KR20240099332A

KR20240099332A - 파브리병의 치료를 위한 바이러스 벡터 작제물의 사용 방법

Info

Publication number: KR20240099332A
Application number: KR1020247017123A
Authority: KR
Inventors: 크리스토발 파살라쿠아; 마샬 휴스턴; 버나드 수베르비엘
Original assignee: 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드
Priority date: 2021-11-03
Filing date: 2022-11-03
Publication date: 2024-06-28
Also published as: IL312548A; AU2022381751A1; CA3236677A1; WO2023081781A1

Abstract

본 개시내용은, 약 5×10¹² 벡터 게놈/체중 킬로그램(vg/㎏) 내지 약 5×10¹³vg/㎏의 용량으로, 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 이식유전자를 포함하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터(예를 들어, AAV 발현 벡터)를 투여함으로써, 파브리병의 하나 이상의 증상의 치료 또는 개선, 글리코스핑고리피드 양의 감소 및/또는 갈락토시다제 A(α-Gal A) 단백질 활성 증가를 필요로 하는 대상체에서 파브리병의 하나 이상의 증상의 치료 또는 개선, 글리코스핑고리피드 양의 감소 및/또는 갈락토시다제 A(α-Gal A) 단백질 활성 증가를 위한 방법에 관한 것이다.

Description

파브리병의 치료를 위한 바이러스 벡터 작제물의 사용 방법

관련 출원과의 상호 참조

본 출원은 2021년 11월 3일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/275,390호 및 2022년 8월 29일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/373,826호의 출원일의 유익을 주장하며, 이의 내용은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.

전자적으로 제출된 서열목록에 대한 참조

본 출원과 함께 제출된 ASCII 텍스트 파일(파일명: 4341_024PC02_Seqlisting_ST26; 용량: 16,280 바이트; 및 생성일: 2022년 11월 2일)의 전자적으로 제출된 서열목록의 내용은 이의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.

기술분야

본 개시내용은 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 이식유전자를 포함하는 발현 벡터(예를 들어, 아데노-연관 바이러스(AAV) 발현 벡터)의 치료적 유효량을 투여함으로써, 파브리병의 하나 이상의 증상의 치료 또는 개선, 글리코스핑고리피드 양의 감소 및/또는 갈락토시다제 A(α-Gal A) 단백질 활성 증가를 필요로 하는 대상체에서의 파브리병의 하나 이상의 증상의 치료 또는 개선, 글리코스핑고리피드 양의 감소 및/또는 갈락토시다제 A 단백질 활성 증가를 위한 방법에 관한 것이다.

파브리병은 효소 α-갈락토시다제 A(GLA)의 결핍증으로부터 초래되는 X-연관 리소좀 축적병이다. 그 결과 글로보트라이아오실세라마이드(Gb3)로부터 말단의 α-갈락토실 모이어티를 가수분해하지 못하면 리소좀 및 세포의 다른 곳에 Gb3가 축적된다. 초기의 특징적인 임상 증상은 중증의 신경병성 통증(말단감각이상), 피부병변(혈관각화종) 및 안구 징후(나이테 각막)를 포함한다. 나중에는, 심장, 신장 및 뇌 혈관 합병증은 심한 이환율 및 수명 단축을 초래한다. 문헌[Desnick et al., α-Galactosidase A Deficiency: Fabry Disease, in: Beaudet et al. (Ed.), The Online Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, The McGraw-Hill Companies, Inc., New York, NY (2014); Van der Veen SJ et al., Mol Genet Metab. 126(2):162-168 (2019)].

2001년 이후로, 파브리병이 있는 환자는 재조합 효소(아갈시다제(agalsidase)-α 및 아갈시다제-β)의 주입에 기반하여 두 가지의 상이한 효소 대체 요법(ERT)으로 치료를 받았다. 문헌[Eng et al., N Engl J Med 345: 9-16 (2001); Schiffmann et al., JAMA 285: 2743-2749 (2001); Lenders et al., J Am Soc Nephrol. 27(1):256-64 (2016)]. 이러한 치료는 단지 증상을 치료하기 위한 것이며, 치유되는 것은 아니므로, 환자는 평생 동안 이러한 단백질의 반복 투여를 받아야 한다.

연구는 재조합 효소의 주입이 항-GLA 중화 항체의 형성을 야기하여, 단기간 급성 합병증을 유발할 뿐만 아니라 요법 저해에 의해 장기간 해로운 영향을 미쳐서, Gb3 및 lyso-Gb3 고갈이 심각하게 감소되게 한다는 것을 시사하였다. 문헌[Lenders et al., J Am Soc Nephrol. 27(1):256-64 (2016)]. 고전적 파브리병이 있는 남성 환자에서, ERT에 의한 치료는, 특히 비가역적 기관 손상이 시작되기 전에 치료가 개시되는 경우에, 합병증 발생을 지연시킨다. 그러나, ERT로 치료된 고전적으로 영향을 받은 남성 환자의 절반 이상에서 항-GLA 중화 항체가 발생된다. 여성 환자 및 비고전적 질환 표현형을 갖는 환자에서, 투여된 재조합 효소에 대한 항체 형성은 거의 관찰되지 않는다. 문헌[Van der Veen SJ et al., Mol Genet Metab. 126(2):162-168 (2019)].

따라서, 예를 들어, 발현된 이식유전자 암호화된 유전자 산물을 치료적으로 적절한 수준으로 전달하기 위해, 게놈 편집을 통한 치료를 비롯하여, 파브리병을 치료하는 데 사용될 수 있는 비-ERT 방법 및 조성물에 대한 필요성이 여전히 남아있다.

일부 양상에서, 파브리병의 치료 또는 파브리병과 관련된 하나 이상의 증상 개선을 필요로 하는 인간 대상체의 파브리병을 치료하고 파브리병과 관련된 하나 이상의 증상을 개선시키는 방법이 본 명세서에 제공되며, 상기 방법은 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 발현 카세트를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 발현 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 발현 카세트는 알파 1-안티트립신(hAAT) 프로모터에 작동 가능하게 연결된 아포지질단백질 E(APOE) 인핸서, 인간 헤모글로빈 베타(HBB)-IGG 인트론, 신호 펩타이드를 암호화하는 서열, 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 이식유전자 및 소 성장 호르몬 폴리 A 신호 서열을 포함하고, AAV 발현 벡터는 약 5×10¹²벡터 게놈/체중 킬로그램(vg/㎏) 내지 약 5×10¹³vg/㎏의 용량으로 투여된다.

일부 양상에서, 파브리병의 치료 또는 파브리병과 관련된 하나 이상의 증상 개선을 필요로 하는 인간 대상체의 파브리병을 치료하고 파브리병과 관련된 하나 이상의 증상을 개선시키는 방법이 본 명세서에 제공되며, 상기 방법은 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 발현 카세트를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 발현 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 발현 카세트는 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 이식유전자를 포함하고, α-GalA 이식유전자는 서열번호 5에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, AAV 발현 벡터는 약 5×10¹²벡터 게놈/체중 킬로그램(vg/㎏) 내지 약 5×10¹³vg/㎏의 용량으로 투여된다.

일부 양상에서, 글리코스핑고리피드의 양 감소를 필요로 하는 인간 대상체에서 글리코스핑고리피드의 양을 감소시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 발현 카세트를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 발현 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 발현 카세트는 알파 1-안티트립신(hAAT) 프로모터에 작동 가능하게 연결된 아포지질단백질 E(APOE) 인핸서, 인간 헤모글로빈 베타(HBB)-IGG 인트론, 신호 펩타이드를 암호화하는 서열, 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 이식유전자 및 소 성장 호르몬 폴리 A 신호 서열을 포함하고, AAV 발현 벡터는 약 5×10¹²벡터 게놈/체중 킬로그램(vg/㎏) 내지 약 5×10¹³vg/㎏의 용량으로 투여되고, 글리코스핑고리피드의 감소된 양은 투여 전 대상체에서의 글리코스핑고리피드의 양에 대한 것이다.

일부 양상에서, 글리코스핑고리피드 양의 감소를 필요로 하는 인간 대상체에서 글리코스핑고리피드의 양을 감소시키는 방법이 본 명세서에 제공되며, 상기 방법은 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 발현 카세트를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 발현 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 발현 카세트는 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 이식유전자를 포함하고, α-GalA 이식유전자는 서열번호 5에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, AAV 발현 벡터는 약 5×10¹²벡터 게놈벡터 게놈/체중 킬로그램(vg/㎏) 내지 약 5×10¹³vg/㎏의 용량으로 투여되고, 글리코스핑고리피드의 감소된 양은 투여 전 대상체에서의 글리코스핑고리피드의 양에 대한 것이다.

일부 양상에서, α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 단백질 활성의 증가를 필요로 하는 인간 대상체에서 α 갈락토시다제 A의 활성을 증가시키는 방법이 본 명세서에 제공되며, 상기 방법은 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 발현 카세트를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 발현 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 발현 카세트는 알파 1-안티트립신(hAAT) 프로모터에 작동 가능하게 연결된 아포지질단백질 E(APOE) 인핸서, 인간 헤모글로빈 베타(HBB)-IGG 인트론, 신호 펩타이드를 암호화하는 서열, 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 α 갈락토시다제 A 이식유전자 및 소 성장 호르몬 폴리 A 신호 서열을 포함하고, AAV 발현 벡터는 약 5×10¹² 벡터 게놈/체중 킬로그램(vg/㎏) 내지 약 5×10¹³ vg/㎏의 용량으로 투여되고, 증가된 α-Gal A 단백질 활성은 투여 전 대상체에서의 α-Gal A 단백질 활성의 양에 대한 것이다.

일부 양상에서, α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 단백질 활성의 증가를 필요로 하는 인간 대상체에서 α 갈락토시다제 A 단백질 활성을 증가시키는 방법이 본 명세서에 제공되며, 상기 방법은 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 발현 카세트를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 발현 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 발현 카세트는 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 이식유전자를 포함하고, α-GalA 이식유전자는 서열번호 5에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, AAV 발현 벡터는 약 5×10¹² 벡터 게놈/체중 킬로그램(vg/㎏) 내지 약 5×10¹³ vg/㎏의 용량으로 투여되고, 증가된 α-Gal A 단백질 활성은 투여 전 대상체에서의 α-Gal A 단백질 활성에 대한 것이다.

일부 양상에서, 대상체는 파브리병을 갖는다.

일부 양상에서, α-Gal A 발현 카세트는 돌연변이된 우드처크 간염 바이러스(WHV) 전사후 조절 요소(WPRE) 서열을 더 포함한다.

일부 양상에서, 돌연변이된 WPRE 서열은 mut6 돌연변이된 WPRE 서열을 포함한다.

일부 양상에서, α-Gal A 발현 카세트는 알파 1-안티트립신(hAAT) 프로모터에 작동 가능하게 연결된 아포지질단백질 E(APOE) 인핸서, 인간 헤모글로빈 베타(HBB)-IGG 인트론, 신호 펩타이드를 암호화하는 서열 및 소 성장 호르몬 폴리 A 신호 서열을 더 포함한다.

일부 양상에서, 이식유전자는 야생형 α-Gal A 서열 또는 코돈-최적화된 α-Gal A 서열을 포함한다.

일부 양상에서, 신호 펩타이드는 α-GalA 신호 펩타이드이다.

일부 양상에서, 인핸서는 서열번호 2에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 프로모터는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 인트론은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, α-GalA 이식유전자는 서열번호 5에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 돌연변이된 WPRE 서열은 서열번호 6에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 폴리 A 신호 서열은 서열번호 7에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일부 양상에서, 인핸서는 서열번호 2에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 프로모터는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 인트론은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 돌연변이된 WPRE 서열은 서열번호 6에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 폴리 A 신호 서열은 서열번호 7에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일부 양상에서, α-Gal A 발현 카세트는 서열번호 9에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일부 양상에서, AAV 발현 벡터 혈청형은 AAV2/6이다.

일부 양상에서, α-Gal A 발현 카세트는 역위 말단 반복부(inverted terminal repeat: ITR)가 각 말단 상에 측접된다. 일부 양상에서, ITR은 아데노-연관 바이러스 2형(AAV2)으로부터 유래된다. 일부 양상에서, AAV 발현 벡터는 AAV2로부터 유래된 ITR이 각 말단 상에 측접된 α-Gal A 발현 카세트를 더 포함하되, α-Gal A 발현 카세트는 아데노-연관 바이러스 6형(AAV6)으로부터 유래된 캡시드로 패키징된다.

일부 양상에서, 대상체는 다음의 증상 중 하나 이상을 갖는다: 정상 초과의 글로보트라이아오실세라마이드(Gb3) 수준, 정상 초과의 글로보트리아오실스핑고신(lyso-Gb3) 수준, 신장 질환, 심장 질환, 무한증, 말단감각이상, 혈관각화종, 위장(GI)관 통증, 각막 및 수정체혼탁 또는 뇌졸중. 일부 양상에서, 혈관각화종은 제주위 혈관각화종(periumbilicial angiokeratoma)이다.

일부 양상에서, 대상체는 약 5% 미만의 α-GalA 단백질 활성을 갖는다.

일부 양상에서, α-GalA 단백질 활성은 대상체의 혈장 및/또는 백혈구에서 측정된다.

일부 양상에서, 대상체는 남성 대상체이다. 일부 양상에서, 대상체는 여성 대상체이다.

일부 양상에서, 대상체는 파브리병을 나타내는 α-GalA 유전자 돌연변이를 갖는다. 일부 양상에서, α-GalA 유전자 돌연변이는 아미노산 돌연변이 G261D, C422T, W340R, S297Y, Q283X, D215S, IVS5/c.801+3A>G, P362L, C422T 또는 N34S를 초래한다.

일부 양상에서, 대상체는, 효소결합면역흡착 검정(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)에 의해 결정 시, 투여 전에 이미 존재하는 항-α-GalA 항체를 갖는다.

일부 양상에서, 대상체는 대상체의 생물학적 샘플이 분석될 때 항-α-GalA 중화항체 양성 대상체이되, 항-α-GalA 중화항체 양성 대상체는, 항-α-GalA 중화항체 검정으로 측정 시, α-갈락토시다제 A 활성의 약 9.6% 초과의 저해를 갖는 생물학적 샘플을 갖는다.

일부 양상에서, 이식유전자로부터 발현된 α-Gal A 단백질은 대상체에서의 글리코스핑고리피드의 양을 투여 전 대상체에서의 글리코스핑고리피드의 양에 비해 적어도 약 2배만큼 감소시킨다.

일부 양상에서, 이식유전자로부터 발현된 α-Gal A 단백질은 대상체에서의 글리코스핑고리피드의 양을 투여 전 대상체에서의 글리코스핑고리피드의 양에 비해 약 10퍼센트(%), 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49%, 약 50%, 약 51%, 약 52%, 약 53%, 약 54%, 약 55%, 약 56%, 약 57%, 약 58%, 약 59%, 약 60%, 약 61%, 약 62%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 68%, 약 69%, 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%만큼 감소시킨다.

일부 양상에서, 이식유전자로부터 발현된 α-Gal A 단백질은 대상체에서의 글리코스핑고리피드의 양을 투여 전과 동일한 수준으로 유지한다.

일부 양상에서, 글리코스핑고리피드는 글로보트라이아오실세라마이드(Gb3), 글로보트리아오실스핑고신(lyso-Gb3), 갈라바이오실세라마이드(galabiosylceramide) 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.

일부 양상에서, Gb3 및/또는 lyso-Gb3 수준은 대상체의 혈장 및/또는 소변에서 측정된다.

일부 양상에서, Gb3 및/또는 lyso-Gb3 수준은 대상체의 조직에서 측정된다.

일부 양상에서, 이식유전자에서 발현된 α-Gal A 단백질은 혈장, 간, 심장, 신장, 소변, 피부 또는 비장 중 하나 이상에서 글리코스핑고리피드의 양을 감소시킨다.

일부 양상에서, 대상체에서 α-Gal A 단백질 활성은 투여 전 대상체에서의 α-Gal A 단백질 활성에 비해 평균 정상 α-Gal A 단백질 활성보다 약 0배 더 높은(즉, 이상) 내지 약 2배 이상, 약 2배 이상 내지 약 5배 이상, 약 5배 이상 내지 약 10배 이상, 약 10배 이상 내지 약 20배 이상, 약 20배 이상 내지 약 30배 이상, 약 30배 이상 내지 약 40배 이상, 약 30배 이상 내지 약 40배 이상, 약 40배 이상 내지 약 50배 이상, 약 50배 이상 내지 약 60배 이상, 약 60배 이상 내지 약 70배 이상, 약 70배 이상 내지 약 80배 이상, 약 80배 이상 내지 약 90배 이상, 약 90배 이상 내지 약 100배 이상, 약 100배 이상 내지 약 200배 이상, 약 200배 이상 내지 약 300배 이상, 약 300배 이상 내지 약 400배 이상, 약 400배 이상 내지 약 500배 이상이다.

일부 양상에서, 대상체에서의 α-Gal A 단백질 활성은 투여 전 대상체에서의 α-Gal A 단백질 활성에 비해 평균 정상 α-Gal A 단백질 활성보다 약 0배 더 높은(즉, 이상) 내지 약 2배 이상, 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 약 10배 이상, 약 11배 이상, 약 12배 이상, 약 13배 이상, 약 14배 이상, 약 15배 이상, 약 16배 이상, 약 17배 이상, 약 18배 이상, 약 19배 이상, 약 20배 이상, 약 21배 이상, 약 22배 이상, 약 23배 이상, 약 24배 이상, 약 25배 이상, 약 26배 이상, 약 27배 이상, 약 28배 이상, 약 29배 이상, 약 30배 이상, 약 31배 이상, 약 32배 이상, 약 33배 이상, 약 34배 이상, 약 35배 이상, 약 36배 이상, 약 37배 이상, 약 38배 이상, 약 39배 이상, 약 40배 이상, 약 41배 이상, 약 42배 이상, 약 43배 이상, 약 44배 이상, 약 45배 이상, 약 46배 이상, 약 47배 이상, 약 48배 이상, 약 49배 이상, 약 50배 이상, 약 51배 이상, 약 52배 이상, 약 53배 이상, 약 54배 이상, 약 55배 이상, 약 56배 이상, 약 57배 이상, 약 58배 이상, 약 59배 이상, 약 60배 이상, 약 61배 이상, 약 62배 이상, 약 63배 이상, 약 64배 이상, 약 65배 이상, 약 66배 이상, 약 67배 이상, 약 68배 이상, 약 69배 이상, 약 70배 이상, 약 71배 이상, 약 72배 이상, 약 73배 이상, 약 74배 이상, 약 75배 이상, 약 76배 이상, 약 77배 이상, 약 78배 이상, 약 79배 이상, 약 80배 이상, 약 81배 이상, 약 82배 이상, 약 83배 이상, 약 84배 이상, 약 85배 이상, 약 86배 이상, 약 87배 이상, 약 88배 이상, 약 89배 이상, 약 90배 이상, 약 91배 이상, 약 92배 이상, 약 93배 이상, 약 94배 이상, 약 95배 이상, 약 96배 이상, 약 97배 이상, 약 98배 이상, 약 99배 이상 또는 약 100배 이상이다.

일부 양상에서, 이식유전자에서 발현된 α-Gal A 단백질의 수준은 대상체의 혈장, 혈청, 전혈, 건조 혈반, 백혈구 또는 다른 혈액 구성성분 중 하나 이상에서 측정된다.

일부 양상에서, 이식유전자에서 발현된 α-Gal A 단백질은 대상체의 신장, 간, 피부 및 심장에서 활성이다.

일부 양상에서, AAV 발현 벡터는 비경구로 투여된다. 일부 양상에서, AAV 발현 벡터는 정맥내로 투여된다.

일부 양상에서, AAV 발현 벡터는 약제학적으로 허용 가능한 담체로 투여된다. 일부 양상에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 CaCl₂, MgCl₂, NaCl, 수크로스 및 Kolliphor(폴록사머) P 188을 함유하는 인산염 완충 식염수를 포함한다.

일부 양상에서, 단지 1회 용량의 AAV 발현 벡터가 대상체에게 투여된다. 일부 양상에서, AAV 발현 벡터는 약 5×10¹²vg/㎏의 용량으로 투여된다. 일부 양상에서, AAV 발현 벡터는 약 1×10¹³vg/㎏의 용량으로 투여된다. 일부 양상에서, AAV 발현 벡터는 약 3×10¹³vg/㎏의 용량으로 투여된다. 일부 양상에서, AAV 발현 벡터는 약 5×10¹³vg/㎏의 용량으로 투여된다.

일부 양상에서, AAV 발현 벡터의 투여 전 및/또는 투여 동안에 대상체에게 면역억제제가 투여된다. 일부 양상에서, 면역억제제는 프레드니손을 포함한다.

일부 양상에서, AAV 발현 벡터의 투여 전 및/또는 투여 동안에 대상체에게 면역억제제가 투여되지 않는다.

일부 양상에서, AAV 발현 벡터의 투여 전에 대상체에게 사전조건화 치료가 투여되지 않는다.

일부 양상에서, 적어도 하나의 α-Gal A 단백질의 발현은 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 적어도 9개월, 적어도 10개월, 적어도 11개월, 적어도 12개월, 적어도 13개월, 적어도 14개월, 적어도 15개월, 적어도 16개월, 적어도 17개월, 적어도 18개월, 적어도 19개월, 적어도 20개월, 적어도 21개월, 적어도 22개월, 적어도 23개월 또는 적어도 24개월 동안 지속된다.

일부 양상에서, ㎖/분/1.73㎡ 단위의 사구체 여과율(eGFR)이 만성 신장 질환 역학 협력(CKD-EPI) 방정식을 사용하여 투여한 후에 대상체에서 측정된다. 일부 양상에서, 연간 eGFR 감소율은 파브리병이 있는 비슷한 비치료 대상체에서보다 더 낮다.

일부 양상에서, 박출률(Ejection Fraction: EF)은 투여한 후에 대상체에서 일회 박출량(stroke volume: SV)/이완기말 좌심실 용적(left ventricular volumes at end-diastole: LVEDV)으로서 측정된다. 일부 양상에서, 연간 EF 감소율은 파브리병이 있는 비슷한 비치료 대상체에서보다 더 낮다.

일부 양상에서, 종축 움직임 변화(Global Longitudinal Strain: GLS)는 투여 후에 2차원(2D) 변형 심장초음파검사 또는 심장 자기 공명 영상화(심장 MRI 또는 CMR)에 의해 대상체에서 측정된다. 일부 양상에서, 연간 단축 진행 심장 근육의 수축 가능성(annual shortening progression the contractibility of the muscles of the heart)은 파브리병이 있는 비슷한 비치료 대상체에서보다 더 낮다.

일부 양상에서, 심근의 이완 시간은 투여 후에 심장 자기 공명 영상화(심장 MRI 또는 CMR)에 대한 천연 T1 맵핑에 의해 대상체에서 측정된다. 일부 양상에서, 이완 시간의 연간 감소는 파브리병이 있는 비슷한 비치료 대상체에서보다 더 낮다.

일부 양상에서, 심근의 증가된 수분 함량으로서의 부종은 투여 후에 심장 자기 공명 영상화(심장 MRI 또는 CMR)에 대한 T2 맵핑에 의해 대상체에서 측정된다. 일부 양상에서, 수분 함량의 연간 증가는 파브리병이 있는 비슷한 비치료 대상체에서보다 더 낮다.

일부 양상에서, 좌심실 질량 지수(LVMI)는 투여 후에 대상체에서 좌심실 질량(LVM)/체표면적으로서 측정된다. 일부 양상에서, LVMI는, 파브리병이 있는 비슷한 비치료 대상체에서보다 연간 LVMI 증가가 더 낮다.

일부 양상에서, 투여 후에 대상체에서 하나 이상의 청각적 증상의 개선이 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 청각적 증상은 이명, 어지럼증 또는 진행성 난청이다.

일부 양상에서, 대상체는 무한증(anhidrosis)에서부터 발한감소증(hypohidrosis) 또는 정상 발한증(normal hidrosis)으로의 발한 수준의 긍정적 변화를 갖는다.

일부 양상에서, 대상체는 투여하기 전에 파브리병에 대한 효소 대체 요법(ERT)("전처리(pre-treatment)")이 투여된 적이 있다. 일부 양상에서, 효소 대체 요법은 재조합 α-갈락토시다제 A(GLA) 단백질 또는 유전자 발현 GAL를 포함한다. 일부 양상에서, 전처리를 위한 효소 대체 요법은 갈라폴드, AVR-RD-01, FLT-190, 페구니갈시다제 알파(pegunigalsidase alfa), 4D-310 또는 이들의 임의의 조합물을 투여하는 것을 포함한다.

일부 양상에서, 상기 전처리를 위한 효소 대체 요법은 GLA에 대한 활성 부위-특이적 샤페론(active site-specific chaperone: ASSC)과 조합하여 재조합 α-갈락토시다제 A(GLA) 단백질을 포함한다. 일부 양상에서, ASSC는 1-데옥시갈락토노지리마이신(1-deoxygalactonojirimycin)이다.

일부 양상에서, 전처리를 위한 효소 대체 요법은 아갈시다제 알파 및/또는 베타 또는 유전자 발현 아갈시다제 알파 및/또는 베타를 포함한다. 일부 양상에서, 전처리를 위한 효소 대체 요법은 파브라자임(fabrazyme), 레프라갈(Replagal), PRX-102 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.

일부 양상에서, 전처리를 위한 효소 대체 요법은 유전자 요법을 포함한다. 일부 양상에서, 유전자 요법은 효소를 암호화하는 벡터를 포함한다. 일부 양상에서, 유전자 요법은 AVR-RD-01, FLT-190, 페구니갈시다제 알파, 4D-310 또는 이들의 임의의 조합물을 투여하는 것을 포함한다.

일부 양상에서, 벡터는 인간 GLA 단백질 또는 아갈시다제 알파 및/또는 베타를 암호화하는 mRNA를 포함한다. 일부 양상에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 양상에서, 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 일부 양상에서, 유전자 요법은 지질 나노입자에 의해 전달된다.

일부 양상에서, 대상체는 투여하기 전에 파브리병에 대한 비-효소 대체 요법("전처리")이 투여된 적이 있다. 일부 양상에서, 파브리병에 대한 전처리 요법은 루세라스타트(lucerastat), 벤글루스타트(venglustat), 아파베타론(apabetalone) 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.

일부 양상에서, 파브리병은 1형 고전적 표현형 또는 2형 후기 발병 표현형이다.

도 1은 간-특이적 조절 요소(예를 들어, 인핸서, 프로모터, 인트론), 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 이식유전자(인간 알파 갈락토시다제 A), 우드처크 간염 바이러스(WHV) 전사후 조절 요소의 성숙 형태(WPREmut6), ITR 서열에 측접된 폴리아데닐화(폴리A) 신호 서열을 포함하는 AAV-001 인간 α 갈락토시다제 A(hGLA) AAV 카세트의 개략도를 나타낸다. SP는 내인성 hGLA 신호 펩타이드를 지칭한다. 다양한 구성요소의 크기는 카세트의 전체 크기(3321 bp)와 같다.
도 2는 실시예 1에 기재한 바와 같이 파브리병이 있는 환자에서 AAV-001(AAV2/6 인간 α-Gal A 유전자 요법)의 안전성 및 내약성을 평가하기 위한 1/2상, 전반적, 개방-표지, 단일-용량, 용량-범위 다기관 연구의 개략도이다.
도 3은 확장 코호트에서 환자 1 내지 9 코호트 1 내지 4 및 환자 10에 대한 기준선 환자 특징(연령(세), ERT 상태, 혈장 α-Gal A 단백질 활성(n㏖/h/㎖), 혈장 lyso-Gb3(ng/㎖), 원발성 질환 징후 및 증상, 신장 기능(eGFR), 이미 존재하는 α-Gal A 항체 및 α-Gal A 아미노산 돌연변이)를 나타낸다. Ab=항체; CKD-EPI=만성 신장 질환 역학 협력(Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration), eGFR=추정 사구체여과율; LOD=검출한계. *기준선 값은 AAV-001 투여 직전 시점으로 간주되었다. CKD-EPI로서 측정된 eGFR(㎖/분/1.73㎡).
도 4A는 AAV-001 치료와 관련된 안전성 및 내약성 데이터를 나타낸다. 모든 안전성 데이터는 컷오프 날짜(예를 들어, 마지막 측정 시점의 날짜)를 기준으로 처음 2 용량 코호트(0.5e13 vg/㎏ 및 1e13 vg/㎏)에서 4명의 환자로부터 평가되었다.
도 4B는 AAV-001 치료와 관련된 안전성 및 내약성 데이터를 나타낸다. 모든 안전성 데이터는 컷오프 날짜까지 용량 코호트 1 내지 3(0.5e13 vg/㎏, 1.0e13 vg/㎏ 및 3.0e13 vg/㎏)에서 5명의 환자로부터 평가되었다. 추적검사의 길이는 4 내지 52주의 범위였다(대상체 1 및 2, 52주; 대상체 3, 40주; 대상체 4, 25주; 대상체 5, 3주). MedDRA=규제 활동을 위한 의학 용어 사전(Medical Dictionary for Regulatory Activities); vg/㎏ = 벡터 게놈/체중 킬로그램.
도 4C는 AAV-001 치료와 관련된 안전성 및 내약성 데이터를 나타낸다. 모든 안전성 데이터는 컷오프 날짜까지 용량 코호트 1 내지 4(각각 0.5e13 vg/㎏, 1.0e13 vg/㎏, 3.0e13 vg/㎏ 및 5.0e13 vg/㎏)에서 9명의 환자로부터 평가되었다. 추적검사의 길이는 4주 내지 15개월의 범위였다. MedDRA=규제 활동을 위한 의학 용어 사전(Medical Dictionary for Regulatory Activities); vg/㎏ = 벡터 게놈/체중 킬로그램.
도 5A는 실시예 2에 기재된 바와 같이 환자 1 내지 4에서 측정된 혈장 α-Gal A 단백질 활성(n㏖/h/㎖)을 나타낸다. ERT= 효소 대체 요법; vg/㎏=벡터 게놈/체중 킬로그램.
도 5B는 실시예 2에 기재된 바와 같이 환자 1 내지 5에서 측정된 혈장 α-Gal A 단백질 활성(n㏖/h/㎖)을 나타낸다. ERT= 효소 대체 요법; vg/㎏=벡터 게놈/체중 킬로그램.
도 5C는 실시예 2에 기재된 바와 같이 환자 1 내지 8에서 측정된 혈장 α-Gal A 단백질 활성(n㏖/h/㎖)을 나타낸다. ERT= 효소 대체 요법; vg/㎏=벡터 게놈/체중 킬로그램.
도 6A는 실시예 2에 기재된 바와 같이 환자 1에서 AAV-001 투여의 12주 및 48주 후에 측정된 혈장 α-Gal A 단백질 활성(n㏖/h/㎖) 및 Lyso-Gb3 농도(ng/㎖)를 나타낸다.
도 6B는 실시예 2에 기재된 바와 같이 환자 1에서 AAV-001 투여의 52주 후에 측정된 혈장 α-Gal A 단백질 활성(n㏖/h/㎖) 및 Lyso-Gb3 농도(ng/㎖)를 나타낸다.
도 6C는 실시예 2에 기재된 바와 같이 환자 1에서 AAV-001 투여 후 시간에 따라 측정된 혈장 α-Gal A 단백질 활성(n㏖/h/㎖) 및 Lyso-Gb3 농도(ng/㎖)를 나타낸다.
도 6D는 실시예 2에 기재된 바와 같이 환자 2에서 AAV-001 투여의 12주 및 48주 후에 측정된 혈장 α-Gal A 단백질 활성(n㏖/h/㎖) 및 Lyso-Gb3 농도(ng/㎖)를 나타낸다.
도 6E는 실시예 2에 기재된 바와 같이 환자 2에서 AAV-001 투여의 52주 후에 측정된 혈장 α-Gal A 단백질 활성(n㏖/h/㎖) 및 Lyso-Gb3 농도(ng/㎖)를 나타낸다.
도 6F는 실시예 2에 기재된 바와 같이 환자 2에서 AAV-001 투여 후 시간에 따라 측정된 혈장 α-Gal A 단백질 활성(n㏖/h/㎖) 및 Lyso-Gb3 농도(ng/㎖)를 나타낸다.
도 6G는 실시예 2에 기재된 바와 같이 환자 3에서 AAV-001 투여의 12주 및 28주 후에 측정된 혈장 α-Gal A 단백질 활성(n㏖/h/㎖) 및 Lyso-Gb3 농도(ng/㎖)를 나타낸다.
도 6H는 실시예 2에 기재된 바와 같이 환자 3에서 AAV-001 투여의 40주 후에 측정된 α-Gal A 단백질 활성(n㏖/h/㎖) 및 36주 후에 측정된 혈장 Lyso-Gb3 농도(ng/㎖)를 나타낸다.
도 6I는 실시예 2에 기재된 바와 같이 환자 3에서 AAV-001 투여 후 시간에 따라 측정된 혈장 α-Gal A 단백질 활성(n㏖/h/㎖) 및 Lyso-Gb3 농도(ng/㎖)를 나타낸다.
도 6J는 실시예 2에 기재된 바와 같이 환자 4에서 AAV-001 투여의 12주 후에 측정된 혈장 α-Gal A 단백질 활성(n㏖/h/㎖) 및 Lyso-Gb3 농도(ng/㎖)를 나타낸다.
도 6K는 실시예 2에 기재된 바와 같이 환자 4에서 AAV-001 투여 후 시간에 따라 측정된 혈장 α-Gal A 단백질 활성(n㏖/h/㎖) 및 Lyso-Gb3 농도(ng/㎖)를 나타낸다.
도 6L은 실시예 2에 기재된 바와 같이 환자 4에서 AAV-001 투여의 25주 후에 측정된 α-Gal A 단백질 활성(n㏖/h/㎖) 및 20주 후에 측정된 혈장 Lyso-Gb3 농도(ng/㎖)를 나타낸다.
도 6M은 실시예 2에 기재된 바와 같이 환자 5에서 AAV-001 투여 후 시간에 따라 측정된 혈장 α-Gal A 단백질 활성(n㏖/h/㎖) 및 Lyso-Gb3 농도(ng/㎖)를 나타낸다.
도 6N은 실시예 2에 기재된 바와 같이 환자 6에서 AAV-001 투여 후 시간에 따라 측정된 혈장 α-Gal A 단백질 활성(n㏖/h/㎖) 및 Lyso-Gb3 농도(ng/㎖)를 나타낸다.
도 6O는 실시예 2에 기재된 바와 같이 환자 7에서 AAV-001 투여 후 시간에 따라 측정된 혈장 α-Gal A 단백질 활성(n㏖/h/㎖) 및 Lyso-Gb3 농도(ng/㎖)를 나타낸다.
도 6P는 실시예 2에 기재된 바와 같이 환자 8에서 AAV-001 투여 후 시간에 따라 측정된 혈장 α-Gal A 단백질 활성(n㏖/h/㎖) 및 Lyso-Gb3 농도(ng/㎖)를 나타낸다.
도 6Q는 실시예 2에 기재된 바와 같이 환자 9에서 AAV-001 투여 후 시간에 따라 측정된 Lyso-Gb3 농도(ng/㎖)를 나타낸다.

