KR20240051700A - Enrichment method of glycoprotein using boronic acid functionalized gold nanoclusters and analysis method of disease-specific glycoprotein comprising the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 보론산 기능화된 금 나노클러스터를 이용하여 향상된 농축효율을 나타내며 비특이성 결합이 최소화된 당단백질의 농축방법을 제공하며, 상기 당단백질의 농축방법을 포함하는 질병 특이성 당단백질의 분석방법은 정상군과 비교하여 환자군의 상이한 당단백질을 파악하여 질병 진단에 용이하게 이용될 수 있다.The present invention provides a method for concentrating glycoproteins with improved enrichment efficiency and minimal non-specific binding using boronic acid-functionalized gold nanoclusters, and a method for analyzing disease-specific glycoproteins including the method for enriching glycoproteins. It can be easily used for disease diagnosis by identifying different glycoproteins in the patient group compared to the normal group.
Description
본 발명은 보론산 기능화된 금 나노클러스터를 이용하는 당단백질의 농축방법 및 이를 포함하는 질병 특이성 당단백질의 분석방법을 제공하는 것이다.The present invention provides a method for concentrating glycoproteins using boronic acid-functionalized gold nanoclusters and a method for analyzing disease-specific glycoproteins containing the same.
특정 개수의 금속 원자와 리간드로 구성되는 나노클러스터(nanocluster) 또는 거대원자(superatom)는 입자가 가지는 정전위상 전자(valence electron)가 새롭 게 정의되는 거대원자 오비탈 이론을 따르며, 이를 하나의 거대한 원자로 보겠다는 이론이다.A nanocluster or superatom, which is composed of a certain number of metal atoms and a ligand, follows the giant atom orbital theory, in which the valence electrons of the particle are newly defined, and will be viewed as one giant atom. is a theory.
나노클러스터는 원자 하나 또는 나노입자(nanoparticle) 대비 안정적이며, 금속적인 성질보다 분자적인 성질이 강해 나노입자와는 전혀 다른 광학적 및 전기화학적 성질을 가진다. 특히, 나노클러스터는 금속 원자의 개수, 금속 원자의 종류 및 리간드 등에 따라 광학적, 전기적 및 촉매적 성질이 민감하게 달라짐에 따라, 매우 다양한 분야에서 나노클러스터에 관한 연구가 활발하게 진행 중이다.Nanoclusters are more stable than single atoms or nanoparticles, and their molecular properties are stronger than their metallic properties, so they have completely different optical and electrochemical properties from nanoparticles. In particular, as the optical, electrical, and catalytic properties of nanoclusters vary sensitively depending on the number of metal atoms, type of metal atom, and ligand, etc., research on nanoclusters is actively underway in a wide variety of fields.
한편, 질병의 진단을 위해 혈액 및 소변과 같은 인간의 체액을 분석하면 비정상 및 정상 상태에서 각각 다르게 발현하는 단백질을 파악할 수 있으며, 이를 바이오마커로 분리하고 분석하는 방법은 종양, 면역 반응 및 혈관 질환 등의 병리적인 신체의 상태를 인지하는데 있어 유용하다.Meanwhile, by analyzing human body fluids such as blood and urine for the diagnosis of diseases, proteins that are expressed differently in abnormal and normal states can be identified, and methods of separating and analyzing these into biomarkers can be used to treat tumors, immune responses, and vascular diseases. It is useful in recognizing pathological physical conditions such as:
상기 비정상 상태에서 다르게 발현하는 단백질은 당쇄화 또는 당화된 단백질로, 단백질의 당쇄화 또는 당화는 질병으로 인한 비정상적 작용과 연관이 있으며, 이러한 당단백질을 파악하면 특이 질병에 대한 바이오마커로 이용될 수 있어 이에 대한 기술개발이 진행되고 있다.Proteins that express differently in the abnormal state are glycosylated or glycosylated proteins. Glycosylation or glycosylation of proteins is associated with abnormal functions caused by diseases. Identifying these glycoproteins can be used as biomarkers for specific diseases. Technology development for this is in progress.
