KR20240086809A - Primer composition for screening wheat genetic resources missing omega-5 gliadin encoded in 1B and 1D chromosomes and uses thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 1B 및 1D 염색체에 암호화된 오메가-5 글리아딘 결손 밀 유전자원 선별용 프라이머 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 오메가-5 글리아딘 유전자가 결실된 밀 유전자원 선별용 프라이머 세트를 이용하여 1B 및 1D 염색체에 존재하는 오메가-5 글리아딘 유전자들의 상대적인 복제수 변이(CNV)를 분석할 수 있으며, 이러한 분석 방법을 확립하여 밀 의존성 운동 유발성 과민증(wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis; WDEIA)에 대한 알러젠이 감소되거나 제거된 밀 계통을 규명할 수 있다.The present invention relates to primers for selecting omega-5 gliadin deficient wheat genetic resources encoded in chromosomes 1B and 1D and their use.
The relative copy number variation (CNV) of the omega-5 gliadin genes present on chromosomes 1B and 1D can be analyzed using the primer set for selecting wheat genetic resources in which the omega-5 gliadin gene has been deleted according to the present invention. By establishing this analysis method, it is possible to identify wheat lines with reduced or eliminated allergens for wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis (WDEIA).
Description
본 발명은 1B 및 1D 염색체에 암호화된 오메가-5 글리아딘 결손 밀 유전자원 선별용 프라이머 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to primers for selecting omega-5 gliadin deficient wheat genetic resources encoded in chromosomes 1B and 1D and their use.
밀(Triticum aestivum)은 벼과(Gramineae) 밀속(Triticum)의 한해살이풀로 소맥이라고도 불린다. 밀은 전 세계적으로 재배되고 있으며 세계 곡물 생산량에서 옥수수에 이어 2위를 차지하고 있다. 밀은 쌀 다음으로 소비가 많이 되는 작물인데 1년에 국민 1인당 약 30kg 이상을, 국가적으로는 약 400만톤 정도가 소비되지만 대부분을 수입에 의존하고 있는 실정이다. 밀은 길고 날씬한 잎을 가지고 있고, 줄기가 비어 있으며 이삭은 20~100개의 꽃을 가지고 있다. 밀의 사용 목적은 빵, 국수, 케익, 크래커 등 다양한데 그 중 Triticum aestivum은 빵이나 국수 등을 만드는데 사용되며, Triticum durum은 스파게티나 마카로니 등을 만드는데 주로 사용된다.Wheat ( Triticum aestivum ) is an annual herb of the genus Triticum of the Gramineae family and is also called wheat. Wheat is grown worldwide and ranks second after corn in world grain production. Wheat is the second most consumed crop after rice. More than 30 kg of wheat is consumed per person per year, and about 4 million tons are consumed nationally, but most of it is dependent on imports. Wheat has long, slender leaves, hollow stems, and ears with 20 to 100 flowers. Wheat is used for various purposes, including bread, noodles, cakes, and crackers. Among them, Triticum aestivum is used to make bread and noodles, and Triticum durum is mainly used to make spaghetti and macaroni.
밀은 종피가 13~17%, 배가 2~3% 그리고 배유가 81~84%를 차지하고 있으며, 배유 저장 단백질 중 글루텐으로 인해 빵, 라면, 과자 등과 같은 가공적성을 가진다. 글루텐 단백질은 알코올 수용액 용해도에 따라 녹는 글리아딘(gliadin)과 녹지 않는 글루테닌(glutenin)으로 나뉜다. 대부분의 글리아딘은 단량체로 존재하고 있으며, 낮은 pH의 A-PAGE(Acid-PAGE)나 SDS-PAGE의 이동성에 따라 ω-5 글리아딘, ω-1,2 글리아딘, α-/β- 글리아딘 및 γ-글리아딘 그룹으로 구분된다. 전체 글리아딘 단백질 중 α-/β- 글리아딘 및 γ-글리아딘은 각각 28~33% 및 23~31%를 차지하고 있는 주요 단백질이며,ω-1,2 글리아딘과 ω-5 글리아딘은 각각 4~7%, 3~6%를 차지하고 있다. 특히, ω-5 글리아딘은 심각한 음식 알러지인 밀 의존성 운동 유발성 과민증(wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis, WDEIA)의 중심 항원이라고 알려져 있는데, 심한 경우 사망에 이르게 한다. 밀이 들어간 음식을 섭취한 후 물리적으로 운동했을 때 증상이 발생하며 주로 성인들에게 발병한다.In wheat, seed coat accounts for 13-17%, embryo 2-3%, and endosperm 81-84%, and due to gluten among the endosperm storage proteins, it is suitable for processing into bread, ramen, and snacks. Gluten proteins are divided into soluble gliadin and insoluble glutenin depending on their solubility in alcohol solution. Most gliadins exist as monomers, and depending on the mobility of low pH A-PAGE (Acid-PAGE) or SDS-PAGE, ω-5 gliadin, ω-1,2 gliadin, α-/ It is divided into β-gliadin and γ-gliadin groups. Among the total gliadin proteins, α-/β- gliadin and γ-gliadin are the major proteins, accounting for 28-33% and 23-31%, respectively, while ω-1,2 gliadin and ω-5 Gliadin accounts for 4-7% and 3-6%, respectively. In particular, ω-5 gliadin is known to be the central antigen in wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis (WDEIA), a serious food allergy, which in severe cases leads to death. Symptoms occur when you exercise physically after eating foods containing wheat, and it mainly affects adults.
최근 연구는 밀 종실이 오메가-5 글리아딘 단백질은 밀의 1B 염색체 Gli-B1 유전자좌에 주요 형태로 존재하고 1D 염색체 Gli-D1 유전자좌에 마이너한 형태로 존재하는 것을 밝혀냈다. A recent study revealed that the wheat seed omega-5 gliadin protein is present in a major form at the Gli-B1 locus on chromosome 1B and a minor form at the Gli-D1 locus on chromosome 1D of wheat.
본 발명은 전술한 문제 및 이와 연관된 다른 문제를 해결하는 것을 목적으로 한다.The present invention aims to solve the above-described problems and other problems associated therewith.
본 발명의 목적은 서열번호 1 및 서열번호 5로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 또는 서열번호 4 및 서열번호 6으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍;을 포함하는 오메가-5 글리아딘(omega-5 gliadin) 유전자가 결실된 밀 유전자원 선별용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.An object of the present invention is a pair of oligonucleotide primers represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 5; or an oligonucleotide primer pair represented by SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 6; to provide a primer set for selecting wheat genetic resources with a deletion of the omega-5 gliadin gene.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 오메가-5 글리아딘 유전자가 결실된 밀 유전자원 선별용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for selecting wheat genetic resources with a deletion of the omega-5 gliadin gene, including the above primer set.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 오메가-5 글리아딘 유전자가 결실된 밀 유전자원 선별용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for selecting wheat genetic resources with a deletion of the omega-5 gliadin gene, including the composition.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 대상 시료에서 핵산을 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭된 산물을 정제하여 유전자 복제수 변이를 확인하는 단계;를 포함하는 오메가-5 글리아딘 유전자가 결실된 밀 유전자원을 선별하는 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is (a) isolating nucleic acids from a target sample; (b) using the isolated nucleic acid as a template and performing an amplification reaction using the primer set of the present invention to amplify the target sequence; and (c) purifying the amplified product to confirm gene copy number variation. The present invention provides a method for selecting wheat genetic resources with a deletion of the omega-5 gliadin gene, including the step of:
본 명세서에 개시된 발명의 기술적 사상에 따라 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 문제점을 해결하기 위한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제는 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The technical problem to be achieved according to the technical idea of the invention disclosed in this specification is not limited to the problem to solve the problems mentioned above, and other problems not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the description below. There will be.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.This is explained in detail as follows. Meanwhile, each description and embodiment disclosed in this application may also be applied to each other description and embodiment. That is, all combinations of the various elements disclosed in this application fall within the scope of this application. Additionally, the scope of the present application cannot be considered limited by the specific description described below.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 1B 및 1D 염색체에 암호화된 오메가-5 글리아딘 결손 밀 유전자원 선별용 프라이머 및 이의 용도를 제공한다.As an aspect for achieving the above object, the present invention provides primers for selecting omega-5 gliadin-deficient wheat genetic resources encoded in chromosomes 1B and 1D, and uses thereof.
