KR20240066476A - Gastrokine 1 specific antibody and use thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 GKN1 단백질의 특정 에피토프에 특이적으로 결합하는 신규한 항체 및 이의 위암 진단 용도에 관한 것으로, 본 발명에서 개발한 GKN1에 특이적인 항체는 새로운 에피토프에 특이적으로 결합하며, 이를 이용하여 혈청 내 GKN1 단백질 수준을 확인함으로써 위암을 민감도 98.4% 및 특이도 93.4%로 검출 (진단)할 수 있으므로, 이를 위암 스크리닝 또는 진단 용도로 유용하게 활용할 수 있다.The present invention relates to a novel antibody that specifically binds to a specific epitope of GKN1 protein and its use in diagnosing gastric cancer. The GKN1-specific antibody developed in the present invention specifically binds to a new epitope and is used to detect serum By checking the level of my GKN1 protein, stomach cancer can be detected (diagnosed) with a sensitivity of 98.4% and a specificity of 93.4%, so this can be useful for stomach cancer screening or diagnosis.
Description
본 발명은 GKN1(Gastrokine 1) 단백질의 특정 에피토프에 특이적으로 결합하는 신규한 항체 및 이의 위암 진단 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a novel antibody that specifically binds to a specific epitope of GKN1 (Gastrokine 1) protein and its use in diagnosing gastric cancer.
암(cancer)은 유전자 발현의 다양한 변화에 의하여 세포의 증식과 사멸이 정상적으로 조절되지 않고 세포의 비정상적인 성장이 야기된 상태로, 인접한 조직에 침투하여 파괴하고 다른 부위로 전이하여 결국 사람이 사망에 이르게 한다. 암을 유발하는 원인, 즉 정상세포가 어떠한 기전을 거쳐 암 세포로 형질전환 되는지에 대해서는 정확히 규명되지는 않았으나, 현재까지 알려진 바에 따르면 암은 환경요인, 화학물질, 방사선, 바이러스 등 외적 요인 및 유전 인자, 면역학적 요인 등의 내적 요인 등이 복잡하게 얽혀 결과적으로 암을 유발하는 것으로 알려져 있다. 암은 혈액 세포 수에 이상을 보이는 혈액암과 신체 내에서 일정한 경도와 형태를 갖는 세포 덩어리 형태의 고형암으로 크게 분류된다. 암은 혈액, 조직 신체의 거의 전 부위에서 발생할 수 있으며, 폐암, 위암, 유방암, 구강암, 간암, 자궁암, 식도암, 피부암 등을 예로 들 수 있다. 암의 치료에는 대부분 수술이나 방사선 요법 및 세포 증식을 억제하는 화학 요법제를 이용한 항암제 치료가 주된 방법이다. 이 중, 위암(gastric cancer; GC)은 전 세계적으로 여러 암 중 5번째로 흔한 악성 종양이며 암으로 인한 사망의 네 번째 주요 원인으로 알려져 있다 (Morgan E, et al., Lancet, eClinicalMedicine, 2022;47:101404). 또한, 대부분의 위암 환자는 무증상으로 진행성 위암 단계에 발견되어 예후가 좋지 않은 것으로 보고되고 있다. 전이성 위암에서는 백금을 기반으로 한 병용 화학 요법이 표준 치료법으로 간주되지만 많은 환자들이 상기 치료법에 불응성을 가지며, 반응성을 나타내는 환자들의 경우에도 반응 기간이 수개월 정도로 짧은 것으로 알려져 있다. 또한, 인간 표피성장인자수용체 2(epidermal growth factor receptor 2; EGFR2)의 발현이 양성인 종양 환자에서 트라스투주맙(trastuzumab) 및 2차 치료제로써 라무시루맙(ramucirumab)을 제외하고는 신규 표적약물에 대한 임상 시험을 통해 위암을 성공적으로 치료한 성과를 얻지 못하였다. 위암에서 생존율이 낮은 이유로는 대부분 진행성 위암에서 발견되고, 위암이 치료법에 대한 공격성 및 반응성이 상당히 상이한 이질적인 질환이며, 환자 각각에서 임상적 결과 및 예후가 보고된 데이터들과 항상 일치하지 않는다는 것이다. 위암의 증상은 전혀 증상이 없는 경우에서부터 격심한 통증에 이르기까지 다양한 양상을 나타내고 있다. 또한, 위암의 증상은 어떤 특성을 가지는 것이 아니라 일반적인 소화기 증상을 나타낸다. 일반적으로 위암의 초기에는 증상이 없는 경우가 대부분이며, 있다고 하더라도 경미하여 약간의 소화불량이나 상복부 불편감을 느끼는 정도이므로 대부분의 사람들이 이를 간과하기 쉬워 위암의 사망률을 높이는 원인이 되기도 한다.Cancer is a condition in which cell proliferation and death are not normally regulated and abnormal growth of cells is caused by various changes in gene expression. It infiltrates and destroys adjacent tissues and metastasizes to other areas, ultimately leading to death. do. The cause of cancer, that is, the mechanism by which normal cells are transformed into cancer cells, has not been accurately identified, but according to what is known to date, cancer is caused by external factors such as environmental factors, chemicals, radiation, viruses, and genetic factors. It is known that internal factors, such as immunological factors, are complexly intertwined and ultimately cause cancer. Cancer is broadly classified into blood cancer, which shows an abnormality in the number of blood cells, and solid cancer, which is a mass of cells with a certain hardness and shape within the body. Cancer can occur in almost all parts of the body, including blood and tissue, and examples include lung cancer, stomach cancer, breast cancer, oral cancer, liver cancer, uterine cancer, esophageal cancer, and skin cancer. The main methods of treating cancer are surgery, radiation therapy, and chemotherapy using chemotherapy agents that inhibit cell proliferation. Among these, gastric cancer (GC) is known to be the fifth most common malignant tumor and the fourth leading cause of cancer-related death among various cancers worldwide (Morgan E, et al., Lancet, eClinicalMedicine, 2022; 47:101404). In addition, it is reported that most gastric cancer patients are asymptomatic and are found at an advanced stage of gastric cancer, so their prognosis is poor. For metastatic gastric cancer, platinum-based combination chemotherapy is considered the standard treatment, but many patients are refractory to this treatment, and even for patients who show responsiveness, the response period is known to be as short as several months. In addition, in patients with tumors positive for human epidermal growth factor receptor 2 (EGFR2) expression, new targeted drugs are not available, except for trastuzumab and ramucirumab as a second-line treatment. No successful treatment of stomach cancer has been achieved through clinical trials. The reason for the low survival rate in gastric cancer is that it is mostly found in advanced gastric cancer, gastric cancer is a heterogeneous disease with significantly different aggressiveness and responsiveness to treatment, and the clinical results and prognosis of each patient do not always match the reported data. Symptoms of stomach cancer range from no symptoms at all to severe pain. Additionally, the symptoms of stomach cancer do not have certain characteristics but rather represent general digestive symptoms. In general, in the early stages of stomach cancer, there are usually no symptoms, and even if there are, they are mild and only cause slight indigestion or discomfort in the upper abdomen, so most people easily overlook them, which can lead to an increase in the mortality rate of stomach cancer.
현재까지의 위암의 검사수단은 물리적인 것이 대부분이었다. 그 첫번째로는 위장 X-선 촬영으로 이중조영법, 압박촬영법, 점막촬영법 등이 있으며, 두번째로는 위내시경으로 위속을 직접 눈으로 들여다 볼 수 있게 하여, X선 검사에서 나타나지 않는 아주 작은 병변도 발견할 수 있을 뿐 아니라 위암이 의심스러운 장소에서 직접조직검사를 시행할 수도 있어, 그 진단율을 높이고 있다. 하지만, 이 방법은 위 내시경 시술자의 전문성이 필요하고, 위생상의 문제와 검사가 진행되는 동안 환자로 하여금 고통을 감수해야 하는 단점이 있었다. 따라서 최근에는 위암에서 특이적으로 발현되는 유전자 마커의 발현수준을 측정함으로써 위암을 선별하고 조기에 진단하려는 연구가 이루어지고 있으며, 위암 환자의 예후를 예측하기 위한 유전자 마커에 대한 연구는 상대적으로 덜 이루어지고 있다. To date, most of the screening methods for stomach cancer have been physical. The first is gastric Not only can this be done, but direct biopsy can also be performed in places where stomach cancer is suspected, increasing the diagnosis rate. However, this method had the disadvantages of requiring expertise from the gastroscopy operator, hygiene issues, and the patient having to endure pain during the examination. Therefore, recently, research has been conducted to screen and diagnose gastric cancer at an early stage by measuring the expression level of genetic markers specifically expressed in gastric cancer. Relatively little research has been done on genetic markers to predict the prognosis of gastric cancer patients. I'm losing.
종래에는 위암 환자의 예후를 예측하기 위하여 해부 ㆍ 병리학적인 관찰방법(암세포의 침윤 정도 및 전이된 림프절의 개수)을 사용하였으나, 의사의 주관적인 판단이 개입될 수 있고, 예후를 정확하게 예측하는데 한계가 있었다. 또한, 위암 수술 후 회복 속도를 향상시키기 위하여, 백금을 이용한 보조화학요법으로 위암 환자의 생존율을 향상시키고자 하는 시도가 있어 왔으나 (Paoletti X. et al.,JAMA 2010;303(17):1729~1737; Lim L. et al., J. Clin. Oncol. 2005;23(25):6220~6232), 30~50%의 환자들이 치료적 절제술 후 종양 재발을 겪으며, 화학요법의 효과는 종양생물학적 관점에서 차이가 있는 것으로 나타났다 (Sasako M. et al., J. Clin. Oncol. 2011;29(33):4387~4393). 따라서 절제술을 받은 위암 환자들에 화학요법을 적용하기 위한 임상적 또는 생물학적 예측인자(predictor)의 개발이 요구되는 실정이다.Previously, anatomical and pathological observation methods (degree of cancer cell invasion and number of metastatic lymph nodes) were used to predict the prognosis of gastric cancer patients, but the doctor's subjective judgment could be involved and there were limitations in accurately predicting the prognosis. . In addition, in order to improve the speed of recovery after gastric cancer surgery, there have been attempts to improve the survival rate of gastric cancer patients with adjuvant chemotherapy using platinum (Paoletti X. et al., JAMA 2010;303(17):1729~ 1737; Lim L. et al., J. Clin. Oncol. 2005;23(25):6220~6232), 30-50% of patients experience tumor recurrence after curative resection, and the effect of chemotherapy depends on tumor biology. It appeared that there was a difference in perspective (Sasako M. et al., J. Clin. Oncol. 2011;29(33):4387~4393). Therefore, there is a need to develop clinical or biological predictors for applying chemotherapy to gastric cancer patients who have undergone resection.
