KR20240054188A - 홍합 접착 단백질-기반 세포 지지체의 제조 방법 및 이의 용도 - Google Patents

홍합 접착 단백질-기반 세포 지지체의 제조 방법 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20240054188A
KR20240054188A KR1020230137918A KR20230137918A KR20240054188A KR 20240054188 A KR20240054188 A KR 20240054188A KR 1020230137918 A KR1020230137918 A KR 1020230137918A KR 20230137918 A KR20230137918 A KR 20230137918A KR 20240054188 A KR20240054188 A KR 20240054188A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cell
stem cells
protein
mussel adhesive
bone
Prior art date
Application number
KR1020230137918A
Other languages
English (en)
Inventor
하성민
정지수
김한솔
임선아
한승민
김용현
이선애
최봉혁
차형준
Original Assignee
(주)네이처글루텍
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)네이처글루텍 filed Critical (주)네이처글루텍
Publication of KR20240054188A publication Critical patent/KR20240054188A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/227—Other specific proteins or polypeptides not covered by A61L27/222, A61L27/225 or A61L27/24
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3834—Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3843—Connective tissue
    • A61L27/3847—Bones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/56—Porous materials, e.g. foams or sponges
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C12N2533/80—Hyaluronan

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Abstract

본 발명은 홍합 접착 단백질-기반 세포 지지체의 제조 방법 및 이의 용도 에 관한 것으로, 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 혼합되어 형성된 코아세르베이트(coacervate)에 최적 조건의 폴록사머(Poloxamer)를 첨가한 후, 세포를 접촉시켜 제조된 액상 물성을 갖는 세포 지지체를 제공하며, 목적 세포를 포집된 상태로 전달 및 생착시키는 연골 재생 효과가 우수하므로, 새로운 세포 치료제 플랫폼으로 적용할 수 있다.

Description

홍합 접착 단백질-기반 세포 지지체의 제조 방법 및 이의 용도{Method for Preparing Mussel Adhesive Protein-Based Cell Scaffold and Uses Thereof}
본 발명은 홍합 접착 단백질-기반 세포 지지체의 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
줄기세포를 이용한 난치병 정복은 현세기 생명과학계의 중요한 과제로 심혈관계, 신경계, 혈액을 비롯한 대부분의 의학분야에서 주목 받고 있다. 특히, 치료가 불가능하다고 간주된 퇴행성 질환에도 줄기세포를 통한 치료요법을 적용함으로써, 많은 긍정적인 결과를 도출하고 있다. 이러한 결과로부터, 줄기세포 이용은 약물 및 수술 위주의 임상치료에 획기적인 변화를 가져 올 수 있는 첨단 의료기술로 평가되고 있다.
그러나, 줄기세포만을 단일적으로 사용하여 시행되는 시술법은 임상적 결과에 의해 다양한 문제점들이 지적되어 왔는데, 가장 크게 대두된 문제점으로는 타겟성과 효율성에 관한 것이다.
상세하게는 종래의 주입하는 형태의 치료제의 경우, 목표로 하고자 하는 부위에 정확히 전달이 안될 수도 있다는 문제점과 함께, 주입된 세포들이 흩어질 우려가 있어 자리잡고 분화하기까지 어려움이 있다는 결과가 연구에 의해 밝혀졌다.
이에 따라, 줄기세포 전달의 효율성 문제를 해결하기 위한 연구로서, 안정한 형태로 치료하고자 하는 부위에 정확히 전달할 수 있는 방법에 대한 연구가 각계 연구분야 협력을 통해 진행되고 있다.
이러한 노력의 일환으로서, 줄기세포에 조직공학적 기술을 접목한 하이브리드형의 조직공학제제가 활발히 연구되고 있다. 상기 조직공학제제란 줄기세포에 전달 매개체를 도입하는 방법으로 생체적합성이 우수한 물질을 적합한 형태로 취한 후, 줄기세포를 배양하여 시술이 필요한 부위에 적용하는 것을 말한다. 이러한 조직공학제제는 질환부위에 따라 다양한 형태로 제작될 수 있다.
또한, 줄기세포가 손상된 조직을 치유하는 치료제로 사용되기 위해서는 손상 조직까지 세포 유실을 최소화하여 잘 전달되어야 할 뿐만 아니라 줄기세포가 지속적으로 분화능을 유지하는 것이 필수적이다. 뿐만 아니라, 줄기세포 치료를 필요로 하는 만성 질환의 경우 손상된 조직이 괴사되어 있을 뿐만 아니라 조직 주변의 혈관 또한 손상된 경우가 많으므로 혈액의 유입이 적다. 이는 물질 대사를 위해 필요한 산소가 부족한 환경이기 때문에 세포가 생존하기 어렵다. 그리하여, 줄기세포 치료를 위한 세포전달체는 생체적합성은 물론, 표적 손상 조직까지 쉽게 전달될 수 있고, 세포 유실을 최소화하며 줄기세포의 생존과 분화능 유지를 할 수 있어야 한다. 이처럼, 목적 질환을 치유하기 위한 세포 지지체를 개발하기 위해서는 앞서 언급한 다양한 조건들을 충족시켜야 하기 때문에 개발이 지연되고 있다.
