KR20240073055A - 암의 예방 및 치료를 위한 mirna 조합물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 암의 예방 및/또는 치료, 구체적으로 교모세포종의 치료에 사용하기 위한 miR-17 모방체 및 miR-340 모방체의 조합물에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 조합물은 miR-222 antagomiR을 추가로 포함한다.
Description
본 발명은 암의 예방 및/또는 치료, 구체적으로 교모세포종의 치료에 사용하기 위한 miR-17 모방체 및 miR-340 모방체의 조합물에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 조합물은 miR-222 antagomiR을 추가로 포함한다.
교모세포종 (Glioblastoma: GBM)은 치명적인 악성 뇌종양인 등급 IV 성상세포종으로, 성인에서 가장 흔한 원발성 뇌종양이다. 오늘날, 수술, 방사선요법, 및 테모졸로미드 (temozolomide)를 사용한 화학요법이 GBM 환자의 치료 표준으로 남아 있다 (Stupp, et al. (2005). Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med 352: 987-996). 그러나, GBM 환자의 전체 생존 중앙값 (약 14개월)은 지난 15년 동안 급격하게 변하지 않았다. 대규모 게놈 및 전사체 프로파일링의 주요 노력을 통해 GBM 환자를 고전 (Classical), 중간엽 (Mesenchymal), 전신경 (Proneural) 및 신경 (Neural) (이는 최근 제거됨)의 4가지 서브타입으로 특성화하고 계층화하였다 (Verhaak, RGet al. (2010). Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell 17: 98-110.; Brennan, CW, et al. (2013). The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell 155: 462-477.; Freije, WAet al. (2004). Gene expression profiling of gliomas strongly predicts survival. Cancer Res 64: 6503-6510). 그럼에도 불구하고, 이러한 빅 데이터 분석 (big data analyses)은 정밀 의학의 진보를 달성하기 위한 새로운 치료 방법 및 약물화 가능한 분자를 아직 강조하지 못하였다.
MiRNAs는 RNA 간섭 과정을 통해 유전자 발현의 번역후 조절에 참여하는 20 내지 22개의 뉴클레오티드로 구성된 작은 비-코딩 RNAs이다 (Bartel, DP, et al. (2004). Micromanagers of gene expression: the potentially widespread influence of metazoan microRNAs. Nat Rev Genet 5: 396-400.; Lee, Y, et al. (2002). MicroRNA maturation: stepwise processing and subcellular localization. EMBO J 21: 4663-4670.; Tomari, Y, et al. (2005). MicroRNA biogenesis: drosha can't cut it without a partner. Curr Biol 15: R61-64). 상기 miRNA 유전자는 RNA 폴리머라제 II에 의해 전사되어 pri-miRNA 전사체를 형성한다. 이러한 pri-miRNA는 Drosha (클래스 2 RNAse III 효소)에 의해 처리되어 약 70개의 뉴클레오티드로 구성된 pre-miRNA 전구체 산물을 방출한다. 마지막으로, 상기 pre-miRNA는 세포질로 방출되고, 여기서 처리되어 성숙한 약 20개의 뉴클레오티드 miRNA를 생성한다. 이러한 miRNA는 RISC 복합체 (RNase III 패밀리의 엔도리보뉴클레아제)에 통합되어, 상보적인 표적 mRNAs와 결합하는 경우 이중가닥 RNA를 형성한다. 결과적으로, miRNA 구조의 루프-단부에서의 절단은 5p 및 3p 가닥을 생성하며, 여기서 5p 및 3p는 miRNA가 pre-miRNA 헤어핀의 5' 또는 3' 단부로부터 기원하는지 여부로 각각 정의한다. 게놈 및 기능적 실험에 기반하여, 인간에서 miRNA 활성은 주로 5p 가닥에 기인한다. 실제로, 3p 가닥은 RISC에서 훨씬 덜 풍부하고, 빠르게 제거된다. miRNA와 표적 mRNA의 상보성 (complementation)에 따라, RISC 복합체는 mRNA 번역을 억제하거나 또는 mRNA 분해를 유도한다 (Tomari, Y, et al. (2005). MicroRNA biogenesis: drosha can't cut it without a partner. Curr Biol 15: R61-64.; Zhang, H, et al. (2004). Single processing center models for human Dicer and bacterial RNase III. Cell 118: 57-68). 최근 계산 예측 (computational prediction)에 따르면, 각 miRNA는 약 200개의 표적 유전자를 조절할 수 있는 잠재력을 가지고 있으며; 따라서 miRNA-매개 유전자 조절은 이제 생물학적 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 간주된다 (Lewis, BP, et al.(2005). Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell 120: 15-20).
MiRNAs는 종양형성 (tumorigenesis) 중에 비정상적인 발현을 겪으며, miRNAs-코딩 유전자는 포유동물의 암에서 획득 및 손실되는 영역의 취약한 부위에 흔히 위치한다 (Calin, GA, et al. (2004). Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 2999-3004).
miRNAs는 매우 중요한 다양한 세포 과정에서 중요한 역할을 하기 때문에, 개인 맞춤형 암 치료에서 miRNAs의 사용은 매우 매력적이다.
그러나, GBM 공격성의 새로운 동인, 및 GBM 치료 전략에 대한 임상적 및 생물학적으로 관련된 miRNAs를 확인하기 위한 더 많은 조사가 분명히 필요하다.
본 발명의 발명자는 GBM 다중표적화 치료 전략에 사용될 수 있는 임상적으로 관련된 miRNAs로서 miR-17 및 miR-340을 확인하였다. 이들은 miR-17 및 miR-340의 이소성 발현 (ectopic expression)이 종양 공격성을 인 비트로 및 인 비보 억제하였음을 발견하였다.
이들은 또한 miR-17, miR-340 및 miR-222의 조합물이 인 비트로 및 인 비보에서 GBM의 모든 서브타입에서 종양 성장의 전신 및 유의미한 억제를 보여주는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 miR-17 모방체 및 miR-340 모방체의 조합물에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 조합물은 miR-222 antagomiR을 추가로 포함한다.
더 구체적으로, 상기 조합물은 miR-221 antagomiR 및/또는 miR-551b 모방체를 추가로 포함한다.
본원에서 사용된, 용어 "조합물 (combination)"은 복수의 성분들을 포함하는 조성물을 의미한다. 용어 "조합물"의 사용은 조성물의 다양한 성분들의 상대적 함량을 제한하지 않으며, 이는 등몰 비율, 동일한 중량 비율, 또는 상이한 몰 또는 중량 비율로 발견될 수 있다.
결과적으로, 하기 조합물은 본 발명의 범위 내에 있다:
- miR-17 모방체 및 miR-340 모방체의 조합물;
- miR-17 모방체, miR-340 모방체 및 miR-222 antagomiR의 조합물;
- miR-17 모방체, miR-340 모방체 및 miR-221 antagomiR의 조합물;
- miR-17 모방체, miR-340 모방체, miR-222 antagomiR 및 miR-221 antagomiR의 조합물;
- miR-17 모방체, miR-340 모방체 및 miR-551b 모방체의 조합물;
- miR-17 모방체, miR-340 모방체, miR-222 antagomiR 및 miR-551b 모방체의 조합물;
- miR-17 모방체, miR-340 모방체, miR-221 antagomiR 및 miR-551b 모방체의 조합물; 및
- miR-17 모방체, miR-340 모방체, miR-222 antagomiR, miR-221 antogomiR 및 miR-551b-모방체의 조합물.
상기 언급한 바와 같이, miRNAs는 RNA 간섭 과정을 통해 유전자 발현의 번역후 조절에 참여하는 20 내지 22개의 뉴클레오티드로 구성된 작은 비-코딩 RNAs이다.
용어 "마이크로RNA (microRNA)" 또는 "miRNA" 또는 "miR"은 유전자 발현의 전사 및/또는 전사후 조절에서 기능하는 작은 비-코딩 RNA를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 다양한 구체예에서, miRNAs는 가이드 가닥 (guide strand) 및 패신저 가닥 (passenger strand)으로 처리되는 듀플렉스 (duplex)를 포함하는 헤어핀 구조를 갖는다.
본원에서 사용된, 용어 "miR"은 상기 miRNA의 임의의 이소형 및 상기 miRNA 패밀리의 모든 구성원을 포함한다. 따라서, 용어 "miRNA"는 스타-서열 (star-sequences) 및 패밀리 구성원을 포함한다. 구체적으로, 본 발명에 따른 miRNA는 인간, 즉 hsa-miRNA이다.
MiRNA 명명법은 여전히 일관되지 않는다. 그러나, miRNA 시스터 (miRNA sisters)를 코딩하는 유전자를 명명하는데 문자 접미사를 사용한다 (예: miR-17a 및 miR17b). 그 다음에, 동일한 성숙한 miRNA가 여러 개별 유전자좌로부터 생성되는 경우 miRNA 단부에 숫자 접미사를 사용한다 (예: miR17a-1 및 miR-17a-2). 2개의 성숙한 miRNA가 각 유전자좌에서 생성될 수 있으며, 하나는 5' 가닥에서 생성되고, 다른 하나는 3' 가닥에서 생성된다 (예: miR-17a-3p 및 miR17a-5p). 주목할 만한 점은 일반적으로 하나의 암 (arm) (가이드 가닥이라고 함)이 다른 암 (패신저 가닥이라고 하며, miRNA*로 알려져 있음)보다 더 우세하고, 생물학적 활성이 더 크다는 것이다.
본 발명에 따른 miR의 RNA 서열은 예를 들어 mirbase (https://www.mirbase.org/index.shtml)에서 공개적으로 이용 가능하다.
구체적으로, miR-17은 miR-17-3p, miR17-5p, miR-17-*를 모두 포함하고, 더 구체적으로 miR-17-3p를 포함하고, 이는 하기 RNA 서열을 포함한다:
구체적으로, miR-340은 miR-340-5p, miR340-3p, miR-340-*를 모두 포함하고; 더 구체적으로 miR-340-5p를 포함하고, 이는 하기 RNA 서열을 포함한다:
구체적으로, miR-222는 miR-222-5p, miR222-3p, miR-222-*를 모두 포함하고; 더 구체적으로 이는 하기 RNA 서열을 포함한다:
구체적으로, miR-221은 miR-221-5p, miR221-3p, miR-221-*를 모두 포함하고; 더 구체적으로 이는 하기 RNA 서열을 포함한다:
구체적으로, miR-551b는 miR-551b-5p, miR551b-3p, miR-551b-*를 모두 포함하고; 더 구체적으로 이는 하기 RNA 서열을 포함한다:
이전에 설명한 바와 같이, 일부 과발현된 miRNAs는 "종양발생 (oncogenic)" 효과를 발휘하는 것으로 보고된 반면에, 일부 하향조절된 miRNA는 "종양 억제 (tumor suppressor)" 효과를 보여주었다. 특정 miRNA 변경은 각각 표적화된 miRNAs의 상향조절 또는 하향조절을 유도하는 "모방체 (mimics)" 또는 "antagomirs"로 지칭되는 올리고뉴클레오티드 서열을 사용하여 구체적으로 표적화될 수 있다. 그러므로, 종양에서 변경된 miRNAs를 확인함으로써, 본 발명자는 암 환자, 구체적으로 GBM 환자의 개인 맞춤형 의학을 위한 표적 요법을 시행할 수 있었다.
따라서, 본 발명자는 암의 예방 및/또는 치료를 위한 모방체로서 그리고 선택적으로 또한 antogomiRs로서 작용하는 핵산들의 조합물을 확인하였다.
