KR20240076377A

KR20240076377A - 인간 혈청 알부민을 이용한 면역억제 t 세포의 대량 생산 방법

Info

Publication number: KR20240076377A
Application number: KR1020230156451A
Authority: KR
Inventors: 김정아
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2022-11-23
Filing date: 2023-11-13
Publication date: 2024-05-30

Abstract

본 발명은 인간 혈청 알부민을 이용한 면역 억제 T 세포의 대량 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 과립구 집락자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)를 투여한 개체로부터 수득한 말초 혈액 조혈모세포(peripheral blood stem cell, PBSC)를 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA) 또는 HSA와 메르캅토에탄올을 포함하는 배지에 배양할 시 면역 억제 효과를 가지는 면역 억제 T 세포를 대량으로 생산할 수 있으며, 상기 면역 억제 T세포는 우수한 급성이식편대숙주병 치료 효과를 보임을 확인한 바, 본 발명은 급성 이식편대숙주병 등 면역 질환 치료에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

인간 혈청 알부민을 이용한 면역억제 T 세포의 대량 생산 방법{A method for mass production of immune inhibitory T cells using human serum albumin}

본 발명은 인간 혈청 알부민을 이용한 면역억제 T 세포의 대량 생산 방법에 관한 것이다.

급성 이식편대숙주병(acute graft-versus-host disease, aGVHD)은 동종 조혈모세포 이식 후 이식된 면역세포와 환자의 체내 세포간의 조직적합항원(major histocompatibility complex, MHC)이 일치하지 않아 발생하는 면역 반응이다. 이식편대숙주병 환자의 약 20%는 통상적으로 사용되는 스테로이드 치료에 반응하지 않아 여러 종류의 면역 억제제를 장기간 사용하게 되고, 이로 인한 부작용으로 삶의 질이 저하되는 것은 물론 결국에는 감염으로 사망에 이르게 된다. 이식편대숙주병으로 인한 장기 손상을 막고 생존율을 향상시키기 위해서는 여러 면역 억제제들을 병합하여 사용하기 보다는, 면역 세포 간의 불균형을 교정해 줄 수 있는 세포 치료가 가장 이상적이다. 하지만, 현재 세포 치료제로 사용되고 있는 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)는 치료 효과가 일시적이고 미미하여 임상에서는 널리 사용되고 있지 못하고 있다.

한편, 최근의 연구보고들에 의하면 세포 표면에 PD1, TIM3, TIGIT, LAG3와 같은 표면 항원들이 발현된 T 림프구들은 다른 T 림프구와는 달리 면역 반응을 억제시키는 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 그러나, 면역 억제 효과를 가지는 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 세포는 혈액 내에 매우 적은 양이 존재하기 때문에(CD3⁺ 림프구 내 3.3±2.9%) 임상에서 세포 치료제로 사용하기 어려운 문제가 있다.

이에, 면역 억제 효과가 우수한 T세포의 대량 생산을 위해 연구한 결과, 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA) 및 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)를 포함하는 배지로 CD3⁺ 림프구를 배양할 경우, 표면항원이 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 림프구와 CD3⁺PD1⁺TIM3^- 림프구와 같은 면역억제 T 림프구가 현저하게 증가함을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

한국공개특허 제2016-0029017호

본 발명의 목적은 면역억제 T세포의 대량 생산 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 생체외(In vitro)에서 T세포를 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺, CD3⁺PD1⁺TIM3^- 및 CD3⁺PD1^-TIM3^-로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 표현형을 갖는 T세포로 유도하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 생체외(In vitro)에서 T세포를 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺의 표현형을 갖는 T세포로 유도하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 면역억제 T 세포의 대량 생산용 배지 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 면역억제 T 세포의 대량 생산용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺, CD3⁺PD1⁺TIM3^- 및 CD3⁺PD1^-TIM3^-로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 표현형을 갖는 면역억제 T세포 증식용 배지 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺의 표현형을 갖는 면역억제 T세포 증식용 배지 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺, CD3⁺PD1⁺TIM3^- 및 CD3⁺PD1^-TIM3^-로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 표현형을 갖는 면역억제 T세포 증식용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺의 표현형을 갖는 면역억제 T세포 증식용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 자가면역질환 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 면역억제 T세포의 대량 생산 방법을 제공한다: 개체에서 분리된 시료로부터 CD3⁺ 세포를 분류하는 단계; 및 상기 CD3⁺ 세포를 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)이 포함된 배지에서 배양하는 단계.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 면역억제 T세포의 대량 생산 방법을 제공한다: 과립구 집락자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)를 투여한 개체에서 분리된 시료로부터 CD3⁺ 세포를 분류하는 단계; 및 상기 CD3⁺ 세포를 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA) 및 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)이 포함된 배지에서 1일 내지 7일동안 배양하는 단계.

또한, 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 생체외(In vitro)에서 T세포를 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺, CD3⁺PD1⁺TIM3^- 및 CD3⁺PD1^-TIM3^-로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 표현형을 갖는 T세포로 유도하는 방법을 제공한다: 과립구 집락자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)를 투여한 개체에서 분리된 시료로부터 CD3⁺ 세포를 분류하는 단계; 및 상기 CD3⁺ 세포를 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA) 및 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)이 포함된 배지에서 1일 내지 3일동안 배양하는 단계.

또한, 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 생체외(In vitro)에서 T세포를 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺의 표현형을 갖는 T세포로 유도하는 방법을 제공한다: 과립구 집락자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)를 투여한 개체에서 분리된 시료로부터 CD3⁺ 세포를 분류하는 단계; 및 상기 CD3⁺ 세포를 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA) 및 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)이 포함된 배지에서 4일 내지 7일동안 배양하는 단계.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 포함하는, 면역억제 T 세포의 대량 생산용 배지 조성물을 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 과립구 집락자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF) 및 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 포함하는, 면역억제 T 세포의 대량 생산용 키트를 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 포함하며, 말초 혈액 조혈모세포(peripheral blood stem cell, PBSC)를 4일 내지 7일간 배양하는 것을 특징으로 하는, CD3⁺PD1⁺TIM3⁺의 표현형을 갖는 면역억제 T세포 증식용 배지 조성물을 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 과립구 집락자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF) 및 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 포함하며, 말초 혈액 조혈모세포(peripheral blood stem cell, PBSC)를 1일 내지 3일간 배양하는 것을 특징으로 하는, CD3⁺PD1⁺TIM3⁺, CD3⁺PD1⁺TIM3^- 및 CD3⁺PD1^-TIM3^-로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 표현형을 갖는 면역억제 T세포 증식용 키트를 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 과립구 집락자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF) 및 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 포함하며, 말초 혈액 조혈모세포(peripheral blood stem cell, PBSC)를 4일 내지 7일간 배양하는 것을 특징으로 하는, CD3⁺PD1⁺TIM3⁺의 표현형을 갖는 면역억제 T세포 증식용 키트를 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 면역억제 T세포의 대량 생산 방법을 통해 제조된 면역억제 T세포를 포함하는, 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 면역억제 T세포의 대량 생산 방법을 통해 제조된 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺의 표현형을 갖는 면역억제 T세포를 포함하는, 자가면역질환 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공한다.

본 발명은 과립구 집락자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)를 투여한 개체로부터 수득한 말초 혈액 조혈모세포(peripheral blood stem cell, PBSC)를 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA) 또는 HSA와 메르캅토에탄올을 포함하는 배지에 배양할 시 면역 억제 효과를 가지는 면역 억제 T 세포를 대량으로 생산할 수 있으며, 상기 면역 억제 T세포는 우수한 급성이식편대숙주병 치료 효과를 보임을 확인하였다.