본 개시내용은, 약 5×10¹² 벡터 게놈/체중 킬로그램(vg/㎏) 내지 약 5×10¹³vg/㎏의 용량으로, 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 이식유전자를 포함하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터(예를 들어, AAV 발현 벡터)를 투여함으로써, 파브리병의 하나 이상의 증상의 치료 또는 개선, 글리코스핑고리피드 양의 감소 및/또는 갈락토시다제 A(α-Gal A) 단백질 활성 증가를 필요로 하는 대상체의 파브리병의 하나 이상의 증상의 치료 또는 개선, 글리코스핑고리피드 양의 감소 및/또는 갈락토시다제 A(α-Gal A) 단백질 활성 증가를 위한 방법에 관한 것이다.

I. 정의

본 개시내용을 더욱 용이하게 이해할 수 있도록, 일부 용어를 우선 정의한다. 본 출원에서 사용되는 바와 같이, 본 명세서에서 달리 분명하게 제공되는 경우를 제외하고, 다음의 용어의 각각은 아래에 제시되는 의미를 가질 것이다. 추가적인 정의는 본 출원 전체적으로 제시된다.

단수의 독립체 용어는 하나 이상의 해당 독립체를 지칭하며; 예를 들어, 달리 언급되지 않는 한, "핵산 서열"이 하나 이상의 핵산 서열을 나타내는 것으로 이해된다는 것이 주목될 것이다. 이렇게 해서, 단수의 용어, "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 상호 호환 가능하게 사용될 수 있다.

더 나아가, 본 명세서에서 사용되는 "및/또는"은 다른 것의 유무와 상관없이 두 가지의 명시된 특징 또는 구성성분 각각의 구체적인 개시내용으로서 취해질 것이다. 따라서, 본 명세서의 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독), 및 "B"(단독)을 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 다음의 양상 각각을 포괄하는 것으로 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B (단독); 및 C (단독).

양상이 "포함하는"이라는 표현과 함께 설명되는 경우에는 "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진"이라는 용어로 기재된 다른 유사한 양상이 또한 제공되는 것으로 이해된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "약"은 당업자에 의해 이해될 것이고, 이것이 사용되는 문맥에 따라 일정한 정도로 변할 것이다. 사용된 문맥에서 당업자에게 명확하지 않은 용어의 사용이 있는 경우, "약"은 특정 값의 최대 플러스 또는 마이너스 10%를 의미할 것이다.

숫자 또는 일련의 숫자 앞에 있는 용어 "적어도"는 "적어도"라는 용어에 인접한 숫자, 및 문맹에서 명확한 바와 같이, 논리적으로 포함될 수 있는 모든 후속 숫자 또는 정수를 포함하는 것으로 이해된다. "예를 들어, 핵산 분자에서 뉴클레오타이드의 수는 정수여야 한다. 예를 들어, "21-뉴클레오타이드 핵산 분자 중 적어도 18개의 뉴클레오타이드"는 18, 19, 20 또는 21개의 뉴클레오타이드가 표시된 특성을 갖는다는 것을 의미한다. 적어도가 일련의 숫자 또는 범위 앞에 존재하는 경우, "적어도"는 일련의 숫자 또는 범위 각각을 수식할 수 있다는 것이 이해된다. "적어도"는 또한 정수로 제한되지 않는다(예를 들어, "적어도 5%"는 유효 숫자의 수를 고려하지 않고 5.0%, 5.1%, 5.18%가 포함됨).

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "이하" 또는 "미만"은 어구에 인접한 값으로 이해되며 문맥상 논리적으로 0까지의 논리적 하위값 또는 정수로 이해된다. 이하가 일련의 숫자 또는 범위 뒤에 존재하는 경우, "이하"는 일련의 숫자 또는 범위 각각을 변형할 수 있다는 것이 이해된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "면역 반응"은 외래 제제 또는 비정상 세포(예를 들어, 파브리병 세포)에 대해 유기체 내에서의 생물학적 반응을 지칭하되, 반응은 이러한 제제/세포 및 이에 의해 야기되는 질환에 대해 유기체를 보호한다. 면역 반응은, 침입 병원균, 병원균으로 감염된 세포 또는 조직, 파브리병 세포 또는 다른 비정상 세포의 선택적 표적화, 이에 대한 결합, 이에 대한 손상, 이들의 파괴 및/또는 이들을 유기체의 신체로부터 제거하는 것, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우에, 정상 인간 세포 또는 조직을 초래하는 면역계의 세포(예를 들어, T 림프구(T 세포), B 림프구(B 세포), 자연살해(NK) 세포, 대식세포, 호산구, 비만세포, 수지상 세포 또는 호중구) 및 임의의 이러한 세포 또는 간에 의해 생성된 가용성 거대분자(항체, 사이토카인 및 보체 포함)의 작용에 의해 매개된다. 일부 양상에서, 면역 반응은, 예를 들어, T 세포의 활성화 또는 저해, 예를 들어, 효과기 T 세포 또는 Th 세포, 예컨대, CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포, 또는 조절 T 세포(Treg 세포)의 저해를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "벡터" 또는 "전달 벡터"는 이것이 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 용어 "벡터" 또는 "전달 벡터"는 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 핵산을 세포에 도입하기 위한 바이러스 비히클과 비바이러스 비히클을 둘 다 포함한다. 예를 들어, 플라스미드, 변형된 진핵 바이러스 또는 변형된 박테리아 바이러스를 포함하는 매우 다수의 벡터가 당업계에 알려져 있으며, 사용된다. 한 가지 유형의 벡터는 "플라스미드"이며, 이는 추가 DNA 세그먼트에 결찰될 수 있는 원형 이중가닥 DNA 루프를 지칭한다. 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이되, 추가 DNA 세그먼트는 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다. 일부 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포(예를 들어, 박테리아 복제기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터)에서 자율복제할 수 있다. 다른 벡터(예를 들어, 비에피솜 포유류 벡터)가 숙주 세포에 도입 시 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 마찬가지로 복제된다. 게다가, 일부 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히, "발현 벡터", 다르게는 "발현 작제물"로도 알려짐)로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서 이용되는 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 개시내용에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 벡터 형태이기 때문에 상호 호환 가능하게 사용될 수 있다. 그러나, 동등한 기능을 하는 발현 벡터, 예컨대, 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스("AAV") 및 렌티바이러스)의 다른 형태가 또한 포함된다.

용어 "발현 벡터" 또는 "발현 작제물"은 핵산 암호화 서열의 일부 또는 모두가 전사될 수 있는 핵산을 포함하는 임의의 유형의 유전자 작제물을 의미한다.

"바이러스 벡터"는 관심 분자, 예를 들어, 단백질, 펩타이드 및 올리고뉴클레오타이드 또는 이들의 조합을 암호화 또는 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 영역을 포함하는 서열을 지칭한다. 바이러스 벡터는 유전자 물질을 세포에 전달하는 데 사용될 수 있다. 바이러스 벡터는 특정 용도를 위해 변형될 수 있다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 전달 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스 벡터이다.

용어 "아데노-연관 바이러스 벡터" 또는 "AAV 벡터"는 아데노-연관 바이러스의 구성성분을 포함하거나 이로부터 유래되고 포유류 세포, 바람하게는 인간 세포를 감염시키는 데 적합한 임의의 벡터를 지칭한다. 용어 AAV 벡터는 전형적으로 페이로드를 포함하는 AAV형 바이러스 입자 또는 비리온을 표기한다. AAV 벡터는 혈청형(즉, "위형" AAV)의 조합물을 포함하는 다양한 혈청형으로부터 또는 다양한 게놈(예를 들어, 단일 가닥 또는 자기-상보적)으로부터 유래될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "AAV2/6", "rAAV2/6" 또는 "위형 AAV2/6" 벡터는 AAV2로부터 유래된 ITR로부터 유래된 ITR이 각 말단 상에 측접된 α-Gal A 발현 카세트를 포함하는 본 개시내용의 AAV 발현 벡터(예를 들어, AAV-001 rAAV 벡터)를 지칭하되, α-Gal A 발현 카세트는 아데노-연관 바이러스 6형(AAV6)로부터 유래된 캡시드로 패키징된다.

또한, AAV 벡터는 복제결함이고/이거나 표적화될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "아데노-연관 바이러스"(AAV)는 AAV 1형, AAV 2형, AAV 3형(3A형 및 3B형 포함), AAV 4형, AAV 5형, AAV 6형, AAV 7형, AAV 8형, AAV 9형, AAV 10형, AAV 11형, AAV 12형, AAV 13형, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh.74, 뱀 AAV, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 양 AAV, 염소 AAV, 새우 AAV, 해당 AAV 혈청형 및 문헌[Gao et al. (J. Virol. 78:6381 (2004)]에 개시된 클레이드) 및 Moris 등의(Virol. 33:375 (2004)), 및 현재 알려진 또는 나중에 발견되는 임의의 다른 AAV를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 문헌[FIELDS et al. VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)] 참조. 일부 양상에서, "AAV 벡터"는 알려진 AAV 벡터의 유도체를 포함한다. 일부 양상에서, "AAV 벡터"는 변형된 또는 인공 AAV 벡터를 포함한다. 일부 양상에서, "AAV 벡터"는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)를 포함한다. 일부 양상에서, AAV 발현 벡터 혈청형은 AAV2/6이다.

일부 양상에서, AAV 벡터는 야생형 AAV 혈청형 서열에 대해 변형 또는 돌연변이된다.

적합한 벡터에 폴리뉴클레오타이드의 삽입은 상보적 응집 말단을 갖는 선택된 벡터에 적절한 폴리뉴클레오타이드 단편을 결찰시킴으로써 달성될 수 있다. 벡터는 벡터에 혼입된 세포의 선택 또는 식별을 제공하는 선택 가능한 마커 또는 리포터를 암호화하도록 조작될 수 있다. 선택 가능 마커 또는 리포터의 발현은 벡터에 포함된 다른 암호화 영역을 혼입 및 발현시키는 숙주 세포의 식별 및/또는 선택을 허용한다. 당업계에서 알려지고 사용되는 선택 가능 마커 유전자의 예는 암피실린, 스트렙토마이신, 겐타마이신, 카나마이신, 하이그로마이신, 비알라포스 제초제, 설폰아마이드 등에 대한 내성을 제공하는 유전자; 및 표현형 마커, 즉, 안토사이아닌 조절 유전자, 아이소펜타닐 트랜스퍼라제 유전자 등으로서 사용되는 유전자를 포함한다. 당업계에 알려진되고 사용된 예는 루시퍼라제(Luc), 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), β-갈락토시다제(LacZ), β-글루쿠로니다제(Gus) 등을 포함한다. 선택 가능 마커는 또한 리포터인 것으로 간주될 수 있다. 일부 양상에서, 전달 벡터는 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 벡터), 플라스미드, 지질, 단백질 입자, 박테리아 벡터, 리소좀, 바이러스-유사 입자, 중합체 입자, 엑소좀 또는 볼트(vault) 입자로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 개시내용의 일부 양상은 바이러스, 특히 약독 바이러스 및/또는 복제결함 바이러스를 포함할 수 있는 생물학적 벡터에 관한 것이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "프로모터"는 유전자의 전사를 개시하는 데 필요한, 세포의 기작 또는 도입된 합성 기작에 의해 인식되는 DNA 서열을 지칭한다. 용어 "프로모터"는 또한 외부 신호 또는 제제에 의해 세포 유형 특이적, 조직-특이적 또는 유도성에 대해 제어 가능한 프로모터-의존적 유전자 발현에 충분한 해당 핵산 요소를 포괄하는 것을 의미하며; 이러한 요소는 천연 유전자의 5' 또는 3' 영역에 위치될 수 있다. 일부 양상에서, 프로모터는 구성적 활성 프로모터, 세포 유형 특이적 프로모터 또는 유도성 프로모터이다. 일부 양상에서, 프로모터는 알파 1-안티트립신(hAAT) 프로모터이다.

일부 양상에서, 마이크로RNA 표적화 서열은 벡터-매개 이식유전자 발현의 특이성을 증가시키기 위해 포함된다. 예를 들어, 문헌[Anja Geisler and Henry Fechner, World J Exp Med., 20; 6(2):37-54 (2016)] 참조.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "인핸서"는 인접한 유전자의 전사를 자극 또는 저해하는 시스-작용성 요소이다. 전사를 저해하는 인핸서는 "사일런서"로도 지칭된다. 인핸서는 암호화 서열로부터 그리고 전사된 영역의 하류 위치로부터 최대 수 킬로베이스 쌍(kb)의 거리에 걸쳐, 배향 중 하나에서 기능할 수 있다(예를 들어, 암호화 서열과 관련될 수 있다). 일부 양상에서, 인핸서는 아포지질단백질 E(APOE) 인핸서이다. 일부 양상에서, APOE 인핸서는 hAAT 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "조절 가능한 프로모터"는 활성이 시스 또는 트랜스 작용 인자(예를 들어, 유도성 프로모터, 예컨대, 외부 신호 또는 제제)에 의해 영향받는 임의의 프로모터이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "구성적 프로모터"는 대부분의 경우 다수의 또는 모든 조직/세포 유형에서 RNA 생산을 지시하는 임의의 프로모터, 예를 들어, 포유류 세포에서 클로닝된 DNA 삽입의 구성적 발현을 촉진하는 인간 CMV 급초기 인핸서/프로모터 영역이다.

용어 "전사 조절 단백질", "전사 조절 인자" 및 "전사 인자"는 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용되고, DNA 반응 요소에 결합하고, 이에 의해 관련 유전자 또는 유전자들의 발현을 전사적으로 조절하는 핵 단백질을 지칭한다. 전사 조절 단백질은 일반적으로 DNA 반응 요소에 직접 결합하지만, 일부 경우에 DNA에 대한 결합은 DNA 반응 요소에 결합하고 결합된 다른 단백질에 결합함으로써 간접적으로 될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "종결 신호 서열"은 RNA 중합효소가 전사를 종결하게 하는 임의의 유전자 요소, 예를 들어 폴리아데닐화(폴리A 또는 pA) 신호 서열일 수 있다. 폴리아데닐화 신호 서열은 폴리아데닐화 공통 서열 AATAAA이 뒤에 이어지는 RNA 전사체의 내인성 절단의 내인성 절단에 필요한 인식 영역이다. 폴리아데닐화 신호 서열은 "폴리A 부위", 즉, 아데닌 잔기가 전사 후 폴리아데닐화에 의해 첨가될 수 있는 RNA 전사체 상의 부위를 제공한다.

용어 "작동 가능하게 연결된", "작동 가능하게 삽입된", "작동 가능하게 위치된", "제어하에" 또는 "전사 제어하에"는 프로모터가 RNA 중합효소 개시 및 유전자의 발현을 제어하기 위해 핵산에 관한 정확한 위치 및 배향에 있다는 것을 의미한다. 일부 양상에서, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 DNA 서열 및 조절 서열(들)이 적절한 분자(예를 들어, 전사 활성체 단백질)이 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 허용하기 위해 이러한 방법으로 연결된다는 것을 의미한다. 일부 양상에서, 용어 "작동 가능하게 삽입된"은 세포에 도입된 관심의 DNA가 도입된 DNA의 전사 및 번역을 지시하는(즉, 예를 들어, 관심 DNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 생산을 촉진하는) DNA 서열에 인접하여 위치된다는 것을 의미한다.

"암호화 서열" 또는 특정 분자(예를 들어, 적어도 하나의 α-Gal A 단백질)를 "암호화하는" 서열은 적절한 조절 서열, 예컨대, 프로모터에 작동 가능하게 연결될 때 시험관내에서 또는 생체내에서 폴리펩타이드로 (DNA의 경우) 전사 또는 (mRNA의 경우) 번역된 핵산이다. 암호화 서열의 경계는 5'(아미노) 말단에서 개시 코돈 그리고 3'(카복시) 말단에서 번역 중단 코돈에 의해 결정된다. 암호화 서열은 원핵 또는 진핵 mRNA로부터의 cDNA, 원핵 또는 진핵 DNA로부터의 게놈 DNA 서열, 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 전사 종결 서열은 보통 암호화 서열에 대해 3'에 위치될 것이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "~로부터 유래된"은 명시된 분자 또는 유기체로부터 단리되고 이를 사용하여 생성된 구성성분, 또는 명시된 분자 또는 유기체로부터의 정보(예를 들어, 아미노산 또는 핵산 서열)를 지칭한다. 예를 들어, 제2 핵산 서열(예를 들어, 다른 AAV 벡터)로부터 유래된 핵산 서열(예를 들어, AAV 벡터)은 제2 핵산 서열의 뉴클레오타이드 서열과 동일하거나 실질적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.

본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드의 경우에, 유래된 종은, 예를 들어, 자연 발생적 돌연변이유발, 인공 지정 돌연변이유발 또는 인공 무작위 돌연변이유발에 의해 얻어질 수 있다. 폴리뉴클레오타이드를 유도하기 위해 사용되는 돌연변이유발은 의도적 지정 또는 의도적 무작위 또는 각각의 혼합일 수 있다. 첫 번째로부터 유래된 상이한 폴리뉴클레오타이드를 생성하기 위한 폴리뉴클레오타이드의 돌연변이유발은 무작위 사건(예를 들어, 중합효소 부정확성(infidelity)에 의해 야기됨)일 수 있고, 유래된 폴리뉴클레오타이드의 식별은 적절한 선별 방법에 의해 이루어질 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "돌연변이"는 후속 세대로 전해질 수 있는 변이체("돌연변이체"로도 불림)를 생성하는 유전자 구조의 임의의 변화를 지칭한다. 유전자의 돌연변이는 DNA에서 단일 염기의 교대, 또는 유전자 또는 염색체의 더 큰 부문의 결실, 삽입 또는 재배열에 의해 야기될 수 있다.

용어 "핵산", "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 상호 호환 가능하게 사용되고, 선형 또는 원형 입체구조의 그리고 단일- 또는 이중가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 중합체를 지칭한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 이러한 용어는 중합체의 길이에 대한 제한으로서 해석되어서는 안 된다. 상기 용어는 자연적 뉴클레오타이드뿐만 아니라 염기, 당 및/또는 인산염 모이어티{예를 들어, 포스포로티오에이트 골격)에서 변형된 뉴클레오타이드의 알려진 유사체를 포괄할 수 있다. 일반적으로, 특정 뉴클레오타이드의 유사체는 동일한 염기쌍 특이성을 갖고; 즉, A의 유사체는 T와 염기쌍을 형성할 것이다. 일부 양상에서, 핵산 분자는 상보적 DNA(cDNA)일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 재조합적으로, 효소적으로 또는 합성에 의해, 예를 들어, 고상 화학 반응 다음에 정제에 의해 생성될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산의 서열을 언급할 때, 공여결합된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드의 핵염기 모이어티의 서열 또는 순서 또는 이의 변형이 언급된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "cDNA"는 주형으로서 DNA 또는 RNA 중 하나를 사용할 수 있는 DNA 중합효소인 역전사효소에 의해 생성된 전령 RNA(mRNA) 분자의 DNA 복제물이다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "mRNA"는 하나 이상의 폴리펩타이드 쇄의 아미노산 서열을 암호화하는 단일 가닥 RNA를 지칭한다.

핵산은 전체 세포에, 세포 용해물에 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 알칼리성/SDS 처리, CsCl 밴딩(banding), 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계에 잘 알려진 다른 것을 포함하는 표준 기법에 의해 다른 세포 구성성분 또는 다른 오염물질, 예를 들어, 다른 세포의 핵산(예를 들어, 염색체의 다른 부분) 또는 단백질로부터 정제될 때 "단리" 또는 "실질적으로 순수하게 제공"된다. 문헌[F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)] 참조.

핵산, 예를 들어, cDNA는 유전자 서열을 제공하기 위해 표준 기법에 따라 돌연변이될 수 있다. 암호화 서열의 경우, 이러한 돌연변이는 원하는 경우 아미노산 서열에 영향을 미칠 수 있다. 특히, 천연 V, D, J, 불변, 스위치 및 본 명세서에 기재된 다른 이러한 서열과 실질적으로 상동성이거나 이들로부터 유래된 DNA 서열이 상정된다("유래된"이, 서열이 다른 서열과 동일하거나 이로부터 변형된다는 것을 나타내는 경우).

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "안티센스"는 내인성 유전자의 발현을 방해하기 위해 유전자, 1차 전사체 또는 가공된 mRNA의 모두 또는 일부에 충분히 상보적인 핵산을 지칭한다. "상보적" 폴리뉴클레오타이드는 표준 왓슨-크릭 상보성 규칙에 따라 염기 짝짓기할 수 있는 것이다. 구체적으로는, 퓨린은 구아닌과 사이토신 쌍(G:C) 및 DNA의 경우 아데닌과 티미딘 쌍(A:T) 또는 RNA의 경우 아데닌과 유라실 쌍(A:U)의 조합을 형성하도록 피리미딘과 염기쌍을 이룰 것이다. 두 폴리뉴클레오타이드가 서로 완전히 상보적이지 않은 경우조차도, 서로 실질적으로 상보적인 적어도 하나의 영역을 각각 갖는다는 조건하에서, 서로 혼성화할 수 있다는 것이 이해된다.

용어 "안티센스 가닥" 및 "가이드 가닥"은 표적 서열, 예를 들어, mRNA에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 dsRNA의 가닥, 예를 들어, shRNA를 지칭한다. 안티센스 가닥은 표적-특이적 침묵을 지시하는 목적하는 mRNA 서열에 충분히 상보적인 서열, 예를 들어, RNAi 기작 또는 과정에 의해 목적하는 표적 mRNA의 파괴를 촉발하는 데 충분한 상보성을 갖는다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "센스 가닥" 및 "운송 가닥(passenger strand)"은 본 명세서에 정의된 용어인 안티센스 가닥의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 dsRNA의 가닥, 예를 들어, shRNA를 지칭한다. dsRNA, 예를 들어, shRNA의 안티센스 및 센스가닥은 혼성화되어 이중가닥 구조를 형성한다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 "유전자"는 유전자 산물을 암호화하는 DNA 영역뿐만 아니라 이러한 조절 서열이 암호화 서열 및/또는 전사된 서열에 인접하든 아니든 유전자 산물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역을 포함한다. 따라서, 유전자는 프로모터 서열, 종결자, 번역 조절 서열, 예컨대, 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 유입 부위, 인핸서, 사일런서, 절연체, 경계 요소, 복제기점, 기질 부착 부위 및 좌위 제어 영역을 포함하지만, 반드시 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "이식유전자"는 다른 유기체의 게놈에 도입된 하나의 유기체로부터의 DNA 세그먼트를 지칭한다. 이식유전자가 세포 자체의 게놈에 통합되고 거기서 유지되도록, 이식유전자는 다양한 방법에 의해 세포에 전달될 수 있다. 최근 몇년에, 선택된 게놈 좌위에 표적화된 삽입을 위해 부위-특이적 뉴클레아제에 의한 절단을 사용하는 이식유전자 통합을 위한 전략이 개발되었다(예를 들어, 미국 특허 제7,888,121호 참조). 뉴클레아제, 예컨대, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성체-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN) 또는 뉴클레아제 시스템, 예컨대, RNA 가이드된 CRISPR/Cas 시스템(조작된 가이드 RNA를 이용)은 표적화된 유전자에 특이적이며, 이식유전자 작제물이 상동직접수선(homology directed repair: HDR)에 의해 또는 비상동성 말단봉합(non-homologous end joining: NHEJ) 유도 과정 동안 말단 포획에 의해 삽입되도록 이용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제9,394,545호; 제9,255,250호; 제9,200,266호; 제9,045,763호; 제9,005,973호; 제9,150,847호; 제8,956,828호; 제8,945,868호; 제8,703,489호; 제8,586,526호; 제6,534,261호; 제6,599,692호; 제6,503,717호; 제6,689,558호; 제7,067,317호; 제7,262,054호; 제7,888,121호; 제7,972,854호; 제7,914,796호; 제7,951,925호; 제8,110,379호; 제8,409,861호; 미국 특허 공개 제20030232410호; 제20050208489호; 제20050026157호; 제20050064474호; 제20060063231호; 제20080159996호; 제201000218264호; 제20120017290호; 제20110265198; 20130137104호; 제20130122591호; 제20130177983호; 제20130196373호; 제20140120622호; 제20150056705호; 제20150335708호; 제20160030477호 및 제20160024474호를 참조하며, 이의 개시내용은 이들의 전문이 참조에 의해 원용된다.

이식유전자는 다양한 방법으로 도입되고 유지될 수 있다. "cDNA" 접근에 따라, 이식유전자가 세포의 염색질에 통합을 통하기보다는 염색체외에서 유지되도록 이식유전자가 세포에 도입된다. 이식유전자는 원형 벡터(예를 들어, 플라스미드, 또는 비통합 바이러스 벡터, 예컨대, AAV 또는 렌티바이러스) 상에서 유지될 수 있고, 여기서, 벡터는 전사 조절 서열, 예컨대, 프로모터, 인핸서, 폴리A 신호 서열, 인트론 및 스플라이싱 신호(미국 특허 공개 제20170119906호)를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 이식유전자를 포함한다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 이식유전자는 야생형 α-Gal A 서열 또는 코돈-최적화된 α-Gal A 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 α-GalA 이식유전자는 서열번호 5에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "유전자 발현"은 유전자에 들어있는 정보를 유전자 산물로 전환하는 것을 지칭한다. 유전자 산물은 유전자의 직접 전사 산물(예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 구조적 RNA 또는 임의의 다른 유형의 RNA) 또는 mRNA의 번역에 의해 생산되는 단백질일 수 있다. 유전자 산물은 또한 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화 및 편집과 같은 과정에 의해 변형된 RNA, 및 예를 들어, 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화 및 글리코실화에 의해 변형된 단백질을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "GLA 유전자"는 본 명세서에 논의된 바와 같은 적어도 하나의 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 단백질을 암호화한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 유전자 발현의 "조절"이라는 용어는 유전자 활성의 변화를 지칭한다. 발현의 조절은 유전자 활성화 및 유전자 억제를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 게놈 편집(예를 들어, 절단, 변경, 비활성화, 무작위 돌연변이)은 발현을 조절하는 데 사용될 수 있다. 유전자 비활성화는, 예를 들어, ZFP, TALE 또는 CRISPR/Cas 시스템을 포함하지 않는 세포에 비해서 유전자 발현의 임의의 감소를 지칭한다. 따라서, 유전자 비활성화는 부분적이거나 완전할 수 있다.