본원에서 miR-17 모방체, miR-340 모방체 및 miR-551b 모방체에 사용된 "모방체 (mimic)"는 이러한 miRNAs를 모방하도록 디자인된 작은, 합성, 이중가닥 RNA 분자를 의미하며, 상기 언급한 바와 같이, 이는 표적화된 miRNAs의 상향조절을 유도할 수 있다. 상기 모방체는 해당 miRs의 세포내 기능을 증가시키거나 또는 대체하며, 모방하는 miRNA에 의해 발현이 하향조절되는 유전자 산물의 발현에 대응할 수 있다. miRNA 모방 기술은 내인성 miRNAs를 모방하여 이의 표적에 특이적으로 결합하고, 이에 의해 표적 유전자의 번역 억제를 유도하는데 사용되는 miRNA-기능 획득 전략 (miRNA-gain-of-function strategy)에 속한다.
이러한 분자는 당업자에게 알려져 있고, 상업적으로 이용 가능하며, 예를 들어 Life technologies 사에서 구입한다.
DNA-기반 miRNA 모방체, RNA-기반 miRNA 모방체, miRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 전구체를 예로 들 수 있다.
DNA-기반 miRNA 모방체는 성숙한 miRNA 서열의 DNA 버전 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체를 포함하는 DNA 올리고뉴클레오티드에 해당한다.
RNA-기반 miRNA 모방체는 이중가닥 RNA인 RNA-기반 모방체에 해당하며, 상기 가닥들 중 하나의 서열은 성숙한 miRNA의 서열 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체를 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 miRNA 모방체는 생성된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 증진시키는 하나 이상의 모이어티에 접합된다. 상기 miRNA 모방체는 DNA-기반이거나 또는 사슬내 염기쌍에 의해 안정화된 단일 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 RNA-기반인 경우, 모이어티는 5' 단부 또는 3' 단부에 연결될 수 있다. 상기 miRNA 모방체가 RNA-기반이고 이중가닥인 경우, 모이어티는 패신저 가닥의 5' 단부, 가이드 가닥의 3' 단부, 가이드 가닥의 5' 단부 및/또는 가이드 가닥의 3' 단부에 연결될 수 있다.
본원에서 사용된, "가이드 가닥 (guide strand)"은 miRNA의 단일가닥 핵산 분자를 의미하며, 이는 표적 mRNA의 서열과 충분히 상보적인 서열을 가지고 있어서 표적 mRNA (예: 5' UTR, 코딩 영역 또는 3' UTR에서)에 혼성화되고, 이의 번역을 감소 또는 억제할 수 있다. 패신저 가닥은 또한 "안티센스 가닥"이라고 한다.
본원에서 사용된, "패신저 가닥 (passenger strand)"은 가이드 가닥의 서열에 상보적이거나 또는 실질적으로 상보적인 서열을 갖는 miRNA의 올리고뉴클레오티드 가닥을 의미한다. 일부 구체예에서, 상기 패신저 가닥은 표적 mRNA (예: 5' UTR, 코딩 영역 또는 3' UTR에서)에 혼성화에 의해 mRNA를 표적화하여, 이의 번역을 감소시키거나 또는 억제할 수 있다. 패신저 가닥은 또한 "센스 가닥"이라고 한다.
이러한 특정 구체예에서, 상기 모이어티는 콜레스테롤 모이어티 또는 지질 모이어티이다. 접합을 위한 추가 모이어티에는 탄수화물, 인지질, 비오틴, 페나진, 엽산, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 쿠마린 및 염료를 포함한다. 특정 구체예에서, 접합체 그룹은 올리고뉴클레오티드에 직접 부착된다. 특정 구체예에서, 접합체 그룹은 아미노, 하이드록실, 카복실산, 티올, 불포화 (예: 이중 또는 삼중 결합), 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산 (ADO), 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트 (SMCC), 6-아미노헥산산 (AHEX 또는 AHA), 치환된 C1-C10 알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 및 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐로부터 선택된 연결 모이어티에 의해 올리고뉴클레오티드에 부착된다. 이러한 특정 구체예에서, 치환기는 하이드록실, 아미노, 알콕시, 카복시, 벤질, 페닐, 니트로, 티올, 티오알콕시, 할로겐, 알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 상기 miRNA 모방체는 캡 (cap) 구조로 변형된다. 이러한 말단 변형은 올리고뉴클레오티드를 엑소뉴클레아제 분해로부터 보호하고, 세포내 전달 및/또는 국소화에 도움이 될 수 있다. 상기 캡은 5'-말단 (5'-캡), 또는 3'-말단 (3'-캡)에 존재할 수 있거나, 또는 두 말단 모두에 존재할 수 있다. 캡 구조는 예를 들어 역전된 데옥시 비염기 캡 (inverted deoxy abasic caps)을 포함한다. 적합한 캡 구조는 4',5'-메틸렌 뉴클레오티드, 1-(베타-D-에리트로푸라노실) 뉴클레오티드, 4'-티오 뉴클레오티드, 카보사이클릭 뉴클레오티드, 1,5-안하이드로헥시톨 뉴클레오티드, L-뉴클레오티드, 알파-뉴클레오티드, 변형된 염기 뉴클레오티드, 포스포로디티오에이트 연결, 트레오펜토푸라노실 뉴클레오티드, 비고리형 3',4'-세코 뉴클레오티드, 비고리형 3,4-디하이드록시부틸 뉴클레오티드, 비고리형 3,5-디하이드록시펜틸 뉴클레오티드, 3'-3'-역전된 뉴클레오티드 모이어티, 3'-3'-역전된 비염기 모이어티, 3'-T-역전된 뉴클레오티드 모이어티, 3'-T-역전된 비염기 모이어티, 1,4-부탄디올 포스페이트, 3'-포스포르아미데이트, 헥실포스페이트, 아미노헥실 포스페이트, 3'-포스페이트, 3'-포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 가교 메틸포스포네이트 모이어티, 및 비-가교 메틸포스포네이트 모이어티 5'-아미노-알킬 포스페이트, 1,3-디아미노-2-프로필 포스페이트, 3-아미노프로필 포스페이트, 6-아미노헥실 포스페이트, 1,2-아미노도데실 포스페이트, 하이드록시프로필 포스페이트, 5'-5'-역전된 뉴클레오티드 모이어티, 5'-5'-역전된 비염기 모이어티, 5'-포스포르아미데이트, 5'-포스포로티오에이트, 5'-아미노, 가교 및/또는 비-가교 5'-포스포르아미데이트, 포스포로티오에이트, 및 5'-머캅토 모이어티를 포함한다.
바람직한 일 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물의 일부를 형성하는 모방체는 인간 miRNAs를 모방한다. 인간 miRNA 분자는 인간 세포, 조직 또는 장기에서 발견되는 miRNA 분자이다. 인간 miRNA 분자는 또한 뉴클레오티드의 치환, 결실 및/또는 부가에 의해 내인성 인간 miRNA 분자로부터 유래된 인간 miRNA 분자일 수 있다.
본원에서 miR-222 antagomiR 및 miR-221 antogomiR에 대해 사용된 "antogomiR"은 이러한 miRNAs에 특이적으로 결합하여 기능을 억제하도록 디자인된 작은, 합성, 단일가닥 RNA 분자를 의미하며, 상기 언급한 바와 같이, 이는 표적화된 miRNAs의 하향조절을 유도할 수 있다. AntagomiRs은 miRNA 접근법의 안티센스 억제를 나타낸다. 표적화된 miRNA에 결합함으로써, 이들은 그 기능을 억제한다. 이들의 안정성, 효능 및 성능을 개선하기 위해 화학적 변형을 사용할 수 있다.
이러한 분자는 당업자에게 알려져 있고, 상업적으로 이용 가능하며, 예를 들어 Life technologies 사에서 구입한다.
Antagomirs는 화학적으로 조작된 콜레스테롤-접합된 단일가닥 RNA 유사체로, 인 비트로 및 인 비보에서 내인성 마이크로RNAs의 효율적이고 특이적인 사일렌서 (silencers)일 수 있다. miRNAs의 억제는 또한 안티센스 2'-O-메틸 (2'-OMe) 올리고리보뉴클레오티드를 사용하거나, 또는 렌티바이러스 또는 아데노바이러스로 발현된 antagomirs를 사용하여 달성될 수 있다. 또한, 단일가닥 RNA 유사체의 MOE (2'-O-메톡시에틸 포스포로티오에이트) 또는 LNA (잠금 핵산 (LNA) 포스포로티오에이트 화학)-변형을 사용하여 miRNA 활성을 억제할 수 있다.
또한, miRNA 스폰지 (miRNA sponges)의 사용에 의해 내인성 miRNAs를 침묵시킬 수 있다. 이 경우에, 관심 있는 miRNA 시드 패밀리 (miRNA seed family)에 대한 다수의 직렬-결합 부위를 함유하는 RNA의 단일 종을 제작한다. miRNA 시드 패밀리의 다양한 구성원이 표적화되기 때문에, 이 접근법의 잠재적 이점은 이러한 miRNAs 패밀리에 의해 일반적으로 조절되는 질병 경로에 보다 효과적으로 영향을 미칠 수 있다는 것이다. 원칙적으로, miRNA를 제거하여 이의 miRNA 표적에 결합하는 것을 방지함으로써 miRNA 기능을 방해하는 것이 가능하다.
miRNA의 특정 mRNA 표적과의 결합은 또한 mRNA의 3'-UTR에 있는 miRNA 표적 서열에 완벽하게 상보적인 올리고뉴클레오티드를 사용하여 방지할 수 있으며, 이를 통해 결합 부위를 차폐하고, miRNA와의 회합을 방지한다. miRNA 기능을 억제하는 추가 접근법은 "이레이저 (erasers)"에 의해 달성될 수 있으며, 여기서 표적 miRNA에 완벽하게 상보적인 서열의 직렬 반복의 발현이 내인성 miRNA 기능을 억제한다. 마지막으로, 물질, 분자, 약물을 사용하여 miRNA 발현 및 생물발생 (biogenesis)을 억제할 수 있다.
성숙한 miRNA와 동등한 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 전달함으로써, 1개의 가닥이 천연 miRNA와 동일한 합성 RNA 듀플렉스를 사용하여 감소된 miRNA의 유효 농도를 증가시킬 수 있다. 이 경우에, 1개의 가닥이 성숙한 miRNA 서열 (가이드 가닥)이고, 상보적이거나 또는 부분적으로 상보적인 가닥이 성숙한 miRNA 서열 (패신저 가닥)과 복합체를 형성하는 짧은 이중가닥 올리고뉴클레오티드가 디자인된다. 마지막으로, 물질, 분자, 약물을 사용하여 miRNA 발현 및 생물발생을 증가시킬 수 있다.
바람직한 일 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물의 일부를 형성하는 antagomiRs은 인간 miRNAs를 표적으로 한다.
본 발명의 맥락에서 사용된, 용어 "치료하다", "치료하는", "치료되는" 또는 "치료"는 증상을 제거하거나 또는 경감시키는 것이 목적인 치료적 치료를 의미한다. 유익하거나 또는 목적하는 임상 결과에는 증상의 제거, 증상의 완화, 병태 정도의 감소, 병태의 안정화 (즉, 악화되지 않는) 상태, 병태 진행의 지연 또는 둔화를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 맥락에서 사용된, 용어 "예방하다", "예방", "예방하는" 또는 "예방되는"은 질병 또는 장애, 또는 이의 하나 이상의 증상의 발병, 재발 또는 확산을 예방하는 것을 의미한다. 특정 구체예에서, 상기 용어는 구체적으로 본원에 제공된 질병 또는 장애의 위험이 있는 환자에 대한, 증상의 발생 전에 본원에 제공된 화합물을 사용한 치료 또는 이의 투여를 의미한다. 상기 용어는 특정 질병의 증상의 억제 또는 감소를 포함한다. 구체적으로, 질병의 가족력이 있는 대상체는 특정 구체예에서 예방적 요법의 후보자이다. 또한, 재발 증상의 병력이 있는 대상체가 또한 예방을 위한 잠재적 후보자이다. 이와 관련하여, 용어 "예방"은 용어 "예방적 치료 (prophylactic treatment)"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 사용되고 달리 정의하지 않는 한, "암 (cancer)"은 신체내 비정상 세포의 성장, 분열 또는 증식을 의미한다. 이는 임의의 타입의 악성 (즉, 비양성) 종양을 의미한다. 악성 종양은 원발성 종양 또는 속발성 종양 (즉, 전이)에 해당할 수 있다. 또한, 상기 종양은 뇌종양; 수모세포종; 망막모세포종; 신경초종; 신경모세포종; 흑색종; NSCLCC; 췌장 종양; 유방암, 간암종 및 신모세포종으로부터 선택된 암에 해당할 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 뇌종양; 수모세포종; 망막모세포종; 신경초종; 신경모세포종; 흑색종; NSCLCC; 췌장 종양; 유방암, 간암종 및 신모세포종의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 조합물에 관한 것이다.