한편, 코아세르베이트는 음이온성 고분자 전해질과 양이온성 고분자 전해질이 특정 조건에서 혼합되었을 때 형성되는 콜로이드 물질의 일종으로, 코아세르베이트가 형성되었을 때 용액의 흡광도는 증가하게 되고, 용액 상에서 동그란 구 형태로 외부 용액과 분리되어 존재한다. 코아세르베이트 형성 시, 참여 전해질은 용액에서 분리되어 응축되고 여전히 액상을 띠게 되며, 이때 표면장력이 줄어들고 점성이 늘어나는 등, 물성도 변화한다. 코아세르베이트는 단백질과 그 반대 성질을 띠는 고분자 전해질과의 혼합을 통해서도 일어날 수 있다 (C.G. deKruif 등, 2004, Current Opinion in Colloid and Interface　Science 9, 340-349). 코아세르베이트의 낮은 표면장력에 기인해 약물, 효소, 세포, 식품첨가물 등의 기능성 물질을 미세캡슐 안에 고정화 하는데 쓰이는 기술도 보고되어 있다. (Schmitt C. 등, 1998, Critical Review in Food Science and Nutrition 8, 689-753).
해양 생명체인 홍합(mussel)은 접착 단백질들(adhesive proteins)을 생산, 분비함으로써 홍합 자신을 바다 속의 바위와 같은 젖은 고체표면에 단단히 부착할 수 있어, 파도의 충격이나 바닷물의 부력 효과에 영향을 받지 않는다 (J.H. Waite 등, 1983, Biological Review 58, 209-231; H.J. Cha 등, 2008, Biotechnology Journal 3,631-638). 이러한 홍합 접착 단백질은 현재 알려진 화학 합성 접착제와 비교하였을 때 강력한 자연 접착제로 알려져 있으며, 대부분 에폭시 수지보다 약 두 배 정도의 높은 인장강도를 나타내면서도 휘어질 수 있는 유연성을 가지고 있다.　또한 홍합 접착 단백질은 플라스틱, 유리, 금속, 테플론 및 생체물질 등의 다양한 표면에 접착할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 젖은 표면에 몇 분 안에 붙을 수 있다.　이러한 특성은 아직까지 화학접착제 분야에서는 미완의 과제로 남아있다. 또한, 접착 단백질은 인간세포를 공격하거나 면역반응을 일으키지 않는 것으로 알려져 수술시 생체조직의 접착이나 부러진 치아의 접착 등의 의료분야에 응용 가능성이 크다 (J. Dove 등, 1986, Journal of American Dental Association 112, 879). 특히, 상기 홍합 접착 단백질은 세포의 표면 접착 기술 분야에도 이용될 수 있는데, 세포의 표면 접착 기술은 세포 배양 및 조직 공학 분야에 필요한 매우 중요한 기술 중의 하나로서, 세포 및 조직 배양을 위해 세포를 세포배양 표면에 효율적으로 접착시킬 수 있는 기술이므로 특정 세포의 전달, 포집, 증식 및 분화를 촉진시키는 데 매우 중요하다
따라서, 최적 조건의 홍합 접착 단백질 기반의 코아세르베이트를 이용한 세포 지지체의 개발은 효율적으로 목적 질환, 특히, 골관절염을 치유할 수 있는 해결책이 될 수 있을 것이다.
이러한 상황 하에서, 본 발명자들은 골관절염 치료용 세포 지지체를 개발하기 위하여 예의 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 홍합 접착 단백질(MAP)에 히알루론산(HA)을 혼합하여 형성된 코아세르베이트(MAP-HA Coacervate)에, 종래 알려진 이용 농도보다 현저히 낮은 농도인 1% 이하, 예컨대, 0.7%(w/w)의 폴록사머(Poloxamer)를 첨가하여 세포지지체(CartiFix)를 제작하였고, 이러한 최적 조성에 의해 하이드로겔이 형성되지 않고 액상 상태의 물성이 유지될 뿐만 아니라, 주사제에 적합한 전단 점도 특성을 가지게 되어, 세포 증식, 스페로이드 형성에 유리한 환경을 제공하여, 우수한 유리연골 재생 효과가 발휘되는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 일 목적은 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 혼합되어 형성된 코아세르베이트(coacervate)에 폴록사머(Poloxamer)를 첨가한 후, 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 지지체의 제조 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 따라 제조된 세포 지지체를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포 지지체를 포함하는 골 재생용 세포 치료제를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포 지지체를 포함하는 골질환의 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 혼합되어 형성된 코아세르베이트(coacervate)에 줄기 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 지지체의 제조 방법 및 이에 따라 제조된 세포 지지체를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 세포 지지체는, 줄기 세포를 함유하는 세포치료용 세포 지지체로서, 줄기 세포를 코아세르베이트로 이루어진 담체의 내부에 삽입시켜 형성된, 즉, 코아세르베이트의 내부에 줄기세포가 봉입된 세포 지지체인 것을 특징으로 한다. 상기 세포 지지체는 이식 부위로부터의 포집된 줄기 세포의 생체 내 이동이 억제되어, 연골결손부위의 줄기세포 소실 방지, 장기간 생착 생존하여 우수한 연골 분화 재생 유도된다.