"관심 영역"은, 외인성 분자에 결합하는 것이 바람직한 유전자 내의 또는 이에 인접한, 예를 들어, 유전자 또는 비암호화 서열과 같은 세포의 염색질의 임의의 영역이다. 결합은 표적화된 DNA 절단 및/또는 표적화된 재조합의 목적을 위한 것일 수 있다. 관심 영역은, 예를 들어, 염색체, 에피솜, 세포소기관 게놈(예를 들어, 미토콘드리아, 엽록체), 또는 감염성 바이러스 게놈에 존재할 수 있다. 관심 영역은 유전자의 암호화 영역 내, 전사된 비-암호화 영역, 예를 들어, 리더 서열, 트레일러(trailer) 서열 또는 인트론 내, 또는 비전사 영역 내, 암호화 영역의 상류 또는 하류 중 하나에 있을 수 있다. 관심 영역은 단일 뉴클레오타이드 쌍만큼 작거나 또는 최대 2,000개의 뉴클레오타이드 쌍 길이, 또는 뉴클레오타이드 쌍의 임의의 정수 값일 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "진핵 세포"는 줄기세포(만능 및 다능성)를 포함하는, 진균 세포(예컨대, 효모 세포), 식물 세포, 동물 세포, 포유류 세포 및 인간 세포(예를 들어, 간 세포, 근육 세포, 적혈구 등)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "분비 조직"은 개개 세포로부터 생성물을 전형적으로 상피로부터 유래된 일부 유형의 내강으로 분비하는 동물의 해동 조직이다. 위장관으로 국소화된 분비 조직의 예는 장, 췌장 및 담낭 내벽의 세포를 포함한다. 다른 분비 조직은 간, 눈과 관련된 다른 조직 및 점막, 예컨대, 침샘, 유선, 전립선, 뇌하수체 및 내분비계의 다른 구성원을 포함한다. 추가로, 분비 조직은 분비될 수 있는 조직 유형의 개개 세포를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드"는 단일 "폴리펩타이드"뿐만 아니라 복수의 "폴리펩타이드"를 포괄하고 둘 이상의 아미노산의 임의의 쇄 또는 쇄들을 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 바와 같이 "펩타이드", "펩타이드 서브유닛", "단백질", "아미노산 쇄", "아미노산 서열" 또는 둘 이상의 아미노산의 쇄 또는 쇄들을 지칭하기 위해 사용되는 임의의 다른 용어는, 이러한 용어 각각이 더 구체적인 의미를 가질 수 있지만, "폴리펩타이드"의 정의에 포함된다. 용어 "폴리펩타이드"는 임의의 이러한 용어 대신 사용되거나, 상호 호환 가능하게 사용될 수 있다. 상기 용어는 번역 후 또는 합성 후 변형, 예를 들어, 팔미토일기의 접합, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아마이드화, 알려진 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질 분해 절단 또는 비-자연 발생적 아미노산에 의한 변형을 겪는 폴리펩타이드를 추가로 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "펩타이드"는 전장 펩타이드 및 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포괄한다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 "펩타이드"는 반감기를 증가시키기 위해 추가 구성성분, 예컨대, Fc 도메인 또는 알부민 도메인을 포함하는 융합 폴리펩타이드의 부분일 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 펩타이드는 또한 다수의 상이한 방법으로 유도체화될 수 있다. 본 명세서에 기재된 펩타이드는, 예를 들어, 팔미토일기의 접합을 포함하는 변형을 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "이의 기능적 단편"은 전체 단백질과 관련된 것 또는 기능을 여전히 할 수 있는(예를 들어, 면역 반응을 자극, 조율, 조절 또는 변형하는) 단백질, 예를 들어, α-갈락토시다제 A 단백질의 단편 또는 일부를 지칭한다.

용어 "α-갈락토시다제 A", "α-Gal A" 및 "GAL"은 상호 호환 가능하게 사용되고, 갈락토스 올리고당, 갈락토만난 및 갈락토지질을 포함하는 α-D-갈락토사이드에서 말단의, 비환원 α-D-갈락토스 잔기의 가수분해를 포함하는 효소 활성을 갖는 단백질을 지칭한다. 일부 양상에서, α-Gal A는 IUBMB 효소 명명법 EC 3.2.1.22(예를 들어, 문헌[Suzuki et al., J. Biol. Chem. 245:781-786(1970); Wiederschain, G. and Beyer, E. Dokl. Akad. Nauk S.S.S.R. 231:486-488 (1976)]에 기재된 바와 같음)에 의해 기재된 효소를 포함한다. 일부 양상에서, α-Gal A는 인간 GLA 유전자, 예를 들어, GenBank 수탁번호 NM_000169에 의해 규정된 인간 α-Gal A 유전자를 포함하는 핵산에 의해 암호화된 단백질을 포함한다. 일부 양상에서, α-Gal A는 GenBank 수탁번호 NP_000160에 의해 규정된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 포함한다.

일부 양상에서, GAL은 α-Gal A를 내인성으로 발현시키는 세포로부터 얻어질 수 있거나, α-Gal A는 재조합 인간 α-Gal A(rhα-Gal A)일 수 있다. 일부 양상에서, rhα-Gal A는 전장 야생형 α-Gal A이다. 일부 양상에서, rhα-Gal A는 야생형 α-Gal A에 존재하는 아미노산 잔기의 서브세트를 포함하되, 서브세트는 기질 결합 및/또는 기질 감소를 위한 활성 부위를 형성하는 야생형 α-Gal A의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 양상에서, rhα-Gal A는 기질 결합 및/또는 기질 감소를 위해 야생형 α-Gal A 활성 부위뿐만 아니라 야생형 α-Gal A에 존재하지 않을 수(도) 있는 다른 아미노산 잔기를 포함하는 융합 단백질이다.

α-Gal A는 상업적 공급원으로부터 얻어질 수 있거나, 당업자에게 알려진 합성 기법에 의해 얻어질 수 있다. 야생형 효소는 재조합 세포 발현 시스템(예를 들어, 포유류 세포, 예컨대, CHO 세포 또는 곤충 세포, 예를 들어, 미국 특허 제5,580,757호; 제6,395,884호; 제6,458,574호; 제6,461,609호; 제6,210,666호; 제6,083,725호), 인간 태반 또는 동물 유즙으로부터 정제될 수 있다.

약제학적 용도에 적합한 α-Gal A를 얻기 위한 다른 합성 기법은, 예를 들어, 미국 특허 제7,560,424호; 제7,396,811호; 제423,135호; 제6,534,300호; 및 제6,537,785호; 미국 특허 공개 제2009/0203575호; 제2009/0029467호; 제2008/0299640호; 제2008/0241118호; 제2006/0121018호; 제2005/0244400호; 제2007/0280925호; 및 제2004/0029779호 및 국제 특허 출원 공개 제2005/077093호에서 찾을 수 있다.

일부 양상에서, α-Gal A는 인간 세포주에서 유전자 조직 기술에 의해 생성되는 아갈시다제 알파이다. 아갈시다제 알파는 Shire Plc.(아일랜드 더블린 소재)로부터의 레프라갈®로서 입수 가능하다. 일부 양상에서, α-Gal A는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주에서 재조합 DNA 기술에 의해 생성되는 아갈시다제 베타이다. 아갈시다제 베타는 Sanofi Genzyme(매사추세츠주 캠브리지 소재)로부터의 Fabrazyme®로서 입수 가능하다. 일부 양상에서, α-Gal A는 JR-051로서 확인된 인간 α-Gal A 유전자를 암호화하는 발현 벡터(JCR Pharmaceuticals Co. Ltd(일본 소재))로 형질전환된 CHO 세포에서 생성된 재조합 인간 α-Gal A이다.

본 명세서에 기재된 인간 α-Gal A 단백질과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 추가로, 본 개시내용은 또한 "실질적으로 유사한" α-Gal A 단백질을 포괄한다. 참조 단백질과 "실질적으로 유사한" 것으로 본 명세서에 기재된 단백질은 천연 단백질의 일부 구조적 및 기능적 특징을 유지하지만 하나 이상의 아미노산 위치에서 천연 아미노산 서열과 다른(즉, 아미노산 치환에 의한) 단백질을 포함한다.

천연 서열로부터 변경된 단백질은 천연 단백질 내의 아미노산 잔기를 치환하고 목적하는 활성을 갖는 단백질을 선택함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, α-Gal A 단백질의 아미노산 잔기는 다른 잔기로 체계적으로 치환될 수 있고, 이어서, 치환된 단백질은 갈락토스 올리고당, 갈락토만난 및 갈락토지질을 포함하는 α-D-갈락토사이드에서 말단, 비환원 α-D-갈락토스 잔기를 가수분해하는 단백질의 능력 및/또는 파브리병을 치료하거나 예방하는 능력에 대한 이러한 치환의 효과를 평가하기 위한 표준 검정에서 시험될 수 있다.

일부 양상에서, 기능적 활성을 유지하기 위해, 보존적 아미노산 치환이 이루어진다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "보존적 아미노산 치환"은 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로의 아미노산 잔기의 치환을 지칭한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 일부 양상에서, α-Gal A 단백질에서 예측된 비필수 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체된다. 항원 결합을 제거하지 않는 뉴클레오타이드 및 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); 및 Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)] 참조).

일부 양상에서, 본 개시내용의 α-Gal A 단백질은 본 명세서에 기재된 또는 당업계에 알려진 α-Gal A 단백질의 아미노산 서열과 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다.

두 서열 사이의 동일성 백분율은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치 수의 함수(즉, 상동성% = 동일한 위치의 #/위치의 총 # × 100)이며, 두 서열의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수, 및 각 갭의 길이를 고려한다. 아래의 비제한적 실시예에 기재된 바와 같이, 서열의 비교 및 두 서열 사이의 동일성 백분율의 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다.

두 뉴클레오타이드 서열 사이의 동일성 백분율은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지(worldwideweb.gcg.com에서 이용 가능)에서 GAP 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 두 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은 또한 PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용해서 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 혼입된 E. Meyers 및 W. Miller의 알고리즘(CABIOS, 4: 11-17 (1989))을 사용해서 결정될 수 있다. 또한, 두 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치 중 하나를 이용하여, GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램(http://www.gcg.com에서 이용 가능)에 혼입된 Needleman 및 Wunsch(J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.

본 명세서에 기재된 핵산 및 단백질 서열은 추가로, 예를 들어, 동일성 관련 서열에 대한 공공 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위해 "질의 서열"로서 사용될 수 있다. 이러한 검색은 문헌[Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 본 명세서에 기재된 핵산 분자와 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 얻기 위해 NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 단어 길이 = 12로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 명세서에 기재된 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 얻기 위해 XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 단어 길이 = 3으로 수행될 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 정렬을 얻기 위해, Gapped BLAST가 문헌[Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때, 각 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. worldwideweb.ncbi.nlm.nih.gov 참조.

"항체"(Ab)는 항원에 특이적으로 결합하고 이황화결합에 의해 상호 연결되는 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질 면역글로불린 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 각각의 H 쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 V _H 로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 불변 도메인, 즉, C _H ₁, C _H ₂ 및 C _H ₃를 포함한다. 각각의 경쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 V _L 로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 불변 도메인인 C _L 을 포함한다. V _H 및 V _L 영역은 추가로 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는 더 보존된 영역이 배치된 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변성의 영역으로 다시 나누어질 수 있다. 각각의 V _H 및 V _L 은 다음의 순서로 아미노-말단에서 카복시-말단으로 배열되는 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 효과기 세포) 및 고전적 상보 시스템의 제1 구성성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 용어 "항-GAL 항체"는, 예를 들어, α-Gal A에 특이적으로 결합하는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 완전한 항체 및 완전한 항체의 항원-결합 부분을 포함한다.

면역글로불린은 IgA, 분비 IgA, IgG 및 IgM을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 통상적으로 알려진 아이소타입으로부터 유래될 수 있다. IgG 하위부류는 또한 당업계에 잘 알려져 있으며, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. "아이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 암호화된 항체 부류 또는 하위부류(예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다. 용어 "항체"는, 예로서, 자연 발생적 항체와 비-자연 발생적 항체 둘 다; 단클론성 항체 및 다클론성 항체; 키메라 및 인간화된 항체; 인간 또는 비인간 항체; 전체 합성 항체; 및 단일쇄 항체를 포함한다. 비인간 항체는 인간에서 이의 면역원성을 감소시키기 위해 재조합 방법에 의해 인간화될 수 있다. 분명하게 언급되지 않은 경우 및 달리 문맥에서 지시되지 않는 한, 용어 "항체"는 또한 임의의 앞서 언급한 면역글로불린의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 부분을 포함하고, 1가 및 2가 단편 또는 부분 및 단일쇄 항체를 포함한다.

"단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다(예를 들어, α-Gal A에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 α-Gal A 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나, α-Gal A에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예컨대, 상이한 종으로부터의 α-Gal A 분자와 교차 반응성을 가질 수 있다. 또한, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.

"항-항원 항체"는 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 항-GAL 항체는 GAL에 특이적으로 결합한다.

용어 "항-GLA 중화항체", "항-GLA NAb", "항-약물 항체", "ADA", "중화 항-약물 항체" 또는 "중화 ADA"는 α-Gal A 효소에 결합하고 비활성화시키는(중화시키는) 항체를 지칭한다. 일부 양상에서, 항-GLA 중화 항체가 존재한다면, 효소 대체 요법은 혈장에서 항-GLA 중화 항체에 의해 직접 비활성화된다(중화된다)(Linthorst et al., Kidny Int 66:1589-1595 (2004); Lenders et al., J Allergy Clin Immunol 141:2289-2292.e7 (2018)).

항체의 "항원-결합 부분"(또한 "항원-결합 단편"으로 불림)은 전체 항체에 의해 결합되는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다는 것이 나타났다. 항체, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 항-GLA 3 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포괄되는 결합 단편의 예는 (i) Fab 단편(파파인 절단으로부터의 단편) 또는 V_L, V_H, LC 및 CH1 도메인으로 이루어진 유사한 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편(펩신 절단으로부터의 단편) 또는 힌지 영역에서 이황화 브리지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 유사한 2가 단편; (iii) V_H 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 V_L 및 V_H 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) V_H　도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR) 및 (vii) 선택적으로 합성 링커에 의해 연결될 수 있는 둘 이상의 단리된 CDR의 조합을 포함한다. 더 나아가, Fv 단편의 두 도메인, 즉, V_L　및 V_H가 별개의 유전자에 의해 암호화된다고 해도, 이들은, V_L　및 V_H　영역이 쌍을 이루어 1가 분자(단일쇄 Fv(scFv)로 알려짐; 예를 들어, 문헌[Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조)를 형성하는 단일 단백질로서 생성되는 것을 가능하게 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있다. 이러한 단일쇄 항체는 또한 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포괄되는 것으로 의도된다. 이러한 항체 단편은 당업자에게 알려진 통상적인 기법을 사용하여 얻어지고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 효용에 대해 선별된다. 항원-결합 부분은 재조합 DNA 기법에 의해, 또는 무손상 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다.

"결합 친화도"는 일반적으로 분자의 단일 결합 부위(예를 들어, 항체)와 이의 결합 상대(예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 표시되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "결합 친화도"는 결합쌍의 구성원(예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 본래의 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 이의 상대 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리상수(K_D)로 표시될 수 있다. 친화도는 평형 해리상수(K_D), 및 평형 결합상수(K_A)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 다수의 당업계에 알려진 방법으로 측정 및/또는 발현될 수 있다. K_D는 k_off/k_on의 몫으로부터 계산되고, 몰농도(M)로서 표현되며, K_A는 k_on/k_off의 몫으로부터 계산된다. k_on은, 예를 들어, 항체 대 항원의 결합 속도 상수를 지칭하고, k_off는, 예를 들어, 항체 대 항원의 해리를 지칭한다. k_on 및 k_off는 당업자에게 알려진 기법, 예컨대, 면역분석법(예를 들어, 효소결합면역흡착 검정(ELISA)), BIAcore^®, BLI(생물층 간섭계) 또는 동력학 배제 검정(kinetic exclusion assay)(KinExA^®)에 의해 결정될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합한다", "특이적으로 인식한다", "특이적 결합", "선택적 결합" 및 "선택적으로 결합한다"는 항체와 관련하여 유사한 용어이고, 항원(예를 들어, 에피토프 또는 면역 복합체)에 결합하는 분자(예를 들어, 항체)를 지칭하며, 이러한 결합은 당업자에 의해 이해되는 바와 같다. 예를 들어, 항원에 특이적으로 결합하는 분자는, 예를 들어, 면역분석법, BIAcore^®, KinExA^® 3000 기기(Sapidyne Instruments, 아이다호주 보이시 소재), 또는 당업계에 알려진 다른 검정에 의해 결정되는 바와 같은 더 낮은 친화도로 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 특정 양상에서, 항원에 특이적으로 결합하는 분자는 분자가 다른 항원에 결합할 때의 K_A 보다 적어도 2 log, 2.5 log, 3 log, 4 log 이상인 K_A로 항원에 결합한다.

항체는 전형적으로 10^-5 내지 10^-11M 이하의 해리상수(K_D)에 의해 반영되는 고친화도로 이들의 동족 항원에 특이적으로 결합한다. 약 10^-4M 초과의 임의의 K_D는 비특이적 결합을 나타내는 것으로 간주된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 항원에 "특이적으로 결합하는" 항체는, 예를 들어, 사전결정된 항원을 사용하는 BIACORE™ 2000 기기 또는 BLI(생물층 간섭계)에서 면역분석법(예를 들어, ELISA) 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술에 의해 결정될 때, 10^-7M 이하, 바람직하게는 10^-8M 이하, 훨씬 더 바람직하게는 10^-9M 이하, 가장 바람직하게는 10^-8M 내지 10^-10M 이하의 K_D를 갖는 것을 의미하는 고친화도로 항원 및 실질적으로 동일한 항원에 결합하지만, 관련 없는 항원에 대해 고친화도로 결합하지 않는 항체를 지칭한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "재조합 숙주 세포"(또는 단순히 "숙주 세포")는 세포에 자연적으로 존재하지 않는 핵산을 포함하는 세포를 지칭하는 것으로 의도되고, 재조합 발현 벡터가 도입된 세포일 수 있다. 이러한 용어는 특정 대상체 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손을 지칭하는 것으로 의도된다는 것이 이해되어야 한다. 일부 변형은 돌연변이 또는 환경 영향으로 인해 다음 세대에서 발생될 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실 모 세포와 동일할 수는 없지만, 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범주 내에 여전히 포함된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "연결된"은 둘 이상의 분자의 결합을 지칭한다. 결합은 공유 또는 비공유일 수 있다. 결합은 또한 유전적(즉, 재조합적으로 융합됨)일 수 있다. 이러한 결합은 화학적 접합 및 재조합 단백질 생성과 같은 당업계에서 인식되는 다양한 기법을 사용하여 달성될 수 있다.

용어 "파브리병"은 고전적 파브리병, 후기 발병 파브리병 및 α-Gal A를 암호화하는 유전자에서 돌연변이를 갖는 반접합성 여성을 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "파브리병"은 대상체가 정상적인 내인성 α-Gal A 활성보다 낮은 활성을 나타내는 임의의 병태를 추가로 포함한다. 파브리병은 다수의 다른 명칭, 예를 들어, 알파-갈락토시다제 A 결핍증, 앤더슨-파브리병, 미만성 구간 혈관각화종, 광범위 혈관각화종, 제세라마이드 트라이헥소시다 결핍증, 파브리병, GLA 결핍증 및 유전성 이소성 지방증으로 지칭된다. 일부 양상에서, 파브리병은 1형 고전적 표현형 또는 2형 후기 발병 표현형이다.

용어 "효소 대체 요법" 또는 "ERT"는 이러한 효소(예를 들어, α-Gal A)에서 결핍증을 갖는 개체에의 비-천연, 정제된 효소의 도입을 지칭한다. 투여되는 효소는 천연 공급원으로부터 또는 재조합 발현에 의해 얻어질 수 있다. 상기 용어는 또한 달리 정제된 효소의 투여를 필요로 하거나 투여로부터 유익을 얻는, 예를 들어, 단백질 기능부전증을 앓고 있는 개체에서의 정제된 효소의 도입을 지칭한다. 도입된 효소는 시험관내에서 생성된 정제된 재조합 효소, 또는 단리된 조직 또는 유체, 예컨대, 태반 또는 동물 유즙으로부터, 또는 식물로부터 정제된 효소일 수 있다.

용어 "공동 제형화"는 α-Gal A 효소(예를 들어, 1-데옥시갈락토노지리마이신(DGJ))에 대해 활성 부위-특이적 샤페론(ASSC)과 함께 제형화되는 효소, 예컨대, ERT에 대해 사용되는 효소(예를 들어, 인간 재조합 α-Gal A 효소(rhα-Gal A))를 포함하는 조성물을 지칭한다. 일부 양상에서, ASSC는 1-데옥시갈락토노지리마이신(DGJ) 또는 1-데옥시갈락토노지리마이신의 약제학적으로 허용 가능한 염, 에스터 또는 프로드러그이다. 일부 양상에서, 염은 염산염(즉, 1-데옥시갈락토노지리마이신-HCl)이다. 일부 양상에서, 공동 제형화로 대상체를 치료하는 것은 α-Gal A 효소 및 ASSC가 공동 제형화의 부분과 동시에 투여되도록 대상체에게 공동 제형을 투여하는 것을 포함한다.

용어 "병용요법"은 이것이 개별적으로 수행될 때 각 요법의 효과에 비해 결과가 향상된 임의의 요법을 지칭한다. 병용요법에서 개개 요법은 동시에 또는 연속해서 투여될 수 있다.

향상은 단독으로 수행될 때의 요법에 의해 달성되는 결과와 비교할 때 유리한 결과를 초래할 수 있는 다양한 요법의 효과의 임의의 개선을 포함할 수 있다. 향상된 효과 및 향상된 효과의 결정은, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 시간적 매개변수(예를 들어, 치료 길이, 회복 시간, 치료의 장기간 효과 또는 치료의 가역성); 생물학적 매개변수(예를 들어, 세포수, 세포 용적, 세포 조성물, 조직 용적, 조직 크기, 조직 조성물); 공간적 매개변수(예를 들어, 조직 강도, 조직 크기 또는 조직 접근성) 및 생리학적 매개변수(예를 들어, 신체 윤곽, 통증, 불편함, 회복 시간 또는 눈에 보이는 표시)와 같은 다양한 매개변수에 의해 측정될 수 있다. 향상된 효과는 상승적 향상을 포함할 수 있되, 향상된 효과는 단독으로 수행될 때의 각 요법의 상가적 효과보다 더 크다. 향상된 효과는 또한 상가적 향상을 포함할 수 있되, 향상된 효과는 단독으로 수행될 때의 각 요법의 상가적 효과와 실질적으로 동일하다. 향상된 효과는 상승적 효과보다 덕 적은 효과를 포함할 수 있되, 향상된 효과는 단독으로 수행될 때의 각 요법의 상가적 효과보다 더 낮지만, 여전히 단독으로 수행될 때의 각 요법의 효과보다 더 양호하다.

용어 "적절한 입체구조를 안정화시키다"는, 야생형 또는 돌연변이체 단백질의 구조가 이의 천연 또는 적절한 형태로서 유지될 수 있는 방법으로, 야생형 단백질과 결합하는 화합물 또는 펩타이드 또는 다른 분자의 능력, 또는 시험관내 및 생체내에서 야생형 기능을 수행할 수 있는 돌연변이체 단백질의 능력을 지칭한다. 이 효과는 그 자체가 (i) 단백질의 저장수명 증가; (ii) 단백질의 단위/양당 더 높은 활성; 또는 (iii) 더 높은 생체내 효능 중 하나 이상을 통해 실제로 나타날 수 있다. 이는 발현 동안 ER로부터 증가된 수율; 온도 증가(예를 들어, 열 안정성 분석에서 결정됨), 또는 무질서 유발제의 존재로 인해, 그리고 유사한 수단에 의해 언폴딩에 대한 더 큰 저항을 통해 실험적으로 관찰될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "활성 부위"는 일부 특정 생물학적 활성을 갖는 단백질의 영역을 지칭한다. 예를 들어, 이는 기질 또는 다른 결합 상대에 결합하고 화학적 결합의 제조 및 파손에 직접 참여하는 아미노산 잔기에 기여하는 부위일 수 있다. 본 출원에서 활성 부위는 효소의 촉매 부위, 항체의 항원 결합 부위, 수용체의 리간드 결합 도메인, 조절제의 결합 도메인 또는 분비된 단백질의 수용체 결합 도메인을 포괄할 수 있다. 활성 부위는 또한 전사 인자 및 조절자의 전사활성화, 단백질-단백질 상호작용 또는 DNA 결합 도메인을 포괄할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "활성 부위-특이적 샤페론"은 특이적으로 단백질의 활성 부위와 가역적으로 상호작용하고 안정한 분자 입체구조의 형성을 향상시키는 단백질, 펩타이드, 핵산, 탄수화물 등을 포함하는 임의의 분자를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "활성 부위-특이적 샤페론"은 Bip, 칼넥신(calnexin) 또는 칼레티쿨린(calreticulin)과 같은 세포의 ER에 존재하는 내인성의 일반적 샤페론, 또는 중수소화된 물, DMSO 또는 TMAO와 같은 일반적인, 비특이적 화학적 샤페론을 포함하지 않는다.

용어 "비효소 대체 요법"은 효소 대체 요법이 아닌 요법(예를 들어, 파브리병 요법)을 지칭한다. 비효소 대체 요법은 소분자 요법을 포함할 수 있다. 파브리병의 소분자 요법에 대한 일부 신흥 약물 개발 전략은 기질 감소 요법(SRT), 잔여 효소 활성화, GLA 프로모터 활성화, 단백질 항상성 조절 (단백질 정체) 및 화학적 샤페론 요법(CCT)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

용어 "면역요법"은 면역 반응을 유도, 향상, 억제 또는 달리 변형시키는 것을 포함하는 방법에 의해 질환을 앓고 있거나, 질환에 걸릴 위험에 있거나 질환 재발할 위험에 있는 대상체의 치료를 지칭한다. 대상체의 "치료" 또는 "요법"은 질환(예를 들어, 파브리병)과 관련된 증상, 합병증 또는 병태 또는 생화학적 징후의 발병, 진행, 발생, 중증도 또는 재발을 반전, 완화, 개선, 저해, 늦춤 또는 예방할 목적으로 대상체에서 수행되는 임의의 유형의 개입 또는 과정 또는 활성제의 투여를 지칭한다. "면역억제 요법"은 대상체에서 면역 반응을 줄이는(감소시키는) 것을 초래하는 요법을 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 어구 "세포와 접촉시키는"(예를 들어, AAV 발현 벡터 또는 본 개시내용의 조성물을 세포와 접촉시키는)은 세포와 직접적으로 또는 간접적으로 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 양상에서, AAV 발현 벡터 또는 본 개시내용의 조성물을 세포와 접촉시키는 것은 시험관내에서 조성물 또는 AAV 벡터를 세포와 접촉시키는 것 또는 생체내에서 AAV 벡터 또는 본 개시내용의 조성물을 세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 따라서, 예를 들어, AAV 벡터 또는 본 개시내용의 조성물은 상기 방법을 수행하는 개체에 의해 세포와 물리적으로 접촉될 수 있고, 또는 대안적으로, AAV 벡터 또는 본 개시내용의 조성물은 후속적으로 세포와 접촉하는 것을 허용하거나 유발하는 상황에 놓일 것이다.

일부 양상에서, 시험관내에서 세포와 접촉하는 것은, 예를 들어, AAV 벡터를 세포와 인큐베이션시킴으로써 행해질 수 있다. 일부 양상에서, 생체내에서 세포와 접촉시키는 것은, 후속적으로 접촉될 세포가 위치된 조직에 제제가 도달하도록, 예를 들어, AAV 벡터 또는 본 개시내용의 조성물을 세포가 위치된 조직에 또는 조직 근처에 주사함으로써, 또는 AAV 벡터 또는 본 개시내용의 조성물을 다른 영역, 예를 들어, 혈류 또는 피하 공간에 주사함으로써 행해질 수 있다. 예를 들어, AAV 벡터는 캡슐화되고/되거나 AAV 벡터를 관심 부위로 보내는 리간드에 결합될 수 있다. 시험관내 및 생체내에서 접촉시키는 방법의 조합이 또한 가능하다. 예를 들어, 세포는 시험관내에서 AAV 벡터 또는 본 개시내용의 조성물과 접촉되고, 후속적으로 대상체에게 이식될 수 있다.

일부 양상에서, 세포와 AAV 벡터 또는 본 개시내용의 조성물을 접촉시키는 것은 세포 내로의 흡수율 또는 흡수를 촉진시키거나 달성함으로써 AAV 벡터 또는 본 개시내용의 조성물을 세포 내로 (직접적 또는 간접적으로) "도입" 또는 "전달"하는 것을 포함한다. 세포 내로 AAV 벡터 또는 본 개시내용의 조성물을 도입하는 것은 시험관내 및/또는 생체내일 수 있다. 예를 들어, 생체내 도입을 위해, AAV 벡터 또는 본 개시내용의 조성물은 특정 조직 부위(예를 들어, 치료 효과가 요망되는 좌위)에 주사될 수 있거나 전신 투여될 수 있다(예를 들어, 치료 효과가 요망되는 좌위에 AAV 벡터를 투여함). 세포 내로의 시험관내 도입은 전기천공법 및 리포펙션과 같은 당업계에 알려진 방법을 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 예를 들어, AAV 벡터 또는 본 명세서에 개시된 조성물의 "유효량", "치료적 유효량" 및 "충분한 양"이라는 용어는 인간을 포함하는 대상체에게 투여될 때, 임상 결과를 포함하는 유리한 또는 목적하는 결과를 달성하기에 충분한 양을 지칭하며, 이렇게 해서, "유효량" 또는 이의 동의어는 이것이 적용되는 문맥에 따른다. 일부 양상에서, 치료적 유효량의 제제(예를 들어, AAV 벡터 또는 본 명세서에 개시된 조성물)는 대조군에 비해 대상체에서 유리한 또는 목적하는 결과를 초래하는 양이다.