더 구체적으로, 상기 뇌종양은 성상세포종, 희소돌기아교세포종, 수막종, 신경아교종 및 교모세포종으로부터 선택되며, 더욱 구체적으로 예방 및/또는 치료할 암은 교모세포종이다.
이미 언급한 바와 같이, 교모세포종 (GBM)은 치명적인 악성 뇌종양인 등급 IV 성상세포종으로, 성인에서 가장 흔한 원발성 뇌종양이다.
구체적으로, GBM은 다양한 서브타입인 중간엽, 전신경, 신경 및 고전적 서브타입으로 특성화될 수 있다.
따라서, 일 구체예에서, 본 발명에 따른 조합물은 이들 서브타입들 중 하나 이상의 서브타입의 교모세포종의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.
가장 중요하게, 일 구체예에서, 본 발명에 따른 조합물은 이들 모든 서브타입들을 예방하거나 또는 치료하는데 효과적이다.
본 발명은 또한 암, 구체적으로 GBM의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 조합물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
구체적으로, 암에 대한 치료가 필요한 대상체는 이러한 질병을 앓고 있는 대상체이다.
본 발명의 맥락에서, 본원에 기재된 질병 및 병태의 치료가 필요한 대상체의 확인은 상기 언급된 바와 같이 수행하며, 이는 당업자의 능력 및 지식 범위 내에 있다. 당해 기술 분야의 임상의는 상기 언급한 기술을 통해 이러한 치료가 필요한 대상체를 쉽게 확인할 수 있다.
치료적으로 유효한 양은 당업자로서 주치의 (attending diagnostician)가 통상적인 기술을 사용하고 유사한 상황에서 얻은 결과를 관찰함으로써 쉽게 결정할 수 있다. 치료적으로 유효한 양을 결정할 때, 주치의는 하기를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 요인을 고려한다: 대상체의 종; 이의 크기, 연령, 및 전반적인 건강 상태; 관련된 특정 질병; 질병의 침범 정도 또는 중증도; 개별 대상체의 반응; 투여되는 특정 화합물; 투여 방식; 투여된 제제의 생체이용률 특성; 선택된 용량 용법; 병용 약물의 사용; 및 기타 관련 상황.
본원에서 사용된, "유효량 (effective amount)"은 본원에 기재된 질병 및 병태의 증상을 감소, 제거, 치료 또는 제어하는데 효과적인 양을 의미한다. 용어 "제어"는 본원에 기재된 질병 및 병태의 진행을 지연, 차단, 저지 또는 중단시킬 수 있는 모든 과정을 의미하지만, 반드시 모든 질병 및 병태 증상의 완전한 제거를 의미하는 것은 아니며, 예방적 치료 및 만성적 사용을 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "환자" 또는 "대상체"는 달리 명시하지 않는 한 온혈 동물 예컨대 포유동물, 구체적으로 인간, 남성 또는 여성을 의미하며, 이는 본원에 기재된 하나 이상의 질병 및 병태를 앓고 있거나 또는 이를 앓을 가능성이 있다.
목적하는 생물학적 효과를 달성하는데 필요한 각 모방체 또는 antagomiR의 양은 투여할 약물의 투여량, 사용된 화합물의 화학적 특성 (예: 소수성), 화합물의 효능, 질병의 타입, 환자의 질병 상태, 및 투여 경로를 포함하는 다수의 요인들에 따라 가변될 것이다.
본원에 제공된 조합물은 선택적으로 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제와의 혼합에 의해, 약학적 조성물로 제제화될 수 있다.
이러한 조성물은 구체적으로 정제 또는 캡슐, 구체적으로 구강분산성 (lyoc) 정제 형태의 경구 투여; 또는 구체적으로 액체 용액, 현탁액 또는 에멀젼 형태의 비경구 투여로 사용하기 위해 제조될 수 있다.
이는 예를 들어 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed.; Gennaro, A. R., Ed.; Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000에 기재된 바와 같이, 제약 분야에 잘 알려진 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 약학적으로 적합한 결합제 및/또는 아쥬반트 물질은 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석 담체 또는 식용 담체를 포함할 것이다. 이는 단위 용량 형태로 투여될 수 있으며, 여기서 용어 "단위 용량 (unit dose)"은 환자에게 투여될 수 있고, 쉽게 취급 및 포장될 수 있으며, 활성 화합물 자체 또는 약학적으로 허용 가능한 조성물로서 포함하는 물리적 및 화학적으로 안정한 단위 용량으로 유지되는 단일 용량을 의미한다.
상기 정제, 환제, 산제, 캡슐, 트로키 및 유사물은 하기 성분들 중 하나 이상, 또는 유사한 특성의 화합물을 함유할 수 있다: 결합제 예컨대 미세결정 셀룰로스 또는 트라가칸트 검; 희석제 예컨대 전분 또는 락토스; 붕해제 예컨대 전분 및 셀룰로스 유도체; 활택제 예컨대 마그네슘 스테아레이트; 유동화제 (glidant) 예컨대 콜로이드성 실리콘 디옥시드; 감미제 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 풍미제 예컨대 페퍼민트 또는 메틸 살리실레이트. 캡슐은 경질 캡슐 또는 연질 캡슐의 형태일 수 있으며, 일반적으로 전분 캡슐뿐만 아니라 가소제와 선택적으로 혼합된 젤라틴 혼합물로부터 제조된다. 또한, 투여량 단위 형태는 투여량 단위의 물리적 형태를 변형시키는 다양한 다른 물질, 예를 들어 당, 셸락 또는 장용제 (enteric agents)의 코팅을 함유할 수 있다. 다른 경구 제형 시럽 또는 엘릭서는 감미제, 보존제, 염료, 착색료 및 풍미제를 함유할 수 있다. 또한, 활성 화합물은 속용성, 변형-방출 또는 지속-방출 제제 및 제형에 혼입될 수 있으며, 이러한 지속-방출 제형은 바람직하게는 바이-모달 (bi-modal)이다.
투여를 위한 액체 제제는 멸균된 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 액체 조성물은 또한 결합제, 완충제, 보존제, 킬레이트제, 감미제, 풍미제 및 착색제 등을 포함할 수 있다. 비-수성 용매는 알코올, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 아크릴레이트 코폴리머, 식물성 오일 예컨대 올리브 오일, 및 유기 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 수성 담체는 알코올 및 물의 혼합물, 하이드로겔, 완충 매질 및 식염수를 포함한다. 구체적으로, 생체적합성, 생분해성 락티드 폴리머, 락티드/글리콜리드 코폴리머, 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 코폴리머는 활성 화합물의 방출을 제어하는데 유용한 부형제일 수 있다. 정맥내 비히클은 수액 및 영양 보충제, 전해질 보충제, 예컨대 링거 덱스트로스에 기반의 것, 및 유사물을 포함할 수 있다.
투여 방식의 예로는 비경구, 예를 들어 피하, 근육내, 정맥내, 피부내 뿐만 아니라 경구 투여, 구체적으로 경구, 정맥내 또는 피하 투여를 포함한다.
본 발명은 하기 도면 및 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다.
도 1: MiR-17-3p, -340, 및 -222는 GBM 세포 생존, 클론원성 (clonogenicity) 및 이동 (transmigration)을 조절한다.
(A). miRNA 발현은 비-표적화 스크램블 대조군 (non-targeting scrambled control), 또는 miR-17-3p, -340, -551b, 및 -222 antagomir의 모방체들에 의해 형질감염된 Ge518에서 qPCR에 의해 결정하였다 (n=5-6).
(B). 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-340, -17-3p, 551b 및 -222 antagomir의 모방체들로 일시적으로 형질감염된 Ge518, Ge738, Ge904 및 Ge970.2의 세포 생존율은 CellTiter-Glo를 사용하여 3일 또는 4일 후에 평가하였다. 히스토그램은 miR-Combo 대 miR-Ctrl에 대한 세포 생존의 배수 변화를 나타낸다 (n=4-5).
(C). 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-340, -17-3p, 및 -222 antagomir의 모방체들로 일시적으로 형질감염된 Ge518, Ge738, Ge904 및 Ge970.2의 클론원성은 클론원성 분석 (clonogenic assay)을 사용하여 결정하였다. 3-4개의 독립적 실험들의 대표 사진. 히스토그램은 miR-Combo 대 miR-Ctrl 조건에 대해 형성된 클론의 배수 변화를 나타낸다. 스케일 바 = 10 μm.
(D). 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-340, -17-3p, 및 -222 antagomir의 모방체들로 일시적으로 형질감염된 Ge518, Ge738, Ge904 및 Ge970.2의 이동은 트랜스웰 플레이트 (transwell plates)를 사용하여 결정하였다. 3개의 독립적 실험들의 대표 사진. 히스토그램은 miR-Combo 대 miR-Ctrl 조건에 대해 트랜스웰을 통해 이동된 세포의 배수 변화를 나타낸다. 스케일 바 = 10 μm.
데이터는 평균 ± SEM으로 표시되고 (*p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001), ns = 유의미하지 않음 (non-significant).
도 2: (A-E). miRNA 발현은 비-표적화 스크램블 (A) 대조군, 또는 (B) miR-17-3p, (C) -340, (D) -551b, 및 (E) -222 antagomir의 모방체들에 의해 형질감염된 Ge518에서 qPCR에 의해 결정하였다 (n=5-6). 히스토그램은 하우스키핑 유전자 (housekeeping genes)로 정규화된 각 조건에서 각 miRNA의 발현을 보여준다. (F-I). 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-17-3p (F), -340 (G), 551b (H) 및 -222 (I) antagomir의 모방체들로 일시적으로 형질감염된 Ge518, Ge738, Ge904 및 Ge970.2의 세포 생존율은 CellTiter-Glo를 사용하여 3 또는 4일 후에 평가하였다. 히스토그램은 miR-Combo 대 miR-Ctrl에 대한 세포 생존의 배수 변화를 나타낸다 (n=4-5). 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되고 (*p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001), ns= 유의미하지 않음.
도 3: (A-D). 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-17-3p (A), -340 (B), -551b (C) 및 -222 (D) antagomir의 모방체들로 일시적으로 형질감염된 Ge518, Ge738, Ge904 및 Ge970.2의 클론원성은 클론원성 분석을 사용하여 결정하였다. 히스토그램은 각 조건 대 miR-Ctrl 조건에서 형성된 클론의 배수 변화를 나타낸다. (E). 3-4개의 독립적 실험들의 대표 사진. 스케일 바 = 1 μm. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되고 (*p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001), ns = 유의미하지 않음.
도 4: 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-17-3p (A), -340 (B), -551b (C) 및 -222 (D) antagomir의 모방체들로 일시적으로 형질감염된 Ge518, Ge738, Ge904 및 Ge970.2의 이동은 트랜스웰을 사용하여 결정하였다. 히스토그램은 각 조건 대 miR-Ctrl에 대해 트랜스웰을 통해 이동된 세포의 배수 변화를 나타낸다. 3개의 독립적 실험들의 대표 사진. 스케일 바 = 1 μm.
데이터는 평균 ± SEM으로 표시되고 (*p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001), ns = 유의미하지 않음.