한편, 항체는 특정 항원과 결합하는 면역 단백질이다. 인간과 마우스를 비롯한 대부분의 포유동물에 있어서, 항체는 중쇄 폴리펩티드와 경쇄 폴리펩티드가 쌍을 이루어 형성된다. 각각의 사슬은 가변 영역 (Fv) 및 불변 영역 (Fc)이라 불리는 2개의 영역으로 이루어져 있다. 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 분자의 항원 결합 결정기를 포함하며, 표적 항원과의 결합에 관여한다. 불변 영역은 항체의 군(또는 동 기준 표본형)을 한정하며 (예를 들어, IgG), 효과기 작용이라 불리는 일련의 중요한 기능상의 특성들을 부여하는, 다수의 Fc 수용체 및 Fc 리간드와의 결합에 관여한다. 예를 들어, 표적에 대한 특이성, 면역 작용기 기작을 매개하는 능력 및 긴 혈청 반감기와 같은 몇몇 중요한 항체의 특성으로 말미암아 항체는 강력한 치료제로서 사용되고 있다.Meanwhile, antibodies are immune proteins that bind to specific antigens. In most mammals, including humans and mice, antibodies are formed by pairing heavy chain polypeptides with light chain polypeptides. Each chain consists of two regions called the variable region (Fv) and the constant region (Fc). The light and heavy chain variable regions contain the antigen-binding determinants of the molecule and are involved in binding to the target antigen. The constant region defines a class (or reference type) of an antibody (e.g., IgG) and is involved in binding to a number of Fc receptors and Fc ligands, conferring a series of important functional properties called effector functions. do. Several important properties of antibodies, for example, specificity for their targets, ability to mediate immune effector mechanisms, and long serum half-life, make them useful therapeutic agents.
본 발명에서는 GKN1에 대한 신규한 항체를 제공하고, 상기 항체를 위암의 진단 용도로 사용하는 것을 목적으로 한다.The purpose of the present invention is to provide a novel antibody against GKN1 and to use the antibody for diagnosing gastric cancer.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 GKN1 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 제공한다.To achieve the above object, the present invention provides an isolated antibody that specifically binds to GKN1 protein or a fragment thereof with immunological activity.
또한, 본 발명은 본 발명의 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자, 이를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.Additionally, the present invention provides an isolated nucleic acid molecule encoding an isolated antibody of the present invention or a fragment having immunological activity thereof, a vector containing the same, and a host cell transformed with the vector.
또한, 본 발명은 GKN1에 특이적인 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 제조하는 방법을 제공한다.Additionally, the present invention provides a method for producing a GKN1-specific antibody or fragment having immunological activity.
또한, 본 발명은 본 발명의 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 포함하는 위암 진단용 조성물을 제공한다.Additionally, the present invention provides a composition for diagnosing gastric cancer comprising the isolated antibody of the present invention or a fragment thereof with immunological activity.
또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 위암 진단 키트를 제공한다.Additionally, the present invention provides a gastric cancer diagnostic kit containing the composition of the present invention.
아울러, 본 발명은 위암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method of providing information necessary for diagnosing stomach cancer.
본 발명에서 개발한 GKN1에 특이적인 항체는 새로운 에피토프에 특이적으로 결합하며, 이를 이용하여 혈청 내 GKN1 단백질 수준을 확인함으로써 위암을 민감도 98.4% 및 특이도 93.4%로 검출 (진단)할 수 있으므로, 이를 위암 진단 용도로 유용하게 활용할 수 있다.The GKN1-specific antibody developed in the present invention specifically binds to a new epitope, and using this, gastric cancer can be detected (diagnosed) with a sensitivity of 98.4% and specificity of 93.4% by checking the GKN1 protein level in the serum. This can be useful for diagnosing stomach cancer.
도 1은 항-GKN1 항체의 생산 과정 및 이의 에피토프 맵핑 결과를 나타낸 도이다:
A: 항-GKN1 항체 제작 과정;
B: 항-GKN1 항체의 핵산 및 아미노산 서열;
C: GKN1 항체가 결합하는 컨센서스 모티프 KGPGGPPPK 주변의 인접 펩타이드들로 형성된 에피토프-유사 스팟 패턴에 대한 형광 강도; 및
D: 항-GKN1 항체의 에피토프 개략도.
도 2는 sandwich ELISA 분석을 이용한 혈청 내 GKN1 단백질 농도 측정을 위한 항-GKN1 항체 및 혈청 희석 인자를 결정한 도이다:
A: 항-GKN1 단일클론 항체(minibody, H7)의 농도에 따른 재조합 GKN1 단백질의 ELISA 표준 곡선;
B: 재조합 GKN1 단백질 농도에 따른 교정 곡선, LOD 및 LOQ 값; 및
C: 혈청 희석도에 따른 혈청 내 GKN1 단백질 농도.
도 3은 ELISA 분석에서 혈청 내 GKN1 단백질의 진단 성능을 확인한 도이다:
A: 위암 환자 vs 건강한 개체의 혈청 내 GKN1 단백질 농도 비교 및 최적 컷-오프 값; 및
B: 항원 GKN1 테스트로 얻은 ROC 곡선.
도 4는 조기 위암 및 진행성 위암 환자에서의 혈청 내 GKN1 단백질의 진단 성능을 확인한 도이다:
A: 건강한 개체, 조기 위암 환자 (EGC) 및 진행성 위암 환자 (AGC)에서의 혈청 내 GKN1 단백질 농도 비교; 및
B 및 C: 건강한 개체와 EGC (B) 및 AGC (C)의 혈청 시료를 이용한 항원 GKN1 테스트로 얻은 ROC 곡선.Figure 1 is a diagram showing the production process of anti-GKN1 antibody and its epitope mapping results:
A: Anti-GKN1 antibody production process;
B: Nucleic acid and amino acid sequences of anti-GKN1 antibody;
C: Fluorescence intensity for the epitope-like spot pattern formed by adjacent peptides around the consensus motif KGPGGPPPK to which the GKN1 antibody binds; and
D: Epitope schematic of anti-GKN1 antibody.
Figure 2 is a diagram showing the determination of anti-GKN1 antibody and serum dilution factor for measuring GKN1 protein concentration in serum using sandwich ELISA analysis:
A: ELISA standard curve of recombinant GKN1 protein depending on the concentration of anti-GKN1 monoclonal antibody (minibody, H7);
B: Calibration curve, LOD and LOQ values depending on recombinant GKN1 protein concentration; and
C: GKN1 protein concentration in serum according to serum dilution.
Figure 3 is a diagram confirming the diagnostic performance of GKN1 protein in serum in ELISA analysis:
A: Comparison of GKN1 protein concentration in serum of gastric cancer patients vs. healthy subjects and optimal cut-off value; and
B: ROC curve obtained with antigen GKN1 test.
Figure 4 is a diagram confirming the diagnostic performance of GKN1 protein in serum in patients with early and advanced gastric cancer:
A: Comparison of GKN1 protein concentration in serum in healthy individuals, early gastric cancer patients (EGC) and advanced gastric cancer patients (AGC); and
B and C: ROC curves obtained with antigen GKN1 test using serum samples from healthy subjects and EGC (B) and AGC (C).
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다. Hereinafter, the present invention will be described in detail through embodiments of the present invention with reference to the attached drawings. However, the following embodiments are provided as examples of the present invention, and if it is judged that a detailed description of a technology or configuration well known to those skilled in the art may unnecessarily obscure the gist of the present invention, the detailed description may be omitted. , the present invention is not limited thereby. The present invention is capable of various modifications and applications within the description of the claims described below and the scope of equivalents interpreted therefrom.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.In addition, the terminology used in this specification is a term used to appropriately express preferred embodiments of the present invention, and may vary depending on the intention of the user or operator or the customs of the field to which the present invention belongs. Therefore, definitions of these terms should be made based on the content throughout this specification. Throughout the specification, when a part is said to "include" a certain component, this means that it does not exclude other components but may further include other components, unless specifically stated to the contrary.
본 명세서 전반을 통하여, 천연적으로 존재하는 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용될 뿐만 아니라 Aib(α-아미노이소부티르산), Sar(N-methylglycine) 등과 같은 다른 아미노산에 대해 일반적으로 허용되는 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 발명에서 약어로 언급된 아미노산은 하기와 같이 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다:Throughout this specification, the customary one- and three-letter codes for naturally occurring amino acids are used, as well as generally acceptable codes for other amino acids such as Aib (α-aminoisobutyric acid), Sar ( N -methylglycine), etc. A three-character code is used. Additionally, amino acids referred to by abbreviations in the present invention are described according to the IUPAC-IUB nomenclature as follows:
알라닌: A, 아르기닌: R, 아스파라긴: N, 아스파르트산: D, 시스테인: C, 글루탐산: E, 글루타민: Q, 글리신: G, 히스티딘: H, 이소류신: I, 류신: L, 리신: K, 메티오닌: M, 페닐알라닌: F, 프롤린: P, 세린: S, 트레오닌: T, 트립토판: W, 티로신: Y 및 발린: V. Alanine: A, Arginine: R, Asparagine: N, Aspartic Acid: D, Cysteine: C, Glutamic Acid: E, Glutamine: Q, Glycine: G, Histidine: H, Isoleucine: I, Leucine: L, Lysine: K, Methionine : M, phenylalanine: F, proline: P, serine: S, threonine: T, tryptophan: W, tyrosine: Y and valine: V.