주어진 제제(예를 들어, AAV 벡터 또는 본 명세서에 개시된 조성물)의 양은 다양한 인자, 예컨대, 주어진 제제, 약제학적 제형, 투여 경로, 질환 또는 장애의 유형, 대상체의 신원(예를 들어, 연령, 성별 및/또는 체중) 또는 치료 중인 숙주 등 등에 따라 달라지는 양에 상응할 것이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자 요법"은 질환을 치료하거나, 질환의 증상을 감소시키거나, 질환의 가능성을 감소시키기 위해 개체의 세포 및/또는 조직에 핵산 서열(예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 면역조절 단백질(예를 들어, 사이토카인 또는 이의 서브유닛)을 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 기능적 단편)을 삽입하는 것이다. 유전자요법은 또한 자연에서 저해성인, 즉, 내인성 유전자 또는 단백질, 예컨대, 바람직하지 않은 또는 비정상적인(예를 들어, 병원성) 유전자 또는 단백질의 발현, 활성 또는 기능을 저해하거나, 줄이거나 또는 감소시키는 이식유전자의 삽입을 포함한다. 이러한 이식유전자는 외인성일 수 있다. 외인성 분자 또는 서열은 세포, 조직 및/또는 치료될 개체에서 정상적으로 발생되지 않는 분자 또는 서열인 것으로 이해된다. 후천성 질환과 선천성 질환 둘 다 유전자 요법이 가능하다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "예방적 유효량"은 질환 또는 장애(예를 들어, 파브리병)를 갖거나 갖는 성향이 있는 대상체에게 투여될 때, 질환 또는 장애를 예방하거나, 이의 증상을 감소시키거나, 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 개선시키는 데 충분한 제제(예를 들어, AAV 벡터 또는 본 명세서에 개시된 조성물)의 양을 포함한다. 질환 또는 장애를 개선시키는 것은 질환 또는 장애의 과정을 늦추는 것 또는 후기 발병 질환 또는 장애를 감소시키는 것을 포함한다. "예방적 유효량"은 제제, 예를 들어, AAV 발현 벡터 또는 본 개시내용의 조성물의 특징, 제제가 투여되는 방법, 질환의 위험도 및 병력, 연령, 체중, 가족력, 유전적 구성, 선행 치료 또는 수반하는 치료의 유형, 만약에 있다면, 치료 중인 환자의 다른 개인적 특징에 따라 다를 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "비표적(off target)"은 임의의 하나 이상의 표적, 유전자 또는 세포 전사체에 대한 임의의 의도하지 않은 효과를 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "시험관내"는 유기체(예를 들어, 동물, 식물 또는 미생물) 내에서보다는 인공 환경에서, 예를 들어, 시험관 또는 반응 용기에서, 세포 배양물에서, 페트리 접시 등에서 발생되는 사건을 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "생체내"는 유기체(예를 들어, 동물, 식물 또는 미생물) 내에서 발생되는 사건을 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "형질감염"은 외인성 핵산을 세포에 도입하는 방법을 지칭한다. 형질감염 방법은 화학적 방법, 물리적 처치 및 양이온성 지질 또는 이들의 혼합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 세포에 형질감염될 수 있는 제제의 목록은 방대하며, 예를 들어, siRNA, shRNA, 센스 및/또는 안티센스 서열, 하나 이상의 유전자를 암호화하는 DNA를 포함하고, 발현 플라스미드, 예를 들어, 벡터 내로 조직화된다.

"단백질 수준을 결정하는"은 직접적 또는 간접적으로 당업계에 알려진 방법에 의한 단백질, 또는 단백질을 암호화하는 mRNA의 검출을 의미한다. "직접적으로 결정하는"은 물리적 독립체 또는 값을 얻기 위한 과정을 수행하는 것(예를 들어, 용어가 본 명세서에 정의된 "샘플을 분석하는 것" 또는 샘플 상의 분석 또는 검정을 수행하는 것)을 의미한다. "간접적으로 결정하는"은 다른 관계자 또는 공급원(예를 들어, 물리적 독립체 또는 값을 직접적으로 획득한 제3자 연구소)으로부터 물리적 독립체 또는 값을 받는 것을 지칭한다. 단백질 수준을 측정하는 방법은 일반적으로 웨스턴 블롯팅, 면역블로팅법, 효소결합면역흡착 검정(ELISA), 방사면역분석법(RIA), 면역침강법, 면역형광법, 표면 플라스몬 공명, 화학발광, 형광 분극화, 인광, 면역조직화학적 분석, 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행시간(MALDI-TOF) 질량분석법, 액체 크로마토그래피(LC)-질량분석법, 미세유세포분석법, 현미경관찰법, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 및 유세포분석뿐만 아니라 효소 활성 또는 다른 단백질 상대와의 상호작용을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 단백질의 특정에 기반한 분석을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. mRNA 수준을 측정하는 방법은 당업계에 알려져 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "수준"은 선택적으로 참조와 비교할 때, 단백질 또는 단백질을 암호화하는 mRNA의 수준/양 또는 활성을 지칭한다. 참조는 본 명세서에 정의된 바와 같은 임의의 유용한 참조일 수 있다. 단백질의 수준은 샘플 중의 총 단백질 또는 mRNA에 대한 질량/vol(예를 들어, g/㎗, ㎎/㎖, ㎍/㎖, ng/㎖) 또는 백분율로 표현될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 단백질의 "줄어든 수준" 또는 "감소된 수준"은 참조에 비해 단백질 수준의 줄어듦/감소를 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "글리코스핑고리피드의 양을 감소시키는"은 투여 전 동일한 대상체에서의 글리코스핑고리피드의 양(ng/㎖)에 비한 글리코스핑고리피드(예를 들어, 글로보트라이아오실세라마이드(Gb3), 글로보트리아오실스핑고신(lyso-Gb3), 갈라바이오실세라마이드 또는 이들의 임의의 조합물)의 양(ng/㎖)의 줄어듦/감소를 의미한다. 글리코스핑고리피드의 양(ng/㎖)의 줄어듦/감소는 본 명세서에서 아래의 실시예 2에 기재된 바와 같이 기준선 지점으로부터 마지막으로 측정된 지점까지 측정된다. 일부 양상에서, 글리코스핑고리피드(예를 들어, lyso-Gb3 농도(ng/㎖))의 양은 본 명세서에서 아래의 실시예 2에 기재된 바와 같이 기준선 지점으로부터 마지막으로 측정된 지점까지 측정된다. 일부 양상에서, 글리코스핑고리피드(예를 들어, Gb3 농도(ng/㎖))의 양은 본 명세서에서 아래의 실시예 2에 기재된 바와 같이 기준선 지점으로부터 마지막으로 측정된 지점까지 측정된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "기준선 지점"은 AAV 발현 벡터 또는 본 개시내용의 약제학적 조성물의 투여 직전의 시점을 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 단백질의 "증가된 수준"이라는 용어는 참조에 비한 단백질 수준의 증가를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 대상체에서 "α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 단백질 활성을 증가시키는"이라는 용어는 투여 전 대상체에서의 α-Gal A 단백질 활성에 비한 α-Gal A 단백질(enzyme) 활성(n㏖/h/㎖)의 증가를 의미하며, 여기서, α-Gal A 단백질 활성의 증가는 본 명세서에서 아래의 실시예 2에 기재된 바와 같이 측정된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 단백질의 "유지된 수준"이라는 용어는 참조에 비한 단백질 수준의 유의미한 줄어듦/감소 또는 증가 없음을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "글리코스핑고리피드의 양을 유지하는"은 투여 전 동일한 대상체에서의 글리코스핑고리피드의 양에 비한 글리코스핑고리피드(예를 들어, 글로보트라이아오실세라마이드(Gb3), 글로보트리아오실스핑고신(lyso-Gb3), 갈라바이오실세라마이드 또는 이들의 임의의 조합물)의 양의 통계학적으로 유의미한 줄어듦/감소 또는 증가가 없다는 것을 의미한다. 일부 양상에서, 대상체는 효소 대체 요법(ERT) 전처리된 대상체이다. ERT는 안정적 용량(동의 전 6개월 동안 ERT의 3 용량 이상 ERT를 놓치지 않은 것으로 정의됨) 및 요법(등록 전 적어도 3개월 동안 14일±1일)으로 투여되어야 한다. 파트가 통계적으로 유의미한지의 여부는 다양한 잘 알려진 통계학적 평가 도구, 예를 들어, 신뢰구간의 결정, p값의 결정, 스튜던트 T 검정, 맨-휘트니 검정(Mann-Whitney test) 등을 사용하여 당업자에 의해 단순한 방식으로 결정될 수 있다. 상세한 설명이 문헌[Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley and Sons, New York 1983]에서 제공된다. 바람직한 신뢰구간은 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이다. p값은 바람직하게는 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 또는 0.0001이다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "약제학적 조성물"은 약제학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 제형화된 본 명세서에 기재된 화합물 또는 분자, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 AAV 벡터를 포함하는 조성물을 나타내고, 포유류에서 질환의 치료를 위한 치료 요법의 부분으로서 정부 규제 기관의 승인하에 제조 또는 판매될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이 "약제학적으로 허용 가능한 부형제"는 본 명세서에 기재된 화합물이 아니고(예를 들어, 활성 화합물을 현탁 또는 용해시킬 수 있는 비히클) 환자에서 실질적으로 비독성이며 비염증성인 특성을 갖는 임의의 성분을 지칭한다.

"참조"는 단백질 또는 mRNA 수준 또는 활성과 비교하는 데 사용되는 임의의 유용한 참조를 의미한다. 참조는 임의의 샘플, 표준, 표준 곡선 또는 비교 목적을 위해 사용되는 수준일 수 있다. 참조는 정상 참조 샘플 또는 참조 표준 또는 수준일 수 있다. "참조 샘플"은, 예를 들어, 대조군, 예를 들어, 사전 결정된 음성 대조군 값, 예컨대, "정상 대조군" 또는 동일한 대상체로부터 취한 사전 샘플; 정상의 건강한 대상체로부터의 샘플, 예컨대, 정상 세포 또는 정상 조직; 질환을 갖지 않는 대상체로부터의 샘플(예를 들어, 세포 또는 조직); 질환으로 진단되지만 본 명세서에 기재된 화합물로 아직 치료되지 않은 대상체로부터의 샘플; 본 명세서에 기재된 화합물에 의해 치료된 대상체로부터의 샘플; 또는 알려진 정상 농도에서의 정제된 단백질(예를 들어, 임의의 본 명세서에 기재된) 샘플일 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 본 명세서에 개시된 조성물, 예를 들어, AAV 발현 벡터 또는 본 개시내용의 조성물이 투여될 수 있는 임의의 유기체를 지칭한다. 전형적인 대상체는 임의의 동물(예를 들어, 포유류, 예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 비인간 영장류 및 인간)을 포함한다. 대상체는 치료를 원하거나 치료가 필요하거나, 치료가 요구되거나, 치료를 받고 있거나, 장래에 치료를 받게 되거나, 특정 질환 병태에 대해 훈련받은 전문가의 관리하에 있는 인간 또는 동물일 수 있다. 일부 양상에서, 대상체는 인간이다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 본 명세서에서 상호 호환 가능하게 사용된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "파브리병이 있는 비슷한 비치료 대상체"는 치료된 대상체와, 예를 들어, 연령, 성별, 인종 및/또는 질환 징후에 따라 매칭된 인간 대상체를 지칭한다. (예를 들어, 문헌[Giugliani et al., Journal of Inborn Errors of Metabolism & Screening Volume 4:1-12 (2016)] 참조).

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "벡터 게놈/체중 킬로그램(vg/㎏)"은 대상체에게 투여되는 발현 카세트(예를 들어, 본 개시내용의 α-Gal A 발현 카세트)의 복제물을 지칭한다. 벡터 게놈/체중 킬로그램 복제물의 수는 정량적 PCR 및/또는 액적 디지털 PCR에 의해 측정될 수 있다.

본 개시내용의 방법 및 투약량에 관해 용어 "고정 용량(flat dose)"의 사용은 환자의 체중 또는 체표면적(BSA)에 관계없이 환자에게 투여되는 용량을 의미한다. 따라서 고정 용량은 ㎎/㎏ 용량으로서 제공되는 것이 아니라, 제제(예를 들어, 재조합 α-Gal A 단백질)의 절대량으로 제공된다. 예를 들어, 60㎏ 개인 및 100 ㎏ 개인은 동일 용량의 항체(예를 들어, 12㎎의 재조합 α-Gal A 단백질)를 받을 것이다.

본 명세서에 지칭되는 바와 같은 용어 "중량 기준 용량"은 환자에게 투여되는 용량이 환자의 체중에 기반하여 계산된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 60㎏ 체중을 갖는 환자가 0.2㎎/㎏의 재조합 α-Gal A 단백질을 필요로 할 때, 투여를 위해 적절한 양의 재조합 α-Gal A 단백질(즉, 12㎎)을 계산하고 사용할 수 있다.

약물 또는 치료제의 "치료적 유효량" 또는 "치료적으로 효과적인 투약량"은 단독으로 또는 다른 치료제와 병용하여 사용될 때, 질환 발병에 대해 대상체를 보호하거나 질환 증상 중증도의 감소, 질환 무증상 기간의 빈도 및 지속기간의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 예방에 의해 입증된 질환 퇴행을 촉진시키는 약물의 임의의 양이다. 질환 퇴행을 촉진시키는 치료제의 능력은 임상 시험 동안 인간 대상체에서, 인간에서 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서, 또는 시험관내 분석에서 제제의 활성을 분석함으로써 숙련된 의사에게 알려진 다양한 방법을 이용하여 평가될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 질환과 관련된 증상, 합병증 또는 병태 또는 생화학적 징후의 발병, 진행, 발생, 중증도 또는 재발을 반전, 완화, 개선, 저해 또는 늦춤 또는 예방하거나 또는 전반적 생존을 향상시킬 목적으로 대상체에서 수행되는 임의의 유형의 개입 또는 과정 또는 활성제를 투여하는 것을 지칭한다. 치료는 질환을 갖는 대상체 또는 (예를 들어, 예방을 위한) 질환을 갖지 않는 대상체에 대해서일 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 병태와 관련하여 사용될 때, 용어 "예방하는"은 조성물을 받지 않는 대상체에 비해 대상체에서 의학적 병태 증상의 빈도를 감소시키거나 발병을 지연시키는 조성물의 투여를 지칭한다.

용어 "개선시키는"은 예방, 중증도 또는 진행의 감소, 관해 또는 이의 치유를 포함하는, 질환 상태, 예를 들어, 파브리병의 치료에서의 임의의 치료적으로 유리한 결과를 지칭한다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 방법은 파브리병과 관련된 하나 이상의 증상 개선을 필요로 하는 인간 대상체의 파브리병과 관련된 하나 이상의 증상을 개선시키는 것이다.

용어 "유효 용량" 또는 "유효 투약량"은 목적하는 효과를 달성하거나 적어도 부분적으로 달성하는 데 충분한 양으로 정의된다. 약물 또는 치료제의 "치료적 유효량" 또는 "치료적으로 효과적인 투약량"은 단독으로 또는 다른 치료제와 병용하여 사용될 때, 질환 증상 중증도의 감소, 질환 무증상 기간의 빈도 및 지속기간의 증가, 전반적 생존(파브리병과 같은 질환의 진단일 또는 이에 대한 치료의 개시로부터 질환으로 진단된 환자가 여전히 살아있는 시간의 길이)의 증가 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 예방에 의해 입증된 질환 퇴행을 촉진시키는 약물의 임의의 양이다. 약물의 치료적 유효량 또는 투약량은 질환이 발생할 위험에 있거나 질환의 재발로 고통받는 대상체에게 단독으로 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 때, 질환의 발생 또는 재발을 저해하는 약물의 임의의 양인 "예방적 유효량" 또는 "예방적으로 효과적인 투약량"을 포함한다. 질환 퇴행을 촉진시키거나 질환의 발생 또는 재발을 저해하는 치료제의 능력은 임상 시험 동안 인간 대상체에서, 인간에서 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서, 또는 시험관내 분석에서 제제의 활성을 분석함으로써 숙련된 의사에게 알려진 다양한 방법을 이용하여 평가될 수 있다.

본 개시내용의 "샘플" 또는 "생물학적 샘플"은 생물학적 유래이고, 일부 양상에서, 진핵 유기체로부터 유래된다. 일부 양상에서, 샘플은 인간 샘플이지만, 동물 샘플이 또한 사용될 수 있다. 본 개시내용에서 사용하기 위한 샘플의 비제한적 공급원은, 예를 들어, 고형 조직, 생검 흡입물, 복수, 유체 추출물, 혈액, 혈장, 혈청, 척수액, 림프액, 피부의 외부 절편, 호흡, 장 및 비뇨생식관, 눈물, 타액, 유즙, 종양 기관, 세포 배양물 및/또는 세포 배양물 구성성분을 포함한다.

"투여하는"은 당업자에게 알려진 임의의 다양한 방법 및 전달 시스템을 사용하여 대상체에게 치료제를 포함하는 조성물을 물리적으로 도입하는 것을 지칭한다. 재조합 α-Gal A 단백질 또는 유전자 발현 α-Gal A의 투여를 위한 바람직한 경로는, 예를 들어, 주사 또는 주입에 의한 정맥내 또는 다른 비경구 투여 경로를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 어구 "비경구 투여"는 보통 주사에 의하는 장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 림프절내, 병변내, 피막내, 안와내, 심장내, 진피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막밑, 지주막하, 척주내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입뿐만 아니라 생체내 전기천공법을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 비경구 경로는 경구, 국소, 상피 또는 점막 투여 경로 예를 들어, 비강내, 질내, 직장, 설하 또는 국소를 포함한다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 정맥내로 투여된다.

투여하는 것은 또한, 예를 들어, 1회, 복수회 및/또는 1회 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 1용량만 투여된다.

용어 "약 1주 1회", "약 2주마다 1회" 또는 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 임의의 다른 유사한 투약 간격은 근사치를 의미한다. "약 1주마다 1회"는 7일 ± 1일마다, 즉, 6일마다 내지 8일마다를 포함할 수 있다. "약 2주마다 1회"는 14일 ± 3일마다, 즉, 11일마다 내지 17일마다를 포함한다. 유사한 근사치는, 예를 들어, 약 3주마다 1회, 약 4주마다 1회, 약 5주마다 1회, 약 6주마다 1회 및 약 12주마다 1회로 적용된다. 일부 양상에서, 약 6주마다 1회 또는 약 12주마다 1회의 투약 간격은 첫 용량이 첫 주의 임의의 날에 투여될 수 있고, 이어서, 다음 용량이 각각 제6주 또는 제12주의 임의의 날에 투여될 수 있다는 것을 의미한다. 다른 양상에서, 약 6주마다 1회 또는 약 12주마다 1회의 투약 간격은 각각 첫 용량이 첫 주의 특정일(예를 들어, 월요일)에 투여되고, 이어서, 다음 용량이 제6주 또는 제12주(즉, 월요일)의 동일한 날에 투여된다는 것을 의미한다.

용어 "본질적으로 포함하는"은 값 또는 조성물이 측정 또는 결정되는 방법, 즉, 측정 시스템의 한계에 부분적으로 따르는 당업자에 의해 결정된 바와 같은 특정 값 또는 조성물에 대해 허용 가능한 오차 범위 내의 값 또는 조성물을 지칭한다. 예를 들어, "본질적으로 포함하는"은 당업계의 실행당 1 또는 1 초과의 표준 편차를 의미할 수 있다. 대안적으로, "본질적으로 포함하는"은 최대 10%의 범위를 의미할 수 있다. 더 나아가, 특히 생물학적 시스템 또는 과정에 대해, 상기 용어는 최대 10배 또는 최대 5배의 값을 의미할 수 있다. 특정 값 또는 조성물이 본 출원 및 청구범위에 제공될 때, 달리 언급되지 않는 한, "본질적으로 포함하는"의 의미는 해당 특정 값 또는 조성물에 대한 허용 가능한 오차 범위 이내인 것으로 추정되어야 한다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용과 관련된 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌[Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; 및 the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 본 개시내용에서 사용되는 다수의 용어의 일반 사전을 당업자에게 제공한다.

단위, 접두사 및 기호는 이들의 국제단위계(SI) 허용 형태로 나타낸다. 수치 범위는 범위를 정하는 숫자를 포함한다. 달리 표시되지 않는 한, 뉴클레오타이드 서열은 좌에서 우로 5'에서 3' 배향으로 기재된다. 아미노산 서열은 좌에서 우로 아미노에서 카복시 배향으로 기재된다. 본 명세서에 제공된 표제는 전체로서 본 명세서에 대해 참조될 수 있는 본 개시내용의 다양한 양상의 제한이 아니다. 따라서, 바로 아래에 정의되는 용어는 본 명세서에 대해 이의 전문에서 참조에 의해 더욱 완전하게 정의된다.

본 명세서에 기재된 바와 같이, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비 범위 또는 정수 범위는 달리 표시되지 않는 한, 열거된 범위 이내의 임의의 정수 값, 적절한 경우, 이의 일부(예컨대, 정수의 1/10 및 1/100)를 포함하는 것으로 이해될 것이다.

본 개시내용의 다양한 양상은 다음의 하위부문에서 더욱 상세하게 기재된다.

II. 본 개시내용의 방법

본 명세서에서 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 이식유전자를 포함하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터(예를 들어, 아데노-연관 바이러스(AAV) 발현 벡터)의 치료적 유효량을 투여함으로써 이를 필요로 하는 대상체에서의 파브리병의 하나 이상의 증상의 치료 또는 개선, 글리코스핑고리피드 양의 감소 및/또는 갈락토시다제 A(α-Gal A) 단백질 활성 증가를 위한 방법이 제공된다.

일부 양상에서, 본 개시내용은 파브리병의 치료 또는 파브리병과 관련된 하나 이상의 증상 개선을 필요로 하는 인간 대상체의 파브리병을 치료하고 파브리병과 관련된 하나 이상의 증상을 개선시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 발현 카세트를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 발현 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 발현 카세트는 알파 1-안티트립신(hAAT) 프로모터에 작동 가능하게 연결된 아포지질단백질 E(APOE) 인핸서, 인간 헤모글로빈 베타(HBB)-IGG 인트론, 신호 펩타이드를 암호화하는 서열, 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 이식유전자 및 소 성장 호르몬 폴리 A 신호 서열을 포함하고, AAV 발현 벡터는 약 5×10¹² 벡터 게놈/체중 킬로그램(vg/㎏) 내지 약 5×10¹³vg/㎏의 용량으로 투여된다.

일부 양상에서, 본 개시내용은 파브리병의 치료 또는 파브리병과 관련된 하나 이상의 증상 개선을 필요로 하는 인간 대상체의 파브리병을 치료하고 파브리병과 관련된 하나 이상의 증상을 개선시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 발현 카세트를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 발현 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 발현 카세트는 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 이식유전자를 포함하고, α-GalA 이식유전자는 서열번호 5에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, AAV 발현 벡터는 약 5×10¹² 벡터 게놈/체중 킬로그램(vg/㎏) 내지 약 5×10¹³vg/㎏의 용량으로 투여된다.

일부 양상에서, 본 개시내용은 글리코스핑고리피드의 양 감소를 필요로 하는 인간 대상체에서 글리코스핑고리피드의 양을 감소시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 발현 카세트를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 발현 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 발현 카세트는 알파 1-안티트립신(hAAT) 프로모터에 작동 가능하게 연결된 아포지질단백질 E(APOE) 인핸서, 인간 헤모글로빈 베타(HBB)-IGG 인트론, 신호 펩타이드를 암호화하는 서열, 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 이식유전자 및 소 성장 호르몬 폴리 A 신호 서열을 포함하고, AAV 발현 벡터는 약 5×10¹² 벡터 게놈/체중 킬로그램(vg/㎏) 내지 약 5×10¹³vg/㎏의 용량으로 투여되고, 글리코스핑고리피드의 감소된 양은 투여 전 대상체에서의 글리코스핑고리피드의 양에 대한 것이다.

일부 양상에서, 본 개시내용은 글리코스핑고리피드 양의 감소를 필요로 하는 인간 대상체에서 글리코스핑고리피드의 양을 감소시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 발현 카세트를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 발현 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 발현 카세트는 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 이식유전자를 포함하고, α-GalA 이식유전자는 서열번호 5에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, AAV 발현 벡터는 약 5×10¹²벡터 게놈/체중 킬로그램(vg/㎏) 내지 약 5×10¹³vg/㎏의 용량으로 투여되고, 글리코스핑고리피드의 감소된 양은 투여 전 대상체에서의 글리코스핑고리피드의 양에 대한 것이다.

일부 양상에서, 본 개시내용은 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 단백질 활성의 증가를 필요로 하는 인간 대상체에서 α 갈락토시다제 A(α-Gal A)의 활성을 증가시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 발현 카세트를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 발현 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 발현 카세트는 알파 1-안티트립신(hAAT) 프로모터에 작동 가능하게 연결된 아포지질단백질 E(APOE) 인핸서, 인간 헤모글로빈 베타(HBB)-IGG 인트론, 신호 펩타이드를 암호화하는 서열, 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 이식유전자 및 소 성장 호르몬 폴리 A 신호 서열을 포함하고, AAV 발현 벡터는 약 5×10¹² 벡터 게놈/체중 킬로그램(vg/㎏) 내지 약 5×10¹³ vg/㎏의 용량으로 투여되고, 증가된 α-Gal A 단백질 활성은 투여 전 대상체에서의 α-Gal A 단백질 활성의 양에 대한 것이다.

일부 양상에서, 본 개시내용은 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 단백질 활성의 증가를 필요로 하는 인간 대상체에서 α 갈락토시다제 A 단백질 활성을 증가시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 발현 카세트를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 발현 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 발현 카세트는 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 이식유전자를 포함하고, α-GalA 이식유전자는 서열번호 5에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, AAV 발현 벡터는 약 5×10¹² 벡터 게놈/체중 킬로그램(vg/㎏) 내지 약 5×10¹³ vg/㎏의 용량으로 투여되고, 증가된 α-Gal A 단백질 활성은 투여 전 대상체에서의 α-Gal A 단백질 활성에 대한 것이다.

일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 1×10¹¹ vg/㎏, 약 2×10¹¹ vg/㎏, 약 3×10¹¹ vg/㎏, 약 4×10¹¹ vg/㎏, 약 5×10¹¹ vg/㎏, 약 6×10¹¹ vg/㎏, 약 7×10¹¹ vg/㎏, 약 8×10¹¹ vg/㎏, 약 9×10¹¹ vg/㎏, 약 1×10¹² vg/㎏, 약 2×10¹² vg/㎏, 약 3×10¹² vg/㎏, 약 4×10¹² vg/㎏, 약 5×10¹² vg/㎏, 약 6×10¹² vg/㎏, 약 7×10¹² vg/㎏, 약 8×10¹² vg/㎏, 약 9×10¹² vg/㎏, 약 1×10¹³vg/㎏, 약 2×10¹³vg/㎏, 약 3×10¹³vg/㎏, 약 4×10¹³vg/㎏, 약 5×10¹³vg/㎏, 약 6×10¹³vg/㎏, 약 7×10¹³vg/㎏, 약 8×10¹³vg/㎏, 약 9×10¹³vg/㎏, 약 1×10¹⁴vg/㎏, 약 2×10¹⁴vg/㎏, 약 3×10¹⁴vg/㎏, 약 4×10¹⁴vg/㎏, 약 5×10¹⁴vg/㎏, 약 6×10¹⁴vg/㎏, 약 7×10¹⁴vg/㎏, 약 8×10¹⁴vg/㎏ 또는 약 9×10¹⁴vg/㎏의 용량으로 투여된다.

일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 5×10¹²vg/㎏의 용량으로 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 1×10¹³vg/㎏의 용량으로 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 3×10¹³vg/㎏의 용량으로 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 5×10¹³vg/㎏의 용량으로 투여된다.

일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 1×10¹¹ vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 2×10¹¹ vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 3×10¹¹ vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 4×10¹¹ vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 5×10¹¹ vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 6×10¹¹ vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 7×10¹¹ vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 8×10¹¹ vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 9×10¹¹ vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 1×10¹² vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 2×10¹² vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 3×10¹² vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 4×10¹² vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 5×10¹²vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 6×10¹² vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 7×10¹² vg/㎏, 약 8×10¹² vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 9×10¹² vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 1×10¹³ vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 2×10¹³vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 3×10¹³ vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 4×10¹³ vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 5×10¹³ vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 6×10¹³ vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 7×10¹³vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 8×10¹³ vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 9×10¹³ vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 1×10¹⁴ vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 2×10¹⁴ vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 3×10¹⁴vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 4×10¹⁴ vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 5×10¹⁴ vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 6×10¹⁴ vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 7×10¹⁴vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 8×10¹⁴vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 9×10¹⁴vg/㎏의 용량만 투여된다.

일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 5×10¹²vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 1×10¹³ vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 3×10¹³vg/㎏의 용량만 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 약 5×10¹³vg/㎏의 용량만 투여된다.

일부 양상에서, 본 명세서에 개시된 AAV 발현 벡터는 부분적으로 투여 경로에 따르는 다양한 방법을 사용하여 대상체, 예를 들어, 인간 대상체에게 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 비경구로 투여된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 정맥내로 투여된다. 일부 양상에서, 본 명세서에 개시된 AAV 발현 벡터는 대상체에게 정맥내 주입에 의해 투여된다.

일부 양상에서, 대상체는 파브리병을 갖는다. 일부 양상에서, 대상체는 파브리병과 관련된 다음의 증상 중 하나 이상을 갖는다: 정상 초과의 글로보트라이아오실세라마이드(Gb3) 수준, 정상 초과의 글로보트리아오실스핑고신(lyso-Gb3) 수준, 신장 질환, 심장 질환, 무한증, 말단감각이상, 혈관각화종, 위장(GI)관 통증, 각막 및 수정체혼탁 또는 뇌졸중. 일부 양상에서, 혈관각화종은 제주위 혈관각화종이다. 일부 양상에서, 파브리병은 1형 고전적 표현형 또는 2형 후기 발병 표현형이다.

일부 양상에서, 대상체는 약 5% 미만의 α-GalA 단백질 활성을 갖는다. 일부 양상에서, 대상체는 효소 대체 요법(ERT) 미경험 대상체이다. 일부 양상에서, ERT 미경험 대상체는 ERT 미경험 고전적 파브리 남성이다.

일부 양상에서, α-GalA 단백질 활성은 본 명세서에서 아래의 실시예 2에 기재되는 바와 같이 대상체의 혈장 피부 및/또는 백혈구에서 측정된다.

일부 양상에서, 대상체는, 예를 들어, 데이터베이스, 예컨대, 국제 파브리병 유전자형-표현형 데이터베이스(dbFGP)로서 파브리병(예를 들어, 고전적 파브리병)을 나타내는 α-GalA 유전자 돌연변이를 갖는다. 일부 양상에서, α-Gal A 유전자 돌연변이는 아미노산 돌연변이 G261D, C422T, W340R, S297Y, Q283X, D215S, IVS5/c.801+3A>G, P362L, C422T 또는 N34S를 초래할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.

일부 양상에서, 대상체는, 효소결합면역흡착 검정(ELISA)에 의해 결정 시, 투여 전에 이미 존재하는 항-α-GalA 항체를 갖는다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "이미 존재하는 항-α-GalA 항체"는, 예를 들어, 인간 혈청에서 α-GalA에 대한 총 항-약물 항체(ADA)를 지칭하되, ADA 항체는 효소결합면역흡착 검정(ELISA)를 사용하여 검출된다. 46.1 이상의 저해%를 갖는 샘플은 α-GalA에 대한 항체의 존재에 대해 양성("항-α-Gal A 항체 양성")으로 보고된다.

항-GLA 중화 항체

인간 혈청에서 α-GalA에 대한 총 항-약물 항체(ADA)는 검출되고, 형광 효소 저해 분석에서 인간 혈청 중에서 적정된다. 분석은 α-GalA 활성에 대한 인간 혈청의 중화 능력을 평가함으로써 항-α-GalA 중화 항체(NAb)의 존재를 결정한다. 9.6%의 컷오프 지점 이상의 저해%를 갖는 샘플은 NAb 양성으로 확인되었지만, 컷 지점 아래의 것은 음성으로 간주된다.