도 5: miR-340, -17-3p 및 -222의 조합 조절은 여러 생물학적 과정 및 대사 경로에 관련된 유전자들을 조절한다.
(A). 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-340, -17-3p 및 -222의 조합 조절로 형질감염된 Ge518 및 Ge970.2를 보여주는 유전자 세트 농축 분석의 기능적 주석 클러스터링 (functional annotation clustering). 히스토그램은 g: 프로파일러 분석 (Profiler analysis)으로부터 각 유전자 패밀리에 대해 농축된 쿼리 수를 보여준다.
(B). 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-340, -17-3p 및 -222의 조합 조절로 형질감염된 Ge518 및 Ge970.2 간의 비교에 대한 벤 다이어그램.
(C). 차등 발현된 유전자들에 기반하여 miR-Combo 대비 Ge518 및 Ge970.2 miR-Ctrl의 계층적 클러스터링.
(D). 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-340, -17-3p 및 -222의 조합 조절로 형질감염된 Ge518 및 Ge970.2를 비교하는 유전자 세트 농축 분석의 기능적 주석 클러스터링. 히스토그램은 g: 프로파일러 분석으로부터 각 유전자 패밀리에 대해 농축된 쿼리 수를 보여준다.
데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다 (*p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001).
도 6: miR-340, -17-3p 및 -222의 조절은 여러 신호전달 경로에 관여하는 유전자를 조절한다. (A). 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-17-3p, -340, 및 -222-3/5p antagomir의 모방체들로 형질감염된 Ge518을 비교하는 유전자 세트 농축 분석의 기능적 주석 클러스터링. 히스토그램은 각 유전자 패밀리의 농축 지수를 보여준다. (B-D). 차등 발현된 유전자들에 기반하여 24시간 동안 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-340 (B), -17-3p (C), 및 -222-3/5p antagomir (D)의 모방체들로 일시적으로 형질감염된 Ge518의 계층적 클러스터링. (E). mRNA는 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-17-3p, -340, 및 -222-3/5p antagomir (n=3)의 모방체들로 형질감염된 Ge518에서 qPCR에 의해 결정하였다. (F). 단백질은 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-17-3p, -340, 및 -222-3/5p antagomir (n=5)의 모방체들로 형질감염된 Ge518에서 웨스턴 블롯에 의해 결정하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되고 (*p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001), ns = 유의미하지 않음.
도 7: (A). RNASeq 또는 TargetScan으로 확인된 miRNA 잠재적 표적 유전자들 간의 비교에 대한 벤 다이어그램. 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-340, -17-3p 및 -222의 조합 조절로 형질감염된 Ge518 및 Ge970.2. (B). miR-Combo 대 miR-Ctrl의 RNASeq, 및 miR-17-3p, -340, 및 -222 antagomir의 RNASeq 모방체들에서 확인된 차등 발현된 유전자들을 비교하는 유전자 세트 농축 분석의 기능적 주석 클러스터링. 히스토그램은 각 유전자 패밀리의 농축 지수를 보여준다. (C). Ge904 PDCs는 3'UTR 리포터 구조체 및 miR-17-3p 또는 miR-340으로 공동-형질감염되었고, 루시퍼라제 활성은 각 대조군에 대해 정규화하였다.
도 8: miR-340, -17-3p 및 -222의 조합 조절은 GBM PDCs에서 AKT의 활성화를 유도하였다.
(A). 인간 포스포-키나제 어레이 (phosphor-kinase array)는 여러 키나제들 및 이들의 단백질 기질들의 인산화 프로파일의 상대 발현을 보여주었다.
3개의 독립적 실험들의 대표 사진. 히스토그램은 miR-Combo 대 miR-Ctrl 조건에 대해 각 키나제의 배수 변화를 나타내었다.
(B). 인간 포스포-키나제 어레이 (phospho-kinase array)는 여러 키나제들 및 이들의 단백질 기질들의 인산화 프로파일의 상대 발현을 보여주었다. 3개의 독립적 실험들의 대표 사진.
(C). 면역블롯 (immunoblots)은 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-340, -17-3p 및 -222의 조합 조절로 형질감염된 Ge518에 대해 지시된 단백질의 발현을 보여준다. 히스토그램은 밀도측정 분석 (densitometry analysis)에 의해 결정된 단백질 발현의 배수 변화를 보여주었다.
도 9: 신경 오가노이드 (neural organoid)의 GBM PDC 침습은 miR-17-3p, miR-222, 및 miR-340의 조합 조절에 의해 감소하였다.
(A-D). 신경 오가노이드를 향한 PSC 분화의 도식도. PSC는 Matrigel (A)에서 배양한 다음에 3주 (C) 동안 마이크로웰 플레이트 (B)에 응집되었다. (D) 신경 오가노이드에 대한 배양 원리의 도식도.
(E). 면역형광은 신경 오가노이드에 존재하는 NeuN, βIII-튜불린, GFAP, 및 MAP2-면역반응성 세포들을 보여주었다. 스케일 바 = 100 μm.
(F). GAD67, Musashi, Nestin (NES), OLIG2, PSD95, S100B, SOX2 및 βIII-튜불린 (TUBB3) mRNA 발현은 GSC Ge904와 공동-배양하기 전에 신경 오가노이드에서 qPCR에 의해 결정하였다. 데이터는 하우스키핑 유전자에 대해 정규화하였고; 평균 (n=4) ± SEM.
(G). 면역형광은 GSC Ge904 및 신경 오가노이드의 공동-배양에 존재하는 GFAP, 및 βIII-튜불린-면역반응성 세포를 보여주었다. 스케일 바 = 100 μm. 히스토그램은 신경 오가노이드 내에 GBM 세포의 침습 스코어 (invasive score)를 나타내었다.
(H). 면역형광은 신경 오가노이드에 존재하는 Ki-67 및 βIII-튜불린 면역반응성 세포를 보여준다. 스케일 바 = 100 μm. 히스토그램은 신경 오가노이드 내에 GBM 세포의 증식 스코어 (proliferative score)를 나타내었다.
데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다 (*p<0.05, 및 **p<0.01).
도 10: 누드 마우스에서 miR-Combo를 반복적으로 주사하면 종양 성장이 지연된다.
(A). Ge518 종양 성장에 대한 miR-17-3p, miR-222, 및 miR-340의 조합 조절의 인 비보 효과 (그룹당 n=5 마우스).
(B). miR-Combo로 치료한 Ge518 종양의 조직학적 분석. 확인된 단백질에 대해 종양을 염색하고, 헤마톡실린으로 대조염색하였다. 스케일 바, 50 μm.
(C). 히스토그램은 ImageJ를 사용하여 정량화된 단백질 발현의 배수 변화를 나타낸다 (n=3). 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되고 (**p<0.01), ns = 유의미하지 않음.
도 11: miR-17-3p, miR-222, 및 miR-340을 발현하는 안정한 독시사이클린-유도성 렌티벡터 시스템을 보유하는 GSC는 인 비보 세포 생존율의 감소 및 종양 성장의 지연을 유도하였다.
(A). miRGE를 발현하는 Ge518, Ge738, 및 Ge970.2 PDCs의 세포 생존율은 CellTiter-Glo를 사용하여 3일 후에 평가하였다. 히스토그램은 독시사이클린 (Dox)으로의 처리 대 미처리 miRGE에 대한 세포 생존의 배수 변화를 나타낸다.
(B). miRGE를 발현하는 Ge518, Ge738, 및 Ge970.2 GSCs의 세포 생존율은 CellTiter-Glo를 사용하여 3일 후에 평가하였다. 히스토그램은 Dox로의 처리 대 미처리 miRGE에 대한 세포 생존의 배수 변화를 나타낸다.
(C). 3-7개의 독립적 실험들의 대표 사진. 막대 그래프는 Dox로의 처리 대 미처리 GSC miRGE의 배수 변화를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다 (*p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001).
(D). 종양 성장에 대한 Dox 처리에 의해 활성화된 miRGE 발현의 인 비보 효과: 유도성 Tet-On 시스템을 포함하는 Ge518, Ge738, 및 Ge970.2 GSCs (1:1:1)의 혼합물을 누드 마우스의 뇌에 두개내 주사하였다 (치료 그룹에서 n=8 마우스; 비치료 그룹에서 n=7 마우스). Log-rank Mantel-Cox 테스트를 사용하여 유의성을 계산하였다.
도 12: 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-340, -17-3p, 및 -222 antagomir의 모방체들로 일시적으로 형질감염된 A375 (흑색종 세포주), MCF-7 (유방 세포주), A549 (폐암 세포주) 및 Ge360 (뇌막세포종 세포주)의 세포 생존율은 CellTiter-Glo를 사용하여 3 또는 4일 후에 평가하였다. 히스토그램은 miR-Combo 대 miR-Ctrl에 대한 세포 생존의 배수 변화를 나타낸다 (n=3).
(A). miRNA 발현은 비-표적화 스크램블 대조군 (non-targeting scrambled control), 또는 miR-17-3p, -340, -551b, 및 -222 antagomir의 모방체들에 의해 형질감염된 Ge518에서 qPCR에 의해 결정하였다 (n=5-6).
(B). 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-340, -17-3p, 551b 및 -222 antagomir의 모방체들로 일시적으로 형질감염된 Ge518, Ge738, Ge904 및 Ge970.2의 세포 생존율은 CellTiter-Glo를 사용하여 3일 또는 4일 후에 평가하였다. 히스토그램은 miR-Combo 대 miR-Ctrl에 대한 세포 생존의 배수 변화를 나타낸다 (n=4-5).
(C). 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-340, -17-3p, 및 -222 antagomir의 모방체들로 일시적으로 형질감염된 Ge518, Ge738, Ge904 및 Ge970.2의 클론원성은 클론원성 분석 (clonogenic assay)을 사용하여 결정하였다. 3-4개의 독립적 실험들의 대표 사진. 히스토그램은 miR-Combo 대 miR-Ctrl 조건에 대해 형성된 클론의 배수 변화를 나타낸다. 스케일 바 = 10 μm.
(D). 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-340, -17-3p, 및 -222 antagomir의 모방체들로 일시적으로 형질감염된 Ge518, Ge738, Ge904 및 Ge970.2의 이동은 트랜스웰 플레이트 (transwell plates)를 사용하여 결정하였다. 3개의 독립적 실험들의 대표 사진. 히스토그램은 miR-Combo 대 miR-Ctrl 조건에 대해 트랜스웰을 통해 이동된 세포의 배수 변화를 나타낸다. 스케일 바 = 10 μm.
데이터는 평균 ± SEM으로 표시되고 (*p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001), ns = 유의미하지 않음 (non-significant).
도 2: (A-E). miRNA 발현은 비-표적화 스크램블 (A) 대조군, 또는 (B) miR-17-3p, (C) -340, (D) -551b, 및 (E) -222 antagomir의 모방체들에 의해 형질감염된 Ge518에서 qPCR에 의해 결정하였다 (n=5-6). 히스토그램은 하우스키핑 유전자 (housekeeping genes)로 정규화된 각 조건에서 각 miRNA의 발현을 보여준다. (F-I). 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-17-3p (F), -340 (G), 551b (H) 및 -222 (I) antagomir의 모방체들로 일시적으로 형질감염된 Ge518, Ge738, Ge904 및 Ge970.2의 세포 생존율은 CellTiter-Glo를 사용하여 3 또는 4일 후에 평가하였다. 히스토그램은 miR-Combo 대 miR-Ctrl에 대한 세포 생존의 배수 변화를 나타낸다 (n=4-5). 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되고 (*p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001), ns= 유의미하지 않음.
도 3: (A-D). 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-17-3p (A), -340 (B), -551b (C) 및 -222 (D) antagomir의 모방체들로 일시적으로 형질감염된 Ge518, Ge738, Ge904 및 Ge970.2의 클론원성은 클론원성 분석을 사용하여 결정하였다. 히스토그램은 각 조건 대 miR-Ctrl 조건에서 형성된 클론의 배수 변화를 나타낸다. (E). 3-4개의 독립적 실험들의 대표 사진. 스케일 바 = 1 μm. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되고 (*p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001), ns = 유의미하지 않음.
