KR20240052771A - Lymphocyte potency assay - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 림프구, 예컨대, 종양 침윤 림프구의 항종양 효력을 측정하는 데 유용한 방법 및 물질을 제공한다.The present disclosure provides methods and materials useful for measuring the antitumor potency of lymphocytes, such as tumor infiltrating lymphocytes.
Description
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본 출원은 미국 가출원 제63/241,768호(출원일: 2021년 9월 8일), 미국 가출원 제63/291,655호(출원일: 2021년 12월 20일) 및 미국 가출원 제63/391,118호(출원일: 2021년 7월 21일)의 35 U.S.C. § 119(e) 하의 이익을 주장하며, 이들 각각은 이들의 전문이 본 명세서에 원용된다.This application is filed under U.S. Provisional Application No. 63/241,768 (filing date: September 8, 2021), U.S. Provisional Application No. 63/291,655 (filing date: December 20, 2021), and U.S. Provisional Application No. 63/391,118 (filing date: 2021) 35 U.S.C. (July 21, 2011). § 119(e), each of which is incorporated herein in its entirety.
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기술분야 Technology field
본 개시내용은 림프구, 예컨대, 종양 침윤 림프구의 항종양 효력(antitumor potency)을 평가하는 데 유용한 방법 및 조성물에 관한 것이다.The present disclosure relates to methods and compositions useful for assessing the antitumor potency of lymphocytes, such as tumor infiltrating lymphocytes.
림프구는 면역계에 필수적인 백혈구이다. 종양 침윤 림프구(TIL)는 혈류를 떠나 종양을 향해 이동하는, T 세포 및 B 세포를 포함하는 백혈구이다. 종양에서 림프구의 존재는 종종 더 양호한 임상 결과와 관련이 있으며, 실제로 림프구, 예컨대, TIL은 종양 세포의 사멸에 연루되어 있다. 림프구는 특정 유형의 암을 치료하기 위한 입양 세포 요법(ACT)으로 일상적으로 사용된다. 예를 들어, TIL의 입양 전달은 특히 예후가 좋지 않은 환자에서 부피가 크고 난치성인 암의 치료에 대한 강력한 접근법이다. ACT에서, 세포는 생체외에서 확장되며 환자에게 다시 주입되기 전에 효력을 특징규명해야 한다.Lymphocytes are white blood cells essential to the immune system. Tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) are white blood cells, including T cells and B cells, that leave the bloodstream and migrate toward the tumor. The presence of lymphocytes in tumors is often associated with better clinical outcome, and indeed lymphocytes, such as TILs, have been implicated in the killing of tumor cells. Lymphocytes are routinely used in adoptive cell therapy (ACT) to treat certain types of cancer. For example, adoptive transfer of TILs is a powerful approach for the treatment of bulky and refractory cancers, especially in patients with poor prognosis. In ACT, cells are expanded ex vivo and their potency must be characterized before being reinjected into the patient.
특히 TIL과 관련된 직접적 또는 간접적인 생물학적 활성을 측정하는 TIL 효력 검정은 환자 간 TIL/종양 특이성의 광범위한 이질성을 고려할 때 TIL을 사용하는 ACT에 특히 중요하다. 또한, 미국 식품의약국(FDA)에서는 ACT에 사용할 수 있는 개별 TIL 제품의 품질을 보장하기 위해 TIL 효력 검정을 요구한다.In particular, TIL potency assays that measure direct or indirect biological activity associated with TILs are particularly important for ACT using TILs, given the wide heterogeneity of TIL/tumor specificity between patients. Additionally, the U.S. Food and Drug Administration (FDA) requires TIL potency testing to ensure the quality of individual TIL products for use in ACT.
중요한 것은, 모든 TIL 효력 검정이 검정의 생물학적 맥락 또는 검정 종점에 의해 생물학적으로 관련이 있는 것으로 간주되는 것은 아니라는 것이다. 규제 지침이 증가함에 따라 TIL 효력 검정 판독값은 임상적 효력으로 전환하기 위해 생체내 기능(예를 들어, 종양 인식 및 세포 사멸)과 상호 연관되어야 한다. 검정은 비세포 기반 TIL 자극 접근법을 사용할 수 있고 세포독성을 대신하는 T 세포 특성을 기반으로 할 수 있지만(예를 들어, TIL 효력 평가를 위해 인터페론 감마(IFN-γ) 방출 검정 사용), TIL의 종양 세포 매개 활성화에 기초한 시험관내 TIL 효력 검정은 TIL 효력을 정확하게 표현하며, 세포독성 또는 IFN-γ 방출을 포함한 대용 평가변수가 사용되는 경우 현장에서 임상 효능과의 상관관계가 가장 분명한 것으로 간주된다(예를 들어, 문헌[de Wolf et al. Cytotherapy 2018 May;20(5):601-622] 참조). 이러한 생물학적으로 관련된 TIL 효력 검정은 현재 현장에서 제한적이다.Importantly, not all TIL potency assays are considered biologically relevant by virtue of the assay's biological context or assay endpoints. With increasing regulatory guidance, TIL potency assay readouts must be correlated with in vivo function (e.g., tumor recognition and cell killing) to translate into clinical potency. Assays can use non-cell-based TIL stimulation approaches and can be based on T cell properties instead of cytotoxicity (e.g., using an interferon gamma (IFN-γ) release assay to assess TIL potency), but the In vitro TIL potency assays based on tumor cell-mediated activation are considered to accurately represent TIL potency and have the clearest correlation with clinical efficacy in the field when surrogate endpoints including cytotoxicity or IFN-γ release are used ( See, for example, de Wolf et al. Cytotherapy 2018 May;20(5):601-622. Such biologically relevant TIL potency assays are currently limited in the field.
본 개시내용은 임상적으로 관련된 항종양 반응을 생성하는 림프구의 능력을 평가하는 데 사용될 수 있는 TIL 효력 검정(본 명세서에서는 TIL 항종양 효력 검정으로도 지칭됨)과 같은 림프구 효력 검정을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 T 세포를 활성화하는 분자(예를 들어, T 세포 항원에 결합하는 분자)와 같이 림프구를 활성화하는 분자를 포함하는 불멸화 세포(예를 들어, 종양 세포)를 제공한다. 종양 세포와 같은 불멸화 세포와 림프구 사이의 이러한 상호작용은 예를 들어, 암에 대한 항종양 요법으로서 림프구의 효력을 평가하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 검정 이전에, 대부분의 림프구(예를 들어, TIL) 효력 검정은 림프구 활성의 척도로서 비세포 기반 림프구 활성화 및 사이토카인(예를 들어, IFN-γ) 방출 검정을 기반으로 하였으며 단지 세포용해 기능을 조사하기 위한 생리학적으로 무관한 자극인 것으로 간주될 수 있다.The present disclosure provides lymphocyte potency assays, such as the TIL potency assay (also referred to herein as the TIL antitumor potency assay), that can be used to assess the ability of lymphocytes to generate clinically relevant anti-tumor responses. In some embodiments, the present disclosure provides immortalized cells (e.g., tumor cells) comprising molecules that activate lymphocytes, such as molecules that activate T cells (e.g., molecules that bind T cell antigens). do. This interaction between lymphocytes and immortalized cells, such as tumor cells, can be used, for example, to evaluate the potency of lymphocytes as anti-tumor therapy for cancer. Prior to the assays described herein, most lymphocyte (e.g., TIL) potency assays were based on non-cell-based lymphocyte activation and cytokine (e.g., IFN-γ) release assays as measures of lymphocyte activity and only It can be considered a physiologically irrelevant stimulus for investigating cytolytic function.
본 개시내용은 예를 들어, 막 연관 항-CD3(OKT3) 항체를 발현하도록 조작된, 인간 흑색종 A375 세포와 같은 종양 세포가 TIL 항종양 기능을 활성화하는 데 사용될 수 있음을 나타내는 데이터를 제공한다. OKT3는 이의 가용성 형태 또는 비드에 결합되어 자성 비드에 테더링된 림프구를 활성화하는 데 사용되는 활성화 항체이다. 예기치 않게, TIL에 대한 막 연관 결합 도메인의 친화성을 감소시키는 OKT3 항체에 돌연변이를 혼입함으로써 TIL에 대한 A375-pKSQ367 세포의 친화성을 감소시키는 과정은 예를 들어, 3차원 시험관내 종양 스페로이드 기능 검정에서 TIL 효력을 평가하기 위한 검정의 유용성을 개선시키는 역할을 한다.The present disclosure provides data showing that tumor cells, e.g., human melanoma A375 cells, engineered to express membrane-associated anti-CD3 (OKT3) antibodies can be used to activate TIL anti-tumor function. . OKT3 is an activating antibody used in its soluble form or bound to beads to activate lymphocytes tethered to magnetic beads. Unexpectedly, the process of reducing the affinity of A375-pKSQ367 cells for TILs by incorporating a mutation in the OKT3 antibody that reduces the affinity of the membrane-associated binding domain for TILs resulted in, for example, three-dimensional in vitro tumor spheroid function. It serves to improve the usefulness of the assay for evaluating TIL efficacy.
본 개시내용은 또한 일부 실시형태에서 2차원 단층 세포 배양물이 림프구의 항종양 활성을 평가하는 데 더 적합한 반면, 일부 실시형태에서는 3차원 다층 스페로이드 배양물이 상이한 림프구 집단, 예컨대, 편집된 TIL 대 비편집된 TIL의 기능적 특성을 평가하는 데 더 적합하다는 것을 나타내는 데이터를 제공한다. 본 명세서에 기재된 스페로이드 설정을 통해 세포 독성, 사이토카인 생산, 증식 및 표현형 변화를 포함하여 TIL 기능/생물학의 여러 양상을 식별하고 평가할 수 있다. 표적 측면에서, 스페로이드 차원은 더 높은 수준의 세포-세포 접촉 및 생체내에서 발생하는 것과 더 가까운 상호 작용을 제공한다. 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 본 명세서에 제공된 효력 검정은 형태학적 특성뿐만 아니라 다른 세포 특성의 변화를 비교하고 대조하는 우아하고 복잡한 세포 미세환경을 제공한다.The present disclosure also provides that, in some embodiments, two-dimensional monolayer cell cultures are more suitable for assessing the antitumor activity of lymphocytes, while in some embodiments three-dimensional multilayer spheroid cultures are suitable for evaluating different lymphocyte populations, such as edited TILs. Provides data indicating that TILs are more suitable for assessing functional properties of versus unedited TILs. The spheroid setup described herein allows the identification and assessment of several aspects of TIL function/biology, including cytotoxicity, cytokine production, proliferation, and phenotypic changes. On the targeting side, the spheroid dimension provides higher levels of cell-cell contact and interactions closer to those that occur in vivo. Without wishing to be bound by theory, the potency assays provided herein provide an elegant and complex cellular microenvironment to compare and contrast changes in morphological properties as well as other cellular properties.
본 개시내용의 양상은 림프구(예를 들어, T 세포)의 효력을 평가하는 방법을 제공하며, 이 방법은 림프구(예를 들어, T 세포) 및 불멸화 세포를 공배양하는 단계로서, 불멸화 세포는 림프구(예를 들어, T 세포)를 활성화하는 분자를 포함하는, 단계 및 림프구의 효력을 평가하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 림프구는 조작되지 않는다(예를 들어, 비자연 발생 게놈 변형을 포함하지 않음).Aspects of the disclosure provide a method of assessing the potency of a lymphocyte (e.g., a T cell), comprising co-culturing a lymphocyte (e.g., a T cell) and an immortalized cell, wherein the immortalized cell comprising a molecule that activates lymphocytes (e.g., T cells) and assessing the potency of the lymphocytes. In some embodiments, the lymphocytes are not engineered (e.g., do not contain non-naturally occurring genomic modifications).
본 개시내용의 다른 양상은 TIL의 효력을 평가하는 방법을 제공하며, 이 방법은 TIL 및 조작된 종양 세포를 공배양하는 단계로서, 조작된 종양 세포는 T 세포를 활성화하는 분자를 포함하는, 단계 및 TIL의 효력을 평가하는 단계를 포함한다.Another aspect of the disclosure provides a method of assessing the potency of a TIL, comprising co-culturing a TIL and an engineered tumor cell, the engineered tumor cell comprising a molecule that activates a T cell. and evaluating the effectiveness of the TIL.
본 개시내용의 또 다른 양상은 다클론성 T 세포의 효력을 평가하는 방법을 제공하며, 다클론성 T 세포 및 불멸화 세포를 공배양하는 단계로서, 불멸화 세포는 T 세포를 활성화하는 분자를 포함하는, 단계 및 다클론성 T 세포의 효력을 평가하는 단계를 포함한다.Another aspect of the disclosure provides a method of assessing the potency of polyclonal T cells, comprising co-culturing a polyclonal T cell and an immortalized cell, wherein the immortalized cell comprises a molecule that activates the T cell. , and evaluating the potency of polyclonal T cells.
일부 실시형태에서, 분자는 T 세포 항원에 결합한다. 일부 실시형태에서, TIL은 T 세포 항원을 발현한다. 일부 실시형태에서, 다클론성 T 세포는 T 세포 항원을 발현한다. 일부 실시형태에서, T 세포 항원은 CD3 항원이다. 일부 실시형태에서, 불멸화 세포는 분자를 발현한다.In some embodiments, the molecule binds a T cell antigen. In some embodiments, the TIL expresses a T cell antigen. In some embodiments, the polyclonal T cells express a T cell antigen. In some embodiments, the T cell antigen is CD3 antigen. In some embodiments, the immortalized cell expresses the molecule.
일부 실시형태에서, 분자는 항체 또는 항체 단편이다. 예를 들어, 항체 단편은 단일 쇄 가변 단편(scFv), F(ab')2 단편, Fab 단편, Fab' 단편 및 Fv 단편으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 단편은 scFv이다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항체 단편은 각각 OKT3 항체 또는 OKT3 항체 단편이다. 일부 실시형태에서, OKT3 항체 단편은 막 결합된 OKT3(mOKT3) scFv이다. 예를 들어, mOKT3 scFv는 저친화성 mOKT3 scFv 변이체일 수 있다.In some embodiments, the molecule is an antibody or antibody fragment. For example, the antibody fragment can be selected from single chain variable fragment (scFv), F(ab')2 fragment, Fab fragment, Fab' fragment and Fv fragment. In some embodiments, the antibody fragment is an scFv. In some embodiments, the antibody or antibody fragment is an OKT3 antibody or OKT3 antibody fragment, respectively. In some embodiments, the OKT3 antibody fragment is membrane bound OKT3 (mOKT3) scFv. For example, mOKT3 scFv may be a low affinity mOKT3 scFv variant.
일부 실시형태에서, 분자는 mOKT3 scFv의 해리 상수(KD)보다 더 낮은 KD로 CD3에 결합하되, mOKT3 scFv의 KD는 약 5×10-10M이다. 일부 실시형태에서, 저친화성 mOKT3 scFv 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열에 비해서 R55 및 Y57 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 저친화성 mOKT3 scFv 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열에 비해서 R55M 및 Y57A 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 저친화성 mOKT3 scFv 변이체는 mOKT3 scFv의 해리 상수 KD보다 적어도 250배 더 낮은 KD로 CD3에 결합한다. 일부 실시형태에서, 저친화성 mOKT3 scFv 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열에 비해서 R55L 및 Y57T 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 저친화성 mOKT3 scFv 변이체는 mOKT3 scFv의 해리 상수 KD보다 적어도 1000배 더 낮은 KD로 CD3에 결합한다.In some embodiments, the molecule binds CD3 with a KD that is lower than the dissociation constant (KD) of mOKT3 scFv, where the KD of mOKT3 scFv is about 5×10 -10 M. In some embodiments, the low affinity mOKT3 scFv variant comprises an amino acid sequence with R55 and Y57 mutations relative to the amino acid sequence of SEQ ID NO:2. In some embodiments, the low affinity mOKT3 scFv variant comprises an amino acid sequence with the R55M and Y57A mutations relative to the amino acid sequence of SEQ ID NO:2. In some embodiments, the low affinity mOKT3 scFv variant binds CD3 with a KD that is at least 250-fold lower than the dissociation constant KD of the mOKT3 scFv. In some embodiments, the low affinity mOKT3 scFv variant comprises an amino acid sequence with the R55L and Y57T mutations relative to the amino acid sequence of SEQ ID NO:2. In some embodiments, the low affinity mOKT3 scFv variant binds CD3 with a KD that is at least 1000-fold lower than the dissociation constant KD of the mOKT3 scFv.
일부 실시형태에서, 분자는 피토헤마글루티닌(PHA) 및 콘카나발린 A(ConA)로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 분자는 박테리아 슈퍼항원, 예를 들어, 스타필로코커스 엔테로톡신 B(staphylococcal enterotoxin B: SEB)이다. 일부 실시형태에서, 분자는 막 테더링된 분자이다.In some embodiments, the molecule is selected from phytohemagglutinin (PHA) and concanavalin A (ConA). In some embodiments, the molecule is a bacterial superantigen, such as staphylococcal enterotoxin B (SEB). In some embodiments, the molecule is a membrane tethered molecule.
일부 실시형태에서, TIL은 조작된 TIL(eTIL)이다. 일부 실시형태에서, eTIL은 편집된 eTIL이다. 일부 실시형태에서, 편집된 eTIL은 게놈 변형을 포함한다.In some embodiments, the TIL is an engineered TIL (eTIL). In some embodiments, the eTIL is an edited eTIL. In some embodiments, the edited eTIL includes genomic modifications.
일부 실시형태에서, 다클론성 T 세포는 신생항원-특이적 T 세포를 포함한다.In some embodiments, polyclonal T cells include neoantigen-specific T cells.
일부 실시형태에서, 다클론성 T 세포는 말초 혈액으로부터 유래한다.In some embodiments, polyclonal T cells are derived from peripheral blood.
일부 실시형태에서, 다클론성 T 세포는 골수로부터 유래한다.In some embodiments, polyclonal T cells are derived from bone marrow.
일부 실시형태에서, 불멸화 세포는 불멸화 세포의 틀론성 집단을 포함한다. 일부 실시형태에서, 불멸화 세포는 불멸화 인간 세포이다. 일부 실시형태에서, 불멸화 세포는 조작된(예를 들어, 인간) 암 세포이다. 일부 실시형태에서, 조작된 암 세포는 조작된 흑색종 세포, 조작된 결장직장암 세포, 조작된 담관암 세포 및 조작된 유방암 세포로부터 선택된다.In some embodiments, the immortalized cells comprise a genetic population of immortalized cells. In some embodiments, the immortalized cells are immortalized human cells. In some embodiments, the immortalized cells are engineered (e.g., human) cancer cells. In some embodiments, the engineered cancer cells are selected from engineered melanoma cells, engineered colorectal cancer cells, engineered cholangiocarcinoma cells, and engineered breast cancer cells.
일부 실시형태에서, 공배양은 적어도 4시간(예를 들어, 약 4 내지 6, 약 4 내지 8, 약 4 내지 12시간, 약 4 내지 18시간 또는 약 4 내지 24시간) 동안이다. 일부 실시형태에서, 공배양은 적어도 12시간 동안이다. 일부 실시형태에서, 공배양은 적어도 24시간, 적어도 48시간 또는 적어도 72시간 동안이다. 일부 실시형태에서, 공배양은 약 1일, 약 1 내지 3일, 약 1 내지 4일, 약 1 내지 5일, 약 1 내지 6일 또는 약 1 내지 7일 동안이다.In some embodiments, the co-culture is for at least 4 hours (e.g., about 4 to 6, about 4 to 8, about 4 to 12 hours, about 4 to 18 hours, or about 4 to 24 hours). In some embodiments, the co-culture is for at least 12 hours. In some embodiments, the co-culture is for at least 24 hours, at least 48 hours, or at least 72 hours. In some embodiments, the co-culture is for about 1 day, about 1 to 3 days, about 1 to 4 days, about 1 to 5 days, about 1 to 6 days, or about 1 to 7 days.
일부 실시형태에서, 효력의 평가는 효과기 사이토카인, 예컨대, IFN-γ의 방출 또는 CD107a의 발현을 포함하는, 종양에 대한 TIL 반응성의 대용 마커를 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효력의 평가는 불멸화 세포의 성장을 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효력의 평가는 불멸화 세포의 세포 사멸 및/또는 생존성을 측정하는 것을 포함한다.In some embodiments, assessment of efficacy includes measuring surrogate markers of TIL reactivity to the tumor, including release of effector cytokines such as IFN-γ or expression of CD107a. In some embodiments, assessing efficacy includes measuring growth of immortalized cells. In some embodiments, assessing efficacy includes measuring cell death and/or viability of the immortalized cells.
일부 실시형태에서, 측정은 세포 생존성 검정을 수행하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 측정은 세포 세포독성 검정을 수행하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 측정은 실시간 세포 생존성 검정, ATP 세포 생존성 검정, 생세포 프로테아제 생존성 검정(live cell protease viability assay), 테트라졸륨 환원 세포 생존성 검정, 레자주린 환원 세포 생존성 검정, 사멸 세포 프로테아제 방출 세포독성 검정(dead-cell protease release cytotoxicity assay), 락테이트 데하이드로게나제 방출 세포독성 검정 및 DNA 염료 세포독성 검정으로부터 선택된 검정을 수행하는 것을 포함한다.In some embodiments, the measurement includes performing a cell viability assay. In some embodiments, the measurement includes performing a cell cytotoxicity assay. In some embodiments, the measurement is a real-time cell viability assay, ATP cell viability assay, live cell protease viability assay, tetrazolium reduced cell viability assay, resazurin reduced cell viability assay, apoptotic cell viability assay. and performing an assay selected from a dead-cell protease release cytotoxicity assay, a lactate dehydrogenase release cytotoxicity assay, and a DNA dye cytotoxicity assay.
본 개시내용의 추가 양상은 종양 침윤 림프구(TIL)의 효력을 평가하는 방법을 제공하며, 이 방법은 TIL 및 조작된 암 세포의 클론성 집단을 공배양하는 단계로서, 조작된 암 세포는 항-CD3 항체 또는 항-CD3 항체 단편을 발현하는, 단계 및 조작된 암 세포의 사멸 및/또는 생존성을 평가하는 단계를 포함한다.A further aspect of the disclosure provides a method of assessing the potency of tumor infiltrating lymphocytes (TILs), comprising co-culturing a clonal population of TILs and engineered cancer cells, wherein the engineered cancer cells are anti- expressing a CD3 antibody or anti-CD3 antibody fragment and assessing killing and/or viability of the engineered cancer cells.
일부 실시형태에서, TIL은 CD3 항원을 발현한다.In some embodiments, the TIL expresses CD3 antigen.
본 개시내용의 추가의 다른 양상은 다클론성 T 세포의 효력을 평가하는 방법을 제공하며, 이 방법은 다클론성 T 세포 및 조작된 암 세포의 클론성 집단을 공배양하는 단계로서, 조작된 암 세포는 항-CD3 항체 또는 항-CD3 항체 단편을 발현하는, 단계 및 조작된 암 세포의 사멸 및/또는 생존성을 평가하는 단계를 포함한다.Still another aspect of the disclosure provides a method of assessing the potency of polyclonal T cells, comprising co-culturing a clonal population of polyclonal T cells and engineered cancer cells, comprising: cancer cells expressing an anti-CD3 antibody or anti-CD3 antibody fragment, and assessing death and/or viability of the engineered cancer cells.
일부 실시형태에서, 다클론성 T 세포는 CD3 항원을 발현한다.In some embodiments, the polyclonal T cells express CD3 antigen.
일부 실시형태에서, 조작된 암 세포는 항-CD3 항체 단편을 발현한다. 예를 들어, 항-CD3 항체 단편은 항-CD3 단일 쇄 가변 단편(scFv)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 scFv는 mOKT3 scFv이다. 일부 실시형태에서, mOKT3 scFv는 저친화성 mOKT3 scFv 변이체이다.In some embodiments, the engineered cancer cells express anti-CD3 antibody fragments. For example, the anti-CD3 antibody fragment may be an anti-CD3 single chain variable fragment (scFv). In some embodiments, the anti-CD3 scFv is mOKT3 scFv. In some embodiments, the mOKT3 scFv is a low affinity mOKT3 scFv variant.
일부 실시형태에서, 저친화성 mOKT3 scFv 변이체는 mOKT3 scFv의 해리 상수(KD)보다 더 낮은 KD로 CD3에 결합하되, mOKT3 scFv의 KD는 약 5×10-10M이다. 일부 실시형태에서, 저친화성 mOKT3 scFv 변이체는 mOKT3 scFv의 해리 상수 KD보다 적어도 1000배 더 낮은 KD로 CD3에 결합한다. 일부 실시형태에서, 저친화성 mOKT3 scFv 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열에 비해서 R55L 및 Y57T 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.In some embodiments, the low affinity mOKT3 scFv variant binds CD3 with a lower KD than the dissociation constant (KD) of mOKT3 scFv, wherein the KD of mOKT3 scFv is about 5×10 -10 M. In some embodiments, the low affinity mOKT3 scFv variant binds CD3 with a KD that is at least 1000-fold lower than the dissociation constant KD of the mOKT3 scFv. In some embodiments, the low affinity mOKT3 scFv variant comprises an amino acid sequence with the R55L and Y57T mutations relative to the amino acid sequence of SEQ ID NO:2.
일부 실시형태에서, 항-CD3 항체 또는 항-CD3 항체 단편은 각각 막-테터링된 항-CD3 항체 또는 막 테더링된 항-CD3 항체 단편이다.In some embodiments, the anti-CD3 antibody or anti-CD3 antibody fragment is a membrane-tethered anti-CD3 antibody or a membrane tethered anti-CD3 antibody fragment, respectively.
일부 실시형태에서, TIL은 조작된 TIL(eTIL)이다. 일부 실시형태에서, eTIL은 편집된 eTIL이다. 일부 실시형태에서, 편집된 eTIL은 게놈 변형을 포함한다.In some embodiments, the TIL is an engineered TIL (eTIL). In some embodiments, the eTIL is an edited eTIL. In some embodiments, the edited eTIL includes genomic modifications.
일부 실시형태에서, 조작된 암 세포는 조작된 흑색종 세포, 조작된 결장직장암 세포, 조작된 담관암 세포 및 조작된 유방암 세포로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 조작된 암 세포는 조작된 흑색종 세포이다.In some embodiments, the engineered cancer cells are selected from engineered melanoma cells, engineered colorectal cancer cells, engineered cholangiocarcinoma cells, and engineered breast cancer cells. In some embodiments, the engineered cancer cells are engineered melanoma cells.
일부 실시형태에서, 공배양은 적어도 24시간, 예를 들어, 약 24 내지 72시간 동안이다.In some embodiments, the co-culture is for at least 24 hours, such as about 24 to 72 hours.
일부 실시형태에서, 측정은 실시간 세포 생존성 검정, ATP 세포 생존성 검정, 생세포 프로테아제 생존성 검정, 테트라졸륨 환원 세포 생존성 검정, 레자주린 환원 세포 생존성 검정, 사멸 세포 프로테아제 방출 세포독성 검정, 락테이트 데하이드로게나제 방출 세포독성 검정 및 DNA 염료 세포독성 검정으로부터 선택된 검정을 수행하는 것을 포함한다.In some embodiments, the measurement is a real-time cell viability assay, ATP cell viability assay, live cell protease viability assay, tetrazolium reduced cell viability assay, resazurin reduced cell viability assay, dead cell protease release cytotoxicity assay, rock and performing an assay selected from a tate dehydrogenase release cytotoxicity assay and a DNA dye cytotoxicity assay.