일부 양상에서, 대상체는 대상체의 생물학적 샘플이 분석될 때 항-α-GalA 중화항체 양성 대상체이되, 항-α-GalA 중화항체 양성 대상체는 위에 기재한 항-α-GalA 중화항체 검정으로 측정 시, α-갈락토시다제 A 활성의 약 9.6% 초과의 저해를 갖는 생물학적 샘플을 갖는다.

일부 양상에서, 항-GLA 중화항체는 α-Gal A 효소에 결합하고, 비활성화(중화)시킨다. 일부 양상에서, 항-GLA 중화 항체가 존재한다면, 효소 대체 요법은 혈장에서 항-GLA 중화 항체에 의해 직접 비활성화된다(중화된다). 일부 양상에서, 항-GLA 중화 항체가 존재하지 않는다면, 효소 대체 요법(예를 들어, 재조합 α-Gal A 효소)는 M6P 수용체를 통해 세포(예를 들어, 내피세포)에 유입되어, 리소좀으로부터의 Gb3 제거를 야기한다. 일부 양상에서, 항-GLA 중화 항체가 존재한다면, 이들은 효소(예를 들어, 재조합 α-Gal A)에 결합함으로써 ERT 활성을 중화시킬 수 있다.

일부 양상에서, 항-GLA 중화 IgG 항체-태그된 ERT 분자는 내재화되고, 대식세포에 의해 분해될 것이다. ERT보다 많은 항-GLA 중화 항체가 존재하는 경우, 이는 감소된 세포의 Gb3 제거율을 초래할 수 있다. ERT 용량이 항-GLA 중화항체 역가를 초과한다면, 더 많은 ERT는 표적 세포의 리소좀에 유입되어, 증가된 Gb3 제거를 초래할 수 있다. (Lenders et al., J Am Soc Nephrol 29:2265-2278 (2018).

항-GLA 항체 중화 활성은, 예를 들어, 문헌[Rombach et al., PLoS One 7: e47805 (2012); Lenders et al., J Am Soc Nephrol 27: 256-264 (2016); Smid et al., Mol Genet Metab 108:132-137 (2013)]에 기재되어 있다.

일부 양상에서, 항-GLA 중화항체는 IgG 항체이다. 일부 양상에서, 항-GLA 중화항체는 IgG4 항체이다. 일부 양상에서, 항-GLA 중화항체는 IgG2 항체이다. 일부 양상에서, 항-GLA 중화항체는 IgG1 항체이다.

일부 양상에서, 항-GLA 중화 항체는 효소 대체 요법 시작의 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 11개월 내에, 또는 약 12개월 내에 발생될 수 있다.

일부 양상에서, 예를 들어, 문헌[Van der Veen et al., Mol Genet Metab. 126(2):162-168 (2019); Wilcox et al., Mol Genet Metab. 105(3):443-449 (2012)]에 기재된 바와 같은, 항-GLA 중화 항체가 발생될 수 있는 인간 대상체, 예를 들어, 고전적 파브리병이 있는 남성 환자.

일부 양상에서, 이식유전자로부터 발현된 α-Gal A 단백질은 대상체에서의 글리코스핑고리피드의 양을 투여 전 대상체에서의 글리코스핑고리피드의 양에 비해 약 10퍼센트(%), 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49%, 약 50%, 약 51%, 약 52%, 약 53%, 약 54%, 약 55%, 약 56%, 약 57%, 약 58%, 약 59%, 약 60%, 약 61%, 약 62%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 68%, 약 69%, 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%만큼 감소시킨다 .

일부 양상에서, 이식유전자로부터 발현된 α-Gal A 단백질은 대상체에서의 글리코스핑고리피드의 양을 투여 전과 동일한 수준으로 유지한다. 일부 양상에서, 글리코스핑고리피드의 양은 본 명세서에 기재된 효소 대체 요법(ERT) 전처리의 안정 용량으로 대상체에게 투여 전과 동일한 수준으로 유지된다. 용어 "효소 대체 요법의 안정 용량" 또는 "ERT의 안정 용량"은 (동의 전 6개월 동안 ERT의 3 용량 초과를 놓치지 않은 것으로 정의됨) 및 요법(등록 전 적어도 3개월 동안 14일 ± 1일)이다. 일부 양상에서, lyso-Gb3의 낮은 기준선 수준을 갖는 대상체(예를 들어, ERT 처리 대상체)는 관찰 기간 동안 lyso-Gb3의 동일한 수준을 유지할 수 있다(예를 들어, lyso-Gb3 수준은 안정되게 남아있거나, 보통의, 비통계학적으로 유의미한 감소를 나타냄).

용어 "ERT-미경험 대상체", "ERT 미경험 대상체" 또는 "효소 대체 요법(ERT) 미경험 대상체"는 효소 대체 요법(ERT)을 받은 적이 없는 대상체(예를 들어, 인간 대상체)를 지칭한다.

용어 "ERT-유사-미경험 대상체", "ERT 유사-미경험 대상체" 또는 "ERT 유사 미경험 대상체"는 이미 ERT를 경험한 적이 있지만 본 명세서에 기재된 바와 같은 임상 연구의 시작 전 과거 6개월에 ERT 치료를 받은 적이 없는 대상체(예를 들어, 인간 대상체)를 지칭한다.

일부 양상에서, 글리코스핑고리피드는 글로보트라이아오실세라마이드(Gb3), 글로보트리아오실스핑고신(lyso-Gb3), 갈라바이오실세라마이드(galabiosylceramide) 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 일부 양상에서, Gb3 및/또는 lyso-Gb3 수준은 아래의 실시예 2에 기재되는 바와 같이 대상체의 혈장 및/또는 소변에서 측정된다. 일부 양상에서, Gb3 및/또는 lyso-Gb3 수준은 대상체의 조직에서 측정된다.

일부 양상에서, 이식유전자에서 발현된 α-Gal A 단백질의 수준은 대상체의 혈장, 혈청, 전혈, 건조 혈반, 백혈구 또는 다른 혈액 구성성분 중 하나 이상에서 측정된다. 일부 양상에서, 이식유전자에서 발현된 α-Gal A 단백질은 대상체의 신장, 간, 피부 및 심장에서 활성이다.

일부 양상에서, AAV 발현 벡터의 투여 전 및/또는 투여 동안에 대상체에게 면역억제제(예를 들어, 예방적 스테로이드 치료)가 투여된다. 일부 양상에서, 면역억제제는 프레드니손을 포함한다.

일부 양상에서, AAV 발현 벡터의 투여 전에 대상체에게 사전조건화 치료(예를 들어, 조건화제)가 투여되지 않는다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "사전 조건" 또는 "사전 조건화"는, 예를 들어, 부설판(Myleran®, GlaxoSmithKline, Busulfex®, Otsuka America Pharmaceutical, Inc.)과 같은 화학요법 조건화제를 사용하는 것을 지칭한다. 조건화제는, 예를 들어, 환자의 골수에서 공간을 생성하기 위해 골수 세포를 고갈/사멸시키는 생체외 렌티바이러스 유전자 요법에 대해 사용될 수 있다. 일단 환자가 유전자 요법을 받는다면, 치료 줄기 세포는 골수에 생착하고 치료 유전자를 함유하는 세포를 생성하는 것으로 예상된다. 조건화제는 화학요법과 관련된 유해효과(예를 들어, 생식능력에서의 심각한 효과)를 가질 수 있다.

일부 양상에서, AAV 발현 벡터의 투여 전 및/또는 투여 동안에 대상체에게 조건화제 또는 면역억제제(예를 들어, 예방적 스테로이드 치료)가 투여되지 않는다.

일부 양상에서, 본 발명의 AAV 발현 벡터 및 약제학적 조성물은 2주 동안 효소 대체 요법(ERT) 주입에 대한 필요성을 제거한다.

일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터 및 약제학적 조성물은 파브리병이 있는 대상체에서 신장 기능을 보존할 수 있다. 일부 양상에서, ㎖/분/1.73㎡ 단위의 사구체 여과율(eGFR)이 만성 신장 질환 역학 협력(CKD-EPI) 방정식을 사용하여 투여한 후에 대상체에서 측정된다. (예를 들어, 문헌[Rombach SM et al., Nephrol Dial Transplant. 25(8):2549-2556 (2010)] 참조). 일부 양상에서, 연간 eGFR 감소율은 파브리병이 있는 비슷한 비치료 대상체에서보다 더 낮다.

일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터 및 약제학적 조성물은 파브리병이 있는 대상체에서 심장 이환율을 감소시킬 수 있다. 일부 양상에서, 박출률(Ejection Fraction: EF)은 투여한 후에 대상체에서 일회 박출량(stroke volume: SV)/이완기말 좌심실 용적(left ventricular volumes at end-diastole: LVEDV)으로서 측정된다. (예를 들어, 문헌[Pieroni et al., Journal of the American College of Cardiology, 77(7): 922-936 (2021); Linhart A. The heart in Fabry disease. In: Mehta A, Beck M, Sunder-Plassmann G, editors. Fabry Disease: Perspectives from 5 Years of FOS. Oxford: Oxford PharmaGenesis; 2006. Chapter 20.] 참조) 일부 양상에서, 연간 EF 감소율은 파브리병이 있는 비슷한 비치료 대상체에서보다 더 낮다.

일부 양상에서, 종축 움직임 변화(GLS)는 투여 후에 2D 변형 심장초음파검사 또는 심장 자기 공명 영상화(심장 MRI 또는 CMR)에 의해 대상체에서 측정된다. (예를 들어, 문헌[Pieroni et al., Journal of the American College of Cardiology, 77(7): 922-936 (2021)] 참조). 일부 양상에서, 연간 단축 진행 심장 근육의 수축 가능성은 파브리병이 있는 비슷한 비치료 대상체에서보다 더 낮다.

일부 양상에서, 좌심실 질량 지수(LVMI)는 투여 후에 대상체에서 좌심실 질량(LVM)/체표면적으로서 측정된다. (예를 들어, 문헌[Pieroni et al., Journal of the American College of Cardiology, 77(7): 922-936 (2021)] 참조). 일부 양상에서, 연간 LVMI 증가는 파브리병이 있는 비슷한 비치료 대상체에서보다 더 낮다.

일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터 및 약제학적 조성물은 파브리병이 있는 대상체에서 하나 이상의 청각적 증상을 개선시킬 수 있다. 일부 양상에서, 투여 후에 대상체에서 하나 이상의 청각적 증상의 개선이 있다. 일부 양상에서, 하나 이상의 청각적 증상은 이명, 어지럼증 또는 진행성 난청이다.

일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터 및 약제학적 조성물은 파브리병이 있는 대상체에서 발한을 개선시킬 수 있다. 일부 양상에서, 대상체는 무한증에서부터 발한감소증 또는 정상 발한증으로의 발한 수준의 긍정적 변화를 가질 수 있다.

III. 아데노 연관 바이러스(AAV) 발현 벡터

데펜도바이러스속에 속하는 파보바이러스인 AAV는 다른 바이러스에서 발견되지 않는 여러 매력적인 특징을 갖는다. 예를 들어, AAV는 비분열 세포를 포함하는 다양한 숙주 세포를 감염시킬 수 있다. 더 나아가, AAV는 상이한 종으로부터의 세포를 감염시킬 수 있다. 중요하게는, AAV는 임의의 인간 또는 동물 질환과 관련되지 않았고, 통합 시 숙주 세포의 생리적 특성을 변경시키는 것으로 나타나지 않는다. 최종적으로, AAV는 광범위한 물리적 및 화학적 조건에서 안정적이고, 이는 그 자체가 생산, 저장 및 수송 요구에 적합하다.

대략 4700개의 뉴클레오타이드를 포함하는 AAV 게놈, 선형, 단일가닥 DNA 분자(AAV-2 게놈은 4681개의 뉴클레오타이드로 이루어짐)는 일반적으로 역위 말단 반복부(inverted terminal repeat: ITR)가 각 말단 상에 측접된 내부 비-반복 세그먼트를 포함한다. ITR은 대략 145개 뉴클레오타이드 길이이고(AAV-1은 143개 뉴클레오타이드의 ITR을 가짐), 복제기점으로서, 바이러스 게놈에 대한 패키징 신호로서 작용하는 것을 포함하는 여러 기능을 갖는다.

게놈의 내부 비반복 부분은 AAV 복제(rep) 및 캡시드(cap) 영역으로 알려진 2개의 거대한 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함한다. 이러한 ORF는 각각 복제 및 캡시드 유전자 산물을 암호화하고: 복제 및 캡시드 유전자 산물(즉, 단백질)은 완전한 AAV 비리온의 복제, 조립 및 패키징을 가능하게 한다. 더 구체적으로는, 적어도 4개의 바이러스 단백질의 패밀리는 AAV rep 영역(Rep 78, Rep 68, Rep 52 및 Rep 40)으로부터 발현되고, 이들 모두는 이들의 겉보기 분자량에 따라 명명된다. AAV cap 영역은 적어도 3개의 단백질(VP1, VP2 및 VP3)을 암호화한다.

AAV는 기능적으로 완전한 AAV 비리온을 형성하기 위해 헬퍼 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 또는 백시니아 바이러스)와의 공동 감염을 필요로 하는, 헬퍼-의존적 바이러스이다. 헬퍼 바이러스와의 공동 감염의 부재 하에서, AAV는 숙주 세포 염색체에 바이러스 게놈을 삽입하거나 에피솜 형태로 존재하는 잠복 상태를 확립하지만, 감염성 비리온은 생산되지 않는다. 헬퍼 바이러스에 의한 후속 감염은 통합 게놈을 "구조하여(rescue)", 이것이 복제되게 하고 바이러스 캡시드에 패키징됨으로써, 감염성 비리온을 재구성한다. AAV가 상이한 종으로부터의 세포를 감염시킬 수 있지만, 헬퍼 바이러스는 숙주 세포와 동일한 종이어야 한다. 따라서, 예를 들어, 인간 AAV는 개 아데노바이러스로 공동감염된 개 세포에서 복제될 것이다.

HNA를 함유하는 재조합 AAV(rAAV) 비리온을 생성하기 위해, 적합한 숙주 세포주는 HNA를 함유하지만, rep 및 cap을 결여하는 AAV 벡터로 형질감염된다. 이어서, 숙주 세포는 야생형(wt) AAV 및 적합한 헬퍼 바이러스로 감염되어 rAAV 비리온을 형성한다. 대안적으로, wt AAV 유전자(rep 및 cap을 포함하는 헬퍼 기능 유전자로 알려짐) 및 헬퍼 바이러스 기능 유전자(부속 기능 유전자로 알려짐)는 하나 이상의 플라스미드에 제공되어, rAAV 비리온의 생산에서 wt AAV 및 헬퍼 바이러스에 대한 필요를 제거한다. 헬퍼 및 부속 기능 유전자 산물은 숙주 세포에서 발현되며, 이들은 이종성 유전자를 함유하는 rAAV 벡터 상에서 트랜스로 작용한다. 이어서, 이종성 유전자는 복제되고, 이것이 wt AAV 게놈인 것처럼 패키징되어, 재조합 AAV 비리온을 형성한다. 얻어진 rAAV 비리온에 의해 환자의 세포가 형질도입될 때, HNA가 유입되고, 환자 세포에서 발현된다. 환자의 세포가 rep 및 cap 유전자뿐만 아니라 부속 기능 유전자를 결여하기 때문에, rAAV 비리온은 추가로 복제하고 이의 게놈을 패키징할 수 없다. 또한, rep 및 cap 유전자 없이, wt AAV 비리온은 환자의 세포에서 형성될 수 없다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2003/0147853호 참조.

일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 임의의 자연적 또는 재조합 AAV 혈청형을 포함하거나 이로부터 유래될 수 있다. 본 개시내용에 따르면, AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12 및 AAV2/6일 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 양상에서, AAV 혈청형은 AAV2/6이다. 일부 양상에서, AAV 혈청형은 AAV2이다. 일부 양상에서, AAV 혈청형은 AAV6이다.

본 개시내용의 AAV 발현 벡터은 임의의 프로모터, 인핸서, 인트론, 신호 펩타이드, GLA-암호화, 폴리 A 서열 또는 우드처크 간염 바이러스(WHV) 전사후 조절 요소(WPRE) 서열을 포함할 수 있는, 발현 카세트를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 인핸서 및/또는 프로모터는 간-특이적이며, 예를 들어, 인간 아포지질단백질 E(APOE) 인핸서 및 인간 알파 1-안티트립신(hAAT) 프로모터로 이루어진다(Miao CH et al., Mol. Ther. 1(6): 522-532 (2000)). 일부 양상에서, 간 특이적 프로모터는 하나 이상의 ApoE 인핸서 서열을 포함한다(예를 들어, 1, 2, 3 및/또는 4; 문헌[Okuyama et al., Hum Gen Ther 7(5):637-645 (1996)] 참조). 일부 양상에서, 프로모터는 인트론에 연결된다. 일부 양상에서, 인트론은 인간 β-글로빈 유전자 및 분자의 첫 번째 인트론으로부터의 5' 공여자 부위 및 면역글로불린 유전자 중쇄 가변 영역의 인트론으로부터의 3' 수용자 부위를 포함하는, 인간 헤모글로빈 베타 (HBB)-IGG 키메라 인트론이다. 일부 양상에서, ApoE/hAAT 프로모터는 의도된 표적 조직인 간세포에서 특이적이고 고도로 활성이지만, 비-간 세포 및 조직 유형에서 비활성이며; 이는 비표적 조직에서 발현 및 활성을 감소 또는 막는다. 일부 양상에서, 신호 펩타이드는 α-GalA 신호 펩타이드(예를 들어, 인간 α-GalA 신호 펩타이드)를 포함하고, 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬(bGH) 폴리A 신호 서열을 포함한다. WPRE 서열은 임의의 야생형 또는 돌연변이된 WPRE 서열일 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제10,179,918호를 참조한다. 일부 양상에서, WPRE 서열은 돌연변이된 WPRE, 예컨대, mut6 WPRE 서열을 포함한다.

일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 2개의 ITR에 측접되는 α-Gal A 발현 카세트를 포함한다. 이러한 2개의 ITR은 α-Gal A 발현 카세트의 5' 및 3' 말단에 있다.

일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 이식유전자를 포함하는 α-Gal A 발현 카세트를 포함한다. 일부 양상에서, α-Gal A 이식유전자는 기능적 α-Gal A 유전자의 야생형 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터는 수정(corrective) α-Gal A 이식유전자를 포함한다. 수정 α-Gal A 이식유전자의 서열은 향상된 생물학적 활성(예를 들어, 생물학적 활성을 증가시키기 위한 최적화된 코돈 및/또는 유전자 발현을 개선시키기 위한 전사 및 번역 조절 서열의 변경)을 제공하기 위해 일부 방식에서 변경된다. 일부 양상에서, α-Gal A 유전자는 발현 특징을 개선시키도록 변형된다. 이러한 변형은 번역 개시 부위(예를 들어, 메티오닌)의 삽입, 최적화된 Kozak 서열의 첨가, 신호 펩타이드의 삽입 및/또는 코돈 최적화를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.

일부 양상에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 AAV 발현 벡터는 국제 특허 출원 공개 WO/2020/142752(본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용됨)의 변이체 #21로도 지칭되는 AAV-001이다.

본 개시내용의 rAAV 벡터(예를 들어, AAV-001 rAAV 벡터)는 hGLA 이식유전자의 발현을 유도하는 간-특이적 조절 요소를 포함하는 인간 α-Gal A(hGLA) 발현 카세트(3321 bp)를 포함한다(도 1). hGLA 이식유전자는 인핸서 및 인간 아포지질단백질 E(ApoE) 유전자로부터의 간 제어 영역 및 인간 α-1-안티트립신(hAAT) 프로모터의 제어하에 있다. 변형된 키메라 인트론(HBB-IghGLA 이식유전자)는 천연 hGLA 단백질 및 승인된 재조합 α-Gal A(Fabrazyme®)와 동일한 아미노산 서열을 갖는 코돈-최적화된 hGLA α-Gal A 효소를 포함한다.

본 개시내용의 α-Gal A 발현 카세트는 우드처크 간염 바이러스(WHV) 전사후 조절 요소의 돌연변이 형태(WPREmut6)를 포함한다. WPREmut6는 WHV X 단백질의 프로모터 영역을 포함한 다음에, X 단백질 발현을 방지하기 위해 X 단백질 오픈 리딩 프레임의 추정 프로모터 영역 및 개시 코돈에 점 돌연변이(mut6, Zanta-Boussif et al., Gene Therapy 16(5): 605-619 (2009))가 있는 X 단백질 자체의 절단된 영역(WPRE, Zufferey et al., J Virol. 73(4): 2886-2892 (1999))을 포함하는 592-bp DNA 서열이다. 폴리 A 서열은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호의 유도체이다. WPREmut6 구성요소의 첨가는 증가된 α-Gal A 단백질 생성으로 이어진다. 실제로, AAV-001PC(WPREmut6 구성요소 없음)에 비해 AAV-001의 효력이 더 큰 것으로 나타났다. AAV-001 rAAV 벡터는 AAV2로부터 유래된 ITR에 의해 각 말단에 측접된 α-Gal A 발현 카세트를 포함하되, α-Gal A 발현 카세트는 Sf9 곤충 세포/재조합 바큘로바이러스(Sf9/rBV) 발현 시스템을 사용해서 아데노-연관 바이러스 6형(AAV6)으로부터 유래된 캡시드로 패키징된다.

일부 양상에서, AAV 발현 벡터(예를 들어, AAV-001 rAAV 벡터) 서열은 아래의 표 1에 나타낸 바와 같이, α-Gal A 발현 카세트의 구성요소 및 서열을 포함한다.

일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터(예를 들어, AAV-001 rAAV 벡터)는 알파 1-안티트립신된(hAAT) 프로모터에 작동 가능하게 연결된 아포지질단백질 E(APOE) 인핸서, 인간 헤모글로빈 베타(HBB)-IGG 인트론, 신호 펩타이드를 암호화하는 서열, 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 이식유전자 및 소 성장 호르몬 폴리 A 신호 서열을 포함하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 발현 카세트를 포함한다. 일부 양상에서, 인핸서는 서열번호 2에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 프로모터는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 인트론은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, α-GalA 이식유전자는 서열번호 5에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 돌연변이된 WPRE 서열은 서열번호 6에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 폴리 A 신호 서열은 서열번호 7에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일부 양상에서, 본 개시내용의 α-Gal A 발현 카세트는 서열번호 9에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일부 양상에서, 인간 α-갈락토시다제 A의 신호 펩타이드는 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.

인간 α-갈락토시다제 A 신호 펩타이드(서열번호 10)

MQLRNPELHLGCALALRFLALVSWDIPGARA

IV. 약제학적 조성물 및 제형

일부 양상에서, 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에서 유용한 AAV 발현 벡터는 약제학적 조성물에 존재한다. 이렇게 해서, 본 개시내용의 일부 양상은 본 개시내용의 AAV 발현 벡터를 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 아쥬반트와 함께 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

일부 양상에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 CaCl₂, MgCl₂, NaCl, 수크로스 및 Kolliphor(폴록사머) P 188을 함유하는 인산염 완충 식염수를 포함한다.

일부 양상에서, 허용 가능한 제형 물질은 바람직하게는 사용되는 투약량 및 농도에서 수용자에 대해 비독성이다. 일부 양상에서, 제형 물질(들)은 s.c. 및/또는 I.V. 투여용이다. 일부 양상에서, 약제학적 조성물은, 예를 들어, pH, 삼투압몰농도, 점성도, 투명도, 색, 등장성, 냄새, 불임성, 안정성, 해리 또는 방출 속도, 조성물의 흡착 또는 침투를 변형, 유지 또는 보존하기 위한 제형 물질을 포함한다. 일부 양상에서, 적합한 제형 물질은 아미노산(예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신); 항미생물제; 항산화제(예컨대, 아스코르브산, 황산나트륨 또는 아황산수소나트륨); 완충제(예컨대, 붕산염, 중탄산염, Tris-HCl, 시트르산염, 인산염 또는 다른 유기산); 증량제(예컨대, 만니톨 또는 글리신); 킬레이트제(예컨대, 에틸렌다이아민 테트라아세트산(EDTA)); 착화제(예컨대, 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-사이클로덱스트린 또는 하이드록시프로필-베타- 사이클로덱스트린); 충전제; 단당류; 이당류; 및 기타 탄수화물(예컨대, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린); 단백질(예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린); 착색제, 향미제 및 희석제; 유화제; 친수성 중합체(예컨대, 폴리비닐피롤리돈); 저분자량 폴리펩타이드; 염-형성 반대이온(예컨대, 나트륨); 보존제(예컨대, 염화벤즈알코늄, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 펜에틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 솔브산 또는 과산화수소); 용매(예컨대, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜); 당 알코올(예컨대, 만니톨 또는 솔비톨); 현탁제; 계면활성제 또는 습윤제(예컨대, 플루로닉스(플루로닉스), PEG, 솔비탄 에스터, 폴리솔베이트, 예컨대, 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트 80, 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 틸록사팔); 안정성 향상제(예컨대, 수크로스 또는 솔비톨); 긴장성 향상제(예컨대, 알칼리 금속 할로겐화물, 바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨, 만니톨 솔비톨); 전달 비히클; 희석제; 부형제 및/또는 약제학적 아쥬반트를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1995).

일부 양상에서, 최적의 약제학적 조성물은, 예를 들어, 의도된 투여 경로, 전달 형식 및 목적하는 투약량에 따라 당업자에 의해 결정될 것이다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기 참조] 참조. 일부 양상에서, 이러한 조성물은 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도 및/또는 AAV 발현 벡터의 생체내 제거 속도에 영향을 미친다.

일부 양상에서, 약제학적 조성물에서 1차 비히클 또는 담체는 자연에서 수성 또는 비수성이다. 예를 들어, 일부 양상에서, 적합한 비히클 또는 담체는 is 주사용수, 생리 식염수 용액 또는 인공 뇌척수액이며, 이는 비경구 투여를 위한 조성물에 통상적인 다른 물질로 보충될 수 있다. 일부 양상에서, 식염수는 등장 인산염 완충 식염수를 포함한다. 일부 양상에서, 중성 완충 식염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 식염수는 추가로 예시적인 비히클이다. 일부 양상에서, 약제학적 조성물은 약 pH 7.0 내지 8.5의 Tris 완충제, 또는 약 pH 4.0 내지 5.5의 아세트산 완충제를 포함한다. 일부 양상에서, 약제학적 조성물은 솔비톨 또는 이에 적합한 대체물을 더 포함한다. 일부 양상에서, AAV 발현 벡터를 포함하는 조성물은 목적하는 순도를 갖는 조성물과 동결건조 케이크 또는 수용액의 형태의 선택된 최적의 제형화제(Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기 참조)를 혼합함으로써 저장용으로 제조된다. 추가로, 일부 양상에서, AAV 발현 벡터를 포함하는 조성물은 수크로스와 같은 적절한 부형제를 사용하여 동결건조물로서 제형화된다.

일부 양상에서, 약제학적 조성물은 비경구 전달을 위해 선택된다.

일부 양상에서, 제형화 구성성분은 투여 부위에 허용 가능한 농도로 존재한다. 일부 양상에서, 생리적 pH에서 또는 약간 더 낮은 pH에서, 전형적으로 약 5 내지 약 8의 pH 범위 내에서 조성물을 유지하기 위해 완충제가 사용된다.

일부 양상에서, 비경구 투여가 고려될 때, 치료 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 비히클 중 본 개시내용의 AAV 발현 벡터를 포함하는 무발열원의 비경구로 허용 가능한 수용액의 형태이다. 일부 양상에서, 비경구 주사용 비히클은, AAV 발현 벡터가 멸균, 등장 용액으로 제형화되고, 적절하게 보존된 멸균 증류수이다. 일부 양상에서, 제제는 생성물의 제어 또는 지속된 방출을 제공할 수 있고, 이어서, 데포 주사를 통해 전달될 수 있는 주사 가능 미소구체, 생분해성 입자, 중합체 화합물(예컨대, 폴리락트산 또는 폴리글리콜산), 비드 또는 리포좀과 같은 제제에 의한 목적하는 분자의 제형화를 수반한다. 일부 양상에서, 하이알루론산이 또한 사용된다. 하이알루론산은, 존재할 때, 순환에서 지속된 지속기간을 촉진시키는 효과를 가질 수 있다. 일부 양상에서, 목적하는 분자를 도입하기 위해 이식 가능한 약물 전달 장치가 사용된다.

일부 양상에서, 약제학적 조성물은 정제의 제조에 적합한 비독성 부형제와의 혼합물에 유효량의 AAV 발현 벡터를 포함한다. 일부 양상에서, 멸균수 또는 다른 적절한 비히클 중에 정제를 용해시킴으로써, 용액이 단위-용량 형태로 제조된다. 일부 양상에서, 적합한 부형제는 비활성 희석제, 예컨대, 탄산칼슘, 탄산나트륨 또는 중탄산나트륨, 락토스 또는 인산칼슘; 또는 결합제, 예컨대, 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 또는 윤활제, 예컨대, 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 활석을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

지속- 또는 제어-전달 제형 중에 AAV 발현 벡터를 포함하는 제형을 포함하는 추가적인 약제학적 조성물은 당업자에게 자명할 것이다. 일부 양상에서, 다양한 다른 지속- 또는 제어된-전달 수단, 예컨대, 리포좀 담체, 생분해성 마이크로입자 또는 다공성 비드 및 데포 주사를 제형화하기 위한 기법은 또한 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 약제학적 조성물의 전달을 위한 다공성 중합체 마이크로입자의 제어 방출을 기재하는 PCT 출원 PCT/US93/00829를 참조한다. 일부 양상에서, 지속-방출 제제는 성형 물품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로입자의 형태로 반투과성 중합체 기질을 포함할 수 있다. 지속 방출 기질은 폴리에스터, 하이드로겔, 폴리락타이드(미국 특허 제3,773,919호 및 EP 058,481), L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체(Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)), 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트)(Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981) 및 Langer, Chem. Tech., 12:98- 105 (1982)), 에틸렌 비닐 아세테이트(Langer et al., 상기 참조) 또는 폴리-D(-)-3-하이드록시뷰티르산(EP 133,988)을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 지속 방출 조성물은 또한 당업계에 알려진 임의의 여러 방법에 의해 제조될 수 있는 리포좀을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Eppstein et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985)]; EP 036,676; EP 088,046 및 EP 143,949 참조.

생체내 투여를 위해 사용될 약제학적 조성물은 전형적으로 멸균이다. 일부 양상에서, 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 달성된다. 일부 양상에서, 조성물이 동결건조되는 경우, 이 방법을 사용하는 멸균화는 동결건조 및 재구성 전 또는 후에 수행된다. 일부 양상에서, 비경구 투여용 조성물은 동결건조 형태로 또는 용액 중에 저장된다. 일부 양상에서, 비경구 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어, 피하주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백(bag) 또는 바이알에 넣어진다.