도 4: 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-17-3p (A), -340 (B), -551b (C) 및 -222 (D) antagomir의 모방체들로 일시적으로 형질감염된 Ge518, Ge738, Ge904 및 Ge970.2의 이동은 트랜스웰을 사용하여 결정하였다. 히스토그램은 각 조건 대 miR-Ctrl에 대해 트랜스웰을 통해 이동된 세포의 배수 변화를 나타낸다. 3개의 독립적 실험들의 대표 사진. 스케일 바 = 1 μm.
데이터는 평균 ± SEM으로 표시되고 (*p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001), ns = 유의미하지 않음.
도 5: miR-340, -17-3p 및 -222의 조합 조절은 여러 생물학적 과정 및 대사 경로에 관련된 유전자들을 조절한다.
(A). 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-340, -17-3p 및 -222의 조합 조절로 형질감염된 Ge518 및 Ge970.2를 보여주는 유전자 세트 농축 분석의 기능적 주석 클러스터링 (functional annotation clustering). 히스토그램은 g: 프로파일러 분석 (Profiler analysis)으로부터 각 유전자 패밀리에 대해 농축된 쿼리 수를 보여준다.
(B). 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-340, -17-3p 및 -222의 조합 조절로 형질감염된 Ge518 및 Ge970.2 간의 비교에 대한 벤 다이어그램.
(C). 차등 발현된 유전자들에 기반하여 miR-Combo 대비 Ge518 및 Ge970.2 miR-Ctrl의 계층적 클러스터링.
(D). 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-340, -17-3p 및 -222의 조합 조절로 형질감염된 Ge518 및 Ge970.2를 비교하는 유전자 세트 농축 분석의 기능적 주석 클러스터링. 히스토그램은 g: 프로파일러 분석으로부터 각 유전자 패밀리에 대해 농축된 쿼리 수를 보여준다.
데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다 (*p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001).
도 6: miR-340, -17-3p 및 -222의 조절은 여러 신호전달 경로에 관여하는 유전자를 조절한다. (A). 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-17-3p, -340, 및 -222-3/5p antagomir의 모방체들로 형질감염된 Ge518을 비교하는 유전자 세트 농축 분석의 기능적 주석 클러스터링. 히스토그램은 각 유전자 패밀리의 농축 지수를 보여준다. (B-D). 차등 발현된 유전자들에 기반하여 24시간 동안 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-340 (B), -17-3p (C), 및 -222-3/5p antagomir (D)의 모방체들로 일시적으로 형질감염된 Ge518의 계층적 클러스터링. (E). mRNA는 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-17-3p, -340, 및 -222-3/5p antagomir (n=3)의 모방체들로 형질감염된 Ge518에서 qPCR에 의해 결정하였다. (F). 단백질은 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-17-3p, -340, 및 -222-3/5p antagomir (n=5)의 모방체들로 형질감염된 Ge518에서 웨스턴 블롯에 의해 결정하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되고 (*p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001), ns = 유의미하지 않음.
도 7: (A). RNASeq 또는 TargetScan으로 확인된 miRNA 잠재적 표적 유전자들 간의 비교에 대한 벤 다이어그램. 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-340, -17-3p 및 -222의 조합 조절로 형질감염된 Ge518 및 Ge970.2. (B). miR-Combo 대 miR-Ctrl의 RNASeq, 및 miR-17-3p, -340, 및 -222 antagomir의 RNASeq 모방체들에서 확인된 차등 발현된 유전자들을 비교하는 유전자 세트 농축 분석의 기능적 주석 클러스터링. 히스토그램은 각 유전자 패밀리의 농축 지수를 보여준다. (C). Ge904 PDCs는 3'UTR 리포터 구조체 및 miR-17-3p 또는 miR-340으로 공동-형질감염되었고, 루시퍼라제 활성은 각 대조군에 대해 정규화하였다.
도 8: miR-340, -17-3p 및 -222의 조합 조절은 GBM PDCs에서 AKT의 활성화를 유도하였다.
(A). 인간 포스포-키나제 어레이 (phosphor-kinase array)는 여러 키나제들 및 이들의 단백질 기질들의 인산화 프로파일의 상대 발현을 보여주었다.
3개의 독립적 실험들의 대표 사진. 히스토그램은 miR-Combo 대 miR-Ctrl 조건에 대해 각 키나제의 배수 변화를 나타내었다.
(B). 인간 포스포-키나제 어레이 (phospho-kinase array)는 여러 키나제들 및 이들의 단백질 기질들의 인산화 프로파일의 상대 발현을 보여주었다. 3개의 독립적 실험들의 대표 사진.
(C). 면역블롯 (immunoblots)은 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-340, -17-3p 및 -222의 조합 조절로 형질감염된 Ge518에 대해 지시된 단백질의 발현을 보여준다. 히스토그램은 밀도측정 분석 (densitometry analysis)에 의해 결정된 단백질 발현의 배수 변화를 보여주었다.
도 9: 신경 오가노이드 (neural organoid)의 GBM PDC 침습은 miR-17-3p, miR-222, 및 miR-340의 조합 조절에 의해 감소하였다.
(A-D). 신경 오가노이드를 향한 PSC 분화의 도식도. PSC는 Matrigel (A)에서 배양한 다음에 3주 (C) 동안 마이크로웰 플레이트 (B)에 응집되었다. (D) 신경 오가노이드에 대한 배양 원리의 도식도.
(E). 면역형광은 신경 오가노이드에 존재하는 NeuN, βIII-튜불린, GFAP, 및 MAP2-면역반응성 세포들을 보여주었다. 스케일 바 = 100 μm.
(F). GAD67, Musashi, Nestin (NES), OLIG2, PSD95, S100B, SOX2 및 βIII-튜불린 (TUBB3) mRNA 발현은 GSC Ge904와 공동-배양하기 전에 신경 오가노이드에서 qPCR에 의해 결정하였다. 데이터는 하우스키핑 유전자에 대해 정규화하였고; 평균 (n=4) ± SEM.
(G). 면역형광은 GSC Ge904 및 신경 오가노이드의 공동-배양에 존재하는 GFAP, 및 βIII-튜불린-면역반응성 세포를 보여주었다. 스케일 바 = 100 μm. 히스토그램은 신경 오가노이드 내에 GBM 세포의 침습 스코어 (invasive score)를 나타내었다.
(H). 면역형광은 신경 오가노이드에 존재하는 Ki-67 및 βIII-튜불린 면역반응성 세포를 보여준다. 스케일 바 = 100 μm. 히스토그램은 신경 오가노이드 내에 GBM 세포의 증식 스코어 (proliferative score)를 나타내었다.
데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다 (*p<0.05, 및 **p<0.01).
도 10: 누드 마우스에서 miR-Combo를 반복적으로 주사하면 종양 성장이 지연된다.
(A). Ge518 종양 성장에 대한 miR-17-3p, miR-222, 및 miR-340의 조합 조절의 인 비보 효과 (그룹당 n=5 마우스).
(B). miR-Combo로 치료한 Ge518 종양의 조직학적 분석. 확인된 단백질에 대해 종양을 염색하고, 헤마톡실린으로 대조염색하였다. 스케일 바, 50 μm.
(C). 히스토그램은 ImageJ를 사용하여 정량화된 단백질 발현의 배수 변화를 나타낸다 (n=3). 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되고 (**p<0.01), ns = 유의미하지 않음.
도 11: miR-17-3p, miR-222, 및 miR-340을 발현하는 안정한 독시사이클린-유도성 렌티벡터 시스템을 보유하는 GSC는 인 비보 세포 생존율의 감소 및 종양 성장의 지연을 유도하였다.
(A). miRGE를 발현하는 Ge518, Ge738, 및 Ge970.2 PDCs의 세포 생존율은 CellTiter-Glo를 사용하여 3일 후에 평가하였다. 히스토그램은 독시사이클린 (Dox)으로의 처리 대 미처리 miRGE에 대한 세포 생존의 배수 변화를 나타낸다.
(B). miRGE를 발현하는 Ge518, Ge738, 및 Ge970.2 GSCs의 세포 생존율은 CellTiter-Glo를 사용하여 3일 후에 평가하였다. 히스토그램은 Dox로의 처리 대 미처리 miRGE에 대한 세포 생존의 배수 변화를 나타낸다.
(C). 3-7개의 독립적 실험들의 대표 사진. 막대 그래프는 Dox로의 처리 대 미처리 GSC miRGE의 배수 변화를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다 (*p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001).
(D). 종양 성장에 대한 Dox 처리에 의해 활성화된 miRGE 발현의 인 비보 효과: 유도성 Tet-On 시스템을 포함하는 Ge518, Ge738, 및 Ge970.2 GSCs (1:1:1)의 혼합물을 누드 마우스의 뇌에 두개내 주사하였다 (치료 그룹에서 n=8 마우스; 비치료 그룹에서 n=7 마우스). Log-rank Mantel-Cox 테스트를 사용하여 유의성을 계산하였다.
도 12: 비-표적화 스크램블 대조군, 또는 miR-340, -17-3p, 및 -222 antagomir의 모방체들로 일시적으로 형질감염된 A375 (흑색종 세포주), MCF-7 (유방 세포주), A549 (폐암 세포주) 및 Ge360 (뇌막세포종 세포주)의 세포 생존율은 CellTiter-Glo를 사용하여 3 또는 4일 후에 평가하였다. 히스토그램은 miR-Combo 대 miR-Ctrl에 대한 세포 생존의 배수 변화를 나타낸다 (n=3).
실시예
실시예 1
물질 및 방법
GBM 세포주 및 환자-유래 모델
서로 다른 서브타입인 Ge269, 518, 835, (중간엽 서브타입) 738, 898,(전신경 서브타입) 885, (신경 서브타입) 904, 970.2 (고전적 서브타입) 유래의 8개의 교모세포종 줄기세포 (GSC)를 이전에 설명된 바와 같이 B27 보충제 및 b-FGF, EGF 모두 10 ng/ml, 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 Glutamax를 가진 DMEM/F12에서 배양하였다 (Cosset, E, et al. (2016). Human tissue engineering allows the identification of active miRNA regulators of glioblastoma aggressiveness. Biomaterials 107: 74-87). GBM 환자-유래 세포 (PDC)를 생성하기 위해, GSCs를 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)-고글루코스/glutamax, 10% 우태아 혈청 (FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (GDC 배지)으로 전달하고 이들을 유지하였다.
화학물질
악티노마이신 D 및 독시사이클린은 Sigma로부터 입수하였고, 각각 5 μM 및 1 mg/ml의 농도로 24시간 동안 사용하였다.
세포 형질감염
miR-17-3p, miR-340-5p 및 miR-551b 모방체들, 및 miR-222-3p antagomir를 제조자의 프로토콜에 따라 최종 농도 5 nM으로 리포펙타민 RNAimax (Invitrogen)를 사용하여 형질감염시켰다. 비-표적화 스크램블 miRNA (Life Technologies)를 대조군으로 사용하였다.
세포 생존율 분석
세포 생존율 분석은 이전에 설명된 바와 같이 CellTiter-Glo 분석 키트 (Promega)를 사용하여 수행하였다 (Cosset, E, et al. (2016). Human tissue engineering allows the identification of active miRNA regulators of glioblastoma aggressiveness. Biomaterials 107: 74-87; Cosset, E, et al. (2017). Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell 32: 856-868 e855).