구체적으로, 본 발명은 실시간 유전자 증폭기(Real-time qPCR)를 이용하여 1B 그리고 1D 염색체에 존재하는 오메가-5 글리아딘 유전자들의 상대적 복제수 변이(Copy number variation; CNV) 분석 방법을 통해 알러젠이 줄어들거나 제거된 밀 계통을 규명하는 방법을 제공한다.Specifically, the present invention analyzes allergens by analyzing the relative copy number variation (CNV) of omega-5 gliadin genes present on chromosomes 1B and 1D using real-time qPCR. Provides a method for identifying reduced or eliminated wheat lines.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 5로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 또는 서열번호 4 및 서열번호 6으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍;을 포함하는, 오메가-5 글리아딘(omega-5 gliadin) 유전자가 결실된 밀 유전자원 선별용 프라이머 세트를 제공한다.In one aspect for achieving the above object, the present invention provides a pair of oligonucleotide primers represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 5; or an oligonucleotide primer pair represented by SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 6; providing a primer set for selecting wheat genetic resources with a deleted omega-5 gliadin gene.
본 발명에 있어서, '글리아딘(gliadin)'은 밀 글루텐의 주요 구성 성분이며, 전체 저장단백질의 40-50% 차지한다. 대부분의 글리아딘이 단량체로 존재하고 글리아딘은 낮은 pH의 A-PAGE(Acid-PAGE)나 SDS-PAGE의 이동성에 따라 ω5-, ω1,2-, α-/β-, γ-글리아딘 4그룹으로 나뉘며 분자량은 30-75 kDa정도이다. γ-, ω-글리아딘은 1번 염색체의 단완에 존재하며 Gli-A1, Gli-B1 및 Gli-D1에 의해 암호화되고, α-/β-글리아딘은 6번 염색체의 단완에 존재하며 Gli-A2, Gli-B2 및 Gli-D2로 암호화된다. 전체 글리아딘 단백질 중 α-/β- 및 γ-글리아딘이 주요 단백질로 구성되고, 각각 28-33% 및 23-31%를 차지한다. ω-글리아딘은 훨씬 적으며, ω-1,2 글리아딘은 4-7%, ω-5 글리아딘은 3-6%를 차지한다.In the present invention, 'gliadin' is a major component of wheat gluten and accounts for 40-50% of the total storage protein. Most gliadins exist as monomers, and gliadins are divided into ω5-, ω1,2-, α-/β-, and γ-types depending on the mobility of low pH A-PAGE (Acid-PAGE) or SDS-PAGE. It is divided into 4 groups of riadins and has a molecular weight of about 30-75 kDa. γ-, ω-gliadins exist on the short arm of chromosome 1 and are encoded by Gli-A1, Gli-B1, and Gli-D1, and α-/β-gliadins exist on the short arm of chromosome 6. It is encoded by Gli-A2, Gli-B2 and Gli-D2. Among the total gliadin proteins, α-/β- and γ-gliadin constitute the major proteins, accounting for 28-33% and 23-31%, respectively. ω-gliadins are much less common, with ω-1,2 gliadins accounting for 4-7% and ω-5 gliadins accounting for 3-6%.
본 발명에 있어서, '오메가-5 글리아딘(omega-5 gliadin)'은 심각한 음식 알러지인 밀 의존성 운동 유발성 과민증(wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis; WDEIA)의 중심 항원으로 알려져 있다.In the present invention, 'omega-5 gliadin' is known to be the central antigen of wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis (WDEIA), a serious food allergy.
본 발명의 용어 '밀 의존성 운동 유발성 과민증(wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis; WDEIA)'는 밀이 들어간 음식을 섭취 후 물리적인 운동을 했을 때 발생하며, 주로 성인에게 발병한다고 알려져 있다. WDEIA 환자들의 혈청 이뮤노글로불린 E(immunoglobulin E; IgE)와 결합하는 주된 항원결정기(predominant epitope)는 오메가 5-글리아딘으로 알려져 있다.The term 'wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis (WDEIA)' of the present invention occurs when physical exercise is performed after consuming food containing wheat, and is known to mainly occur in adults. The predominant epitope that binds to the serum immunoglobulin E (IgE) of WDEIA patients is known to be omega 5-gliadin.
본 발명에 있어서, '프라이머'는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.In the present invention, 'primer' refers to a single-stranded oligonucleotide sequence complementary to the nucleic acid strand to be copied, and can serve as a starting point for the synthesis of a primer extension product. The length and sequence of the primers should allow for initiation of synthesis of the extension product. The specific length and sequence of the primer will depend on the complexity of the DNA or RNA target desired as well as the conditions under which the primer is used, such as temperature and ionic strength.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산 (peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, HRP (horse radish peroxidase), 알칼리 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 비오틴) 등이 있다.In the present invention, oligonucleotides used as primers may also include nucleotide analogues, such as phosphorothioates, alkylphosphorothioates or peptide nucleic acids, or May contain an intercalating agent. Additionally, primers may incorporate additional features that do not change the basic nature of the primer serving as the starting point for DNA synthesis. The primer sequence of the present invention may, if necessary, contain a label detectable directly or indirectly by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or chemical means. Examples of labels include enzymes (e.g., HRP (horse radish peroxidase), alkaline phosphatase), radioactive isotopes (e.g., 32 P), fluorescent molecules, chemical groups (e.g., biotin), etc. there is.