일 측면에서, 본 발명은 GKN1(gastrokine 1) 단백질의 BRICHOS 도메인에 위치한 단일 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to an isolated antibody or an immunologically active fragment thereof that specifically binds to a single epitope located in the BRICHOS domain of the gastrokine 1 (GKN1) protein.
일 구현예에서, 상기 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.In one embodiment, the epitope may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
일 구현예에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1(Complementarity determining regions light chain), 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3를 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다.In one embodiment, the isolated antibody or fragment having immunological activity is CDRL1 (Complementarity determining regions light chain) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, CDRL2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 4. It may include a VL domain containing CDRL3 containing the amino acid sequence.
일 구현예에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH(Complementarity determining regions Heavy chain)1, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3를 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.In one embodiment, the isolated antibody or fragment having immunological activity is CDRH (Complementarity determining regions heavy chain) 1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, CDRH2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: It may contain a VH domain containing CDRH3 containing the amino acid sequence of 7.
일 구현예에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다.In one embodiment, the isolated antibody or fragment having immunological activity may include a VL domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
일 구현예에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 링커를 포함할 수 있다.In one embodiment, the isolated antibody or fragment having immunological activity may include a linker containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
일 구현예에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.In one embodiment, the isolated antibody or fragment having immunological activity may include a VH domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
일 구현예에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 불변 단일쇄 Fv(Constant single-chain Fv)를 포함할 수 있다.In one embodiment, the isolated antibody or fragment thereof with immunological activity may include a constant single-chain Fv (Constant single-chain Fv) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
일 구현예에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.In one embodiment, the isolated antibody or fragment having immunological activity may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.
일 구현예에서, 상기 단리된 항체는 키메라 항체, 인간화 항체(humanized antibody), 이가(bivalent), 양특이성 분자, 미니바디(minibody) (scFv-Fc), 도메인 항체, 이중특이적 항체(bispecific antibody), 항체 모방체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody)일 수 있으며, 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 Fab, Fd, Fd', Fab', dAb, F(ab'), F(ab')2, scFv(single chain fragment variable), scFv-Fc, Fv, 단일쇄 항체, Fv 이량체(dsFv) 또는 상보성 결정 영역(CDR) 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, scFv 또는 미니바디인 것이 더욱 바람직하다.In one embodiment, the isolated antibody is a chimeric antibody, humanized antibody, bivalent, bispecific molecule, minibody (scFv-Fc), domain antibody, bispecific antibody. ), antibody mimetics, diabodies, triabodies, and tetrabodies, and fragments thereof with immunological activity include Fab, Fd, Fd', Fab', dAb, F(ab) '), F(ab') 2 , scFv (single chain fragment variable), scFv-Fc, Fv, single chain antibody, Fv dimer (dsFv) or complementarity determining region (CDR) fragment. Any one selected from the group consisting of It may be, and it is more preferable that it is an scFv or a minibody.
상기 항체는 전체(whole) 항체 형태일 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(heavy chain)를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합(disulfide bond)으로 연결되어 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, 항체 단편의 예는 (i) 경쇄의 가변영역(VL) 및 중쇄의 가변영역(VH)과 경쇄의 불변영역(CL) 및 중쇄의 첫번째 불변 영역(CH1)으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward ES et al., Nature 341:544-546 (1989)]; (v) 분리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 결합된 단일쇄 Fv 분자(scFv); (viii) 이특이적인 단일쇄 Fv 이량체(PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적인 단편인 디아바디(diabody) WO94/13804) 등을 포함한다. The antibodies are in whole antibody form as well as functional fragments of the antibody molecule. A full antibody has a structure of two full-length light chains and two full-length heavy chains, and each light chain is connected to the heavy chain by a disulfide bond. A functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment that possesses an antigen-binding function. Examples of antibody fragments include (i) the variable region (VL) of the light chain, the variable region (VH) of the heavy chain, the constant region (CL) of the light chain, and Fab fragment consisting of the first constant region (CH1) of the heavy chain; (ii) Fd fragment consisting of VH and CH1 domains; (iii) an Fv fragment consisting of the VL and VH domains of a single antibody; (iv) a dAb fragment consisting of a VH domain (Ward ES et al., Nature 341:544-546 (1989)); (v) an isolated CDR region; (vi) a bivalent fragment comprising two linked Fab fragments. an F(ab')2 fragment; (vii) a single-chain Fv molecule (scFv) in which the VH domain and the VL domain are joined by a peptide linker to form an antigen binding site; (viii) a bispecific single-chain Fv dimer; (PCT/US92/09965) and (ix) diabody WO94/13804, which is a multivalent or multispecific fragment produced by gene fusion.
본 발명의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 동물 유래 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 및 이들의 면역학적 활성을 가진 단편으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 항체는 재조합적 또는 합성적으로 생산된 것일 수 있다.The antibody or immunologically active fragment thereof of the present invention may be selected from the group consisting of animal-derived antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, and immunologically active fragments thereof. The antibody may be recombinantly or synthetically produced.
원하는 항원을 피면역 동물에게 면역시켜 생산하는 동물 유래 항체는 일반적으로 치료 목적으로 인간에 투여시 면역거부반응이 일어날 수 있으며, 이러한 면역거부반응을 억제하고자 키메릭 항체(chimeric antibody)가 개발되었다. 키메릭 항체는 유전공학적 방법을 이용하여 항-아이소타입(anti-isotype) 반응의 원인이 되는 동물 유래 항체의 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 치환한 것이다. 키메릭 항체는 동물 유래 항체에 비하여 항-아이소타입 반응에 있어서 상당 부분 개선되었으나, 여전히 동물 유래 아미노산들이 가변 영역에 존재하고 있어 잠재적인 항-이디오타입(anti-idiotypic) 반응에 대한 부작용을 내포하고 있다. 이러한 부작용을 개선하고자 개발된 것이 인간화 항체(humanized antibody)이다. 이는 키메릭 항체의 가변 영역 중 항원의 결합에 중요한 역할을 하는 CDR(complementaritiy determining regions) 부위를 인간 항체 골격(framework)에 이식하여 제작된다.Animal-derived antibodies produced by immunizing an immunized animal with a desired antigen can generally cause immune rejection when administered to humans for therapeutic purposes, and chimeric antibodies have been developed to suppress such immune rejection. A chimeric antibody is one in which the constant region of an animal-derived antibody, which causes an anti-isotype reaction, is replaced with the constant region of a human antibody using genetic engineering methods. Chimeric antibodies have significantly improved anti-isotype responses compared to animal-derived antibodies, but animal-derived amino acids still exist in the variable region, resulting in potential side effects on anti-idiotypic responses. I'm doing it. Humanized antibodies were developed to improve these side effects. It is produced by grafting the CDR (complementary determining regions) region, which plays an important role in antigen binding, among the variable regions of a chimeric antibody into the human antibody framework.
인간화 항체를 제작하기 위한 CDR 이식(grafting) 기술에 있어서 가장 중요한 것은 동물 유래 항체의 CDR 부위를 가장 잘 받아들일 수 있는 최적화된 인간 항체를 선정하는 것이며, 이를 위하여 항체 데이터베이스의 활용, 결정구조(crystal structure)의 분석, 분자모델링 기술 등이 활용된다. 그러나, 최적화된 인간 항체 골격에 동물 유래 항체의 CDR 부위를 이식할지라도 동물 유래 항체의 골격에 위치하면서 항원 결합에 영향을 미치는 아미노산이 존재하는 경우가 있기 때문에, 항원 결합력이 보존되지 못하는 경우가 상당수 존재하므로, 항원 결합력을 복원하기 위한 추가적인 항체 공학 기술의 적용은 필수적이라고 할 수 있다.The most important thing in CDR grafting technology to produce humanized antibodies is to select an optimized human antibody that can best accept the CDR region of an animal-derived antibody. To this end, use of an antibody database and crystal structure (crystal structure) Structure analysis, molecular modeling technology, etc. are used. However, even when the CDR region of an animal-derived antibody is transplanted onto an optimized human antibody framework, there are cases where amino acids that affect antigen binding are present in the framework of the animal-derived antibody, so antigen-binding ability is not preserved in many cases. Therefore, the application of additional antibody engineering technology to restore antigen binding ability can be said to be essential.
상기 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 생체에서 분리된 (생체에 존재하지 않는) 것 또는 비자연적으로 생산(non-naturally occurring)된 것일 수 있으며, 예컨대, 합성적 또는 재조합적으로 생산된 것일 수 있다.The antibody or fragment thereof with immunological activity may be isolated from a living body (not present in the living body) or non-naturally occurring, for example, synthetically or recombinantly produced. You can.
본 발명에서 "항체"라 함은, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질을 의미하는 것으로서, 그 종류는 특별히 제한되지 않으며, 자연적 또는 비자연적(예컨대, 합성적 또는 재조합적)으로 얻어질 수 있다. 항체는 생체 외뿐 아니라 생체 내에서도 매우 안정하고 반감기가 길기 때문에 대량 발현 및 생산에 유리하다. 또한, 항체는 본질적으로 다이머(dimer) 구조를 가지므로 접착능(avidity)이 매우 높다. 완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.In the present invention, "antibody" refers to a substance produced by stimulation of an antigen within the immune system, the type of which is not particularly limited, and may be produced naturally or unnaturally (e.g., synthetically or recombinantly). can be obtained. Antibodies are very stable not only in vitro but also in vivo and have a long half-life, making them advantageous for mass expression and production. In addition, antibodies inherently have a dimer structure, so their avidity is very high. A complete antibody has a structure of two full-length light chains and two full-length heavy chains, and each light chain is connected to the heavy chain by a disulfide bond. The constant region of an antibody is divided into a heavy chain constant region and a light chain constant region, and the heavy chain constant region has gamma (γ), mu (μ), alpha (α), delta (δ), and epsilon (ε) types, and subclasses. It has gamma 1 (γ1), gamma 2 (γ2), gamma 3 (γ3), gamma 4 (γ4), alpha 1 (α1), and alpha 2 (α2). The constant region of the light chain has kappa (κ) and lambda (λ) types.