일부 양상에서, 일단 약제학적 조성물이 제형화되면, 이는 용액, 현탁액, 겔, 에멀션, 고체로서 또는 탈수 또는 동결건조 분말로서 멸균 바이알에 저장된다. 일부 양상에서, 이러한 제형은 바로 사용 가능한 형태로 또는 투여 전에 재구성되는 형태(예를 들어, 동결건조)로 저장된다.

V. 파브리병 요법

일부 양상에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 AAV 발현 벡터로 인간 대상체의 파브리병을 치료하는 방법에 관한 것이되, 대상체는 투여하기 전에 파브리병에 대해 효소 대체 요법(ERT)("전처리") 또는 투여하기 전에 파브리병에 대해 비-효소 대체 요법("전처리")이 투여된 적이 있다.

V.A 효소 대체 요법

일부 양상에서, 전처리 ERT는 효소 대체 요법을 포함한다.

일부 양상에서, 전처리 ERT는 재조합 α 갈락토시다제 A(GLA) 단백질 또는 GAL을 발현시키는 유전자를 포함한다. 일부 양상에서, 전처리 ERT는 아갈시다제 알파 및/또는 베타 또는 유전자 발현 아갈시다제 알파 및/또는 베타를 포함한다. 일부 양상에서, 효소 대체 요법은 아갈시다제 알파(레프라갈®, Shire Human Genetic Therapies), 아갈시다제 베타(Fabrazyme®; Sanofi Genzyme), 페구니갈시다제 알파(PRX-102; Protalix BioTherapeutics) 또는 이들의 임의의 조합물을 투여하는 단계를 포함한다. ERT의 이러한 형태는 정맥내로 투여되는 효소의 재조합 형태로 환자의 부적절한 α-Gal A 활성을 보상하는 것으로 의도된다. ERT는 신장 및 일부 다른 세포 유형의 모세혈관내피에서 Gb3 침착을 감소시키는 것으로 입증되었다. ERT는 여러 상황에서 효과적이지만, 치료는 또한 제한이 있다. ERT는 뇌졸중 위험을 감소시키는 것으로 입증되지 않았고, 심장 근육은 느리게 반응하며, 신장의 일부 세포 유형에서 Gb3 제거는 제한되어 있다. 일부 환자는 ERT에 대한 면역 반응이 발생된다. 예를 들어, 미국 특허 제10,155,027호를 참조한다.

일부 양상에서, 아갈시다제 알파의 약 0.2㎎/㎏ 체중은 정맥내 주입으로서 2주마다 주입된다.

일부 양상에서, 아갈시다제 베타의 약 0.3㎎/㎏ 체중은 정맥내 주입으로서 2주마다 주입된다. 일부 양상에서, 아갈시다제 베타의 약 1㎎/㎏ 체중은 정맥내 주입으로서 2주마다 주입된다.

일부 양상에서, 더 높은 ERT 투약을 통해 대상체에서 더 높은 항-GLA 중화항체 수준을 포화시키는 것은 임상적 이점을 제공할 수 있다(예를 들어, 혈장 lyso-Gb3 수준을 감소시킴). 예를 들어, 문헌[Lenders et al., Orphanet Journal of Rare Diseases, 13(171) (2018)] 참조.

일부 양상에서, 전처리 ERT는 유전자 요법을 포함한다. 일부 양상에서, 유전자 요법은 효소를 암호화하는 벡터를 포함한다. 일부 양상에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 양상에서, 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 일부 양상에서, 유전자 요법은 AVR-RD-01(AvroBio), FLT-190(Freeline Therapeutics), 페구니갈시다제 알파(PRX-102; Protalix BioTherapeutics) 및 4D-310(4D Molecular Therapeutics) 또는 이들의 임의의 조합물을 투여하는 것을 포함한다.

AVR-RD-01 약물 제품은 인간 AGA 상보적 데옥시리보핵산(cDNA) 서열을 암호화하는 렌티바이러스 벡터/알파-갈락토시다제 A(AGA)로 형질도입된 세포를 함유하는 자가 CD34+ 세포-풍부 분획을 포함한다. (ClinicalTrials.gov; 식별자: NCT03454893).

FLT190은 AAV8 캡시드(ssAAV8-FRE1-GLAco)로 위형화된, 간 특이적 프로모터(FRE1)에 의해 구동된 코돈-최적화된 인간 GLA cDNA를 갖는 단일가닥(ss) AAV 유전자 요법 작제물이다. (Nephron Clinical Practice, Abstracts: 6th Update on Fabry Disease: Biomarkers, Progression and Treatment Opportunities, May 26-28, 2019, Prague, Czech Republic).

페구니갈시다제 알파(PRX-102)는 재조합 α-갈락토시다제-A 효소의 연구용, 식물 세포 배양-발현되고, 화학적으로 변형된 안정화된 형태이다. 단백질 서브유닛은 짧은 PEG 모이어티를 사용하여 화학적 가교를 통해 공유결합되어, 독특한 약물동태학 매개변수를 갖는 분자를 생성한다. 임상 연구에서, PRX-102는 대략 80시간의 순환 반감기를 갖는 것으로 관찰되었다.

4D-310, 아데노-연관 바이러스(AAV) 유전자 요법은 CAG 프로모터에 의해 유도되는 코돈-최적화된 전장 인간 GLA 이식유전자를 암호화하는 2개의 활성 구성성분(캡시드(4D-C102) 및 이식유전자 카세트)으로 이루어진다. 4D-310은 복제될 수 없도록(복제 부적격) 조작되었다. (ClinicalTrials.gov; 식별자: NCT04519749).

일부 양상에서, 유전자 요법은 효소를 암호화하는 벡터를 포함한다. 일부 양상에서, 벡터는, 예를 들어, 미국 특허 제9,308,281호에 기재된 바와 같이, 인간 GLA 단백질 또는 아갈시다제 알파 및/또는 베타를 암호화하는 mRNA를 포함한다. 일부 양상에서, mRNA는 (예를 들어, 야생형 또는 mRNA의 천연 형태에 비해) mRNA에 안정성을 부여하는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있고, 또한 단백질의 관련된 비정상 발현에 연관된 결함을 수정하는 야생형에 비해 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 핵산은 5'과 3' 비번역 영역 중 하나 또는 둘 다에 대해 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 거대세포바이러스(CMV) 급초기 1(IE1) 유전자의 부분적 서열, 폴리 A 꼬리, Cap1 구조 또는 인간 성장 호르몬(hGH)을 암호화하는 서열의 포함을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 양상에서, mRNA는 mRNA 면역원성을 감소시키도록 변형된다.

일부 양상에서, 유전자 요법은 전달 비히클에 의해 전달된다. 일부 양상에서, 전달 비히클은 미국 특허 제9,308, 281호에 기재된 바와 같이, 리포좀 전달 비히클, 예를 들어, 지질 나노입자이다. 일부 양상에서, 인간 GLA 단백질 또는 아갈시다제 알파 및/또는 베타를 암호화하는 mRNA는 표적 세포에 대한 전달을 촉진시키기 위해 리포좀 전달 비히클에서 제형화된다. 상정된 전달 비히클은 하나 이상의 양이온성 지질, 비양이온성 지질 및/또는 PEG-변형된 지질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 전달 비히클은 다음의 양이온성 지질 중 적어도 하나를 포함할 수 있다: C12-200, DLin-KC2-DMA, DODAP, HGT4003, ICE, HGT5000 및 HGT5001. 일부 양상에서, 전달 비히클은 콜레스테롤(chol) 및/또는 PEG-변형 지질을 포함한다. 일부 양상에서, 전달 비히클은 DMG-PEG2K를 포함한다. 일부 양상에서, 전달 비히클은 다음의 지질 제형 중 하나를 포함한다: C12-200, DOPE, chol, DMG-PEG2K; DODAP, DOPE, 콜레스테롤, DMG-PEG2K; HGT5000, DOPE, chol, DMG-PEG2K, HGT5001, DOPE, chol 및 DMG-PEG2K.

일부 양상에서, 전처리 ERT는 Galafold®(미갈라스타트; Amicus Therapeutics)를 투여하는 것을 포함한다. Galafold®는 알파-갈락토시다제 A(알파-Gal A) 약리학적 샤페론이다. 일부 양상에서, 123㎎의 Galafold®는, 예를 들어, 문헌[Lenders et al., J Am Soc Nephrol, 29:2265-2278 (2018)]에 기재된 바와 같이 동일한 날에 이틀마다 1회 경구 투여된다.

V.B 효소 대체 요법 및 활성 부위-특이적 샤페론

일부 양상에서, 본 개시내용의 전처리 ERT는, 예를 들어, 미국 특허 제10,155,027호에 기재된 바와 같이, α-Gal A, 예를 들어, 미갈라스타트(1-데옥시갈락토노지리마이신(DGJ))의 경우, 활성 부위-특이적 샤페론(ASSC)과 병용하여 α-갈락토시다제 A 단백질(예를 들어, 재조합 α-Gal A(rhα-Gal A))를 포함한다.

일부 양상에서, 본 개시내용은 α-Gal A의 병용요법(예를 들어, rhα-Gal A ERT) 및 α-Gal A 효소(예를 들어, (DGJ))의 경우 ASSC를 제공한다. 일부 양상에서, α-Gal A 및 ASSC는 함께 공동제형화되고, 공동 제형으로서 대상체에게 동시에 투여된다. 일부 양상에서, ASSC 1-데옥시갈락토노지리마이신은 약제학적 조성물로서 α-Gal A와 함께 공동제형화된다. 이러한 조성물은 대상체에 대한 투여 후 저장 동안(즉, 시험관내)과 생체내에서 α-Gal A의 안정성을 향상시킬 수 있고, 순환 반감기, 조직 흡수를 증가시키며, α-Gal A의 치료 효능 증가(예를 들어, 조직 GL-3 수준 감소의 증가)를 초래한다. 일부 양상에서, 투여 경로는 정맥내이다. 투여는 제제의 볼루스를 주기적으로 주사하거나, 예를 들어, 외부 저장소(예를 들어, IV 백)의 정맥내 투여와 같이 장기간에 걸쳐 지속 방출 투약 형태로 투여될 수 있다.

정맥내 투여 용도에 적합한 공동 제형화는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 일부 양상에서, 형태는 멸균이며 용이한 주사능이 존재하는 정도로 유체이다. 일부 양상에서, 이는 제조 및 저장 조건 하에서 안정하며, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존된다. 일부 양상에서, 공동 제형화는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질과 같은 담체를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아 및 항진균제(예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 벤질 알코올, 솔브산 등)에 의해 일어날 수 있다.

일부 양상에서, 등장제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨이 첨가된다. 주사 가능한 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물 중의 사용에 의해 일어날 수 있다. 멸균 주사 가능한 용액은 위에 열거된 다양한 다른 성분이 있는 적절한 용매 중에서 필요한 양으로 α-Gal A 및 ASSC(예를 들어, DGJ)를 혼입시킨 후에, 여과 또는 말단 멸균화시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 염기성 분산액 매질 및 위에 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 다양한 멸균 활성 성분을 혼입시킴으로써 분산액이 제조된다. 멸균 주사 가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 이전에 이의 멸균 여과된 용액으로부터의 임의의 추가적인 바람직한 성분을 활성 성분의 분말에 더하여 수득하는 진공 건조 및 냉동-건조 기법이다.

일부 양상에서, 공동 제형은 부형제를 함유할 수 있다. 공동제형에 포함될 수 있는 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 시트르산염 완충제, 인산염 완충제, 아세트산염 완충제, 및 중탄산염 완충제, 아미노산, 유레아, 알코올, 아스코르브산, 인지질과 같은 완충제; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 콜라겐 및 젤라틴, 염(예컨대, EDTA, EGTA 및 염화나트륨), 리포좀, 폴리비닐피롤리돈, 당(예컨대, 덱스트란, 만니톨, 솔비톨 및 글리세롤), 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어, PEG-4000, PEG-6000), 글리세롤, 글리신(또는 다른 아미노산) 및 지질이다. 공동제형과 함께 사용하기 위한 완충제 시스템은 시트르산염, 아세트산염, 중탄산염 및 인산염 완충제를 포함할 수 있다.

공동제형은 또한 비이온성 세정제를 함유할 수 있다. 비이온성 세정제는 Polysorbate 20, Polysorbate 80, Triton X-100, Triton X-114, Nonidet P-40, Octyl α-glucoside, Octyl β-glucoside, Brij 35, Pluronic, 및 Tween 20을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

단백질 및 샤페론 제제의 동결건조를 위해, 단백질 농도는 약 0.1㎎/㎖ 내지 약 10㎎/㎖일 수 있다. 증량제, 예컨대, 글리신, 만니톨, 알부민 및 덱스트란이 동결건조 혼합물에 첨가될 수 있다. 또한, 가능한 동결보존제, 예컨대, 이당류, 아미노산 및 PEG가 동결건조 혼합물에 첨가될 수 있다. 위에 열거한 임의의 완충제, 부형제 및 세정제가 또한 첨가될 수 있다.

일부 양상에서, 공동제형은 약 0.05 내지 약 100μM, 약 0.1 내지 약 75μM, 약 0.2 내지 약 50μM, 약 0.3 내지 약 40μM, 약 0.4 내지 약 30μM, 약 0.5 내지 약 20μM, 약 0.6 내지 약 15μM, 약 0.7 내지 약 10μM, 약 0.8 내지 약 9μM, 약 0.9 내지 약 8μM, 약 1 내지 약 7μM, 약 2 내지 약 6μM, 또는 약 3 내지 약 5μM의 농도로 α-Gal A를 포함한다.

일부 양상에서, 공동제형은 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5 또는 15μM의 농도로 α-Gal A를 포함한다.

일부 양상에서, 공동제형은 약 0.0025 내지 약 5㎎/㎖, 약 0.005 내지 약 4.5㎎/㎖, 약 0.025 내지 약 4㎎/㎖, 약 0.05 내지 약 3.5㎎/㎖, 약 0.25 내지 약 3㎎/㎖, 약 0.5 내지 약 2.5㎎/㎖, 약 0.75 내지 약 2㎎/㎖ 또는 약 1 내지 약 1.5㎎/㎖의 농도로 α-Gal A를 포함한다.

일부 양상에서, 공동제형은 약 10 내지 약 25,000μM, 약 50 내지 약 20,000μM, 약 100 내지 약 15,000μM, 약 150 내지 약 10,000μM, 약 200 내지 약 5,000μM, 약 250 내지 약 1,500μM, 약 300 내지 약 1,000μM, 약 350 내지 약 550μM 또는 약 400 내지 약 500μM의 농도로 DGJ를 포함한다.

일부 양상에서, 공동제형은 약 0.002 내지 약 5㎎/㎖, 약 0.005 내지 약 4.5㎎/㎖, 약 0.02 내지 약 4㎎/㎖, 약 0.05 내지 약 3.5㎎/㎖, 약 0.2 내지 약 3㎎/㎖, 약 0.5 내지 약 2.5㎎/㎖ 또는 약 1 내지 약 2㎎/㎖의 농도로 DGJ를 포함한다.

일부 양상에서, 공동제형은 약 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18000, 19000 또는 20000μM의 농도로 DGJ를 포함한다.

일부 양상에서, α-Gal A 효소 및 DGJ는 대상체에 투여를 위한 공동제형을 생성하도록 조합되되, 대상체에게 투여되는 공동제형의 α-Gal A 효소의 투약량은 약 0.05 내지 약 10㎎/㎏, 약 0.1 내지 약 5㎎/㎏, 약 0.2 내지 약 4㎎/㎏, 약 0.3 내지 약 3㎎/㎏, 약 0.4 내지 약 2㎎/㎏, 약 0.5 내지 약 1.5㎎/㎏ 또는 약 0.5 내지 약 1㎎/㎏이다.

일부 양상에서, 대상체에게 투여되는 공동제형의 α-Gal A 효소의 투약량은 약 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 또는 5㎎/㎏이다.

일부 양상에서, α-Gal A 효소와 DGJ는 대상체에 투여를 위한 공동제형을 생성하도록 조합되되, 대상체에게 투여되는 공동제형의 DGJ의 투약량은 약 0.05 내지 20㎎/㎏, 약 0.1 내지 약 15㎎/㎏, 약 0.2 내지 약 10㎎/㎏, 약 0.3 내지 약 10㎎/㎏, 약 0.4 내지 약 9㎎/㎏, 약 0.5 내지 약 8㎎/㎏, 약 0.6 내지 약 7㎎/㎏, 약 0.7 내지 약 6㎎/㎏, 약 0.8 내지 약 5㎎/㎏, 약 0.9 내지 약 4㎎/㎏, 약 1 내지 약 3㎎/㎏, 또는 약 1.5 내지 약 2㎎/㎏이다.

일부 양상에서, 대상체에게 투여되는 공동제형의 DGJ의 투약량은 약 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10㎎/㎏이다.

일부 양상에서, α-Gal A와 DGJ의 공동제형은 DGJ가 존재하지 않는 것을 제외하고 α-Gal A가 공동제형과 동일한 투약량으로 대상체에게 투여될 때 달성된 혈장 AUC 농도의 약 0.5 내지 10배, 약 1 내지 약 8배, 약 1.5 내지 약 6배, 약 2 내지 약 5.5배, 약 2.5 내지 약 5배 또는 약 3 내지 약 4.5배의 혈장 AUC 농도를 달성하는 데 효과적인 양으로 대상체에게 정맥내로 투여될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "AUC"는 주어진 약물에 대해 시간에 따라 신체의 총 노출을 평가하기 위한 수학적 계산을 나타낸다. 투약 후 혈액 중의 농도를 플로팅하는 그래프에서, 약물 농도 변수는 y축 상에 있고, 시간은 x-축 상에 있다. 지정된 시간 간격에 대한 약물 농도 곡선과 x-축 사이의 면적은 AUC이다. AUC는 투약 계획에 대한 가이드로서 그리고 신체 내의 상이한 약물의 이용 가능성을 비교하기 위해 사용된다.

일부 양상에서, α-Gal A와 DGJ의 공동제형은 DGJ가 존재하지 않는 것을 제외하고 α-Gal A가 공동제형과 동일한 투약량으로 대상체에게 투여될 때 달성된 α-Gal A 조직 흡수 수준의 약 0.5 내지 10배, 약 1 내지 약 8배, 약 1.5 내지 약 6배, 약 2 내지 약 5.5배, 약 2.5 내지 약 5배 또는 약 3 내지 약 4.5배의 α-Gal A 조직 흡수 수준을 달성하는 데 효과적인 양으로 대상체에게 정맥내로 투여될 수 있다.

공동제형의 전달은 몇 시간, 1주 내지 몇 주, 1개월 내지 몇 개월, 또는 최대 1년 이상 범위의 사전 선택된 투여 기간에 걸쳐 지속적일 수 있다. 일부 양상에서, 투약 형태는 장기간의 시간 기간에 걸쳐 α-Gal A의 전달에 적합하게 된 것이다. 이러한 전달 장치는 몇 시간(예를 들어, 2시간, 12시간, 또는 24시간 내지 48시간 이상) 내지 며칠(예를 들어, 2 내지 5일 이상, 약 100일 이상), 내지 몇 개월 또는 몇 년 동안 α-Gal A의 투여에 적합하게 될 수 있다. 일부 양상에서, 장치는 약 1개월 내지 약 12개월 이상 범위의 기간 동안 전달에 적합하게 된다. α-Gal A 전달 장치는, 예를 들어, 약 2시간 내지 약 72시간, 약 4시간 내지 약 36시간, 약 12시간 내지 약 24시간; 약 2일 내지 약 30일, 약 5일 내지 약 20일, 약 7일 내지 약 100일 이상, 약 10일 내지 약 50일; 약 1주 내지 약 4주; 약 1개월 내지 약 24개월 이상, 약 2개월 내지 약 12개월, 약 3개월 내지 약 9개월, 또는 필요한 경우 이러한 범위 내에 증분적 범위를 포함하는 다른 범위의 시간의 기간 동안 개체에게 α-Gal A를 투여하는 데 적합한 것일 수 있다.

일부 양상에서, DGJ와의 공동제형에 존재하는 α-Gal A의 용량은 1일 1회, 2일마다 1회, 3일마다 1회, 4일마다 1회, 5일마다 1회 또는 6일마다 1회 정맥내로 투여된다. 일부 양상에서, 용량은 개체의 간에서의 α-Gal A의 독성 수준을 초래하지 않는다. 일부 양상에서, α-Gal A 및 DGJ의 공동제형 조성물은 용량 투여 후 약 24시간 이내에 대상체의 조직에서 α-Gal A의 피크 농도를 초래하기 위한 충분한 용량으로 투여된다. 일부 양상에서, α-Gal A 및 DGJ의 공동제형 조성물은 용량 투여 후 약 0.2 내지 약 50시간, 약 0.2 내지 약 24시간, 약 0.2 내지 약 5시간, 약 0.2 내지 약 1시간, 약 0.2 내지 약 0.5시간 또는 약 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0.5 또는 더 적은 시간 이내에 대상체의 조직에서 α-Gal A의 피크 농도를 초래하기 위한 충분한 용량으로 투여된다. 일부 양상에서, 공동제형은 단일 용량으로 투여된다. 일부 양상에서, 공동제형은 다회 용량으로 투여된다.

V.C 비-효소 대체 요법

일부 양상에서, 파브리병에 대한 요법은 효소 대체 요법이다.

일부 양상에서, 비-효소 대체 요법은 소분자 요법을 포함한다. 파브리병의 소분자 요법에 대한 일부 신흥 약물 개발 전략은, 예를 들어, 문헌[Motabar et al., Curr Chem Genomics 4: 50-56 (2010)]에 기재된 바와 같이, 기질 감소 요법(SRT), 잔여 효소 활성화, GLA 프로모터 활성화, 단백질 항상성 조절 (단백질 정체) 및 화학적 샤페론 요법(CCT)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

일부 양상에서, 소분자 요법은 루세라스타트(Idorsia Pharmaceuticals Ltd), 벤글루스타트(Sanofi Genzyme), 또는 아파베타론(development codes RVX 208, RVX-208, 및 RVX000222; Resverlogix Corp.) 또는 이들의 임의의 조합물을 투여하는 것을 포함한다.

VI. AAV 발현 벡터의 생성 방법

또한 바이러스 복제 세포와 AAV 폴리뉴클레오타이드 또는 AAV 게놈(예를 들어, 본 개시내용의 AAV 벡터)를 접촉시키는 것을 포함하는 바이러스 복제 세포에서 바이러스 게놈 복제에 의해, AAV 입자의 생성을 위한 방법은 본 개시내용의 범주 내이다. 본 개시내용과 관련하여, 본 명세서에 개시된 AAV 발현 벡터는 AAV 페이로드 작제물 벡터로 간주된다.

일부 양상에서, AAV 입자는 (1) 적격 박테리아 세포를 박미드(bacmid) 벡터 및 바이러스 작제물 벡터 및/또는 AAV 페이로드 작제물 벡터 중 하나로 공동 형질감염시키는 단계, (2) 얻어진 바이러스 작제물 발현 벡터 및 AAV 페이로드 작제물 발현 벡터를 단리시키고, 별도로 바이러스 복제 세포를 형질감염시키는 단계, (3) 바이러스 작제물 발현 벡터 또는 AAV 페이로드 작제물 발현 벡터를 포함하는 바이러스 작제물 입자 및 얻어진 페이로드를 단리 및 정제하는 단계, (4) 바이러스 작제물 발현 벡터 또는 AAV 페이로드 작제물 발현 벡터를 포함하는 바이러스 작제물 입자와 AAV 페이로드 둘 다로 바이러스 복제 세포를 공동감염시키는 단계, 및 (5) 파보바이러스 게놈을 포함하는 바이러스 입자를 채취 및 정제하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된다.

일 양상에서, 본 개시내용은 (1) 포유류 세포, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만 HEK293 세포를, 페이로드 영역(예를 들어, 본 개시내용의 치료 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드), rep 및 cap 유전자를 발현시키는 작제물 및 헬퍼 작제물로 동시에 공동형질감염시키는 단계, 및 (2) 바이러스 게놈을 포함하는 AAV 입자를 채취 및 정제하는 단계를 포함하는, AAV 입자를 생성하는 방법을 제공한다.

일부 양상에서, AAV 입자는 곤충 세포를 포함하는 바이러스 복제 세포에서 생성될 수 있다. 배양물에서 곤충 세포에 대한 성장 조건 및 배양물에서 곤충 세포 내 이종성 산물의 생산은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제6,204,059호를 참조한다.

바이러스 복제 세포는 원핵(예를 들어, 박테리아) 세포, 및 곤충 세포, 효모 세포 및 포유류 세포를 포함하는 진핵세포를 비롯한, 임의의 생물학적 유기체로부터 선택될 수 있다. 바이러스 복제 세포는 포유류 세포, 예컨대, A549, WEH1, 3T3, 10T1/2, BHK, MDCK, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO를 포함할 수 있다.

W138, HeLa, HEK293, Saos, C2C12, L cells, HT1080, HepG2 및 1차 섬유아세포, 간세포 및 근아세포는 포유류로부터 유래된다. 바이러스 복제 세포는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼 및 햄스터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 포유류 종으로부터 유래된 세포 또는 섬유아세포, 간세포, 종양 세포, 세포주 형질전환 세포 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 세포 유형을 포함한다.

본 명세서에 개시된 바이러스 생산은 α-Gal A 단백질과 같은 페이로드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 페이로드를 전달하기 위해 표적 세포와 접촉하는 AAV 입자, 예를 들어, 재조합 바이러스 작제물을 생산하는 공정 및 방법을 기재한다.

일부 양상에서, AAV 입자는 포유류 세포를 포함하는 바이러스 복제 세포에서 생성될 수 있다. 재조합 AAV 입자의 생산을 위해 통상적으로 사용되는 바이러스 복제 세포는 293 세포, COS 세포, HeLa 세포 및 KB 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

일부 양상에서, AAV 입자는 포유류 세포에서 생산되되, 모두 3개의 VP 단백질은 1:1:10(VP1:VP2:VP3)에 접근하는 화학량론에서 발현된다. 이러한 제어된 발현 수준을 허용하는 조절 메커니즘은 차별적 스플라이싱에 의해 생성되는 VP1에 대한 하나 및 VP2 및 VP3에 대한 다른 하나인, 2개의 mRNA의 생산을 포함한다.

일부 양상에서, AAV 입자는 삼중 형질감염 방법을 사용하여 포유류 세포에서 생산되되, 페이로드 작제물, 파보바이러스 Rep 및 파보바이러스 Cap 및 헬퍼 작제물은 3개의 상이한 작제물 내에 포함된다. AAV 입자 생산의 3가지 구성성분의 삼중 형질감염 방법은 형질도입 효율, 표적 조직(향성) 평가 및 안정성을 포함하는 분석을 위해 소량의 바이러스를 생산하는 데 이용될 수 있다.

일부 양상에서, 바이러스 작제물 벡터 및 AAV 페이로드 작제물 벡터는 각각 알려진 표준 분자 생물학 기법에 의해 바큘로바이러스 플라스미드로도 알려진 박미트에 트랜스포존 공여자/수용자 시스템에 의해 혼입되고, 당업자에 의해 수행될 수 있다. 별도의 바이러스 복제 세포 집단의 형질감염은 2개의 바큘로바이러스, 즉, 바이러스 작제물 발현 벡터를 포함하는 1개 및 AAV 페이로드 작제물 발현 벡터를 포함하는 다른 1개를 생성한다. 2개의 바큘로바이러스는 AAV 입자의 생산을 위해 단일 바이러스 복제 세포 집단을 감염시키는 데 사용될 수 있다.

열대거세미나방(Spodoptera frugiperda: Sf9) 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 곤충 세포에서 바이러스 입자를 생산하기 위한 바큘로바이러스 발현 벡터는 높은 역가의 바이러스 입자 산물을 제공한다. 바이러스 작제물 발현 벡터 및 AAV 페이로드 작제물 발현 벡터를 암호화하는 재조합 바큘로바이러스는 바이러스 복제 세포의 생산적 감염을 개시한다. 1차 감염으로부터 방출된 전염성 바큘로바이러스 입자는 배양물에서 추가 세포를 2차로 감염시켜, 초기 감염 다중도의 함수인 다수의 감염 주기에서 전체 세포 배양물 집단을 기하급수적으로 감염시킨다, 예를 들어, 문헌[Urabe, M. et al., J Virol. 2006 Feb; 80 (4): 1874-85]을 참조하며, 이의 내용은 본 명세서에 이들의 전문이 참조에 의해 원용된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터(예를 들어, AAV-001 rAAV 벡터)는 AAV2로부터 유래된 ITR이 각 말단 상에 측접된 α-Gal A 발현 카세트를 포함하되, α-Gal A 발현 카세트는 Sf9 곤충 세포/재조합 바큘로바이러스(Sf9/rBV) 발현 시스템을 사용하여 아데노-연관 바이러스 6형(AAV6)으로부터 유래된 캡시드로 패키징된다. 일부 양상에서, 본 개시내용의 AAV 발현 벡터(예를 들어, AAV-001 rAAV 벡터)는 AAV2로부터 유래된 ITR이 각 말단 상에 측접된 α-Gal A 발현 카세트를 포함하되, α-Gal A 발현 카세트는 포유류 발현 시스템, 예를 들어, HEK293을 사용해서 AAV6로부터 유래된 캡시드로 패키징된다.

곤충 세포 시스템에서 바큘로바이러스에 의한 AAV 입자의 생산은 알려진 바큘로바이러스 유전적 및 물리적 불안정성을 처리할 수 있다. 바큘로바이러스-감염 바이러스 생산 세포는 액체 질소에서 동결보존될 수 있는 분취액에 채취되고; 분취액은 대규모 바이러스 생산 세포 배양물의 감염을 위한 생존도 및 감염도를 보유한다(Wasilko DJ et al., Protein Expr Purif. 2009 Jun; 65(2): 122-32).

일부 양상에서, 바큘로바이러스 감염에 허용적인 안정적인 바이러스 복제 세포는 전체 AAV 게놈, Rep 및 Cap 유전자, Rep 유전자, Cap 유전자, 전사 카세트로서의 각각의 Rep 단백질, 별도의 전사 카세트로서의 각각의 VP 단백질, AAP(조립체 활성화 단백질) 또는 천연 또는 비천연 프로모터를 갖는 바큘로바이러스 헬퍼 유전자 중 적어도 하나를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 AAV 복제 및 바이러스 입자 생산에 필요한 임의의 구성요소의 적어도 하나의 안정한 통합된 복제물로 조작된다.

일부 양상에서, AAV 입자 생산은 생산 규모를 증가시키기 위해 변형될 수 있다. 대규모 배양물 형식으로 복제 세포의 형질감염은 당업계에 알려진 임의의 방법에 따라 수행될 수 있다.

일부 양상에서, 세포 배양물 생물반응기는 대규모 바이러스 생산을 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, 생물반응기는 교반 탱크 반응기를 포함한다.