본 발명에서 오메가-5 글리아딘 유전자가 결실된 밀 유전자원 선별을 위한 프라이머는 PCR용 프라이머 쌍을 포함하며, 보다 구체적으로는 이에 제한되지는 않으나, 상기 전술한 오메가-5 글리아딘 DNA 게놈에 대한 실시간 qPCR(Real-time qPCR)용 프라이머 쌍을 의미할 수 있다. 본 발명의 프라이머 쌍은 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함하며, 구체적으로는 1D 염색체에 암호화된 오메가-5 글리아딘 유전자에 특이적(또는 상보적)인 것으로, 상기 1D 염색체에 암호화된 오메가-5 글리아딘 유전자의 복제수 변이(Copy Number Variation; CNV)를 분석할 수 있는 서열번호 1 및 서열번호 5로 표시되는 프라이머 쌍, 1B 염색체에 암호화된 오메가-5 글리아딘 유전자에 특이적인 것으로, 상기 1B 염색체에 암호화된 오메가-5 글리아딘 유전자의 복제수 변이(Copy Number Variation; CNV)를 분석할 수 있는 서열번호 4 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.In the present invention, primers for selecting wheat genetic resources with deletion of the omega-5 gliadin gene include primer pairs for PCR, and are more specifically, but not limited to, the above-mentioned omega-5 gliadin DNA genome. It may refer to a primer pair for real-time qPCR. The primer pair of the present invention includes a forward primer and a reverse primer, and is specifically specific (or complementary) to the omega-5 gliadin gene encoded in the 1D chromosome. A primer pair represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 5 capable of analyzing copy number variation (CNV) of the gliadin gene, specific for the omega-5 gliadin gene encoded on chromosome 1B, It may include a pair of primers represented by SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 6, which can analyze copy number variation (CNV) of the omega-5 gliadin gene encoded on chromosome 1B.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 오메가-5 글리아딘 유전자가 결실된 밀 유전자원을 선별하기 위하여 사용되는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는, 오메가-5 글리아딘 유전자에 대한 복제수 변이를 분석함으로써 오메가-5 글리아딘 유전자가 결실된 밀 유전자원을 선별하기 위하여 사용되는 것일 수 있다.In the present invention, the primer set may be used to select wheat genetic resources with a deletion of the omega-5 gliadin gene, and more specifically, copy number variation for the omega-5 gliadin gene. The analysis may be used to select wheat genetic resources in which the omega-5 gliadin gene has been deleted.
본 발명에 있어서, 상기 '복제수 변이(Copy Number Variation)'는 유전체의 개인별 변이에서 구조 변이에 해당하는 유전적 변화로, 유전체에서 관찰되는 구조적 변이(structural variation) 중에서 가장 흔하게 나타난다. 통상적으로 2n의 형태로 존재하는 일반적인 서열들과는 달리 결실(0n, 1n 상태), 증폭(3n 이상의 상태)되는 등 대표적인 표준 참조 게놈(Reference Genome)와 비교해 반복되는 서열의 숫자의 차이를 보이는 DNA 조각을 주로 의미한다.In the present invention, the 'Copy Number Variation' is a genetic change corresponding to a structural variation in the individual variation of the genome, and is the most common structural variation observed in the genome. Unlike general sequences that usually exist in 2n form, DNA fragments that show differences in the number of repeated sequences compared to a representative standard reference genome, such as deletion (0n, 1n state) and amplification (3n or more state) It mainly means
상기 목적을 달성하기 위한 다른 일 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 오메가-5 글리아딘 유전자가 결실된 밀 유전자원 선별용 조성물 및 이를 포함하는 선별용 키트를 제공한다. In another aspect for achieving the above object, the present invention provides a composition for selecting wheat genetic resources with a deletion of the omega-5 gliadin gene, including the primer set, and a selection kit containing the same.
상기 '프라이머', '프라이머 세트', '글리아딘' 및 '오메가-5 글리아딘'은 전술한 바와 같다.The ‘primer’, ‘primer set’, ‘gliadin’, and ‘omega-5 gliadin’ are as described above.
상기 키트는 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transcription PCR) 키트, 중합효소 연쇄반응(PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(RQ-PCR) 키트, 역 중합효소연쇄반응(inverse PCR) 키트 및 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR) 키트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 구체적으로는 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR; qPCR) 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The kit includes a reverse transcription PCR kit, polymerase chain reaction (PCR) kit, real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) kit, and real-time polymerase chain reaction quantitative test (RQ-PCR). It may be one or more selected from the group consisting of kits, inverse PCR kits, and multiplex PCR kits, specifically, real-time polymerase chain reaction (qPCR). It may be a kit, but is not limited thereto.
상기 조성물 및 키트는 서열번호 1 및 5로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 4 및 6으로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트와, 추가로 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 키트에서 증폭 반응을 수행하기 위한 시약으로 DNA 폴리머라제(polymerase), dNTPs 및 버퍼 등을 포함할 수 있으며, 또한 PCR 산물의 증폭 여부를 확인하기 위해 전기영동(electrophoresis)의 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 목적상 상기 조성물 및 키트를 이용하여 오메가-5 글리아딘 유전자의 상대적 유전자 복제수를 분석하는 경우, 상대적 유전자 복제수를 정량화하기 위한 레퍼런스 프라이머 쌍을 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.The composition and kit may include a primer set including the primer pair represented by SEQ ID NOs: 1 and 5, the primer pair represented by SEQ ID NOs: 4 and 6, and a reagent for further performing an amplification reaction. For the purpose of the present invention, reagents for performing an amplification reaction in the kit may include DNA polymerase, dNTPs, and buffer, and electrophoresis may be performed to confirm whether or not the PCR product is amplified. The necessary components may be additionally included in the kit of the present invention. In addition, for the purpose of the present invention, when analyzing the relative gene copy number of the omega-5 gliadin gene using the composition and kit, a reference primer pair for quantifying the relative gene copy number may be additionally included. , for example, may include a primer pair represented by SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 일 양태로서, 본 발명은 (a) 대상 시료에서 핵산을 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭된 산물을 정제하여 유전자 복제수 변이를 확인하는 단계;를 포함하는 오메가-5 글리아딘 유전자가 결실된 밀 유전자원을 선별하는 방법을 제공한다.As another aspect for achieving the above object, the present invention includes the steps of (a) isolating nucleic acids from a target sample; (b) using the isolated nucleic acid as a template and performing an amplification reaction using the primer set of the present invention to amplify the target sequence; and (c) purifying the amplified product to confirm gene copy number variation. It provides a method of selecting wheat genetic resources with a deletion of the omega-5 gliadin gene, including the step.
상기 '프라이머', '글리아딘' 및 '오메가-5 글리아딘'은 전술한 바와 같다.The ‘primer’, ‘gliadin’ and ‘omega-5 gliadin’ are as described above.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 '시료'는 밀(Triticum aestivum)에 속하는 품종일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the 'sample' in step (a) may be a variety belonging to wheat ( Triticum aestivum ), but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 '핵산'은 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재할 수 있고, RNA, DNA, 당- 또는 골격-변형 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드와 같은 핵산 유사체 분자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the 'nucleic acid' in step (a) may exist in single-stranded or double-stranded form and may be a nucleic acid analog molecule such as RNA, DNA, sugar- or backbone-modified ribonucleotide or deoxyribonucleotide. However, it is not limited to this.