도 1은 G-CSF mobilized 말초 혈액 조혈모세포(G-PBSC)에서 분리한 CD3⁺ 림프구를 HSA(human serum albumin)을 포함하는 배지 또는 HSA 및 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)을 포함하는 배지로 배양한 경우, 세포수를 확인한 결과이다.
도 2는 정상인의 혈액에서 분리한 CD3⁺ 림프구(CD3⁺ PBSC), 배양전의 CD3⁺G-PBSC(D0 CD3⁺G-PBSC) 및 본 발명에 따른 방법으로 4일간 배양한 CD3⁺G-PBSC(D4 CD3⁺G-PBSC)내의 CD3⁺PD1+, CD3⁺PD1⁺TIM3⁺, CD3⁺PD1⁺LAG3⁺ 및 CD3⁺PD1⁺TIGIT⁺ 림프구의 개수를 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 방법으로 4일간 배양한 CD3⁺G-PBSC에서 분리한 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 및 CD3⁺PD1^-TIM3^- 림프구에서 측정한 혼합림프구 반응 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 방법으로 4일간 배양한 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 림프구에서 발현되는 TIGIT 및 LAG3 표면항원을 확인한 도이다.
도 5는 배양전의 CD3⁺G-PBSC(대조군) 및 본 발명에 따른 방법으로 2일 혹은 4일간 배양한 CD3⁺G-PBSC에서 측정한 혼합 림프구 반응을 확인한 도이다.
도 6은 배양전의 CD3⁺G-PBSC(대조군), 본 발명에 따른 방법으로 2일, 4일간 배양한 CD3⁺G-PBSC세포 내의 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺, CD3⁺PD1⁺TIM3^-, CD3⁺PD1^-TIM3^- 림프구의 개수를 나타낸 도이다.
도 7는 본 발명에 따른 방법으로 2일 혹은 4일간 배양한 CD3⁺G-PBSC에서 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺, CD3⁺PD1^-TIM3^- 및 CD3⁺PD1⁺TIM3^-림프구를 각각 분리한 뒤 각 림프구에서 혼합 림프구 반응을 측정한 결과와, 분리한 림프구를 세포 표면항원 발현에 따라 anti-PD1 mAb 혹은 anti-Tim3 mAb로 처리한 뒤 측정한 혼합 림프구 반응 결과이다.
도 8은 배양전의 CD3⁺G-PBSC에서 CD3⁺PD1-TIM3-와 CD3⁺PD1⁺TIM3^- 림프구만을 분리하여 본 발명에 따른 방법으로 4일간 배양한 뒤, CD3⁺PD1^-TIM3^-와 CD3⁺PD1⁺TIM3^- 림프구에서 분화되는 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 림프구의 양을 측정한 결과이다.
도 9는 이종이식 aGVHD 마우스 모델(NOD-scid IL-2Rγ null)을 이용하여, 본 발명에 따른 방법으로 4일간 배양한 CD3⁺G-PBSC 세포의 치료 효과를 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 이종이식 aGVHD 마우스 모델(NOD-scid IL-2Rγ null)을 이용하여, 본 발명에 따른 방법으로 2일간 배양한 CD3⁺G-PBSC 세포의 치료 효과를 평가한 도이다.

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 이하의 설명에 있어, 당업자에게 주지 저명한 기술에 대해서는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다.

따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명은 하기 단계를 포함하는, 면역억제 T세포의 대량 생산 방법을 제공한다: 개체에서 분리된 시료로부터 CD3⁺ 세포를 분류하는 단계; 및 상기 CD3⁺ 세포를 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)이 포함된 배지에서 배양하는 단계.

본 발명에 있어서, 상기 용어 “CD3”는 T 세포 공동 수용체로서, 세포독성 T 세포 및 도움 T 세포의 활성화에 관여하는 분자를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 용어 "인간 혈청 알부민"은 인간의 혈청 단백질의 대부분을 구성하는 수용성 단백질로서, 혈액의 삼투압 조절 및 혈액을 통해 물질을 수송할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 시료는 혈액, 조직, 세포, 혈장, 대변, 소변 및 정액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 시료는 혈액 및 말초 혈액 조혈모세포(peripheral blood stem cell, PBSC)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있고, 보다 바람직하게는 PBSC일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 용어 “말초 혈액 조혈모세포(peripheral blood stem cell, PBSC)”는 말초 혈관에 존재하는 조혈모세포를 의미한다. 상기 조혈모세포는 혈액을 생산하는 줄기 세포로서, 적혈구, 백혈구, 혈소판, T 세포 등 혈액 내 모든 세포를 생산하는 줄기 세포를 의미한다.

더불어 상기 개체는 건강한 동종 개체일 수 있다. 바람직하게는 상기 개체는 본 발명의 면역억제 T세포가 투여될 개체와 동종의 건강한 개체일 수 있다.

더불어 상기 개체는 CD3⁺ 세포가 말초혈액내로 가동화된 것을 특징으로 한다. 상기 가동화란 CD3⁺ 세포가 말초혈액내로 이동한 것을 의미할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 CD3⁺ 세포의 말초혈액내로의 가동화는 당 분야에 공지된 방법이라면 제한없이 사용가능하다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 가동화를 위하여 백혈구 성장인자(leucocyte growth factor)를 개체에 투여하였다.

따라서 상기 개체는 백혈구 성장인자(leucocyte growth factor)가 투여된 개체일 수 있으며, 상기 백혈구 성장인자(leucocyte growth factor)는 과립구 집락자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 용어 “과립구 집락자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)”는 당단백질의 일종으로 조혈모세포의 증식 및 분화를 촉진하며, 호중구의 생존능을 항진시켜 호중구감소증의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.

한편, 본 발명의 일실시예에 따르면 본 발명의 면역억제 T 세포의 대량 생산 방법에 있어서, CD3⁺ 림프구 배양 시 HSA를 포함한 배지로 배양하는 경우, 배양전 대비 세포 수가 0.4±0.1배 증가됨을 확인하였다. 더불어 HSA와 메르캅토에탄올을 포함하는 배지로 배양하는 경우, 배양전 대비 세포 수가 1.0±0.6배 증가함을 확인한 바, CD3⁺ 림프구의 수율이 현저히 증가됨을 확인하였다.

따라서 본 발명의 면역억제 T 세포의 대량 생산 방법에 있어서, 상기 배지는 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)을 추가적으로 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 용어 “메르캅토에탄올(mercaptoethanol)”은 이황화결합을 환원시킬 수 있고, 수산기 라디칼을 제거할 수 있어 생물학적 환원제 및 항산화제로 활용되는 화합물을 의미한다.

상기 메르캅토에탄올의 농도는 1 μM 내지 200 μM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 메르캅토에탄올의 농도는 20 μM 내지 100 μM일 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 메르캅토에탄올의 농도는 30 μM 내지 70 μM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 상기 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)의 농도는 1 중량% 내지 10 중량%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 인간 혈청 알부민의 농도는 1 중량% 내지 8 중량%일 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 인간 혈청 알부민의 농도는 2 중량% 내지 8 중량%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 인간 혈청 알부민은 소태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)과 같은 이종 단백질이 아닌 동종 단백질로서, 임상에서 세포 치료제로 사용하기에 보다 안전하다. 또한, 상기 인간 혈청 알부민의 농도가 1 중량% 내지 10 중량%일 경우, 면역억제 T 세포의 생산 수율이 현저하게 증가될 수 있어, 면역억제 T 세포의 대량 생산에 유용하게 활용될 수 있다.