본 발명에서 용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1 , CH2 및 CH3 과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.As used herein, the term "heavy chain" refers to a variable region domain V H and three constant region domains C H1 , C H2 and It is interpreted to include both the full-length heavy chain including C H3 and the hinge, and fragments thereof. Additionally, the term "light chain" refers to a full-length light chain and fragments thereof comprising a variable region domain V L and a constant region domain C L comprising an amino acid sequence with sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen. It is interpreted to mean that it includes all.
본 발명에서 용어, "가변 영역(variable region) 또는 가변 부위 (variable domain)"는 항원과 특이적으로 결합하는 기능을 수행하면서 서열상의 많은 변이를 보이는 항체 분자의 부분을 의미하고, 가변 영역에는 상보성 결정 영역인 CDR1, CDR2 및 CDR3가 존재한다. 상기 CDR 사이에는 프레임 워크 영역(framework region, FR) 부분이 존재하여 CDR 고리를 지지해주는 역할을 한다. 상기 "상보성 결정 영역"은 항원의 인식에 관여하는 고리모양의 부위로서 이 부위의 서열이 변함에 따라 항체의 항원에 대한 특이성이 결정된다.In the present invention, the term "variable region or variable domain" refers to a portion of an antibody molecule that exhibits many variations in sequence while performing the function of specifically binding to an antigen, and the variable region There are complementarity determining regions CDR1, CDR2, and CDR3. A framework region (FR) exists between the CDRs and serves to support the CDR ring. The "complementarity determining region" is a ring-shaped region involved in antigen recognition, and as the sequence of this region changes, the specificity of the antibody to the antigen is determined.
본 발명에서 사용되는 용어 "scFv(single chain fragment variable)"는 유전자 재조합을 통해 항체의 가변영역만을 발현시켜 만든 단쇄항체를 말하며, 항체의 VH 영역과 VL 영역을 짧은 펩티드 사슬로 연결한 단일쇄 형태의 항체를 말한다. 상기 용어 "scFv"는 달리 명시되지 않거나, 문맥상 달리 이해되는 것이 아니라면, 항원 결합 단편을 비롯한 scFv 단편을 포함하고자 한다. 이는 통상의 기술자에게 자명한 것이다.The term "scFv (single chain fragment variable)" used in the present invention refers to a single chain antibody made by expressing only the variable region of an antibody through genetic recombination, and is a single chain antibody made by connecting the VH region and VL region of the antibody with a short peptide chain. It refers to antibodies in chain form. The term "scFv" is intended to include scFv fragments, including antigen-binding fragments, unless otherwise specified or otherwise understood from the context. This is self-evident to those skilled in the art.
본 발명에서 용어, "상보성결정영역(complementarity determining region, CDR)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역 (hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다 (CDRH1, CDRH2,CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 항원결정부위에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. In the present invention, the term "complementarity determining region (CDR)" refers to the amino acid sequence of the hypervariable region of the heavy and light chains of immunoglobulin. The heavy and light chains may each contain three CDRs (CDRH1, CDRH2, CDRH3 and CDRL1, CDRL2, CDRL3). The CDR may provide key contact residues for the antibody to bind to the antigen or epitope.
본 발명에서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.In the present invention, the term "specifically binds" Or "specifically recognized" has the same meaning commonly known to those skilled in the art, and means that an antigen and an antibody specifically interact to produce an immunological reaction.
본 발명에서 용어, "항원결합단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv) 2 , scFv-Fc, Fab, Fab' 또는 F(ab') 2 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 항원결합단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab') 2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변 부위와 경쇄 가변 부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있으며, 당업계에 적절한 서열이 알려져 있다. 상기 항원결합단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab') 2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.In the present invention, the term "antigen-binding fragment" refers to a fragment of the overall structure of an immunoglobulin, and refers to a portion of a polypeptide containing a portion to which an antigen can bind. For example, it may be scFv, (scFv) 2, scFv-Fc, Fab, Fab' or F(ab') 2, but is not limited thereto. Among the antigen-binding fragments, Fab has one antigen-binding site with a structure that includes the variable regions of the light and heavy chains, the constant region of the light chain, and the first constant region (C H1 ) of the heavy chain. Fab' differs from Fab in that it has a hinge region containing one or more cysteine residues at the C-terminus of the heavy chain C H1 domain. The F(ab') 2 antibody is produced when the cysteine residue in the hinge region of Fab' forms a disulfide bond. Fv is a minimal antibody fragment containing only the heavy chain variable region and the light chain variable region, and recombinant techniques for producing Fv fragments are widely known in the art. In a two-chain Fv, the heavy chain variable region and the light chain variable region are connected by a non-covalent bond, and in a single-chain Fv (single-chain Fv), the variable region of the heavy chain and the variable region of the short chain are generally shared through a peptide linker. They can be linked by a bond or directly linked at the C-terminus to form a dimer-like structure, such as double-chain Fv. The linker may be a peptide linker consisting of 1 to 100 or 2 to 50 amino acids, and suitable sequences are known in the art. The antigen-binding fragment can be obtained using a proteolytic enzyme (for example, Fab can be obtained by restriction digestion of the entire antibody with papain, and F(ab') 2 fragment can be obtained by digestion with pepsin), It can be produced through genetic recombination technology.
본 발명에서 용어 "힌지 영역(hinge region)"은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서, CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며, 항체 내 항원 결합 부위의 유연성(flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다. 예컨대, 상기 힌지는 인간 항체로부터 유래한 것일 수 있으며, 구체적으로, IgA, IgE, 또는 IgG, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터 유래한 것일 수 있다.In the present invention, the term "hinge region" refers to a region included in the heavy chain of an antibody, exists between the C H1 and C H2 regions, and has the function of providing flexibility of the antigen binding site in the antibody. refers to the area where For example, the hinge may be derived from a human antibody, specifically, IgA, IgE, or IgG, such as IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자, 이를 포함하는 벡터, 및 이로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to an isolated nucleic acid molecule encoding an antibody of the present invention or an immunologically active fragment thereof, a vector containing the same, and a host cell transformed therewith.
일 구현예에서, 상기 단리된 핵산 분자는 서열번호 13 내지 23의 염기서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있다.In one embodiment, the isolated nucleic acid molecule may include any one selected from the group consisting of base sequences of SEQ ID NOs: 13 to 23.
본 발명의 핵산 분자는 단리된 것이거나 재조합된 것일 수 있으며, 단일쇄 및 이중쇄 형태의 DNA 및 RNA뿐만 아니라 대응하는 상보성 서열이 포함된다. 단리된 핵산은 천연 생성 원천에서 단리된 핵산의 경우, 핵산이 단리된 개체의 게놈에 존재하는 주변 유전 서열로부터 분리된 핵산이다. 주형으로부터 효소적으로 또는 화학적으로 합성된 핵산, 예컨대 PCR 산물, cDNA 분자, 또는 올리고뉴클레오타이드의 경우, 이러한 절차로부터 생성된 핵산이 단리된 핵산분자로 이해될 수 있다. 단리된 핵산분자는 별도 단편의 형태 또는 더 큰 핵산 구축물의 성분으로서의 핵산 분자를 나타낸다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 작동가능하게 연결된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더(leader)의 DNA는 폴리펩타이드가 분비되기 전의 형태인 전단백질(preprotein)로서 발현되는 경우 폴리펩타이드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 폴리펩타이드 서열의 전사에 영향을 주는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 작동가능하게 연결된 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 통상적인 방법에 따라 사용한다.Nucleic acid molecules of the invention may be isolated or recombinant and include single- and double-stranded forms of DNA and RNA as well as corresponding complementary sequences. An isolated nucleic acid, in the case of a nucleic acid isolated from a naturally occurring source, is a nucleic acid that has been separated from the surrounding genetic sequence present in the genome of the individual from which the nucleic acid was isolated. In the case of nucleic acids synthesized enzymatically or chemically from a template, such as PCR products, cDNA molecules, or oligonucleotides, the nucleic acids resulting from these procedures may be understood as isolated nucleic acid molecules. Isolated nucleic acid molecules refer to nucleic acid molecules either in the form of separate fragments or as components of larger nucleic acid constructs. A nucleic acid is operably linked when placed in a functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, the DNA of the presequence or secretion leader is operably linked to the DNA of the polypeptide when the polypeptide is expressed as a preprotein in a form before secretion, and the promoter or enhancer is a polypeptide sequence. is operably linked to the coding sequence when it affects transcription, or the ribosome binding site is operably linked to the coding sequence when configured to facilitate translation. In general, this means that operably linked DNA sequences are located adjacent to each other, and in the case of secretory leaders, this means that they are adjacent and exist within the same reading frame. However, enhancers do not need to be located adjacently. Linking is accomplished by ligation at convenient restriction enzyme sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used according to conventional methods.
본 발명의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 항체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 항체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 핵산 분자는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 핵산 분자의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA(mRNA)분자일 수 있다.Isolated nucleic acid molecules encoding the antibodies of the present invention or immunologically active fragments thereof are expressed from the coding region due to codon degeneracy or in consideration of preferred codons in the organism in which the antibody is to be expressed. Various modifications may be made to the coding region within the scope of not changing the amino acid sequence of the antibody, and various modifications or modifications may be made to parts other than the coding region within the scope of not affecting gene expression, and such modifications may be made to the coding region. Those skilled in the art will understand that genes are also included within the scope of the present invention. That is, as long as the nucleic acid molecule of the present invention encodes a protein with equivalent activity, one or more nucleic acid bases may be mutated by substitution, deletion, insertion, or a combination thereof, and these are also included within the scope of the present invention. The sequence of these nucleic acid molecules may be single or double stranded, and may be DNA molecules or RNA (mRNA) molecules.