본 발명에 있어서, 상기 (b)의 증폭하는 단계는 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR; qPCR)을 수행하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 실시간 중합효소 연쇄반응은 '정량적 중합효소 연쇄반응(qPCR)으로도 알려져 있으며, 다수의 표적 유전자의 발현 변화를 확인하여 고속 대량의 실험 결과를 스크리닝하는 데 주로 사용된다.In the present invention, the amplification step of (b) may include performing real-time polymerase chain reaction (qPCR). The real-time polymerase chain reaction of the present invention is also known as 'quantitative polymerase chain reaction (qPCR), and is mainly used to screen high-speed and large-scale experimental results by confirming changes in the expression of multiple target genes.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에서 유전자 복제수를 확인하는 단계는 상기 (b) 단계의 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써 표적 서열을 증폭하고 증폭된 유전자의 양을 측정함으로써 확인하는 것일 수 있으며, 구체적으로, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 얻어진 증폭된 산물의 유전자 복제수를 기준으로, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 얻어진 증폭된 산물의 상대적 유전자 복제수가 1 미만이면 오메가-5 글리아딘 유전자가 감소 또는 결실된 밀 유전자원인 것으로 판단할 수 있다.In the present invention, the step of confirming the gene copy number in step (c) may be confirmed by amplifying the target sequence by performing a real-time polymerase chain reaction in step (b) and measuring the amount of the amplified gene. Specifically, based on the gene copy number of the amplified product obtained using the primer pair represented by SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, the relative gene copy number of the amplified product obtained using the primer set of the present invention is 1. If it is less than that, it can be judged to be a wheat genetic resource in which the omega-5 gliadin gene has been reduced or deleted.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, and it will be obvious to those skilled in the art that the scope of the present invention should not be construed as limited by these examples.
본 발명에 따른 오메가-5 글리아딘 유전자가 결실된 밀 유전자원 선별용 프라이머 세트를 이용하여 1B 및 1D 염색체에 존재하는 오메가-5 글리아딘 유전자들의 상대적인 복제수 변이(CNV)를 분석할 수 있으며, 이러한 분석 방법을 확립하여 알러젠이 감소되거나 제거된 밀 계통을 규명할 수 있다.The relative copy number variation (CNV) of the omega-5 gliadin genes present on chromosomes 1B and 1D can be analyzed using the primer set for selecting wheat genetic resources in which the omega-5 gliadin gene has been deleted according to the present invention. By establishing this analysis method, it is possible to identify wheat lines with reduced or eliminated allergens.
도 1은 서열번호 1 내지 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 665개의 밀 유전자원에서 11개의 밀 계통을 선별하고, 이들 밀 계통에서 1D 오메가-5 글리아딘 또는 1B 오메가-5 글리아딘 유전자가 존재하고 있는지 여부를 확인하기 위하여 실험한 결과이다.
도 2는 복제수 변이를 분석하기 위하여 1D 오메가-5 글리아딘 유전자 및 1B 오메가-5 글리아딘 유전자에 특이적인 프라이머를 제작하는 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 대조군 계통 및 선별된 11개의 밀 계통에서 본 발명에서 제작한 프라이머 세트를 이용하여 1D 오메가-5 글리아딘 유전자 및 1B 오메가-5 글리아딘 유전자의 복제수 변이를 분석한 결과이다.
도 4 내지 도 6은 11개의 밀 유전자원 계통에서 오메가-5 글리아딘 유전자가 결실된 것을 더 확인하기 위하여, 2차원 전기영동 및 2-D 면역블랏 분석을 실시한 결과이다.
도 7은 선별된 밀 계통 및 대조군 계통에서 글리아딘 분획의 조성을 평가하기 위하여 RP-UPLC로 분석한 결과이다.Figure 1 shows that 11 wheat lines were selected from 665 wheat genetic resources using primers of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, and that the 1D omega-5 gliadin or 1B omega-5 gliadin gene was found in these wheat lines. This is the result of an experiment to check whether it exists or not.
Figure 2 shows the process of producing primers specific to the 1D omega-5 gliadin gene and the 1B omega-5 gliadin gene to analyze copy number variation.
Figure 3 shows the results of analyzing the copy number variation of the 1D omega-5 gliadin gene and the 1B omega-5 gliadin gene in the control line and 11 selected wheat lines using the primer set produced in the present invention.
Figures 4 to 6 show the results of two-dimensional electrophoresis and 2-D immunoblot analysis to further confirm that the omega-5 gliadin gene was deleted in 11 wheat genetic resource lines.
Figure 7 shows the results of analysis by RP-UPLC to evaluate the composition of the gliadin fraction in selected wheat lines and control lines.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through the following examples. However, these examples are for illustrative purposes only and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예 1. 밀 유전자원에서 1D 염색체에 암호화된 오메가-5 글리아딘 결손 라인 선별Example 1. Selection of omega-5 gliadin deletion lines encoded in 1D chromosome from wheat genetic resources
1B 그리고 1D 오메가-5 글리아딘 유전자 염기서열에 각각 특이적인 PCR 프라이머를 이용하여 665개의 밀 유전자원에서 genomic DNA의 PCR 분석을 통해 1D 오메가-5 글리아딘 유전자가 결손된 밀 11개의 밀 계통을 선별하고, 선별된 1D 오메가-5 글리아딘 유전자가 결손된 밀 유전자원에서 오메가-5B 글리아딘이 존재하고 있는지 여부를 확인하였다(도 1). 이 때 사용한 1B 그리고 1D 오메가-5 글리아딘 유전자 염기서열에 특이적인 PCR 프라이머의 서열 및 PCR 수행 조건은 아래 표 1과 같다. 665개의 밀 유전자원은 National Institute of crop science of south korea의 밀 육종 프로그램에서 교배되는데 사용되는 유전자원을 사용하였고, CS, DH20, N1BT1A, N1BT1D, N1DT1A 및 N1DT1B를 대조군으로 사용하였다. Eleven wheat lines with a deletion in the 1D omega-5 gliadin gene were identified through PCR analysis of genomic DNA from 665 wheat genetic resources using PCR primers specific to the 1B and 1D omega-5 gliadin gene base sequences, respectively. was selected, and it was confirmed whether omega-5B gliadin exists in the wheat genetic resources lacking the selected 1D omega-5 gliadin gene (Figure 1). The sequences of PCR primers specific to the 1B and 1D omega-5 gliadin gene sequences used at this time and PCR performance conditions are shown in Table 1 below. 665 wheat genetic resources were used for crossbreeding in the wheat breeding program of the National Institute of Crop Science of South Korea, and CS, DH20, N1BT1A, N1BT1D, N1DT1A, and N1DT1B were used as controls.
오메가-5 글리아딘1D
Omega-5 Gliadin
(서열번호 1)ω-D4-F
(SEQ ID NO: 1)
63°C 30s
72°C 45s95°C 30s
63°C 30s
72°C 45s
(서열번호 2)ω-D4-R
(SEQ ID NO: 2)
오메가-5 글리아딘1B
Omega-5 Gliadin
(서열번호 3)ω-5B-F
(SEQ ID NO: 3)
60°C 45s
72°C 60s94°C 30s
60°C 45s
72°C 60s
(서열번호 4)ω-5B-R
(SEQ ID NO: 4)
1D 오메가-5 글리아딘 유전자 염기서열에 특이적인 프라이머를 이용한 PCR 분석 결과, CS(Chinese Spring), Glu-B3 및 Gli-B1 유전자좌가 결실된 돌연변이 계통인 DH20, 그리고 CS의 nullisomic-tetrasomic 계통인 N1BT1A 및 N1BT1D 계통에서는 약 1.0kb의 오메가-D4 유전자 단편이 검출되는 것을 확인하였다. 반면, 이러한 단편은 CS의 nullisomic-tetrasomic 계통인 N1DT1A 및 N1DT1B, 그리고 선별된 11개의 밀 유전자원(#5, #168, #205, #212, #241, #307, #321, #332, #337, #479 및 #572)에서는 발견되지 않았다.As a result of PCR analysis using primers specific for the 1D omega-5 gliadin gene sequence, CS (Chinese Spring), DH20, a mutant strain with deletion of Glu-B3 and Gli-B1 loci, and nullisomic-tetrasomic strain of CS It was confirmed that an omega-D4 gene fragment of approximately 1.0 kb was detected in the N1BT1A and N1BT1D lines. On the other hand, these fragments were derived from the nullisomic-tetrasomic lines of CS, N1DT1A and N1DT1B, and from 11 selected wheat genetic sources (#5, #168, #205, #212, #241, #307, #321, #332, # 337, #479 and #572).