한편, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 정상인의 말초혈액에서는 1×10³ 개의 CD3⁺G-PBSC 세포당 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 림프구가 각각 2±1개로 매우 낮게 측정되었다. 그러나 정상인에게 G-CSF를 5일간 피하 주사한 뒤 CD3⁺G-PBSC를 수집하고, 이를 5% HSA과 메르캅토에탄올을 포함하는 배지로 4일간 배양할 경우, 1×10³ 개의 CD3⁺ 세포 당 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 림프구 수가 865±88 개로 측정되었다. 즉, 본 발명에 따른 방법을 통해, CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 림프구 수를 말초혈액보다 433배 증가시킬수 있고, 배양전 대비 약 13배 이상 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

더불어 본 발명의 또 다른 일실시예에 따르면, 5% HSA과 메르캅토에탄올을 포함하는 배지로 CD3⁺G-PBSC 세포를 배양하는 경우, CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 세포수는 배양시간이 경과됨에 따라 증가되었는데 배양전에는 1×10³ 개의 CD3⁺G-PBSC 당 68±8개였으나, 배양 2일 후에는 212±44개로, 배양 4일 후에는 865±88개로 증가되었다. 반면에 CD3⁺PD1⁺TIM3^- 림프구는 배양전에는 1×10³ 개의 CD3⁺G-PBSC 당 197±52개였으나, 배양 2일 후에는 172±64개로, 배양 4일 후에는 거의 모든 세포가 소실되었다. 또한 CD3⁺PD1^-TIM3^- 림프구 수는 배양전에는 1×10³ 개의 CD3⁺G-PBSC 당 735±105개였으나, 배양 2일 후에는 616±192개로, 배양 4일 후에는 67±38개로 감소되었다.

특히 또다른 일실시예에 따르면, CD3⁺G-PBSC에서 CD3⁺PD1^-TIM3^-와 CD3⁺PD1⁺TIM3^- 림프구를 분리하여 본 발명에 따른 방법으로 4일간 배양한 결과, CD3⁺PD1^-TIM3^- 림프구 중에는 70.8±3.1%의 세포가, CD3⁺PD1⁺TIM3^- 림프구 중에는 80.7±5.2%의 세포가 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 림프구로 분화되는 것을 확인하였다. 상기 결과들을 종합하면, CD3⁺PD1^-TIM3^- 림프구와 CD3⁺PD1⁺TIM3^- 림프구는 배양시간이 경과됨에 따라 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 림프구로 분화된다고 추정된다.

그러므로 본 발명에 있어서, 상기 용어 “대량 생산”은 치료 용량의 세포 수만큼 세포를 확보하는 것을 의미한다. 본 발명의 면역억제 T세포의 대량 생산 방법은, 상기 CD3⁺ 세포 분획으로부터 면역 억제 효과가 탁월한 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 림프구를 약 87% (86.5±8.8%) 포함하는 세포를 생산하는 것을 의미한다.

상기 용어 “PD1” 및 “Tim3”는 공동 억제 인자(co-inhibitory molecule)로서, 상기 인자들을 발현하는 T 세포는 과다한 면역반응을 차단하고 면역 관용 상태(tolerance)를 유지할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 용어, "면역 관용" 이란 특정 항원에 대하여 면역 반응을 나타내지 않는 상태를 의미한다. 따라서 본 발명에 따른 면역억제 T세포는 자가 항원에 대한 관용을 유도하고 T 세포의 증식을 억제하는 T세포를 의미하며, 본 발명의 목적상, 본 발명의 면역억제 T세포는 자가면역질환, 바람직하게는 이식편대숙주질환을 일으키는 자가 항원에 대하여 면역관용을 유도하는 T세포를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 배양은 1일 내지 7일동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 방법으로 1일 내지 7일동안 배양된 면역억제 T세포는 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺의 표현형을 갖는 것을 특징으로 한다.

한편, 상기 배양이 1일 내지 3일동안 수행되는 경우, 상기 면역 억제 T세포는 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺, CD3⁺PD1⁺TIM3^- 및 CD3⁺PD1^-TIM3^-로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 표현형을 가질 수 있다.

더불어 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 면역억제 T 세포의 대량 생산 방법을 제공한다: 과립구 집락자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)를 투여한 개체에서 분리된 시료로부터 CD3⁺ 세포를 분류하는 단계; 및 상기 CD3+ 세포를 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA) 및 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)이 포함된 배지에서 1일 내지 7일동안 배양하는 단계.

또한 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 생체외(In vitro)에서 T세포를 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺, CD3⁺PD1⁺TIM3^- 및 CD3⁺PD1^-TIM3^-로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 표현형을 갖는 T세포로 유도하는 방법을 제공한다: 과립구 집락자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)를 투여한 개체에서 분리된 시료로부터 CD3⁺ 세포를 분류하는 단계; 및 상기 CD3⁺ 세포를 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA) 및 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)이 포함된 배지에서 1일 내지 3일동안 배양하는 단계.

또한 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 생체외(In vitro)에서 T세포를 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺의 표현형을 갖는 T세포로 유도하는 방법을 제공한다: 과립구 집락자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)를 투여한 개체에서 분리된 시료로부터 CD3⁺ 세포를 분류하는 단계; 및 상기 CD3⁺ 세포를 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA) 및 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)이 포함된 배지에서 4일 내지 7일동안 배양하는 단계.

상기 과립구 집락자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)는 1 내지 50 μg/kg의 농도로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 1 내지 30 μg/kg의 농도로 투여될 수 있고, 보다 바람직하게는 10 μg/kg의 농도로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명은 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 포함하는, 면역억제 T 세포의 대량 생산용 배지 조성물을 제공한다.

상기 배지 조성물은 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)을 더 포함하는 것일 수 있다.

또한 상기 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)의 농도는 1 중량% 내지 10 중량%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 인간 혈청 알부민의 농도는 1 중량% 내지 8 중량%일 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 인간 혈청 알부민의 농도는 2 중량 % 내지 8 중량%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 배지 조성물은 혈액 또는 말초 혈액 조혈모세포(peripheral blood stem cell, PBSC) 배양 용도로 사용될 수 있으며, 보다 바람직하게는 PBSC 배양 용도로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 배지 조성물을 이용해 배양된 면역억제 T 세포는 CD3⁺PD1⁺Tim3⁺의 면역 표현형을 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 배지(media)는 in vitro에서 세포 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium, CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 상기 배지로는, 동물세포의 배양에 이용되는 일반적인 어떠한 배지도 사용할 수 있다. 바람직하게는, 혈청(예컨대, 우태아 혈청, 말 혈청 또는 인간 혈청)이 함유된 배지를 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 배지는, 예를 들어, RPMI 시리즈(예컨대, RPMI 1640), Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle), α-MEM, Iscove's MEM, 199 배지, CMRL 1066, F12, F10, DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium), DMEM과 F12의 혼합물, Way-mouth's MB752/1, McCoy's 5A 및 MCDB 시리즈를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 배지에는, 다른 성분, 예를 들어, 항산화제 또는 페니실린 (penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제를 포함할 수 있다.

더불어 본 발명은 과립구 집락자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF) 및 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 포함하는, 면역억제 T 세포의 대량 생산용 키트를 제공한다. 상기 키트는 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)을 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 키트에 포함되는 G-CSF, HSA 및 메르캅토에탄올의 농도는 앞서 설명한 바와 같다.