본 발명에 따른 본 발명의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자는 단백질 발현을 위해 발현벡터에 삽입될 수 있다. 발현벡터는, 통상 조절 또는 제어 (regulatory) 서열, 선별마커, 임의의 융합 파트너, 및/또는 추가적 요소와 작동가능하게 연결된, 즉, 기능적 관계에 놓인 단백질을 포함한다. 적절한 상태에서, 핵산으로 형질전환된 숙주세포, 바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자 함유 발현벡터를 배양하여 단백질 발현을 유도하는 방법에 의해 본 발명의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편이 생산될 수 있다. 포유류 세포, 박테리아, 곤충 세포, 및 효모를 포함하는 다양한 적절한 숙주세포가 사용될 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다. 외인성 핵산을 숙주세포에 도입하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 사용되는 숙주세포에 따라 달라질 것이다. 바람직하게는, 생산비가 저렴하여 산업적 이용가치가 높은 대장균을 숙주세포로 생산할 수 있다.Isolated nucleic acid molecules encoding the antibodies of the present invention or fragments having immunological activity according to the present invention may be inserted into an expression vector for protein expression. Expression vectors typically contain proteins operably linked, i.e., placed in a functional relationship, with regulatory or control sequences, selectable markers, optional fusion partners, and/or additional elements. Under appropriate conditions, a host cell transformed with a nucleic acid, preferably an expression vector containing an isolated nucleic acid molecule encoding an antibody of the present invention or a fragment having immunological activity thereof, is cultured to induce protein expression. Antibodies of the invention or fragments thereof with immunological activity can be produced. A variety of suitable host cells can be used, including, but not limited to, mammalian cells, bacteria, insect cells, and yeast. Methods for introducing exogenous nucleic acids into host cells are known in the art and will vary depending on the host cell used. Preferably, E. coli, which has low production cost and thus has high industrial value, can be produced as a host cell.
본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 상기 시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속(Escherichia sp.)균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속(Bacillus sp.)균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모(yeast)인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널 서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.Vectors of the present invention include, but are not limited to, plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors, viral vectors, etc. Suitable vectors include expression control elements such as promoters, operators, start codons, stop codons, polyadenylation signals, and enhancers, as well as signal sequences or leader sequences for membrane targeting or secretion, and can be prepared in various ways depending on the purpose. The promoter of the vector may be constitutive or inducible. The signal sequence includes the PhoA signal sequence and OmpA signal sequence when the host is Escherichia sp., and the α-amylase signal sequence and subtilisin signal when the host is Bacillus sp. For sequences, etc., if the host is yeast, the MFα signal sequence, SUC2 signal sequence, etc. can be used, and if the host is an animal cell, the insulin signal sequence, α-interferon signal sequence, antibody molecule signal sequence, etc. can be used. It is not limited to this. Additionally, the vector may include a selection marker for selecting host cells containing the vector, and if it is a replicable expression vector, it will include an origin of replication.
본 발명에서 용어, "벡터"는 핵산 서열을 복제할 수 있는 세포로의 도입을 위해서 핵산 서열을 삽입할 수 있는 전달체를 의미한다. 핵산 서열은 외생 (exogenous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다. 벡터로서는 플라스미드, 코스미드 및 바이러스(예를 들면 박테리오파지)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 표준적인 재조합 기술에 의해 벡터를 구축할 수 있다(Maniatis, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; 및 Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology , John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994 등).In the present invention, the term "vector" refers to a carrier capable of inserting a nucleic acid sequence for introduction into a cell capable of replicating the nucleic acid sequence. Nucleic acid sequences may be exogenous or heterologous. Vectors include, but are not limited to, plasmids, cosmids, and viruses (eg, bacteriophages). Those skilled in the art can construct vectors by standard recombination techniques (Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; and Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994, etc.)
일 구현예에서, 상기 벡터의 제작 시, 상기 항체를 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.In one embodiment, when constructing the vector, expression control sequences such as promoters, terminators, enhancers, etc., depending on the type of host cell for producing the antibody, membrane targeting or secretion Sequences, etc. can be appropriately selected and combined in various ways depending on the purpose.
본 발명에서, 용어 "발현 벡터"는 전사되는 유전자 산물 중 적어도 일부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한 벡터를 의미한다. 일부의 경우에는 그 후 RNA 분자가 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드로 번역된다. 발현 벡터에는 다양한 조절서열을 포함할 수 있다. 전사 및 번역을 조절하는 조절서열과 함께 벡터 및 발현 벡터에는 또 다른 기능도 제공하는 핵산 서열도 포함될 수 있다.In the present invention, the term "expression vector" refers to a vector containing a nucleic acid sequence encoding at least a portion of the gene product to be transcribed. In some cases, the RNA molecule is then translated into a protein, polypeptide, or peptide. Expression vectors may contain various control sequences. In addition to regulatory sequences that regulate transcription and translation, vectors and expression vectors may also contain nucleic acid sequences that also serve other functions.
본 발명에서, 용어 "숙주세포"는 진핵생물 및 원핵생물을 포함하며, 상기 벡터를 복제할 수 있거나 벡터에 의해 코딩되는 유전자를 발현할 수 있는 임의의 형질 전환 가능한 생물을 의미한다. 숙주세포는 상기 벡터에 의해 형질감염(transfected) 또는 형질전환(transformed) 될 수 있으며, 이는 외생의 핵산분자가 숙주세포 내에 전달되거나 도입되는 과정을 의미한다.In the present invention, the term "host cell" includes eukaryotes and prokaryotes, and refers to any transformable organism capable of replicating the vector or expressing the gene encoded by the vector. The host cell may be transfected or transformed by the vector, which refers to a process in which an exogenous nucleic acid molecule is transferred or introduced into the host cell.
일 구현예에서, 상기 숙주 세포는 박테리아 또는 동물세포일 수 있으며, 동물 세포주는 CHO 세포, HEK 세포 또는 NSO 세포일 수 있고, 박테리아는 대장균일 수 있다.In one embodiment, the host cells may be bacteria or animal cells, the animal cell line may be CHO cells, HEK cells, or NSO cells, and the bacteria may be Escherichia coli.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 숙주 세포 배양물로부터 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 회수하는 단계를 포함하는 GKN1에 특이적인 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 제조하는 방법에 관한 것이다.In one aspect, the present invention includes culturing a host cell transformed with a vector containing an isolated nucleic acid molecule encoding an isolated antibody of the present invention or a fragment having immunological activity thereof; and recovering the antibody or immunologically active fragment thereof from the host cell culture.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 단리된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 포함하는 위암 선별검사 및 진단용 조성물에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to a composition for screening and diagnosing gastric cancer comprising the isolated antibody of the present invention or a fragment having immunological activity thereof.
일 구현예에서, 상기 조성물은 혈액, 혈장 또는 혈청 내에서 GKN1 단백질의 농도(수준)을 측정하기 위한 조성물일 수 있으며, 혈청 내 GKN1 단백질의 농도 측정용인 것이 가장 바람직하다.In one embodiment, the composition may be a composition for measuring the concentration (level) of GKN1 protein in blood, plasma, or serum, and is most preferably used for measuring the concentration of GKN1 protein in serum.
일 구현예에서, 상기 측정은 웨스턴블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), sandwich ELISA, 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 면역 전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석 또는 단백질 마이크로어레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 수행될 수 있으며, sandwich ELISA로 측정되는 것이 가장 바람직하다.In one embodiment, the measurement is performed using Western blot, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), sandwich ELISA, radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, and immunoprecipitation assay ( It can be performed by a method selected from the group consisting of Immunoprecipitation assay, Complement Fixation Assay, FACS, mass spectrometry, or protein microarray, and is most preferably measured by sandwich ELISA.
일 구현예에서, 상기 조성물은 ELISA 또는 sandwich ELISA 분석용일 수 있다.In one embodiment, the composition may be used for ELISA or sandwich ELISA analysis.
일 구현예에서, 상기 위암은 조기 위암 또는 진행성 위암일 수 있다.In one embodiment, the stomach cancer may be early stomach cancer or advanced stomach cancer.
일 측면에서, 본 발명은 조성물을 포함하는 위암 스크리닝 또는 진단 키트에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to a gastric cancer screening or diagnostic kit comprising a composition.
일 구현예에서, 상기 키트는 대상체 또는 환자로부터 생체 시료를 수집하기 위한 도구 및/또는 시약 뿐 아니라 그 시료로부터 게놈 DNA, cDNA, RNA 또는 단백질을 준비하기 위한 도구 및/또는 시약을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 게놈 DNA의 관련 영역을 증폭하기 위한 PCR 프라이머를 포함할 수 있다. 상기 키트는 약리게놈학적 프로파일링에 유용한 유전 인자의 프로브를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 키트의 사용에 있어서, 표지화된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 분석 중 용이하게 동정할 수 있다.In one embodiment, the kit may further include tools and/or reagents for collecting a biological sample from a subject or patient, as well as tools and/or reagents for preparing genomic DNA, cDNA, RNA or protein from the sample. there is. For example, it may include PCR primers to amplify relevant regions of genomic DNA. The kit may contain probes of genetic factors useful for pharmacogenomic profiling. Additionally, in the use of these kits, labeled oligonucleotides can be used for easy identification during analysis.
일 구현예에서, 상기 키트는 DNA 중합효소 및 dNTP(dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP), 형광물질 등의 표지 물질을 추가로 더 함유할 수 있다.In one embodiment, the kit may further contain labeling substances such as DNA polymerase, dNTPs (dGTP, dCTP, dATP, and dTTP), and fluorescent substances.
일 측면에서, 본 발명은 검사 대상체로부터 분리한 생물학적 시료에서 GKN1 단백질 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 위암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to a method of providing information necessary for diagnosing gastric cancer, comprising measuring the GKN1 protein concentration in a biological sample isolated from a test subject.
일 구현예에서, GKN1 단백질 수준이 143.2 ng/ml 이하인 경우 검사 대상체가 위암일 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.In one embodiment, if the GKN1 protein level is 143.2 ng/ml or less, a step of determining that the test subject has gastric cancer may be further included.
일 구현예에서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장 또는 혈청일 수 있으며, 혈청인 것이 더욱 바람직하다.In one embodiment, the biological sample may be blood, plasma, or serum, and is more preferably serum.
일 구현예에서, 위암은 조기 위암 또는 진행성 위암일 수 있다.In one embodiment, the stomach cancer may be early stomach cancer or advanced stomach cancer.
일 구현예에서, ELISA 분석 방법으로 GKN1 단백질 농도를 측정할 수 있으며, sandwich ELISA 분석 방법으로 측정하는 것이 가장 바람직하다.In one embodiment, the GKN1 protein concentration can be measured using an ELISA analysis method, and it is most preferable to measure it using a sandwich ELISA analysis method.