한편, 1B 오메가-5 글리아딘 유전자 염기서열에 특이적인 프라이머를 이용한 PCR 분석 결과, CS, N1DT1A 및 N1DT1B 계통에서 약 1.2kb의 유전자 단편이 검출되었으나, DH20, N1BT1A 및 N1BT1D 계통, 그리고 2가지의 밀 유전자형인 #332 및 #337에서는 검출되지 않는 것을 확인하였다.Meanwhile, as a result of PCR analysis using primers specific for the 1B omega-5 gliadin gene sequence, a gene fragment of approximately 1.2 kb was detected in the CS, N1DT1A, and N1DT1B lines, but in the DH20, N1BT1A, and N1BT1D lines, and two It was confirmed that it was not detected in wheat genotypes #332 and #337.
특히, #332 및 #337에서는 1D 오메가-5 글리아딘 및 1B 오메가-5 글리아딘 특이적 프라이머를 사용한 PCR 분석 산물 모두에서 증폭되지 않았다. #332 및 #337 두 계통의 유전자형이 1BL.1RS 밀-호밀 전좌(translocation)로 유래했는지를 확인하기 위해, 1RS 염색질을 검출하는 데 사용되는 3개의 호밀 특이적 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 분석을 수행하였다. 사용된 프라이머 쌍의 염기서열은 아래 표 2와 같다.In particular, #332 and #337 were not amplified in both PCR analysis products using 1D Omega-5 gliadin and 1B Omega-5 gliadin specific primers. To determine whether the genotypes of the two lines #332 and #337 originated from the 1BL.1RS wheat-rye translocation, PCR analysis was performed using three rye-specific primer pairs used to detect 1RS chromatin. did. The base sequences of the primer pairs used are shown in Table 2 below.
(서열번호 9)Sec1 gene-F
(SEQ ID NO: 9)
60°C 60s,
72°C 90s94°C 45s;
60°C 60s;
72°C 90s
(서열번호 10)Sec1 gene-R
(SEQ ID NO: 10)
(서열번호 11)PrCEN-3-F
(SEQ ID NO: 11)
58°C 30s,
72°C 75s94°C 30s;
58°C 30s;
72°C 75s
(서열번호 12)PrCEN-3-R
(SEQ ID NO: 12)
(서열번호 13)O-SEC5'/A
(SEQ ID NO: 13)
50°C 120s,
72°C 180s94°C 60s;
50°C 120s,
72°C 180s
(서열번호 14)O-SEC3'/R
(SEQ ID NO: 14)
1BL.1RS 전좌(translocation)는 1R 호밀(rye) 염색체의 짧은 팔(1RS)을 Glu-B3 및 Gli-B1 유전자좌를 포함하는 밀의 1B 염색체의 짧은 팔(1BS)과 교체함으로써 생물학적 및 비생물학적 스트레스 및 수확능을 개선하기 위하여 빵밀의 육종 프로그램에서 가장 널리 사용되어지는 외래 염색질 공급원 중 하나이다. #332 및 #337 밀 계통뿐만 아니라, 1BL.1RS 전좌에 대한 대조군 계통인 Clement에서, Sec1 gene, PrCEN-3 및 0-sec5/'A 및 O-SEC3'/R에 대한 특이적 프라이머 쌍으로부터의 PCR 분석 결과 각각 약 1.2kb, 1.2kb, 1.5kb/0.7kb의 크기로 증폭되는 것을 확인하였고, 이는 두 계통(#332, #337)이 1BL.1RS 전좌 계통으로부터 유래되는 것임을 나타낸다.The 1BL.1RS translocation replaces the short arm (1RS) of the 1R rye chromosome with the short arm (1BS) of the wheat 1B chromosome, which contains the Glu-B3 and Gli-B1 loci, thereby protecting against biotic and abiotic stress and stress. It is one of the most widely used exotic chromatin sources in bread wheat breeding programs to improve yield. From #332 and #337 wheat lines, as well as Clement, a control line for the 1BL.1RS translocation, from specific primer pairs for the Sec1 gene, PrCEN-3, and 0-sec5/'A and O-SEC3'/R. As a result of PCR analysis, it was confirmed that the amplification was about 1.2kb, 1.2kb, and 1.5kb/0.7kb, respectively, indicating that the two lines (#332, #337) are derived from the 1BL.1RS translocation lineage.
실시예 2. 오메가-5 글리아딘 유전자의 CNV(Copy Number Variation) 분석을 위한 프라이머 설계Example 2. Primer design for CNV (Copy Number Variation) analysis of omega-5 gliadin gene
레퍼런스 밀 품종인 Chinese Spring(CS)의 고품질 유전체 서열을 이용하여 1B 그리고 1D 오메가-5 글리아딘 유전자 서열의 보존(conversed) 영역에서 각각 복제수 변이(Copy Number Variation; CNV)을 분석할 수 있는 프라이머를 각각 디자인하였다. 1D 오메가-5 글리아딘 유전자의 CNV 분석을 위해서 N-말단에 보존 영역의 프라이머를 제작하였고(도 2A), 1B 오메가-5 글리아딘 유전자의 CNV 분석을 위해서 C-말단에 보존 영역의 프라이머를 제작하였다(도 2B). Using the high-quality genome sequence of Chinese Spring (CS), a reference wheat variety, copy number variation (CNV) can be analyzed in the conserved regions of the 1B and 1D omega-5 gliadin gene sequences, respectively. Primers were designed individually. For CNV analysis of the 1D omega-5 gliadin gene, primers with a conserved region at the N-terminus were prepared (Figure 2A), and for CNV analysis of the 1B omega-5 gliadin gene, primers with a conserved region at the C-terminus were prepared. was produced (Figure 2B).
오메가-5 글리아딘 유전자가 결실된 밀 유전자원 품종을 선별하기 위한 CNV 분석을 위해 제작된 프라이머 서열은 아래 표 3과 같다.The primer sequences produced for CNV analysis to select wheat genetic resource varieties with deletion of the omega-5 gliadin gene are shown in Table 3 below.