본 개시내용의 추가 양상은 TIL의 효력을 평가하는 방법을 제공하며, 이 방법은 TIL, 불멸화 세포 및 T 세포를 활성화하고 불멸화 세포에 결합하는 이중특이적 분자를 공배양하는 단계 및 TIL의 효력을 평가하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, TIL은 CD3 항원을 발현한다. 일부 실시형태에서, 이중특이적 분자는 CD3에 결합하는 분자를 포함한다.A further aspect of the disclosure provides a method of assessing the potency of a TIL, comprising co-culturing a TIL, an immortalized cell, and a bispecific molecule that activates the T cell and binds to the immortalized cell, and determining the potency of the TIL. Includes an evaluation step. In some embodiments, the TIL expresses CD3 antigen. In some embodiments, the bispecific molecule includes a molecule that binds CD3.
일부 실시형태에서, TIL은 조작된 TIL(eTIL)이다. 일부 실시형태에서, eTIL은 편집된 eTIL이다. 일부 실시형태에서, 편집된 eTIL은 게놈 변형을 포함한다.In some embodiments, the TIL is an engineered TIL (eTIL). In some embodiments, the eTIL is an edited eTIL. In some embodiments, the edited eTIL includes genomic modifications.
본 개시내용의 다른 양상은 다클론성 T 세포의 효력을 평가하는 방법을 제공하며, 이 방법은 다클론성 T 세포, 불멸화 세포 및 T 세포를 활성화하고 불멸화 세포에 결합하는 이중특이적 분자를 공배양하는 단계 및 다클론성 T 세포의 효력을 평가하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 다클론성 T 세포는 CD3 항원을 발현한다. 일부 실시형태에서, 이중특이적 분자는 CD3에 결합하는 분자를 포함한다.Another aspect of the disclosure provides a method of assessing the potency of polyclonal T cells, comprising co-producing polyclonal T cells, immortalized cells, and a bispecific molecule that activates the T cells and binds to the immortalized cells. It includes steps of culturing and evaluating the potency of polyclonal T cells. In some embodiments, the polyclonal T cells express CD3 antigen. In some embodiments, the bispecific molecule includes a molecule that binds CD3.
일부 실시형태에서, 불멸화 세포는 불멸화 세포의 틀론성 집단을 포함한다. 일부 실시형태에서, 불멸화 세포는 인간 세포이다. 일부 실시형태에서, 불멸화 세포는 (예를 들어, 인간) 암 세포이다. 일부 실시형태에서, 암 세포는 흑색종 세포, 결장직장암 세포, 담관암 세포 및 유방암 세포로부터 선택된다.In some embodiments, the immortalized cells comprise a genetic population of immortalized cells. In some embodiments, the immortalized cells are human cells. In some embodiments, the immortalized cells are (e.g., human) cancer cells. In some embodiments, the cancer cells are selected from melanoma cells, colorectal cancer cells, cholangiocarcinoma cells, and breast cancer cells.
일부 실시형태에서, 이중특이적 분자는 CD19에 결합하는 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중특이적 분자는 CD3에 결합하는 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중특이적 분자는 CD19 및 CD3에 결합하는 분자를 포함한다.In some embodiments, the bispecific molecule includes a molecule that binds CD19. In some embodiments, the bispecific molecule includes a molecule that binds CD3. In some embodiments, the bispecific molecule includes a molecule that binds CD19 and CD3.
일부 실시형태에서, 이중특이적 분자는 CD19-CD3 BiTE®이다.In some embodiments, the bispecific molecule is CD19-CD3 BiTE®.
일부 실시형태에서, 공배양은 적어도 24시간, 예를 들어, 약 24 내지 72시간 동안이다.In some embodiments, the co-culture is for at least 24 hours, such as about 24 to 72 hours.
일부 실시형태에서, 측정은 세포 생존성 검정을 수행하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 측정은 세포 독성 검정을 수행하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 측정은 실시간 세포 생존성 검정, ATP 세포 생존성 검정, 프로테아제 생존성 검정, 테트라졸륨 환원 세포 생존성 검정, 레자주린 환원 세포 생존성 검정, 사멸 세포 프로테아제 방출 세포독성 검정, 락테이트 데하이드로게나제 방출 세포독성 검정 및 DNA 염료 세포독성 검정으로부터 선택된 검정을 수행하는 것을 포함한다.In some embodiments, the measurement includes performing a cell viability assay. In some embodiments, the measurement includes performing a cytotoxicity assay. In some embodiments, the measurement is a real-time cell viability assay, ATP cell viability assay, protease viability assay, tetrazolium reduced cell viability assay, resazurin reduced cell viability assay, dead cell protease release cytotoxicity assay, lactate and performing an assay selected from a dehydrogenase release cytotoxicity assay and a DNA dye cytotoxicity assay.
본 개시내용의 상기 및 다른 특징 및 이점은 첨부된 도면과 함께 예시적인 실시형태의 하기 상세한 설명으로부터 보다 완전하게 이해될 것이다.
도 1은 mOKT3을 암호화하는 pKSQ366 또는 pKSQ367 렌티바이러스 0㎕, 25㎕, 50㎕, 100㎕, 200㎕, 400㎕ 또는 800㎕가 형질도입된 A375 세포가 인간 Pan-CD3+ T 세포와 밤새 공배양된 것을 도시한 도면. 다음날, CD69 활성화를 유세포 분석법을 통해 평가하였다. 다양한 양의 pKSQ366 바이러스가 형질도입된 A375 세포는 25㎕의 바이러스를 제외하고 유사한 수준의 CD69 활성화를 유도하는 것을 발견하였다. pKSQ367이 형질도입된 A375 세포는 약간 더 높은 수준의 CD69 활성화를 유도하였고, 다양한 양의 바이러스의 사용에도 유사한 수준의 활성화가 발견되었다.
도 2는 A375-pKSQ367 및 형질도입되지 않은 세포를 염소-항-마우스 항체로 염색하여 mOKT3 표면 발현을 확인한 것을 도시한 도면. 99.2%의 A375-pKSQ367가 mOKT3을 발현함을 발견하였다.
도 3A 내지 도 3C는 다양한 효과기 세포 대 표적 세포 비율(E:T)에서 3일 동안 A375-pKSQ367과 공배양된 프리(pre)-REP TIL을 도시한 도면. D2777에서 10:1을 제외하고 프리-REP TIL에 의한 A375의 사멸은 관찰되지 않았다. 증가된 TIL 인식 및 A375-pKSQ367의 후속 사멸이 모든 E:T에서 관찰된다.
도 4는 다양한 막 앵커, 신호 펩타이드 및 scFv 링커를 갖는 작제물이 모두 T 세포의 강력한 활성화를 생성한다는 것을 도시한 도면. 제시된 작제물을 갖는 K562 세포를 pan T 세포와 공배양하였다. 24시간 후, CD8 및 CD69 표면 발현에 대해 T 세포를 염색하고 유세포 분석법으로 측정하였다. CD69 발현은 K562 세포의 원형질막에 테더링하는 데 사용된 앵커에 관계없이 mOKT3을 발현하는 K562 세포와 공배양한 후 높았다.
도 5는 고친화성 A375 pKSQ367이 이것이 유래된 A375 모 세포주와 비교하여 mOKT3 마커의 높은 발현을 나타낸다는 것을 도시한 도면.
도 6은 저친화성 세포주 A375 pKSQ397이 높은 mOKT3 마커 발현을 나타냄을 도시한 도면. 형질도입에 사용되는 바이러스의 부피를 늘려도 이들 세포 표면의 mOKT3 발현은 증가하지 않는다.
도 7은 저친화성 세포주 A375 pKSQ398이 중간 수준의 mOKT3 마커 발현을 나타낸다는 것을 도시한 도면. 형질도입에 사용되는 바이러스의 부피를 늘려도 이들 세포 표면의 mOKT3 발현은 증가하지 않는다.
도 8은 A375 pKSQ367 표적 세포와의 공배양 후 pan T 세포가 세포 표면에서 CD69의 증가된 발현을 나타냄을 도시한 도면. 이는 표적 세포(A375 pSKQ367)의 인식 및 pan T 세포의 활성화를 나타낸다. 대조적으로, pan T 세포는 A375 모세포와의 공배양 후 CD69 발현이 거의 나타나지 않는다. 이는 인식이 부족하여 pan T 세포의 활성화가 증가하지 않음을 나타낸다. 대조군으로서 단독으로 배양된 pan T 세포는 기본 CD69 발현이 부족함을 나타낸다.
도 9는 A375 pKSQ396 표적 세포와의 공배양 후 pan T 세포가 세포 표면에서 CD69의 발현을 거의 나타내지 않음을 도시한 도면. 이러한 발현 수준은 A375 모세포와 공배양된 pan T 세포와 대등하다(도 8). 이는 pan T 세포에 의한 표적 세포 인식이 부족하여 활성화가 증가하지 않음을 나타낸다.
도 10은 A375 pKSQ397 표적 세포와의 공배양 후 pan T 세포가 세포 표면에서 CD69의 발현을 나타냄을 도시한 도면. 이러한 발현 수준은 표적 세포(A375 pSKQ397)의 인식 및 pan T 세포의 활성화를 나타낸다. 더 많은 부피의 바이러스가 형질도입된 표적 세포는 pan T 세포의 활성화를 약간 증가시키는 능력을 갖는 것으로 보인다.
도 11은 A375 pKSQ398 표적 세포와의 공배양 후 pan T 세포가 세포 표면에서 CD69의 발현을 나타냄을 도시한 도면. 이러한 발현 수준은 표적 세포(A375 pSKQ398)의 인식 및 pan T 세포의 활성화를 나타낸다. 더 많은 부피의 바이러스가 형질도입된 표적 세포는 pan T 세포의 활성화를 약간 증가시키는 능력을 갖는 것으로 보인다.
도 12는 A375 모 세포를 TIL 공여자 3239로부터의 유전자 표적-편집 TIL(EP 없음, OLFR, SOCS1, CBLB)과 단층으로 공배양한 것을 도시한 도면. mOKT3 표면 발현의 부족으로 인해 표적 A375 세포 성장의 감소 또는 차이가 없음이 관찰되었다.
도 13은 A375 pKSQ367 세포를 TIL 공여자 3239로부터의 유전자 표적-편집 TIL(EP 없음, OLFR, SOCS1, CBLB)과 단층으로 공배양한 것을 도시한 도면. 이전에 관찰된 높은 수준의 mOKT3 표면 발현으로 인해, 표적 A375 pKSQ367 세포 성장의 상당한 감소가 나타났다.
도 14는 A375 pKSQ398 세포를 TIL 공여자 3239로부터의 유전자 표적-편집 TIL(EP 없음, OLFR, SOCS1, CBLB)과 단층으로 공배양한 것을 도시한 도면. pKSQ398은 pKSQ367에 비해서 CD3에 대해서 낮은 친화성을 갖기 때문에, 표적 A375 pKSQ398 세포의 TIL-사멸의 동역학에서 감소가 나타났다. 모든 군은 세포주에 대해 유사한 활성을 갖는데, 이는 OKT3 친화성이 낮으면 TIL이 표적을 사멸시키기 어렵게 된다는 것을 시사한다.
도 15는 10,000개의 A375-pKSQ367 또는 A375-pKSQ398을 초저부착 플레이트에 플레이팅하고 10일에 걸쳐 영상화하여 스페로이드 형태를 관찰한 것을 도시한 도면.
도 16은 10,000개의 A375-pKSQ367 또는 A375-pKSQ398을 초저부착 플레이트에 플레이팅한 것을 도시한 도면. 전기천공되지 않은(EP 없음) 및 SOCS1 편집 TIL을 4일 후에 다양한 E:T 비율로 첨가하였다. 영상화를 스페로이드 형성 및 공배양 기간 동안 지속적으로 수행하였다. 이러한 영상을 A375-pKSQ367의 경우 36시간 후에, A375-pKSQ398의 경우 72시간 후에 수집하였다.
도 17은 10,000개의 A375-pKSQ367 또는 A375-pKSQ398을 초저부착 플레이트에 플레이팅한 것을 도시한 도면. 전기천공되지 않은(EP 없음) 및 SOCS1 편집 TIL을 4일 후에 다양한 E:T 비율로 첨가하였다. 영상화를 스페로이드 형성 및 공배양 기간 동안 지속적으로 수행하였다. 이러한 영상을 72시간의 공배양 후에 수집하였다.
도 18은 10,000개의 A375-pKSQ367을 초저부착 플레이트에 플레이팅한 것을 도시한 도면. 전기천공되지 않은(EP 없음) 및 SOCS1 편집 TIL을 4일 후에 다양한 E:T 비율로 첨가하였다. 영상화를 스페로이드 형성 및 공배양 기간 동안 지속적으로 수행하였다. 이러한 영상을 5일의 공배양 후에 수집하였다.
도 19는 5,000개 또는 10,000개의 A375-pKSQ398을 초저부착 플레이트에 플레이팅한 것을 도시한 도면. 전기천공되지 않은(EP 없음) 및 SOCS1 편집 TIL을 4일 후에 다양한 E:T 비율로 첨가하였다. 영상화를 스페로이드 형성 및 공배양 기간 동안 지속적으로 수행하였다. 이러한 영상을 5일의 공배양 후에 수집하였다.
도 20은 상이한 효과기:표적(E:T) 비율에서 72시간에 걸쳐 A375-OKT3lt 스페로이드에 대한 SOCS1 편집 TIL 및 대조군 미편집 TIL의 세포독성을 도시한 도면. 단층 배양에서, SOCS1 편집 세포는 A375-pKSQA367 및 A375-pKSQ368 세포 둘 다의 사멸에 있어서 편집되지 않은 세포와 다르지 않았다(도 13 및 도 14). 3D 스페로이드 설정에서, SOCS1 편집 세포는 대조군에 비해 향상된 세포 독성을 나타내었다. 이는 스페로이드 설정에서 검정의 민감도가 다르다는 것을 시사한다.
도 21은 상이한 효과기:표적(E:T) 비율에서 24시간에 A375-OKT3lt 스페로이드에 대한 SOCS1 편집 TIL 및 대조군 미편집 TIL에 의해서 생산된 IFNγ를 도시한 도면.
도 22는 상이한 효과기:표적(E:T) 비율에서 24시간에 A375-OKT3lt 스페로이드에 대한 SOCS1 편집 TIL 및 대조군 미편집 TIL에 의해서 생산된 IL-6을 도시한 도면.
도 23은 24시간 TIL-스페로이드 공배양 후 상청액에서 검출된 발광 수준을 도시한 도면.
도 24는 24시간 TIL-스페로이드 공배양 후 상청액에서 계산된 LDH 수준을 도시한 도면.These and other features and advantages of the present disclosure will be more fully understood from the following detailed description of exemplary embodiments taken in conjunction with the accompanying drawings.
Figure 1 shows A375 cells transduced with 0 μl, 25 μl, 50 μl, 100 μl, 200 μl, 400 μl, or 800 μl of pKSQ366 or pKSQ367 lentivirus encoding mOKT3, co-cultured with human Pan-CD3 + T cells overnight. A drawing showing what has been done. The next day, CD69 activation was assessed by flow cytometry. A375 cells transduced with various amounts of pKSQ366 virus were found to induce similar levels of CD69 activation, except for 25 μl of virus. A375 cells transduced with pKSQ367 induced slightly higher levels of CD69 activation, and similar levels of activation were found using various amounts of virus.
Figure 2 shows mOKT3 surface expression confirmed by staining A375-pKSQ367 and non-transduced cells with a goat-anti-mouse antibody. We found that 99.2% of A375-pKSQ367 expressed mOKT3.
Figures 3A - 3C depict pre-REP TILs co-cultured with A375-pKSQ367 for 3 days at various effector to target cell ratios (E:T). No killing of A375 by pre-REP TILs was observed except at 10:1 in D2777. Increased TIL recognition and subsequent killing of A375-pKSQ367 are observed in all E:T.
Figure 4 shows that constructs with various membrane anchors, signal peptides and scFv linkers all produce robust activation of T cells. K562 cells with the indicated constructs were co-cultured with pan T cells. After 24 hours, T cells were stained for CD8 and CD69 surface expression and measured by flow cytometry. CD69 expression was high after coculture with K562 cells expressing mOKT3, regardless of the anchor used to tether to the plasma membrane of K562 cells.
Figure 5 shows that high affinity A375 pKSQ367 shows high expression of the mOKT3 marker compared to the A375 parental cell line from which it is derived.
Figure 6 shows that low-affinity cell line A375 pKSQ397 shows high mOKT3 marker expression. Increasing the volume of virus used for transduction did not increase mOKT3 expression on the surface of these cells.
Figure 7 shows that low affinity cell line A375 pKSQ398 shows intermediate level of mOKT3 marker expression. Increasing the volume of virus used for transduction did not increase mOKT3 expression on the surface of these cells.
Figure 8 shows that pan T cells show increased expression of CD69 on the cell surface after co-culture with A375 pKSQ367 target cells. This indicates recognition of target cells (A375 pSKQ367) and activation of pan T cells. In contrast, pan T cells show little CD69 expression after coculture with A375 blast cells. This indicates that activation of pan T cells does not increase due to lack of recognition. As a control, pan T cells cultured alone show a lack of basal CD69 expression.
Figure 9 shows that pan T cells show little expression of CD69 on the cell surface after co-culture with A375 pKSQ396 target cells. This expression level is comparable to pan T cells cocultured with A375 parental cells ( Fig. 8 ). This indicates that there is no increase in activation due to lack of target cell recognition by pan T cells.
Figure 10 is a diagram showing the expression of CD69 on the cell surface of pan T cells after co-culture with A375 pKSQ397 target cells. This expression level indicates recognition of target cells (A375 pSKQ397) and activation of pan T cells. Target cells transduced with larger volumes of virus appear to have the ability to slightly increase the activation of pan T cells.
Figure 11 is a diagram showing the expression of CD69 on the cell surface of pan T cells after co-culture with A375 pKSQ398 target cells. This expression level indicates recognition of target cells (A375 pSKQ398) and activation of pan T cells. Target cells transduced with larger volumes of virus appear to have the ability to slightly increase the activation of pan T cells.
Figure 12 depicts monolayer co-culture of A375 parental cells with gene target-edited TILs (no EP, OLFR , SOCS1 , CBLB ) from TIL donor 3239. A reduction or no difference in target A375 cell growth was observed due to lack of mOKT3 surface expression.
Figure 13 shows monolayer co-culture of A375 pKSQ367 cells with gene target-edited TILs (no EP, OLFR , SOCS1 , CBLB ) from TIL donor 3239. Due to the previously observed high levels of mOKT3 surface expression, a significant reduction in target A375 pKSQ367 cell growth was observed.
Figure 14 shows monolayer co-culture of A375 pKSQ398 cells with gene target-edited TIL (no EP, OLFR , SOCS1 , CBLB ) from TIL donor 3239. Because pKSQ398 has a lower affinity for CD3 compared to pKSQ367, there was a decrease in the kinetics of TIL-kill of target A375 pKSQ398 cells. All groups have similar activity against cell lines, suggesting that low OKT3 affinity makes it difficult for TILs to kill their targets.
Figure 15 is a diagram showing spheroid morphology observed by plating 10,000 A375-pKSQ367 or A375-pKSQ398 on an ultra-low attachment plate and imaging over 10 days.
Figure 16 shows 10,000 A375-pKSQ367 or A375-pKSQ398 plated on an ultra-low adhesion plate. Non-electroporated (no EP) and SOCS1 edited TILs were added at various E:T ratios after 4 days. Imaging was performed continuously throughout the spheroid formation and co-culture period. These images were collected after 36 hours for A375-pKSQ367 and after 72 hours for A375-pKSQ398.
Figure 17 shows 10,000 A375-pKSQ367 or A375-pKSQ398 plated on an ultra-low adhesion plate. Non-electroporated (no EP) and SOCS1 edited TILs were added at various E:T ratios after 4 days. Imaging was performed continuously throughout the spheroid formation and co-culture period. These images were collected after 72 hours of co-culture.
Figure 18 is a diagram showing 10,000 A375-pKSQ367 plated on an ultra-low adhesion plate. Non-electroporated (no EP) and SOCS1 edited TILs were added at various E:T ratios after 4 days. Imaging was performed continuously throughout the spheroid formation and co-culture period. These images were collected after 5 days of co-culture.
Figure 19 is a diagram showing 5,000 or 10,000 A375-pKSQ398 plated on an ultra-low adhesion plate. Non-electroporated (no EP) and SOCS1 edited TILs were added at various E:T ratios after 4 days. Imaging was performed continuously during spheroid formation and co-culture. These images were collected after 5 days of co-culture.
Figure 20 depicts the cytotoxicity of SOCS1 edited TILs and control unedited TILs on A375-OKT3lt spheroids over 72 hours at different effector:target (E:T) ratios. In monolayer cultures, SOCS1 edited cells did not differ from unedited cells in the killing of both A375-pKSQA367 and A375-pKSQ368 cells ( Figures 13 and 14 ). In a 3D spheroid setting, SOCS1 edited cells showed enhanced cytotoxicity compared to controls. This suggests that the sensitivity of the assay is different in the spheroid setting.
Figure 21 depicts the IFNγ produced by SOCS1 edited TILs and control unedited TILs on A375-OKT3lt spheroids at different effector:target (E:T) ratios at 24 hours.
Figure 22 depicts IL-6 produced by SOCS1 edited TIL and control unedited TIL on A375-OKT3lt spheroids at different effector:target (E:T) ratios at 24 hours.
Figure 23 shows the level of luminescence detected in the supernatant after 24 hours of TIL-spheroid co-culture.
Figure 24 shows LDH levels calculated in the supernatant after 24 hours of TIL-spheroid co-culture.
본 개시내용은 일부 양상에서 종양 침윤 림프구(TIL)의 항종양 효력을 측정하는 데 유용한 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 이들 방법은 예를 들어, TIL 및 불멸화 세포를 공배양하는 단계 및 TIL, 불멸화 세포 및 이중특이적 분자를 공배양하는 것을 포함하는 접근법을 사용하여 TIL 효력을 평가하는 단계를 포함한다.The present disclosure provides, in some aspects, methods and compositions useful for measuring the antitumor potency of tumor infiltrating lymphocytes (TILs). In some embodiments, these methods include, for example, co-culturing a TIL and an immortalized cell and assessing TIL potency using an approach comprising co-culturing a TIL, an immortalized cell, and a bispecific molecule. do.
현재 T 세포 기능 모니터링에 사용되는 많은 TIL 효력 검정은 사이토카인(예를 들어, IFN-γ 또는 IL-2) 방출 검정의 사용에 중점을 둔다. 예를 들어, T 세포 활성화는 항-CD3/항-CD28 항체 코팅 비드를 비롯한 비세포 기반 T 세포 활성화 시약과의 짧은 공배양 기간 후 IFN-γ 분비를 측정하여 결정할 수 있다. IFN-γ와 같은 사이토카인은 표적 세포에서 MHC I 및 Fas 발현을 향상시키기 때문에 사이토카인 분비는 CD8+ T 세포의 세포용해 활성과 상관관계가 있다. 예를 들어, 인터페론 감마(IFN-γ) 방출이 TCR 자극 시 50pg/㎖ 초과, 100pg/㎖ 초과, 150pg/㎖ 초과 또는 200pg/㎖ 초과인 경우 TIL이 강력한 것으로 간주될 수 있다.Many TIL potency assays currently used to monitor T cell function focus on the use of cytokine (e.g., IFN-γ or IL-2) release assays. For example, T cell activation can be determined by measuring IFN-γ secretion after a brief co-culture period with non-cell based T cell activation reagents, including anti-CD3/anti-CD28 antibody coated beads. Because cytokines such as IFN-γ enhance MHC I and Fas expression on target cells, cytokine secretion is correlated with cytolytic activity of CD8 + T cells. For example, a TIL may be considered potent if interferon gamma (IFN-γ) release is greater than 50 pg/ml, greater than 100 pg/ml, greater than 150 pg/ml, or greater than 200 pg/ml upon TCR stimulation.
그러나 TIL이 적어도 표적 세포와 상호작용할 수 있어야 하고 그랜자임 B 및 퍼포린을 함유한 세포용해 과립의 탈과립과 같은 사멸 유도를 위한 매개체를 생산/방출할 수 있어야 하는 표적 종양 세포에 의한 활성화 및 이의 직접적인 사멸은 비세포 기반 TIL 활성화 방법에 의해 유도되는 현재 이용 가능한 사이토카인 방출 검정에서는 측정되지 않는 임상 효능의 동일하게 중요한 지표이다. 본 명세서에서 제공되는 TIL 효력 검정은 보다 생리학적으로 관련된 TIL/종양 세포 공배양 설정에서 표적 세포(예를 들어, 불멸화 세포, 예컨대, 암 세포)의 세포 사멸 및/또는 생존성 또는 CD107a와 같은 탈과립화의 대용 마커의 측정 또는 IFN-γ, IL-6, IL_2 및 TNFα와 같은 효과기 사이토카인/케모카인(예를 들어, 전염증성 사이토카인/케모카인)의 생산을 직접 측정할 수 있는 기회를 제공하는 관련 종양 세포 기반 상호작용을 통해 TIL을 활성화하여 기존 TIL 효력 검정(예를 들어, 사이토카인 방출 검정)을 개선한다.However, their direct activation by target tumor cells requires that TILs must be able to at least interact with the target cells and produce/release mediators for inducing death, such as degranulation of cytolytic granules containing granzyme B and perforin. Killing is an equally important indicator of clinical efficacy that is not measured in currently available cytokine release assays induced by non-cell-based TIL activation methods. TIL potency assays provided herein may be used to determine apoptosis and/or viability or degranulation, such as CD107a, of target cells (e.g., immortalized cells, e.g., cancer cells) in a more physiologically relevant TIL/tumor cell co-culture setting. Measurement of surrogate markers of inflammation or the opportunity to directly measure the production of effector cytokines/chemokines (e.g., pro-inflammatory cytokines/chemokines) such as IFN-γ, IL-6, IL_2, and TNFα. Activating TILs through tumor cell-based interactions improves existing TIL potency assays (e.g., cytokine release assays).
"TIL 효력 검정"은 TIL의 항종양 활성(예를 들어, 사이토카인 생산, TIL 탈과립화, 종양 성장 저해)을 특징규명, 예를 들어, 정량화하는 데 사용되는 검정을 지칭한다. TIL 효력 검정은 TIL의 급속한 확장 전 및/또는 후에 그리고 입양 세포 요법(ACT)과 같은 임상 사용 적용 전에 TIL 항종양 활성을 평가하는 데 사용될 수 있다.“TIL potency assay” refers to an assay used to characterize, e.g., quantify, the antitumor activity of TILs (e.g., cytokine production, TIL degranulation, tumor growth inhibition). TIL potency assays can be used to assess TIL antitumor activity before and/or after rapid expansion of TILs and prior to application for clinical use, such as adoptive cell therapy (ACT).
종양 침윤 림프구Tumor infiltrating lymphocytes
조작된 TIL 및/또는 편집된 TIL을 포함하는 종양 침윤 림프구(TIL)는 이의 항종양 활성(예를 들어, 종양 세포 성장의 저해)의 효력을 기초로 특징규명될 수 있다.Engineered TILs and/or tumor infiltrating lymphocytes (TILs) comprising edited TILs can be characterized based on the potency of their antitumor activity (e.g., inhibition of tumor cell growth).