일 구현예에서, sandwich ELISA 분석 방법으로 혈청 내 GKN1 단백질 농도를 측정하기 위한 본 발명의 항-GKN1 항체의 최적 농도는 0.1 ug/ml일 수 있고, 상기 혈청의 최적 희석도는 10배일 수 있다.In one embodiment, the optimal concentration of the anti-GKN1 antibody of the present invention for measuring the GKN1 protein concentration in serum by a sandwich ELISA analysis method may be 0.1 ug/ml, and the optimal dilution of the serum may be 10 times.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.The present invention will be described in more detail through the following examples. However, the following examples are only for illustrating the content of the present invention and are not intended to limit the present invention.
실시예 1. 항-GKN1 단일클론 항체 (minibody) 제작Example 1. Production of anti-GKN1 monoclonal antibody (minibody)
항-GKN1 단일클론 항체를 개발하기 위해, 특정 항원에 대한 선택성 및 특이성을 가진 파지 디스플레이 테스트 방법을 이용하였다. 구체적으로, 인간 재조합 GKN1 단백질을 고체상에 고정한 후, M13 박테리오파지 표면에 다양한 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 발현하는 scFv 파지 라이브러리와 함께 배양하였다. 결합되지 않은 파지를 씻어내고, 고-친화성 파지를 고정된 항원으로부터 용리하였다. 용리된 파지를 E. coli 숙주 세포와 인큐베이션하여 감염시키고 GKN1에 친화성을 가지는 항체를 나타내는 파지의 아집단이 증폭되었다. 상기 패닝 과정을 3회 반복하였다. 감염된 박테리아의 콜로니를 플레이트에서 배양한 후, 각 콜로니로부터 단일클론 scFv(single-chain variable fragment)를 생성하고 ELISA를 이용하여 재조합 GKN1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 scFv를 독립적인 클론 단위로 선별하였다 (총 95개). 그 중 Fc 및 BSA(Bovine serum albumin)에 대한 백그라운드가 낮은 5가지를 확보하고, 이 중 BSA에 대한 백그라운드가 가장 낮은 단일클론 컨쥬게이트를 PCR로 증폭하고 미니-바디 (scFv-Fc) 발현 벡터에 삽입하였다. 그 후, 상기 재조합 플라스미드를 HEK293F 세포에 트랜스펙션하고 친화성 크로마토그래피를 이용하여 단일클론 미니-바디를 정제하였다 (도 1A).To develop anti-GKN1 monoclonal antibodies, a phage display test method with selectivity and specificity for a specific antigen was used. Specifically, human recombinant GKN1 protein was immobilized on a solid phase and then incubated with a scFv phage library expressing the heavy and light chain variable domains of various antibodies on the surface of M13 bacteriophage. Unbound phage was washed away, and high-affinity phage was eluted from the immobilized antigen. The eluted phages were incubated with E. coli host cells to infect them, and a subpopulation of phages expressing antibodies with affinity for GKN1 was amplified. The panning process was repeated three times. After cultivating colonies of infected bacteria on a plate, a monoclonal scFv (single-chain variable fragment) was generated from each colony, and the monoclonal scFv that specifically binds to the recombinant GKN1 protein was selected as an independent clone unit using ELISA. (95 in total). Among them, five with low background for Fc and BSA (Bovine serum albumin) were obtained, and among these, the monoclonal conjugate with the lowest background for BSA was amplified by PCR and inserted into a mini-body (scFv-Fc) expression vector. inserted. Afterwards, the recombinant plasmid was transfected into HEK293F cells and the monoclonal mini-body was purified using affinity chromatography (Figure 1A).
실시예 2. 항-GKN1 단일클론 항체 분석Example 2. Anti-GKN1 monoclonal antibody analysis
2-1. 중쇄 및 경쇄 가변 부위 서열 확인2-1. Confirmation of heavy and light chain variable region sequences
상기 실시예 1에서 제작한 항-GKN1 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 부위(영역)의 아미노산 서열을 결정하였다. 구체적으로, 항-GKN1 항체의 파지미드 DNA를 추출한 후 PCR-시퀀싱 (ABI3730XL, Sanger-method sequencing, Phred Score>20) (프라이머 서열: Forward: 5'-AAGACAGCTATCGCGATTGCAG-3' 및 reverse: 5'-GCCCCCTTATTAGCGTTTGCCATC-3')을 이용하여 항-GKN1 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 부위의 DNA 서열을 결정하고 항체의 VL, 링커, VH 및 CDRs(complementarity determining regions, 상보성결정영역)의 서열을 표기하였다 (도 1b). The amino acid sequences of the heavy chain and light chain variable regions (regions) of the anti-GKN1 antibody prepared in Example 1 were determined. Specifically, the phagemid DNA of the anti-GKN1 antibody was extracted and then subjected to PCR-sequencing (ABI3730XL, Sanger-method sequencing, Phred Score>20) (primer sequence: Forward: 5'-AAGACAGCTATCGCGATTGCAG-3' and reverse: 5'-GCCCCCTTATTAGCGTTTGCCATC -3') was used to determine the DNA sequence of the heavy and light chain variable regions of the anti-GKN1 antibody, and the sequences of the antibody's VL, linker, VH, and CDRs (complementarity determining regions) were indicated (Figure 1b) .
2-2. 에피토프 맵핑2-2. Epitope mapping
상기 실시예 1에서 제작한 항-GKN1 항체의 잠재력 및 항원 특이성을 조사하기 위해, 199 펩타이드를 포함하는 마이크로어레이 기술인 PEPperMAP®기술 (PEPperPRINT GmbH, Heidelberg, Germany)을 이용하여 항체의 선형 에피토프를 맵핑하였다. 구체적으로, 절단된 펩타이드를 피하기 위해, GKN1 (UniProtKB Q9NS71)의 서열의 C-말단 및 N-말단을 중성 GSGSGSG 링커로 연장하였다. 연장된 항원 서열을 14개 아미노산의 펩타이드-펩타이드 오버랩을 가지는 선형의 15개 아미노산 펩타이드로 번역하였다. 펩타이드 합성 후, C-말단의 시스테인 및 적절하게 변형된 N-말단 간의 티오에테르(thioether) 연결을 통해 모든 펩타이드를 고리화하였다. 중복 프린트된 199개의 서로 다른 펩타이드 (398개의 펩타이드 스팟)를 포함하며, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA, YPYDVPDYAG, 76 스팟) 대조군 펩타이드로서 추가로 포함하도록 형태적(conformational) GKN1 펩타이드 마이크로어레이를 제작하였다. 항-GKN1 항체를 함유하는 하이브리도마 상청액을 인큐베이션 PBS 버퍼 (pH 7.4, with 0.005% Tween 20) 및 10% MB-070 블로킹 버퍼 (Rockland Immunochemicals, Limerick, Pennsylvania, USA)로 희석하고, 상기 펩타이드 마이크로어레이와 4℃에서 140 rpm으로 16시간 동안 인큐베이션하였다. 어레이를 세척 버퍼 (PBS, pH 7.4, with 0.005% Tween 20)로 세척하여 결합하지 않은 항체들을 제거하였다. 그 후, 펩타이드 어레이를 0.2 μg/mL의 DyLight680 (Thermo Fisher Scientific)가 컨쥬게이트된 고트 항-인간 IgG (H+L)로 염색하였다. 펩타이드 어레이를 프레이밍하는 HA 대조 펩타이드를 0.5 μg/mL의 단일클론 항-HA (12CA5)-DyLight800 (Thermo Fisher Scientific)로 상온에서 45분간 염색하였다. LI-COR Odyssey Imaging System (scanning offset 0.65 mm, resolution 21 μm, 및 scanning intensities of 7/7 (red=700 nm/green=800 nm) 및 PepSlide Analyzer를 이용하여 스팟 강도 및 펩타이드 주석(peptide annotation)을 정량하였다. 또한, 또 다른 인간 GKN1 펩타이드 마이크로어레이 카피를 인간 항체 항-GKN1 항체와 인큐베이션한 결과, 신호-노이즈 비율에서 컨센서스 모티프(consensus motif)인 KGPGGPPPK를 중심으로 인접한 펩타이드들에서 스팟 패턴을 보였다 (도 1C). 이러한 신호 패턴들을 바탕으로 에피토프를 맵핑한 결과, 본 발명에서 제작한 항체가 GKN1 단백질의 BRICHOS 도메인에 위치한 단일 에피토프 (KLQGKGPGGPPPKGL, 서열번호 1)를 인식하는 명확한 단일클론 항체 반응을 나타냈다 (도 1D).To investigate the potential and antigen specificity of the anti-GKN1 antibody produced in Example 1, the linear epitope of the antibody was mapped using PEPperMAP® technology (PEPperPRINT GmbH, Heidelberg, Germany), a microarray technology containing 199 peptides. . Specifically, to avoid truncated peptides, the C-terminus and N-terminus of the sequence of GKN1 (UniProtKB Q9NS71) were extended with a neutral GSGSGSG linker. The extended antigen sequence was translated into a linear 15 amino acid peptide with a peptide-peptide overlap of 14 amino acids. After peptide synthesis, all peptides were cyclized through a thioether linkage between the cysteine at the C-terminus and the appropriately modified N-terminus. A conformational GKN1 peptide microarray was created containing 199 different overprinted peptides (398 peptide spots), with the additional inclusion of human influenza hemagglutinin (HA, YPYDVPDYAG, 76 spots) as a control peptide. did. Hybridoma supernatant containing anti-GKN1 antibody was diluted with incubation PBS buffer (pH 7.4, with 0.005% Tween 20) and 10% MB-070 blocking buffer (Rockland Immunochemicals, Limerick, Pennsylvania, USA), and the peptide micro The array was incubated at 4°C at 140 rpm for 16 hours. The array was washed with wash buffer (PBS, pH 7.4, with 0.005% Tween 20) to remove unbound antibodies. The peptide array was then stained with goat anti-human IgG (H+L) conjugated with 0.2 μg/mL DyLight680 (Thermo Fisher Scientific). The HA control peptide framing the peptide array was stained with 0.5 μg/mL monoclonal anti-HA (12CA5)-DyLight800 (Thermo Fisher Scientific) for 45 minutes at room temperature. Spot intensity and peptide annotation were determined using the LI-COR Odyssey Imaging System (scanning offset 0.65 mm, resolution 21 μm, and scanning intensities of 7/7 (red=700 nm/green=800 nm) and PepSlide Analyzer. In addition, another human GKN1 peptide microarray copy was incubated with a human antibody anti-GKN1 antibody, and a spot pattern was seen in adjacent peptides centered around the consensus motif KGPGGPPPK in the signal-to-noise ratio. Figure 1C). As a result of epitope mapping based on these signal patterns, the antibody produced in the present invention showed a clear monoclonal antibody response recognizing a single epitope (KLQGKGPGGPPPKGL, SEQ ID NO: 1) located in the BRICHOS domain of GKN1 protein. Figure 1D).