오메가-5 글리아딘1D
Omega-5 Gliadin
(서열번호 1)ω-D4-F
(SEQ ID NO: 1)
55°C 20s95°C 10s
55°C 20s
(서열번호 5)OD4-NR
(SEQ ID NO: 5)
오메가-5 글리아딘1B
Omega-5 Gliadin
(서열번호 6)O5B-CF
(SEQ ID NO: 6)
55°C 20s95°C 10s
55°C 20s
(서열번호 4)ω-5B-R
(SEQ ID NO: 4)
실시예 3. 대조군 계통들과 선발된 계통들에서 오메가-5 글리아딘 유전자의 CNV 분석Example 3. CNV analysis of the omega-5 gliadin gene in control lines and selected lines
제작된 오메가-5 글리아딘 유전자들의 qPCR 프라이머 세트의 정확도를 확인하기 위하여 먼저 대조군 계통(control varieties)에서 CNV를 측정하였다. 1B 및 1D 오메가-5 글리아딘 유전자에 대한 qPCR 분석에서, 대조군 계통 및 선별된 밀 유전자원 계통들에서의 상대적 CNV는 TaPFT1 유전자에 대한 프라이머 쌍인 Ref_181을 레퍼런스 프라이머 쌍으로 이용하여 CNV 값을 정량화함으로써 측정된 상대적 유전자 복제수를 분석하고, 이를 CS, DH20, 그리고 1B 및 1D nullisomic-tetrasomic 계통(N1BT1A, N1BT1D, N1DT1A 및 N1DT1A)의 결과와 비교하였다. 사용한 레퍼런스 프라이머 쌍 Ref_181의 염기서열은 아래 표 4와 같다.To confirm the accuracy of the qPCR primer set of the constructed omega-5 gliadin genes, CNV was first measured in control varieties. In qPCR analysis for the 1B and 1D omega-5 gliadin genes, the relative CNVs in the control lines and selected wheat germline lines were determined by quantifying the CNV values using Ref_181, a primer pair for the TaPFT1 gene, as a reference primer pair. The measured relative gene copy numbers were analyzed and compared with those of CS, DH20, and 1B and 1D nullisomic-tetrasomic lines (N1BT1A, N1BT1D, N1DT1A, and N1DT1A). The base sequence of the reference primer pair Ref_181 used is shown in Table 4 below.
(서열번호 7)Ref181-F
(SEQ ID NO: 7)
55°C 20s95°C 10s
55°C 20s
(서열번호 8)Ref181-R
(SEQ ID NO: 8)
그 결과, 도 3A에 표기된 바와 같이 1D 오메가-5 글라이딘 유전자 특이 qPCR 프라이머 세트는 1D 오메가-5 글리아딘 유전자들이 존재하는 CS, DH20 및 N1BT1A에서 유사한 상대적 CNV를 보였고, 1D 염색체가 4개인 tetrasomic N1BT1D 계통에서는 CS에 비해 CNV가 2배 증가되는 것을 확인하였다. 또한, 1D 염색체가 결손된(null) N1DT1A 및 N1DT1B에서 CNV가 0에 가까운 것을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 3A, the 1D omega-5 glidin gene-specific qPCR primer set showed similar relative CNVs in CS, DH20, and N1BT1A, where 1D omega-5 gliadin genes exist, and was a tetrasomic with four 1D chromosomes. In the N1BT1D line, it was confirmed that CNV increased two-fold compared to CS. In addition, it was confirmed that the CNV was close to 0 in N1DT1A and N1DT1B, which have a missing (null) 1D chromosome.
한편, 도 3B에 표기된 바와 같이 1B 오메가-5 글리아딘 유전자 특이 qPCR 프라이머 세트에서는 1B 오메가-5 글리아딘 유전자들이 결손된 DH20, N1BT1A 및 N1BT1D 계통에서 상대적 CNV는 0에 가까웠고, 1B 오메가-5 글리아딘 유전자들이 존재하는 CS와 N1DT1A에서 유사한 CNV를 보였다. 또한, 1B 염색체가 4개인 tetrasomic N1DT1B 계통에서는 CS에 비해 CNV가 2배 증가되는 것을 확인하였다.Meanwhile, as shown in Figure 3B, in the 1B omega-5 gliadin gene-specific qPCR primer set, the relative CNV was close to 0 in the DH20, N1BT1A, and N1BT1D lines lacking the 1B omega-5 gliadin genes, and the 1B omega-5 gliadin genes were close to 0. Similar CNVs were seen in CS and N1DT1A, which contain gliadin genes. In addition, in the tetrasomic N1DT1B line with four 1B chromosomes, CNV was confirmed to be two-fold increased compared to CS.
이를 토대로, 실시예 1에서 선발된 11개의 밀 계통에 대한 1B 및 1D 염색체에 있는 오메가-5 글리아딘의 상대적 유전자 복제수 변이를 정량화하기 위하여 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR; qPCR) 분석을 진행하였고, qPCR 분석을 위한 프라이머로 실시예 2에서 제작한 프라이머 세트를 사용하였다. Based on this, real-time polymerase chain reaction (qPCR) was used to quantify the relative gene copy number variation of omega-5 gliadin on chromosomes 1B and 1D for the 11 wheat lines selected in Example 1. Analysis was performed, and the primer set prepared in Example 2 was used as primers for qPCR analysis.
그 결과, 11개의 밀 유전자원 계통 모두 1D 오메가-5 글리아딘 유전자 특이 qPCR 프라이머 세트에서 1D 염색체가 결손된(null) N1DT1A 및 N1DT1B와 같이 CNV가 0에 가까웠으며, 이는 선별된 계통들에서 복제수가 감소되었음을 나타낸다. 또한, 1B 오메가-5 글리아딘 유전자 특이 qPCR 프라이머 세트에서는 1BL.1RS 전좌(translocation) 계통인 #332 및 #337을 제외한 나머지 9개의 밀 유전자원 계통에서 CS 및 N1DT1A와 유사한 CNV를 보이고, N1DT1B의 절반을 나타내는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라, DH20, N1BT1A, N1BT1D, #332 및 #337에서의 CNV는 0에 가까운 것을 확인하였다. 이러한 qPCR 분석 결과는 선별된 11개의 밀 유전자원 계통에서 1D 오메가-5 글리아딘 유전자가 결실되었음을 나타내고, 일부 밀 유전자원 계통에서는 1B 오메가-5 글리아딘 유전자도 결실되어 있음을 나타낸다.As a result, all 11 wheat genetic resource lines had CNVs close to 0 in the 1D omega-5 gliadin gene-specific qPCR primer set, such as N1DT1A and N1DT1B, which have 1D chromosomes missing (null), which were replicated in the selected lines. It indicates that the number has decreased. In addition, the 1B omega-5 gliadin gene-specific qPCR primer set showed CNVs similar to CS and N1DT1A in the remaining 9 wheat genetic resource lines except #332 and #337, which are 1BL.1RS translocation lines, and CNVs similar to N1DT1A in N1DT1B. It was confirmed that it represents half. In addition, CNVs in DH20, N1BT1A, N1BT1D, #332, and #337 were confirmed to be close to 0. These qPCR analysis results indicate that the 1D omega-5 gliadin gene was deleted in the 11 selected wheat genetic resource lines, and that the 1B omega-5 gliadin gene was also deleted in some wheat genetic resource lines.
실시예 4. 대조군 계통들에서의 2-DE 및 2-D 면역블랏(immunoblot) 분석Example 4. 2-DE and 2-D immunoblot analysis in control strains
11개의 밀 유전자원 계통에서 오메가-5 글리아딘 유전자가 결실되었음을 더 증명하기 위해, 먼저 대조군 계통에서의 2차원 전기영동(2-D electrophoresis; 2DE)과 오메가-5 글리아딘 특이 항체를 사용한 2-D 면역블랏(immunoblot) 분석을 실시하였다(도 4).To further prove that the omega-5 gliadin gene was deleted in the 11 wheat germline lines, we first used 2-D electrophoresis (2DE) in the control line and an omega-5 gliadin-specific antibody. 2-D immunoblot analysis was performed (Figure 4).