본 발명에서 홍합 접착 단백질은 홍합에서 유래된 접착 단백질로, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 국제특허공개 제WO2006/107183호 또는 제WO2005/092920호에 기재된 모든 홍합 접착 단백질을 포함한다.
본 명세서에서, "홍합 접착 단백질"은 홍합, 구체적으로 홍합의 족사에서 유래하는 접착성을 갖는 단백질로, 예를 들어, 미틸러스 에둘리스(Mytilus edulis), 미틸러스 갈로프로빈시얼리스(Mytilus galloprovincialis), 미틸러스 코루스커스(Mytilus coruscus) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 홍합 (예, 족사)에서 유래한 홍합 접착 단백질 및 이의 변이체들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다. 또한, 상기 홍합 접착 단백질은 자연 유래의 것 또는 재조합적으로 합성된 것일 수 있으며, 재조합적으로 합성되는 경우, 자연 유래 단백질의 N-말단에 개시코돈에 의한 메티오닌(Met)이 추가로 포함될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 홍합 접착 단백질은 N-말단에 개시코돈에 의한 메티오닌(Met)을 추가로 포함하는 단백질도 포함하는 것으로 해석될 수 있다.
예를 들어, 상기 홍합 접착 단백질은, (1) FP(foot protein)-1 (GenBank No. Q27409 또는 Genbank No. S23760 (Q25460))에 반복적으로 나타나는 데카펩타이드 AKPSYPPTYK (서열번호 1)를 1개 이상, 2개 이상, 또는 2개 내지 20개 (예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 20개), 또는 2개 내지 10개, 예컨대, 6개 포함하는 단백질 (예컨대, 6x AKPSYPPTYK: 서열번호 2 또는 11; 이하, FP-1 변이체); (2) FP-2 (서열번호 3 또는 12); (3) FP-3 (서열번호 4 또는 13); (4) FP-4 (서열번호 5 또는 14); (5) FP-5 (서열번호 6, 7, 15, 또는 16); 및 (6) FP-6 (서열번호 8 또는 17)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나, 또는 (7) 상기 (1) 내지 (6) 중에서 선택된 2 이상이 연결된 융합 단백질을 포함할 수 있다.
상기 홍합 접착 단백질로서 사용 가능한 융합 단백질(7)은 (1) 내지 (6) 중에서 선택된 2 이상 각각 1회 이상 순서에 상관없이 연결된 형태일 수 있으며, 일 예에서, FP-1 변이체 (서열번호 2 또는 11), FP-5 (서열번호 6, 7, 15, 또는 16), 및 FP-1 변이체 (서열번호 2 또는 11)이 N-말단에서 C-말단 방향 또는 C-말단에서 N-말단 방향, 보다 예컨대, N-말단에서 C-말단 방향으로 순서대로 연결된 것일 수 있다. 상기 융합 단백질에서, N-말단에서 C-말단 방향으로, FP-1 변이체와 FP-5 사이, 및 FP-5와 FP-1 변이체 사이, 또는 이들 모두 (즉, FP-5의 N-말단과 C-말단 중 어느 하나 또는 양쪽 모두)에 기능적 펩타이드가 추가로 포함 (삽입)될 수 있다. 상기 기능적 펩타이드는 각종 효소 절단 위치, 링커 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 기능적 펩타이드가 2개 이상 포함되는 경우 (예, FP-5의 N-말단과 C-말단 모두에 포함되는 경우), 상기 2개 이상의 기능적 펩타이드는 서로 동일하거나 다를 수 있다. 예를 들어, 상기 기능적 펩타이드는 PW (Pro-Trp), GS (Gly-Ser) 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 홍합 접착 단백질로서 사용 가능한 융합 단백질은 서열번호 9, 10, 18, 또는 19의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 설명된 홍합 접착 단백질의 아미노산 서열을 아래의 표 1에 예시하였다:
[표 1]
본 발명에서 홍합 접착 단백질의 변이체(mutants)는 바람직하게는 홍합 접착 단백질의 접착력을 유지하는 전제 하에 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실말단이나 아미노말단에 추가적인 서열을 포함하거나 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명에서의 상기 홍합 접착 단백질은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 외부 유전자를 발현할 수 있는 용도로 제작된 통상의 벡터에 발현 가능하도록 삽입하여, 유전공학적인 방법으로 대량 생산할 수 있다. 상기 벡터는 단백질을 생산하기 위한 숙주세포의 종류 및 특성에 따라 적절히 선택하거나, 신규로 제작할 수 있다. 상기 벡터를 숙주세포에 형질전환하는 방법 및 형질전환체로부터 재조합 단백질을 생산하는 방법은 통상의 방법으로 용이하게 실시할 수 있다. 상기한 벡터의 선택, 제작, 형질전환 및 재조합 단백질의 발현 등의 방법은, 본원발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시할 수 있으며, 통상의 방법에서 일부의 변형도 본원발명에 포함된다.