어구 "종양 침윤 림프구" 또는 "TIL"은 대상체의 혈류를 떠나 종양으로 이동한 림프구 집단을 지칭한다. TIL은 CD8+ 세포독성 T 세포, CD4+ T 세포, 예컨대, Th1 및 Th17 CD4+ T 세포, 자연 살해 T 세포, 및 자연 살해(NK) 세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. TIL은 1차 및 2차 TIL 둘 다를 포함한다. "1차 TIL"은 본 명세서에 개략된 바와 같이 환자 조직 샘플로부터 얻어진 것이고(때때로 "신선하게 수거된"이라고 지칭), "2차 TIL"은 벌크 TIL 및 확장된 TIL("REP TIL" 또는 "사후-REP TIL")을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 확장되거나 증식된 임의의 TIL 세포 집단이다. 일부 실시형태에서, 1차 TIL은 환자의 말초 혈액으로부터 얻어진 종양 반응성 T 세포를 포함한다. TIL 세포 집단은 유전자 변형된 또는 달리 조작된 TIL을 포함할 수 있다. "TIL"은 또한 대상체의 혈류를 떠나 종양으로 이동한 다음 혈류로 다시 들어가기 위해 출발한 림프구의 집단을 지칭한다.The phrase “tumor infiltrating lymphocytes” or “TIL” refers to a population of lymphocytes that have left the subject's bloodstream and migrated to the tumor. TILs include, but are not limited to, CD8+ cytotoxic T cells, CD4+ T cells, such as Th1 and Th17 CD4+ T cells, natural killer T cells, and natural killer (NK) cells. TIL includes both primary and secondary TIL. “Primary TILs” are those obtained from patient tissue samples (sometimes referred to as “freshly harvested”) as outlined herein, and “secondary TILs” are bulk TILs and expanded TILs (“REP TILs” or “REP TILs”). Any expanded or proliferated TIL cell population, including but not limited to "post-REP TIL"). In some embodiments, the primary TIL comprises tumor-reactive T cells obtained from the patient's peripheral blood. The TIL cell population may include genetically modified or otherwise engineered TILs. “TIL” also refers to a population of lymphocytes that leave a subject's bloodstream, travel to a tumor, and then set out to re-enter the bloodstream.
본 명세서에 일반적으로 약술된 바와 같이, TIL은 일반적으로 환자 샘플로부터 채취되고, 환자에게 이식하기 전에 그 수를 확장하도록 조작된다. 일부 실시형태에서, TIL은 하기에 논의된 바와 같이 유전자 조작될 수 있다. 일반적으로, TIL은 초기에 환자 종양 샘플("1차 TIL")로부터 얻어진 다음, 본 명세서에 기술된 바와 같은 추가 조작을 위해 더 큰 집단으로 확장되고, 선택적으로 동결보존 및 재자극되고, 선택적으로 TIL의 표시로서 표현형 및 대사 매개변수에 대해 평가된다.As generally outlined herein, TILs are generally harvested from patient samples and manipulated to expand their numbers prior to implantation into the patient. In some embodiments, TILs may be genetically engineered as discussed below. Typically, TILs are initially obtained from patient tumor samples (“primary TILs”) and then expanded into larger populations for further manipulation as described herein, optionally cryopreserved and restimulated, and optionally As an indication of TILs, phenotypic and metabolic parameters are evaluated.
용어 "대상체"는 인간을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이러한 인간은 환자 자신의 TIL의 확장된 집단을 포함하는 면역요법을 필요로 하는 환자일 수 있다. 다른 실시형태에서, 이러한 인간은 환자 자신의 TIL의 확장된 집단을 포함하는 면역요법을 필요로 하는 또 다른 환자일 수 있다.The term “subject” refers to a human. In some embodiments, such human may be a patient in need of immunotherapy comprising an expanded population of the patient's own TILs. In another embodiment, this human may be another patient in need of immunotherapy comprising an expanded population of the patient's own TILs.
TIL은 일반적으로 세포 표면 마커를 사용하여 생화학적으로 정의되거나 종양에 침윤하여 치료에 영향을 미치는 능력에 의해 기능적으로 정의될 수 있다. TIL은 일반적으로 다음 바이오마커 중 하나 이상을 발현하는 것으로 분류될 수 있다: CD4, CD8, TCRαβ, TCRgd, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45RA, CD45RO, CD95, PD-1 및 CD25. 추가로, 대안적으로, TIL은 환자에게 재도입될 때 고형 종양을 침윤하는 능력에 의해 기능적으로 정의될 수 있다.TILs can generally be defined biochemically using cell surface markers or functionally by their ability to infiltrate tumors and influence treatment. TILs can generally be classified as expressing one or more of the following biomarkers: CD4, CD8, TCRαβ, TCRgd, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45RA, CD45RO, CD95, PD-1, and CD25. Additionally, alternatively, TILs can be functionally defined by their ability to infiltrate solid tumors when reintroduced to the patient.
통상적인 TIL 제조 공정에 의해 생체외에서 배양된 TIL을 이용하는 입양 세포 요법은 적어도 2개의 단계, 즉 사전-REP 단계에 후속하는 적어도 하나의 급속 확장 프로토콜(REP) 단계를 포함한다. 입양 세포 요법은 흑색종 환자에서 숙주 면역억제 후 성공적인 요법을 초래하였다. 현재 주입 허용 매개변수는 TIL의 구성 판독값(예를 들어, CD28, CD8 또는 CD4 양성) 및 REP 생성물의 확장 및 생존율의 수치적 배수에 의존한다.Adoptive cell therapy using TILs cultured ex vivo by conventional TIL preparation processes involves at least two steps: a pre-REP step followed by at least one rapid expansion protocol (REP) step. Adoptive cell therapy resulted in successful therapy after host immunosuppression in melanoma patients. Current injection tolerance parameters depend on the composition readout of the TIL (e.g., CD28, CD8, or CD4 positivity) and the numerical fold of the expansion and viability of the REP product.
어구 "세포의 집단" 또는 "TIL의 집단"은 공통 형질을 공유하는 다수의 세포 또는 TIL을 지칭한다. 일반적으로 집단은 일반적으로 1×106 내지 1×1010개로 다양하며, 상이한 TIL 집단은 상이한 수를 포함한다. 예를 들어, IL-2의 존재 하에서 1차 TIL의 초기 성장은 대략 1×107개 세포의 벌크 TIL의 집단을 초래할 수 있다. REP 확장은 일반적으로 주입을 위해 1.5×109 내지 1.5×1010개 세포의 집단을 제공하기 위해 수행된다. 일부 실시형태에서, 세포의 집단은 단클론성이다. 다른 실시형태에서, 세포의 집단은 다클론성이다. 일부 실시형태에서, 세포의 집단이 다클론성인 경우, 세포는 하나 이상의 일반적인 특질을 여전히 공유한다. 단클론성 T 세포 집단은 단일 TCR-유전자 재배열 패턴의 우위를 초래할 것이다. 이에 반해서, 다클론성 T 세포 집단은 다양한 TCR-유전자 재배열 패턴을 갖는데, 이는 특정 상황에서는 이들을 더 효과적이도록 만들 수 있다.The phrase “population of cells” or “population of TILs” refers to a number of cells or TILs that share common traits. In general, populations typically vary from 1×10 6 to 1×10 10 , with different TIL populations containing different numbers. For example, initial growth of primary TILs in the presence of IL-2 can result in a population of bulk TILs of approximately 1× 10 cells. REP expansion is typically performed to provide a population of 1.5×10 9 to 1.5×10 10 cells for injection. In some embodiments, the population of cells is monoclonal. In another embodiment, the population of cells is polyclonal. In some embodiments, when a population of cells is polyclonal, the cells still share one or more common traits. Monoclonal T cell populations will result in a predominance of single TCR-gene rearrangement patterns. In contrast, polyclonal T cell populations have different TCR-gene rearrangement patterns, which may make them more effective in certain situations.
일부 실시형태에서, TIL은 고친화성 T 세포 수용체(TCR), 예를 들어, 종양-연관 항원에 표적화되는 TCR, 예컨대, MAGE-1, HER2 또는 NY-ESO-1, 또는 종양-연관 세포 표면 분자(예를 들어, 메소텔린) 또는 계통-제한 세포 표면 분자(예를 들어, EGFR, CD19 또는 HER2)에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 추가 기능을 포함하도록 유전자 조작된다.In some embodiments, the TIL is a high affinity T cell receptor (TCR), e.g., a TCR targeting a tumor-associated antigen, such as MAGE-1, HER2 or NY-ESO-1, or a tumor-associated cell surface molecule. Genetically engineered to contain additional functions, including but not limited to chimeric antigen receptors (CARs) that bind to lineage-restricted cell surface molecules (e.g., mesothelin) or lineage-restricted cell surface molecules (e.g., EGFR, CD19, or HER2) do.
용어 "조작된 TIL" 또는 "eTIL"은 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 초래하는, 비-자연 수단을 통해서 달성된 하나 이상의 게놈 변형을 포함하는 TIL뿐만 아니라 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 비-자연 발생 유전자-조절 시스템을 포함하는 TIL을 포함한다. "변형되지 않은 TIL" 또는 "대조군 TIL"은, 게놈이 비자연 발생 수단을 통해서 변형되지 않았고, 비자연 발생 유전자-조절 시스템을 포함하지 않거나 대조군 유전자-조절 시스템(예를 들어, 빈 벡터 대조군, 비-표적화 gRNA, 스크램블드(scrambled) siRNA 등)을 포함하는 TIL 또는 TIL의 집단을 지칭한다. 1종 이상의 내인성 유전자의 발현 및/또는 기능이 감소된 자연 발생된 TIL은 용어 변형되지 않은 또는 대조군 TIL 하에 포함된다.The term “engineered TIL” or “eTIL” refers to one or more TILs as well as TILs comprising one or more genomic modifications achieved through non-natural means that result in reduced expression and/or function of one or more endogenous target genes. Includes TILs that contain non-naturally occurring gene-regulatory systems that can reduce the expression and/or function of endogenous target genes. “Unmodified TIL” or “control TIL” means that the genome has not been modified through non-naturally occurring means and does not contain a non-naturally occurring gene-regulatory system or a control gene-regulatory system (e.g., an empty vector control, refers to a TIL or group of TILs containing non-targeting gRNA, scrambled siRNA, etc.). Naturally occurring TILs that have reduced expression and/or function of one or more endogenous genes are included under the term unmodified or control TIL.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해서 제조된 조작된 TIL은 내인성 표적 유전자의 게놈 DNA 서열 내에 하나 이상의 변형(예를 들어, 하나 이상의 핵산의 삽입, 결실 또는 돌연변이)을 포함하여 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 초래한다. 일부 실시형태에서, 게놈 DNA 서열에서의 변형은 mRNA 전사를 감소 또는 저해하여, 암호화된 mRNA 전사체 및 단백질의 발현 수준을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 게놈 DNA 서열에서의 변형은 mRNA 번역을 감소 또는 저해하여, 암호화된 단백질의 발현 수준을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 게놈 DNA 서열에서의 변형은 내인성 단백질의 변형되지 않은(즉, 야생형) 버전(예를 들어, 하기에 기재된 음성-우세(dominant-negative) 돌연변이체)에 비해서 감소된 또는 변경된 기능을 갖는 변형된 내인성 단백질을 암호화한다.In some embodiments, engineered TILs produced by the methods described herein include one or more modifications (e.g., insertions, deletions, or mutations of one or more nucleic acids) within the genomic DNA sequence of the endogenous target gene. Resulting in reduced expression and/or function. In some embodiments, modifications in the genomic DNA sequence reduce or inhibit mRNA transcription, resulting in reduced expression levels of encoded mRNA transcripts and proteins. In some embodiments, modifications in the genomic DNA sequence reduce or inhibit mRNA translation, resulting in reduced expression levels of the encoded protein. In some embodiments, the modification in the genomic DNA sequence results in reduced or altered function compared to an unmodified (i.e., wild-type) version of the endogenous protein (e.g., a dominant-negative mutant described below). encodes a modified endogenous protein with
일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 표적 세포, 예컨대, 종양 세포 또는 항원 제시 세포(APC)에 의해서 발현되는 단백질 표적을 인식하는 조작된 항원-특이적 수용체를 추가로 포함한다. 용어 "조작된 항원 수용체"는 비자연 발생 항원-특이적 수용체, 예컨대, 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 재조합 T 세포 수용체(TCR)를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 조작된 항원 수용체는 힌지 및 막관통 도메인을 통해서 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인에 융합된 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR이다. 일부 실시형태에서, CAR 세포외 도메인은 MHC-독립적인 방식으로 표적 세포에 의해서 발현되는 항원에 결합하고, 이것은 RE 세포의 활성화 및 증식으로 이어진다. 일부 실시형태에서, CAR의 세포외 도메인은 항체 또는 이의 항원결합 단편에 융합된 태그를 인식한다. 이러한 실시형태에서, CAR의 항원-특이성은 표지된 항체의 항원-특이성에 좌우되어, 또 다른 항체를 하나의 항체로 대체함으로써 단일 CAR 작제물을 사용하여 다수의 상이한 항원을 표적화할 수 있다. 일부 실시형태에서, CAR의 세포외 도메인은 항체로부터 유래된 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 본 개시내용에 유용한 항원 결합 도메인은 예를 들어, scFv; 항체; 항체의 항원 결합 영역; 중쇄/경쇄의 가변 영역; 및 단일 쇄 항체를 포함한다.In some embodiments, the modified TIL further comprises an engineered antigen-specific receptor that recognizes a protein target expressed by a target cell, such as a tumor cell or antigen presenting cell (APC). The term “engineered antigen receptor” refers to a non-naturally occurring antigen-specific receptor, such as a chimeric antigen receptor (CAR) or recombinant T cell receptor (TCR). In some embodiments, the engineered antigen receptor is a CAR comprising an extracellular antigen binding domain fused to a cytoplasmic domain comprising a signaling domain through hinge and transmembrane domains. In some embodiments, the CAR extracellular domain binds an antigen expressed by the target cell in an MHC-independent manner, which leads to activation and proliferation of the RE cell. In some embodiments, the extracellular domain of the CAR recognizes a tag fused to an antibody or antigen-binding fragment thereof. In this embodiment, the antigen-specificity of the CAR depends on the antigen-specificity of the labeled antibody, allowing a single CAR construct to be used to target multiple different antigens by substituting one antibody for another. In some embodiments, the extracellular domain of the CAR may comprise an antigen-binding fragment derived from an antibody. Antigen binding domains useful in the present disclosure include, for example, scFv; antibodies; the antigen binding region of an antibody; Variable regions of heavy/light chains; and single chain antibodies.
일부 실시형태에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 TCR 복합체 제타 쇄(예컨대, CD3ξ 신호전달 도메인), FcγRIII, FcεRI 또는 T-림프구 활성화 도메인으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 공자극성 도메인, 예를 들어, 4-1BB, CD28, CD40, MyD88 또는 CD70 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 2개의 공자극성 도메인, 예를 들어, 4-1BB, CD28, CD40, MyD88 또는 CD70 도메인 중 임의의 2개를 추가로 포함한다. 예시적인 CAR 구조 및 세포내 신호전달 도메인은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 WO 2009/091826; US 20130287748; WO 2015/142675; WO 2014/055657; 및 WO 2015/090229 참조).In some embodiments, the intracellular signaling domain of the CAR may be derived from the TCR complex zeta chain (e.g., CD3ξ signaling domain), FcγRIII, FcεRI, or T-lymphocyte activation domain. In some embodiments, the intracellular signaling domain of the CAR further comprises a costimulatory domain, e.g., a 4-1BB, CD28, CD40, MyD88 or CD70 domain. In some embodiments, the intracellular signaling domain of the CAR further comprises any two of two costimulatory domains, e.g., 4-1BB, CD28, CD40, MyD88, or CD70 domains. Exemplary CAR structures and intracellular signaling domains are known in the art (e.g., WO 2009/091826; US 20130287748; WO 2015/142675; WO 2014/055657; and WO 2014/055657, incorporated herein by reference) 2015/090229).
다양한 종양 항원에 특이적인 CAR은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, CD171-특이적 CAR(문헌[Park et al., Mol Ther (2007) 15(4):825-833]), EGFRvIII-특이적 CAR(문헌[Morgan et al., Hum Gene Ther (2012) 23(10):1043-1053]), EGF-R-특이적 CAR(문헌[Kobold et al., J Natl Cancer Inst (2014) 107(1):364]), 탄산무수화효소 K-특이적 CAR(문헌[Lamers et al., Biochem Soc Trans (2016) 44(3):951-959]), FR-α-특이적 CAR(문헌[Kershaw et al., Clin Cancer Res (2006) 12(20):6106-6015]), HER2-특이적 CAR(문헌[Ahmed et al., J Clin Oncol (2015) 33(15)1688-1696; Nakazawa et al., Mol Ther (2011) 19(12):2133-2143; Ahmed et al., Mol Ther (2009) 17(10):1779-1787; Luo et al., Cell Res(2016) 26(7):850-853; Morgan et al., Mol Ther (2010) 18(4):843-851; Grada et al., Mol Ther Nucleic Acids (2013) 9(2):32]), CEA-특이적 CAR(문헌[Katz et al., Clin Cancer Res (2015) 21(14):3149-3159]), IL13Rα2-특이적 CAR(문헌[Brown et al., Clin Cacner Res (2015) 21(18):4062-4072]), GD2-특이적 CAR(문헌[Louis et al., Blood (2011) 118(23):6050-6056; Caruana et al., Nat Med (2015) 21(5):524-529]), ErbB2-특이적 CAR(문헌[Wilkie et al., J Clin Immunol (2012) 32(5):1059-1070]), VEGF-R-특이적 CAR(문헌[Chinnasamy et al., Cancer Res (2016) 22(2):436-447]), FAP-특이적 CAR(문헌[Wang et al., Cancer Immunol Res (2014) 2(2):154-166]), MSLN-특이적 CAR(문헌[Moon et al, Clin Cancer Res (2011) 17(14):4719-30]), NKG2D-특이적 CAR(문헌[VanSeggelen et al., Mol Ther (2015) 23(10):1600-1610]), CD19-특이적 CAR(Axicabtagene ciloleucel(Yescarta®) 및 Tisagenlecleucel(Kymriah®)이다. 또한 종양-특이적 CAR의 임상 시험의 검토에 대해서는 문헌[82/337 Li et al., J Hematol and Oncol (2018) 11(22)]을 참조하기 바란다.CARs specific for various tumor antigens are known in the art, for example, CD171-specific CAR (Park et al ., Mol Ther (2007) 15(4):825-833), EGFRvIII- Specific CAR (Morgan et al ., Hum Gene Ther (2012) 23(10):1043-1053), EGF-R-specific CAR (Kobold et al ., J Natl Cancer Inst (2014) 107(1):364]), carbonic anhydrase K-specific CAR (Lamers et al ., Biochem Soc Trans (2016) 44(3):951-959]), FR-α-specific CAR (Kershaw et al., Clin Cancer Res (2006) 12(20):6106-6015), HER2-specific CAR (Ahmed et al ., J Clin Oncol (2015) 33(15)1688- 1696; Nakazawa et al ., Mol Ther (2011) 19(12):2133-2143; Ahmed et al ., Mol Ther (2009) 17(10):1779-1787; Cell Res (2016) 26(7):850-853; Morgan et al ., Mol Ther (2010) 18(4):843-851; Grada et al ., Mol Ther Nucleic Acids (2013) 9(2):32]), CEA -specific CAR (Katz et al ., Clin Cancer Res (2015) 21(14):3149-3159), IL13Rα2-specific CAR (Brown et al ., Clin Cacner Res (2015) 21( 18):4062-4072]), GD2-specific CAR (Louis et al ., Blood (2011) 118(23):6050-6056; Caruana et al ., Nat Med (2015) 21(5): 524-529]), ErbB2-specific CAR (Wilkie et al ., J Clin Immunol (2012) 32(5):1059-1070]), VEGF-R-specific CAR (Chinnasamy et al . , Cancer Res (2016) 22(2):436-447]), FAP-specific CAR (Wang et al ., Cancer Immunol Res (2014) 2(2):154-166]), MSLN-specific enemy CAR (Moon et al , Clin Cancer Res (2011) 17(14):4719-30), NKG2D-specific CAR (VanSeggelen et al , Mol Ther (2015) 23(10):1600 -1610]), CD19-specific CARs (Axicabtagene ciloleucel (Yescarta®) and Tisagenlecleucel (Kymriah®). Please also refer to the literature [82/337 Li et al ., J Hematol and Oncol (2018) 11(22)] for a review of clinical trials of tumor-specific CAR.
본 명세서에 일반적으로 약술된 바와 같이, TIL은 일반적으로 환자 샘플로부터 채취되고, 환자에게 이식하기 전에 그 수를 확장하도록 조작된다. 일부 실시형태에서, TIL은 하기에 논의된 바와 같이 유전자 조작될 수 있다. 일반적으로, TIL은 초기에 환자 종양 샘플("1차 TIL")로부터 얻어진 다음, 추가 조작을 위해 더 큰 집단으로 확장되고, 선택적으로 동결보존 및 재자극되고, 선택적으로 TIL의 표시로서 표현형 및 대사 매개변수에 대해 평가된다.As generally outlined herein, TILs are generally harvested from patient samples and manipulated to expand their numbers prior to implantation into the patient. In some embodiments, TILs may be genetically engineered as discussed below. Typically, TILs are initially obtained from patient tumor samples (“primary TILs”) and then expanded into larger populations for further manipulation, optionally cryopreserved and restimulated, and optionally phenotypic and metabolic as an indication of the TIL. It is evaluated against parameters.
환자 종양 샘플은 일반적으로 외과적 절제술, 바늘 생검, 또는 종양 및 TIL 세포의 혼합물을 함유하는 샘플을 얻기 위한 다른 수단을 통해 당업계에 공지된 방법을 사용하여 얻어질 수 있다. 일반적으로, 종양 샘플은 원발성 종양, 침습성 종양 또는 전이를 포함하는 임의의 고형 종양에서 유래할 수 있다. 고형 종양은 방광암, 뇌암, 유방암(삼중음성유방암 포함), 자궁경부암, 결장직장암, 위암, 자궁내막암, 신장암, 입술 및 구강암, 두경부암(예를 들어, 두경부 편평세포암(HNSCC)) 교모세포종, 다형성 교모세포종, 신경모세포종, 간암, 중피종, 폐암(비소세포폐암(NSCLC) 및 소세포폐암 포함) 피부암(편평세포 암종, 기저세포 암종, 비흑색종 피부암 및 흑색종을 포함하지만 이들로 제한되지 않음), 난소암, 포도막암, 자궁암, 췌장암, 전립선암, 육종, 갑상선암을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 세포 유형일 수 있다. 일부 실시형태에서, 유용한 TIL은 악성 흑색종 종양으로부터 얻어지는데, 그 이유는 이것이 특히 높은 수준의 TIL을 갖는 것으로 보고되었기 때문이다. 원발성 폐(비소세포 폐암(NSCLC)), 방광, 자궁경부 및 흑색종 종양 또는 이의 전이를 사용하여 TIL을 얻을 수 있다.Patient tumor samples can be obtained using methods known in the art, generally through surgical resection, needle biopsy, or other means to obtain samples containing a mixture of tumor and TIL cells. In general, tumor samples can be from any solid tumor, including primary tumors, invasive tumors, or metastases. Solid tumors include bladder, brain, breast (including triple-negative breast), cervix, colorectal, stomach, endometrial, kidney, lip and oral cavity, and head and neck cancers (e.g., head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC)). blastoma, glioblastoma multiforme, neuroblastoma, liver cancer, mesothelioma, lung cancer (including non-small cell lung cancer (NSCLC) and small cell lung cancer) skin cancer (including but not limited to squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, non-melanoma skin cancer, and melanoma) (not limited to), ovarian cancer, uveal cancer, uterine cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, sarcoma, and thyroid cancer. In some embodiments, useful TILs are obtained from malignant melanoma tumors because they have been reported to have particularly high levels of TILs. TILs can be obtained using primary lung (non-small cell lung cancer (NSCLC)), bladder, cervical, and melanoma tumors or their metastases.
일단 수득되면, 종양 샘플은 일반적으로 약 1 내지 약 8㎣ 또는 약 0.5 내지 약 4㎣의 작은 조각으로 날카로운 절개를 사용하여 단편화되며, 약 2 내지 3㎣가 특히 유용하다. TIL은 효소 종양 소화물을 사용하여 이러한 단편으로부터 배양된다. 이러한 종양 소화물은 효소 배지(예를 들어, 로즈웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute: RPMI) 1640 완충액, 2mM 글루타메이트, 10μg/㎖ 겐타마이신, 30단위/㎖의 DNase 및 1.0㎎/㎖의 콜라게나아제)에서의 인큐베이션, 그 다음 기계적 해리(예를 들어, 조직 해리제 사용)에 의해 생산될 수 있다. 종양 소화물은 종양을 효소 배지에 넣고, 약 1분 동안 종양을 기계적으로 해리시킨 다음 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 작은 조직 조각만 존재할 때까지 상기 조건 하에서 기계적 해리 및 인큐베이션 주기를 반복하여 생산될 수 있다. 이 과정의 완료 시에, 세포 현탁액이 적혈구 또는 죽은 세포를 상당한 수로 함유하면, FICOLL 분지형 친수성 다당류를 사용하여 밀도 구배 분리를 수행하여 이러한 세포를 제거할 수 있다. 미국 특허 공개 제2012/0244133 A1호에 기재된 것과 같은 당업계에 공지된 대안적인 방법이 사용될 수 있으며, 이의 개시내용은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 상기 방법 중 임의의 것은 TIL을 확장하는 방법 또는 암을 치료하는 방법에 대해 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태에서 사용될 수 있다.Once obtained, the tumor sample is fragmented using sharp dissection into small pieces, typically about 1 to about 8 mm3 or about 0.5 to about 4 mm3, with about 2 to 3 mm3 being particularly useful. TILs are cultured from these fragments using enzymatic tumor digests. These tumor digests were cultured in enzyme medium (e.g., Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 buffer, 2mM glutamate, 10 μg/ml gentamicin, 30 units/ml DNase, and 1.0 mg/ml collagenase). ), followed by mechanical dissociation (e.g., using a tissue dissociator). Tumor digests were prepared by placing the tumor in enzyme medium, mechanically dissociating the tumor for approximately 1 minute, and then incubating at 37°C, 5% CO 2 for 30 minutes, followed by mechanical dissociation and incubation under these conditions until only small tissue fragments were present. It can be produced by repeating the cycle. Upon completion of this process, if the cell suspension contains significant numbers of red blood cells or dead cells, these cells can be removed by performing density gradient separation using FICOLL branched hydrophilic polysaccharide. Alternative methods known in the art may be used, such as those described in US Patent Publication No. 2012/0244133 A1, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety. Any of the above methods can be used in any of the embodiments described herein for methods of expanding TILs or methods of treating cancer.
일반적으로, 수거된 세포 현탁액은 "1차 세포 집단" 또는 "새로 수거된" 세포 집단으로 불린다. 일부 실시형태에서, 단편화는 예를 들어, 분해 및 소화를 포함하는 물리적 단편화를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단편화는 물리적 단편화이다. 일부 실시형태에서, 단편화는 절개이다. 일부 실시형태에서, 단편화는 소화에 의한 것이다. 일부 실시형태에서, TIL은 초기에 효소적 종양 소화물 및 환자로부터 얻어진 종양 단편으로부터 배양될 수 있다.Typically, the harvested cell suspension is referred to as the “primary cell population” or “freshly harvested” cell population. In some embodiments, fragmentation includes physical fragmentation, including, for example, decomposition and digestion. In some embodiments, fragmentation is physical fragmentation. In some embodiments, fragmentation is incision. In some embodiments, fragmentation is by digestion. In some embodiments, TILs may initially be cultured from enzymatic tumor digests and tumor fragments obtained from patients.