1B 및 1D 염색체의 오메가-5 글리아딘 유전자를 모두 포함하고 있는 CS, 1B 염색체의 오메가-5 글리아딘 유전자만을 포함하는 CS의 nullisomic-tetrasomic 계통(N1DT1A 및 N1DT1B), 및 1D 염색체의 오메가-5 글리아딘 유전자만을 포함하는 DH20 밀 계통을 대조군으로 사용하였다. CS containing both omega-5 gliadin genes from chromosomes 1B and 1D, nullisomic-tetrasomic lines of CS containing only the omega-5 gliadin gene from chromosome 1B (N1DT1A and N1DT1B), and omega-5 gliadin genes from chromosome 1D. 5 The DH20 wheat line containing only the gliadin gene was used as a control.
도 4에서 보는 바와 같이 2차원 전기영동 분석에서는, 1B 오메가-5 글리아딘 영역은 빨간색 타원형으로, 1D 오메가-5 글리아딘 영역은 파란색 타원형으로 표시하였다. 1B 오메가-5 글리아딘은 1B 및 1D 오메가-5 글리아딘 유전자가 모두 정상적으로 발현되는 CS에서 명확하게 관찰되었다. 마찬가지로, 1D 염색체가 결실된 N1DT1A 및 N1DT1B에서는 1B 오메가-5 글리아딘만이 관찰되었다. 한편, 1B 염색체에 존재하는 Glu-B3 및 Gli-B1 유전자좌가 결실된 DH20의 경우, 1B 오메가-5 글리아딘 영역은 2D 겔에서 관찰되지 않았다. As shown in Figure 4, in the two-dimensional electrophoresis analysis, the 1B omega-5 gliadin region was indicated by a red oval, and the 1D omega-5 gliadin region was indicated by a blue oval. 1B omega-5 gliadin was clearly observed in CS where both 1B and 1D omega-5 gliadin genes were expressed normally. Likewise, only 1B omega-5 gliadin was observed in N1DT1A and N1DT1B, which had chromosome 1D deleted. Meanwhile, in the case of DH20, in which the Glu-B3 and Gli-B1 loci present on chromosome 1B were deleted, the 1B omega-5 gliadin region was not observed in the 2D gel.
이들 대조군 계통의 오메가-5 글리아딘에 대한 단일클론항체와의 면역반응성을 평가하기 위하여 2-D 면역블랏(immunoblot) 분석을 추가적으로 수행하였고, 1B 오메가-5 글리아딘의 반응성은 빨간색 타원형으로, 1D 오메가-5 글리아딘의 반응성은 파란색 타원형으로 표시하였다. 예상한 바와 같이, 단일클론항체는 CS의 1B 및 1D 오메가-5 글리아딘의 단백질과 강하게 반응하였다. 또한, 1D 염색체가 각각 1A 및 1B 염색체로 치환된 NIDT1A 및 NIDT1B에서는 1B 오메가-5 글리아딘만이 반응한 반면, Glu-B3 및 Gli-B1 유전자좌가 결여된 DH20 계통에서는 1D 오메가-5 글리아딘만이 강하게 반응하는 것으로 나타났다. To evaluate the immunoreactivity of these control strains with monoclonal antibodies against omega-5 gliadin, 2-D immunoblot analysis was additionally performed, and the reactivity of 1B omega-5 gliadin is indicated by the red oval. , the reactivity of 1D omega-5 gliadin is indicated by a blue oval. As expected, the monoclonal antibody reacted strongly with the 1B and 1D omega-5 gliadin proteins of CS. Additionally, only 1B omega-5 gliadins responded in NIDT1A and NIDT1B, in which the 1D chromosome was replaced with 1A and 1B chromosomes, respectively, whereas in the DH20 line lacking the Glu-B3 and Gli-B1 loci, 1D omega-5 gliadins responded. Only Dean appeared to react strongly.
실시예 5. 선별된 밀 계통들에서의 2-DE 및 2-D 면역블랏(immunoblot) 분석Example 5. 2-DE and 2-D immunoblot analysis in selected wheat lines
실시예 4의 대조군 계통에 대한 2차원 전기영동(2-DE) 및 2-D 면역블랏 분석 결과를 고려하여, 실시예 1에서 선별된 11개의 밀 유전자원에서 오메가-5 글리아딘 단백질의 발현을 확인하기 위해 마찬가지로 2차원 전기영동 및 오메가-5 글리아딘 특이 항체를 사용한 2D 면역블랏(immunoblot) 분석을 실시하였다(도 5 및 도 6). Expression of omega-5 gliadin protein in 11 wheat genetic resources selected in Example 1, considering the results of two-dimensional electrophoresis (2-DE) and 2-D immunoblot analysis for the control line in Example 4 To confirm, two-dimensional electrophoresis and 2D immunoblot analysis using omega-5 gliadin-specific antibodies were similarly performed (Figures 5 and 6).
2-DE 분석에서, 1BL.1RS 전좌(translocation) 계통인 #332와 #337을 제외한 나머지 9개의 밀 유전자원 계통에서는 1B 오메가-5 글리아딘만이 발현되는 것을 확인하였고, 1D 오메가-5 글리아딘은 결손되었음을 확인하였다. 본 분석 결과는 PCR 분석 및 qPCR을 이용한 CNV 분석 결과와 일치함을 나타내었다.In 2-DE analysis, it was confirmed that only 1B omega-5 gliadin was expressed in the remaining 9 wheat genetic resource lines, excluding #332 and #337, which are 1BL.1RS translocation lines, and 1D omega-5 gliadin. It was confirmed that Riadin was defective. The results of this analysis were consistent with the results of CNV analysis using PCR analysis and qPCR.
2-D 면역불랏 분석에서, 1BL.1RS 전좌(translocation) 계통인 #332와 #337을 제외한 나머지 9개의 밀 유전자원 계통들에서, 1B 오메가-5 글리아딘이 단일클론항체와 강하게 반응하였다. 대조적으로, CS 및 DH20에서 관찰된 1D 오메가-5 글리아딘의 면역반응성 신호는 11개의 밀 유전자원 계통 모두에서 관찰되지 않았으며, 이는 1D 오메가-5 글리아딘 유전자가 존재하지 않음을 나타낸다.In 2-D immunoblot analysis, 1B omega-5 gliadin reacted strongly with monoclonal antibody in the remaining nine wheat germline lines, except for #332 and #337, which are 1BL.1RS translocation lines. In contrast, the immunoreactive signal for 1D omega-5 gliadin observed in CS and DH20 was not observed in all 11 wheat germline lines, indicating that the 1D omega-5 gliadin gene is not present.