그러나 혈청 내에 상기 바이오마커로서 의미가 있는 단백질 외의 다수의 단백질로 인하여 미량 존재하는 바이오마커를 분석하는 것은 매우 어려우며, 따라서 혈청 단백질로부터 바이오마커로 의미를 가질 수 있는 당단백질을 분리하고 농축하는 것은 상당히 중요한 문제로 되고 있다.However, it is very difficult to analyze trace amounts of biomarkers in serum due to the large number of proteins other than those meaningful as biomarkers, and therefore, it is quite difficult to separate and concentrate glycoproteins that may be meaningful as biomarkers from serum proteins. It is becoming an important issue.
이러한 당쇄화 또는 당화된 단백질을 분리하고 농축하는 기존의 방법으로는 친수성 상호작용을 통한 액체크로마토그래피를 이용하거나, 렉틴을 이용하는 방법, 킬레이트 상호작용을 이용하는 방법 및 공유결합을 형성하는 하이드라지드 또는 보론산을 이용하는 방법으로 크게 나누어 볼 수 있다. 이러한 종래의 분리 및 농축방법은 당에 대한 특이성의 부족하거나, N-, O- 당단백체의 포괄적인 농축의 불가능하거나, 농축과정에서 당 또는 당쇄구조가 변형되어 구조정보의 소실 등의 문제점이 있어 이를 개선할 수 있는 당단백체의 분리 및 농축방법이 필요한 실정이다.Existing methods for separating and concentrating such glycosylated or glycosylated proteins include using liquid chromatography through hydrophilic interaction, using lectins, methods using chelate interactions, and hydrazide or covalent bond forming methods. It can be roughly divided into methods using boronic acid. These conventional separation and concentration methods have problems such as lack of specificity for sugars, the impossibility of comprehensive enrichment of N- and O- glycoproteins, or loss of structural information due to deformation of the sugar or sugar chain structure during the concentration process. There is a need for methods for separating and concentrating glycoproteins that can improve this.
본 발명의 목적은 보론산 기능화된 금 나노클러스터를 이용하여 향상된 특이성과 우수한 농축효율을 나타내는 당단백질의 농축방법을 제공하는 것이다.The purpose of the present invention is to provide a method for enriching glycoproteins that exhibits improved specificity and excellent enrichment efficiency using boronic acid-functionalized gold nanoclusters.
본 발명의 또 다른 목적은 보론산 기능화된 금 나노클러스터를 이용하는 당단백질의 농축방법을 포함하는 질병 특이성 당단백질의 분석방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for analyzing disease-specific glycoproteins, including a method for concentrating glycoproteins using boronic acid-functionalized gold nanoclusters.
본 발명은 보론산 기능화된 금 나노클러스터를 이용하는 당단백질의 농축방법을 제공하며, 구체적으로 상기 당단백질의 농축방법은 a) 하기 화학식 1로 표시되는 금 나노클러스터를 당단백질을 포함하는 시료와 혼합하는 단계; b) 당단백질과 복합화된 금 나노클러스터를 분리하는 단계; 및 c) 당단백질과 금 나노클러스터를 분리하는 단계;를 포함할 수 있다.The present invention provides a method for concentrating glycoproteins using boronic acid-functionalized gold nanoclusters. Specifically, the method for concentrating glycoproteins includes: a) mixing gold nanoclusters represented by the following formula (1) with a sample containing glycoproteins; steps; b) separating the gold nanocluster complexed with the glycoprotein; and c) separating the glycoprotein and the gold nanocluster.
[화학식 1][Formula 1]
[상기 화학식 1에서,[In Formula 1 above,
L1은 3가 연결기이고;L 1 is a trivalent linking group;
상기 3가 연결기는 -O-, -C(=O)-, -C(=O)O-, -NH- 및 -C(=O)NH-에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 연결기를 포함하며;The trivalent linking group includes one or two or more linking groups selected from -O-, -C(=O)-, -C(=O)O-, -NH-, and -C(=O)NH-;
R1은 각각 독립적으로 -OH 또는 이며;R 1 is each independently -OH or and;
y 단위 중 상기 R1의 적어도 하나 이상은 이고;At least one of the y units of R 1 is ego;
R2는 각각 독립적으로 수소 또는 -C(=O)O-R11Ar1이며;R 2 is each independently hydrogen or -C(=O)OR 11 Ar 1 ;
y 단위 중 상기 R2의 적어도 하나 이상은 -C(=O)O-R11Ar1이고;Among y units, at least one of R 2 is -C(=O)OR 11 Ar 1 ;
R11은 C1-C20알킬렌이며,R 11 is C1-C20 alkylene,
Ar1은 C6-C30의 아릴이고;Ar 1 is aryl of C6-C30;
X는 10 내지 400의 정수이며;X is an integer from 10 to 400;
Y는 10 내지 100의 정수이다.]Y is an integer from 10 to 100.]