일부 실시형태에서, TIL은 종양 소화물로부터 수득된다. 일부 실시형태에서, 종양 소화물은 효소 배지, 예를 들어, 비제한적으로 RPMI 1640, 2mM GlutaMAX, 10㎎/㎖ 젠타마이신, 30U/㎖ DNase 및 1.0㎎/㎖ 콜라게나제에서의 기계적으로 해리된 종양의 인큐베이션, 그 다음 기계적 해리(GentleMACS, 밀테니이 바이오테크사, 미국 캘리포니아주 어번 소재)에 의해서 생성된다. 일부 실시형태에서, 기계적으로 해리된 종양은 대략 1㎣ 조각으로 파괴될 것이다. 종양을 효소 배지에 넣은 후, 종양을 약 1분 동안 기계적으로 해리시킬 수 있다. 그런 다음, 용액을 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 인큐베이션시킨 다음 약 1분 동안 다시 기계적으로 파괴할 수 있다. 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 다시 인큐베이션시킨 후, 종양을 약 1분 동안 세 번째로 기계적으로 파괴할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조직의 큰 조각이 존재하는 경우 세 번째 기계적 파괴 후, 5% CO2에서 37℃에서 30분의 추가 인큐베이션 유무에 관계 없이 하나 또는 두 개의 추가 기계적 해리가 샘플에 적용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 최종 인큐베이션의 완료 시에, 세포 현탁액이 적혈구 또는 죽은 세포를 상당한 수로 함유하면, FICOLL을 사용하여 밀도 구배 분리를 수행하여 이러한 세포를 제거할 수 있다.In some embodiments, TILs are obtained from tumor digests. In some embodiments, the tumor digest is a mechanically dissociated tumor in an enzyme medium, such as, but not limited to, RPMI 1640, 2mM GlutaMAX, 10 mg/ml gentamicin, 30 U/ml DNase, and 1.0 mg/ml collagenase. produced by incubation, followed by mechanical dissociation (GentleMACS, Miltenii Biotech, Auburn, CA, USA). In some embodiments, mechanically dissociated tumors will be broken into approximately 1 mm 3 pieces. After placing the tumor in enzyme medium, the tumor can be mechanically dissociated for approximately 1 minute. The solution can then be incubated at 37°C, 5% CO 2 for 30 minutes and then mechanically disrupted again for about 1 minute. After another incubation at 37°C, 5% CO 2 for 30 minutes, the tumor can be mechanically disrupted a third time for approximately 1 minute. In some embodiments, after the third mechanical disruption if large pieces of tissue are present, one or two additional mechanical dissociations may be applied to the sample with or without an additional incubation of 30 minutes at 37°C in 5% CO 2 . In some embodiments, upon completion of the final incubation, if the cell suspension contains significant numbers of red blood cells or dead cells, density gradient separation can be performed using FICOLL to remove these cells.
일부 실시형태에서, 세포는 샘플 수거 후 선택적으로 동결되거나 동결보존될 수 있고, 확장 단계로 진입하기 전에 동결 저장될 수 있다.In some embodiments, cells may optionally be frozen or cryopreserved after sample collection and stored frozen prior to entering the expansion phase.
일부 실시형태에서, TIL은 초기 종양 단편화 또는 비응집으로부터 최대 총 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 총 9 내지 25일, 9 내지 21일 또는 9 내지 14일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 9일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 10일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 11일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 12일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 13일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 14일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 15일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 16일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 17일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 18일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 19일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 20일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 21일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 22일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 23일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 24일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 25일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 26일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 27일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 28일 동안 확장된다.In some embodiments, the TILs are derived from initial tumor fragmentation or non-aggregation up to a total of 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, Extends for 26, 27 or 28 days. In some embodiments, the TIL extends for a total of 9 to 25 days, 9 to 21 days, or 9 to 14 days. In some embodiments, the TIL is extended for up to a total of 9 days. In some embodiments, the TIL extends for up to a total of 10 days. In some embodiments, the TIL extends for up to a total of 11 days. In some embodiments, the TIL extends for up to a total of 12 days. In some embodiments, the TIL extends for up to a total of 13 days. In some embodiments, the TIL is extended for up to a total of 14 days. In some embodiments, the TIL is extended for up to a total of 15 days. In some embodiments, the TIL is extended for up to a total of 16 days. In some embodiments, the TIL extends for up to a total of 17 days. In some embodiments, the TIL extends for up to a total of 18 days. In some embodiments, the TIL extends for up to a total of 19 days. In some embodiments, the TIL extends for up to a total of 20 days. In some embodiments, the TIL extends for up to a total of 21 days. In some embodiments, the TIL extends for up to a total of 22 days. In some embodiments, the TIL extends for up to a total of 23 days. In some embodiments, the TIL extends for up to a total of 24 days. In some embodiments, the TIL extends for up to a total of 25 days. In some embodiments, the TIL extends for up to a total of 26 days. In some embodiments, the TIL extends for up to a total of 27 days. In some embodiments, the TIL extends for up to a total of 28 days.
일부 실시형태에, 확장된 TIL을 본 명세서에 기재된 것을 비롯한 다수의 표현형 마커의 발현에 대해서 분석한다. 일부 실시형태에서, 마커는 하기로부터 선택된다: TCRα/β, CD57, CD28, CD4, CD27, CD56, CD8a, CD45RA, CD45RO, CD8a, CCR7, CD4, CD3, CD38 및 HLA-DR. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 조절 마커의 발현은 즉 하기의 군으로부터 측정된다: CD137, CD8a, Lag3, CD4, CD3, PD-1, TIM-3, CD69, CD8a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1 및 CD154.In some embodiments, expanded TILs are analyzed for expression of multiple phenotypic markers, including those described herein. In some embodiments, the marker is selected from: TCRα/β, CD57, CD28, CD4, CD27, CD56, CD8a, CD45RA, CD45RO, CD8a, CCR7, CD4, CD3, CD38, and HLA-DR. In some embodiments, the expression of one or more regulatory markers is measured from the following group: CD137, CD8a, Lag3, CD4, CD3, PD-1, TIM-3, CD69, CD8a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1. and CD154.
일부 실시형태에서, 기억 마커는 CCR7 또는 CD62L이다. 일부 실시형태에서, 재자극된 TIL은 사이토카인 방출 검정을 사용하여, 사이토카인 방출에 대해서 평가된다. 일부 실시형태에서, TIL은 OKT3으로의 자극 또는 자가유래 종양 소화물과의 공배양에 응답한 인터페론-감마(IFN-γ) 분비에 대해서 평가된다. 일부 실시형태에서, TIL은 OKT3으로의 자극 또는 자가유래 종양 소화물과의 공배양에 응답한 IL-6 분비에 대해서 평가된다. 측정할 수 있는 추가 효과기 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-12, IL-17, IL-18, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및 종양 괴사인자-α(TNFα)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 케모카인, 예컨대, CXCL10, CXCL13, CCL1, CCL3, CCL4, CCL5, CCL9/10, CCL17, CCL22, CCL23 및 XCL1을 또한 평가할 수 있다.In some embodiments, the memory marker is CCR7 or CD62L. In some embodiments, restimulated TILs are assessed for cytokine release using a cytokine release assay. In some embodiments, TILs are assessed for interferon-gamma (IFN-γ) secretion in response to stimulation with OKT3 or co-culture with autologous tumor digest. In some embodiments, TILs are assessed for IL-6 secretion in response to stimulation with OKT3 or co-culture with autologous tumor digest. Additional effector cytokines that can be measured include IL-1, IL-2, IL-12, IL-17, IL-18, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), and tumor necrosis factor-α (TNFα). Including but not limited to these. Chemokines such as CXCL10, CXCL13, CCL1, CCL3, CCL4, CCL5, CCL9/10, CCL17, CCL22, CCL23 and XCL1 can also be assessed.
TIL은 다양한 조절 마커, 예컨대, TCRα/β, CD56, CD27, CD28, CD57, CD45RA, CD45RO, CD25, CD127, CD95, IL-2R, CCR7, CD62L, KLRG1 및 CD122에 대해서 평가된다.TILs are assessed for various regulatory markers such as TCRα/β, CD56, CD27, CD28, CD57, CD45RA, CD45RO, CD25, CD127, CD95, IL-2R, CCR7, CD62L, KLRG1 and CD122.
불멸화 세포immortalized cells
불멸화 세포는 무한정 증식하도록 조작되어 장기간 배양될 수 있는 세포이다. 불멸화 세포주는 전형적으로 염색체 이상 또는 종양과 같이 지속적으로 분열할 수 있는 돌연변이가 있는 다양한 공급원에서 유래된다. 따라서 불멸화 세포는 "조작된" 세포로 간주된다. 불멸화 세포 집단은 이종 집단일 수 있거나 (틀론성 집단을 형성하기 위해) 단일 불멸화 클론으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 불멸화 세포는 불멸화 세포의 이종 집단을 포함한다. 일부 실시형태에서, 불멸화 세포는 불멸화 세포의 틀론성 집단을 포함한다.Immortalized cells are cells that have been engineered to proliferate indefinitely and can be cultured for long periods of time. Immortalized cell lines typically come from a variety of sources with mutations that allow them to continue dividing, such as chromosomal abnormalities or tumors. Immortalized cells are therefore considered “engineered” cells. The immortalized cell population may be a heterogeneous population or may be derived from a single immortalized clone (to form a monogenic population). In some embodiments, the immortalized cells comprise a heterogeneous population of immortalized cells. In some embodiments, the immortalized cells comprise a genetic population of immortalized cells.
불멸화 세포는 다양한 종 및/또는 기원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 불멸화 세포는 불멸화 동물 세포, 불멸화 인간 세포, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 실시형태에서, 불멸화 세포는 불멸화 인간 세포이다.Immortalized cells may be derived from a variety of species and/or origins. For example, the immortalized cells can be immortalized animal cells, immortalized human cells, or combinations thereof. In some embodiments, the immortalized cells are immortalized human cells.
일부 실시형태에서, 불멸화 세포는 암 세포이다. 예를 들어, 암 세포는 흑색종 세포, 결장직장암 세포, 담관암 세포 및 유방암 세포를 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 암 세포는 흑색종 세포, 결장직장암 세포, 담관암 세포 및 유방암 세포로부터 선택된다.In some embodiments, the immortalized cells are cancer cells. For example, cancer cells may include, but are not limited to, melanoma cells, colorectal cancer cells, cholangiocarcinoma cells, and breast cancer cells. In some embodiments, the cancer cells are selected from melanoma cells, colorectal cancer cells, cholangiocarcinoma cells, and breast cancer cells.
본 명세서에 기재된 TIL 효력 검정에 사용하기 위해 조작될 수 있는 불멸화 세포는 A375 흑색종 세포(예를 들어, ATCC® CRL-1619™), K562 다능성, 조혈 악성 세포, 1차 세포(예를 들어, ATCC® CCL-243™), 인간 배아 신장(HEK) 293T 세포(예를 들어, ATCC® CRL-1573) 및 중국 햄스터 난소(CHO) 세포(예를 들어, ATCC® CCL-61™)를 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 불멸화 세포는 A375 세포, K562 세포, 1차 세포, HEK293T 세포 및 CHO 세포로부터 선택된다. 본 명세서에 기재된 검정 및 방법에 유용한 불멸화 세포는 전술한 예에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 다른 불멸화 세포주는 당업계에 알려져 있으며 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다.Immortalized cells that can be engineered for use in the TIL potency assays described herein include A375 melanoma cells (e.g., ATCC® CRL-1619™), K562 pluripotent, hematopoietic malignant cells, primary cells (e.g. , ATCC® CCL-243™), human embryonic kidney (HEK) 293T cells (e.g., ATCC® CRL-1573), and Chinese hamster ovary (CHO) cells (e.g., ATCC® CCL-61™). You can, but are not limited to these. In some embodiments, the immortalized cells are selected from A375 cells, K562 cells, primary cells, HEK293T cells, and CHO cells. It should be understood that immortalized cells useful in the assays and methods described herein are not limited to the examples described above. Other immortalized cell lines are known in the art and can be used according to the present disclosure.
TIL이 억제 신호에 내성이 있는지 여부를 시험하기 위해서 T 세포 반응을 억제하는 면역 억제 마커, 예컨대, PD-L1, PD-L2를 발현하는 세포주의 사용도 본 명세서에서 고려된다. 일부 실시형태에서, TIL 효력 검정에 사용하기 위해 조작될 수 있는 불멸화 세포는 T 세포 반응을 억제하는 면역 억제 마커, 예컨대, PD-L1을 발현하는 세포주를 포함한다.The use of cell lines expressing immunosuppressive markers that suppress T cell responses, such as PD-L1, PD-L2, to test whether TILs are resistant to inhibitory signals is also contemplated herein. In some embodiments, immortalized cells that can be engineered for use in TIL potency assays include cell lines that express immunosuppressive markers that suppress T cell responses, such as PD-L1.
T 세포 반응을 향상시키기 위해 공자극 마커, 예컨대, CD80/86, OX40L 및/또는 41BBL을 발현하는 세포주도 TIL 효력 검정에 사용하기 위해 조작될 수 있다. 일부 실시형태에서, TIL 효력 검정을 위해 조작될 수 있는 불멸화 세포는 T 세포 반응을 향상시키기 위한 공자극 마커, 예컨대, CD80/86을 발현할 수 있는 세포주를 포함한다.Cell lines expressing costimulatory markers such as CD80/86, OX40L and/or 41BBL to enhance T cell responses can also be engineered for use in TIL potency assays. In some embodiments, immortalized cells that can be engineered for TIL potency assays include cell lines capable of expressing costimulatory markers, such as CD80/86, to enhance T cell responses.
어구 "종양 세포" 또는 "암 세포"는 제어되지 않는 방식으로 분열하여 고형 종양을 형성하거나 혈액에 비정상적인 세포를 넘치게 하는 세포를 지칭한다. 건강한 세포는 더 이상 더 많은 딸세포가 필요하지 않을 때 분열을 멈추지만, 종양 세포 또는 암세포는 계속해서 복제물을 생산한다. 그들은 또한 전이로 알려진 과정에서 신체의 한 부분에서 또 다른 부분으로 퍼질 수 있다. 종양 세포는 방광암, 뇌암, 유방암(삼중음성유방암 포함), 자궁경부암, 결장직장암, 위암, 자궁내막암, 신장암, 입술 및 구강암, 두경부암(예를 들어, 두경부 편평세포암(HNSCC)) 교모세포종, 다형성 교모세포종, 신경모세포종, 간암, 중피종, 폐암(비소세포폐암(NSCLC) 및 소세포폐암 포함) 피부암(편평세포 암종, 기저세포 암종, 비흑색종 피부암 및 흑색종을 포함하지만 이들로 제한되지 않음), 난소암, 포도막암, 자궁암, 췌장암, 전립선암, 육종, 갑상선암을 비롯한 다수의 암 유형으로부터 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 암 세포는 림프종으로부터도 단리된다. 종양 세포는 원발성 종양 및 전이로부터 단리될 수 있다.The phrase “tumor cell” or “cancer cell” refers to a cell that divides in an uncontrolled manner to form a solid tumor or flood the blood with abnormal cells. Healthy cells stop dividing when they no longer need more daughter cells, but tumor cells, or cancer cells, continue to produce copies. They can also spread from one part of the body to another in a process known as metastasis. Tumor cells include bladder, brain, breast (including triple-negative breast), cervix, colorectal, stomach, endometrial, kidney, lip and oral cavity, and head and neck cancers (e.g., head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC)). blastoma, glioblastoma multiforme, neuroblastoma, liver cancer, mesothelioma, lung cancer (including non-small cell lung cancer (NSCLC) and small cell lung cancer) skin cancer (including but not limited to squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, non-melanoma skin cancer, and melanoma) can be isolated from a number of cancer types, including ovarian cancer, uveal cancer, uterine cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, sarcoma, and thyroid cancer. In some embodiments, cancer cells are also isolated from lymphoma. Tumor cells can be isolated from primary tumors and metastases.
불멸화 세포는 TIL과의 공배양과 관련하여 전체적으로 설명되어 있지만, 불멸화 세포는 T 세포를 활성화하는, 예를 들어, T 세포 항원에 결합하는 분자를 발현하거나 발현하도록 조작된 암세포와 같은 임의의 종양 세포로 대체될 수 있음을 이해해야 한다.Immortalized cells are described throughout in the context of co-culture with TILs, but immortalized cells are any tumor cell, such as a cancer cell, that expresses or has been engineered to express molecules that activate T cells, e.g., that bind to T cell antigens. It must be understood that it can be replaced with .
림프구를 활성화하는 분자Molecules that activate lymphocytes
본 개시내용의 조작된 불멸화 세포는 T 세포를 활성화하는 분자를 포함하거나 발현할 수 있다.The engineered immortalized cells of the present disclosure may contain or express molecules that activate T cells.
"림프구를 활성화하는 분자" 및 "T 세포를 활성화하는 분자"는 세포를 활성화하는 비내인성 자극을 지칭한다. 내인성 과정에서, T 세포는 예를 들어, 항원-제시 세포(APC)의 표면 상에서 발현되는 MHC 클래스 II 분자에 의해 펩타이드 항원이 제시될 때 활성화된다. 활성화되면, T 세포는 빠르게 분열하고, 면역 반응을 조절하거나 보조하는 사이토카인을 분비한다. 내인성 T 세포 활성화 과정은 적어도 (a) CD3를 포함하는 TCR 복합체의 활성화, 및 (b) APC 표면 상의 단백질에 의한 CD28 또는 4-1BB의 공자극을 포함한다. T 세포의 내인성 활성화는 CD3, CD28 또는 4-1BB 효능제(예를 들어, 항체)에 의한 T 세포의 자극에 의해 시뮬레이션될 수 있다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 따라서, CD3, CD28 및/또는 4-1BB는 함께 T 세포를 활성화할 수 있다.“Molecules that activate lymphocytes” and “molecules that activate T cells” refer to non-endogenous stimuli that activate cells. In the endogenous process, T cells are activated when peptide antigens are presented, for example, by MHC class II molecules expressed on the surface of antigen-presenting cells (APCs). When activated, T cells divide rapidly and secrete cytokines that regulate or assist immune responses. The endogenous T cell activation process involves at least (a) activation of a TCR complex containing CD3, and (b) costimulation of CD28 or 4-1BB by proteins on the APC surface. It is known in the art that endogenous activation of T cells can be simulated by stimulation of T cells with CD3, CD28, or 4-1BB agonists (e.g., antibodies). Therefore, CD3, CD28 and/or 4-1BB can together activate T cells.
활성화된 T 세포는 수가 증가하거나 증식하여 면역 반응을 증강시키기 위해 사이토카인(활성화된 TIL)을 생산하기 시작한다.Activated T cells increase in number or proliferate and begin producing cytokines (activated TILs) to enhance the immune response.
불멸화 세포는 T 세포 항원에 결합(예를 들어, 직접 결합)함으로써 T 세포를 활성화하는 분자를 포함 및/또는 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, TIL(예를 들어, 조작된 TIL 및/또는 편집된 TIL)은 T 세포 항원을 발현한다. T 세포 항원의 비제한적인 예는 CD3, CD28, CD2, 41BB, OX40, GITR, ICOS, CD4, CD8을 포함한다. 일부 실시형태에서, T 세포 항원은 CD3이다. 일부 실시형태에서, T 세포 항원은 CD28이다. 일부 실시형태에서, T 세포 항원은 CD2이다.Immortalized cells may contain and/or express molecules that activate T cells by binding (e.g., directly binding) to T cell antigens. In some embodiments, the TILs (e.g., engineered TILs and/or edited TILs) express a T cell antigen. Non-limiting examples of T cell antigens include CD3, CD28, CD2, 41BB, OX40, GITR, ICOS, CD4, CD8. In some embodiments, the T cell antigen is CD3. In some embodiments, the T cell antigen is CD28. In some embodiments, the T cell antigen is CD2.
용어 "CD3"은 세포독성 T 세포(CD8+ 미경험 T 세포) 및 또한 T 헬퍼 세포(CD4+ 미경험 T 세포) 둘 다를 활성화시키는 것을 돕는 CD3(분화 클러스터 3) T 세포 공수용체를 지칭한다. CD3은 6개의 구별되는 폴리펩타이드 쇄(2개의 CD3 제타 쇄, 2개의 CD3 엡실론 쇄, 1개의 CD3e 감마 쇄 및 1개의 CD3 델타 쇄)로 구성된 단백질 복합체이다. 이러한 쇄는 T 세포 수용체(TCR) 알파 쇄 및 베타 쇄(또는 감마 쇄 및 델타 쇄)와 회합하여 T 림프구에서 활성화 신호를 생성한다. TCR 알파 쇄 및 베타 쇄(또는 감마 및 델타 쇄) 및 CD3 분자는 함께 TCR 복합체를 구성한다. 인간 CD3E 유전자는 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 유전자 ID 916에 의해 식별된다. 인간 CD3E 유전자에 대한 예시적인 뉴클레오타이드 서열은 NCBI 참조 서열: NG_007383.1이다.The term “CD3” refers to the CD3 (cluster of differentiation 3) T cell coreceptor, which helps activate both cytotoxic T cells (CD8+ naive T cells) and also T helper cells (CD4+ naive T cells). CD3 is a protein complex composed of six distinct polypeptide chains (two CD3 zeta chains, two CD3 epsilon chains, one CD3e gamma chain, and one CD3 delta chain). These chains associate with the T cell receptor (TCR) alpha and beta chains (or gamma and delta chains) to generate activation signals in T lymphocytes. The TCR alpha and beta chains (or gamma and delta chains) and CD3 molecules together make up the TCR complex. The human CD3E gene is identified by the National Center for Biotechnology Information (NCBI) gene ID 916. An exemplary nucleotide sequence for the human CD3E gene is NCBI Reference Sequence: NG_007383.1.
용어 "CD28"은 T 세포 활성화 및 생존에 필요한 공자극 신호를 제공하는 T 세포 상에서 발현되는 단백질 중 하나인 분화 클러스터 28을 지칭한다. T 세포 수용체(TCR)에 더하여 CD28을 통한 T 세포 자극은 인터류킨과 같은 다양한 사이토카인의 생산을 위한 강력한 신호를 제공할 수 있다. CD28은 CD80 및 CD86 단백질에 대한 수용체이다. 톨(Toll)-유사 수용체 리간드에 의해 활성화되는 경우, CD80 발현은 항원 제시 세포(APC)에서 상향 조절된다. 인간 CD28 유전자는 NCBI 유전자 ID 940으로 식별된다. 인간 CD28 유전자에 대한 예시적인 뉴클레오타이드 서열은 NCBI 참조 서열: NG_029618.1이다. 인간 CD28 폴리펩타이드의 예시적인 아미노산 서열은 다음과 같다:The term “CD28” refers to cluster of differentiation 28, one of the proteins expressed on T cells that provide costimulatory signals necessary for T cell activation and survival. In addition to the T cell receptor (TCR), T cell stimulation through CD28 can provide a powerful signal for the production of various cytokines such as interleukins. CD28 is the receptor for the CD80 and CD86 proteins. When activated by Toll-like receptor ligands, CD80 expression is upregulated on antigen presenting cells (APCs). The human CD28 gene is identified by NCBI gene ID 940. An exemplary nucleotide sequence for the human CD28 gene is NCBI Reference Sequence: NG_029618.1. An exemplary amino acid sequence of a human CD28 polypeptide is as follows:
MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(서열번호 19).MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRR PGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 19).
용어 "CD2"는 T 세포 및 자연 살해(NK) 세포의 표면에서 발견되는 세포 부착 분자인 분화 클러스터 2를 지칭한다. CD2는 다른 접착 분자와 상호작용하고, T 세포 및 NK 세포에서 공자극 분자로 작용한다. 인간 CD2 유전자는 NCBI 유전자 ID 914로 식별된다. 인간 CD2 유전자에 대한 예시적인 뉴클레오타이드 서열은 NCBI 참조 서열: NG_050908.1이다. 인간 CD2 폴리펩타이드의 예시적인 아미노산 서열은 다음과 같다:The term “CD2” refers to cluster of differentiation 2, a cell adhesion molecule found on the surface of T cells and natural killer (NK) cells. CD2 interacts with other adhesion molecules and acts as a costimulatory molecule in T cells and NK cells. The human CD2 gene is identified by NCBI gene ID 914. An exemplary nucleotide sequence for the human CD2 gene is NCBI Reference Sequence: NG_050908.1. An exemplary amino acid sequence of a human CD2 polypeptide is as follows:
MSFPCKFVASFLLIFNVSSKGAVSKEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIYDTKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTLTCEVMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLDIYLIIGICGGGSLLMVFVALLVFYITKRKKQRSRRNDEELETRAHRVATEERGRKPHQIPASTPQNPATSQHPPPPPGHRSQAPSHRPPPPGHRVQHQPQKRPPAPSGTQVHQQKGPPLPRPRVQPKPPHGAAENSLSPSSN(서열번호 20).MSFPCKFVASFLLIFNVSSKGAVSKEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIYDTKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTLTCEVMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSC PEKGLDIYLIIGICGGGSLLMVFVALLVFYITKRKKQRSRRNDEELETRAHRVATEERGRKPHQIPASTPQNPATSQHPPPPPGHRSQAPSHRPPPPGHRVQHQPQKRPPAPSGTQVHQQKGPPLPRPRVQPKPPHGAAENSLSPSSN (SEQ ID NO: 20).
일부 실시형태에서, 불멸화 세포는 결합, 예를 들어, T 세포 항원에 특이적으로 결합함으로써 T 세포를 활성화하는 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 불멸화 세포는 CD3 항원에 결합함으로써 T 세포를 활성화하는 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 불멸화 세포는 CD28 항원에 결합함으로써 T 세포를 활성화하는 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 불멸화 세포는 CD2 항원에 결합함으로써 T 세포를 활성화하는 분자를 포함한다.In some embodiments, the immortalized cells comprise molecules that activate T cells by binding, e.g., specifically binding to a T cell antigen. In some embodiments, the immortalized cells comprise molecules that activate T cells by binding to CD3 antigen. In some embodiments, the immortalized cells comprise molecules that activate T cells by binding to CD28 antigen. In some embodiments, the immortalized cells comprise molecules that activate T cells by binding to CD2 antigen.
어구 "특이적으로 결합하는"은 복합체가 더 낮은 회합 친화성을 갖는 다른 항원과 비교할 때, 특정 항원(예를 들어, T 세포 항원)과 높은 특이성으로 상호작용하는 분자(예를 들어, 항체)를 지칭한다. 특이적 결합 상호작용은 이온 결합, 수소 결합, 또는 다른 유형의 화학적 또는 물리적 회합을 통해 매개될 수 있다. 일부 실시형태에서, 분자는 단백질 및/또는 거대분자의 복합체 혼합물에서 그의 표적 항원을 인식할 때 특정 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, T 세포를 활성화하는 분자는 대략 10-5M 미만, 예컨대, 대략 10-6M, 10-7M, 10-8M, 10-9M 또는 10-10 M 미만 또는 더 낮은 친화도(KD)로 T 세포 항원에 결합한다.The phrase “specifically binds” refers to a molecule (e.g., an antibody) that interacts with a particular antigen (e.g., a T cell antigen) with high specificity when compared to another antigen for which the complex has a lower binding affinity. refers to Specific binding interactions may be mediated through ionic bonds, hydrogen bonds, or other types of chemical or physical associations. In some embodiments, a molecule specifically binds to a particular antigen when it recognizes its target antigen in a complex mixture of proteins and/or macromolecules. In some embodiments, the molecule that activates the T cell is less than about 10 -5 M, such as less than about 10 -6 M, 10 -7 M, 10 -8 M, 10 -9 M or 10 -10 M or lower. Binds to T cell antigens with high affinity (KD).
일부 실시형태에서, T 세포를 활성화하는 분자는 T 세포 효능제이다. 용어 "효능제"는 세포 표면 상에서 또는 가용성 형태로 표적에 결합하는 화학물질, 분자, 거대분자, 분자 복합체 또는 거대분자 복합체를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 효능제가 세포 표면 상의 표적에 결합할 때, 효능제는 표적을 활성화하여 생물학적 반응을 생성한다. 효능제는 호르몬, 신경전달물질, 항체 및 항체 단편을 포함한다.In some embodiments, the molecule that activates T cells is a T cell agonist. The term “agonist” refers to a chemical, molecule, macromolecule, molecular complex, or macromolecular complex that binds to a target on the cell surface or in soluble form. In certain embodiments, when an agonist binds to a target on the cell surface, the agonist activates the target to produce a biological response. Agonists include hormones, neurotransmitters, antibodies, and antibody fragments.