세포 용해

바이러스 생산 세포를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 본 개시내용의 세포는 당업계에 알려진 임의의 방법에 따라 세포 용해될 수 있다. 본 개시내용의 임의의 세포 내에 존재하는 하나 이상의 제제(예를 들어, 바이러스 입자)를 얻기 위해 세포 용해가 수행될 수 있다.

세포 용해 방법은 화학적 또는 기계적일 수 있다. 화학적 세포 용해는 전형적으로 하나 이상의 세포와 하나 이상의 용해제를 접촉시키는 것을 포함한다. 기계적 용해는 전형적으로 하나 이상의 세포에 하나 이상의 용해 조건 및/또는 하나 이상의 용해력을 가하는 것을 포함한다. 일부 양상에서, 화학적 용해는 세포를 용해시키는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "용해제"는 세포의 붕괴에 도움을 줄 수 있는 임의의 제제를 지칭한다. 일부 경우에, 용해제는 용해 용액 또는 용해 완충제로도 불리는 용액 중에 도입된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "용해 용액"은 하나 이상의 용해제를 포함하는 용액(전형적으로 수용액)을 지칭한다. 용해제에 추가로, 용해 용액은 1종 이상의 완충제, 가용화제, 계면활성제, 보존제, 동결보존제, 효소, 효소 저해제 및/또는 킬레이터를 포함할 수 있다.

염의 농도는 세포막의 파열을 위한 효과적인 농도를 얻도록 증가 또는 감소될 수 있다. 세정제를 포함하는 용해제는 이온성 세정제 또는 비이온성 세정제를 포함할 수 있다. 세정제는 세포막, 세포벽, 지질, 탄수화물, 지방단백질 및 당단백질을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 세포 구조를 붕괴시키거나 용해시키는 작용을 할 수 있다.

일부 양상에서, 기계적 세포 용해가 수행된다. 기계적 세포 용해 방법은 하나 이상의 용해 조건 및/또는 하나 이상의 용해력의 사용을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "용해 조건"은 세포 붕괴를 촉진시키는 상태 또는 환경을 지칭한다. 용해 조건은 특정 온도, 압력, 삼투압 순도, 염도 등을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 용해 조건은 증가 또는 감소된 온도를 포함한다. 일부 양상에서, 용해 조건은 세포 붕괴를 촉진시키기 위한 온도의 변화를 포함한다. 이러한 양상에 따라 수행되는 세포 용해는 냉동 해동 용해를 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "용해력"은 세포를 붕괴시키기 위해 사용되는 물리적 활성을 지칭한다. 용해력은 기계력, 음파력, 중력, 광학력, 전기력 등을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 기계력에 의해 수행되는 세포 용해는 본 명세서에서 "기계적 용해"로 지칭된다. 기계적 용해에 따라 사용될 수 있는 기계력은 고전단 유체력을 포함할 수 있다.

일부 양상에서, 용해 없이 AAV 입자를 채취하는 방법은 효율적이고 확장 가능한 AAV 입자 생산을 위해 사용될 수 있다. 비제한적 예에서, AAV 입자는 미국 특허 출원 제20090275107호에 기재된 바와 같이 헤파린 결합 부위를 결여하는 AAV 입자를 배양시킴으로써, 세포 배양물 중에서 AAV 입자가 상청액으로 통과하게 하고, 상청액을 배양물로부터 수집하고; 상청액으로부터 AAV 입자를 단리시킴으로써 생산될 수 있다.

AAV 정제

바이러스 입자를 포함하는 세포 용해물을 정화할 수 있다. 정화는 세포 용해물로부터의 바이러스 입자의 정제에서 취해지는 초기 단계를 지칭한다. 정화는 더 거대한, 불용성 파편을 제거함으로써 추가 정제를 위한 용해물을 제조하는 작용을 한다. 정화 단계는 원심분리 및 여과를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.

일부 양상에서, AAV 입자는 하나 이상의 크로마토그래피 방법에 의해 정화된 세포 용해물로부터 정제될 수 있다. 크로마토그래피는 혼합물로부터 하나 이상의 구성요소를 분리하기 위한 당업계에 알려진 다수의 방법을 지칭한다. 이러한 방법은 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피), 면역친화도 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.

위에 인용된 모든 참고문헌뿐만 아니라 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 이들의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.

다음의 실시예는 예로서 제공되며, 제한하려는 것이 아니다.

실시예

본 개시내용은 특정한 이의 양상을 참조로 하여 기재되었지만, 본 개시내용의 진정한 정신 및 범주로부터 벗어나는 일 없이 다양한 변화가 이루어질 수 있고 동등물이 대체될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 또한, 특정 상황, 물질, 물질의 조성, 공정, 공정 단계 또는 단계들을 본 개시내용의 목적, 사상 및 범주에 적합하게 하기 위한 다수의 변형이 이루어질 수 있다. 모든 이러한 변형은 본 개시내용의 범주 내인 것으로 의도된다.

실시예 1

파브리병이 있는 성인에서의 AAV-001의 임상 평가

파브리병이 있는 대상체에서 AAV-001, rAAV2/6 인간 α-Gal A 유전자 요법의 안전성 및 내약성을 평가하기 위한 1/2상, 다기관, 개방-표지, 단일 용량, 용량-범위 연구에서 AAV-001을 평가한다. 연구 결과를 도 2에 제시한다.

연구의 1차적 목적은 AAV-001의 안전성 및 내약성을 평가하는 것이다. 연구의 2차적 목적은 시간에 따른 α-Gal A의 약력학 및 혈장 중 이의 기질의 존재; ERT 상에서 대상체에 필요한 ERT 투여에 대한 AAV-001의 영향을 평가하는 것; 신장 및 심장 기증에 대한 AAV-001의 영향을 평가하는 것; 파브리병에 대한 AAV-001의 임상 영향(삶의 질(QoL) 포함)을 평가하는 것 및 시간에 따른 rAAV2/6 벡터 DNA 쉐딩(shedding)을 평가하는 것이다. 연구의 추가 목적은 시간에 따른 α-Gal A의 약력학 및 소변 및 조직에서의 이의 존재를 평가하는 것; 시간에 따른 α-Gal A의 약물동태학을 평가하는 것; 및 rAAV2/6 및 α-Gal A에 대한 면역 반응을 평가하는 것이다.

연구 평가

평가는 치료 후 발생된 이상사례(treatment-emergent adverse event: TEAE)의 사건, 일상적 혈액학, 화학 및 간 기능, 활력 징후, ECO 및 ECHO, 일련의 알파 태아단백질(AFP) 시험 및 임의의 간 덩어리의 형성을 모니터링하기 위한 간의 MRI(또는 동등한 영상화)를 포함한다. 추가적으로, 기준선으로부터의 변화는 다음에서 1년에 걸쳐 특정 시점에 측정될 수 있다: 혈장 중 α-Gal A 활성; 혈장 중 Gb3 수준; 혈장 중 Lyso-Gb3 수준; FABRAZYME^®(또는 동등한 ERT) 주입의 빈도; 혈액 중 크레아티딘 수준에 의해 계산된 추정 사구체여과율(eGFR); 심장 자기 공명 영상화(MRI)에 의해 측정된 좌심실 질량, 소변 중 총 단백질 및 알부민 대 크레아티닌 비; 조직에서 측정된 α-Gal A 및 Gb3 수준; 조직 및 소변에서 측정된 기질 수준; 소변 중 신장 기능의 바이오마커; 통증평가설문(Brief Pain Inventory: BPI)에 의해 측정된 신경병성 통증, 통증 의약 사용 빈도; GI 증상 등급 척도에 의해 측정된 위장(GI) 증상; 마인츠 중증도 점수 지표(Mainz Severity Score Index: MSSI); SF-36 설문지에 의해 측정된 삶의 질(QOL) 환자-보고 결과; rAAV2/6 및 α-Gal A에 대한 면역 반응; 및 rAAV 벡터 제거율을 혈액, 혈장, 타액, 소변, 대변 및 정액 중의 벡터 게놈 수준에 의해 측정할 수 있다.

표적 대상체 집단 및 적격 기준

고전적 파브리병이 있는 18세 이상의 남성 및 여성 대상체. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 대상체는 효소 대체 요법(ERT) 요법 중; 또는 ERT-미경험; 또는 ERT-유사-미경험일 수 있고, 6개월 전에 ERT 치료를 받은 적이 없다.

대상체 포함 기준은 하기를 포함한다: (1) 혈장 또는 백혈구 중 하나 및 고전적 파브리병의 다음의 증상 중 하나 이상에서 5% 미만의 α-Gal A 활성으로 정의되는 바와 같이 고전적 파브리병의 문서화된 진단을 받은 대상체: i) 나이테 각막, ii) 말단감각이상, iii) 무한증, iv) 혈관각화종(군집성 제주위 혈관각화종이 문서화된 경우, 이는 고전적 파브리병의 병리학적 징후이므로 이 증상만으로 충분함); (2) ERT 중인 대상체(14일[±1일] 요법); 또는 -Gal A 활성이 5% 초과인 ERT 중이거나; ERT-미경험이거나; ERT-유사 미경험이고 동의 전 과거 6개월에 ERT 치료를 받은 적이 없는 대상체; (3) ERT를 받고 있는 중인 대상체의 경우, ERT는 안정적 용량(동의 전 6개월 동안 ERT의 3 용량 이상 ERT를 놓치지 않은 것으로 정의됨) 및 요법(등록 전 적어도 3개월 동안 14일[±1일])으로 투여되어야 함; (4) 고전적 파브리병을 나타내는 돌연변이를 갖는 대상체(즉, 데이터베이스, 예컨대, 국제 파브리병 유전자형-표현형 데이터베이스(dbFGP)와 같은 데이터베이스에 열거됨); (5) 최저점에서의 α-Gal A 활성이 분석의 정상 범위의 하한 미만인 대상체; (6) 약 18세 초과의 대상체; (7) 성적으로 성숙한 대상체는 발현 작제물 투여 시부터 연구 치료제의 투여 후 최소 3회 연속 정액 샘플이 AAV 음성이 될 때까지 그리고 연구 치료제 투여 후 최소 90일 동안 콘돔 사용에 동의하고 정자 기증을 삼가야 함; 및 (8) 대상체가 서명한, 서면 동의서.

문서화된 진단적 α-Gal A 활성 수준을 갖지 않는 대상체의 경우, 혈액 샘플은 (혈장 및/또는 백혈구에서) α-Gal A 활성 수준을 측정하기 위해 채취된다. ERT 중인 해당 대상체의 경우, 이런 채혈은 이들의 마지막 ERT 주입(최저점) 후 적어도 13일에 취해진다. i. α-Gal A 활성의 대상체 수준이 5% 초과이고 대상체가 ERT 중인 경우, 효소 활성의 이런 수준은 마지막 ERT 주입으로부터의 잔여 α-Gal A 활성으로 인한 것일 수 있다. 이 경우에, 고전적 파브리병의 진단은 다음의 3개 기준이 충족되는 경우에 확인된다:

a. 고전적 파브리병의 다음의 문서화된 증상 특징 중 둘 이상: 나이테 각막, 말단감각이상, 무한증, 혈관각화종. 군집성 제주위 혈관각화종이 문서화된 경우, 이는 고전적 파브리병의 병리학적 징후이므로 이 증상만으로 충분함;

b. 고전적 파브리병을 나타내는 돌연변이(즉, www.dbfgp.org와 같은 데이터염기에 열거됨); 및

c. 최저점에서의 α-Gal A 활성이 분석의 정상 범위의 하한 미만임.

대상체가 α-Gal A 유전자에서 돌연변이를 갖는다는 것을 확인하기 위해 선별 시 파브리병 유전자 서열분석을 수행한다. 혈액 또는 타액 샘플에 대해 분석을 수행한다. 이용 가능하다면, 연구 전에 얻어진 유전자 서열분석 결과를 사용할 수 있다. 선별 시 HIV, HAV, HBV, HCV 및 TB에 대한 시험을 수행한다. HIV의 진단 또는 활성 HAV, HBV, HCV 또는 TB 감염의 증거를 갖는 대상체는 본 연구에 참가하는 데 적격이 아닐 수도 있다.

AAV6에 대한 대상체의 이미 존재하는 면역 반응을 평가하기 위해 선별 시 AAV6에 대한 중화 항체의 수준을 측정한다. AAV6에 대해 상승된 이미 존재하는 중화 항체를 갖는 대상체는 본 연구에 참가하는 데 적격이 아닐 수도 있다. 투약이 선별의 3개월 이내에 완료되지 않는다면, AAV6에 대한 혈청 중화 분석을 반복한다.

이용 가능한 경우, 연구 전에 얻어진 혈장 또는 백혈구에서의 진단 α-Gal A 활성 수준 결과를 사용한다. 문서화된 진단적 α-Gal A 활성 수준을 갖지 않는 대상체의 경우, 혈액 샘플은 (혈장 및/또는 백혈구에서) α-Gal A 활성 수준을 측정하기 위해 채취된다. ERT 중인 해당 대상체의 경우, 이런 채혈은 이들의 마지막 ERT 주입 후 적어도 13일에 취해진다.

흉부 X-선(흉부의 PA 방사선사진으로도 알려짐)을 얻어서 대상체의 일반적 건강상태 및 연구 적격을 평가할 수 있다. 의학적으로 표시되지 않는 한, 연구 등록의 6개월 이내에 촬영한 흉부 X-선을 사용하여 대상체 적격을 결정한다. 각 대상체에 대한 신체검사를 수행하고, 최소한 일반적 외모, 두부, 눈, 귀, 코 및 목(HEENT)뿐만 아니라 심혈관, 피부과학, 호흡, GI, 근골격 및 신경계를 포함한다.

대상체 제외 기준은 다음의 대상체를 포함할 수 있다: (1) 현장 조사원 및 의료 모니터의 의견에서 ERT에 비반응성인 것으로 알려짐(예를 들어, ERT에 대한 문서화된 기질 수준 감소 없음); (2) 사전 동의서 3개월 이내에 미갈라스타트(Galafold™)를 이용하는 현재의 치료 또는 사전 치료를 받고 있음, (3) AAV(예를 들어, AAV6)에 대한 양성 중화항체 반응을 가짐, (4) 현장 조사자 또는 의료 모니터의 의견으로 연구 관찰 기간 동안 안전성 또는 효능의 평가를 손상시킬 것으로 예상되는 병발 질병이 있음; (5) 60 ㎖/분/1.73㎡ 미만의 eGFR을 가짐; (6) 뉴욕 심장 협회 PI 등급 이상을 가짐; (7) 정량적 중합효소 드레인 반응(qPCR) 또는 결핵(TB)에 의한 활성 감염에 의해 측정할 때 A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV)(음성 HCV - DNA), 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 의한 활성 감염이 있음; (8) 사전동의서의 6개월 이내의 간 질환, 예컨대, 2차 지방증, 비알코올성 지방간염(NASH) 및 간경변, 담관염, 담적병; 길버트 증후군을 제외; 비정상적 순환 AFP의 병력이 있음; (9) ERT를 받는 대상체의 경우, 현장 조사자 및 의료 모니터의 의견에 따르면 ERT에 대한 상당한 주입 반응에 의해 나타나는 것과 같이 동의 전 6개월 이내에 ERT 치료에 대한 최근 또는 지속적인 과민 반응이 있음; (10); 간 염증의 마커 또는 다음 중 하나 이상에 의해 확인되는 바와 같은 간 기능장애의 명백한 또는 숨겨진 원인: (i) 3.5g/㎗ 미만의 알부민; (ii) 정상상한(ULN) 초과의 총 빌리루빈 및 0.5㎎/㎗ 초과의 직접 빌리루빈;(iii) 2.0×ULN 초과의 알칼리성 포스파타제(ALP); (iv) 1.5×ULN 초과의 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT); (11) 지난 6개월 동안 전신(IV 또는 경구) 면역조절제 또는 스테로이드 사용의 현재 또는 병력이 있음(국소 치료가 허용됨, 예를 들어, 천식 또는 습진)(간헐적 전신 스테로이드의 사용은 의료 모니터와 논의 후에 허용될 수 있음); (12) 면역억제를 위해 코르티코스테로이드를 사용하는 것이 금기임; (13) 비흑색종 피부암을 제외하고 악성종양의 병력이 있음, (14) 알코올 또는 약물 남용의 병력이 있음; (15) 동의 전 지난 3개월 이내에 이전의 조사 중재 약물 또는 의료 기기 연구에 참여함(RalLRoAD 시험에서와 같이 이식 가능한 루프 레코더는 제외함); (16) 유전자 요법 산물로 사전 치료를 받음; (17) AAV-001 제형의 구성성분에 대한 알려진 과민증; (18) 현장 조사자 또는 의료 모니터의 의견으로 대상체가 연구 참여에 부적합하다고 판단하는 기타 모든 이유.

기준선 기간

기준선 평가 및 절차를 AAV-001 주입 전 12주 이내에 수행한다. ERT를 받는 대상체에서, α-Gal A 수준, 및 Gb3 및 lyso-Gb3을 포함하는 평가를 이전의 ERT 투여 후 14일(±1일)로 정의되는 ERT 최저점 수준에서 취할 것이다. 2개의 샘플을 2일의 다른 날 오전에 기준선에서 채취할 것이다. ERT를 받지 않는 대상체의 경우, 2회 사이에 14일(±1일)을 두고 2회에 걸쳐 기준선에서 2개의 샘플을 취할 것이다.

병용약물

잠재적으로 간독성인 의약을 제외하고, 모든 의약이 허용될 수 있다. 디클로페낙, 아미오다론, 클로이프로마진, 플루코나졸, 이소니아지드, 리팜핀, 발프로산, 고용량의 아세트아미노펜(4 내지 8gm/일) 등과 같은 간독성제뿐만 아니라 간독성 허브 보충제, 예컨대, 세네치오(senecio)/활나물(crotal aria), 게르만더 차, 수풀, 삼칠초, 마황(한약) 등은 연구 기간 동안 섭취되어서는 안 된다. ERT를 받고 있는 중인 대상체의 경우, ERT는 안정적 용량(동의 전 과거 6개월 동안 ERT의 3 용량 이상 ERT를 놓치지 않은 것으로 정의됨) 및 요법(등록 전 적어도 3개월 동안 14일±1일)으로 투여되어야 함. 대상체는 ERT를 중단하지 않는 한 치료 표준에 따라 연구 동안 안정한 용량 및 요법(14일±1일)으로 ERT를 계속 받아야 한다.

용량 코호트

허용 가능하고 안전한 것으로 간주되는 용량은 용량 확장 코호트에서 이용될 것이다. 용량 증량이 완료된 후, 용량 확장이 시작되어 최대 6명의 대상체가 각 용량 확장 코호트에 등록될 것이고, 여기에는 α-Gal A에 대해 항체-양성은 고전적 파브리병이 있는 환자, α-Gal A에 대해 항체 음성인 고전적 파브리병이 있는 환자, 여성 환자(여성 코호트) 및 신장(신장 코호트) 및 심장(심장 코호트) 포함 및 제외 기준에 대한 기준을 충족시키는 환자가 포함된다. 새로운 안전성 고려사항이 있는 경우에 확장 코호트에 대한 용량을 재평가할 수 있다.

항 α-Gal A Ab 양성 코호트: α-Gal A에 항체 양성인 고전적 파브리병이 있는 최대 6명의 남성 대상체를 등록할 것이다.

항 α-Gal A Ab 음성 코호트: α-Gal A에 항체 음성인 고전적 파브리병이 있는 최대 6명의 남성 대상체를 등록할 것이다.

여성 코호트: 고전적 파브리병이 있는 최대 6명의 여성 대상체를 등록할 것이다.

신장 코호트: 2㎖/분/1.73㎡/년 이상의 선형 음성 eGFR 기울기(적어도 3개의 과거 혈청 크레아티닌 값[선별 방문 동안 얻어진 값을 포함하여 18개월 이내]으로부터 추정)를 갖는 증상이 있는 파브리병이 있는 최대 6명의 남성 또는 여성 대상체를 등록할 것이다.

심장 코호트: 2D 변형 심장초음파검사에서 전반적인 세로 변형 감소 또는 CMR에서 낮은 천연 T1 맵핑과 같은 질환 진행을 나타내는 LVH 또는 심장 변화에 대한 다른 설명 없이 2D 심장 초음파에서 좌심실 비대(LVH) 또는 CMR(확장기 중격 및 후벽 두께≥12㎜)로 정의된 심장이 관련된 증상이 있는 파브리병이 있는 최대 6명의 남성 또는 여성 대상체를 등록할 것이다.

선별 전 6개월의 기간에 심혈관 사건을 갖는 대상체를 조사자의 재량으로 제외할 수 있다.

개시 용량은 5.0E+12 vg/㎏이고, 다음 용량 수준까지의 임의의 용량 증량은 이전 코호트 및/또는 생체내 rAAV2/6-기반 요법을 사용하는 다른 임상 시험으로부터의 데이터 검토에 따르고, 적절한 경우 외부 주제 전문가, 연구 의료 모니터 및 현장 조사관을 포함하는 안전성 모니터링 위원회(SMC)의 권고에 기반한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, SMC 구성원은 적절한 의학 및 과학 기술을 갖고, 연구의 안전 감독을 제공할 것이다. 또한, 투약한 대상체의 관찰된 효소 활성 수준 및 안전성 프로파일에 따라서, SMC는 (코호트 3에서의 용량에 대한 5배 증가 대신) 코호트 3에서 3.0E+13 vg/㎏의 중간 용량 수준까지의 용량 증량(코호트 2의 용량으로부터 3배 증가)을 권장할 수 있다. 프로토콜은 또한 5.0E+13 vg/㎏의 추가 용량 수준이 코호트 4에 추가 용량으로 포함될 수 있도록 허용한다. 그러나, 대상체에게 주어진 용량은 실질적인 수정 없이 5.0E+13을 초과하지 않을 것이다. 용량 코호트를 표 2에 나타낸다. (또한 도 3 참조)

치료 계획

모든 포함/제외 기준을 충족시키는 18세 초과의 대상체를 등록한다. SMC 검토 후 4명의 대상체가 추가된 최대 총 18명의 대상체에 대해 임의의 코호트가 확장될 가능성이 있는 용량 코호트의 각각에 적어도 2명의 대상체를 배정하였다. 발현 벡터를 정맥내 주입을 통해 투여한다. 각 코호트 내에서, 이전 대상체에게 투약된 후 적어도 약 2주가 될 때까지 후속 대상체에게 주입될 수 없도록 치료는 시차를 둔다. 다음 용량 수준까지의 용량 증량은 이전 코호트의 마지막 대상체에게 투약된 후 적어도 약 4주까지 일어날 수 없으며, 전체 사전 코호트로부터의 안전성 데이터는 SMC에 의해 검토되었다.

연구 등록 전에 ERT를 받은 대상체는 연구 동안 ERT를 계속 받아야 하며, ERT를 중단하지 않는 한 표준 치료당 이들의 현재 용량 및 요법(14일±1일)을 유지해야 한다. ERT에 대한 대상체의 경우, 이전 ERT 주입 후 14일(+/-1일)로 정의되는 오전에 최저점에서 2회의 별도로 샘플을 취할 수 있도록, 효소 및 기질 수준의 기준 시험이 조정된다. 선별 기간 동안 사전에 추가 시점을 취하고, 따라서, 유전자 요법 투여 전에 최저점에서 α-Gal A의 잔여 수준을 평가하기 위한 3개의 시점을 갖는다. 이러한 3가지 샘플은 효소 수준에 잠재적으로 영향을 미치는 비특이적 요인을 최소화하기 위해 최저점에서, 바람직하게는 하루 중 동시에(예를 들어, 아침에) 채취된다.

rAAV 캡시드 단백질에 대한 잠재적인 면역 반응을 최소화하기 위해, 간 손상의 경우 이식유전자 발현 상실을 피하고 간 기능을 보존하기 위해, 프레드니손 또는 등가 코르티코스테로이드를 발현 벡터 주입의 약 2일 전부터 시작해서 예방적으로 투여할 수 있고, 최대 약 20주의 기간에 걸쳐 점감할 수 있다.

주사기 펌프 또는 IV 주입 펌프를 사용하여 발현 벡터를 주사할 수 있다(Study Pharmacy Manual 참조). 총 용적은 기준선에서의 대상체의 코호트 배정 및 체중(㎏)에 따라 달라진다. 대상체가 병원 또는 급성 치료 시설에 있는 동안 발현 벡터는 대상체의 활력 징후(온도, 심박수, 호흡수 및 혈압)를 모니터링하면서 제어된 속도로 IV 카테터를 통해 투여될 수 있고, 대상체는 발현 벡터 주입의 완료 후 적어도 24시간 동안 관찰을 위해 남아있을 수 있다. 대상체는 모든 활력 징후가 안정적이고 임의의 부작용(AE)이 해결되거나 연구자의 판단에 따라 대상체가 안정된 것으로 간주될 때 퇴원할 수 있다.

도 4A는 컷오프 날짜를 기준으로 처음 2 용량 코호트(0.5e13 vg/kg 및 1e13 vg/kg)에서 4명의 환자로부터 평가된 안전성 데이터를 나타낸다. 스테로이드 치료가 필요한 간 효소 상승은 없었다. 연구 중단, 입원 또는 사망으로 이어지는 부작용(AE)은 없었다.

도 4B는 컷오프 날짜까지 용량 코호트 1 내지 3(0.5e13 vg/㎏, 1.0e13 vg/㎏ 및 3.0e13 vg/㎏)에서 5명의 환자로부터 평가된 안전성 데이터를 나타낸다. 스테로이드 치료가 필요한 간 효소 상승은 없었다. 연구 중단, 입원 또는 사망으로 이어지는 부작용(AE)은 없었다.

도 4C는 컷오프 날짜까지 용량 코호트 1 내지 4(0.5e13 vg/㎏, 1.0e13 vg/㎏, 3.0e13 vg/㎏ 및 5.0e 13 vg/㎏)에서 5명의 환자로부터 평가된 안전성 데이터를 나타낸다. 스테로이드 치료가 필요한 간 효소 상승은 없었다. 연구 중단, 입원 또는 사망으로 이어지는 부작용(AE)은 없었다.

AAV-001로 주입 후에, 8일차; 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48 및 52주차에 연구 방문을 수행할 수 있다. 28, 32, 40, 44 및 48주차 연구 방문은 임상 현장에서의 평가가 필요하지 않은 평가가 있으며, 따라서 원격으로 수행할 수 있다. AE 및 병용약물에 대한 평가는 전화를 통해 원격으로 수행할 수 있다.

대상체에 프레드니손 또는 동등한 코르티코스테로이드를 사용하는 동안 발현 벡터 주입 후 대략 처음 20주 동안 매주 2회 간 검사(AST, ALT, GOT, 전체 및 직접 빌리루빈, ALP, LDH, 알부민, 및 총 단백질 수준)는 AAV-매개 면역원성을 모니터링하기 위해 수행하며 원격으로 수행할 수 있다. 간 검사를 위한 혈액 샘플을 가능하면 2 내지 4일 간격으로 채혈하며, 단, 첫 주에는 2일차 및 제8일차 방문 시 채혈할 수 있다. 후속적으로 면역억제의 중단 후 4주 동안(21 내지 24주차) 매주 간 검사를 수행할 수 있고, 이어서, 연구 방문(28 내지 52주)에 맞춰 매달 실시할 수 있다.

프레드니손 또는 동등한 코르티코스테로이드로 전처리했음에도 불구하고, ALT 상승 증거가 있는 경우, 프레드니손 또는 동등한 코르티코스테로이드의 용량은 계속될 수 있고(프레드니손 1㎎/㎏ [max 60㎎] 또는 등가물; 경구 또는 정맥내 및/또는 사례별 기준으로 증가됨), 간 효소는 간 효소의 정상화까지 1주 2회 평가할 수 있고, 이어서, 이후에 프로토콜에 따라 평가할 수 있다.

용량 증량

각 코호트에서 처음 2명의 대상체의 경우, 이전의 대상체를 적어도 2동안 관찰할 때까지 각 후속 대상체에게 주입하지 않도록. 치료는 시차를 둔다. 다음 용량 수준까지의 용량 증량은 이전 코호트의 2명의 대상체에게 투약된 후 적어도 4주까지 일어날 수 없으며, 사전 코호트에서 2명의 대상체로부터의 안전성 데이터는 SMC에 의해 검토되었다. 중단 규칙 중에 어느 것이 충족되면 투약 및 용량 증량은 중단될 수 있다.

ERT 철회

AAV-001에 의한 치료는 인간 α-Gal A에 대한 cDNA를 암호화하는 rAAV 벡터를 이용함으로써 ERT에 대한 필요를 제거하여, 파브리병 대상체에서 a-Gal A의 장기간, 간-특이적 발현을 초래할 수 있었다. ERT를 철회하는 대상체는 임의의 AE, 활력 징후, 기준선과 비교할 때 안전성 실험실 및 a-Gal A 및 기질 수준의 임의의 변화에 대해 면밀히 모니터링한다. ERT 철회는 표적 간 세포의 형질도입 동안 충분한 시간을 가능하게 하기 위해 4주의 기간 후에 고려되어야 한다. ERT 중단을 받은 대상체는 피로, 및 신경병성 통증, 임의의 AE, 활력 징후, 기준선과 비교할 때 간 기능 검사 및 α-Gal A 및 기질(Gb3 및 Lyso-Gb3) 수준을 포함하는 안전성 실험실 평가의 임의의 변화를 포함하는 임의의 임상 증상에 대해 면밀히 모니터링한다. ERT 철회는 후원사와 협의한 후에 현장 조사자의 재량에 따를 수 있으며, 다음 기준을 충족시킬 의향이 있는 대상체에 대해 고려된다:

(1) AAV-001의 투여 후 4주 초과임;

(2) 의학적으로 안정하고 현장 조사자의 판단으로 ERT의 일시적 중단을 용인할 수 있음,

(3) ERT 철회 추적검사 방문까지 안전성 모니터링을 강화하고 추가 실험실 검사를 수행하는 데 동의함;

(4) ERT는 ERT 철회 추적검사 방문 후에 재시작할 필요가 없음.

그러나, ERT는 임상 상황이나 현장 조사자의 판단으로 언제든지 재개할 수 있다.

이전에 성공적이지 않았다면, 대상체가 원할 경우 이전의 시도 후 적어도 12주 후에 ERT 철회를 반복할 수 있고, 현장 조사자의 재량으로 그리고 후원사와 협의한 후에 철회될 수 있다.

ERT 철회 모니터링(±2일)

ERT 철회 모니터링 방문은 ERT 철회 방문 후 처음 4주 동안 매주 실시하며, 이어서, ERT 철회 추적검사 방문까지 ERT 철회 후 마지막 8주 동안 격주로 실시한다. ERT 철회 모니터링 방문은 연구 부담을 줄이기 위해 가능할 때마다 정기적인 예정된 방문과 조합되어야 한다. ERT 철회 모니터링 방문은 원격으로 수행할 수 있다.

