included before the culturing step.
본 출원의 판토텐산 및/또는 판토산 생산방법은, 상기 배양에 따른 배지(배양이 수행된 배지) 또는 미생물(예컨대, 코리네박테리움 속 균주)로부터 판토텐산 및/또는 판토산을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다.The method for producing pantothenic acid and/or pantoic acid of the present application adds the step of recovering pantothenic acid and/or pantoic acid from the culture medium (medium in which the culture was performed) or microorganisms (e.g., Corynebacterium genus strains). It can be included as . The recovering step may be additionally included after the culturing step.
상기 회수는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 판토텐산 및/또는 판토산을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 판토텐산 및/또는 판토산을 회수할 수 있다.The recovery involves collecting the desired pantothenic acid and/or pantoic acid using a suitable method known in the art according to the cultivation method of the microorganism of the present application, such as a batch, continuous or fed-batch culture method. It could be. For example, centrifugation, filtration, crystallization, treatment with protein precipitants (salting out), extraction, ultrasonic disruption, ultrafiltration, dialysis, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity. Various chromatographies such as chromatography, HPLC, or a combination of these methods can be used, and the desired pantothenic acid and/or pantoic acid can be recovered from the medium or microorganism using a suitable method known in the art.
또한, 본 출원의 판토텐산 및/또는 판토산 생산방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 출원의 판토텐산 및/또는 판토산 생산방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 연속적 또는 비연속적으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In addition, the method for producing pantothenic acid and/or pantoic acid of the present application may additionally include a purification step. The purification can be performed using a suitable method known in the art. In one example, when the method for producing pantothenic acid and/or pantoic acid of the present application includes both a recovery step and a purification step, the recovery step and the purification step are performed sequentially or discontinuously regardless of the order, simultaneously, or in one step. It may be performed in an integrated manner, but is not limited thereto.
또 다른 하나의 양상은 본 출원의 미생물, 상기 미생물을 배양한 배지, 또는 이들의 조합을 포함하는 판토텐산 및/또는 판토산 생산용 조성물을 제공하는 것이다.Another aspect is to provide pantothenic acid and/or a composition for producing pantoic acid containing the microorganism of the present application, a medium culturing the microorganism, or a combination thereof.
또 다른 하나의 양상은 상기 미생물을 판토텐산 또는 판토산 생산에 사용하기 위한 용도를 제공한다.Another aspect provides the use of the microorganism for the production of pantothenic acid or pantoic acid.
또 다른 하나의 양상은 상기 미생물을 판토텐산 또는 판토산 생산용 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.Another aspect provides the use of the microorganism for the production of pantothenic acid or a composition for producing pantoic acid.
본 출원의 조성물은 판토텐산 및/또는 판토산 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The compositions of the present application may further comprise any suitable excipients commonly used in pantothenic acid and/or compositions for the production of pantoic acid, such as preservatives, wetting agents, dispersing agents, suspending agents, buffering agents, stabilizing agents. Or it may be an isotonic topic, but it is not limited thereto.
본 출원의 음이온 수송 단백질의 활성이 증대된 미생물을 배양하는 경우, 고수율의 판토텐산 및/또는 판토산 생산이 가능하다. 이에, 산업적인 면에서 생산의 편의성 및 제조원가 절감의 효과를 기대할 수 있다.When cultivating microorganisms with increased activity of the anion transport protein of the present application, high yield production of pantothenic acid and/or pantoic acid is possible. Accordingly, from an industrial perspective, convenience of production and reduction of manufacturing costs can be expected.
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through the following examples. However, these are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.
실시예 1. 판토텐산 생산 균주 제작 및 음이온 수송 단백질을 암호화하는 유전자 탐색 및 선별Example 1. Creation of pantothenic acid producing strains and search and selection of genes encoding anion transport proteins
야생형의 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium Glutamicum)은 D-판토텐산을 생산하는 능력은 있으나, 거의 생산하지 않는다. 이에, 본 출원의 목적에 따라 D-판토텐산 배출능을 증가시키는 유전자를 용이하게 선별하기 위하여, D-판토텐산 생산능이 증가된 균주를 활용하였다.Wild-type Corynebacterium glutamicum has the ability to produce D-pantothenic acid, but hardly produces it. Therefore, in order to easily select genes that increase the ability to excrete D-pantothenic acid according to the purpose of the present application, a strain with increased D-pantothenic acid production ability was used.
구체적으로 음이온 수송 단백질의 판토텐산의 생산성 증대 효과를 확인하기 위해 변이주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 ΔpanB::panB(EC) (유럽특허공개공보 EP 4032977 A1)를 모균주로 하여 판토텐산 수송 능력이 있어 생산능을 증대시킬 수 있을 것으로 추정되는 다양한 음이온 수송 단백질의 과발현을 유도하였다. 후보 음이온 수송 단백질을 보유한 미생물, 해당 단백질 서열 및 이를 암호화하는 핵산서열을 아래 표 1에 정리하였다.Specifically, in order to confirm the effect of the anion transport protein on increasing the productivity of pantothenic acid, the mutant strain Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ΔpanB::panB(EC) (European Patent Publication EP 4032977 A1) was used as the parent strain, which has the ability to transport pantothenic acid. Overexpression of various anion transport proteins, which are presumed to increase production capacity, was induced. Microorganisms possessing candidate anion transport proteins, the corresponding protein sequences, and the nucleic acid sequences encoding them are summarized in Table 1 below.