실시예 3. 혈청 GKN1 ELISA 분석 최적화Example 3. Optimization of serum GKN1 ELISA assay
3-1. 항-GKN1-HRP 컨쥬게이트 제작3-1. Construction of anti-GKN1-HRP conjugate
sandwich ELISA 검사를 위해 HRP-conjugation Kit (Abcam)를 이용하여 본 발명의 항-GKN1 항체 (H7 minibody)에 HRP를 표지하였다. ELISA 검사에서 HRP 표지된 항체를 이용하여 TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)와 37℃에서 30분 반응시킨 후 A450 흡광도 판독값을 기준으로 계산하였다. For the sandwich ELISA test, the anti-GKN1 antibody (H7 minibody) of the present invention was labeled with HRP using the HRP-conjugation Kit (Abcam). In the ELISA test, HRP-labeled antibody was used and reacted with TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) at 37°C for 30 minutes, and then calculated based on the A450 absorbance reading.
3-2. 항-GKN1 항체의 농도 최적화3-2. Optimization of concentration of anti-GKN1 antibody
혈청 내 GKN1 농도를 측정하기 위한 GKN1 sandwich ELISA 분석 방법의 적용 가능성을 재조합 GKN1 단백질, 건강한 개체 및 위암 환자 유래 혈청을 이용하여 확인하였다. 구체적으로, 혈청 시료는 침윤 정도에 따라 분류된 진행성 위암 (advanced gastric cancer, AGC) 420명 및 조기 위암(early gastric cancer, EGC) 180명을 포함하는 600명의 위암 환자와, 대조군 건강한 지원자 (n=280)로부터 수집되었으며, 상기 어떤 환자에게서도 가족성 암의 증거가 발견되지 않았다. 상기 혈청 시료들 간 변이를 정규화하기 위해, 혈청 내 총 단백질 농도를 PBS를 사용해 15 μg/ml로 조정하였다. 또한, sandwich ELISA 검사에서 검출용으로 사용되는 본 발명의 항체 농도를 최적화하기 위해 항-GKN1 항체 (H7 미니바디)를 0.025, 0.05, 0.1 및 0.2 ug으로 연속희석하여 softMaxPro를 이용하여 로지스틱 회귀 모델에서 변동 계수 (coefficient of variation, CV)를 추정하였다. ELISA 조건 최적화를 위해, 큰 양의 선행 연관성 (R2>0.9)을 달성한 조건, 및 LOD(limit of detection), LOQ(lower limit of quantification) 및 재조합 GKN1 단백질, 인간 혈청 및 항-GKN1 항체의 희석 선형성과 같은 분석 매개 변수가 평가되었다. 아울러, 마이크로타이터 플레이트를 또 다른 항-GKN1 단일클론 항체 (C8 미니바디)로 코팅하고 마이크로플레이트용 접착 실링 필름 (ImmunoChemistry Technologies, MN, USA)으로 밀봉하였다. 200 ul/웰의 블로킹 용액으로 웰들을 블로킹한 후, 플레이트를 상온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후 HBST 버퍼로 2회 세척하고 재조합 인간 GKN1 단백질로 보정하였다. 그 후, 상기에서 준비한 혈청 시료와 재조합 GKN1 단백질을 각 웰에 넣고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후 HBST로 3회 세척하고 본 발명의 실시예 1에서 제작한 HRP가 컨쥬게이션된 항-GKN1 단일클론 항체 (H7 미니바디)를 검출용 항체 (detection antibody)를 첨가한 뒤, 상온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 혈청 내 GKN1 수준은 Synergy H1 plate reader ELISA reader (Bio-Tek)를 이용하여 A450 흡광도 판독값을 기준으로 계산하였다.The applicability of the GKN1 sandwich ELISA analysis method to measure GKN1 concentration in serum was confirmed using recombinant GKN1 protein, serum from healthy individuals, and gastric cancer patients. Specifically, serum samples were collected from 600 gastric cancer patients, including 420 advanced gastric cancer (AGC) and 180 early gastric cancer (EGC) classified by degree of invasion, and a control group of healthy volunteers (n= 280), and no evidence of familial cancer was found in any of the patients. To normalize the variation between the serum samples, the total protein concentration in serum was adjusted to 15 μg/ml using PBS. In addition, in order to optimize the concentration of the antibody of the present invention used for detection in the sandwich ELISA test, anti-GKN1 antibody (H7 minibody) was serially diluted to 0.025, 0.05, 0.1, and 0.2 ug and calculated using softMaxPro in a logistic regression model. The coefficient of variation (CV) was estimated. For ELISA condition optimization, conditions that achieved a large positive a priori association (R 2 > 0.9), and limit of detection (LOD), lower limit of quantification (LOQ), and recombinant GKN1 protein, human serum, and anti-GKN1 antibody Analytical parameters such as dilution linearity were evaluated. In addition, the microtiter plate was coated with another anti-GKN1 monoclonal antibody (C8 minibody) and sealed with an adhesive sealing film for microplates (ImmunoChemistry Technologies, MN, USA). After blocking the wells with 200 ul/well of blocking solution, the plate was incubated at room temperature for 1 hour. Afterwards, it was washed twice with HBST buffer and corrected with recombinant human GKN1 protein. Afterwards, the serum sample prepared above and the recombinant GKN1 protein were added to each well and incubated at 37°C for 1 hour. After washing three times with HBST, the HRP-conjugated anti-GKN1 monoclonal antibody (H7 minibody) prepared in Example 1 of the present invention was added as a detection antibody, and incubated at room temperature for 1 hour. It was incubated for a while. GKN1 levels in serum were calculated based on A450 absorbance readings using a Synergy H1 plate reader ELISA reader (Bio-Tek).
Sandwich ELISA 분석을 위해 다른 항-GKN1 항체(C8) 1 ug/ml를 마이크로프레이트에 코팅하고 재조합 GKN1 단백질을 이용하여, 실시예 1에서 선정한 본 발명의 HRP 컨쥬게이션된 항-GKN1 항체 (H7)의 여러 농도에서 얻은 ELISA 값은 H7 항-GKN1 항체 0.1 ug/ml을 사용한 값과 유사하게 매우 일관된 값을 가지는 것으로 나타났다 (도 2A). 또한, 재조합 GKN1 단백질의 연속 희석 계산 곡선에서, 결과 대 예측 재조합 GKN1 농도의 선형 회귀 분석은 0.1 ug/ml의 H7-HRP 항체로 검출한 경우 0.9906의 결정 계수 (R2, coefficient of determination)를 도출했다 (도 2A). C8 항-GKN1 항체 1 ug/ml를 마이크로프레이트에 코팅하고 캘리브레이터로서 재조합 GKN1 단백질을, 그리고 본 발명의 HRP 컨쥬게이션된 항-GKN1 항체 (H7)를 검출용 항체로 사용한 sandwich ELISA 분석에서 CV(variation coefficient)는 재조합 GKN1 단백질에 대해 0.02 내지 0.06로 나타났고 PBS 시료에 대해 0.18로 나타났다. 아울러, LOD는 0.402 ng/ml로, LOQ는 1.34 ng/ml로 나타났다 (도 2B). 또한, 상기 결과의 결정 계수와 바탕시료(blank) 값을 기준으로 혈청 내 GKN1 수준을 sandwich ELISA 법으로 측정하기 위한 본 발명의 최적 항-GKN1 항체의 농도는 0.1 ug/ml인 것을 확인할 수 있었다.For sandwich ELISA analysis, 1 ug/ml of another anti-GKN1 antibody (C8) was coated on a microplate and the HRP conjugated anti-GKN1 antibody (H7) of the present invention selected in Example 1 was used using recombinant GKN1 protein. ELISA values obtained at various concentrations appeared to be very consistent, similar to the values using 0.1 ug/ml of H7 anti-GKN1 antibody (Figure 2A). Additionally, in the serial dilution calculation curve of recombinant GKN1 protein, linear regression analysis of the resulting versus predicted recombinant GKN1 concentration yielded a coefficient of determination (R 2 ) of 0.9906 when detected with 0.1 ug/ml H7-HRP antibody. (Figure 2A). 1 ug/ml of C8 anti-GKN1 antibody was coated on a microplate, and CV (variation) was performed in a sandwich ELISA assay using recombinant GKN1 protein as a calibrator and the HRP conjugated anti-GKN1 antibody (H7) of the present invention as a detection antibody. coefficient) was found to be 0.02 to 0.06 for the recombinant GKN1 protein and 0.18 for the PBS sample. In addition, the LOD was found to be 0.402 ng/ml and the LOQ was found to be 1.34 ng/ml (Figure 2B). In addition, based on the coefficient of determination and blank value of the above results, it was confirmed that the optimal concentration of the anti-GKN1 antibody of the present invention for measuring the level of GKN1 in serum by sandwich ELISA method was 0.1 ug/ml.