세포 이동
세포 (2x104)를 무혈청 (0% FBS) GDC 배지내 트랜스웰 폴리카보네이트 막 인서트 (24웰, 8 μm 공극, Corning)의 필터 상에 시딩하고, 하부 구획을 10% FBS GDC 배지로 충전하였다. 이동 평가를 위해 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후에, 하부 표면 상의 부착 세포를 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 정량 및/또는 계수하였다. EVOS 현미경 (Life Technologies)을 사용하여 이미지를 캡쳐하고, 수동으로 계산하였다.
miRGE 렌티벡터
miR-17-3p, miR-340-5p 및 miR-222-3p를 포함하는 miRGE 구조체를 이전에 보고된 바와 같이 Vector Lab (Dr. Patrick Salmon, University of Geneva)에서 생성하였다 (Myburgh, R, et al. (2014). Optimization of Critical Hairpin Features Allows miRNA-based Gene Knockdown Upon Single-copy Transduction. Mol Ther Nucleic Acids 3: e207).
루시퍼라제 분석
0일째 (D0)에서, miR-340 및 miR-17-3p를 발현하지 않기 때문에 선택된 PDCs Ge904를 24웰 플레이트에 웰당 80,000개 세포로 시딩하였다. 24시간 후 D1에서, 제조자의 프로토콜에 따라 리포펙타민 3000 (L3000-008 Invitrogen)을 사용하여 상응하는 miRNA 및 플라스미드로 세포를 형질감염시켰다. 24시간 후 D2에서, 이중 루시퍼라제 리포터 분석 (Dual Luciferase Reporter Assay)의 수동 용해 완충제 (E1910 Promega)를 사용하여 웰에서 세포를 용해시킨 후에, 제조자의 프로토콜에 따라 발광을 측정하였다. 결과는 Renilla 대조군에 대해 정규화하였다.
신경 오가노이드
인간 유도 만능성 줄기세포주 (iPSCs) 및 배아 줄기세포 (ESCs)를 사용하여 이전에 설명된 바와 같이 약간의 수정을 적용하여 신경 오가노이드를 생성하였다 (Cosset, E, et al. (2019). Human Neural Organoids for Studying Brain Cancer and Neurodegenerative Diseases. J Vis Exp.). iPSCs는 친절하게도 Dr. Youssef Hibaoui가 제공하였고, 이전에 설명된 바와 같이 생성하였다 (Hibaoui, Y, et al. (2014). Modelling and rescuing neurodevelopmental defect of Down syndrome using induced pluripotent stem cells from monozygotic twins discordant for trisomy 21. EMBO Mol Med 6: 259-277.). 상기 인간 ESCs인 HS420은 친절하게도 Karl-Heinz Krause 교수가 제공하였다.
인간 포스포-키나제 분석
키나제들의 인산화 프로파일들은 제조자의 권장사항에 따라 인간 포스포-키나제 어레이 키트 (R&D Systems)를 사용하여 수행하였다.
정량화를 위해, 분석 겔, 플롯 레인 코맨드 (analyze gels, plot lane command)를 사용하여 Image J 소프트웨어에서 점들 (dots)을 분석하였다. 모든 점들은 음성 대조군에 대해 정규화하였다. Combo 조건은 대조군 조건에 대해 정규화하였다.
면역블로팅
단백질을 IP-MS 세포 용해 완충액 (Life Technologies)에서 추출하고, 이전에 설명된 바와 같이 Pierce BCA 키트 (Thermo Fisher)를 사용하여 정량화하였다 (Cosset, E, et al. (2017). Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell 32: 856-868 e855). 면역블롯팅에는 하기 항체들을 사용하였다: 비멘틴 (Millipore), p-P70 S6 키나제 (Cell Signaling), P70 S6 키나제 (Cell Signaling), pAKT (Cell Signaling), AKT (Cell Signaling), GAPDH (Cell Signaling), 및 로딩 대조군으로서 β-액틴 HRP (Sigma-Aldrich). 단백질 발현 분석을 위해, 발현을 β-액틴에 대해 정규화한 다음에, 이들 각각의 대조군과 비교하였다.
면역조직화학 (IHC) 및 면역형광 (IF) 포르말린-고정 파라핀-포매된 조직의 IHC 및 IF 염색은 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다 (Cosset, E, et al. (2016). Human tissue engineering allows the identification of active miRNA regulators of glioblastoma aggressiveness. Biomaterials 107: 74-87; Cosset, E, et al. (2017). Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell 32: 856-868 e855). 그 다음에 절편을 1차 항체 pAKT (Cell Signaling), AKT (Cell Signaling), Ki-67 (Chemicon), 및 CD31 (Abcam)과 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션한 다음에, IHC의 경우 비오틴-접합된 항-토끼 IgG 및 3,3'-디아미노벤지딘 기질 (Vector)을 사용한 아비딘-비오틴 퍼옥시다제 검출 시스템과 인큐베이션한 다음에, 헤마톡실린 (Sigma)으로 대조염색하였다. IF의 경우 절편을 1차 항체 βIII-튜불린 (Covance), GFAP (Dako), MAP-2 (Millipore), NeuN (Millipore), Ki-67 (Chemicon)과 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 다음, 형광색소-표지된 2차 항체를 사용하였다: 마우스, 염소 또는 토끼에 대한 염소 또는 당나귀 유래의 Alexa Fluor (555 및/또는 488)-표지된 항체 (Molecular Probes).
역전사 정량적 PCR (RT-qPCR)
전체 RNA의 단리는 제조자의 지침에 따라 이전에 설명한 바와 같이 Qiagen의 RNeasy 키트를 사용하여 수행하였다 (Cosset, E, et al. (2016). Human tissue engineering allows the identification of active miRNA regulators of glioblastoma aggressiveness. Biomaterials 107: 74-87). 프라이머 서열은 표 1 및 2에 기재되어 있다.
활용하기 전에, 효능 테스트를 수행하였고, 모든 프라이머를 검증하였다. 적어도, 2개의 하우스키핑 유전자 (EEF1A1, 및 ALAS1)를 정규화에 사용하였다. RT-PCR 반응은 적어도 3회의 기술적 및 생물학적 3회 반복으로 수행하였고, 평균 주기 역치 (CT) 값을 결정하였다. miRNAs의 경우, miR-16-5p 및 miR-191-5p를 검증하였고, 하우스키핑 유전자로서 사용하였다.
RNASeq 데이터 분석
이전에 설명한 바와 같이 (Cosset, E, et al. (2016). Human tissue engineering allows the identification of active miRNA regulators of glioblastoma aggressiveness. Biomaterials 107: 74-87), 전체 RNA를 Trizol 방법을 사용하여 추출하였다. 그 다음에, RNA 품질을 확인한 후에, SR100 - 라이브러리 TruSeqHT 표준 - Illumina HiSeq 4000을 사용하고, FastQC v.0.11.5를 사용하여 시퀀싱 품질 관리를 수행하였다.
그 다음에, Morpheus (https://software.broadinstitute.org/morpheus)를 통해 계층적 클러스터링을 생성하였다.
인 실리코 데이터 분석
Gliovis는 TCGA 데이터세트 (http://gliovis.bioinfo.cnio.es/)에서 표적 유전자의 Kaplan-Meier log-rank-테스트 분석을 위한 p-값을 검색하는데 사용하였다. 유전자 농축 분석은 g:Profiler 및 DAVID Bioinformatics 리소스를 사용하여 수행하였다 (Raudvere, U, et al. (2019). g:Profiler: a web server for functional enrichment analysis and conversions of gene lists (2019 update). Nucleic Acids Res 47: W191-W198; Huang da, W, et al. (2009). Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res 37: 1-13.; Huang da, et al.(2009). Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc 4: 44-57).
TCGA 분석
miRNA 발현 데이터 및 GBM 샘플에 대한 해당 임상 데이터를 TCGA 데이터 포털에서 다운로드하고 (http://cancergenome.nih.gov/), 이전에 설명한 바와 같이 분석하였다 (Cosset, E, et al. (2016). Human tissue engineering allows the identification of active miRNA regulators of glioblastoma aggressiveness. Biomaterials 107: 74-87).
피하 주사
모든 동물 절차는 기관 동물 관리에서 정한 표준에 따라 승인된 프로토콜 GE/38/20에 따라 제네바 동물 연구 윤리 위원회에 따라 수행하였다. Ge518 및 Ge738 GSCs (200 μl의 PBS 중 5 x 106개의 종양 세포)를 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 크기가 150 mm3 크기에 도달할 때까지 이를 캘리퍼스를 사용하여 1주당 3회 모니터링하였다.
투약
모방체-인비보펙타민 및 antagomir-인비보펙타민 복합체를 제조자의 지침에 따라 제조하였다. 모방체/antagomir의 최종 농도는 마우스당 200 μl당 1.75 mg/ml (5 nmol에 해당)이었다. 제1 펄스로서, 마우스에게 앞서 언급한 농도를 2회 주사한 다음에, 격일로 마우스당 200 μl당 0.875 mg/ml (2.5 nmol에 해당)를 주사하였다. 상기 용액을 주사할 때까지 실온에서 유지하였다. mirVanaTM 음성 대조군 모방체를 대조 그룹으로 사용하였다. 본 발명자는 모방체의 경우 mirVanaTM miR-17-3p (MC12246), mirVanaTM miR-340-5p (MC12670)를 사용하였고, antagomir의 경우 mirVanaTM miR-222 (MH11376)를 사용하였다.
정위 뇌종양 주사
6-10 주령 암컷 nu/nu 면역저하 마우스에게 miRGE를 보유하는 Ge518, Ge738 및 Ge970.2를 세척하고 PBS에서 재현탁한 후에 정위로 이식하였다.
정량화 및 통계 분석
각 실험의 샘플 크기 및 통계는 결과 섹션 및 도면 범례에 제공된다. 표시된 데이터는 도면 범례에 명시된 바와 같이 다수의 실험들에서 수득한 결과를 나타낸다. 모든 통계 분석은 ANOVA (one-way analysis of variance) 및 Student's t-테스트를 사용하여 수행하였고, 여기서 p＜0.05는 유의미한 것으로 간주하였다. 모든 통계 분석은 Prism 소프트웨어 GraphPad를 사용하여 수행하였다. Chi-squared 테스트 또는 t-테스트를 사용하여 통계적 유의성을 계산하였다.
결과
miR-17-3p, miR-222, 및 miR-340의 조합 조절은 GBM 세포 생존율, 클론원성 및 이동 능력을 억제한다
본 발명자는 먼저 miR-17-3p, miR-340 및 miR-551b가 발현되지 않거나 또는 낮은 수준으로 발현되고, miR-222가 발현되는 PDCs를 선택하였다. 실제로, 본 발명자는 miR-17-3p, miR-340 및 miR-551b 발현을 증가시키고, miR-222 발현을 감소시키는 것을 목표로 하였다. 정량적 RT-PCR (RT-qPCR)을 사용하여 9개의 환자-유래 GBM 세포 및 2개의 확립된 세포주 (U87MG 및 U251)를 스크리닝한 후에, Ge518이 miRNA 발현 조절을 위한 최적의 환자-유래 세포 (PDC) 모델인 것으로 나타났다 (표 3).