상기 L1은 -OH, -COOH 및 -NH2에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 치환기를 갖는 것일 수 있다.The L 1 may have one or more substituents selected from -OH, -COOH and -NH 2 .
또한 상기 화학식 1의 L1은 하기 화학식 2 또는 3으로 표시되는 3가 연결기일 수 있다.Additionally, L 1 in Formula 1 may be a trivalent linking group represented by Formula 2 or 3 below.
[화학식 2][Formula 2]
[화학식 3][Formula 3]
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 화학식 1의 R11은 C1-C5알킬렌이며; Ar1은 C6-C20의 아릴일 수 있다.R 11 in Formula 1 according to an embodiment of the present invention is C1-C5 alkylene; Ar 1 may be C6-C20 aryl.
일 실시예에 따른 상기 화학식 1의 x는 18, 22, 25, 38, 67, 102, 144 또는 333이며; y는 14, 18, 24, 35, 44, 60 또는 79일 수 있다.In Formula 1 according to one embodiment, x is 18, 22, 25, 38, 67, 102, 144, or 333; y can be 14, 18, 24, 35, 44, 60 or 79.
또한 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 화학식 1의 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 이며; y 단위 중 상기 R2는 적어도 하나 이상은 일 수 있다.In addition, R 2 in Formula 1 according to an embodiment of the present invention is each independently hydrogen or and; Among y units, R 2 is at least one It can be.
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 금 나노클러스터의 입자크기는 1 내지 10 nm일 수 있다.The particle size of the gold nanoclusters represented by Formula 1 of the present invention may be 1 to 10 nm.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 b)단계의 분리는 3k 내지 30k Da의 분자량 차단도(molecular weight cutoff, MWCO)를 가지는 한외여과막을 이용하는 것일 수 있다.The separation in step b) according to an embodiment of the present invention may be performed using an ultrafiltration membrane having a molecular weight cutoff (MWCO) of 3k to 30k Da.
또한 상기 a)단계 및 b)단계는 염기성 용액에서 수행되는 것일 수 있으며, 상기 c)단계는 산성 용액에서 수행되는 것일 수 있다.Additionally, steps a) and b) may be performed in a basic solution, and step c) may be performed in an acidic solution.
본 발명의 일 실시예에 따른 당단백질을 포함하는 시료는 세포, 세포배양액, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 소변, 뇌척수액, 난포액, 모유, 수정체액, 췌액 또는 이들의 가수분해된 폴리펩티드일 수 있으며, 상기 가수분해는 효소를 이용하여 수행되는 것일 수 있고, 상기 당단백질의 평균분자량은 1k 내지 200k Da일 수 있다.A sample containing a glycoprotein according to an embodiment of the present invention may be cells, cell culture fluid, blood, serum, plasma, saliva, urine, cerebrospinal fluid, follicular fluid, breast milk, lens fluid, pancreatic fluid, or hydrolyzed polypeptides thereof. , the hydrolysis may be performed using an enzyme, and the average molecular weight of the glycoprotein may be 1k to 200k Da.
본 발명의 일 실시예에 따른 당단백질의 농축방법은 아미노벤조보록졸(aminobenzoboroxole)과 당단백질의 시스-디올의 pH에 따른 결합 및 해리를 이용하는 것일 수 있다.The method for concentrating glycoproteins according to an embodiment of the present invention may use binding and dissociation of aminobenzoboroxole and cis-diol of glycoproteins depending on pH.
본 발명은 일 실시예에 따른 당단백질의 농축방법으로 농축된 당단백질을 질량분석하는 단계; 및 대조군에 비해 양이 유의적으로 변화한 펩티드를 탐색하는 단계;를 포함하는 질병 특이성 당단백질의 분석방법을 제공한다.The present invention includes the steps of performing mass spectrometry on a glycoprotein enriched by a glycoprotein enrichment method according to an embodiment; and a step of searching for peptides whose quantity is significantly changed compared to the control group.