서열primer
order
실시예 2. 외래 미생물 유래 음이온 수송 단백질이 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물 제작Example 2. Production of Corynebacterium glutamicum microorganisms introduced with anion transport proteins derived from foreign microorganisms
확보된 미생물들의 음이온 수송 단백질을 암호화하는 핵산(표 1)을 각각 합성 후 이들 각 핵산을 주형으로 하여 상기 표 1의 프라이머 서열을 이용하여 PCR을 수행하였다. PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하여 PCR을 수행하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 30회 반복하였다. 그 결과 각각의 음이온 수송 단백질을 암호화하는 DNA 단편을 획득하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium Glutamicum) 유래의 lysC 프로모터를 확보하기 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머를 이용하였고, 프로모터를 상기 방법과 동일하게 PCR을 수행하여 DNA 단편을 획득하였다. 제한효소 ScaI으로 처리한 후 65℃에서 20분간 열처리한 pECCG117(대한민국 등록특허 제10-0057684호) 벡터와 상기 DNA 단편들 (각 Transporter, PlysC)을 몰농도 (M) 2:1:1이 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이는 상기 표 1에 벡터의 이름과 도입된 유전자의 정보를 표기하였다.After synthesizing each nucleic acid (Table 1) encoding anion transport proteins of the obtained microorganisms, PCR was performed using each of these nucleic acids as a template and using the primer sequences in Table 1 above. PCR was performed using PfuUltraTM high-confidence DNA polymerase (Stratagene), and the PCR conditions were denaturation at 95°C for 30 seconds; Annealing 55°C, 30 seconds; And the polymerization reaction was repeated 30 times at 72°C for 2 minutes. As a result, DNA fragments encoding each anion transport protein were obtained. To secure the lysC promoter derived from Corynebacterium Glutamicum, primers of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 were used using Corynebacterium glutamicum genomic DNA as a template, and the promoter was used in the same manner as above. PCR was performed to obtain DNA fragments. pECCG117 (Korean Patent No. 10-0057684) vector treated with restriction enzyme ScaI and then heat-treated at 65°C for 20 minutes and the above DNA fragments (each Transporter, PlysC) were mixed at a molar concentration (M) of 2:1:1. A plasmid was obtained by cloning according to the provided manual using TaKaRa's Infusion Cloning Kit, and the name of the vector and information on the introduced gene are indicated in Table 1 above.
제작된 5종의 벡터들을 전기천공법에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 ΔpanB::panB(EC) (유럽특허공개공보 EP 4032977 A1)에 형질전환하여 외래 음이온 수송 단백질을 발현하는 미생물들을 제작하였다.Five types of vectors were transformed into Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ΔpanB::panB(EC) (European Patent Publication EP 4032977 A1) by electroporation to produce microorganisms expressing foreign anion transport proteins. did.
실시예 3. 외래 미생물 유래 음이온 수송단백질이 발현되는 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물의 판토텐산 생산능 조사Example 3. Investigation of the pantothenic acid production ability of Corynebacterium glutamicum microorganisms expressing anion transport proteins derived from foreign microorganisms
상기 실시예 2에서 얻어진 균주들의 판토텐산 생산능을 확인하기 위하여 하기와 같은 조성으로 이뤄진 생산배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바풀 플라스크에 모균주 및 상기 균주들을 각각 접종한 후, 32℃에서 48시간동안 200 rpm으로 진탕 배양하여 판토텐산을 제조하였다.In order to confirm the pantothenic acid production ability of the strains obtained in Example 2, the parent strain and the above strains were each inoculated into a 250 ml corner-bottle flask containing 25 ml of the production medium composed of the following composition, and then incubated at 32°C for 48 hours. Pantothenic acid was prepared by shaking culture at 200 rpm for 1 hour.
<생산배지><Production Badge>
포도당 10%, 베타-알라닌 0.5%, 효모추출물 0.4%, 황산암모늄 1.5%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.05%, 황산철7수염 10mg/ℓ, 황산망간1수염 6.7 mg/ℓ, 비오틴 50 ㎍/ℓ, 티아민·HCl 100 ㎍/ℓ, pH 7.2Glucose 10%, beta-alanine 0.5%, yeast extract 0.4%, ammonium sulfate 1.5%, monobasic potassium phosphate 0.1%, magnesium sulfate 7-hydrate, 0.05%, iron sulfate 7-hydrate, 10 mg/ℓ, manganese sulfate mono-hydrate 6.7 mg/ℓ , biotin 50 ㎍/ℓ, thiamine·HCl 100 ㎍/ℓ, pH 7.2
다양한 미생물 유래의 음이온 수송 단백질을 발현하는 코리네박테리움 글루타미쿰의 판토텐산 생산능을 아래 표 2에 정리하였다.The pantothenic acid production capacity of Corynebacterium glutamicum, which expresses anion transport proteins derived from various microorganisms, is summarized in Table 2 below.