T 세포를 활성화하는 분자의 비제한적인 예는 항체, 예컨대, 전체 항체 및/또는 항체 단편, NANOBODY® 결합제, AFFIMER® 결합제 및 다른 분자 결합제, 예컨대, 리간드 및 수용체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.Non-limiting examples of molecules that activate T cells include, but are not limited to, antibodies, such as whole antibodies and/or antibody fragments, NANOBODY® binding agents, AFFIMER® binding agents, and other molecular binding agents such as ligands and receptors.
용어 "항체"는 일반적으로 4개의 폴리펩타이드 쇄, 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)로 구성된 면역글로불린(Ig) 분자, 또는 Ig 분자의 에피토프 결합 특징을 유지하는 이의 기능성 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 지칭한다. 이러한 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체 항체 포맷은 당업계에 공지되어 있다. 전장 항체의 일 실시형태에서, 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. 중쇄 가변 영역(도메인)은 또한 본 개시내용에서 VDH로 지정된다. CH는 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL)과 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. CL은 단일 CL 도메인으로 구성된다. 경쇄 가변 영역(도메인)은 또한 본 명세서에서 VDL로 지정된다. VH 및 VL은 프레임워크 영역(FR)이라고 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변성 영역으로 더 세분화될 수 있다. 일반적으로, 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카복시 말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류일 수 있다.The term “antibody” generally refers to an immunoglobulin (Ig) molecule consisting of four polypeptide chains, two heavy (H) and two light (L) chains, or functional fragments thereof that retain the epitope binding characteristics of the Ig molecule, including mutations. Refers to body, variant or derivative. Such fragment, mutant, variant or derivative antibody formats are known in the art. In one embodiment of a full-length antibody, each heavy chain consists of a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH). The heavy chain variable region (domain) is also designated as VDH in this disclosure. CH consists of three domains: CH1, CH2, and CH3. Each light chain consists of a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL). CL consists of a single CL domain. The light chain variable region (domain) is also designated herein as VDL. VH and VL can be further subdivided into hypervariable regions called complementarity-determining regions (CDRs) interspersed with more conserved regions called framework regions (FRs). Generally, each VH and VL consists of three CDRs and four FRs arranged from amino terminus to carboxy terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, and FR4. Immunoglobulin molecules can be of any type (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY), class (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2).
일부 실시형태에서, 불멸화 세포는 항체 단편인 분자를 발현한다. 일부 실시형태에서, 항체 단편은 단일 쇄 가변 단편(scFv), F(ab')2 단편, Fab 단편, Fab' 단편 및 Fv 단편으로부터 선택된다.In some embodiments, the immortalized cells express molecules that are antibody fragments. In some embodiments, the antibody fragment is selected from single chain variable fragment (scFv), F(ab')2 fragment, Fab fragment, Fab' fragment, and Fv fragment.
용어 효능제 또는 항체와 함께 사용되는 용어 "단편"은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 효능제 또는 항체의 단편을 지칭한다. 항체 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 도메인 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 도메인 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) 단일 가변 도메인을 포함하는 dAb 단편; 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 추가로, Fv 단편의 두 도메인인 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여 이들을 VL 영역과 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자(단일 쇄 Fv(scFv)로 공지됨)를 형성하는 단일 단백질로서 만들어 지게 할 수 있는 합성 링커에 의해서 연결될 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체는 또한 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 것으로 의도된다. 다이아바디와 같은 다른 형태의 단일 쇄 항체가 또한 포함된다. 또한, 단일 쇄 항체는 상보적 경쇄 폴리펩타이드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fv 분절(VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 "선형 항체"를 포함한다.The term “fragment,” as used in conjunction with the term agonist or antibody, refers to a fragment of an agonist or antibody that retains the ability to specifically bind to an antigen. Examples of antibody fragments include (i) the Fab fragment, which is a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL and CH1 domains; (ii) the F(ab')2 fragment, a bivalent fragment containing two Fab fragments linked by a disulfide bridge in the hinge region; (iii) Fd fragment consisting of VH domain and CH1 domain; (iv) an Fv fragment consisting of the VL and VH domains of a single arm of the antibody; (v) dAb fragment containing a single variable domain; and (vi) an isolated complementarity determining region (CDR). Additionally, although the two domains of the Fv fragment, VL and VH, are encoded by separate genes, they can be generated using recombinant methods by pairing the VL and VH regions into a monovalent molecule, known as a single-chain Fv (scFv). ) can be linked by a synthetic linker, which allows them to be made as a single protein to form a protein. Such single chain antibodies are also intended to be encompassed within the term “antigen-binding portion” of an antibody. Other types of single chain antibodies, such as diabodies, are also included. Single chain antibodies also include "linear antibodies" which contain a pair of tandem Fv segments (VH-CH1-VH-CH1) that together with complementary light chain polypeptides form a pair of antigen binding regions.
용어 "KD"는 특정 효능제-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭한다. 전형적으로, 본 명세서에 기재된 효능제는 예를 들어, 리간드로서 효능제 및 분석물로서 표적을 사용하는 Biacore 기기에서 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술을 사용하여 결정된 바와 같이, 약 1×10-9M 또는 1×10-10M인 mOKT3 scFv의 KD보다 더 높은 해리 평형 상수(KD)로 표적에 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 효능제(예를 들어, 저친화성 mOKT3 scFv 변이체)는 5×10-10M보다 더 높은 KD에 상응하는 친화성으로 표적 단백질(예를 들어, CD3)에 결합한다.The term “KD” refers to the dissociation equilibrium constant of a particular agonist-antigen interaction. Typically, the agonists described herein have a molecular weight of about 1 Binds to the target with a dissociation equilibrium constant (KD) higher than the KD of mOKT3 scFv, which is M or 1×10 -10 M. In some embodiments, an agonist described herein (e.g., a low affinity mOKT3 scFv variant) binds a target protein (e.g., CD3) with an affinity corresponding to a KD higher than 5×10 -10 M. do.
용어 "koff"(sec-1)는 특정 효능제-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 지칭한다. 상기 값은 또한 kd 값으로 지칭된다.The term “koff” (sec-1) refers to the dissociation rate constant of a particular agonist-antigen interaction. This value is also referred to as the kd value.
용어 "kon"(M-1Хsec-1)는 특정 효능제-항원 상호작용의 회합 속도 상수를 지칭한다.The term “kon” (M-1Хsec-1) refers to the association rate constant of a specific agonist-antigen interaction.
용어 "KD"(M)는 특정 효능제-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭한다.The term “KD” (M) refers to the dissociation equilibrium constant of a particular agonist-antigen interaction.
용어 "KA"(M-1)는 특정 효능제-항원 상호작용의 회합 평형 상수를 지칭하고, kon을 koff로 나누어서 얻어진다.The term “KA” (M -1 ) refers to the association equilibrium constant of a particular agonist-antigen interaction and is obtained by dividing kon by koff.
어구 "항-CD28 항체"는 항체 또는 이의 변이체, 예를 들어, 단클론성 항체를 지칭하고, 성숙 T 세포의 T 세포 항원 수용체에서 CD28 수용체에 대해 지향되는 인간, 인간화된, 키메라 또는 뮤린 항체를 포함한다.The phrase “anti-CD28 antibody” refers to an antibody or variant thereof, e.g., a monoclonal antibody, and includes human, humanized, chimeric or murine antibodies directed against the CD28 receptor on the T cell antigen receptor of mature T cells. do.
어구 "항-CD2 항체"는 항체 또는 이의 변이체, 예를 들어, 단클론성 항체를 지칭하고, 성숙 T 세포의 T 세포 항원 수용체에서 CD2 수용체에 대해 지향되는 인간, 인간화된, 키메라 또는 뮤린 항체를 포함한다.The phrase “anti-CD2 antibody” refers to an antibody or variant thereof, e.g., a monoclonal antibody, and includes human, humanized, chimeric or murine antibodies directed against the CD2 receptor at the T cell antigen receptor on mature T cells. do.
어구 "항-CD3 항체"는 항체 또는 이의 변이체, 예를 들어, 단클론성 항체를 지칭하고, 성숙 T 세포의 T 세포 항원 수용체에서 CD3 수용체에 대해 지향되는 인간, 인간화, 키메라 또는 뮤린 항체를 포함한다(예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 공개 제WO2013186613A1호 참조). 항-CD3 항체는 무로모납이라고도 알려진 OKT3을 포함한다. 항-CD3 항체는 또한 T3 및 CD3c로도 알려진 UCHT1 클론을 포함한다. 다른 항-CD3 항체는 예를 들어, 오텔릭시주맙, 테플리주맙 및 비실리주맙을 포함한다.The phrase “anti-CD3 antibody” refers to an antibody or variant thereof, e.g., a monoclonal antibody, and includes human, humanized, chimeric or murine antibodies directed against the CD3 receptor on the T cell antigen receptor of mature T cells. (See, for example, International Publication No. WO2013186613A1, incorporated herein by reference). Anti-CD3 antibodies include OKT3, also known as muromonap. Anti-CD3 antibodies include the UCHT1 clone, also known as T3 and CD3c. Other anti-CD3 antibodies include, for example, otelixizumab, teplizumab, and vicilizumab.
뮤로모납-CD3 경쇄Muromonab-CD3 light chain
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRADTAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(서열번호 17)QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRADTAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTS TSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO: 17)
뮤로모납-CD3 중쇄Muromonab-CD3 heavy chain
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGGTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 18)QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGGTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSS VTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 18)
용어 "OKT-3"는 밀테니이 바이오테크사(Miltenyi Biotech, Inc.), 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)에 의해 생산된 항-CD3 항체 및/또는 이의 바이오시밀러 또는 변이체(예를 들어, 인간화, 키메라 또는 친화성 성숙 변이체)를 지칭한다. OKT3를 생산할 수 있는 하이브리도마는 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)에서 입수 가능하고, ATCC 수탁 번호 CRL 8001로서 배정된다. OKT3를 생산할 수 있는 하이브리도마는 ECACC(European Collection of Authenticated Cell Cultures)에서 입수 가능하고, 카탈로그 번호 86022706으로 배정된다.The term “OKT-3” refers to an anti-CD3 antibody produced by Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA, and/or a biosimilar or variant thereof (e.g., humanized, chimera or affinity mature variant). Hybridomas capable of producing OKT3 are available from the American Type Culture Collection and are assigned ATCC accession number CRL 8001. Hybridomas capable of producing OKT3 are available from the European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC) and are assigned catalog number 86022706.
일부 실시형태에서, 항체 단편은 OKT3 항체, 예컨대, OKT3 항체 단편이다. 일부 실시형태에서, OKT3 항체 단편은 막 결합된 OKT3(mOKT3) scFv 단편이다.In some embodiments, the antibody fragment is an OKT3 antibody, such as an OKT3 antibody fragment. In some embodiments, the OKT3 antibody fragment is a membrane bound OKT3 (mOKT3) scFv fragment.
막관통 도메인은 불멸화 세포의 세포 표면에 mOKT3 scFv를 고정하는 데 활용될 수 있다. 예를 들어, 인간 CD8 막관통 도메인은 mOKT3 scFv를 불멸화 세포의 세포 표면에 고정시키는 데 활용될 수 있다. mOKT3 scFv를 불멸화 세포의 세포 표면에 고정시키기 위해 마우스(pKSQ366)와 같은 다른 종, 또는 CD14 또는 CD28과 같은 다른 막관통 단백질로부터의 CD8 막관통 도메인을 사용하는 것도 본 명세서에서 고려된다. 일부 실시형태에서, mOKT3 scFv는 불멸화 세포의 세포 표면에 테더링되어 발현된다. 일부 실시형태에서, 인간 CD8 막관통 도메인은 mOKT3 scFv를 불멸화 세포의 세포 표면에 고정시키는 데 활용된다.The transmembrane domain can be utilized to anchor mOKT3 scFv to the cell surface of immortalized cells. For example, the human CD8 transmembrane domain can be utilized to anchor mOKT3 scFv to the cell surface of immortalized cells. Also contemplated herein is the use of the CD8 transmembrane domain from another species, such as mouse (pKSQ366), or another transmembrane protein, such as CD14 or CD28, to anchor the mOKT3 scFv to the cell surface of immortalized cells. In some embodiments, the mOKT3 scFv is expressed tethered to the cell surface of an immortalized cell. In some embodiments, the human CD8 transmembrane domain is utilized to anchor the mOKT3 scFv to the cell surface of immortalized cells.
많은 T 세포는 mOKT3의 매우 강한 자극에 반응할 것이다. 더 낮은 친화성의 T 세포 수용체 결합을 사용하면 세포 대 세포 변이로 인한 T 세포 수용체 신호전달 역치의 미묘한 차이를 분리할 수 있으며, 환자에게 주입하기 전에 T 세포 요법 제품 간의 품질을 더욱 민감하게 결정할 수 있다. mOKT3 단편의 저친화성 변이체는 부위 돌연변이 유발을 통해 만들어질 수 있으며, 이를 통해 인식된 항원과 자연 T 세포 수용체의 친화성을 더욱 밀접하게 모델링할 수 있다. 자연 T 세포 수용체의 공개된 친화성은 μM KD 범위이다.Many T cells will respond to very strong stimulation of mOKT3. The use of lower affinity T cell receptor binding allows for the isolation of subtle differences in T cell receptor signaling thresholds due to cell-to-cell variation and allows for more sensitive determination of quality between T cell therapy products prior to infusion into patients. . Low-affinity variants of the mOKT3 fragment can be created through site mutagenesis, which can more closely model the affinity of the recognized antigen and the natural T cell receptor. The published affinities of natural T cell receptors are in the μM KD range.
일부 실시형태에서, 저친화성 mOKT3 scFv 변이체가 사용된다. 일부 실시형태에서, 분자는 mOKT3 scFv의 해리 상수(KD)보다 더 낮은 KD로 CD3에 결합하되, mOKT scFv의 KD는 약 1×10-9 내지 약 1×10-11, 예를 들어, 약 5×10-10M이다. 일부 실시형태에서, 저친화성 mOKT3 scFv 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열에 비해서 R55 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 저친화성 mOKT3 scFv 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열에 비해서 Y57 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 저친화성 mOKT3 scFv 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열에 비해서 R55 및 Y57 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 저친화성 mOKT3 scFv 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열에 비해서 R55M 및 Y57A 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 저친화성 mOKT3 scFv 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열에 비해서 R55L 및 Y57T 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.In some embodiments, low affinity mOKT3 scFv variants are used. In some embodiments, the molecule binds CD3 with a KD that is lower than the dissociation constant (KD) of the mOKT3 scFv, wherein the KD of the mOKT scFv is from about 1×10 -9 to about 1×10 -11 , e.g., about 5 ×10 -10 M. In some embodiments, the low affinity mOKT3 scFv variant comprises an amino acid sequence with an R55 mutation relative to the amino acid sequence of SEQ ID NO:2. In some embodiments, the low affinity mOKT3 scFv variant comprises an amino acid sequence with a Y57 mutation relative to the amino acid sequence of SEQ ID NO:2. In some embodiments, the low affinity mOKT3 scFv variant comprises an amino acid sequence with R55 and Y57 mutations relative to the amino acid sequence of SEQ ID NO:2. In some embodiments, the low affinity mOKT3 scFv variant comprises an amino acid sequence with the R55M and Y57A mutations relative to the amino acid sequence of SEQ ID NO:2. In some embodiments, the low affinity mOKT3 scFv variant comprises an amino acid sequence with the R55L and Y57T mutations relative to the amino acid sequence of SEQ ID NO:2.
일부 실시형태에서, 저친화성 mOKT3 scFv 변이체는 약 1×10-6 내지 약 5×10-8의 해리 상수(KD)로 CD3에 결합한다. 예를 들어, 저친화성 mOKT3 scFv 변이체는 약 1×10-6, 1×10-7 또는 1×10-8의 KD로 CD3에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 저친화성 mOKT3 scFv 변이체는 약 5×10-7의 KD로 CD3에 결합한다.In some embodiments, the low affinity mOKT3 scFv variant binds CD3 with a dissociation constant (KD) of about 1×10 -6 to about 5×10 -8 . For example, low-affinity mOKT3 scFv variants can bind CD3 with a KD of approximately 1×10 -6 , 1×10 -7 or 1×10 -8 . In some embodiments, the low affinity mOKT3 scFv variant binds CD3 with a KD of about 5×10 −7 .
일부 실시형태에서, 저친화성 mOKT3 scFv 변이체는 mOKT3 scFv의 KD보다 적어도 10배 더 낮은, 적어도 20배 더 낮은, 적어도 30배 더 낮은, 적어도 40배 더 낮은, 적어도 50배 더 낮은, 적어도 60배 더 낮은, 적어도 70배 더 낮은, 적어도 80배 더 낮은, 적어도 90배 더 낮은, 적어도 100배 더 낮은, 적어도 110배 더 낮은, 적어도 120배 더 낮은, 적어도 130배 더 낮은, 적어도 140배 더 낮은, 적어도 150배 더 낮은, 적어도 160배 더 낮은, 적어도 170배 더 낮은, 적어도 180배 더 낮은, 적어도 190배 더 낮은, 적어도 200배 더 낮은, 적어도 210배 더 낮은, 적어도 220배 더 낮은, 적어도 230배 더 낮은, 적어도 240배 더 낮은, 적어도 250배 더 낮은, 적어도 275배 더 낮은, 적어도 300배, 적어도 400배, 적어도 500배, 적어도 600배, 적어도 700배, 적어도 800배, 적어도 900배, 적어도 1000배, 적어도 1100배, 적어도 1200배 더 낮은 KD로 CD3에 결합한다. 일부 실시형태에서, 저친화성 mOKT3 scFv 변이체는 mOKT3 scFv의 해리 상수 KD보다 적어도 250배 더 낮은 KD로 CD3에 결합한다. 일부 실시형태에서, 저친화성 mOKT3 scFv 변이체는 OKT3 scFv의 해리 상수 KD보다 적어도 1000배 더 낮은 KD로 CD3에 결합한다.In some embodiments, the low affinity mOKT3 scFv variant has a KD that is at least 10-fold lower, at least 20-fold lower, at least 30-fold lower, at least 40-fold lower, at least 50-fold lower, at least 60-fold lower. lower, at least 70 times lower, at least 80 times lower, at least 90 times lower, at least 100 times lower, at least 110 times lower, at least 120 times lower, at least 130 times lower, at least 140 times lower, at least 150 times lower, at least 160 times lower, at least 170 times lower, at least 180 times lower, at least 190 times lower, at least 200 times lower, at least 210 times lower, at least 220 times lower, at least 230 times lower, at least 240 times lower, at least 250 times lower, at least 275 times lower, at least 300 times, at least 400 times, at least 500 times, at least 600 times, at least 700 times, at least 800 times, at least 900 times, Binds to CD3 with a KD that is at least 1000-fold, at least 1100-fold, and at least 1200-fold lower. In some embodiments, the low affinity mOKT3 scFv variant binds CD3 with a KD that is at least 250-fold lower than the dissociation constant KD of the mOKT3 scFv. In some embodiments, the low affinity mOKT3 scFv variant binds CD3 with a KD that is at least 1000-fold lower than the dissociation constant KD of the OKT3 scFv.
일부 실시형태에서, T 세포를 활성화하는 분자는 막 테더링된 분자이다. T 세포 수용체 CD3에 결합하고 클러스터링하여 T 세포를 활성화하는 다른 분자, 예컨대, 박테리아 슈퍼항원(예를 들어, SEB), 피토헤마글루티닌(PHA) 또는 콘카나발린 A(ConA)은 불멸화 세포의 세포 표면에 테더링된 mOKT3 scFv와 유사한 방식으로 작동하는 것으로 고려된다. 일부 실시형태에서, T 세포를 활성화하는 분자는 피토헤마글루티닌(PHA)이다. 일부 실시형태에서, T 세포를 활성화하는 분자는 콘카나발린 A(ConA)이다. T 세포 수용체/CD3 성분에 결합하는 다른 단클론성 항체 scFv 단편, 예를 들어, 항-CD3 항체 클론 BC3 또한 불멸화 세포의 세포 표면에 테더링된 mOKT3 scFv와 유사한 방식으로 작동하는 것으로 고려된다. 일부 실시형태에서, T 세포를 활성화하는 분자는 항-CD3 항체 클론 BC3이다.In some embodiments, the molecule that activates the T cell is a membrane tethered molecule. Other molecules that activate T cells by binding to and clustering on the T cell receptor CD3, such as bacterial superantigens (e.g., SEB), phytohemagglutinin (PHA), or concanavalin A (ConA), can be used to activate T cells. It is considered to operate in a similar manner to mOKT3 scFv tethered to the cell surface. In some embodiments, the molecule that activates T cells is phytohemagglutinin (PHA). In some embodiments, the molecule that activates T cells is concanavalin A (ConA). Other monoclonal antibody scFv fragments that bind to the T cell receptor/CD3 component, such as anti-CD3 antibody clone BC3, are also contemplated to function in a similar manner to the mOKT3 scFv tethered to the cell surface of immortalized cells. In some embodiments, the molecule that activates T cells is anti-CD3 antibody clone BC3.
일부 실시형태에서, 불멸화 세포는 Fc 수용체를 발현한다. 이러한 실시형태에서, Fc 수용체 및 CD3와 같은 T 세포 항원 둘 다에 결합하는 항체, 예컨대, 단클론성 항-CD3 항체를 사용하여 TIL의 효능을 평가할 수 있다.In some embodiments, the immortalized cells express Fc receptors. In this embodiment, antibodies that bind both Fc receptors and T cell antigens such as CD3, such as monoclonal anti-CD3 antibodies, can be used to assess the efficacy of TILs.
다른 실시형태에서, T 세포를 활성화하는 분자는 불멸화 세포에 의해 발현되지 않는다. 오히려, 분자는 불멸화 세포 및 T 세포 둘 다에 결합할 수 있는 이중특이적 분자일 수 있다. 블리나투모맙(blinatumomab)과 같은 이중특이적 T 세포 관여자는 불멸화 세포에 의해 발현되는 CD19 및 T 세포에 의해 발현되는 CD3에 결합하는 이러한 분자의 비제한적인 한 예이다.In another embodiment, the molecules that activate T cells are not expressed by the immortalized cells. Rather, the molecule may be a bispecific molecule capable of binding to both immortalized cells and T cells. Bispecific T cell engagers, such as blinatumomab, are a non-limiting example of such molecules that bind to CD19 expressed by immortalized cells and CD3 expressed by T cells.
공배양 조건Coculture conditions
일부 양상에서, 본 명세서에 제공된 방법은 림프구(예를 들어, TIL)와 불멸화 세포를 공배양하는 것을 포함한다.In some aspects, the methods provided herein include co-culturing lymphocytes (e.g., TILs) and immortalized cells.
불멸화 세포는 세포의 2차원 단층 또는 다층 3차원 스페로이드로 배양될 수 있다. 스페로이드는 편평한 표면에 대한 부착을 예방하는 환경에서 형성되는 자가 조립 다세포 응집체이다.Immortalized cells can be cultured as two-dimensional monolayers of cells or as multilayered three-dimensional spheroids. Spheroids are self-assembling multicellular aggregates that form in environments that prevent attachment to flat surfaces.
2차원 배양은 예를 들어, 부착 표면을 갖는 배양 플라스크, 접시, 멀티웰 플레이트에서 세포가 단층으로 성장하는 부착 배양이다. 이에 비해서, 3차원 스페로이드 배양은 예를 들어, 비부착성 플레이트의 현탁 배양, 농축 배지 또는 겔-유사 물질 또는 스캐폴드에서 세포가 다층 스페로이드로서 성장하는 비부착성 또는 저부착성 배양 시스템이다.Two-dimensional culture is an adherent culture in which cells grow as a monolayer, for example, in culture flasks, dishes, or multiwell plates with an adhesive surface. In comparison, three-dimensional spheroid culture is a non-adherent or low-adherence culture system in which cells are grown as multilayer spheroids, for example, in suspension culture on non-adherent plates, in concentrated media, or on gel-like materials or scaffolds. .
일부 실시형태에서, 3차원 시스템의 불멸화 세포는 초저부착(ULA) 표면에서 배양된다. 초저부착 표면은 특이적 및 비특이적 고정화를 저해하는 물질을 포함하는 표면으로, 세포를 부유 상태로 만들어 3차원 스페로이드 형성을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 초저부착 표면은 친수성 중성 하전 코팅을 포함한다. 일부 실시형태에서, 친수성 중성 하전 하이드로겔 코팅은 표면에 공유 결합된다. 일부 실시형태에서, 표면은 폴리스티렌을 포함한다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 초저부착 표면은 친수성 중성 하전 코팅이 공유 결합되는 폴리스티렌 표면이다. 당업계에 공지된 바와 같이, 초저부착 표면은 일반적으로 안정적이고, 세포독성이 없고, 생물학적으로 불활성이며, 분해되지 않는다.In some embodiments, immortalized cells in a three-dimensional system are cultured on ultra-low adhesion (ULA) surfaces. Ultra-low adhesion surfaces are surfaces containing substances that inhibit specific and non-specific immobilization, allowing cells to float and form three-dimensional spheroids. In some embodiments, the ultra-low adhesion surface includes a hydrophilic neutral charge coating. In some embodiments, the hydrophilic neutrally charged hydrogel coating is covalently attached to the surface. In some embodiments, the surface includes polystyrene. Accordingly, in some embodiments, the ultra-low adhesion surface is a polystyrene surface to which a hydrophilic neutral charged coating is covalently attached. As is known in the art, ultra-low adhesion surfaces are generally stable, non-cytotoxic, biologically inert, and non-degradable.
일부 실시형태에서, 3차원 시스템의 불멸화 세포는 초저부착 멀티웰 플레이트(예를 들어, Corning®)에서 배양된다. 일부 실시형태에서, 멀티웰 플레이트(예를 들어, 멀티웰 폴리스티렌 플레이트)의 초저부착 표면은 친수성 중성 하전 공유 결합 하이드로겔 층이다. 다양한 멀티웰 포맷, 예를 들어, 6웰, 24웰 또는 96웰 포맷이 입수 가능하다.In some embodiments, immortalized cells in a three-dimensional system are cultured in ultra-low attachment multiwell plates (e.g., Corning®). In some embodiments, the ultra-low adhesion surface of a multiwell plate (e.g., a multiwell polystyrene plate) is a hydrophilic neutrally charged covalent hydrogel layer. A variety of multiwell formats are available, such as 6-well, 24-well or 96-well formats.
하기에 제공된 배양 조건이 2차원 또는 3차원 공배양에 사용될 수 있다.The culture conditions provided below can be used for two-dimensional or three-dimensional co-culture.
일부 실시형태에서, 불멸화 세포의 공배양은 25,000 내지 200,000개의 불멸화 세포를 포함한다. 예를 들어, 불멸화 세포의 공배양은 50,000 내지 100,000개의 불멸화 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 불멸화 세포의 공배양은 25000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000 또는 10000개의 불멸화 세포를 포함한다.In some embodiments, the co-culture of immortalized cells includes 25,000 to 200,000 immortalized cells. For example, a co-culture of immortalized cells may contain 50,000 to 100,000 immortalized cells. In some embodiments, the co-culture of immortalized cells comprises 25000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000 or 10000 immortalized cells.
일부 실시형태에서, 불멸화 세포는 예를 들어, 멀티웰 플레이트, 예컨대, 96웰 플레이트에 혈청(예를 들어, 우태아 혈청(FBS)) 및 항생제(예를 들어, Pen/Strep)를 함유한 배지(예를 들어, 둘베코 변형 이글 배지(DMEM))에 플레이팅된다.In some embodiments, the immortalized cells are grown in medium containing serum (e.g., fetal bovine serum (FBS)) and antibiotics (e.g., Pen/Strep), e.g., in a multiwell plate, e.g., a 96-well plate. Plated on (e.g., Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)).