3-3. 혈청의 희석도 최적화3-3. Optimization of dilution of serum
10개의 서로 다른 건강한 혈청으로 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 및 1:1280의 혈청 희석 농도를 평가하여 혈청의 최적 희석도를 결정하였다. 그 결과, 1:10 및 1:100으로 희석한 혈청에서 혈청 내 GKN1 농도의 Mean ± SD는 각각 24.29 ± 18.33 ng/ml 및 0.957 ± 1.17 ng/ml로 나타났다. 혈청 희석 배수에 따른 결정 계수 (R2)는 10개의 시료 모두에서 0.92 이상으로 나타났으며, 혈청을 10배 희석한 분석 결과에서 CV는 1.1859 및 s/n ratios는 3.038로 나타났다 (도 2C). 이를 통해, ELISA 분석에서 혈청 내 IgG 등으로 인한 비특이적 반응을 최소화하기 위한 혈청의 최적 희석도는 10배 희석인 것을 확인할 수 있었다.Serum dilutions of 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 and 1:1280 were evaluated with 10 different healthy sera to determine the optimal dilution of serum. decided. As a result, the mean ± SD of GKN1 concentration in serum in serum diluted 1:10 and 1:100 was 24.29 ± 18.33 ng/ml and 0.957 ± 1.17 ng/ml, respectively. The coefficient of determination (R 2 ) according to serum dilution factor was found to be more than 0.92 in all 10 samples, and in the analysis results of 10-fold dilution of serum, CV was 1.1859 and s/n ratios were 3.038 (Figure 2C). Through this, it was confirmed that the optimal dilution of serum to minimize non-specific reactions due to IgG in serum in ELISA analysis is 10-fold dilution.
실시예 4. 혈청 내 GKN1 ELISA 분석값을 이용한 위암 진단Example 4. Gastric cancer diagnosis using GKN1 ELISA assay in serum
4-1. 혈청 내 GKN1의 ELISA 분석을 통한 위암 진단 확인4-1. Confirmation of gastric cancer diagnosis through ELISA analysis of GKN1 in serum
상기 실시예 3에서와 같이, 건강한 대상 및 위암 환자의 혈청 시료 내 GKN1 수준을 sandwich ELISA 분석으로 확인하였다. 항-GKN1 sandwich ELISA키트의 진단 유용성을 최적화하기 위해, ROC(receiver-operator characteristic) 곡선 분석을 수행하였으며, 이를 이용하여 위암 검출을 위한 혈청 GKN1 농도의 최적 컷오프 수준을 결정하였다. 상기 혈청 내 GKN1 단백질 수준의 컷-오프 값을 기반으로 민감도 (true positive fraction; TPF), 특이도 (true negative fraction; TPF), FNF (false negative fraction), FPF(false positive fraction), PPV(positive predictive value), NPV(negative predictive value), 정확도(accuracy), LR+(positive likelihood ratio), LR-(negative likelihood ratio) 및 DOR(diagnostic odds ratio)를 결정하였다.As in Example 3 above, the level of GKN1 in serum samples from healthy subjects and gastric cancer patients was confirmed by sandwich ELISA analysis. To optimize the diagnostic utility of the anti-GKN1 sandwich ELISA kit, receiver-operator characteristic (ROC) curve analysis was performed, and the optimal cutoff level of serum GKN1 concentration for gastric cancer detection was determined. Based on the cut-off value of the GKN1 protein level in the serum, sensitivity (true positive fraction; TPF), specificity (true negative fraction; TPF), FNF (false negative fraction), FPF (false positive fraction), PPV (positive fraction) predictive value (NPV), negative predictive value (NPV), accuracy, positive likelihood ratio (LR+), negative likelihood ratio (LR-), and diagnostic odds ratio (DOR) were determined.
본 발명의 항-GKN1 항체를 이용한 ELISA 분석으로 혈청을 10배 희석하여 GKN1 농도를 확인한 결과, 혈청 내 GKN1 농도가 위암 환자 (57.96 ± 47.03 ng/ml)에서 건강한 대상 (312.9 ± 134.5 ng/ml)에 비해 현저히 낮은 것으로 나타났다 (도 3A 및 표 1). 또한, 혈청 내 GKN1 단백질이 위암의 스크리닝 및 조기 진단 마커로서 적용될 수 있는지 확인하기 위해, ROC 곡선 분석을 수행한 결과, 혈청 내 GKN1 단백질 수준은 AUC 값이 0.9953로 건강한 개인과 위암 환자를 거의 확실하게 구분하는 것으로 나타났으며 (도 3B), 143.2 ng/ml의 혈청 내 GKN1 수준이 위암 진단을 위한 최적 컷-오프 값으로 확인되었다 (도 3A). 280명의 대조군 중 271명에서 혈청 내 GKN1 단백질 수준은 상기 컷-오프 값을 초과한 반면, 600명의 위암 환자 중 581명의 환자 혈청 내 GKN1 단백질 농도가 상기 컷-오프 값 이하로 나타났다 (도 3A 및 표 1). 이 컷-오프 값에서, 위암 진단에 대한 민감도 및 특이도는 각각 98.4% 및 93.4%로 나타났으며 (도 3B 및 표 2), PPV 및 NPV는 각각 96.8% 및 96.7%로 나타났다 (표 2). 또한, 혈청 내 GKN1 컷-오프 값에서 진단 정확도 및 DOR는 각각 96.8% 및 920.7로 나타났다 (표 2). 따라서, 본 발명의 항-GKN1 항체를 이용한 혈청 내 GKN1 단백질의 sandwich ELISA 분석이 민감도 및 특이도가 매우 높은 위암 스크리닝 또는 진단 툴로서 이용될 수 있음을 알 수 있다.As a result of confirming the concentration of GKN1 by diluting the serum 10 times by ELISA analysis using the anti-GKN1 antibody of the present invention, the concentration of GKN1 in the serum was found to be higher in gastric cancer patients (57.96 ± 47.03 ng/ml) and in healthy subjects (312.9 ± 134.5 ng/ml). It was found to be significantly lower compared to (Figure 3A and Table 1). In addition, to determine whether GKN1 protein in serum can be applied as a screening and early diagnosis marker for gastric cancer, ROC curve analysis was performed, and the results showed that the GKN1 protein level in serum had an AUC value of 0.9953, which almost certainly differentiates healthy individuals and gastric cancer patients. (Figure 3B), and a serum GKN1 level of 143.2 ng/ml was identified as the optimal cut-off value for gastric cancer diagnosis (Figure 3A). The GKN1 protein level in the serum of 271 out of 280 controls exceeded the above cut-off value, while the GKN1 protein level in the serum of 581 patients out of 600 gastric cancer patients was below the above cut-off value (Figure 3A and Table One). At this cut-off value, the sensitivity and specificity for diagnosing gastric cancer were 98.4% and 93.4%, respectively (Figure 3B and Table 2), and the PPV and NPV were 96.8% and 96.7%, respectively (Table 2). . Additionally, the diagnostic accuracy and DOR at the GKN1 cut-off value in serum were 96.8% and 920.7, respectively (Table 2). Therefore, it can be seen that the sandwich ELISA analysis of GKN1 protein in serum using the anti-GKN1 antibody of the present invention can be used as a gastric cancer screening or diagnostic tool with very high sensitivity and specificity.
4-2. 진행성 위암(AGC) 및 조기 위암(EGC) 구별능 확인4-2. Confirmed ability to differentiate between advanced gastric cancer (AGC) and early gastric cancer (EGC)
본 발명의 항-GKN1 항체를 이용한 혈청 내 GKN1 단백질의 ELISA 분석이 위암의 진행 정도도 구별할 수 있는지 확인하였다. It was confirmed whether ELISA analysis of GKN1 protein in serum using the anti-GKN1 antibody of the present invention can distinguish the degree of progression of gastric cancer.
그 결과, 혈청 내 GKN1 단백질 수준이 EGC 는 68.24 ± 35.22 ng/ml 및 AGC는 53.56 ± 50.66 ng/ml 로 나타나 건강한 개체에 비해 현저히 낮게 나타났으며, AGC 환자군과 EGC 환자군과의 통계학적 차이는 없었다 (도 4A 및 표 3). 또한, ROC 곡선 분석은 혈청 내 GKN1 수준이 건강한 개체로부터 EGC 및 AGC 환자를 모두 명확하게 구별하는 것으로 나타났으며, AUC는 각각 0.9955 (AUC 95% CI= 0.9883 ~ 1.000) 및 0.9959 (AUC 95% CI= 0.9923 ~ 0.9996)로 나타났다 (도 4B 및 C). 또한, ROC 분석 결과, 건강한 개체로부터 EGC 및 AGC를 진단하기 위한 혈청 내 GKN1 수준의 최적 진단 컷-오프 값이 각각 133.8 ng/ml (민감도 97.7% 및 특이도 97.8%) 및 139.0 ng/ml (민감도 97.8% 및 특이도 94.7%)인 것으로 나타났다 (도 4A 내지 C, 및 표 4). As a result, the GKN1 protein level in serum was 68.24 ± 35.22 ng/ml for EGC and 53.56 ± 50.66 ng/ml for AGC, which was significantly lower than that of healthy individuals, and there was no statistical difference between the AGC patient group and the EGC patient group. (Figure 4A and Table 3). Additionally, ROC curve analysis showed that serum GKN1 levels clearly distinguished both EGC and AGC patients from healthy individuals, with AUCs of 0.9955 (AUC 95% CI=0.9883 to 1.000) and 0.9959 (AUC 95% CI), respectively. = 0.9923 ~ 0.9996) (Figure 4B and C). Additionally, the ROC analysis results showed that the optimal diagnostic cut-off values of serum GKN1 levels for diagnosing EGC and AGC in healthy individuals were 133.8 ng/ml (sensitivity 97.7% and specificity 97.8%) and 139.0 ng/ml (sensitivity 97.8%, respectively). 97.8% and specificity 94.7%) (Figures 4A-C, and Table 4).
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Claims (26)
b) 숙주 세포 배양물로부터 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 회수하는 단계를 포함하는 GKN1에 특이적인 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 제조하는 방법.a) cultivating a host cell transformed with a vector containing an isolated nucleic acid molecule encoding the isolated antibody of claim 1 or an immunologically active fragment thereof; and
b) A method of producing a GKN1-specific antibody or immunologically active fragment thereof, comprising the step of recovering the antibody or immunologically active fragment thereof from the host cell culture.
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