본 발명에서 음이온성 고분자는 상기 양이온성인 홍합 접착 단백질과 결합하여 코아세르베이트를 형성할 수 있는 고분자 물질이라면 제한없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 상기 양이온성인 홍합 접착 단백질의 pI(Isoelectric point)보다 낮은 고분자, 더 바람직하게는 pI 수치가 2 내지 6인 고분자, 보다 더 바람직하게는 pI 수치가 2 내지 4인 고분자일 수 있다. 상기 pI 수치를 초과하거나 미만인 경우 코아세르베이트가 형성되기 어려우므로 상기 pI 범위내의 음이온성 고분자를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 음이온성 고분자는 예를 들면, 히알루론산(hyaluronic acid), 페레독신(ferredoxin), 폴리스티렌술폰산(poly styrene sulfonic acid), 아라비아 검(gum arabic), 젤라틴(gelatin), 알부민(albumin), 카보폴(carbopol), 고 또는 저 메톡실 펙틴(high or low methoxyl pectin), 카르복시메틸 구아검 나트륨(sodium carboxymethyl guar gum), 잔탄 검(xanthan gum), 유청 단백질(whey protein), 레구민(faba bean legumin), 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 알긴산(alginate), 캐러지넌(carrageenan), 헥사메타인산 나트륨(sodium hexametaphosphate), 카제인 나트륨(sodium casinate), 헤모글로빈(hemoglobin), 헤파린(heparin) 및 세포외 다당체 B40(exopolysaccharide B40)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 상기 음이온성 고분자의 평균 분자량은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 1kDa 내지 300kDa으로 이루어진 군에서 선택된 분자량을 가질 수 있으며 보다 바람직하게는 10kDa 내지 100kD, 더 바람직하게는 17kDa 내지 59kDa, 가장 바람직하게는 17kDa, 35kDa 또는 59kD의 분자량을 가질 수 있다. 상기 분자량을 초과하거나 미만인 경우 코아세르베이트가 형성되지 않을 수 있기 때문이다.
본 발명의 줄기세포 지지체는 목적하는 효과를 달성할 수 있는 한 1 종 이상의 생체 활성물질을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 생체 활성물질은 생체에 투여되거나 피부 표면에 도포할 경우 일정한 약리 활성을 나타내는 물질로, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 약물, 효소, 세포 및 식품첨가물로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있으며, 보다 바람직하게는 항암제, 항생제, 항염증제, 호르몬, 호르몬 길항제, 인터루킨, 인터페론, 성장 인자, 종양 괴사 인자, 엔도톡신, 림포톡시, 유로키나제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제, 프로테아제 저해제, 알킬포스포콜린, 방사선 동위원소 표지 물질, 계면활성제, 심혈관계 약물, 위장관계 약물 및 신경계 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
또한, 본 발명의 세포 지지체의 폴록사머는 0.01 내지 10%(w/w)로 혼합되어 형성될 수 있다.
상기 혼합은 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자 및 줄기세포를 동시에 혼합하는 경우를 의미하거나 보다 바람직하게는 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체와 음이온성 고분자중 어느 하나가 녹아있는 용액에 줄기세포를 혼합하고, 이후 코아세르베이트 형성을 유도하기 위해 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체와 음이온성 고분자중 나머지 하나를 추가 혼합하는 경우를 의미한다.
상술한 바와 같이 상기 홍합 접착 단백질 및 음이온성 고분자에 의해 형성된 코아세르베이트가 줄기세포 주위에 피막을 형성하도록 한다.
또한, 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체와 음이온성 고분자는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 적정 용매에 0.0001 내지 50 중량%로 혼합할 수 있다. 또한 상기 혼합시 줄기세포는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 0.01 내지 20%(w/w), 보다 더 바람직하게는 0.1 내지 2%(w/w), 가장 바람직하게는 0.7%(w/w)로 혼합하는 것이 바람직하다.
본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 상기 줄기세포 지지체를 제조하기 위한 용매의 종류, 적정 pH, 적정 온도는 코아세르베이트가 효과적으로 형성될 수 있는 공지된 조건 및 방법을 이용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "줄기세포"는, 자기복제능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다.
본 발명의 줄기세포는 목적에 따라 적절히 제한 없이 선택될 수 있으며, 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간으로부터 유래된 공지된 모든 조직, 세포 등의 성체 세포로부터 유래할 수 있으며, 예를 들어, 골수, 제대혈, 태반(또는 태반 조직세포), 지방(또는 지방조직 세포) 등으로부터 유래할 수 있다.
예컨대, 상기 줄기세포는 골수, 지방 조직, 근육 조직, ex vivo 배양된 자기조직 간엽 줄기 세포, 동종 이계 간엽 줄기 세포, 제대혈, 배 난황낭, 태반, 제대, 골막, 태아 및 사춘기 피부, 그리고 혈액으로부터 제한없이 얻어지는 줄기세포일 수 있으며, 태아 또는 출생직후 또는 성인으로부터 유래된 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 줄기세포는 목적하는 효과를 달성할 수 있는 한 줄기세포의 종류를 제한하지 않으나, 바람직하게는 상기 줄기세포는 지방 줄기 세포 (Adipose Stem Cell, ASC), 중간엽 줄기 세포(Mesenchymal Stem Cell, MSC), 골수줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포 및 유도만능줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 줄기세포일 수 있고, 가장 바람직하게는 지방 줄기 세포 (Adipose Stem Cell, ASC) 또는 중간엽 줄기 세포(Mesenchymal Stem Cell, MSC)일 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 세포 지지체를 포함하는 골 재생용 세포 치료제를 제공한다.