ERT 철회 추적검사(ERT 철회 후 최대 12주)

ERT 철회 추적검사 방문은 ERT 철회 방문 후 12주차에 일어날 것이지만, 임상적으로 표시되는 경우 현장 조사자의 재량으로 더 빨리 일어날 수 있다. 임상적으로 표시된다면, ERT는 임상 상황이나 현장 조사자의 판단으로 언제든지 재개할 수 있다.

연구 종료 방문 및 장기간 추적검사 연구

최종 평가를 위해 52주차에 연구 종료(EOS) 방문을 수행할 것이다. EOS 방문 시, 대상체는 별도의 장기간 추적검사 연구에 참여하도록 권장될 것이고, 대상체는 최대 추가 4년 동안 추적할 것이다.

연구 지속기간

연구 참여 지속기간은 각 대상체에 대해 최대 76주일 수 있으며, 이는 선별의 경우 최대 8주, 기준선의 경우 최대 12주 및 투약 후 52주차의 추적검사로 나누어진다. 누적(accrual)은 9 내지 12개월 동안 계획된다.

안전성 모니터링 위원회 및 중단 규칙

다음 기준 중 어느 것이 충족되면 연구 등록을 중단해야 하고, SMC를 소집하여 적절한 조치 과정에 대한 권장사항을 제시할 수 있다: (1) 발현 벡터 제형과 적어도 인과관계의 합리적인 가능성이 있는 임의의 하나의 3등급 이상의 유해사례; (2) 발현 벡터 제형과 적어도 인과관계의 합리적인 가능성이 있는 심각한 부작용(SAE); (3) 인간 대상체의 사망; (4) 악성 종양의 발생.

연구는 또한 다음의 이유 중 어느 것의 경우 중단될 수 있다: (1) 후원사는 SMC 또는 규제 기관과 협의하여, 어떤 이유로든 연구를 계속함으로써 대상체 안전성이 손상될 수 있다고 결정하고; (2) 후원사는 AAV-001의 개발을 중단하기로 결정한다.

모든 데이터를 평가하여 연구에 변경사항을 적용해야 하는지의 여부 또는 누적을 계속해야 하는지 중단해야 하는지를 결정할 것이다. 중단 기준이 충족된다면, 검토를 위해 규제 당국에 상당한 수정안이 제출되고 수정안이 기관 임상시험심사위원회(IRB)/독립윤리위원회(IEC) 또는 동등한 기관에 의해 승인될 때까지 대상체에 대한 추가 투약은 해당 용량 수준 이상에서 수행되지 않을 것이다.

실시예 2

혈장 α-Gal A 활성 및 Lyso-Gb3

파브리병 혈장 α-Gal A 활성 및 lyso-Gb3에 의한 성인의 AAV-001 치료 효과를 시험하는 것을 4개의 용량 코호트(코호트 1(n=2; 환자 1 및 2); 0.5e13 vg/㎏ 및 코호트 2(n=2; 환자 3 및 4); 1e13 vg/㎏, 코호트 3(n=3; 환자 5, 6 및 7); 3.0e13 vg/㎏ 및 코호트 4(n=2; 환자 8 및 9); 5.0e13 vg/㎏)에 걸쳐 9명의 환자(환자 1, 환자 2, 환자 3, 환자 4, 환자 5, 환자 6, 환자 7, 환자 8 및 환자 9)로부터 평가하였다. 환자 1 내지 9에 대한 기준선 특징을 도 3에 나타낸다.

혈장 α-Gal A 활성

다음에 나타내는 바와 같이 37℃에서 인공 기질인 4-메틸움벨리페릴 α-D 갈락토피라노사이드(4-MU-α-Gal)의 절단으로부터 생기는 4-메틸움벨리페론(4-MU) 생성물을 측정함으로써 K₂-EDTA 혈장 중 α-Gal A 활성을 결정하였다:

4-MU-α-Gal(기질, 비-형광) + α-Gal A →4-MU(형광)

활성은 3시간 반응 시간에 생성된 4-MU(n㏖/㎖)의 양으로 표시하였고, n㏖/hr/㎖로 제시하였다.

α-Gal A 혈장 활성 및 배수 변화에 대한 정상 남성 범위

α-Gal A에 대한 정상 남성 범위는 3시간 인큐베이션 시간에 검증된 혈장 α-Gal A 활성 분석을 이용하여 40명의 건강한 남성 공여자로부터 결정하였고, n㏖/hr/㎖로 제시하였다. 남성 정상 범위: 2.45 내지 11.37n㏖/h/㎖, 평균 5.70 n㏖/h/㎖. 평균에 대한 배수 변화는 5.70n㏖/h/㎖에서 결정된 평균 정상 범위를 참조하여 계산하였다.

lyso-Gb3에 대한 정상 남성 범위:

K₂-EDTA 혈장 중 lyso-Gb3에 대한 정상 남성 범위는 내부 표준으로서 검증된 LC-MS/MS 및 lyso-Gb3-d7을 사용하여 40명의 건강한 남성 공여자로부터 결정하였다. 상기 방법은 LC-MS/MS 분석 전에 단백질 침전 추출 절차를 이용하였다. 남성 정상 범위: 0.323 내지 0.625 ng/㎖, 0.473 ng/㎖의 평균 농도.

도 5C는 데이터 컷오프에 의해 이용 가능한 데이터가 있는 모든 대상체가 정상 수준 초과의 α-Gal 활성을 나타낸다는 것을 보여준다.

컷오프 날짜 현재 4 용량 코호트(0.5e13 vg/㎏, 1.0e13 vg/㎏, 3.0e13 vg/㎏ 및 5.0e13 vg/㎏)에 걸쳐 8명의 대상체로부터 바이오마커 결과를 평가하였다. 마지막 측정 시점에 배수 변화를 계산하였다. 3시간 반응 시간을 사용해서 α-Gal A 활성을 측정하였고, n㏖/hr/㎖로 제시하였다. 환자 1, 4, 5, 6 및 7의 경우, 이를 ERT 최저점에서 샘플링하였다. 건강한 남성 개체에 기반하여 정상 범위 및 평가를 결정하였다. 도 5C는 대상체 1 내지 8(치료한 처음 2명의 대상체에 대해 최대 18개월)에 대해 데이터 컷오프를 통해 상승된 α-Gal A 활성이 관찰되었다는 것을 나타낸다. α-Gal A 활성은 대상체 7 및 8에 대해 2주차에 정상 내이다. 대상체 1 및 4는 ERT로부터 제외하였다.

평균 정상보다 최대 21배 높은 활성 수준이 관찰되었다.

도 6A는 환자 1이 연구 종료까지 1년 동안 지속된 α-Gal 활성의 정상 수준 초과를 나타냈다는 것을 보여준다. Lyso-Gb3은 연구 종료까지 기준선의 10% 이내에 남아있었다. 도 6B는 환자 1이 48주 동안 지속된 α-Gal 활성의 정상 수준 초과를 나타냈다는 것을 보여준다. 도 6C는 환자 1이 18주 동안 지속된 α-Gal 활성의 정상 수준 초과를 나타냈다는 것을 보여준다. 좌심실 비대(드롭 동심원(drop concentric))는 런인(run-in)에서 증가되었고, MRI 상에서 치료 1년 후에 안정화되었다. 혈장 lyso-Gb3의 낮은 기준선 수준은 시간에 따라 안정적으로 유지되었다. 환자 1은 다리 부종과 땀을 흘릴 수 있는 능력의 개선을 보고하였다. 환자 1은 장기간 추적검사(추가 4년 동안 3개월마다 추적검사)로 넘어갔다.

도 6D는 환자 2가 48주 내내 지속된 α-Gal 활성의 정상 수준 초과를 나타냈다는 것을 보여준다. 도 6E는 환자 2가 1년 동안 지속된 α-Gal 활성의 정상 수준 초과를 나타냈다는 것을 보여준다. 도 6F는 환자 2가 18주 동안 지속된 α-Gal 활성의 정상 수준 이상을 나타냈다는 것을 보여준다. 환자의 기준선 경증의 두심실 확장(biventricular dilation)은 MRI에 의하면 1년 후에 개선되었다. 혈장 lyso-Gb3의 낮은 기준선 수준은 시간에 따라 안정적으로 유지되었다. 환자 2는 땀을 흘리는 능력의 개선을 보고하였다. 환자 2는 장기간 추적검사(추가 4년 동안 3개월마다 추적검사)로 넘어갔다.

도 6G는 환자 3이 28주차에 마지막으로 측정된 시점까지 지속된 α-Gal 활성의 정상 수준 초과를 나타냈다는 것을 보여준다. 환자 2는 또한 기준선에서 28주까지의 lyso-Gb3의 대략 40% 감소를 나타냈다. AAV-001 투여 후 12주 동안 lyso-Gb3 감소가 관찰되었다. 도 6H는 환자 3이 40주차에 마지막으로 측정된 시점까지 지속된 α-Gal 활성의 정상 수준 초과를 나타냈다는 것을 보여준다. 도 6I는 환자 3이 52주차에 마지막으로 측정된 시점까지 지속된 α-Gal 활성의 정상 수준 초과를 나타냈다는 것을 보여준다. 환자의 심장 MRI는 기준선과 24주차에 정상이다. 기준선에서 환자의 혈장 lyso-Gb3 수준을 평가하였다. 환자 3은 투약 후 10주 이내에 기준선으로부터 혈장 lyso-Gb3의 대략 40% 감소를 나타냈고, 이는 52주 내내 유지되었다. 환자 3은 땀을 흘리는 능력의 개선을 보고하였다.

도 6J는 환자 4가 12주 내내 지속된 α-Gal 활성의 정상 수준 초과를 나타냈다는 것을 보여준다. 도 6K는 환자 4가 25주 내내 지속된 α-Gal 활성의 정상 수준 초과를 나타냈다는 것을 보여준다. 도 6L은 환자 4가 40주 내내 지속된 α-Gal 활성의 정상 수준 초과를 나타냈다는 것을 보여준다. 환자 4는 기준선에서 경증의 LVH가 존재하였다. 환자 4는 (2주 투약 빈도에 기반하여) 24주차에 ERT에서 제외하였다.

도 6M은 환자 5가 24주 내내 지속된 α-Gal 활성의 정상 수준 초과를 나타냈다는 것을 보여준다. 환자 5는 기준선에서 경증의 LVH가 존재하였다. 도 6N은 환자 6이 12주 내내 지속된 α-Gal 활성의 정상 수준 초과를 나타냈다는 것을 보여준다. 환자 6은 기준선에서 경증의 LVH가 존재하였다. 도 6O는 환자 7 기준선 및 α-Gal의 투약 데이터를 나타낸다. 환자 7은 기준선에서 경증 내지 중등증의 LVH가 존재하였다. 도 6P는 환자 8 기준선 및 α-Gal의 투약 데이터를 나타낸다. 환자 8은 기준선에서 정상 심장 MRI를 보여주었다. 도 6Q는 환자 9가 이 데이터컷의 순간에 α-Gal 데이터가 없다는 것을 나타낸다. 환자 9는 기준선에서 중등증의 LVH가 존재하였다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

파브리병의 치료 또는 파브리병과 관련된 하나 이상의 증상 개선을 필요로 하는 인간 대상체에서 파브리병을 치료하고 파브리병과 관련된 하나 이상의 증상을 개선시키는 방법으로서,
α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 발현 카세트를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 발현 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 발현 카세트는 알파 1-안티트립신(hAAT) 프로모터에 작동 가능하게 연결된 아포지질단백질 E(APOE) 인핸서, 인간 헤모글로빈 베타(HBB)-IGG 인트론, 신호 펩타이드를 암호화하는 서열, 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 이식유전자 및 소 성장 호르몬 폴리 A 신호 서열을 포함하고, 상기 AAV 발현 벡터는 체중 킬로그램당 약 5×10¹² 벡터 게놈/체중 킬로그램(vg/㎏) 내지 약 5×10¹³vg/㎏의 용량으로 투여되는, 방법.
파브리병의 치료 또는 파브리병과 관련된 하나 이상의 증상 개선을 필요로 하는 인간 대상체에서 파브리병을 치료하고 파브리병과 관련된 하나 이상의 증상을 개선시키는 방법으로서,
α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 발현 카세트를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 발현 벡터를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 발현 카세트는 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 이식유전자를 포함하고, 상기 α-GalA 이식유전자는 서열번호 5에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 AAV 발현 벡터는 약 5×10¹² 벡터 게놈/체중 킬로그램(vg/㎏) 내지 약 5×10¹³vg/㎏의 용량으로 투여되는, 방법.
글리코스핑고리피드의 양 감소를 필요로 하는 인간 대상체에서 글리코스핑고리피드의 양을 감소시키는 방법으로서,
α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 발현 카세트를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 발현 벡터를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 발현 벡터는 알파 1-안티트립신(hAAT) 프로모터에 작동 가능하게 연결된 아포지질단백질 E(APOE) 인핸서, 인간 헤모글로빈 베타(HBB)-IGG 인트론, 신호 펩타이드를 암호화하는 서열, 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 이식유전자 및 소 성장 호르몬 폴리 A 신호 서열을 포함하고, 상기 AAV 발현 벡터는 5×10¹² 벡터 게놈/체중 킬로그램(vg/㎏) 내지 약 5×10¹³vg/㎏의 용량으로 투여되고, 상기 글리코스핑고리피드의 감소된 양은 상기 투여 전 상기 대상체에서의 글리코스핑고리피드의 양에 대한 것인, 방법.
글리코스핑고리피드 양의 감소를 필요로 하는 인간 대상체에서 글리코스핑고리피드의 양을 감소시키는 방법으로서,
α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 발현 카세트를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 발현 벡터를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 발현 카세트는 상기 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 이식유전자를 포함하고, 상기 α-GalA 이식유전자는 서열번호 5에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 AAV 발현 벡터는 약 5×10¹²벡터 게놈/체중 킬로그램(vg/㎏) 내지 약 5×10¹³vg/㎏의 용량으로 투여되고, 상기 글리코스핑고리피드의 감소된 양은 상기 투여 전 상기 대상체에서의 글리코스핑고리피드의 양에 대한 것인, 방법.
α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 단백질 활성의 증가를 필요로 하는 인간 대상체에서 α 갈락토시다제 A(α-Gal A)의 활성을 증가시키는 방법으로서,
α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 발현 카세트를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 발현 벡터를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 발현 카세트는 알파 1-안티트립신(hAAT) 프로모터에 작동 가능하게 연결된 아포지질단백질 E(APOE) 인핸서, 인간 헤모글로빈 베타(HBB)-IGG 인트론, 신호 펩타이드를 암호화하는 서열, 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 이식유전자 및 소 성장 호르몬 폴리 A 신호 서열을 포함하고, 상기 AAV 발현 벡터는 약 5×10¹² 벡터 게놈/체중 킬로그램(vg/㎏) 내지 약 5×10¹³ vg/㎏의 용량으로 투여되고, 상기 증가된 α-Gal A 단백질 활성은 상기 투여 전 상기 대상체에서의 α-Gal A 단백질 활성의 양에 대한 것인, 방법.
α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 단백질 활성의 증가를 필요로 하는 인간 대상체에서 α 갈락토시다제 A 단백질 활성을 증가시키는 방법으로서,
α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 발현 카세트를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 발현 벡터를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 발현 카세트는 상기 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 이식유전자를 포함하고, 상기 α-GalA 이식유전자는 서열번호 5에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 AAV 발현 벡터는 약 5×10¹² 벡터 게놈/체중 킬로그램(vg/㎏) 내지 약 5×10¹³ vg/㎏의 용량으로 투여되고, 상기 증가된 α-Gal A 단백질 활성은 상기 투여 전 상기 대상체에서의 α-Gal A 단백질 활성에 대한 것인, 방법.
제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 파브리병이 있는, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 α-Gal A 발현 카세트는 돌연변이된 우드처크 간염 바이러스(WHV) 전사후 조절 요소(WPRE) 서열을 더 포함하는, 방법.
제8항에 있어서, 상기 돌연변이된 WPRE 서열은 mut6 돌연변이된 WPRE 서열을 포함하는, 방법.
제2항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 α-Gal A 발현 카세트는 알파 1-안티트립신(hAAT) 프로모터에 작동 가능하게 연결된 아포지질단백질 E(APOE) 인핸서, 인간 헤모글로빈 베타(HBB)-IGG 인트론, 신호 펩타이드를 암호화하는 서열 및 소 성장 호르몬 폴리 A 신호 서열을 더 포함하는, 방법.
제1항, 제3항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이식유전자는 야생형 α-Gal A 서열 또는 코돈-최적화된 α-Gal A 서열을 포함하는, 방법.
제1항, 제3항, 제5항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호 펩타이드는 α-GalA 신호 펩타이드인, 방법.
제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 인핸서는 서열번호 2에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 프로모터는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 인트론은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 α-GalA 이식유전자는 서열번호 5에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 돌연변이된 WPRE 서열은 서열번호 6에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 폴리 A 신호 서열은 서열번호 7에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 인핸서는 서열번호 2에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 프로모터는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 인트론은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 돌연변이된 WPRE 서열은 서열번호 6에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 폴리 A 신호 서열은 서열번호 7에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 α-Gal A 발현 카세트는 서열번호 9에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 발현 벡터 혈청형은 AAV2/6인, 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 다음의 증상: 정상 초과의 글로보트라이아오실세라마이드(Gb3) 수준, 정상 초과의 글로보트리아오실스핑고신(lyso-Gb3) 수준, 신장 질환, 심장 질환, 무한증, 말단감각이상, 혈관각화종, 위장(GI)관 통증, 각막 및 수정체혼탁 또는 뇌졸중 중 하나 이상을 갖는, 방법.
제17항에 있어서, 혈관각화종은 제주위 혈관각화종(periumbilicial angiokeratoma)인, 방법.
제5항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 약 5% 미만의 α-GalA 단백질 활성을 갖는, 방법.
제19항에 있어서, 상기 α-GalA 단백질 활성은 상기 대상체의 혈장 및/또는 백혈구에서 측정되는, 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 남성 대상체인, 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 여성 대상체인, 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 파브리병을 나타내는 α-GalA 유전자 돌연변이를 갖는, 방법.
제19항에 있어서, 상기 대상체는 효소 대체 요법(enzyme replacement therapy: ERT) 미경험 대상체인, 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는, 효소결합면역흡착 검정(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)에 의해 결정 시, 상기 투여 전에 이미 존재하는 항-α-GalA 항체를 갖는, 방법.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 상기 대상체의 생물학적 샘플이 분석될 때 항-α-GalA 중화항체 양성 대상체이되, 상기 항-α-GalA 중화항체 양성 대상체는, 항-α-GalA 중화항체 검정으로 측정 시, α-갈락토시다제 A 활성의 약 9.6% 초과의 저해를 갖는 생물학적 샘플을 갖는, 방법.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이식유전자로부터 발현된 상기 α-Gal A 단백질은 상기 대상체에서의 글리코스핑고리피드의 양을 상기 투여 전 상기 대상체에서의 글리코스핑고리피드의 양에 비해 적어도 약 2배만큼 감소시키는, 방법.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이식유전자로부터 발현된 α-Gal A 단백질은 상기 대상체에서의 상기 글리코스핑고리피드의 양을 상기 투여 전 상기 대상체에서의 상기 글리코스핑고리피드의 양에 비해 약 10퍼센트(%), 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49%, 약 50%, 약 51%, 약 52%, 약 53%, 약 54%, 약 55%, 약 56%, 약 57%, 약 58%, 약 59%, 약 60%, 약 61%, 약 62%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 68%, 약 69%, 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%만큼 감소시키는, 방법.
제1항, 제2항 및 제5항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이식유전자로부터 발현된 상기 α-Gal A 단백질은 상기 대상체에서의 상기 글리코스핑고리피드의 양을 상기 투여 전과 동일한 수준으로 유지하는, 방법.
제3항, 제4항 및 제7항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글리코스핑고리피드는 글로보트라이아오실세라마이드(Gb3), 글로보트리아오실스핑고신(lyso-Gb3), 갈라바이오실세라마이드(galabiosylceramide) 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 방법.
제30항에 있어서, Gb3 및/또는 lyso-Gb3 수준은 상기 대상체의 혈장, 조직, 및/또는 소변에서 측정된, 방법.
제1항 내지 제28항 및 제30항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이식유전자에서 발현된 α-Gal A 단백질은 혈장, 간, 심장, 신장, 소변, 피부 또는 비장 중 하나 이상에서 글리코스핑고리피드의 양을 감소시키는, 방법.
제5항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에서의 상기 α-Gal A 단백질 활성은 상기 투여 전 상기 대상체에서의 α-Gal A 단백질 활성에 비해 평균 정상 α-Gal A 단백질 활성보다 약 0배 이상 내지 약 2배 이상, 약 2배 이상 내지 약 5배 이상, 약 5배 이상 내지 약 10배 이상, 약 10배 이상 내지 약 20배 이상, 약 20배 이상 내지 약 30배 이상, 약 30배 이상 내지 약 40배 이상, 약 30배 이상 내지 약 40배 이상, 약 40배 이상 내지 약 50배 이상, 약 50배 이상 내지 약 60배 이상, 약 60배 이상 내지 약 70배 이상, 약 70배 이상 내지 약 80배 이상, 약 80배 이상 내지 약 90배 이상, 약 90배 이상 내지 약 100배 이상, 약 100배 이상 내지 약 200배 이상, 약 200배 이상 내지 약 300배 이상, 약 300배 이상 내지 약 400배 이상, 약 400배 이상 내지 약 500배 이상인, 방법.
제33항에 있어서, 상기 대상체에서의 상기 α-Gal A 단백질 활성은 상기 투여 전 상기 대상체에서의 α-Gal A 단백질 활성에 비해 상기 평균 정상 α-Gal A 단백질 활성보다 약 0배 이상 내지 약 2배 이상, 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 약 10배 이상, 약 11배 이상, 약 12배 이상, 약 13배 이상, 약 14배 이상, 약 15배 이상, 약 16배 이상, 약 17배 이상, 약 18배 이상, 약 19배 이상, 약 20배 이상, 약 21배 이상, 약 22배 이상, 약 23배 이상, 약 24배 이상, 약 25배 이상, 약 26배 이상, 약 27배 이상, 약 28배 이상, 약 29배 이상, 약 30배 이상, 약 31배 이상, 약 32배 이상, 약 33배 이상, 약 34배 이상, 약 35배 이상, 약 36배 이상, 약 37배 이상, 약 38배 이상, 약 39배 이상, 약 40배 이상, 약 41배 이상, 약 42배 이상, 약 43배 이상, 약 44배 이상, 약 45배 이상, 약 46배 이상, 약 47배 이상, 약 48배 이상, 약 49배 이상, 약 50배 이상, 약 51배 이상, 약 52배 이상, 약 53배 이상, 약 54배 이상, 약 55배 이상, 약 56배 이상, 약 57배 이상, 약 58배 이상, 약 59배 이상, 약 60배 이상, 약 61배 이상, 약 62배 이상, 약 63배 이상, 약 64배 이상, 약 65배 이상, 약 66배 이상, 약 67배 이상, 약 68배 이상, 약 69배 이상, 약 70배 이상, 약 71배 이상, 약 72배 이상, 약 73배 이상, 약 74배 이상, 약 75배 이상, 약 76배 이상, 약 77배 이상, 약 78배 이상, 약 79배 이상, 약 80배 이상, 약 81배 이상, 약 82배 이상, 약 83배 이상, 약 84배 이상, 약 85배 이상, 약 86배 이상, 약 87배 이상, 약 88배 이상, 약 89배 이상, 약 90배 이상, 약 91배 이상, 약 92배 이상, 약 93배 이상, 약 94배 이상, 약 95배 이상, 약 96배 이상, 약 97배 이상, 약 98배 이상, 약 99배 이상 또는 약 100배 이상인, 방법.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이식유전자에서 발현된 α-Gal A 단백질의 수준은 상기 대상체의 혈장, 혈청, 전혈, 건조 혈반, 백혈구 또는 다른 혈액 구성성분 중 하나 이상에서 측정된, 방법.
제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이식유전자에서 발현된 상기 α-Gal A 단백질은 상기 대상체의 신장, 간, 피부 및 심장에서 활성인, 방법.
제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 발현 벡터는 비경구 투여되는, 방법.
제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 발현 벡터는 정맥내로 투여되는, 방법.
제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 발현 벡터는 약제학적으로 허용 가능한 담체로 투여되는, 방법.
제39항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 CaCl₂, MgCl₂, NaCl, 수크로스 및 Kolliphor(폴록사머) P 188을 함유하는 인산염 완충 식염수를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 단지 1회 용량의 상기 AAV 발현 벡터가 상기 대상체에게 투여되는, 방법.
제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 발현 벡터는 약 5×10¹²vg/㎏의 용량으로 투여되는, 방법.
제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 발현 벡터는 약 1×10¹³vg/㎏의 용량으로 투여되는, 방법.
제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 발현 벡터는 약 3×10¹³vg/㎏의 용량으로 투여되는, 방법.
제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 발현 벡터는 약 5×10¹³vg/㎏의 용량으로 투여되는, 방법.
제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 발현 벡터의 투여 전 및/또는 투여 동안에 상기 대상체에게 면역억제제가 투여되는, 방법.
제46항에 있어서, 상기 면역억제제는 프레드니손을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 발현 벡터의 투여 전 및/또는 투여 동안에 상기 대상체에게 면역억제제가 투여되지 않는, 방법.
제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 발현 벡터의 투여 전에 상기 대상체에게 사전조건화 치료가 투여되지 않는, 방법.
제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 α-Gal A 단백질의 발현은 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 적어도 9개월, 적어도 10개월, 적어도 11개월, 적어도 12개월, 적어도 13개월, 적어도 14개월, 적어도 15개월, 적어도 16개월, 적어도 17개월, 적어도 18개월, 적어도 19개월, 적어도 20개월, 적어도 21개월, 적어도 22개월, 적어도 23개월 또는 적어도 24개월 동안 지속되는, 방법.
제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, ㎖/분/1.73㎡ 단위의 사구체 여과율(eGFR)이 만성 신장 질환 역학 협력(CKD-EPI) 방정식을 사용하여 투여한 후에 상기 대상체에서 측정되는, 방법.
제51항에 있어서, 연간 eGFR 감소율은 파브리병이 있는 비슷한 비치료 대상체에서보다 더 낮은, 방법.
제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 박출률(Ejection Fraction: EF)은 상기 투여 후에 상기 대상체에서 일회 박출량(stroke volume: SV)/이완기말 좌심실 용적(left ventricular volumes at end-diastole: LVEDV)으로서 측정되는, 방법.
제53항에 있어서, 연간 EF 감소율은 파브리병이 있는 비슷한 비치료 대상체에서보다 더 낮은, 방법.
제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 종축 움직임 변화(Global Longitudinal Strain: GLS)는 상기 투여 후에 2차원(2D) 변형 심장초음파검사 또는 심장 자기 공명 영상화(심장 MRI 또는 CMR)에 의해 상기 대상체에서 측정된, 방법.
제55항에 있어서, 연간 단축 진행 심장 근육의 수축 가능성은 파브리병이 있는 비슷한 비치료 대상체에서보다 더 낮은, 방법.
제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 좌심실 질량 지수(Left Ventricular Mass Index: LVMI)는 상기 투여 후에 상기 대상체에서 좌심실 질량(left ventricular mass: LVM)/체표면적으로서 측정된, 방법.
제57항에 있어서, 연간 LVMI 증가는 파브리병이 있는 비슷한 비치료 대상체에서보다 더 낮은, 방법.
제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 후에 상기 대상체에서 하나 이상의 청각적 증상의 개선이 있는, 방법.
제59항에 있어서, 하나 이상의 청각적 증상은 이명, 어지럼증 또는 진행성 난청인, 방법.
제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 무한증(anhidrosis)에서부터 발한감소증(hypohidrosis) 또는 정상 발한증(normal hidrosis)으로의 발한 수준의 긍정적 변화를 갖는, 방법.
제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 상기 투여 전에 파브리병에 대한 효소 대체 요법(ERT)("전처리(pre-treatment)")이 투여된 적이 있는, 방법.
제62항에 있어서, 상기 전처리를 위한 상기 효소 대체 요법은 재조합 α-갈락토시다제 A(GLA) 단백질 또는 유전자 발현 GAL를 포함하는, 방법.
제62항 또는 제63항에 있어서, 상기 전처리를 위한 상기 효소 대체 요법은 갈라폴드, AVR-RD-01, FLT-190, 페구니갈시다제 알파(pegunigalsidase alfa), 4D-310 또는 이들의 임의의 조합물을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전처리를 위한 상기 효소 대체 요법은 상기 GLA에 대한 활성 부위-특이적 샤페론(active site-specific chaperone: ASSC)과 조합하여 재조합 α-갈락토시다제 A(GLA) 단백질을 포함하는, 방법.
제65항에 있어서, 상기 ASSC는 1-데옥시갈락토노지리마이신인, 방법.
제62항 또는 제63항에 있어서, 상기 전처리를 위한 상기 효소 대체 요법은 아갈시다제(agalsidase) 알파 및/또는 베타 또는 유전자 발현 아갈시다제 알파 및/또는 베타를 포함하는, 방법.
제67항에 있어서, 상기 전처리를 위한 상기 효소 대체 요법은 파브라자임(fabrazyme), 레프라갈(Replagal), PRX-102 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 방법.
제63항 또는 제68항에 있어서, 상기 전처리를 위한 상기 효소 대체 요법은 유전자 요법을 포함하는, 방법.
제69항에 있어서, 상기 유전자 요법은 상기 효소를 암호화하는 벡터를 포함하는, 방법.
제69항에 있어서, 상기 유전자 요법은 AVR-RD-01, FLT-190, 페구니갈시다제 알파, 4D-310 또는 이들의 임의의 조합물을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
제70항에 있어서, 상기 벡터는 인간 GLA 단백질 또는 아갈시다제 알파 및/또는 베타를 암호화하는 mRNA를 포함하는, 방법.
제70항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인, 방법.
제73항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 포함하는, 방법.
제69항에 있어서, 상기 유전자 요법은 지질 나노입자에 의해 전달되는, 방법.
제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 상기 투여하기 전에 파브리병에 대한 비효소 대체 요법("전처리")이 투여된 적이 있는, 방법.
제76항에 있어서, 파브리병에 대한 상기 전처리 요법은 루세라스타트(lucerastat), 벤글루스타트(venglustat), 아파베타론(apabetalone) 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 방법.
제1항, 제2항 및 제7항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 파브리병은 1형 고전적 표현형 또는 2형 후기 발병 표현형인, 방법.
제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 α-Gal A 발현 카세트는 역위 말단 반복부(inverted terminal repeat: ITR)가 각 말단 상에 측접된, 방법.
제79항에 있어서, 상기 ITR은 아데노-연관 바이러스 2형(AAV2)으로부터 유래된, 방법.
제1항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 발현 벡터는 아데노-연관 바이러스로부터 유래된 캡시드로 패키징된 상기 α-Gal A 발현 카세트를 더 포함하는, 방법.
제81항에 있어서, 상기 α-Gal A 발현 카세트는 아데노-연관 바이러스 6형(AAV6)으로부터 유래된 캡시드로 패키징된, 방법.