본 발명자는 miRNA-기반 다중-표적화 요법이 GBM 환자에게 더 유익할 것이라고 판단하였다. 이러한 가설을 테스트하기 위해, Ge518 PDCs에서 조합된 모방체 및 antagomir (miR-Combo)를 사용하여 각각 이소성으로 발현하거나 또는 발현을 억제하였다. 정량적 스템-루프 실시간 RT-PCR을 통해 miRNA 조절을 확인한 후에 (도 1의 A), 본 발명자는 형질감염 후 3일째에 세포 생존율을 측정하였고 (도 1의 B), 비-표적화 스크램블 대조군 (miR-Ctrl)과 비교하여 miR-Combo를 사용하여 세포 생존율이 유의미하게 감소하는 것을 관찰하였다. 이전에 보고된 바와 같이, Ge518은 중간엽 표현형을 보였다 (Cosset, et al. (2017). Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell 32: 856-868.e855). 전신경 및 고전적 표현형을 갖는 다른 환자-유래 모델에서 miR-Combo의 억제 가능성을 확인하기 위해, 본 발명자는 또한 형질감염 후에 Ge738 (전신경 서브타입), Ge904 및 Ge970.2 (고전적 서브타입) (Cosset, et al. (2017). Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell 32: 856-868.e855) 세포 생존율을 테스트하였다 (도 2의 B). 본 발명의 결과는 모든 PDCs에 대한 세포 생존율의 유의미한 억제를 보여주었고, 이는 확인된 miRNAs의 차등 발현을 가진 임의의 서브타입의 GBM 세포가 miR-Combo를 사용하여 치료적으로 표적화될 수 있음을 나타낸다. 그 다음에, 본 발명자는 어떤 miRNA가 이러한 억제를 담당하는지 이해하고자 하였다. 결과적으로, 본 발명자는 각 miRNA를 개별적으로 형질감염시키고, 이들의 조절을 확인하고 (보충 도 2의 A-D), PDC 생존율을 분석하였다. 보충 도 2의 F-I에 도시된 바와 같이, 본 발명자는 주로 miR-17-3p 및 miR-340을 통해 여러 PDCs의 세포 생존율이 유의미하게 감소하는 것을 관찰하였다. Ge970.2에서는 miR-222에 대해 세포 생존율의 억제 경향이 나타났고, Ge518에서는 유의미한 억제가 발견되었다 (보충 도 2의 I).
그 다음에, miR-Combo의 생물학적 효과를 더 잘 특성화하기 위해, 본 발명자는 또한 GBM PDCs의 이동 및 클론원성 가능성을 분석하였다. miRNAs의 조합 조절은 모든 PDCs에서 세포 클론원성 및 이동의 유의미한 감소를 유도하였다 (도 1의 C-D). 마찬가지로, 각 miRNA를 개별적으로 형질감염시킨 후에, 본 발명자는 miR17-3p, miR-340, 및 miR-222가 관찰된 생물학적 효과의 대부분을 매개하고, 다양한 PDCs에 대한 서로 다른 효과가 있음을 보여주었고, 이는 이들 모두를 조합 전략에 사용할 필요성을 강조하였다 (도 3 및 도 4). 전체적으로, 본 발명의 데이터는 miR-17-3p, miR-340 및 miR-222가 생존, 클론원성 및 이동 능력에 영향을 주어 GBM 공격성을 억제하는 것을 입증하였다.
miR-17-3p, miR-222 및 miR-340의 조절은 세포 생존율에 관여하는 유전자를 조절한다
유전자 조절 수준에서 miR-Combo의 효과를 이해하기 위해, 비-표적화 스크램블 대조군과 비교하여 miR-Combo로 형질감염된 Ge518 및 Ge970.2 PDCs 모두에서 전체 전사체 분석을 수행하였다 (도 5의 A). 벌크 mRNA 추출 후에, RNASeq 분석은 각 세포주에 대해 3개의 생물학적 복제로 수행하였다. Ge518 PDCs에서, 유전자 온톨로지 농축 분석 (gene ontology enrichment analysis)을 통해 3가지 주요 패밀리에 관여하는 유전자의 발현을 나타내었다: 세포 및 생물학적 과정 (MT2A, CDKL5, CXCR4, MAPK14, PLXNA4, RAB21, TGFBR3, VGLL4), 양이온 수송 및 항상성 (CHRNB2, RRAD, CACNA1H, GPR35, P2RX5, ATP2A1), 및 성장 조절 (MAPK11, NRCAM, SHTN1, SMURF1, CDKN1B, TNKS2, GDF5, VGLL4) (도 5의 A). g :Profiler 22를 통한 miRNA-표적 상호작용 데이터베이스인 miRTarBase 분석에서 miR-340-5p (ROCK1, LIMS1, ANKRD40, SKP2, FRS2) 및 miR-9-5p (SFT2D2, DICER1, IGF2BP3, SPON2, CXCR4, SERPINH1, RAP2A) 표적 유전자의 농축을 보여주었다. Ge970.2 PDCs에서, 항바이러스 반응 및 타입 I 인터페론 신호전달에 관여하는 유전자에 대한 강력하고 유의미한 농축을 발견하였다 (OAS-1, -2, -3, -L, MX-1, -2, IFI44L) (도 5의 A). 더욱이, NRF2 경로 (NFE2L2, GCLC, NQO1, YES1) 뿐만 아니라 대사 재프로그래밍 (metabolic reprogramming) 및 펜토스 포스파제 과정 및 경로에 관여하는 유전자 (TKT, G6PD, PGD, TALDO1), 및 산화 스트레스에 관여하는 유전자가 풍부하게 발견되었다. 전체적으로, 이러한 분석은 2개의 모델에서 miR-Combo에 대한 서로 다른 세포 반응을 보여주었다. 공통 적중 (hits)을 확인하기 위해, 본 발명자는 PDCs, Ge518 및 Ge970.2의 전사 프로파일링을 비교하였고, 54개의 공통 유전자를 발견하였다 (도 5의 B). 계층적 클러스터링 데이터는 먼저 샘플들을 세포주별로 그룹화하여, 본 발명자 및 당업자가 이미 설명한 바와 같이 GBM 세포주의 이질성 (heterogeneity)의 유의미한 수준을 확인하였다 (도 5의 C) (Calvo Tardon et al. (2020). An Experimentally Defined Hypoxia Gene Signature in Glioblastoma and Its Modulation by Metformin. Biology (Basel) 9 ; Sottoriva, A, et al. (2013). Intratumor heterogeneity in human glioblastoma reflects cancer evolutionary dynamics. Proc Natl Acad Sci U S A 110: 4009-4014 ; Patel, et al. (2014). Singlecell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma. Science 344: 1396- 1401). 그 다음에, 상기 데이터를 조건에 따라 miR-Combo 대 miR-Ctrl로 그룹화하였다. PDCs 모두의 경우, 본 발명자는 GBM 공격성에 관여하는 것으로 이미 밝혀진 여러 유전자들 예컨대 ROCK1 18, 26, LIMS1 18, SKP2 27, NFE2L2 28, RAB2129의 유의미한 감소를 관찰하였다. 대조적으로, 종양 억제인자로서 이미 확인된 ELAVL2, RAD9B 및 CNOT3의 발현 (Nord, H, et al. (2009). Characterization of novel and complex genomic aberrations in glioblastoma using a 32K BAC array. Neuro Oncol 11: 803-818), 및 세포 주기 진행 31의 억제제는 각각 miR-Combo 조건에서 상향조절되었다 (도 5의 C). 마지막으로, 유전자 온톨로지 농축 분석을 통해 여러 miRNA 예컨대 miR-340-5p 및 miR-4255 (KLHL15, LRRC58, OTUD4, SEC23A, SUCO)에 대한 농축을 확인하였다 (도 5의 D). 종합적으로, 본 발명의 데이터는 miR-Combo 형질감염 후 GBM PDCs에서 조절되는 중요한 유전자의 서브세트를 강조하였다.
그 다음에, 각 miRNA의 효과를 개별적으로 조사하기 위해, 전체 전사체 분석을 miR-17-3p, 및 miR-340 모방체 및 miR-222 antagomir로 형질감염된 Ge518 세포주에서 수행하였다. 상기 유전자 온톨로지 농축 분석은 miR-17-3p 및 miR-222에 대한 공통 경로로서 스트레스에 대한 세포 반응에 관여하는 유전자의 발현을 보여주었다 (도 6의 A). 더욱이, 본 발명자는 miR-340 및 miR-222에 대한 신호 전달에 관여하는 유전자를 발견하였다. miR-340의 경우, 이전에 개시된 바와 같이 (Cossetet al. (2016). Human tissue engineering allows the identification of active miRNA regulators of glioblastoma aggressiveness. Biomaterials 107: 74-87 ; Fiore, D, et al. (2016). miR-340 predicts glioblastoma survival and modulates key cancer hallmarks through down-regulation of NRAS. Oncotarget 7: 19531-19547), 상이한 세포 환경에서, 본 발명자는 miR-340 표적 유전자로서 ROCK1 및 LIMS1을 확인하였다 (도 6의 A-B). 더욱이, 본 발명자는 뉴런 발달 및 분화, 작은 GTPase 매개 신호 전달 및 세포 표면 수용체 신호전달 경로에 관여하는 유전자를 검출하였다. miR17-3p의 경우, 본 발명자는 형태형성 및 배아 발달, 스트레스에 대한 세포 반응 및 유기질소 화합물에 대한 반응에 관여하는 3가지 유전자 패밀리를 발견하였다 (도 6의 A, C). miR-222의 경우, 산화 스트레스/반응성 산소종/약물에 대한 반응, 조혈 및 면역계 발달, 및 RNA 폴리머라제에 의한 전사 조절에 여러 유전자 패밀리가 조절장애가 있는 것으로 밝혀졌다 (도 6의 A, D). 이러한 결과를 확인하기 위해, 각 기능성 패밀리의 대표 유전자 세트를 선택하고, 정량적 RT-PCR 및/또는 웨스턴 블롯을 통해 검증하였다 (도 6의 E-F). 또한, miR-340의 경우 NFE2L2, COL5A3 및 BDKRB2, miR-222의 경우 ZFP36, NFKBIZ, 및 NTN1, 및 miR-17-3P의 경우 LITAF, 및 F2RL2와 같은 여러 유전자의 발현이 생존율 저하와 상관관계가 있다 (표 4).
주목할 점은 본 발명자가 RNASeq 분석을 예측된 miRNA 표적 유전자와 비교한 경우, 상대적으로 짧은 수의 공통 적중을 발견하였다 (도 7의 A). 각 miRNA에 대해 개별적으로 수행된 RNASeq를 사용한 miR-Combo 대 miR-Control (miR-Ctrl)의 RNASeq는 각 miRNA가 조합 전략에 의해 매개되는 유전자 조절에 기여하는 것을 보여주었다 (도 7의 B).
3'UTR의 miRNA 표적화를 검증하기 위해, E2F-3'UTR 및 TNFRSF-3'UTR의 전체 길이를 포함하는 루시퍼라제 리포터 구조체를 사용하고, miR-Ctrl 대 miR-17-3p 및 miR-340 각각을 사용하여 Ge904 모델에서 일시적으로 공동-형질감염시켰다 (도 7의 C). miR-17-3p 및 miR-340의 이소성 발현은 리포터 구조체를 함유하는 세포에서 이들의 각 대조군과 비교하여 루시퍼라제 활성을 1.5배 감소시켰으며, 이는 확인된 miRNAs가 활성 miRNAs로 작용한다는 증거를 제공한다.
기계적으로, 상기 miR-Combo가 다운스트림 신호전달을 조절할 수 있는지를 확인하고 이해하기 위해, 본 발명자는 인간 포스포-프로테옴 어레이를 사용하여 포스포-키나제 활성을 분석하였다 (도 8의 A-B). 형질감염 후에, 상기 Ge518 PDCs를 프로테옴 프로파일러 어레이 (proteome profiler array)에 적용하였고, 이는 세포 용해물에서 인산화된 단백질을 검출한다. 본 발명자는 p70 S6 키나제의 유의미한 활성화, 및 AKT 및 PRAS40 활성의 유의미한 억제를 확인하였다 (도 8의 A). mTOR의 다운스트림 기질인 리보솜 S6 단백질 키나제, p70 S6 키나제는 세포-주기 진행 및 세포 생존을 제어하는 역할로 알려져 있다. 더욱이, PRAS40은 포유동물의 라파마이신 C1 표적 (mTORC1) 활성을 억제하는 것으로 알려져 있다. 실제로, PRAS40은 Raptor에 결합함으로써, mTOR 기질인 4E-BP1 및 p70S6K와 경쟁한다. 이러한 데이터는 세포가 miR-Combo로 형질감염된 경우 관찰된 세포 생존의 억제와 일치한다. 이러한 결과를 확인하기 위해, 본 발명자는 면역블롯팅을 통해 AKT 및 P70 S6 키나제의 발현 및 활성화를 분석하였다 (도 8의 C). 본 발명자는 P70 S6 인산화가 증가하는 경향을 관찰하였더라도, 이의 활성이 유의미하게 조절되는 것은 관찰하지 못했다. 흥미롭게도, 본 발명자는 대조군과 비교하여 상기 콤보에서 P70 S6 키나제 풀 (pool)의 증가 경향을 관찰하였다 (도 8의 C).