상기 키트는 상기한 것에 한정되는 것은 아니며, 다른 시약이나 기구를 포함할 수 있다. 예를 들면, 배양 대상 세포를 배양하기 위한 배양 플레이트나 면역 억제 활성을 분석법(예를 들면, 혼합 림프구 반응(mixed lymphocyte reaction, MLR) 등)에 필요한 시약을 포함할 수 있고, 배양하는 대상이 되는 PBSC를 구비하고 있을 수도 있다.

본 발명에 따른 키트의 제공형태는 G-CSF 및 HSA 또는, G-CSF, HSA 및 메르캅토에탄올을 포함하는 배지와 그외 배양에 필요한 성분 및 그 외의 시약 모두를 적절한 용량 및/또는 형태로 함유한 하나의 용기일 수 있거나, 각각 다른 용기에 의해 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 키트는 상술한 본 발명에 따른 방법을 실시하기 위한 순서 등을 기재한 설명서를 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 포함하며, 말초 혈액 조혈모세포(peripheral blood stem cell, PBSC)를 1일 내지 3일간 배양하는 것을 특징으로 하는, CD3⁺PD1⁺TIM3⁺, CD3⁺PD1⁺TIM3^- 및 CD3⁺PD1^-TIM3^-로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 표현형을 갖는 면역억제 T세포 증식용 배지 조성물을 제공한다.

더불어 본 발명은 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 포함하며, 말초 혈액 조혈모세포(peripheral blood stem cell, PBSC)를 4일 내지 7일간 배양하는 것을 특징으로 하는, CD3⁺PD1⁺TIM3⁺의 표현형을 갖는 면역억제 T세포 증식용 배지 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 면역억제 T세포 증식용 배지 조성물은 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)을 더 포함할 수 있다.

상기 HSA 및 메르캅토에탄올의 농도를 비롯한 배지 조성물에 대한 구체적인 설명은 앞서 설명한 바와 같다.

또한 본 발명은 과립구 집락자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF) 및 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 포함하며, 말초 혈액 조혈모세포(peripheral blood stem cell, PBSC)를 1일 내지 3일간 배양하는 것을 특징으로 하는, CD3⁺PD1⁺TIM3⁺, CD3⁺PD1⁺TIM3^- 및 CD3⁺PD1^-TIM3^-로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 표현형을 갖는 면역억제 T세포 증식용 키트를 제공한다.

더불어 본 발명은 과립구 집락자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF) 및 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 포함하며, 말초 혈액 조혈모세포(peripheral blood stem cell, PBSC)를 4일 내지 7일간 배양하는 것을 특징으로 하는, CD3⁺PD1⁺TIM3⁺의 표현형을 갖는 면역억제 T세포 증식용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 면역억제 T 세포 증식용 키트는 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 키트에 있어서, 상기 G-CSF, HSA 및 메르캅토에탄올의 농도를 비롯한 구체적인 설명은 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명의 또다른 일실시예에 따르면, 5% HSA 및 메르캅토에탄올이 포함된 배지에서 2일 혹은 4일간 배양한 전체 CD3⁺G-PBSC에 대한 혼합 림프구 반응을 시행한 결과, 배양전의 CD3⁺G-PBSC(대조군)의 경우는 0.5±0.1%의 T 세포가 동종 단핵구에 대해 증식하지 않는 것으로 측정되었으며, 4일간 배양한 CD3⁺G-PBSC의 경우는 13.9±6.4%가, 2일간 배양한 CD3⁺G-PBSC의 경우는 43.2±10.1%의 T 세포가 동종 단핵구에 대해 증식하지 않는 것으로 확인되었다. 이상의 결과에서 2일간 배양한 CD3⁺G-PBSC가 면역반응 억제효과가 가장 우수하였으며, 이 세포의 면역반응 억제효과는 4일간 배양 후 분리한 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 림프구에서보다 우수하였다. 즉, 본 발명에 따른 방법을 통해 배양한 T 세포는 우수한 면역반응 억제 효과를 보이며, 그 효과가 2일간 배양한 T 세포가 월등히 우수함을 확인하였다.

또한 본 발명의 또다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 방법을 따라 배양한 CD3⁺G-PBSC 세포를 이종이식 aGVHD 마우스 모델에 주입한 결과, 마우스의 생존이 현저히 증가함을 확인하였다. 특히 2일간 배양한 CD3⁺G-PBSC를 1×10⁷ cells/kg 용량으로 주입한 실험군의 경우, 세포주입 80일 시점에서 대상 마우스가 100%가 생존한바, 4일간 배양한 CD3⁺G-PBSC보다 현저히 우수한 치료 효과를 나타내었다. 즉, 본 발명에 따른 방법을 통해 배양한 T 세포는 우수한 이식편대숙주질환 치료 효과를 보이며, 그 효과가 2일간 배양한 T 세포가 월등히 우수함을 확인하였다.

따라서 본 발명은 본 발명에 따른 면역억제 T세포의 대량 생산 방법을 통해 제조된 면역억제 T세포를 포함하는, 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 상기 면역억제 T 세포는 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺의 표현형을 가지는 것을 특징으로 한다. 더불어 상기 면역억제 T 세포는 CD3⁺PD1⁺TIM3^- 및 CD3⁺PD1^-TIM3^-로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 표현형을 더 가지는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 자가면역질환은 이식편대숙주질환(graft-versus-host disease), 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis), 천식(Asthma), 피부염(Dermititis), 건선(Psoriasis), 낭섬유증(Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증(Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증(Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환(Inflammatory Bowel Dieseses), 자가면역성 당뇨 (Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증(Diabetic retinopathy), 비염(Rhinitis), 혀혈-재관류 손상 (Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술후 재협착 (Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환(Chronic obstructive pulmonary diseases; COPD), 그레이브병 (Graves disease), 위장관 알러지 (Gastrointestinal allergies), 결막염(Conjunctivitis), 죽상경화증(Atherosclerosis), 관상동맥질환(Coronary artery disease), 협심증(Angina), 암 전이 및 소동맥 질환으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 질환일 수 있고, 바람직하게는 이식편대숙주질환(graft-versus-host disease)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 용어 "이식편대숙주질환(graft-versus-host disease)"은 조혈모세포이식 시 수혈된 림프구가 면역 기능이 저하된 숙주(수혈 받은 사람의 신체)를 공격하여 발열, 발진, 간 기능 이상, 설사, 범혈구 감소증(백혈구, 적혈구, 혈소판이 모두 감소된 상태) 등의 증상을 일으키는 질환이다. 이식 후 발생하는 이식편대숙주병은 급성과 만성 두 종류가 있다. 조혈모세포이식 시에 발생하는 것 외에는 매우 드물지만 수혈 시 이식편대숙주병이 발생할 수 있는데, 수혈 후 발생하는 이식편대숙주반응은 일단 발생하면 매우 치명적이다.

본 발명의 약학적 조성물은 자가면역질환이 발병되거나, 발병할 가능성이 있는 “개체”에 투여될 수 있으며, 상기 "개체"는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있고, 본 발명의 면역억제 T세포가 유래된 개체와 동종의 개체일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 “예방”은 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 억제하거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 “치료”는 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 호전 또는 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물에는 유효성분 이외에 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 효과를 증가시킬 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학적 조성물 중 포함되는 유효성분의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학적 조성물에 0.01 ~ 5,000 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ㎍/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.

본 발명에 있어서, 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 유효성분인 면역억제 T세포 외에, 자가면역질환, 바람직하게는 이식편대숙주질환의 치료 효과 상승을 위하여 이미 안전성이 검증되고 치료 효과를 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 자가면역질환, 바람직하게는 이식편대숙주질환의 외과적 치료와 더불어 사용될 수 있다.