일부 실시형태에서, 불멸화 세포는 약 48시간 내지 약 96시간(예를 들어, 약 48시간, 약 60시간, 약 72시간, 약 84시간 또는 약 96시간) 동안 배지에서 (예를 들어, ULA 표면을 갖는 멀티웰 플레이트에서 또는 부착성 멀티웰 플레이트에서) 배양되어 TIL을 첨가하기 전에 3차원 스페로이드를 형성한다.In some embodiments, the immortalized cells are cultured in medium (e.g., on a ULA surface) for about 48 hours to about 96 hours (e.g., about 48 hours, about 60 hours, about 72 hours, about 84 hours, or about 96 hours). or in adherent multiwell plates) to form three-dimensional spheroids prior to addition of TILs.
예를 들어, 공배양 이전에 TIL, 예컨대, pre-REP TIL을 생성하기 위해서, 일부 실시 형태에서, 종양 소화 샘플(예를 들어, 흑색종 종양 소화 샘플)을 해동하고, IL-2의 존재 하의 pre-REP 배지에 플레이팅(예를 들어, 1.5e6개 세포/㎖)한다. 일부 실시형태에서, IL-2의 재플레이팅 및 공급은 예를 들어, 2일 후 성장이 1.5배 미만 성장으로 느려질 때까지 1 내지 3일마다 반복된다.For example, to generate TILs, e.g., pre-REP TILs, prior to co-culture, in some embodiments, a tumor digest sample (e.g., a melanoma tumor digest sample) is thawed and incubated in the presence of IL-2. Plate in pre-REP medium (e.g., 1.5e6 cells/ml). In some embodiments, replating and feeding of IL-2 is repeated every 1 to 3 days until growth slows to less than 1.5-fold growth, for example, after 2 days.
공배양 개시 전날, 일부 실시형태에서, 프리-REP TIL을 해동하고, REP 배지(예를 들어, RPMI, AIM-V, 5% 인간 AB 혈청 및 IL-2)에서 밤새 휴지시킨다.The day before co-culture initiation, in some embodiments, pre-REP TILs are thawed and rested overnight in REP medium (e.g., RPMI, AIM-V, 5% human AB serum and IL-2).
일부 실시형태에서, pan T 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 단리되어 불멸화 세포와 함께 배양된다.In some embodiments, pan T cells are isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and cultured with immortalized cells.
일부 실시형태에서, 공배양은 2:1 효과기(T 세포) 대 표적(불멸화 세포) 비율(E:T로 약칭함)에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 공배양은 1:1 E:T 비율로 수행된다. 일부 실시형태에서, 공배양은 1:2 E:T 비율로 수행된다. 일부 실시형태에서, 공배양은 3:1, 2:1 또는 1:1 E:T 비율로 수행된다. 일부 실시형태에서, 공배양은 5:1 E:T 비율로 수행된다. 일부 실시형태에서, 공배양은 10:1 E:T 비율로 수행된다. 일부 실시형태에서, 공배양은 20:1 E:T 비율로 수행된다.In some embodiments, co-culture is performed at a 2:1 effector (T cell) to target (immortalized cell) ratio (abbreviated as E:T). In some embodiments, co-culture is performed at a 1:1 E:T ratio. In some embodiments, co-culture is performed at a 1:2 E:T ratio. In some embodiments, co-culture is performed at a 3:1, 2:1, or 1:1 E:T ratio. In some embodiments, co-culture is performed at a 5:1 E:T ratio. In some embodiments, co-culture is performed at a 10:1 E:T ratio. In some embodiments, co-culture is performed at a 20:1 E:T ratio.
공배양 기간은 다를 수 있다. 일부 실시형태에서, TIL과 불멸화 세포는 적어도 2시간, 적어도 3시간 또는 적어도 4시간 동안 공배양된다. 예를 들어, TIL과 불멸화 세포는 2 내지 72시간, 2 내지 48시간, 2 내지 36시간, 2 내지 24시간, 2 내지 12시간, 4 내지 72시간, 4 내지 48시간, 4 내지 36시간, 4 내지 24시간, 4 to 12시간, 12 내지 72시간, 8 내지 72시간, 8 내지 48시간, 8 내지 36시간, 8 내지 24시간, 8 내지 12시간, 12 내지 72시간, 12 내지 48시간, 12 내지 36시간, 12 내지 24시간, 24 내지 72시간, 24 내지 48시간 또는 24 내지 36시간 동안 공배양될 수 있다. 일부 실시형태에서, TIL과 불멸화 세포는 약 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간 또는 72시간 동안 공배양된다. 일부 실시형태에서, TIL과 불멸화 세포는 적어도 12시간, 적어도 24시간, 적어도 48시간, 적어도 36시간 또는 적어도 72시간 동안 배양된다.The co-culture period may vary. In some embodiments, the TIL and the immortalized cell are co-cultured for at least 2 hours, at least 3 hours, or at least 4 hours. For example, TILs and immortalized cells 2 to 72 hours, 2 to 48 hours, 2 to 36 hours, 2 to 24 hours, 2 to 12 hours, 4 to 72 hours, 4 to 48 hours, 4 to 36 hours, 4 to 24 hours, 4 to 12 hours, 12 to 72 hours, 8 to 72 hours, 8 to 48 hours, 8 to 36 hours, 8 to 24 hours, 8 to 12 hours, 12 to 72 hours, 12 to 48 hours, 12 Co-culture may be performed for 36 hours, 12 to 24 hours, 24 to 72 hours, 24 to 48 hours, or 24 to 36 hours. In some embodiments, TILs and immortalized cells are co-cultured for about 2 hours, 4 hours, 6 hours, 8 hours, 12 hours, 18 hours, 24 hours, 36 hours, 48 hours, or 72 hours. In some embodiments, the TIL and the immortalized cells are cultured for at least 12 hours, at least 24 hours, at least 48 hours, at least 36 hours, or at least 72 hours.
일부 실시형태에서, TIL과 불멸화 세포의 공배양은 인터류킨-2(IL-2), IL-15 또는 이들의 조합을, 예를 들어, 약 5,000U/㎖ 내지 약 8,000U/㎖ (예를 들어, 5,000U/㎖, 5,500U/㎖, 6,000U/㎖, 6,500U/㎖, 7,000U/㎖, 7,500U/㎖ 또는 8,000U/㎖)의 최종 농도로 포함한다.In some embodiments, co-culture of TILs with immortalized cells produces interleukin-2 (IL-2), IL-15, or a combination thereof, e.g., at about 5,000 U/ml to about 8,000 U/ml (e.g. , 5,000U/ml, 5,500U/ml, 6,000U/ml, 6,500U/ml, 7,000U/ml, 7,500U/ml or 8,000U/ml).
IL-2는 면역계에서 사이토카인 신호전달 분자의 한 유형인 인터류킨이다. 그것은 면역을 담당하는 백혈 세포(백혈구, 종종 림프구)의 활성을 조절하는 15.5 내지 16kDa의 단백질이다. IL-2는 미생물 감염에 대한 신체의 자연적 반응의 일부이다. IL-2는 림프구에서 발현되는 IL-2 수용체에 결합하여 효과를 매개한다. IL-2의 주요 공급원은 활성화된 CD4+ T 세포 및 활성화된 CD8+ T 세포이다.IL-2 is an interleukin, a type of cytokine signaling molecule in the immune system. It is a 15.5 to 16 kDa protein that regulates the activity of white blood cells (leukocytes, often lymphocytes) responsible for immunity. IL-2 is part of the body's natural response to microbial infection. IL-2 mediates its effects by binding to the IL-2 receptor expressed on lymphocytes. The main sources of IL-2 are activated CD4+ T cells and activated CD8+ T cells.
IL-2는 주로 T 세포에 대한 직접적인 효과를 통해 면역계의 주요 기능, 내성 및 면역에 필수적인 역할을 한다. T 세포가 성숙하는 흉선에서, 그것은 특정 미성숙 T 세포가 조절 T 세포로 분화하는 것을 촉진시킴으로써 자가면역 질환을 예방하는데, 이것은 그렇지 않았으면 신체에서 정상적인 건강한 세포를 공격하기 위해서 프라이밍되었을 다른 T 세포를 억제한다. IL-2는 활성화 유도 세포 사멸(AICD)을 향상시킨다. IL-2는 또한 초기 T 세포가 항원에 의해 자극된 경우 T 세포가 효과기 T 세포 및 기억 T 세포로 분화하는 것을 촉진하여, 신체가 감염과 싸우는 것을 돕는다. 다른 극성화 사이토카인과 함께, IL-2는 미경험 CD4+ T 세포가 Th1 및 Th2 림프구로 분화하는 것을 자극하는 반면, 그것은 Th17 및 여포성 Th 림프구로의 분화를 방해한다. 그것의 발현과 분비는 엄격하게 조절되며, 면역 반응을 높이고 약화시키는 일시적인 양성 및 음성 피드백 루프의 일부로 기능한다. 항원-선택된 T 세포 클론의 수 및 기능의 확장에 의존하는 T 세포 면역학적 기억의 발달에서의 이의 역할을 통해, 그것은 세포-매개된 면역을 지속시키는 역할을 한다.IL-2 plays an essential role in key functions of the immune system, tolerance and immunity, primarily through direct effects on T cells. In the thymus, where T cells mature, they prevent autoimmune diseases by promoting the differentiation of certain immature T cells into regulatory T cells, which suppress other T cells that would otherwise be primed to attack normal healthy cells in the body. do. IL-2 enhances activation-induced cell death (AICD). IL-2 also promotes the differentiation of T cells into effector T cells and memory T cells when initial T cells are stimulated by antigen, helping the body fight infection. Together with other polarizing cytokines, IL-2 stimulates the differentiation of naïve CD4+ T cells into Th1 and Th2 lymphocytes, whereas it impedes differentiation into Th17 and follicular Th lymphocytes. Its expression and secretion are tightly regulated and function as part of transient positive and negative feedback loops that potentiate and dampen immune responses. Through its role in the development of T cell immunological memory, which depends on the expansion of the number and function of antigen-selected T cell clones, it serves to sustain cell-mediated immunity.
IL-15는 인간에서 염색체 4q31의 34kb 영역에 의해 암호화되는 14 내지 15kDa의 당단백질이다. IL-15는 IL-2와 구조적 유사성을 갖는 사이토카인이다. IL-2와 마찬가지로, IL-15도 IL-2/IL-15 수용체 베타 쇄(CD122)와 공통 감마 쇄(감마-C, CD132)로 구성된 복합체에 결합하고 이를 통해 신호를 전달한다. IL-15는 단핵구, 대식세포, 수지상 세포(DC), 각질세포, 섬유아세포, 근세포 및 신경 세포를 비롯한 수많은 세포 유형 및 조직에서 구성적으로 발현된다. 다면발현성(pleiotropic) 사이토카인으로서, 이것은 선천성 및 적응성 면역에 중요한 역할을 한다. IL-15는 T 세포와 자연살해(NK) 세포의 활성화와 증식을 조절한다. 항원의 부재 하에서 기억 T 세포를 유지하는 생존 신호는 IL-15에 의해 제공된다. 이러한 사이토카인은 NK 세포 발달에도 관여한다.IL-15 is a 14 to 15 kDa glycoprotein encoded by a 34 kb region on chromosome 4q31 in humans. IL-15 is a cytokine with structural similarity to IL-2. Like IL-2, IL-15 binds to and transmits signals through a complex consisting of the IL-2/IL-15 receptor beta chain (CD122) and the common gamma chain (gamma-C, CD132). IL-15 is constitutively expressed in numerous cell types and tissues, including monocytes, macrophages, dendritic cells (DCs), keratinocytes, fibroblasts, myocytes, and neurons. As a pleiotropic cytokine, it plays an important role in innate and adaptive immunity. IL-15 regulates the activation and proliferation of T cells and natural killer (NK) cells. Survival signals that maintain memory T cells in the absence of antigen are provided by IL-15. These cytokines are also involved in NK cell development.
림프구 항종양 효력의 평가Evaluation of lymphocyte antitumor efficacy
림프구(예를 들어, TIL)와 불멸화 세포의 공배양 후, 림프구 항종양 효력은 예를 들어, 일정 시간에 걸친 불멸화 세포의 탈과립화(예를 들어, CD107a 발현), 사이토카인 생산(예를 들어, IFN-γ) 및/또는 세포 사멸 및/또는 생존성을 측정하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 효력을 평가하는 기간은 12 내지 72시간일 수 있다. 일부 실시형태에서, 림프구(예를 들어, TIL) 항종양 효력은 12 내지 48시간, 12 내지 36시간, 12 내지 24시간, 24 내지 72시간, 24 내지 48시간, 또는 24 내지 36시간 동안 평가된다. 일부 실시형태에서, 림프구(예를 들어, TIL) 항종양 효능은 12시간, 24시간, 36시간, 48시간 또는 72시간 동안 평가된다. 일부 실시형태에서, 림프구(예를 들어, TIL) 항종양 효능은 적어도 12시간, 적어도 24시간, 적어도 48시간, 적어도 36시간 또는 적어도 72시간 동안 평가된다.After co-culture of immortalized cells with lymphocytes (e.g., TILs), the lymphocyte anti-tumor potency can be determined by, for example, degranulation of the immortalized cells over a period of time (e.g., CD107a expression), cytokine production (e.g. , IFN-γ) and/or cell death and/or viability can be measured. For example, the period for evaluating effectiveness may be 12 to 72 hours. In some embodiments, lymphocyte (e.g., TIL) anti-tumor potency is assessed for 12 to 48 hours, 12 to 36 hours, 12 to 24 hours, 24 to 72 hours, 24 to 48 hours, or 24 to 36 hours. . In some embodiments, lymphocyte (e.g., TIL) antitumor efficacy is assessed over 12 hours, 24 hours, 36 hours, 48 hours, or 72 hours. In some embodiments, lymphocyte (e.g., TIL) anti-tumor efficacy is assessed for at least 12 hours, at least 24 hours, at least 48 hours, at least 36 hours, or at least 72 hours.
탈과립화를 측정하는 방법은 유세포 분석법 판독을 사용하여 CD107a 또는 CD107b와 같은 리소좀 연관 막 당단백질(LAMP)의 세포 표면 염색을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. LAMP는 세포용해성 과립의 지질 이중층에서 발견되며, TIL에 의한 사멸 중재를 위해 방출되면 TIL 표면에 융합되어 탈과립화 및 직접적인 세포 독성에 대한 마커 역할을 한다.Methods for measuring degranulation include, but are not limited to, cell surface staining for lysosomal associated membrane glycoproteins (LAMPs) such as CD107a or CD107b using flow cytometry readout. LAMP is found in the lipid bilayer of cytolytic granules, and when released to mediate death by TILs, it fuses to the TIL surface and serves as a marker for degranulation and direct cytotoxicity.
사이토카인 산물을 측정하는 방법은 mOKT3-A375 세포주와 TIL의 공배양 후 세포 배양 상청액의 ELISA, Luminex 또는 MSD 검정 또는 mOTK3-A375 공배양 후 TIL 내 사이토카인 전사체의 qRT-PCR 분석을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.Methods for measuring cytokine products include ELISA, Luminex or MSD assays of cell culture supernatants after co-culture of TILs with the mOKT3-A375 cell line, or qRT-PCR analysis of cytokine transcripts in TILs after co-culture of mOTK3-A375 cell line, but these is not limited to
효력을 평가하기 위해 세포 사멸 및/또는 생존성을 측정하는 방법은 실시간 세포 생존성 검정, ATP 세포 생존성 검정, 생세포 프로테아제 생존성 검정, 테트라졸륨 환원 세포 생존성 검정, 레자주린 환원 세포 생존성 검정, 사멸 세포 프로테아제 방출 세포독성 검정, 락테이트 데하이드로게나제 방출 세포독성 검정 및 DNA 염료 세포독성 검정을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 세포 건강, 세포 사멸 및/또는 세포 생존성을 측정하기 위한 당업계에 공지된 다른 분석도 본 명세서에서 고려된다. 이러한 검정의 비제한적인 예는 다음과 같다.Methods for measuring cell death and/or viability to assess potency include real-time cell viability assay, ATP cell viability assay, live cell protease viability assay, tetrazolium reduced cell viability assay, and resazurin reduced cell viability assay. , dead cell protease release cytotoxicity assay, lactate dehydrogenase release cytotoxicity assay, and DNA dye cytotoxicity assay. Other assays known in the art for measuring cell health, cell death, and/or cell viability are also contemplated herein. Non-limiting examples of such assays are as follows.
세포 생존성 검정은 대사적으로 활성(살아있는) 세포의 지표로 다양한 마커를 사용한다. 일반적으로 사용되는 마커의 예는 ATP 수준 측정, 기질 환원 능력 측정, 살아있는 세포(living cell) 고유의 효소/프로테아제 활성 검출을 포함한다.Cell viability assays use various markers as indicators of metabolically active (living) cells. Examples of commonly used markers include measuring ATP levels, measuring substrate reducing capacity, and detecting enzyme/protease activity specific to living cells.
RealTime-Glo™ MT 세포 생존성 검정(Promega, 카탈로그 번호 G9711)은 실시간으로 세포 생존성을 측정한다. 이 검정에서, 조작된 루시퍼라제 및 전구기질(prosubstrate)(루시퍼라제의 기질이 아님)을 배양 배지에 직접 첨가한다. 전구기질은 세포막을 관통하여 세포 안으로 들어갈 수 있다. 그러나 활성 대사를 하는 생존 세포(viable cell)만 전구기질을 루시퍼라제의 기질로 환원시킬 수 있다. 그런 다음 기질은 발광 신호를 생성하기 위해 검출 시약 내의 루시퍼라제에 의해 사용되는 세포를 빠져나간다. 동일한 웰을 3일 동안 반복적으로 측정할 수 있다. 이 방법의 주요 장점은 간단한 운동 모니터링을 통해 더 적은 수의 플레이트 및 세포를 사용하여 용량 반응을 결정할 수 있다는 것이다. 또한, 이 방법은 세포 용해가 필요하지 않기 때문에 동일한 세포를 추가 세포 기반 검정 또는 하류 응용 프로그램에 사용할 수 있다.The RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay (Promega, catalog number G9711) measures cell viability in real time. In this assay, engineered luciferase and prosubstrate (not a substrate of luciferase) are added directly to the culture medium. The precursor substrate can penetrate the cell membrane and enter the cell. However, only viable cells with active metabolism can reduce the precursor substrate to a substrate for luciferase. The substrate then exits the cell where it is used by luciferase in the detection reagent to generate a luminescent signal. The same well can be measured repeatedly over 3 days. The main advantage of this method is that dose response can be determined using fewer plates and cells through simple kinetic monitoring. Additionally, because this method does not require cell lysis, the same cells can be used for additional cell-based assays or downstream applications.
생존 세포만 ATP를 합성할 수 있기 때문에 ATP을 사용하여 세포 생존성을 측정할 수 있다. ATP는 세제, 안정화된 루시퍼라제 및 루시페린 기질을 함유한 시약을 사용하여 CellTiter-Glo® 발광 세포 생존성 검정(Promega, 카탈로그 번호 G7570)을 사용하여 측정될 수 있다. 세제는 생존 세포를 용해시켜 ATP를 배지로 방출한다. ATP의 존재 하에서, 루시퍼라제는 루시페린을 사용하여 발광을 생성하는데, 이것은 발광 측정기를 사용하여 10분 이내에 검출될 수 있다. CellTiter-Glo® 2.0 검정(Promega, 카탈로그 번호 G9241)는 시약 준비 시간을 줄이고 간편한 구현을 위해 실온 저장의 편의성을 제공하는 단일 용액으로 제공된다. 이러한 ATP 검정은 기질을 유색 생성물로 전환하는 데 긴 인큐베이션 시간이 필요하지 않다. 또한 이것은 감도가 우수하고 선형성이 넓어 적은 세포 수가 사용되는 고속대량처리 응용 분야와도 잘 호환된다. 또한 이것은 다른 방법에 비해 아티팩트가 발생할 가능성이 적다.Because only viable cells can synthesize ATP, ATP can be used to measure cell viability. ATP can be measured using the CellTiter-Glo® luminescent cell viability assay (Promega, catalog number G7570) using reagents containing detergent, stabilized luciferase, and luciferin substrate. Detergent lyses viable cells, releasing ATP into the medium. In the presence of ATP, luciferase uses luciferin to produce luminescence, which can be detected within 10 minutes using a luminometer. CellTiter-Glo® 2.0 assay (Promega, catalog number G9241) is available as a single solution that reduces reagent preparation time and provides room temperature storage for easy implementation. This ATP assay does not require long incubation times to convert the substrate to a colored product. Additionally, it has excellent sensitivity and wide linearity, making it well compatible with high-throughput applications where small cell numbers are used. It is also less likely to produce artifacts than other methods.
생세포 프로테아제 활성은 세포 사멸 후 빠르게 사라지므로 이것은 생존 세포의 유용한 마커이다. CellTiter-Fluor™ 세포 생존성 검정(Promega, 카탈로그 번호 G6080)을 사용하면 세포 투과성 형광원성 프로테아제 기질(GF-AFC)을 사용하여 생세포 프로테아제 활성을 측정할 수 있다. 기질은 생세포에 들어가는데 여기서 기질은 생세포 프로테아제에 의해 절단되어 생존 세포 수에 비례하는 형광 신호를 생성한다. 이 방법의 인큐베이션 시간은 0.5 내지 1시간인데, 이는 테트라졸륨 검정(1 내지 4시간)보다 짧다. 이 방법은 세포를 용해하지 않기 때문에 생물발광 리포터 세포 기반 검정을 포함하여 동일한 샘플 웰에서 다른 많은 검정과의 멀티플렉싱을 허용한다.Live cell protease activity disappears rapidly after apoptosis, so this is a useful marker of viable cells. The CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assay (Promega, catalog number G6080) allows measurement of live cell protease activity using a cell-permeable fluorogenic protease substrate (GF-AFC). The substrate enters live cells, where it is cleaved by live cell proteases, producing a fluorescent signal proportional to the number of viable cells. The incubation time for this method is 0.5 to 1 hour, which is shorter than the tetrazolium assay (1 to 4 hours). Because this method does not lyse cells, it allows multiplexing with many other assays in the same sample well, including bioluminescent reporter cell-based assays.
생존 세포를 검출하는 데 사용되는 테트라졸륨 화합물은 두 가지 기본 카테고리로 분류된다:Tetrazolium compounds used to detect viable cells fall into two basic categories:
생존 세포에 쉽게 침투하는 양전하 화합물(MTT):Positively charged compounds (MTT) that readily penetrate viable cells:
활성 대사를 하는 생존 세포는 MTT를 자색 포마잔 생성물로 전환할 수 있다. 따라서 색상 형성은 생존 세포의 유용한 마커일 수 있다. CellTiter 96® 비방사성 세포 증식 검정(MTT)(Promega, 카탈로그 번호 G4000)은 이 화학을 사용한다. 그러나 이 방법의 인큐베이션 시간은 길다(보통 4시간). 또한, 포마잔 생성물은 불용성이므로 흡광도 판독값을 기록하기 전에 가용화 시약을 첨가해야 한다.Viable cells with active metabolism can convert MTT to a purple formazan product. Therefore, color formation may be a useful marker of viable cells. The CellTiter 96 ® non-radioactive cell proliferation assay (MTT) (Promega, catalog number G4000) uses this chemistry. However, the incubation time for this method is long (usually 4 hours). Additionally, because the formazan product is insoluble, a solubilizing reagent must be added before recording absorbance readings.
세포를 관통하지 않는 음전하 화합물(MTS, XTT, WST-1):Negatively charged compounds that do not penetrate cells (MTS, XTT, WST-1):
CellTiter 96® 수성 1 용액 세포 증식 검정(MTS)(Promega, 카탈로그 번호G3582)을 사용하는 경우 음전하 화합물은 중간 전자 커플링 시약과 조합되어야 하는데, 이것은 세포에 들어가서 환원된 다음 세포에서 빠져나와 테트라졸륨을 가용성 포마잔 생성물로 전환시킬 수 있다. 이 방법에 대한 인큐베이션 시간은 1 내지 4시간이다. 생성된 포마잔은 가용성이므로 가용화제를 첨가할 필요가 없어 더욱 편리한다.When using the CellTiter 96 ® Aqueous 1 Solution Cell Proliferation Assay (MTS) (Promega, catalog number G3582), a negatively charged compound must be combined with an intermediate electron coupling reagent, which enters the cell, is reduced, and then exits the cell to form tetrazolium. It can be converted to a soluble formazan product. Incubation time for this method is 1 to 4 hours. Since the produced formazan is soluble, there is no need to add a solubilizer, which is more convenient.
레자주린은 고유 형광이 거의 없는 진한 청색의 세포 투과성 표시 염료이다. CellTiter-Blue® 세포 생존성 검정(Promega, 카탈로그 번호 G8080)은 레자주린을 사용하여 세포 생존성을 측정한다. 활성 대사를 하는 생존 세포만 레자주린을 분홍색의 형광성을 띠는 레조루핀으로 환원할 수 있다. 1 내지 4시간 인큐베이션 후 마이크로플레이트 분광광도계 또는 형광계를 사용하여 신호를 정량화한다. 이 방법은 테트라졸륨 검정보다 상대적으로 저렴하고 민감한다. 그러나 시험될 화합물로부터의 형광은 레소루핀 판독을 방해할 수 있다.Resazurin is a dark blue, cell-permeable indicator dye with little intrinsic fluorescence. The CellTiter-Blue ® cell viability assay (Promega, catalog number G8080) uses resazurin to measure cell viability. Only living cells with active metabolism can reduce resazurin to pink fluorescent resorufin. After 1 to 4 hours of incubation, quantify the signal using a microplate spectrophotometer or fluorometer. This method is relatively cheaper and more sensitive than the tetrazolium assay. However, fluorescence from the compound being tested can interfere with the resorufin readout.
모든 테트라졸륨 또는 레자주린 환원 검정의 단점은 시간이 지남에 따라 유색 또는 형광 생성물의 축적에 의존한다는 것이다. 신호는 시간이 지남에 따라 점차적으로 증가하기 때문에 이러한 긴 인큐베이션 동안 세포 생존성의 감소는 검출될 수 없다.A drawback of all tetrazolium or resazurin reduction assays is that they depend on the accumulation of colored or fluorescent products over time. Because the signal increases gradually over time, no decrease in cell viability can be detected during these long incubations.
세포가 죽어 막의 온전성을 잃으면 사멸 세포 프로테아제가 방출된다. 그런 다음 발광성 기질(CytoTox-Glo™ 세포독성 검정, Promega, 카탈로그 번호 G9290) 또는 형광성 기질(CytoTox-Fluor™ 세포독성 검정, Promega, 카탈로그 번호 G9260)을 사용하여 사멸 세포 프로테아제 활성을 측정할 수 있다. 기질은 세포 투과성이 아니기 때문에 본질적으로 온전한 생존 세포에서는 이러한 기질로부터의 신호가 생성되지 않는다. 또한 검정은 비용해성이므로 다른 호환 가능한 검정 화학 물질과 멀티플렉싱될 수 있다.When cells die and lose the integrity of their membranes, apoptotic cell proteases are released. Apoptotic cell protease activity can then be measured using a luminescent substrate (CytoTox-Glo™ cytotoxicity assay, Promega, catalog number G9290) or a fluorescent substrate (CytoTox-Fluor™ cytotoxicity assay, Promega, catalog number G9260). Because the matrices are not cell permeable, essentially no signals from intact viable cells are generated from these matrices. Additionally, the black is insoluble, so it can be multiplexed with other compatible black chemistries.
막 온전성을 상실한 죽은 세포는 락테이트 데하이드로게나제(LDH)를 방출하는데, 이것은 락테이트의 피루브산염으로의 전환 및 동시에 NADH의 생성을 촉매한다. 방출된 LDH 활성은 NADH를 생산하기 위해 과량의 기질(락테이트 및 NAD+)을 제공함으로써 측정될 수 있다. 이러한 NADH는 다양한 검정 화학을 사용하여 측정할 수 있다.Dead cells that have lost their membrane integrity release lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the conversion of lactate to pyruvate and concurrent production of NADH. Released LDH activity can be measured by providing excess substrate (lactate and NAD+) to produce NADH. This NADH can be measured using a variety of assay chemistries.