본 발명의 골 재생용 세포 치료제는 연골 손상 및 결손 부위를 빠르게 재생시킨다.
또한, 본 발명의 골 재생용 세포 치료제는 추가적으로 생체적합성 결합제, 항생제, 비타민, 글루코사민, 사이토카인 및 성장인자로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상을 포함할 수 있다.
상기 생체적합성 결합제는 젤라틴, 히알루론산(hyaluronic acid), 수산화인회석(hydroxyapatite), 콜라겐, 피브린, 피브리노겐, 트롬빈, 머슬(mussel) 접착 단백질, 엘라스틴, 카제인, 알부민, 케라틴, 키틴 및 키토산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 생체적합성 결합제는 전분, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락틱-[0043] 코-글리콜산, 폴리디옥사논, 폴리카프로락톤, 폴리카보네이트, 폴리옥소에스테르, 폴리아미노산, 폴리무수물, 폴리히드록시부틸레이트, 폴리히록시발리레이트, 폴리(프로필렌 글리콜-코-퓨마릭산), 티로신계-폴리카보네이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오즈, 에틸 셀룰로오즈 및 카르복시 메틸 셀룰로오즈로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 골 재생용 치료제는 골 결손 부위에 직접 주입하거나 생체주입가능한 형태의 이식재에 충진하여 주입하여 목적의 효과를 달성할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 세포 지지체를 포함하는 세포 치료제 또는 상기 세포 지지체를 포함하는 골질환의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "세포 치료제"는, 세포와 조직의 기능을 복원하기 위하여 살아 있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식, 선별하거나 여타 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등 일련의 행위를 통하여 치료, 진단, 예방 목적으로 사용되는 의약품을 말하며, 특히 "줄기세포 치료제" 배아줄기세포 치료제와 성체줄기세포 치료제로 분류할 수 있다.
상기 줄기세포 치료제는 또한 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 줄기세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 투여될 수 있으며, 이런 담체로 생리학적 식염수를 예로 들 수 있다.
본 발명의 줄기세포 치료제는 골질환들의 세포 치료에 직접적 혹은 간접적으로 적용할 수 있다.
상기 골질환은 골다공증, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환, 대사성골질환 및 뼈의 손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종일 수 있으며, 골 재생 효과가 발휘하는 한, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 코아세르베이트를 0.0001 내지 50 중량%로 포함한다. 본 발명의 조성물은 상기 유효성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수있다.
본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 코아세르베이트 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
투여량은 대상의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 약 0.1 내지 100 ㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 0.5 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명은 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 혼합되어 형성된 코아세르베이트(coacervate)에 최적 조건의 폴록사머(Poloxamer)를 첨가한 후, 세포를 접촉시켜 제조된 액상 물성을 갖는 세포 지지체를 제공하며, 목적 세포를 포집된 상태로 목적 조직에 전달 및 생착시킴으로써 목적 조직의 재생 효과를 우수하게 달성하므로, 새로운 세포 치료제 플랫폼으로 적용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 홍합 접착 단백질-기반 코아세르베이트(coacervate) 세포 지지체를 개략적으로 보여준다.
도 2a 및 2b는 본 발명의 홍합 접착 단백질 기반 코아세르베이트(coacervate)에 다양한 농도의 폴록사머 첨가시 물성 변화를 보여준다. 분말 상태의 코아세르베이트에 각각 0.5, 1, 2, 4% Poloxamer 용액을 넣어 수화시켰으므로 최종 농도는 각각 0.35, 0.7, 1.4, 2.8% 이다.
도 2c는 다양한 조건에 따른 세포 증식 및 3차원 배양 결과를 보여준다.
도 3은 본 발명의 홍합 접착 단백질-기반 코아세르베이트 세포 지지체의 세포 포집을 보여준다.
도 4는 본 발명의 홍합 접착 단백질-기반 코아세르베이트 세포 지지체의 인 비트로 실험에서의 유효성을 보여준다.
도 5a 및 5b는 본 발명의 홍합 접착 단백질-기반 코아세르베이트 세포 지지체의 인 비보 실험에서의 유효성을 보여준다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. 재조합 홍합접착 단백질의 제작
홍합 접착 단백질 fp-151(SEQ ID NO:1)을 자연에 존재하는 홍합 접착 단백질 fp-1 중에서 80번 정도 반복되는 10개의 아미노산으로 구성된 데카펩타이드(decapeptide)가 대장균에서 발현될 수 있도록 6개의 데카펩타이드로 이루어진 fp-1 변이체를 합성하고 2 개의 fp-1 변이체 사이에 Mgfp-5의 유전자(Genbank No. AAS00463 또는 AY521220)를 넣은 후, 대장균에서 생산한 것이다 (D.S. Hwang et. al., Biomaterials 28, 3560-3568, 2007).
구체적으로 fp-1 (Genbank No. Q27409 또는 S23760)의 아미노산 서열에서, AKPSYPPTYK로 이루어진 펩타이드가 6회 반복 연결된 fp-1 변이체(이하, 6xAKPSYPPTYK라 함)를 제조하고 Mgfp-5의 N-말단에 상기 6xAKPSYPPTYK을 조합하고 또한 Mgfp-5의 C-말단에 6xAKPSYPPTYK를 조합하여 fp-151을 제조하였다. 상기 홍합 접착 단백질의 구체적 제조는 국제특허공개 제WO2006/107183호 또는 제WO2005/092920호에 나타낸 바와 동일하며, 상기 특허 문헌은 전체로서 참고문헌으로 본 발명에 포함된다.