대조적으로, AKT 전체에 대한 콤보 및 대조군 간에는 차이가 발견되지 않았으며, 콤보에서 AKT 활성화의 유의미한 증가가 관찰되어, 인간 포스포-프로테옴 분석을 확인하였다.
miR-17-3p, miR-222, 및 miR-340의 조합 조절은 신경 오가노이드에서 GBM PDC 침습을 억제한다
본 발명자는 최근 만능성 줄기세포 (PSCs) 유래의 조직으로부터 성상-신경 (astro-neural) 운명을 향한 3D 인간 뇌-유사 조직을 생성하는 인 비트로 조직 공학 접근법을 개발하였다 (Cosset, et al. (2016). Human tissue engineering allows the identification of active miRNA regulators of glioblastoma aggressiveness. Biomaterials 107: 74-87 ; Cosset, et al. (2019). Human Neural Organoids for Studying Brain Cancer and Neurodegenerative Diseases. J Vis Exp.). 이전에, 본 발명자는 GBM 세포가 증식하여 뇌-유사 조직으로 발전하여, 인 비보 숙주/종양 상호작용의 일부 임계적 중요한 특징을 모방하는 혼합 조직을 생성하는 것을 나타내었다 (Cosset, et al. (2016). Human tissue engineering allows the identification of active miRNA regulators of glioblastoma aggressiveness. Biomaterials 107: 74-87 ; Nayernia, et al. (2013). The relationship between brain tumor cell invasion of engineered neural tissues and in vivo features of glioblastoma. Biomaterials 34: 8279-8290.). 그러므로, miRNA combo (miR-Combo)의 억제 가능성을 3D로 연구하기 위해, 본 발명자는 이러한 프로토콜을 사용하여 신경 오가노이드를 생성하였다 (도 9의 A-D). 신경 오가노이드의 특성화는 mRNA 및 단백질 수준에서 신경 (βIII-튜불린 (TUBB3), MAP2 및 NeuN), 성상세포 (GFAP, S100B) 및 희소돌기아교세포 (OLIG2) 마커의 발현을 보여주었고, 이는 신경 성숙을 확인하였다 (도 9의 E-F). GBM 줄기세포 (GSC)는 종양 내에서 가장 공격적이고 약물 내성이 있는 세포를 나타내고, 자가-재생 및 종양-개시 특성을 나타내기 때문에, 본 발명자는 이를 miRNA 다중-표적화 전략을 확인하기 위한 모델로서 사용하기로 결정하였다 (Singh, et al. (2004). Identification of human brain tumour initiating cells. Nature 432: 396-401 ; Baoet al. (2006). Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature 444: 756-760). 본 발명자는 GSC Ge904를 신경 오가노이드와 24시간 동안 공동-배양한 후에, miR-Combo로 형질감염시켰다 (도 9의 G-H). 형질감염 후 4일째에, GSC Ge904의 경우, 본 발명자는 각각의 마커인 GFAP 및 Ki-67을 사용하여 세포 침습 및 증식을 평가하였고, 신경 오가노이드는 βIII-튜불린을 사용하였다 (도 9의 G-H). 본 발명자는 miR-Ctrl 조건에서 GSCs가 신경 오가노이드로 침습하였고, miR-Combo로 형질감염된 세포는 콤팩트하고 침습되지 않은 것을 관찰하였다 (도 9의 G). miR-Control 조건에서는 상기 GSCs가 증식함에 따라 더 커지는 반면에, miR-Combo에서는 상기 GSCs가 증식을 정지하는 것처럼 더 작아진다 (도 9의 H). 따라서, 본 발명자는 일차 부위로부터 멀리 떨어진 침습성 단일 세포에서 Ki-67에 대한 더 강한 신호를 관찰하였다. 종합적으로, 이러한 데이터는 miRNAs가 3D 공동-배양에 침투하고, 이의 증식 및 침입 능력을 억제하여 GBM 세포 행동에 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다.
GBM 이종이식편의 종양 성장은 miR-17-3p, miR-222 및 miR-340 combo 치료로 감소한다
본 발명의 연구 결과를 임상에 적용하기 위해, 본 발명자는 인 비보에서 Ge518 종양 성장에 대한 조합 치료의 효과를 조사하고자 하였다. 이를 위해, 본 발명자는 누드 마우스의 옆구리에 Ge518 세포를 피하 주사하였다 (도 10의 A). 종양이 150 mm2에 도달하면, 마우스를 miR-Combo로 치료하였다. 본 발명자는 인 비트로에서 밝혀진 바와 같이, 종양 성장의 유의미한 지연을 보여주었고, 이는 miR-Combo가 GBM 성장 및 종양형성 능력에 효율적으로 영향을 미치는 것을 나타낸다 (도 10의 A). 본 발명자는 또한 miR-Ctrl과 비교하여 miR-Combo에서 세포 증식의 마커인 Ki-67 발현의 유의미한 감소를 발견하여, GBM 세포 증식에 대한 조합 전략의 효과를 확인하였다 (도 10의 B-C). CD31 염색으로 평가한 종양 혈관화 분석에서는 유의미한 차이가 나타나지 않았지만, CD31 발현의 감소 및 혈관이 더 작아지는 경향을 관찰할 수 있었다 (도 10의 B-C). 이러한 결과를 확인하기 위해, 본 발명자는 또 다른 PDC 모델인 Ge738을 사용하였고, 종양 성장에서 유사한 지연을 보여주었다 (도 10의 D). 종합적으로, 본 발명자는 miR-17-3p, miR-340 및 miR-222를 조절하는 것으로 구성된 조합 표적화 요법이 인 비보에서 GBM 성장 및 종양형성 능력을 억제하는데 효과적임을 보여주었다.
잘 설명된 miRGE 렌티벡터 시스템 (Myburgh, et al. (2014). Optimization of Critical Hairpin Features Allows miRNA-based Gene Knockdown Upon Singlecopy Transduction. Mol Ther Nucleic Acids 3: e207.)을 사용하여, 본 발명자는 GBM PDCs에서 miR-17-3p, 및 miR-340 모방체들, 및 miR-222 antagomiR을 동시에 발현시켰다.
그 다음에, Tet-On 시스템을 사용하여, GBM 세포를 독시사이클린으로 처리하여 miRNA 조절을 수행하였다. 도 11의 A에 나타낸 바와 같이, 독시사이클린 처리는 Ge518, Ge738, 및 Ge970.2 PDCs 모두에서 세포 생존율의 유의미한 감소를 유도하였다.
그 다음에, 본 발명자는 또한 GBM 종양의 공격적인 서브세트인 GSCs에 대한 miRGE의 효과를 조사하고자 하였다. miR-Combo로 형질감염된 PDCs에서의 결과와 일치하는, 본 발명자는 또한 독시사이클린 처리하에 miRGE 생존 능력을 갖는 PDCs의 유의미한 감소를 관찰하였다 (도 11의 A). 유사하게, 본 발명자는 3일 후에 miRGE GSC 생존 능력에 대한 독시사이클린 처리의 효과를 관찰하였고, 이는 분화 세포 및 줄기세포 모두에서 이러한 조합 전략의 잠재력을 나타낸다 (도 11의 B). 이러한 결과에 따라, 독시사이클린 처리하에 종양구-형성 능력이 유의미하게 억제되는 것으로 나타났다 (도 11의 C). 더 중요한 것은 인 비보에서 GSC 종양형성에 대한 이러한 miRNAs의 효과를 평가하기 위해, 본 발명자는 miRGE 렌티벡터 시스템으로 형질도입된 중간엽 (Ge518), 전신경 (Ge738) 및 고전적 (Ge970.2) GSC의 혼합물 (1:1:1)을 면역결핍 마우스의 뇌에 두개내 이식하였다 (도 11의 D). 실제로, 여러 서브타입 유래의 GSC의 혼합물은 다수의 서브타입들이 공존하는 인 비보 환경을 모방한다. 본 발명의 발견을 임상에 활용하기 위해, 독시사이클린을 음용수에 투여하는 것은 제1 마우스에서 신경학적 증상이 발생한 13일 후에만 수행하였다. 여기서, 본 발명자는 미처리 대조 그룹과 비교하여 독시사이클린-처리 그룹에서 종양 성장의 유의미한 지연을 보여주었다 (도 11의 D). 전체적으로, 이러한 결과는 관련 예후 바이오마커로서 뿐만 아니라, 치료제에 대한 미충족 수요가 여전히 큰 GBM의 치료를 위한 약물 가능성 표적 (druggable targets)으로서 조합 전략의 임상적 관련성을 강조한다.
실시예 2
물질 및 방법
세포 형질감염
miR-17-3p, 및 miR-340-5p 모방체들, 및 miR-222-5p antagomir를 제조자의 프로토콜에 따라 최종 농도 5 nM으로 리포펙타민 RNAimax (Invitrogen)를 사용하여 형질감염시켰다. 비-표적화 스크램블 miRNA (Life Technologies)를 대조군으로서 사용하였다.
세포 생존율 분석
세포 생존율 분석은 제조자의 프로토콜에 따라 CellTiter-Glo 분석 키트 (Promega)를 사용하여 수행하였다.
결과
결과는 도 12에 나타낸다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (15)
- 암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 miR-17 모방체 및 miR-340 모방체의 조합물 (combination).
- 청구항 1에 있어서, 상기 조합물은 miR-222 antagomiR를 추가로 포함하는 것인 조합물.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 조합물은 miR-221 antagomiR 및/또는 miR-551b 모방체를 추가로 포함하는 것인 조합물.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miR-17 모방체는 miR-17-3p 모방체인 것인 조합물.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miR-340 모방체는 miR-340-5p 모방체인 것인 조합물.
- 청구항 2 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miR-222 antagomiR은 miR-222-5p 및 miR-222-3p antogomiRs로부터 선택되는 것인 조합물.
- 청구항 3 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miR-221 antagomiR은 miR-221-3p 및 miR-221-5p antagomiRs로부터 선택되고, 및/또는 상기 miR-551b 모방체는 miR-551b-5p 모방체인 것인 조합물.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 뇌종양; 수모세포종; 망막모세포종; 신경초종; 신경모세포종; 흑색종; NSCLCC; 췌장 종양; 유방암, 간암종 및 신모세포종으로부터 선택된 암의 예방 및/또는 치료를 위한 것인 조합물.
- 청구항 8에 있어서, 상기 뇌종양은 성상세포종, 희소돌기아교세포종, 수막종, 신경아교종 및 교모세포종으로부터 선택되는 것인 조합물.
- 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 교모세포종의 예방 및/또는 치료를 위한 것인 조합물.
- 청구항 10에 있어서, 중간엽 (mesenchymal), 전신경 (proneural), 신경 (neural) 및 고전적 (classical) 서브타입들 중 하나 이상의 서브타입의 교모세포종의 예방 및/또는 치료를 위한 것인 조합물.
- 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miR-17 모방체, miR-340 모방체, 및 선택적으로 miR-222 antagomiR, miR-221 antagomiR 및/또는 miR-551b 모방체가 순차적으로 투여되는 것인 조합물.
- 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miR-17 모방체, miR-340 모방체, 및 선택적으로 miR-222 antagomiR, miR-221 antagomiR 및/또는 miR-551b 모방체가 동시에 투여되는 것인 조합물.
- 청구항 1 내지 10 및 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조합물은 약학적 조성물로 제제화되는 것인 조합물.
- 청구항 14에 있어서, 상기 약학적 조성물은 정맥내, 경구 또는 피하로 투여되는 것인 조합물.
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