1. LDH-Glo™ 세포독성 검정: LDH-Glo™ 세포독성 검정(카탈로그 번호 J2380)에서 환원효소는 NADH와 환원효소 기질(프로루시페린)을 사용하여 루시페린을 생성한다. 루시페린은 독점적인 루시퍼라제를 사용하여 측정되며 광 신호는 루미노미터로 측정된 LDH의 양에 비례한다.1. LDH-Glo™ cytotoxicity assay: In the LDH-Glo™ cytotoxicity assay (catalog number J2380), reductase uses NADH and a reductase substrate (proluciferin) to produce luciferin. Luciferin is measured using a proprietary luciferase and the optical signal is proportional to the amount of LDH measured with a luminometer.
2. CytoTox-ONE™ 균질 막 온전성 검정: CytoTox-ONE™ 균질 막 온전성 검정(Promega, 카탈로그 번호 G7890): 형광계를 사용하여 측정된 레자주린의 형광 레조루핀 생성물로의 전환.2. CytoTox-ONE™ Homogenous Membrane Integrity Assay: CytoTox-ONE™ Homogenous Membrane Integrity Assay (Promega, Cat. No. G7890): Conversion of resazurin to the fluorescent resorufin product measured using a fluorometer.
3. CytoTox 96® 비방사성 세포독성 검정: CytoTox 96® 비방사성 세포독성 분석(Promega, 카탈로그 번호 G1780)은 색 흡광도로 측정하여 테트라졸륨 염(INT)이 빨간색 포마잔 생성물로 전환되는 것을 검출한다.3. CytoTox 96® Non-radioactive Cytotoxicity Assay: The CytoTox 96® Non-radioactive Cytotoxicity Assay (Promega, catalog number G1780) detects the conversion of the tetrazolium salt (INT) to the red formazan product as measured by color absorbance.
일부 DNA 결합 염료는 생세포에서 제외되지만 침투 가능한 죽은 세포에 들어가 이의 DNA를 염색할 수 있다. 트립판 블루와 같은 종래의 염료는 혈구계를 사용하여 염색된 세포를 수동으로 계수해야 하는 경우가 많으며 이는 노동 집약적이고 쉽게 규모 확대할 수 없다. 종래의 염료의 또 다른 단점은, 이들이 세포에 대한 독성이 있을 수 있으며 종말점 측정에만 사용할 수 있다는 것이다. Some DNA-binding dyes are excluded from living cells but can enter permeable dead cells and stain their DNA. Conventional dyes such as trypan blue often require manual counting of stained cells using a hemocytometer, which is labor intensive and cannot be easily scaled up. Another disadvantage of conventional dyes is that they can be toxic to cells and can only be used for endpoint measurements.
CellTox™ Green Dye와 같은 최신 염료는 DNA에 결합할 때 형광 신호를 생성하며 이는 형광계를 사용하여 쉽게 측정된다. 이는 배양 배지에 희석되어 시딩 시 또는 시험 화합물로 처리할 때 세포에 직접 전달될 수 있으므로 실시간 역학 측정이 가능하다. CellTox™ 녹색 세포독성 검정(Promega, 카탈로그 번호 G8741)은 독성이 없고 광 안정성이 높으며 쉽게 규모 확대될 수 있다.Modern dyes, such as CellTox™ Green Dye, produce a fluorescent signal when bound to DNA, which is easily measured using a fluorometer. It can be diluted in culture medium and delivered directly to cells at seeding or when treated with test compounds, allowing real-time kinetic measurements. The CellTox™ green cytotoxicity assay (Promega, catalog number G8741) is non-toxic, highly photostable, and can be easily scaled up.
본 명세서에 개시된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 각각 인용된 주제와 관련하여 참조에 의해 포함되며, 일부 경우에는 문서 전체를 포괄할 수 있다.All references, patents, and patent applications disclosed herein are each incorporated by reference with respect to the subject matter cited, and in some cases may encompass the entire document.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 단수 표현은 달리 명확하게 나타내지 않는 한 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.As used in this specification and claims, the singular expressions “a,” “a,” and “an” should be understood to mean “at least one,” unless clearly indicated otherwise.
또한, 명확하게 반대로 나타내지 않는 한, 하나 초과의 단계 또는 행동을 포함하는 본 명세서에 청구된 임의의 방법에서, 방법의 단계 또는 행동의 순서는 방법의 단계 또는 행동이 언급되는 순서로 반드시 제한되는 것은 아니라는 것을 이해해야 한다.Additionally, unless clearly indicated to the contrary, in any method claimed herein that includes more than one step or act, the order of the method steps or acts is not necessarily limited to the order in which the method steps or acts are recited. You must understand that it is not.
상기 명세서뿐만 아니라 청구범위에서, "포함하는", "포함하는", "운반하는", "갖는", "함유하는", "포함하는", "보유하는", "구성되는" 등과 같은 모든 전환적 어구는 등은 개방형, 즉 포함하지만 이에 제한되지 않는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 미국 특허청 특허 심사 절차 매뉴얼, 섹션 2111.03에 명시된 바와 같이 "이루어진" 및 "본질적으로 이루어진"의 전환 어구만 각각 폐쇄형 또는 반폐쇄형 전환 문구가 된다.In the foregoing specification as well as in the claims, all transitions such as "comprising", "comprising", "carrying", "having", "containing", "comprising", "having", "consisting of", etc. The phrase should be understood to mean open-ended, including but not limited to. As specified in Section 2111.03 of the United States Patent and Trademark Office Patent Examination Procedure Manual, only the transition phrases “consisting of” and “consisting essentially of” are closed or semi-closed transition phrases, respectively.
수치 앞의 "약" 및 "실질적으로"라는 용어는 인용된 수치의 ±10%를 의미한다.The terms “approximately” and “substantially” preceding a value mean ±10% of the quoted value.
값의 범위가 제공되는 경우, 범위의 상한과 하한 사이 및 범위의 상한과 하한을 포함하는 각각의 값이 본 명세서에서 구체적으로 고려되고 설명된다.Where a range of values is provided, each value between and including the upper and lower limits of the range is specifically contemplated and described herein.
실시예Example
실시예 1: 보편적인 T 세포 효능제 단백질 MOKT3 및 이의 더 낮은 친화성 변이체의 생성 Example 1: Generation of the universal T cell agonist protein MOKT3 and its lower affinity variants
보편적인 인간 T 세포 효능제(본 명세서에서는 막-OKT3(mOKT3) 또는 pKSQ367로 지칭됨)를 다음 아미노산 서열의 융합에 의해 생성시켰다:The universal human T cell agonist (referred to herein as membrane-OKT3 (mOKT3) or pKSQ367) was generated by fusion of the following amino acid sequences:
마우스 IgG 중쇄로부터의 신호 펩타이드: MERHWIFLLLLSVTAGVHS (서열번호 1);Signal peptide from mouse IgG heavy chain: MERHWIFLLLLSVTAGVHS (SEQ ID NO: 1);
마우스 단클론성 항-CD3e 항체 클론 OKT3으로부터의 scFv:scFv from mouse monoclonal anti-CD3e antibody clone OKT3:
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIN (서열번호 2); 및QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDT SKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIN (SEQ ID NO: 2); and
인간 CD8로부터의 막관통 도메인:Transmembrane domain from human CD8:
SHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYV (서열번호 12).SHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYV (SEQ ID NO: 12).
mOKT3 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 cDNA를 EF1A 프로모터를 함유하고 이어서 T2A 자가 절단 펩타이드(EGRGSLLTCGDVEENPGP(서열번호 15)) 및 블라스티시딘 내성 유전자(MAKPLSQEESTLIERATATINSIPISEDYSVASAALSSDGRIFTGVNVYHFTGGPCAELVVLGTAAAAAAGNLTCIVAIGNENRGILSPCGRCRQVLLDLHPGIKAIVKDSDGQPTAVGIRELLPSGYVWEG*(서열번호 16))를 함유하는 렌티바이러스 벡터 플라스미드에 클로닝하였다. EF1A 프로모터에 의해 발현된 OKT3-CD8 단백질을 갖는 최종 작제물은 또한 본 명세서에서 pKSQ367로 지칭된다.A codon-optimized cDNA encoding the mOKT3 protein was cloned containing the EF1A promoter followed by the T2A self-cleaving peptide (EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 15)) and the blasticidin resistance gene (MAKPLSQEESTLIERATATINSIPISEDYSVASAALSSDGRIFTGVNVYHFTGGPCAELVVLGTAAAAAAGNLTCIVAIGNENRGILSPCGRCRQVLLDLHPGIKAIVKDSDGQPTAV Lentiviral vector containing GIRELLPSGYVWEG* (SEQ ID NO: 16)) Cloned into plasmid. The final construct with OKT3-CD8 protein expressed by the EF1A promoter is also referred to herein as pKSQ367.
mOKT3 단백질의 더 낮은 친화성 변이체를 pKSQ367 렌티바이러스 작제물의 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 작제하였다. scFv의 R55 및 Y57번 위치를 Chen et al. doi.org/10.3389/fimmu.2017.00793에 기재된 바와 같이, 각각 R55M 및 Y57A(mOKT3ma/pKSQ397이라고 알려짐), 또는 R55L 및 Y57T(mOKT3lt/pKSQ398이라고 알려짐)로 돌연변이시켰다. 이러한 scFv 변이체의 공개된 친화성은 모 OKT3 클론보다 250배 더 낮거나(OKT3ma) 1000배 더 낮다(OKT3lt)(KD인 공개 친화성은 5×10-10 M, Law et al, Reinhertz et al.). mOKT3의 낮은 친화성 변이체는 자연 T 세포 수용체(TCR)와 인식된 항원(μM KD 범위의 공개 친화성)의 친화성을 더욱 밀접하게 모델링한다. 많은 T 세포가 mOKT3의 매우 강한 자극에 반응하는 반면, 더 낮은 친화성의 TCR 결합은 세포 대 세포 TCR 신호 전달 역치의 미묘한 차이를 분리할 수 있게 하며 환자에게 주입하기 전에 T 세포 요법 제품 간의 품질을 더욱 민감하게 결정할 수 있게 한다.Lower affinity variants of the mOKT3 protein were constructed by site-directed mutagenesis of the pKSQ367 lentiviral construct. Positions R55 and Y57 of scFv were described by Chen et al . Mutations were made to R55M and Y57A (known as mOKT3ma/pKSQ397), or R55L and Y57T (known as mOKT3lt/pKSQ398), respectively, as described in doi.org/10.3389/fimmu.2017.00793. The published affinities of these scFv variants are either 250-fold lower (OKT3ma) or 1000-fold lower (OKT3lt) than the parent OKT3 clone (KD, published affinities of 5×10 -10 M, Law et al, Reinhertz et al.). Low affinity variants of mOKT3 more closely model the affinity of the natural T cell receptor (TCR) and the recognized antigen (public affinities in the μM KD range). While many T cells respond to very strong stimulation of mOKT3, lower affinity TCR binding allows for isolating subtle differences in cell-to-cell TCR signaling thresholds and further ensures quality between T cell therapy products prior to infusion into patients. Allows you to make sensitive decisions.
렌티바이러스 작제물은 293T 세포에 pCMV-VSV-G 및 psPax2 렌티바이러스 패키징 플라스미드를 공동 형질감염시켜 패키징하였다. 바이러스 상청액을 A375 세포로 옮겼고 형질도입 48시간 후 배지를 블라스티시딘 함유 배지로 전환하여 mOKT3 작제물을 보유하는 성공적으로 형질도입된 세포를 선택하였다. 성공적으로 형질도입되고 선택된 A375 세포를 A375-pKSQ367(A375-mOKT3이라고도 함)로 지칭할 것이다. Lentiviral constructs were packaged by co-transfecting pCMV-VSV-G and psPax2 lentiviral packaging plasmids into 293T cells. Viral supernatant was transferred to A375 cells and successfully transduced cells carrying the mOKT3 construct were selected by switching the medium to blasticidin-containing medium 48 hours after transduction. Successfully transduced and selected A375 cells will be referred to as A375-pKSQ367 (also known as A375-mOKT3).
실시예 2: mOKT3-A375 세포의 생성 및 이들이 T 세포를 활성화하는지의 확인.Example 2: Generation of mOKT3-A375 cells and confirmation that they activate T cells.
50,000 또는 100,000개의 A375-pKSQ367 세포를 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 우태아 혈청(FBS) 및 항생제 중에 96웰 플레이트에 웰당 플레이팅하였다. Pan T 세포를 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 단리시켰고 이전에 플레이팅된 A375-pKSQ367과 공배양하였다. 공배양은 2:1 효과기 대 표적 비율(E:T로 약칭)에서 수행하였다. 이전에 플레이팅된 A375-pKSQ367에서 배지를 제거하고, IL-2가 포함된 조혈 무혈청 배양 배지 중 100,000개 또는 200,000개의 T 세포를 각각 50,000개 또는 100,000개의 A375-pKSQ367을 함유하는 웰에 첨가하였다. 상청액을 플레이트에서 제거하고 세포를 항-CD3 및 항-CD69 항체로 염색하였다. 유세포 분석을 수행하고 CD69 발현을 측정하였다. CD69 활성화를 모든 형질도입된 샘플에서 관찰하였다(도 1).50,000 or 100,000 A375-pKSQ367 cells were plated per well in 96-well plates in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), and antibiotics. Pan T cells were isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and cocultured with previously plated A375-pKSQ367. Cocultures were performed at a 2:1 effector to target ratio (abbreviated as E:T). Media was removed from previously plated A375-pKSQ367, and 100,000 or 200,000 T cells in hematopoietic serum-free culture medium containing IL-2 were added to wells containing 50,000 or 100,000 A375-pKSQ367, respectively. . The supernatant was removed from the plate and the cells were stained with anti-CD3 and anti-CD69 antibodies. Flow cytometry was performed and CD69 expression was measured. CD69 activation was observed in all transduced samples ( Figure 1 ).
mOKT3의 표면 발현을 확인하기 위해서, A375-pKSQ367 세포를 세포 염색 완충액 중 염소 혈청과 함께 인큐베이션시킨 후 세포를 세포 염색 완충액으로 세척한 다음 1:100 염소-항-마우스 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 세척하고 유세포 분석을 수행하여 발현을 평가하였다. OKT3 발현은 형질도입된 세포의 99.2%에서 관찰되었다(도 2).To confirm the surface expression of mOKT3, A375-pKSQ367 cells were incubated with goat serum in cell staining buffer, then cells were washed with cell staining buffer and then incubated with 1:100 goat-anti-mouse antibody. Cells were washed and flow cytometry was performed to assess expression. OKT3 expression was observed in 99.2% of transduced cells ( Figure 2 ).
종양 침윤 림프구(TIL)에 의한 mOKT3-A375 세포의 사멸Killing of mOKT3-A375 cells by tumor infiltrating lymphocytes (TILs)
프리-REP TIL을 생성시키기 위해서, 흑색종 종양 소화 샘플을 해동시키고, 열 불활성화 인간 AB 혈청, Pen/Step, HEPES 완충액, 글루타맥스, 베타-머캅토에탄올, 젠타마이신, IL-2 및 DNase(D277 및 D3291 배양에만 첨가됨)를 포함하는 프리- REP 배지에 1.5e6개 세포/㎖로 플레이팅하였다. IL-2를 나중에 세포에 첨가하였다. 세포를 계수하고 IL-2(D277 및 D3291)가 포함된 프리-REP 배지 또는 1:1 프리-REP TIL 배지: 조혈 무혈청 배양 배지 및 IL-2(D5746)에 1e6개 세포/㎖로 다시 플레이팅하였다. 2일 후 성장이 1.5배 미만 성장으로 둔화될 때까지 IL-2의 재플레이팅 및 공급을 반복하였다. D277, D3291, D5746을 배양 기간이 끝난 후 동결시켰다.To generate pre-REP TIL, melanoma tumor digestion samples were thawed and incubated with heat-inactivated human AB serum, Pen/Step, HEPES buffer, Glutamax, beta-mercaptoethanol, gentamicin, IL-2, and DNase. were plated at 1.5e6 cells/ml in pre-REP medium containing (added only to D277 and D3291 cultures). IL-2 was added to the cells later. Count cells and repopulate at 1e6 cells/ml in pre-REP medium with IL-2 (D277 and D3291) or 1:1 pre-REP TIL medium: hematopoietic serum-free culture medium and IL-2 (D5746). ting. Replating and feeding of IL-2 was repeated after 2 days until growth slowed to less than 1.5-fold growth. D277, D3291, and D5746 were frozen after the incubation period.
공배양 개시 전날, 프리-REP TIL을 3명의 공여자로부터 해동시키고 IL-2가 포함된 REP 배지에서 밤새 동안 정치시켰다. 6,000개의 A375-pKSQ367을 IL-2 및 카스파제 3/7 염료가 포함된 REP 배지에서 공배양 개시 전날 96웰 플레이트에 플레이팅하였다. 다음날 배지를 96웰 플레이트에서 제거하고 전날 10:1, 3:1, 1:1 또는 0.3:1 E:T로 플레이팅된 A375-pKSQ367에 TIL을 첨가하였다. 플레이트를 IncuCyte에 의해 3일 동안 2시간마다 영상화하였다. A375-pKSQ367 세포의 TIL 인식 및 사멸을 시험된 모든 E:T에서 관찰하였다(도 3A 내지 도 3C).The day before the start of co-culture, pre-REP TILs were thawed from three donors and allowed to stand overnight in REP medium containing IL-2. 6,000 A375-pKSQ367 were plated in 96-well plates the day before the start of co-culture in REP medium containing IL-2 and caspase 3/7 dye. The next day, the medium was removed from the 96-well plate, and TILs were added to A375-pKSQ367 plated the previous day at 10:1, 3:1, 1:1, or 0.3:1 E:T. Plates were imaged by IncuCyte every 2 hours for 3 days. TIL recognition and killing of A375-pKSQ367 cells was observed in all E:Ts tested ( Figures 3A to 3C ).
대안적인 OKT3 막 앵커의 실시예:Examples of Alternative OKT3 Membrane Anchors:
본 실험의 목적은 다양한 신호 펩타이드와 막 앵커가 세포 표면에서 mOTK3을 발현하는 데 사용될 수 있고 mOKT3가 A375 세포 외에 다른 세포 유형에서도 발현될 수 있음을 보여주는 것이었다. 2백만 개의 K562 세포에 다양한 신호 펩타이드, 예컨대, 마우스 IgG, 인간 CSF2R 및 인간 CD5, 및 마우스 CD8a, 인간 CD8a, 인간 CD28 및 인간 CD14를 포함하는 막 앵커 단백질에 융합된 OKT3 scFv를 함유하는 pKSQ328, pKSQ377, pKSQ378, pKSQ368 및 pKSQ369 작제물을 암호화하는 렌티바이러스를 형질도입하였다. 형질도입 48시간 후, 형질도입된 K562 세포를 존재하는 경우 블라스티시딘 내성 마커에 대해 선택하였다. 형질도입 후 제8일에, K562 안정 세포주를 IL-2 함유 배지에서 공여자 PBMC로부터 단리된 100,00개의 pan T 세포의 존재 하에 100,000개의 세포/웰로 플레이팅하였다. 플레이팅 24시간 후, 세포를 항 CD8 및 항-CD69 항체로 염색하였다. 유세포 분석을 수행하고 자극되지 않은 대조군에 비해 CD69(T 세포 활성화의 마커)의 표면 발현에 대해 CD8+ T 세포를 정량화하였다. 본 발명자들은 mOKT3 작제물을 작제하는 데 사용된 신호 펩타이드와 막 앵커의 다양한 조합이 T 세포의 활성화를 유도한다는 것을 관찰하였다(도 4).The purpose of this experiment was to show that various signal peptides and membrane anchors can be used to express mOTK3 on the cell surface and that mOKT3 can be expressed in other cell types besides A375 cells. pKSQ328, pKSQ377 containing an OKT3 scFv fused to various signal peptides such as mouse IgG, human CSF2R and human CD5, and membrane anchor proteins including mouse CD8a, human CD8a, human CD28 and human CD14 in 2 million K562 cells. , lentiviruses encoding pKSQ378, pKSQ368, and pKSQ369 constructs were transduced. Forty-eight hours after transduction, transduced K562 cells were selected for blasticidin resistance markers, if present. At day 8 after transduction, the K562 stable cell line was plated at 100,000 cells/well in the presence of 100,00 pan T cells isolated from donor PBMCs in IL-2 containing medium. 24 hours after plating, cells were stained with anti-CD8 and anti-CD69 antibodies. Flow cytometry was performed and CD8+ T cells were quantified for surface expression of CD69 (a marker of T cell activation) compared to unstimulated controls. We observed that various combinations of signal peptide and membrane anchor used to construct the mOKT3 construct induced activation of T cells (Figure 4).
실시예 3: 특징규명: mOKT3의 발현, pan T 세포와의 공배양 및 cd69 유도Example 3: Characterization: expression of mOKT3, co-culture with pan T cells and cd69 induction
A375 모세포(적색 형광 핵 리포터인 NucLightRed 함유)에 pKSQ367, pKSQ396, pKSQ397 또는 pKSQ398을 형질도입하였다. '저친화성' 작제물인 pKSQ396, pKSQ397 및 pKSQ398은 형질도입을 보장하기 위해 세 가지 다른 부피의 바이러스로 형질도입되었다.A375 parental cells (containing NucLightRed, a red fluorescent nuclear reporter) were transduced with pKSQ367, pKSQ396, pKSQ397, or pKSQ398. The 'low affinity' constructs pKSQ396, pKSQ397 and pKSQ398 were transduced with three different volumes of virus to ensure transduction.
형질도입 및 작제물의 효능을 평가하기 위해 여러 분석을 수행하였다.Several assays were performed to evaluate the efficacy of the transduction and constructs.
1. 세포 표면에서의 mOKT3 발현.1. mOKT3 expression on the cell surface.
2. A375 형질도입된 표적 세포와 공배양 후 CD69의 발현을 통한 pan T 세포의 활성화.2. Activation of pan T cells through expression of CD69 after co-culture with A375 transduced target cells.
3. 환자 유래 흑색종 TIL과의 공배양 후 A375 형질도입된 세포의 성장(TIL에 의한 인식 지표) 감소.3. Reduced growth (indicative of recognition by TILs) of A375 transduced cells after co-culture with patient-derived melanoma TILs.
A375 세포(A375 모 계통 및 형질도입 계통 모두)를 세포 배양 배지에 1.5e6/㎖로 재현탁시킨 다음 96 웰 V 바닥 플레이트에 0.75e5/50㎕/웰로 플레이팅하고 밤새 인큐베이션시켰다. 다음날, 플레이팅된 세포를 세포 염색 완충액 중 염소 혈청으로 차단하고 암실에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포 염색 완충액 중 염소 항-마우스 IgG2a 다클론성 Alexa647(1:100)로 세포를 염색하고 인큐베이션시켰다. 세척 후, 세포를 세포 염색 완충액에 재현탁시키고 BD Fortessa에서 획득하였다(도 5 내지 도 7).A375 cells (both A375 parental and transgenic lines) were resuspended in cell culture medium at 1.5e6/ml and then plated in 96 well V-bottom plates at 0.75e5/50 μl/well and incubated overnight. The next day, plated cells were blocked with goat serum in cell staining buffer and incubated in the dark. Cells were then stained and incubated with goat anti-mouse IgG2a polyclonal Alexa647 (1:100) in cell staining buffer. After washing, cells were resuspended in cell staining buffer and acquired on a BD Fortessa ( Figures 5-7 ).
A375 세포(A375 모 계통 및 형질도입 계통 모두)를 세포 배양 배지에 1.5e6/㎖로 재현탁시킨 다음 96 웰 V 바닥 플레이트에 0.75e5/50㎕/웰로 플레이팅하고 밤새 인큐베이션시켰다. 다음날; PBMC(공여자 #148192)를 해동시키고, 제조사 프로토콜에 따라 pan T 세포를 단리시켰다. 단리된 Pan T 세포를 계수하고 1.5e6/㎖로 재현탁시켰다. 0.75e5개의 단리된 pan T 세포를 플레이팅된 A375 표적 세포에 첨가하고(웰당 50㎕) 밤새 인큐베이션시켰다. 플레이팅된 세포를 세포 염색 완충액으로 세척하고, 세포 염색 완충액에서 항-CD69 Ab BV785에 대해 염색하고 인큐베이션시켰다. 세척 후, 세포를 세포 염색 완충액에 재현탁시키고 BD Fortessa에서 획득하였다(도 8 내지 도 11).A375 cells (both A375 parental and transgenic lines) were resuspended in cell culture medium at 1.5e6/ml and then plated in 96 well V-bottom plates at 0.75e5/50 μl/well and incubated overnight. next day; PBMCs (donor #148192) were thawed and pan T cells were isolated according to the manufacturer's protocol. Isolated Pan T cells were counted and resuspended at 1.5e6/ml. 0.75e5 isolated pan T cells were added to the plated A375 target cells (50 μl per well) and incubated overnight. Plated cells were washed with cell staining buffer, stained against anti-CD69 Ab BV785 in cell staining buffer, and incubated. After washing, cells were resuspended in cell staining buffer and acquired on a BD Fortessa ( Figures 8 to 11 ).
실시예 4: 2차원 A375-pKSQ367 공배양 모델Example 4: Two-dimensional A375-pKSQ367 co-culture model
A375 세포(A375 모 계통 및 형질도입 계통 모두)를 세포 배양 배지에 1.2e5/㎖로 재현탁시킨 다음 96웰 편평 바닥 플레이트에 6e3/50㎕/웰로 플레이팅하고 밤새 인큐베이션시켰다. 다음날; REP 배지(AIMV, RPMI, Human AB Serum) 중의 각각의 TIL 조건의 6e3/50㎕/웰을 플레이팅된 A375 표적 세포 위에 첨가하였다. IL-2를 함유한 1개의 REP 배지를 각각의 공배양 웰에 첨가하였다. 공배양 플레이트를 IncuCyte로 옮기기 전에 실온에서 인큐베이션시켰다. 공배양 플레이트를 영상 수집을 시작하기 전에 추가 시간 동안 IncuCyte에서 인큐베이션시켰다. 총 72시간 동안 2시간마다 영상을 획득하였다(10x 대물렌즈에서 Read Phase & Red). IncuCyte 영상을 각각의 웰에서 검출된 적색 형광의 전체 면적에 대해 정량화한 다음 0시간으로 다시 정규화하여 시간 경과에 따른 표적 세포 확장/감소의 변화를 확인하였다(도 12 내지 도 14).A375 cells (both A375 parental and transgenic lines) were resuspended at 1.2e5/ml in cell culture medium and then plated at 6e3/50 μl/well in 96-well flat bottom plates and incubated overnight. next day; 6e3/50 μl/well of each TIL condition in REP medium (AIMV, RPMI, Human AB Serum) was added onto the plated A375 target cells. One REP medium containing IL-2 was added to each coculture well. Coculture plates were incubated at room temperature before transferring to IncuCyte. Coculture plates were incubated in IncuCyte for an additional hour before starting image acquisition. Images were acquired every 2 hours for a total of 72 hours (Read Phase & Red at 10x objective). IncuCyte images were quantified for the total area of red fluorescence detected in each well and then normalized back to 0 hours to confirm changes in target cell expansion/decrease over time ( FIGS. 12 to 14 ).