더불어 본 발명은 본 발명에 따른 면역억제 T세포의 대량 생산 방법을 통해 제조된 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺의 표현형을 갖는 면역억제 T세포를 포함하는, 자가면역질환 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공한다. 더불어 상기 면역억제 T 세포는 CD3⁺PD1⁺TIM3^- 및 CD3⁺PD1^-TIM3^-로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 표현형을 더 가지는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 "세포 치료제(cellular therapeutic agent)"란, 인간으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 이러한 세포가 질병의 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.

본 발명의 세포 치료제 조성물은 병변 부위에 직접 투여될 수 있으며, 이 경우 주사제 형태로 투여될 수 있다. 특히 본 발명의 세포 치료제 조성물은 본 발명에 따른 제조 방법을 통해 제조된, CD3⁺PD1⁺TIM3⁺의 표현형을 갖는 면역억제 T세포를 직접 투여하기 위하여 주사제 형태로 제형화 될 수 있으며, 이 경우, 주사제에 적합하도록 하이드로겔을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 세포 치료제에 사용할 수 있는 하이드로겔은 주사제에 적합한 당 분야에 공지된 하이드로겔을 제한없이 포함할 수 있으며, 소장점막하 조직, 히알루론산(hyalurinic acid), 카복시메틸셀룰로오스(CMC, carboxymethylcellulose), 알지네이트(alginate), 키토산(chitosan), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(poly(N-isopropylacrylamide)), β-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 플루로닉(Poly(ethylene oxide)poly(propylene oxide)poly(ethyleneoxide), Pluronic), 피브린, 폴리에틸렌옥사이드 (PEO) 및 카복시메틸셀룰로오스(CMC)와 폴리에틸렌이민(PEI)의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 세포 치료제 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있으며, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 세포 수집 및 증식 방법

정상 상태의 말초 혈액 조혈모세포(peripheral blood stem cell, PBSC) 공여자에게 G-CSF(neutrogin, 10 μg/kg)를 5일간 피하 주사한 뒤 COBE spectra 세포 분리기를 이용하여 G-CSF mobilized 말초 혈액 조혈모세포(G-PBSC)를 수집하였다. 수집한 G-PBSC에서 CD3 Dynabeads™를 이용한 자기 활성화 세포 분리(magnetic-activated cell sorting, MACS)를 사용하여 CD3⁺ 림프구를 분리하였다. 분리한 CD3⁺ 림프구를 5% HSA(human serum albumin)에서 5×10⁵ 세포수/mL의 농도로 2일 또는 4일간 배양하였다. 배양액은 2 mM L-글루타민, 25 mM HEPES(hydroxyethyl piperazine ethane sulfonicacid), 1 mM 피루브산나트륨(sodium pyruvate), 50μM 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)이 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하였다.

CD3⁺G-PBSC 림프구를 HSA 및 메르캅토에탄올을 포함한 배지로 4일간 배양한 결과, 배양 전에 비해 전체 세포 수가 1.0±0.6배 증가하였고, HSA 단독으로 배양한 경우에는 세포 수가 0.4±0.1배 증가하였다(도 1 참조). 상기 실험을 통해, CD3⁺ 림프구를 HSA과 메르캅토에탄올로 배양함으로써, CD3+ 림프구의 수율을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

<실시예 2> 증식된 세포의 표현형 확인

상기 실시예 1에서 배양한 세포에서 공동 억제 인자(co-inhibitory molecule)인 PD1, TIM3, LAG3 및 TIGIT의 발현 여부를 확인하기 위해, 형광 활성 세포 분류기(fluorescence-activated cell sorter, FACS)를 이용한 유세포 분석을 수행하였다. 이때 대조군으로서 건강한 개체(정상인)의 말초혈액의 PD1, TIM3, LAG3 및 TIGIT 발현 여부도 확인하였다.

그 결과, 정상인의 말초혈액에서는 1×10³ 개의 CD3⁺G-PBSC 세포당 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺, CD3⁺PD1⁺LAG3⁺ 및 CD3⁺PD1⁺TIGIT⁺ 림프구가 각각 2±1, 3±1 및 3±1개로 매우 낮게 측정되었다. 반면 G-CSF를 5일간 피하 주사한 뒤 G-PBSC를 수집하고 CD3⁺ 림프구를 분리한 결과, 1×10³ 개의 CD3+G-PBSC 당 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺, CD3+PD1+LAG3+ 및 CD3+PD1+TIGIT+ 림프구가 각각 68±8, 105±18 및 38±6개로 증가됨을 확인하였다. 더불어 수집된 CD3⁺G-PBSC를 5% HSA에서 4일간 배양한 결과, 1×10³ 개의 CD3⁺G-PBSC 당 CD3⁺PD1⁺LAG3⁺ 및 CD3⁺PD1⁺TIGIT⁺ 림프구 수가 각각 865±89, 295±36 또는 5±4개로 측정되었다. 이 결과로 G-CSF를 5일간 피하 주사한 뒤 수집한 G-PBSC를 5% HSA 및 50μM 메르캅토에탄올을 포함하는 배지에서 배양하는 방법을 통해, CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 림프구의 수는 말초혈액에서 보다 433배, 배양 전보다 약 13배 이상 증가되는 것을 확인하였다(도 2 참조). 더불어 배양된 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 림프구는 전체 세포의 48.9±5.2%에서 LAG3 표면항원이 발현되었으며, TIGIT은 거의 발현되지 않았다(도 4 참조).

특히 5% HSA 및 50μM 메르캅토에탄올을 포함하는 배지로 4일간 배양한 CD3⁺G-PBSC는 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 및 CD3⁺PD1^-TIM3^- 표면항원이 발현되는 두 군의 림프구로 분화되었다(도 3, 6 참조). 이에 반해 5% HSA 및 50μM 메르캅토에탄올을 포함하는 배지로 2일간 배양한 CD3⁺G-PBSC는 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺, CD3⁺PD⁺TIM3^- 및 CD3⁺PD1^-TIM3^- 표면항원이 발현되는 세 군의 림프구로 분화되었다(도 6 참조).

5% HSA 및 50μM 메르캅토에탄올을 포함하는 배지로 배양한 CD3⁺G-PBSC 중 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 세포수는 배양시간이 경과됨에 따라 증가되었는데 배양전에는 1×10³ 개의 CD3⁺G-PBSC 당 68±8개였으나, 배양 2일 후에는 212±44개로, 배양 4일 후에는 865±88개로 증가되었다(도 6 참조). 반면에 CD3⁺PD1⁺TIM3^- 림프구는 배양전에는 1×10³ 개의 CD3⁺G-PBSC 당 197±52개였으나, 배양 2일 후에는 172±64개로, 배양 4일 후에는 거의 모든 세포가 소실되었다(도 6 참조). 또한 CD3⁺PD1^-TIM3^- 림프구 수도 배양시간이 경과됨에 따라 감소하였는데 배양전에는 1×10³ 개의 CD3⁺G-PBSC 당 735±105개였으나, 배양 2일 후에는 616±192개로, 배양 4일 후에는 67±38개로 감소되었다(도 6 참조). 상기 결과들을 종합하면, CD3⁺PD1^-TIM3^- 림프구와 CD3⁺PD1⁺TIM3^- 림프구는 배양시간이 경과됨에 따라 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 림프구로 분화된다고 추정할 수 있다. 이를 증명하기 위해 배양전의 CD3⁺G-PBSC에서 CD3⁺PD1^-TIM3^-와 CD3⁺PD1⁺TIM3^- 림프구를 분리하여 4일간 배양하였다. 그 결과, 4일간 배양 후에는 CD3⁺PD1^-TIM3^- 림프구 중에는 70.8±3.1%의 세포가, CD3⁺PD1⁺TIM3^-림프구 중에는 80.7±5.2%의 세포가 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 림프구로 분화되는 것을 확인할 수 있었다(도 8 참조).