실시예 2. 홍합 접착 단백질 기반 코아세르베이트(coacervate)의 제조
본 발명자들은, 홍합 접착 단백질 기반 코아세르베이트를 활용한 생물학적 유효성을 갖는 골관절염 치료용 세포 지지체의 새로운 제형을 규명하고자 하였다(도 1).
이에, 상기 실시예 1-1에서 제조된 홍합 접착 단백질 fp-151과 음가 전해질 고분자인 히알루론산(HA)을 혼합하여 형성된 코아세르베이트에 다양한 농도의 폴록사머(Poloxamer) 188(w/w)를 첨가하여 물성 변화를 확인하였다.
구체적으로 MAP는 2.3% (w/w)농도로 DW에 용해시켰다. HA (1100 kDa)는 1% (w/w) 농도로 DW에 용해시켰다. 이후 상기 두 용액을 부피비로 1:1로 혼합한 뒤 원심분리하여 코아세르베이트를 회수하였다. 이후 회수된 코아세르베이트를 동결건조 및 동결분쇄하여 분말상태로 가공하였다. Poloxamer는 0.5, 1, 2, 4% (w/w) 농도로 PBS에 용해시켰다. 코아세르베이트(Coacervate) 건조 분말을 각 Poloxamer 용액으로 재수화 하여 Poloxamer 최종 농도가 0.35, 0.7, 1.4, 2.8% (w/w)인 코아세르베이트를 제조하고, 각진동수(Angular frequency)에 따른 점성을 측정하였다.
그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, MAP-HA Coacervate에 폴록사머(Poloxamer)를 첨가했을 때, Coacervate 내 Poloxamer 농도 증가에 따라 점도가 향상되는 반면, 기존의 고농도(20% 이상)의 Poloxamer 첨가와 같은 Hydrogel을 형성하지 않는 것을 확인하였다.
즉, 저전단에서는 액상(Loss modulus > Storage modulus)이고, Loss modulus와 Storage modulus의 수치가 역전되는 Crossover point는 Poloxamer 농도 증가에 따라 앞당겨졌다. 전반적인 물성 역시 Poloxamer 농도 증가에 따라 앞당겨졌다. 또한, 기존의 고함량 Poloxamer (20% 이상)로 만들어진 Hydrogel과는 다르게, Coacervate에 Poloxamer를 첨가한 CartiFix는 액상으로 Poloxamer와는 다른 물리적 특성을 가지고 있다.
또한, 도 2b에 나타낸 바와 같이, Poloxamer 농도 증가에 따라 저전단(0.01~1 Hz)에서 점도가 크게 향상되었고, 고 전단에서(10~100 Hz)는 점도가 감소하는 것을 확인하였다. 이를 통해, 주사 가능한 액상 성질을 유지하면서도 병변 부위에서 이탈을 막을 수 있다. 즉, Poloxamer 첨가를 통해, 병변 부위에서 형상 유지 (저전단 점도 증가)가 원활하면서도 주사성이 있는 (고전단 점도 감소) 액상체의 제작이 가능하다.
또한, 도 2c에 나타낸 바와 같이, Coacervate 단독으로는 Spheroid 생성이 되지 않았고, Poloxamer가 최종농도로 0.7% 포함될 시 Spheroid가 생성되는 것을 확인하였다. 계면활성제 첨가 시 세포 생존율이 감소하는 것을 확인하였다. 즉, Coacervate 단독으로는 세포 증식 및 3차원 배양이 어려우며, Poloxamer 혼합 시 세포 증식 및 3차원 배양이 확인되었다. 다른 계면활성제는 오히려 세포 사멸을 일으켰다.
따라서, 본 발명의 최적 조건으로 홍합 접착 단백질-기반 코아세르베이트를 제작하는 경우, 하이드로겔이 형성되지 않고 액상 상태의 물성이 유지되며, 세포 증식, 스페로이드 형성에 유리한 환경을 제공한다.
실시예 3. 홍합 접착 단백질-기반 코아세르베이트 세포 지지체의 제작 및 확인
본 발명자들은 실시예 2에서 제작된 홍합 접착 단백질 기반 코아세르베이트에 ADSc (rat) 세포를 Seeding한 후, 인큐베이션하여 세포 지지체를 얻었다. 이를 Paraffin section 후, H&E 염색하여 코아세르베이트 내에 포집된 세포의 양상을 관찰하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 종래의 코아세르베이트와는 달리 Poloxamer 0.7% (w/w)를 포함하는 코아세르베이트에서는 형성된 공극 내에 세포가 Cluster 형태로 잘 부착되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
이는, 3D 세포 배양이 가능한 액상형 지지체(Scaffold)라는 점에서 기존의 Coacervate 기반의 세포치료제와는 차별성을 갖는다.
따라서, Coacervate 와 Poloxamer 188를 함께 사용하였을 때, 공극 내에서 Cell cluster가 잘 형성됨을 입증한다.