실시예 6. 선별된 밀 계통들에서의 글리아딘 분획 조성 분석Example 6. Analysis of gliadin fraction composition in selected wheat lines
선별된 밀 계통 및 대조군 계통에서 글리아딘 분획의 조성을 평가하기 위하여 총 글리아딘 분획을 3회 추출하고 RP-UPLC로 분석하였다(도 7). 피크의 명확한 감소 또는 결실은 크로마토그램에 빨간색 화살표로 나타내었으며, 1BL.1RS 전좌(translocation)에 의한 오메가-세칼린(secalin) 피크는 파란색 화살표로 표시하였다.To evaluate the composition of the gliadin fraction in selected wheat lines and control lines, the total gliadin fraction was extracted three times and analyzed by RP-UPLC (Figure 7). A clear reduction or deletion of the peak is indicated by a red arrow in the chromatogram, and the omega-secalin peak due to 1BL.1RS translocation is indicated by a blue arrow.
오메가-5 글리아딘의 피크는 1BL.1RS 전좌(translocation)를 포함하는 #332 및 #337을 제외한 나머지 9개의 선별된 밀 계통에서 관찰될 수 있었으며, 이는 1B 오메가-5 글리아딘 유전자는 1D 오메가-5 글리아딘 유전자가 없는 경우 일차적인 오메가-5 글리아딘임을 나타낸다. 이러한 관찰은 1D 염색체가 결실된 N1DT1A 및 N1DT1B에서도 확인되었으며, 이 결과는 9개의 선별된 밀 계통, N1DT1A 및 N1DT1B의 2-DE 및 2-D 면역블랏 분석의 결과와 일치하였다.The peak of omega-5 gliadin could be observed in the remaining 9 selected wheat lines except #332 and #337, which contain the 1BL.1RS translocation, indicating that the 1B omega-5 gliadin gene is present in the 1D Absence of the omega-5 gliadin gene indicates primary omega-5 gliadin. This observation was also confirmed in N1DT1A and N1DT1B with 1D chromosome deletion, and these results were consistent with the results of 2-DE and 2-D immunoblot analysis of nine selected wheat lines, N1DT1A and N1DT1B.
흥미롭게도, 오메가-1,2 글리아딘 피크는 7개의 밀 계통(#5, #205, #212, #241, #307, #479 and #572)에서 상당히 감소하였다. 정량적으로, 총 글리아딘 함량에서 오메가-1,2 글리아딘의 비중은 4.74% 내지 6.05%의 범위로 나타났으며, 이것은 양성 대조군으로 사용된 8개의 빵밀 품종의 평균 값인 11.56%의 절반으로 나타났다.Interestingly, omega-1,2 gliadin peaks were significantly reduced in seven wheat lines (#5, #205, #212, #241, #307, #479 and #572). Quantitatively, the proportion of omega-1,2 gliadins in total gliadin content ranged from 4.74% to 6.05%, which is half of the average value of 11.56% for the eight bread wheat cultivars used as positive controls. appear.
1BL.1RS 전좌(translocation)를 포함하는 #332, #337 및 대조군 밀 품종인 Clement에서는, 오메가-세칼린(secalin) 피크가 관찰되었으며, 이는 오메가-5 글리아딘이 호밀(rye)의 오메가-세칼린으로 대체되었기 때문인 것으로 보인다. #332 및 #337의 오메가-5 글리아딘 영역에서는 1B 및 1D 오메가-5 글리아딘 유전자가 존재하지 않기 때문에 피크의 흔적만이 나타나며, 이러한 결과는 오메가-5 글리아딘에 대한 단일클론항체를 사용한 2-D 면역블랏 분석의 결과와 일치하였다.In #332, #337, and the control wheat cultivar Clement containing the 1BL.1RS translocation, omega-secalin peaks were observed, indicating that omega-5 gliadins are similar to the omega-5 gliadins in rye. This appears to be because it was replaced by secalin. In the omega-5 gliadin regions of #332 and #337, only traces of peaks appear because the 1B and 1D omega-5 gliadin genes do not exist, and these results are consistent with the monoclonal antibody against omega-5 gliadin. This was consistent with the results of 2-D immunoblot analysis using .
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As above, specific parts of the content of the present invention have been described in detail, and those skilled in the art will understand that these specific techniques are merely preferred embodiments and do not limit the scope of the present invention. It will be obvious. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
서열목록 전자파일 첨부Sequence list electronic file attached
Claims (12)
상기 오메가-5 글리아딘 유전자가 결실된 밀 유전자원 선별은 유전자 복제수 변이를 분석함으로써 선별하는 것인, 프라이머 세트.According to paragraph 1,
A primer set in which selection of wheat genetic resources in which the omega-5 gliadin gene is deleted is performed by analyzing gene copy number variation.
상기 서열번호 1 및 서열번호 5로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍은 1D 염색체에 암호화된 오메가-5 글리아딘 유전자에 특이적인 것인, 프라이머 세트.According to paragraph 1,
A primer set in which the oligonucleotide primer pair represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 5 is specific for the omega-5 gliadin gene encoded in the 1D chromosome.
상기 서열번호 4 및 서열번호 6으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍은 1B 염색체에 암호화된 오메가-5 글리아딘 유전자에 특이적인 것인, 프라이머 세트.According to paragraph 1,
A primer set in which the oligonucleotide primer pair represented by SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 6 is specific for the omega-5 gliadin gene encoded on chromosome 1B.
상기 조성물은 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 더 포함하는 것인, 조성물.According to clause 5,
The composition further includes a pair of oligonucleotide primers represented by SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8.
상기 키트는 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transcription PCR) 키트, 중합효소 연쇄반응(PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(RQ-PCR) 키트, 역 중합효소연쇄반응(inverse PCR) 키트 및 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR) 키트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 키트.In clause 7,
The kit includes a reverse transcription PCR kit, polymerase chain reaction (PCR) kit, real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) kit, and real-time polymerase chain reaction quantitative test (RQ-PCR). A kit, which is at least one selected from the group consisting of a kit, an inverse PCR kit, and a multiplex PCR kit.
(b) 상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭된 산물을 정제하여 유전자 복제수 변이를 확인하는 단계;를 포함하는 오메가-5 글리아딘 유전자가 결실된 밀 유전자원을 선별하는 방법.(a) isolating nucleic acids from a target sample;
(b) using the isolated nucleic acid as a template and performing an amplification reaction using the primer set of claim 1 to amplify the target sequence; and
(c) purifying the amplified product to confirm gene copy number variation. A method of selecting wheat genetic resources with a deletion of the omega-5 gliadin gene, including the step of:
상기 (b)의 증폭하는 단계는 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 증폭반응을 수행하는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.According to clause 9,
The amplifying step of (b) further includes performing an amplification reaction using the primer pair represented by SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8.
상기 (b)의 증폭하는 단계는 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는 것인, 방법.According to clause 9,
The amplifying step of (b) includes performing a real-time polymerase chain reaction.
상기 (c)의 유전자 복제수 변이를 확인하는 단계는, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 얻어진 증폭된 산물의 유전자 복제수를 기준으로, 상기 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 얻어진 증폭된 산물의 상대적 유전자 복제수가 1 미만이면 오메가-5 글리아딘 유전자가 감소 또는 결실된 밀 유전자원인 것으로 판단하는 단계를 포함하는 것인, 방법.According to clause 9,
The step of confirming the gene copy number variation in (c) is based on the gene copy number of the amplified product obtained using the primer pair represented by SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, using the primer set of paragraph 1. A method comprising determining that the omega-5 gliadin gene is a reduced or deleted wheat genetic resource if the relative gene copy number of the amplified product obtained is less than 1.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20240086809A true KR20240086809A (en) | 2024-06-19 |
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