<실시예 3> 혼합 림프구 반응을 이용하여, 배양한 림프구의 면역 반응 억제 효과 확인

혼합 림프구 반응(mixed lymphocyte reaction, MLR)을 이용하여, 본 발명에 따른 방법으로 배양한 세포의 면역반응 억제효과를 확인하였다. 상기 혼합 림프구 반응은 동종 항원에 대한 T 림프구의 면역 반응을 측정하는 in vitro 실험 방법이다. 구체적으로, T 림프구를 다른 사람의 단핵구(CD14⁺ 세포)와 혼합하여 배양하면, 두 세포 간의 MHC가 일치하지 않아 배양 중인 T 림프구가 다른 사람의 단핵구를 동종 항원으로 인식하여 증식하게 되는데, 이때 T 림프구의 증식 정도를 측정함으로써 동종 항원에 대한 T 림프구의 면역 반응을 측정하게 된다. T 림프구 외에 동종 단핵구가 증식되는 것을 방지하기 위해 동종 단핵구는 방사선을 조사한다. 이때 5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester(CFSE)로 T 림프구를 염색하여 T 림프구의 증식 정도를 측정한다. 염색된 CFSE는 세포막을 투과하여 세포 내의 단백질과 비특이적으로 결합하여 남아있다가, 세포가 분열할 때마다 CFSE의 형광량이 절반으로 감소된다. 이를 이용하여 배양 후 세포 내의 CFSE 형광도를 측정하면 림프구의 증식 정도를 확인할 수 있다. 이를 기반으로, 혼합 림프구 반응을 위해 본 발명의 방법에 따라 배양한 T 림프구를 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺, CD3⁺PD1^-TIM3^- 및 CD3⁺PD1⁺TIM3^- 림프구로 분리하였고, 분리한 림프구를 동종 단핵구(CD14⁺ 세포)와 세포수 1:2의 비율로 혼합하여 3일간 배양하였다. 이후, 배양된 전체 세포를 수거하여 CSFE 형광도 수준을 측정하였고, 동종 항원에 반응하여 증식하지 않는 림프구의 분획을 %로 측정하였다. anti-PD1 mAb와 anti-Tim3 mAb는 각각 20μg/mL과 40μg/mL의 농도로 5% HSA 세포 배양액에 넣어 사용하였다.

5% HSA 및 50μM 메르캅토에탄올을 포함하는 배지로 4일간 배양한 CD3⁺G-PBSC는 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 및 CD3⁺PD1^-TIM3^-인 두 군의 림프구로 분화되었다(도 3 참조). CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 및 CD3⁺PD1^-TIM3^- 림프구에서 혼합 림프구 반응을 시행한 결과, CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 림프구의 경우는 34.7±1.8%의 T 세포가 동종 단핵구에 대해 증식하지 않았으며, CD3⁺PD1^-TIM3^- 림프구의 경우는 18.7±0.6%에서 T 세포가 증식하지 않았다(도 3 참조). 이를 통해, CD3⁺G-PBSC에서 분화하는 림프구 중 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 림프구의 면역반응 억제효과가 높음을 확인하였다.

또한 배양시간에 따른 CD3⁺G-PBSC 세포의 면역반응 억제효과를 파악하기 위해 5% HSA 및 50μM 메르캅토에탄올을 포함하는 배지로 2일 혹은 4일간 배양한 CD3⁺G-PBSC 세포에 대한 혼합 림프구 반응을 시행하였다. 분석 결과, 대조군인 배양전의 CD3⁺G-PBSC의 경우는 0.5±0.1%의 T 세포가 동종 단핵구에 대해 증식하지 않는 것으로 측정되었으나, 5% HSA 및 50μM 메르캅토에탄올을 포함하는 배지로 2일간 배양한 CD3⁺G-PBSC의 경우에는 43.2±10.1%의 T 세포가 동종 단핵구에 대해 증식하지 않았고, 5% HSA 및 50μM 메르캅토에탄올을 포함하는 배지로 4일간 배양한 CD3⁺G-PBSC의 경우는 13.9±6.4%의 T 세포가 동종 단핵구에 대해 증식하지 않았다(도 5 참조). 이 결과로 2일간 배양한 CD3⁺G-PBSC가 가장 면역억제 효과가 우수함을 확인하였고(도 5 참조), 이 세포의 면역 억제효과는 4일간 배양한 뒤 분리한 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 림프구 보다도 높게 나타났다(도 3 참조).

또한, 2일간 배양한 CD3⁺G-PBSC는 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺, CD3⁺PD1^-TIM3^-와 CD3⁺PD1⁺TIM3^- 림프구, 세 군으로 분화되었다(도 6 참조). 세 군의 림프구를 분리 한 뒤 각각에서 혼합 림프구 반응을 시행한 결과, CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 림프구의 경우는 19.5±3.0%의 T 세포가 동종 단핵구에 대해 증식하지 않았고, CD3⁺PD1^-TIM3^- 림프구의 경우는 29.1±12.6%의 T 림프구가, CD3⁺PD1^-TIM3^- 림프구의 경우는 20.3±7.9%의 T 림프구가 동종 단핵구에 대해 증식하지 않는 것으로 확인되었다(도 7 참조). 혼합 림프구 반응에서 2일간 배양한 CD3⁺G-PBSC 중 43.2±10.1%의 T 림프구가 동종 단핵구에 대해 증식하지 않는 결과와 비교하면(도 5 참조), 분리된 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺, CD3⁺PD1⁺TIM3^- 및 CD3⁺PD1^-TIM3^- 림프구의 면역억제 능력은 현저히 감소되었다(도 7 참조). 상기 결과들을 종합하면, 면역반응 억제를 위해서는 본 발명의 방법으로 2일간 배양한 CD3⁺G-PBSC 전체를 사용하는 방법이 가장 효과적이라는 결론에 이르게 되었다.