실시예 4. 홍합 접착 단백질-기반 코아세르베이트 세포 지지체의 인 비트로 및
인 비보 실험에서 유효성 확인
본 발명자들은 본 발명의 홍합 접착 단백질 기반 코아세르베이트-세포 지지체(CartiFix)의 In vitro 상 유효성을 확인하였다.
구체적으로 코아세르베이트 건조분말에 Poloxamer 1% (w/w)이 포함된 지방줄기세포 현탁 배지를 점적하고 혼합하여 지방줄기세포가 탑재된 Poloxamer 최종 농도 0.7% (w/w)의 코아세르베이트를 제조하고, 7일 및 14일 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하였다. 연골 분화 배지는 매 이틀 당 한 번씩 교환하였다. 이후 해당 코아세르베이트를 포르말린으로 고정하고 paraffin section 한 뒤, 면역 염색하여 분석하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 세포 증식 마커인 Ki-67 염색을 실시했을 때, 푸른색으로 염색된 세포 주변으로 붉은색 염색상이 확인되었고, 이는 세포가 7일차까지 활발히 증식하고 있는 것을 의미한다. 또한, 7일차 이후, 연골의 분화를 확인하기 위한 Alcian Blue 염색을 실시했을 때, 붉은색으로 표시된 세포 주변으로 푸른색의 히알루론산이 염색된 것을 확인하였고, 이는 연골세포 분화가 이루어졌음을 의미한다.
또한, 유리 연골의 대표적 지표인 Collagen type 2를 염색한 결과, 푸른색 세포 주변으로 붉은색으로 염색된 Collagen type 2의 발현을 확인하였고, 이는 연골이 잘 형성되고 있음을 의미한다.
또한, 본 발명자들은 본 발명의 홍합 접착 단백질 기반 코아세르베이트-세포 지지체(CartiFix)의 In vivo 상 유효성을 확인하였다.
구체적으로 연골 결손 및 미세천공술 효과를 내기 위해 Rat의 대퇴연골 활차구에 직경 2 mm, 깊이 2 mm의 결손을 만들고 출혈을 확인하였다. 이후 연골 결손부에 아무것도 처리하지 않은 군 (대조군 1), 연골분화줄기세포 이식 후 Fibrin sealant로 고정한 군 (대조군 2), 연골분화줄기세포 이식 후 CartiFix로 고정한 군 (실험군 1), CartiFix 도포 군 (실험군 2)으로 총 4개 군을 처리하였다.
그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, Rat 모델에 미세천공술을 시술하고 처리했을 때, 아무 처리하지 않은 군 (대조군 1)에서는 육안상 섬유화된 연골이 관측된 반면, 기존의 세포치료제와 같은 방법으로 Fibrin 및 Cell을 도포한 처리군 (대조군 2) 및 본 발명의 CartiFix 처리군 (실험군 1, 2)에서는 육안상 연골 재생이 잘 관찰되었다. 또한, 조직 분석을 위해, Safranin O 염색을 수행한 결과, 12주차에서 대조군 1에서는 재생 연골이 완전히 섬유화 되었으며, 대조군 2 에서도 대부분이 섬유화되었다. CartiFix + cell 군에서는 재생연골이 잘 유지되고 있었으며, CartiFix 단독 도포 군에서도 연골의 섬유화는 거의 관측되지 않았다.
또한, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 재생 연골의 Collagen을 면역학적 방법을 통해 분석한 결과, 대조군 1, 2에서는 Collagen Type II 발현이 적고, Type I이 많이 발현된 것에 비해 실험군인 CartiFix + cell 및 CartiFix 군에서는 Collagen Type II이 잘 발현되었다. 이는 재생된 연골이 정상 연골에 가까운 것을 의미한다.
종래 방법에서는, 고분자량의 HA 사용으로 인해 MAP-HA 코아세르베이트의 점도가 증가할수록 세포 생존이 어려웠다. 즉, 고점도 액상체로 인한 Cell membrane의 shear stress를 줄이기 위해 최적 조건의 Poloxamer을 첨가한 본 발명은 상술한 문제점을 개선한 것으로, 상기 Poloxamer을 첨가하여 고점도 액상 상태의 물성을 갖게 된 본 발명의 홍합 접착 단백질-기반 코아세르베이트 세포 지지체를 생체 내에 전달 및 이식하면, 연골결손부위의 이식된 세포의 손실을 방지하고, 장기간 생착 및 생존하여 연골 분화 및 재생을 효과적으로 유도할 수 있음을 입증하였다.