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 ΔpanB::panB(EC)는 약 0.28 g/L의 판토텐산이 생산되는 것을 확인하였다. 외래 미생물 유래의 음이온 수송 단백질을 발현하는 균주들 중에서 코리네박테리움 스테이셔니스 유래의 음이온 수송 단백질 Ncam0154 (서열번호 14)를 발현하는 균주인 ATCC13032 ΔpanB::panB(EC) pECCG117-Ncam0154는 0.69 g/L의 판토텐산을 생산하여, 가장 높은 판토텐산 생산성을 보였다.As shown in Table 2, it was confirmed that the parent strain, Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ΔpanB::panB(EC), produced about 0.28 g/L of pantothenic acid. Among strains expressing anion transport proteins derived from foreign microorganisms, ATCC13032 ΔpanB::panB(EC) pECCG117-Ncam0154, a strain expressing the anion transport protein Ncam0154 (SEQ ID NO. 14) derived from Corynebacterium stasis, weighed 0.69 g. /L of pantothenic acid was produced, showing the highest pantothenic acid productivity.
상기의 결과는 본 출원에서 선별한 5종의 음이온 수송 단백질 중에서 코리네박테리움 스테이셔니스 유래의 음이온 수송 단백질인 Ncam0154가 판토텐산을 보다 더 효율적으로 생산할 수 있음을 의미하며, 음이온 수송 단백질이 판토텐산의 생산을 증가시킴을 확인할 수 있었다.The above results mean that among the five types of anion transport proteins selected in this application, Ncam0154, an anion transport protein derived from Corynebacterium stasis, can produce pantothenic acid more efficiently, and that the anion transport protein is capable of producing pantothenic acid more efficiently. It was confirmed that production was increased.
실시예 4. Ncam0154 단백질 활성이 강화된 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물의 판토텐산 생산능 조사Example 4. Investigation of pantothenic acid production ability of wild-type Corynebacterium glutamicum microorganism with enhanced Ncam0154 protein activity
실시예 3의 결과로부터 가장 우수한 판토텐산 생산성을 나타낸 Ncam0154 단백질이 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰에 도입되었을 때도 유사한 판토텐산 생산능 향상 효과를 나타내는지 확인하였다.From the results of Example 3, it was confirmed whether the Ncam0154 protein, which showed the best pantothenic acid productivity, showed a similar effect of improving pantothenic acid production ability when introduced into wild-type Corynebacterium glutamicum.
구체적으로 실시예 2에서 제작된 pECCG117-Ncam0154 벡터를 전기천공법에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 형질전환하여 Ncam0154를 발현하는 균주 (ATCC13032 pECCG117-Ncam0154)를 제작하였다. 제작된 균주를 모균주(ATCC13932)와 함께 하기와 같은 조성으로 이뤄진 생산배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바풀 플라스크에 각각 접종한 후, 32 ℃에서 48시간동안 200 rpm으로 진탕 배양한 후 판토텐산 생산능을 측정하였다.Specifically, the pECCG117-Ncam0154 vector constructed in Example 2 was transformed into Corynebacterium glutamicum ATCC13032 by electroporation to produce a strain expressing Ncam0154 (ATCC13032 pECCG117-Ncam0154). The prepared strains were inoculated together with the parent strain (ATCC13932) into a 250 ml corner-barpool flask containing 25 ml of production medium composed of the following composition, and then cultured with shaking at 200 rpm at 32°C for 48 hours, followed by pantothenic acid. Productivity was measured.
<생산배지><Production Badge>
포도당 10%, 베타-알라닌 0.5%, 효모추출물 0.4%, 황산암모늄 1.5%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.05%, 황산철7수염 10mg/ℓ, 황산망간1수염 6.7 mg/ℓ, 비오틴 50 ㎍/ℓ, 티아민·HCl 100 ㎍/ℓ, pH 7.2Glucose 10%, beta-alanine 0.5%, yeast extract 0.4%, ammonium sulfate 1.5%, monobasic potassium phosphate 0.1%, magnesium sulfate 7-hydrate, 0.05%, iron sulfate 7-hydrate, 10 mg/ℓ, manganese sulfate mono-hydrate 6.7 mg/ℓ , biotin 50 ㎍/ℓ, thiamine·HCl 100 ㎍/ℓ, pH 7.2
그 결과 상기 표 3에 나타난 바와 같이, Ncam0154 단백질은 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물에서 발현되었을 때도 모균주 대비 판토텐산 생산능을 50% 향상시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in Table 3 above, it was confirmed that the Ncam0154 protein could improve the pantothenic acid production ability by 50% compared to the parent strain even when expressed in wild-type Corynebacterium glutamicum microorganisms.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, those skilled in the art to which the present invention pertains will understand that the present invention can be implemented in other specific forms without changing its technical idea or essential features. In this regard, the embodiments described above should be understood in all respects as illustrative and not restrictive. The scope of the present invention should be construed as including the meaning and scope of the patent claims described below rather than the detailed description above, and all changes or modified forms derived from the equivalent concept thereof are included in the scope of the present invention.
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