또한, 4일간 배양한 CD3⁺G-PBSC 내에는 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 림프구 수가 86.5±8.8%로 확인되었으며, 배양 2일 후의 21.2±4.4% 보다 증가됨에도 불구하고, 4일간 배양한 CD3⁺G-PBSC의 면역억제 효과는 크게 감소됨을 확인하였다(도 5, 도 6 참조). 이는 배양 2일 후와 4일 후의 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 림프구가 같은 표면항원을 발현하는 세포지만 면역억제 능력은 다른 세포일수 있다는 가능성을 제시한다. 이를 증명하기 위하여, 배양 2일, 4일 후의 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 세포를 분리하여, PD1에 대한 단클론항체(anti-PD1 mAb)와 Tim3에 대한 단클론항체(anti-Tim3 mAb)를 각각 처리한 뒤 혼합림프구 반응을 시행하였다. 일반적으로 anti-PD1 mAb 혹은 anti-Tim3 mAb를 처리하면 면역억제 T 림프구의 동종면역반응 억제효과가 상쇄되어, 동종 단핵구에 반응하지 않는 T 림프구가 감소할 것으로 예상된다. 이와 같이, 배양 4일 후에 분리한 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 림프구를 anti-PD1 mAb와 anti-Tim-3 mAb로 각각 처리한 결과, 동종 단핵구에 대해 증식하지 않는 T 림프구가 각각 34.7±1.8%에서 17.7±7.0%로, 34.7±1.8%에서 15.3±4.4%로 감소되어, anti-PD1 mAb와 anti-Tim-3 mAb에 의한 동종면역반응 억제효과가 상쇄되는 것을 확인할 수 있었다. 반면에 배양 2일 후에 분리한 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺를 anti-PD1 mAb와 anti-Tim-3 mAb 로 각각 처리하였을 때, 동종 단핵구에 대해 증식하지 않는 T 림프구는 각각 19.5±3.0%에서 17.6±7.8%로, 19.5±3.0%에서 19.6±3.3%로, 19.7±3.6%로 측정되어, 예상했던 anti-PD1 mAb와 anti-Tim-3 mAb로 인한 면역반응 증가 효과는 관찰되지 않았다. 더불어 배양 2일 후의 CD3⁺G-PBSC에서 분리한 CD3⁺PD1⁺TIM3^-세포를 anti-PD1 mAb로 처리하였을 때는 동종 단핵구에 대해 증식하지 않는 T 림프구가 29.1±12.6%에서 23.0±11.1%로 감소되어, CD3⁺PD1⁺TIM3^-세포에 대한 anti-PD1 mAb의 면역반응 증강효과를 확인할 수 있었다(도 7 참조). 이러한 결과를 종합해보면, 4일간 배양한 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 림프구와는 달리 2일간 배양한 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 림프구는 anti-PD1 mAb와 anti-Tim3 mAb에 면역반응 억제효과가 상쇄되지 않는 세포로, 두 세포는 같은 표현항원을 발현하는 세포지만, 기능은 다른 종류의 세포임을 확인할 수 있었다.

<실시예 4> 이종이식 GVHD 마우스 모델을 이용한, 배양한 림프구의 면역 반응 억제 효과 확인

배양한 CD3⁺G-PBSC 세포의 치료 효과를 확인하기 위해 면역 기능이 결핍된 이종이식 aGVHD 마우스 모델(NOD-scid IL-2Rγ null)을 이용하여 실험하였다. NOD-scid IL-2Rγ null 마우스는 T 림프구 및 B 림프구의 기능이 결핍된 마우스이다. NOD-scid IL-2Rγ null 마우스에 3Gy의 방사선을 조사한 뒤, 정상 동종 개체로부터 분리한 3.5±1.8×10⁷개/kg의 PBMC를 마우스의 복강 내에 주사하여 aGVHD를 유도하였다. 이후, 본 발명의 방법에 따라 배양한 CD3⁺G-PBSC 림프구를 단계적으로 증가시켜(대조군 vs. 1×10⁶ cells/kg vs. 1×10⁷ cells/kg vs. 5×10⁷ cells/kg vs. 10×10⁷ cells/kg) 마우스 꼬리 정맥에 주사한 뒤, 마우스의 생존 여부를 확인함으로써 배양한 CD3⁺G-PBSC 림프구의 치료 효과를 평가하였다.

그 결과, 대조군(n=7)의 경우에는 말초 단핵구 주입 100일 시점에서 14%의 마우스만이 생존한 반면, 5% HSA 및 50μM 메르캅토에탄올을 포함하는 배지에서 4일간 배양한 CD3⁺G-PBSC 림프구를 1×10⁶ cells/kg 용량으로 주입한 군(n=5)에서는 대상 마우스가 20%가 생존하였다. 반면에 1×10⁷ cells/kg 용량으로 주입한 군(n=7)에서는 대상 마우스의 71%가 생존하여, 4일간 배양한 CD3⁺G-PBSC는 1×10⁷ cells/kg가 적절한 치료 용량임을 확인하였다(도 9 참조). 또, 4일간 배양한 CD3⁺G-PBSC 림프구의 용량을 증가시킨, 5 배 용량인 5×10⁷ cells/kg(n=3), 혹은 10배 용량인 10×10⁷ cells/kg(n=3)를 주입하면 대상 마우스가 대부분 20일 이내에 사망하였다(도 9 참조).

같은 방법으로 2일간 배양한 CD3⁺G-PBSC를 주입하여 aGVHD에 대한 치료 효과를 평가하였다(도 10 참조). 1×10⁷ cells/kg 용량으로 주입한 군(n=4)에서는 세포주입 80일 시점에서 대상 마우스가 100% 생존하는 것을 확인하였다(도 10 참조). 또, 2일간 배양한 CD3+G-PBSC 림프구를 1×10⁷ cells/kg의 5 배 용량인 5×10⁷ cells/kg (n=2)를 주입한 경우는 대상 마우스의 50%가 생존하였고, 10배 용량인 10×10⁷ cells/kg(n=2)을 주입한 군은 모두 사망하지 않고 생존하는 것을 확인하였다(도 10 참조). 이를 통해, HSA으로 배양한 CD3+G-PBSC 림프구는 in vivo에서도 면역반응을 효과적으로 억제함을 확인하였고, 2일간 배양한 CD3⁺G-PBSC 림프구를 1×10⁷ cells/kg의 용량으로 투여하는 방법이 이식편대숙주반응을 가장 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.

상기 실시예들의 결과로부터, HSA과 메르캅토에탄올을 포함하는 배지로 CD3⁺G-PBSC를 4일간 배양할 경우, 대부분의 세포(86.5±8.8%)가 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 림프구로 분화되며, 분화된 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 림프구는 면역 반응 억제 효과가 우수함을 확인하였다. 또, 2일간 HSA에서 배양한 CD3⁺G-PBSC는 다량의 CD3⁺PD1⁺TIM3^- 림프구와 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 림프구가 포함되어 있으며, 4일간 배양하여 분리한 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺ 림프구 보다 우수한 면역억제 효과를 나타냈다. 그러므로 본 발명에 따른 방법을 기반으로 2일간 배양한 CD3⁺G-PBSC가 가장 이상적인 세포 치료제이며, 앞으로 이식편대숙주병 등의 면역 질환 치료에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims

하기 단계를 포함하는, 면역억제 T세포의 대량 생산 방법:
개체에서 분리된 시료로부터 CD3⁺ 세포를 분류하는 단계; 및
상기 CD3⁺ 세포를 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)이 포함된 배지에서 배양하는 단계.
제 1항에 있어서,
상기 시료는 혈액, 조직, 세포, 혈장, 대변, 소변 및 정액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 면역억제 T 세포의 대량 생산 방법.
제 1항에 있어서,
상기 시료는 혈액 및 말초 혈액 조혈모세포(peripheral blood stem cell, PBSC)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 면역억제 T 세포의 대량 생산 방법.
제 1항에 있어서,
상기 개체는 건강한 동종 개체인 것을 특징으로 하는, 면역억제 T 세포의 대량 생산 방법.
제 1항에 있어서,
상기 개체는 CD3⁺ 세포가 말초혈액내로 가동화된 것을 특징으로 하는, 면역억제 T 세포의 대량 생산 방법.
제 1항에 있어서,
상기 개체는 백혈구 성장인자(leucocyte growth factor)가 투여된 개체인 것을 특징으로 하는, 면역억제 T 세포의 대량 생산 방법.
제 6항에 있어서,
상기 백혈구 성장인자(leucocyte growth factor)는 과립구 집락자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)인 것을 특징으로 하는, 면역억제 T 세포의 대량 생산 방법.
제 1항에 있어서,
상기 배지는 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 면역억제 T 세포의 대량 생산 방법.
제 8항에 있어서,
상기 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)의 농도는 1 μM 내지 200 μM인 것을 특징으로 하는, 면역억제 T 세포의 대량 생산 방법.
제 1항에 있어서,
상기 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)의 농도는 1 중량% 내지 10 중량%인 것을 특징으로 하는, 면역억제 T 세포의 대량 생산 방법.
제 1항에 있어서,
상기 배양은 1일 내지 7일동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 면역억제 T세포의 대량 생산 방법.
제 1항에 있어서,
상기 면역억제 T세포는 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺의 표현형을 갖는 것을 특징으로 하는, 면역억제 T세포의 대량 생산 방법.
제 1항에 있어서,
상기 배양이 1일 내지 3일동안 수행되는 경우, 상기 면역억제 T세포는 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺, CD3⁺PD1⁺TIM3^- 및 CD3⁺PD1^-TIM3^-로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 표현형을 갖는 것을 특징으로 하는, 면역억제 T세포의 대량 생산 방법.
하기의 단계를 포함하는, 면역억제 T 세포의 대량 생산 방법:
과립구 집락자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)를 투여한 개체에서 분리된 시료로부터 CD3⁺ 세포를 분류하는 단계; 및
상기 CD3⁺ 세포를 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA) 및 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)이 포함된 배지에서 1일 내지 7일동안 배양하는 단계.
하기의 단계를 포함하는, 생체외(In vitro)에서 T세포를 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺, CD3⁺PD1⁺TIM3^- 및 CD3⁺PD1^-TIM3^-로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 표현형을 갖는 T세포로 유도하는 방법:
과립구 집락자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)를 투여한 개체에서 분리된 시료로부터 CD3⁺ 세포를 분류하는 단계; 및
상기 CD3⁺ 세포를 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA) 및 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)이 포함된 배지에서 1일 내지 3일동안 배양하는 단계.
하기의 단계를 포함하는, 생체외(In vitro)에서 T세포를 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺의 표현형을 갖는 T세포로 유도하는 방법:
과립구 집락자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)를 투여한 개체에서 분리된 시료로부터 CD3⁺ 세포를 분류하는 단계; 및
상기 CD3⁺ 세포를 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA) 및 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)이 포함된 배지에서 4일 내지 7일동안 배양하는 단계.
제 14항에 있어서,
상기 과립구 집락자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)는 1 내지 50 μg/kg의 농도로 투여되는 것을 특징으로 하는, 면역억제 T 세포의 대량 생산 방법.
인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 포함하는, 면역억제 T 세포의 대량 생산용 배지 조성물.
제 18항에 있어서,
상기 배지 조성물은 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)을 더 포함하는 것인, 면역억제 T 세포의 대량 생산용 배지 조성물.
제 19항에 있어서,
상기 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)의 농도는 1 μM 내지 200 μM인 것을 특징으로 하는, 면역억제 T 세포의 대량 생산용 배지 조성물.
제 18항에 있어서,
상기 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)의 농도는 1 중량% 내지 10 중량%인 것을 특징으로 하는, 면역억제 T 세포의 대량 생산용 배지 조성물.
제 18항에 있어서,
상기 배지 조성물은 혈액 또는 말초 혈액 조혈모세포(peripheral blood stem cell, PBSC) 배양 용도로 사용되는 것을 특징으로 하는, 면역억제 T 세포의 대량 생산용 배지 조성물.
제 18항에 있어서,
상기 면역억제 T 세포는 CD3⁺PD1⁺Tim3⁺의 면역 표현형을 가지는 것을 특징으로 하는, 면역억제 T 세포의 대량 생산용 배지 조성물.
과립구 집락자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF) 및 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 포함하는, 면역억제 T 세포의 대량 생산용 키트.
제 24항에 있어서,
상기 키트는 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 면역억제 T 세포의 대량 생산용 키트.
인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 포함하며,
말초 혈액 조혈모세포(peripheral blood stem cell, PBSC)를 1일 내지 3일간 배양하는 것을 특징으로 하는, CD3⁺PD1⁺TIM3⁺, CD3⁺PD1⁺TIM3^- 및 CD3⁺PD1^-TIM3^-로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 표현형을 갖는 면역억제 T세포 증식용 배지 조성물.
제 26항에 있어서,
상기 배지 조성물은 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, CD3⁺PD1⁺TIM3⁺, CD3⁺PD1⁺TIM3^- 및 CD3⁺PD1^-TIM3^-로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 표현형을 갖는 면역억제 T세포 증식용 배지 조성물.
인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 포함하며,
말초 혈액 조혈모세포(peripheral blood stem cell, PBSC)를 4일 내지 7일간 배양하는 것을 특징으로 하는, CD3⁺PD1⁺TIM3⁺의 표현형을 갖는 면역억제 T세포 증식용 배지 조성물.
제 28항에 있어서,
상기 배지 조성물은 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, CD3⁺PD1⁺TIM3⁺의 표현형을 갖는 면역억제 T세포 증식용 배지 조성물.
과립구 집락자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF) 및 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 포함하며,
말초 혈액 조혈모세포(peripheral blood stem cell, PBSC)를 1일 내지 3일간 배양하는 것을 특징으로 하는, CD3⁺PD1⁺TIM3⁺, CD3⁺PD1⁺TIM3^- 및 CD3⁺PD1^-TIM3^-로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 표현형을 갖는 면역억제 T세포 증식용 키트.
제 30항에 있어서,
상기 키트는 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)을 더 포함하는 것인, CD3⁺PD1⁺TIM3⁺, CD3⁺PD1⁺TIM3^- 및 CD3⁺PD1^-TIM3^-로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 표현형을 갖는 면역억제 T세포 증식용 키트.
과립구 집락자극인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF) 및 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 포함하며,
말초 혈액 조혈모세포(peripheral blood stem cell, PBSC)를 4일 내지 7일간 배양하는 것을 특징으로 하는, CD3⁺PD1⁺TIM3⁺의 표현형을 갖는 면역억제 T세포 증식용 키트.
제 32항에 있어서,
상기 키트는 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)을 더 포함하는 것인, CD3⁺PD1⁺TIM3⁺의 표현형을 갖는 면역억제 T세포 증식용 키트.
제 1항에 따른 면역억제 T세포의 대량 생산 방법을 통해 제조된 면역억제 T세포를 포함하는, 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 34항에 있어서,
상기 자가면역질환은 이식편대숙주질환(graft-versus-host disease), 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis), 천식(Asthma), 피부염(Dermititis), 건선(Psoriasis), 낭섬유증(Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증(Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증(Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환(Inflammatory Bowel Dieseses), 자가면역성 당뇨 (Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증(Diabetic retinopathy), 비염(Rhinitis), 혀혈-재관류 손상 (Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술후 재협착 (Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환(Chronic obstructive pulmonary diseases; COPD), 그레이브병 (Graves disease), 위장관 알러지 (Gastrointestinal allergies), 결막염(Conjunctivitis), 죽상경화증(Atherosclerosis), 관상동맥질환(Coronary artery disease), 협심증(Angina), 암 전이 및 소동맥 질환으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 질환인 것인, 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 34항에 있어서,
상기 면역억제 T세포는 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺의 표현형을 갖는 것을 특징으로 하는, 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 34항에 있어서,
상기 면역억제 T세포는 CD3⁺PD1⁺TIM3^- 및 CD3⁺PD1^-TIM3^-로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 표현형을 더 가지는 것을 특징으로 하는, 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 따른 면역억제 T세포의 대량 생산 방법을 통해 제조된 CD3⁺PD1⁺TIM3⁺의 표현형을 갖는 면역억제 T세포를 포함하는, 자가면역질환 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물.
제 38항에 있어서,
상기 면역억제 T세포는 CD3⁺PD1⁺TIM3^- 및 CD3⁺PD1^-TIM3^-로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 표현형을 더 가지는 것을 특징으로 하는, 자가면역질환 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물.