따라서, 본 발명에 따른 홍합 접착 단백질-기반 코아세르베이트 세포 지지체는 손상된 골 조직 재생을 위한 세포치료제 또는 주사제로서 뿐만 아니라 골 재생을 위한 조직공학용 복합 지지체로서 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (11)

  1. 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 혼합되어 형성된 코아세르베이트(coacervate)에 폴록사머(Poloxamer)를 첨가한 후, 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 지지체의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 홍합 접착 단백질은 미틸러스 에둘리스(Mytilus edulis), 미틸러스 갈로프로빈시얼리스(Mytilus galloprovincialis), 또는 미틸러스 코루스커스(Mytilus coruscus)의 족사 단백질 (foot protein; fp)인 것인, 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 홍합 접착 단백질은,
    (1) 데카펩타이드 AKPSYPPTYK를 2개 내지 10개 포함하는 단백질;
    (2) FP-2;
    (3) FP-3;
    (4) FP-4;
    (5) FP-5; 및
    (6) FP-6
    으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나, 또는
    (7) 상기 (1) 내지 (6) 중에서 선택된 2 이상이 연결된 융합 단백질
    을 포함하는 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 음이온성 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid), 페레독신(ferredoxin), 폴리스티렌술폰산(poly styrene sulfonic acid), 아라비아 검(gum arabic), 젤라틴(gelatin), 알부민(albumin), 카보폴(carbopol), 고 또는 저 메톡실 펙틴(high or low methoxyl pectin), 카르복시메틸 구아검 나트륨(sodium carboxymethyl guar gum), 잔탄 검(xanthan gum), 유청 단백질(whey protein), 레구민(faba bean legumin), 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 알긴산(alginate), 캐러지넌(carrageenan), 헥사메타인산 나트륨(sodium hexametaphosphate), 카제인 나트륨(sodium casinate), 헤모글로빈(hemoglobin), 헤파린(heparin) 및 세포외 다당체 B40(exopolysaccharide B40)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상인 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 세포는 지방 줄기 세포 (Adipose Stem Cell, ASC), 중간엽 줄기 세포(Mesenchymal Stem Cell, MSC), 골수줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포 및 유도만능줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 줄기세포인 것인, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 폴록사머(Poloxamer)는 0.01 내지 10%(w/w) 농도인 것인, 방법.
  7. 제1항의 방법에 따라 제조된 세포 지지체.
  8. 제7항의 세포 지지체를 포함하는 골 재생용 세포 치료제.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 골 재생용 치료제는 골 결손 부위에 직접 주입하거나 생체주입가능한 형태의 이식재에 충진하여 주입할 수 있는 것인, 골 재생용 세포 치료제.
  10. 제7항의 세포 지지체를 포함하는 골질환의 치료용 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 골질환은 뼈의 손상, 골결손 질환, 골다공증, 골관절염, 류미티스 관절염, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환 및 대사성 골질환으로 이루어진 그룹에서 선택되는 1 종 이상인 것인, 조성물.
KR1020230137918A 2022-10-14 2023-10-16 홍합 접착 단백질-기반 세포 지지체의 제조 방법 및 이의 용도 KR20240054188A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020220132618 2022-10-14
KR20220132618 2022-10-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20240054188A true KR20240054188A (ko) 2024-04-25

Family

ID=90885190

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020230137918A KR20240054188A (ko) 2022-10-14 2023-10-16 홍합 접착 단백질-기반 세포 지지체의 제조 방법 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20240054188A (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ruvinov et al. Alginate biomaterial for the treatment of myocardial infarction: progress, translational strategies, and clinical outlook: from ocean algae to patient bedside
JP5496675B2 (ja) 細胞移植療法に用いられる心疾患治療薬
KR100880622B1 (ko) 연골 및 다른 조직의 복구 및 재생용 조성물 및 방법
US20070116680A1 (en) Stem cells within gel microenvironments
JP5903068B2 (ja) 心組織の保護および再生のための組成物および方法
KR101889697B1 (ko) 근섬유 단편을 사용한 근조직 재생
El Blidi et al. Extraction methods, characterization and biomedical applications of collagen: A review
RU2491076C2 (ru) Способ и композиция для регенерации тканей с помощью стволовых или костномозговых клеток
WO2010039823A2 (en) Compositions and methods for tissue repair with extracellular matrices
Yan et al. Advances in the application of supramolecular hydrogels for stem cell delivery and cartilage tissue engineering
TW201117841A (en) Pharmaceutical composition for improving myocardial infarction
US20200291077A1 (en) Porous microspheres including mussel adhesive protein, and method for manufacturing same
JP2012526155A (ja) イガイ接着蛋白質またはその変異体に陰イオン性高分子が含まれたコアセルベート
KR102005737B1 (ko) 신규한 3d 바이오 프린팅용 바이오 잉크 및 이의 이용
WO2011142425A1 (ja) 上皮層含有組織の再生材および再生評価方法
US9248164B2 (en) Growth factor anchoring type bone graft material, method for producing growth factor anchoring type bone graft material, kit for producing growth factor anchoring type bone graft material, and method for forming bone
Joshi et al. Nanofibers based tissue engineering and drug delivery approaches for myocardial regeneration
Portillo Esquivel et al. Application of cell, tissue, and biomaterial delivery in cardiac regenerative therapy
KR102194155B1 (ko) 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질을 포함하는 온도 감응성 생체 소재
Mu et al. Biomaterials‐based cell therapy for myocardial tissue regeneration
KR20240054188A (ko) 홍합 접착 단백질-기반 세포 지지체의 제조 방법 및 이의 용도
US20190307688A1 (en) Novel stem cell carrier and method for preparing the same
KR102475487B1 (ko) 심장 이식용 시트 및 이의 제조방법
US20170252411A1 (en) Compositions Derived from Platelet Lysates and Uses in Vascularization
KR102090958B1 (ko) 말미잘 유래 실크 단백질 기반의 3d 바이오 프린팅용 바이오 잉크 및 이의 용도