도 13 및 도 14에서, A375 pKSQ367 및 A375 pKSQ398 세포를 각각 단층으로 배양하였다. 편집되지 않은 TIL 및 유전자 편집된 TIL을 배양물에 첨가하고, TIL 세포독성을 영상화를 통해 종양 세포 영역의 변화로 측정하였다. 종양 표적으로서 A375 pKSQ367의 경우, SOCS1 및 CBLB 유전자 편집된 TIL 모두 편집되지 않은 TIL보다 더 양호한 종양 제어를 나타내지 않았고(도 13); 종양 표적으로서 A375 pKSQ398의 경우, 편집되든 편집되지 않든 모든 TIL은 종양 성장을 제어할 수 없었다(도 14). 따라서 종양 표적이 단층으로 배양되는 환경에서는 편집되지 않은 TIL과 편집된 TIL의 효능을 차별화할 수 없다.In Figures 13 and 14 , A375 pKSQ367 and A375 pKSQ398 cells were cultured as a monolayer, respectively. Unedited and gene-edited TILs were added to the culture, and TIL cytotoxicity was measured as changes in tumor cell area through imaging. For A375 pKSQ367 as a tumor target, neither SOCS1 nor CBLB gene edited TILs showed better tumor control than unedited TILs ( Figure 13 ); For A375 pKSQ398 as a tumor target, all TILs, whether edited or unedited, were unable to control tumor growth ( Figure 14 ). Therefore, in an environment where tumor targets are cultured as a monolayer, the efficacy of unedited and edited TILs cannot be differentiated.
실시예 5: 3차원 A375-pKSQ367 스페로이드 공배양 모델 Example 5: 3D A375-pKSQ367 spheroid co-culture model
3D 종양 스페로이드는 표적 세포의 단층보다 더 까다로운 표적과 복잡한 미세환경을 제공할 수 있으므로 A375-pKSQ367 스페로이드를 공배양 검정을 위한 표적 세포로 사용하는 것을 탐구하였다. 이를 통해 편집된 TIL과 편집되지 않은 TIL 간의 미묘한 효능 차이를 확인할 수 있다.Since 3D tumor spheroids can provide more challenging targets and complex microenvironments than monolayers of target cells, we explored the use of A375-pKSQ367 spheroids as target cells for coculture assays. This allows us to identify subtle differences in efficacy between edited and unedited TILs.
단일 클론으로부터 생성된 고친화성(pKSQ367) 및 저친화성(pKSQ398) A375 계통 둘 다를 스페로이드 기반 공배양에 사용하였다.Both high-affinity (pKSQ367) and low-affinity (pKSQ398) A375 lines generated from a single clone were used in spheroid-based cocultures.
A375-pKSQ367 고친화성 클론 및 저친화성 클론을 열 불활성화 FBS 및 항생제가 보충된 DMEM에서 유지시켰다. A375-pKSQ367 고친화성 단일 세포 클론 20을 고친화성 스페로이드 공배양 검정에 사용하였고, A375-pKSQ367 저친화성 단일 세포 클론 6을 저친화성 스페로이드 공배양 검정에 사용하였다.A375-pKSQ367 high-affinity and low-affinity clones were maintained in DMEM supplemented with heat-inactivated FBS and antibiotics. A375-pKSQ367 high-affinity single cell clone 20 was used in the high-affinity spheroid co-culture assay, and A375-pKSQ367 low-affinity single cell clone 6 was used in the low-affinity spheroid co-culture assay.
A375-pKSQ367 스페로이드 공배양의 경우 일반적인 프로토콜을 따랐다:For A375-pKSQ367 spheroid co-culture, the general protocol was followed:
제-4일: A375-pKSQ367을 FBS 및 항생제가 보충된 RPMI에서 계대배양하고 5,000 내지 10,000개의 생세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃ 5%CO2 인큐베이터 내부의 Incucyte 영상화 시스템으로 옮기고 스페로이드 형성을 촉진하기 위해 인큐베이션시켰다. 몇 시간마다 한 번씩 위상 및 적색 채널에서 4X 배율로 영상을 촬영하였다. Day-4: A375-pKSQ367 was subcultured in RPMI supplemented with FBS and antibiotics and plated at a density of 5,000-10,000 viable cells/well. The plate was transferred to the Incucyte imaging system inside a 37°C 5%CO 2 incubator and incubated to promote spheroid formation. Images were taken at 4X magnification in the phase and red channels once every few hours.
제-1일: 공여자 4명(공여자 1: D4267, NSCLC, 공여자 2: D4397, NSCLC, 공여자 3: D6164, 흑색종, 공여자 4: D6481, 흑색종)의 냉동보존 TIL을 해동시키고, 세척하고, 계수하고, TIL 배지(RPMI 1640, AIM V, 인간 AB 혈청 보충)에서 ㎖당 3e^6개의 생세포로 재현시켰다. IL-2를 첨가하였다. 세포를 적절한 크기의 플라스크에 넣고 37℃ 5%CO2 인큐베이터에서 밤새 동안 정치시켰다. Day - 1: Cryopreserved TIL from 4 donors (Donor 1: D4267, NSCLC; Donor 2: D4397, NSCLC; Donor 3: D6164, melanoma; Donor 4: D6481, melanoma) were thawed, washed, and Counted and reproduced at 3e^6 viable cells per ml in TIL medium (RPMI 1640, AIM V, supplemented with human AB serum). IL-2 was added. Cells were placed in a flask of appropriate size and left overnight in an incubator at 37°C and 5% CO 2 .
제0일: TIL을 세포 여과기를 통해 적절한 크기의 원뿔형 튜브로 여과하고 원심분리시키고, 계수하였다. A375-pKSQ367 스페로이드가 함유된 플레이트를 Incucyte에서 제거하였다. TIL을 10:1 내지 0.625:1의 효과기 세포 대 표적 세포(E:T) 비율로 A375-pKSQ367 스페로이드에 첨가하였다. E:T 비율을 제0일의 살아있는 TIL(효과기) 계수치 및 A375-pKSQ367(표적) 초기 시딩 밀도에 기초하여 계산하였다. 일부 웰은 TIL이 첨가되지 않았으며 성장 제어 역할을 하였다. 플레이트를 37℃ 5%CO2 인큐베이터 내부의 Incucyte 영상화 시스템으로 옮기고 영상화를 제-4일과 같이 계속하였다. Day 0: TILs were filtered through a cell strainer into appropriately sized conical tubes, centrifuged, and counted. Plates containing A375-pKSQ367 spheroids were removed from Incucyte. TILs were added to A375-pKSQ367 spheroids at an effector cell to target cell (E:T) ratio of 10:1 to 0.625:1. E:T ratios were calculated based on day 0 live TIL (effector) counts and A375-pKSQ367 (target) initial seeding density. Some wells had no TIL added and served as growth controls. The plate was transferred to the Incucyte imaging system inside a 37°C 5%CO 2 incubator and imaging continued as on day -4.
제6일: 영상화를 중단하고 Incucyte에서 수집한 영상을 시각적으로 평가하여 분석을 수행하였다. Day 6: Imaging was discontinued and analysis was performed by visually evaluating the images collected by Incucyte.
이 경우 영상을 흑백으로 변환하여 특정 시점에서 웰에 남아 있는 스페로이드(검은색)의 면적을 비교하여 분석을 수행하였다. 이 데이터는 또한 스페로이드의 형광 강도를 평가하여 분석되었다. 형광 수준의 감소는 스페로이드 사멸의 지표로 사용되었다. 이 검정은 또한 크롬 방출 또는 카스파제 3 발현을 판독하여 표적 세포 아폽토시스를 평가하도록 설계될 수 있다.In this case, the image was converted to black and white and analysis was performed by comparing the area of spheroids (black) remaining in the well at a specific time point. This data was also analyzed by evaluating the fluorescence intensity of the spheroids. The decrease in fluorescence level was used as an indicator of spheroid death. This assay can also be designed to assess target cell apoptosis by reading chromium release or caspase 3 expression.
A375-pKSQ367 스페로이드의 형태를 TIL이 첨가되지 않은 웰에서 평가하였다. 고친화성 및 저친화성 스페로이드 형태의 차이가 관찰되었다. 구체적으로, 동일한 플레이팅 밀도(10,000개 셀/웰)에서 고친화성 계통(도면에서 "A375-pKSQ367"로 표시됨)은 저친화성 계통(도에서 "A375-OKT3lt"로 표시됨)보다 훨씬 "더 큰"/"느슨한" 스페로이드를 형성하였다. 형태학적 차이는 스페로이드 공배양 기간(A375-OKT3 시딩 후 4 내지 10일) 동안 관찰되었다. 동일한 계통의 클론 간에도 형태의 차이가 존재할 수 있으며, 이러한 형태의 차이는 T 세포 간의 미묘한 차이를 알아낼 수 있는 또 다른 기회를 제공할 수 있는 것이 가능하다(도 15).The morphology of A375-pKSQ367 spheroids was evaluated in wells without TIL added. Differences between high-affinity and low-affinity spheroid morphologies were observed. Specifically, at the same plating density (10,000 cells/well), the high-affinity strain (denoted as “A375-pKSQ367” in the figure) is significantly “larger” than the low-affinity strain (denoted as “A375-OKT3lt” in the figure). /"Loose" spheroids were formed. Morphological differences were observed during the spheroid co-culture period (4 to 10 days after A375-OKT3 seeding). It is possible that morphological differences may exist even between clones of the same lineage, and these morphological differences may provide another opportunity to uncover subtle differences between T cells ( Fig. 15 ).
A375-pKSQ367 스페로이드에 대한 TIL의 세포 독성을 동일한 시점에서 증가된 E:T 비율의 효과를 비교하여 평가하였다. TIL과 A375-pKSQ367 스페로이드를 공배양한 경우 EP 없음 및 SOCS1 편집 TIL에 의한 용량 의존적 사멸이 고친화성(도면에서 "A375-OKT3"로 표시됨)(공여자 1 및 2) 및 저친화성(도면에서 "A375-OKT3lt"로 표시됨)(공여자 1, 2, 3 및 4) 스페로이드 둘 다에 대해서 관찰되었다(도 16).The cytotoxicity of TILs on A375-pKSQ367 spheroids was assessed by comparing the effect of increased E:T ratio at the same time points. Coculture of A375-pKSQ367 spheroids with TILs resulted in dose-dependent killing by no-EP and SOCS1-edited TILs, both high-affinity (indicated as “A375-OKT3” in the figure) (donors 1 and 2) and low-affinity (indicated as “A375-OKT3” in the figure). A375-OKT3lt") (donors 1, 2, 3, and 4) were observed for both spheroids ( Figure 16 ).
A375-pKSQ367 고친화성(도면에서 "A375-pKSQ367"로 표시) 및 저친화성(도면에서 "A375-pKSQ367A375-pKSQ398"로 표시) 스페로이드에 대한 TIL의 세포 독성 역학의 차이는 동일한 시점에 남아 있는 고친화성 스페로이드와 저친화성 스페로이드의 크기를 비교하여 평가하였다. 본 발명자들은 공여자 1과 2에 의해 고친화성 스페로이드가 저친화성 스페로이드보다 더 빨리 사멸되는 것을 관찰하였다(도 17).The difference in the cytotoxic kinetics of TILs against A375-pKSQ367 high-affinity (indicated as “A375-pKSQ367” in the figure) and low-affinity (indicated as “A375-pKSQ367A375-pKSQ398” in the figure) spheroids is due to the difference in the cytotoxicity of TILs remaining at the same time point. The size of the igneous spheroid and the low-affinity spheroid were compared and evaluated. The present inventors observed that high-affinity spheroids were killed faster than low-affinity spheroids by donors 1 and 2 ( Figure 17 ).
A375 pKSQ367(A375-OKT3) 종양 세포가 TIL 첨가 전 4일 동안 3D 종양 스페로이드로서 성장된 도 17에서, SOCS1 편집 TIL은 편집되지 않은 대조군(EP 없음)보다 종양을 사멸시키는 더 큰 능력을 나타내었고, 1.25:1 비율에서 SOCS1 편집 TIL에 의해서 종양이 완전히 제거된 반면 편집되지 않은 대조군이 있는 웰에서는 잔류 종양이 인지된다. SOCS1 편집 TIL의 향상된 효능은 A375 pKSQ398(A375-OKT3lt) 세포가 3D 종양 스페로이드로 성장했을 때 관찰되었지만 차이는 더 높은 E:T 비율(5:1)에서 관찰된다.In Figure 17 , where A375 pKSQ367(A375-OKT3) tumor cells were grown as 3D tumor spheroids for 4 days prior to TIL addition, SOCS1 edited TILs displayed a greater ability to kill tumors than the unedited control (no EP). , at a 1.25:1 ratio, tumors were completely eliminated by SOCS1-edited TILs, whereas residual tumor was recognized in wells with unedited controls. Enhanced efficacy of SOCS1-edited TILs was observed when A375 pKSQ398(A375-OKT3lt) cells were grown as 3D tumor spheroids, but differences were observed at higher E:T ratios (5:1).
SOCS1 편집 TIL이 동일한 E:T에서 고친화성 A375-pKSQ367 스페로이드의 사멸 증가를 유도했는지 여부를 평가하였다. 공여자 2에서 SOCS1 편집 TIL에 의한 고친화성 A375-pKSQ367 스페로이드에 대한 세포 독성 증가가 관찰되었다. 이러한 영상을 공배양 5일 후에 캡처하였는데, 이는 A375-pKSQ367이 상이한 항종양 효력의 TIL을 구별할 수 있음을 입증하였다(도 18).We assessed whether SOCS1-edited TILs induced increased killing of high-affinity A375-pKSQ367 spheroids at the same E:T. In donor 2, increased cytotoxicity against high-affinity A375-pKSQ367 spheroids was observed by SOCS1-edited TILs. These images were captured after 5 days of co-culture, demonstrating that A375-pKSQ367 can distinguish TILs of different antitumor potency ( Figure 18 ).
SOCS1 편집 TIL이 저친화성 A375-pKSQ367 스페로이드의 사멸 증가를 유도했는지 여부를 평가하였다. 공여자 2, 3 및 4의 경우, 본 발명자들은 SOCS1 편집 TIL로부터의 A375-pKSQ367 저친화성 스페로이드에 대한 증가된 효력을 관찰하였다. 이러한 결과는 A375-pKSQ367 저친화성 스페로이드가 상이한 효력의 TIL 집단을 구별하는 감도를 증가시킨다는 것을 입증한다(도 19).We assessed whether SOCS1-edited TILs induced increased killing of low-affinity A375-pKSQ367 spheroids. For donors 2, 3 and 4, we observed increased potency against A375-pKSQ367 low affinity spheroids from SOCS1 edited TILs. These results demonstrate that A375-pKSQ367 low affinity spheroids increase the sensitivity to distinguish TIL populations of different potency ( Figure 19 ).
SOCS1 편집 TIL이 저친화성 A375-pKSQ367 스페로이드의 사멸을 증가시키는지 여부를 스페로이드 형광으로 평가하였다. A375-OKT3lt 세포를 96웰 초저부착 플레이트에 플레이팅하고 4일 동안 배양하여 스페로이드 형성을 허용하였다. 제4일에, SOCS1 편집 TIL 또는 대조군(예를 들어, 편집되지 않은) TIL을 해동시키고 다양한 효과기:표적(E:T) 비율로 스페로이드 배양물에 첨가하였다. SOCS1 편집 TIL 또는 대조군(예를 들어, 편집되지 않은) TIL에 의한 스페로이드의 세포독성을 스페로이드 형광 수준의 변화에 따라 InCucyte에 의해 모니터링하였다. SOCS1 편집 TIL은 E:T 비율이 증가함에 따라 저친화성 A375-pKSQ367 스페로이드의 사멸 증가를 나타냈다(도 20).Whether SOCS1-edited TILs increased the killing of low-affinity A375-pKSQ367 spheroids was assessed by spheroid fluorescence. A375-OKT3lt cells were plated in 96-well ultra-low attachment plates and cultured for 4 days to allow spheroid formation. On day 4, SOCS1 edited TILs or control (e.g., unedited) TILs were thawed and added to the spheroid cultures at various effector:target (E:T) ratios. Cytotoxicity of spheroids by SOCS1 edited TILs or control (e.g., unedited) TILs was monitored by InCucyte according to changes in spheroid fluorescence levels. SOCS1-edited TILs showed increased killing of low-affinity A375-pKSQ367 spheroids with increasing E:T ratio ( Figure 20 ).
실시예 6: IFN-γ 및/또는 IL-6 사이토카인 방출에 기초한 TIL 효력을 평가하기 위한 A375-pKSQ367 모델의 사용 Example 6: Use of the A375-pKSQ367 model to evaluate TIL potency based on IFN-γ and/or IL-6 cytokine release
TIL 효력은 세포독성 및/또는 사이토카인 방출에 기초하여 상청액에서 측정할 수도 있다. 저친화성 A375-pKSQ367 세포 3차원(3D) 스페로이드를 공배양 검정을 위한 표적 세포로 사용하여 세포독성 및 효과기 사이토카인 방출을 평가하였다. 단일 클론에서 생성된 고-(pKSQ367) 계통을 또한 하기에 기재된 바와 같이 사용할 수 있다.TIL potency may also be measured in the supernatant based on cytotoxicity and/or cytokine release. Low-affinity A375-pKSQ367 cell three-dimensional (3D) spheroids were used as target cells for coculture assays to evaluate cytotoxicity and effector cytokine release. High-(pKSQ367) lines generated from a single clone can also be used as described below.
A375-pKSQ367 고친화성 클론 및 저친화성 클론을 단일 세포 현탁액 및 3D 스페로이드 공배양 분석을 위해 열 불활성화 FBS 및 항생제가 보충된 DMEM에서 유지시켰다.A375-pKSQ367 high-affinity and low-affinity clones were maintained in DMEM supplemented with heat-inactivated FBS and antibiotics for single cell suspension and 3D spheroid coculture analysis.
A375-pKSQ367 3D 스페로이드 공배양의 경우 유사한 프로토콜을 따랐다:For A375-pKSQ367 3D spheroid co-culture a similar protocol was followed:
제-4일(3D 스페로이드 공배양의 경우에만): A375-pKSQ367을 FBS 및 항생제가 보충된 RPMI에서 계대배양하고 5,000 내지 10,000개의 생세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃ 5%CO2 인큐베이터 내부의 Incucyte 영상화 시스템으로 옮기고 스페로이드 형성을 촉진하기 위해 인큐베이션시켰다. 몇 시간마다 한 번씩 위상 및 적색 채널에서 4X 배율로 영상을 촬영한다. Day -4 (for 3D spheroid co-cultures only): A375-pKSQ367 was subcultured in RPMI supplemented with FBS and antibiotics and plated at a density of 5,000-10,000 viable cells/well. The plate was transferred to the Incucyte imaging system inside a 37°C 5%CO 2 incubator and incubated to promote spheroid formation. Images are taken at 4X magnification in the phase and red channels once every few hours.
제-1일: 냉동보존된 TIL을 해동시키고, 1회 세척한 후, 계수하고, TIL 배지(RPMI 1640과 AIM V의 1:1 혼합물, 인간 AB 혈청이 보충됨)에 ㎖당 3e6개의 생세포로 재현탁시켰다. IL-2를 첨가한다. 세포를 적절한 크기의 플라스크에 넣고 37℃ 5%CO2 인큐베이터에서 밤새 동안 정치시켰다. 단일 세포 현탁 검정을 위해서, A375-pKSQ367 세포를 5,000 내지 10,000개의 생세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. TIL을 첨가하기 전에 밤새 플레이트를 37℃ 5%CO2 인큐베이터 내부로 옮겼다. Day-1: Cryopreserved TIL were thawed, washed once, counted, and seeded in TIL medium (1:1 mixture of RPMI 1640 and AIM V supplemented with human AB serum) at 3e6 viable cells per ml. It was resuspended. Add IL-2. Cells were placed in a flask of appropriate size and left overnight in an incubator at 37°C and 5% CO 2 . For single cell suspension assays, A375-pKSQ367 cells were plated at a density of 5,000 to 10,000 viable cells/well. The plate was transferred inside a 37°C 5%CO 2 incubator overnight before adding TIL.
제0일: TIL을 세포 여과기를 통해 적절한 크기의 원뿔형 튜브로 여과하고 원심분리시키고, 계수하였다. A375-pKSQ367 스페로이드 및/또는 A375-pKSQ367 단일 세포 현탁액을 포함하는 플레이트를 인큐베이터에서 제거하였다. TIL을 20:1 내지 0.625:1의 효과기 세포 대 표적 세포(E:T) 비율로 첨가하였다. E:T 비율을 제0일의 살아있는 TIL(효과기) 계수치 및 A375-pKSQ367(표적) 초기 시딩 밀도에 기초하여 계산하였다. 일부 웰은 TIL이 첨가되지 않았으며 성장 제어 역할을 하였다. 플레이트를 검정에 적합한 경우 37℃ 5%CO2 인큐베이터 또는 37℃ 5%CO2 인큐베이터 내부의 Incucyte 영상화 시스템으로 옮기고 영상화를 계속하였다. Day 0: TILs were filtered through a cell strainer into appropriately sized conical tubes, centrifuged, and counted. Plates containing A375-pKSQ367 spheroids and/or A375-pKSQ367 single cell suspension were removed from the incubator. TILs were added at an effector cell to target cell (E:T) ratio of 20:1 to 0.625:1. E:T ratios were calculated based on day 0 live TIL (effector) counts and A375-pKSQ367 (target) initial seeding density. Some wells had no TIL added and served as growth controls. Plates were transferred to a 37°C 5%CO 2 incubator or an Incucyte imaging system inside a 37°C 5%CO 2 incubator as appropriate for the assay and imaging continued.
3D 스페로이드 검정: TIL의 첨가 후 제1일 내지 제2일 사이에 영상화를 중단하고 Incucyte에서 수집한 영상을 시각적으로 평가하여 분석을 수행하였다. A375-pKSQ367 스페로이드에 대한 TIL의 세포독성을 이 시점에서 증가된 E:T 비율의 효과를 동시에 수거된 상청액과 비교하여 평가하였다. IFNγ 및/또는 IL-6 생산 및 다른 사이토카인의 존재를 상청액에서 직접 검출하였다. TIL 세포독성을 평가하기 위한 대안적 접근법으로서, 표적 세포 용해 시 상청액으로 빠르게 방출되는 락테이트 데하이드로게나제의 수준을 또한 LDH-GloTM 세포독성 검정(Promega)을 사용하여 상청액에서 측정하였다. 3D Spheroid Assay: Imaging was stopped between the first and second days after addition of TIL and analysis was performed by visually evaluating the images collected in Incucyte. The cytotoxicity of TILs on A375-pKSQ367 spheroids was assessed by comparing the effect of increased E:T ratios at this time point with supernatants collected simultaneously. Production of IFNγ and/or IL-6 and the presence of other cytokines were detected directly in the supernatant. As an alternative approach to assess TIL cytotoxicity, the level of lactate dehydrogenase, which is rapidly released into the supernatant upon target cell lysis, was also measured in the supernatant using the LDH-Glo ™ cytotoxicity assay (Promega).
효력이 증가된 TIL은 단일 세포 현탁액 또는 스페로이드 공배양 검정에서 ELISA, MSD 또는 Luminex 검정으로 평가한 바와 같이 더 많은 양의 IFNγ 및 IL-6 사이토카인 생산을 생성하고/하거나 상청액에서 락테이트 데하이드로게나제의 측정 증가에 반영되는 바와 같이 더 큰 세포 독성을 나타내는 것으로 예측되었다.TILs with increased potency produce greater amounts of IFNγ and IL-6 cytokine production as assessed by ELISA, MSD, or Luminex assays in single cell suspension or spheroid co-culture assays and/or are produced by lactate dehydrogenase in the supernatant. It was predicted to exhibit greater cytotoxicity as reflected in increased measurements of genease.
저친화성 A375-pKSQ367 스페로이드와 공배양하여 성장된 SOCS1 편집 TIL이 IFNγ 및/또는 IL-6의 효력을 증가시켰는지 여부를 평가하였다. 저친화성 A375-pKSQ367 스페로이드와 공배양된 SOCS1 편집 TIL의 E:T 비율 증가는 IFNγ(도 21) 및 IL-6(도 22) 둘 다의 분비 증가를 나타내었다. SOCS1 편집 TIL은 모든 E:T 비율에 걸쳐 더 높은 수준의 두 사이토카인을 생성하였다.We assessed whether SOCS1-edited TILs grown in co-culture with low-affinity A375-pKSQ367 spheroids increased the potency of IFNγ and/or IL-6. Increased E:T ratio of SOCS1 edited TILs cocultured with low-affinity A375-pKSQ367 spheroids indicated increased secretion of both IFNγ ( Figure 21 ) and IL-6 ( Figure 22 ). SOCS1 edited TILs produced higher levels of both cytokines across all E:T ratios.
SOCS1 편집 TIL의 공배양 및 저친화성 A375-pKSQ367 공배양의 상청액은 또한 대조군 TIL과의 공배양에 비해 더 높은 수준의 락테이트 데하이드로게나제를 나타내었는데, 이는 더 많은 양의 A375-KSQ367 세포 사멸 및 락테이트 데하이드로게나제 방출로 이어지는 향상된 세포 독성과 일치한다(도 23 및 도 24)Supernatants of cocultures of SOCS1-edited TILs and low-affinity A375-pKSQ367 cocultures also showed higher levels of lactate dehydrogenase compared to cocultures with control TILs, which was consistent with higher amounts of A375-KSQ367 cell death. and enhanced cytotoxicity leading to lactate dehydrogenase release ( Figures 23 and 24 )
Claims (111)
TIL과 불멸화 세포를 공배양하는 단계로서, 상기 불멸화 세포는 T 세포를 활성화하는 분자를 포함하는, 상기 공배양하는 단계; 및
상기 TIL의 효력을 평가하는 단계
를 포함하는, 방법.As a method for evaluating the potency of tumor infiltrating lymphocytes (TIL),
co-culturing a TIL and an immortalized cell, wherein the immortalized cell comprises a molecule that activates a T cell; and
Steps to evaluate the effectiveness of the TIL
Method, including.
TIL 및 조작된 암 세포의 클론성 집단을 공배양하는 단계로서, 상기 조작된 암 세포는 항-CD3 항체 또는 항-CD3 항체 단편을 발현하는, 상기 공배양하는 단계; 및
상기 조작된 암 세포의 사멸 및/또는 생존성을 평가하는 단계
를 포함하는, 방법.A method of assessing the potency of tumor infiltrating lymphocytes (TIL), comprising:
co-culturing a clonal population of TILs and engineered cancer cells, wherein the engineered cancer cells express an anti-CD3 antibody or an anti-CD3 antibody fragment; and
Assessing death and/or viability of the engineered cancer cells
Method, including.
TIL, 불멸화 세포 및 T 세포를 활성화하고 상기 불멸화 세포에 결합하는 이중특이적 분자를 공배양하는 단계; 및
상기 TIL의 효력을 평가하는 단계
를 포함하는, 방법.A method of assessing the potency of tumor infiltrating lymphocytes (TIL), comprising:
co-culturing TILs, immortalized cells, and a bispecific molecule that activates and binds to T cells; and
Steps to evaluate the effectiveness of the TIL
Method, including.
다클론성 T 세포와 불멸화 세포를 공배양하는 단계로서, 상기 불멸화 세포는 T 세포를 활성화하는 분자를 포함하는, 상기 공배양하는 단계; 및
상기 다클론성 T 세포의 효력을 평가하는 단계
를 포함하는, 방법.As a method for evaluating the potency of polyclonal T cells,
co-culturing a polyclonal T cell and an immortalized cell, wherein the immortalized cell comprises a molecule that activates a T cell; and
Evaluating the effectiveness of the polyclonal T cells
Method, including.
다클론성 T 세포, 불멸화 세포 및 T 세포를 활성화하고 상기 불멸화 세포에 결합하는 이중특이적 분자를 공배양하는 단계; 및
상기 다클론성 T 세포의 효력을 평가하는 단계
를 포함하는, 방법.As a method for evaluating the potency of polyclonal T cells,
co-culturing polyclonal T cells, immortalized cells, and a bispecific molecule that activates the T cells and binds to the immortalized cells; and
Evaluating the effectiveness of the polyclonal T cells
Method, including.
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