본 발명의 보론산 기능화된 금 나노클러스터는 입자의 크기가 작아 용해도가 우수하고, 넓은 표면적을 가질 수 있어 우수한 당단백질 농축효율을 나타낼 수 있으며, 보론산 기능화된 금 나노클러스터는 원자적으로 규명된 구조를 가지고 있어 기존의 다른 고체상을 이용하는 당단백질 농축방법과 대비하여 비특이성 결합이 최소화될 수 있다.The boronic acid-functionalized gold nanocluster of the present invention has excellent solubility due to its small particle size and can have a large surface area, showing excellent glycoprotein concentration efficiency. The boronic acid-functionalized gold nanocluster has been atomically identified. Because it has a structure, non-specific binding can be minimized compared to glycoprotein concentration methods using other existing solid phases.
또한 보론산 기능화된 금 나노클러스터는 pH의 조건에 따라 시스-디올을 함유한 당단백질과 결합 및 해리를 조절할 수 있어 단순한 조작으로 당단백질의 농축을 수행할 수 있으며, 보론산 기능화된 금 나노클러스터를 재이용할 수 있어 보다 경제적으로 이용될 수 있다.In addition, boronic acid-functionalized gold nanoclusters can control binding and dissociation with cis-diol-containing glycoproteins depending on pH conditions, allowing concentration of glycoproteins through simple manipulation. It can be reused and used more economically.
본 발명의 보론산 기능화된 금 나노클러스터를 이용하는 당단백질의 농축방법을 포함하는 질병 특이성 당단백질의 분석방법은 정상군과 비교하여 환자군의 상이한 당단백질 펩티드 시퀀스, 당의 형태, 당의 구조를 파악하여 질병 진단에 용이하게 이용될 수 있다.The disease-specific glycoprotein analysis method, including the glycoprotein enrichment method using the boronic acid-functionalized gold nanocluster of the present invention, identifies the different glycoprotein peptide sequences, sugar forms, and sugar structures in the patient group compared to the normal group to identify the disease. It can be easily used for diagnosis.
도 1은 보론산 기능화된 금 나노클러스터를 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 당단백질 농축방법을 나타내는 모식도이다.
도 3은 실시예 1의 UV-vis-NIR 분광광도계를 이용하여 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 실시예 1의 질량분석기기를 이용하여 분석한 결과를 나타내는 도이다.Figure 1 is a schematic diagram showing boronic acid-functionalized gold nanoclusters.
Figure 2 is a schematic diagram showing the glycoprotein concentration method of the present invention.
Figure 3 is a diagram showing the results of analysis using the UV-vis-NIR spectrophotometer of Example 1.
Figure 4 is a diagram showing the results of analysis using the mass spectrometer of Example 1.
이하, 본 발명의 보론산 기능화된 금 나노클러스터를 이용하는 당단백질의 농축방법 및 이를 포함하는 질병 특이성 당단백질의 분석방법에 대하여 상세히 설명한다.Hereinafter, a method for concentrating glycoproteins using the boronic acid-functionalized gold nanocluster of the present invention and a method for analyzing disease-specific glycoproteins containing the same will be described in detail.
본 발명에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다.As used herein, the singular forms “a,” “an,” and “the” are intended to also include the plural forms, unless the context clearly dictates otherwise.
또한, 본 발명에서 사용되는 수치 범위는 하한치와 상한치와 그 범위 내에서의 모든 값, 정의되는 범위의 형태와 폭에서 논리적으로 유도되는 증분, 이중 한정된 모든 값 및 서로 다른 형태로 한정된 수치 범위의 상한 및 하한의 모든 가능한 조합을 포함한다. 본 발명의 명세서에서 특별한 정의가 없는 한 실험 오차 또는 값의 반올림으로 인해 발생할 가능성이 있는 수치범위 외의 값 역시 정의된 수치범위에 포함된다.In addition, the numerical range used in the present invention includes the lower limit and upper limit and all values within the range, increments logically derived from the shape and width of the defined range, all double-defined values, and the upper limit of the numerical range defined in different forms. and all possible combinations of the lower bounds. Unless otherwise specified in the specification of the present invention, values outside the numerical range that may occur due to experimental error or rounding of values are also included in the defined numerical range.
본 발명에 기재된, "포함한다"는 "구비한다", "함유한다", "가진다" 또는 "특징으로 한다" 등의 표현과 등가의 의미를 가지는 개방형 기재이며, 추가로 열거되어 있지 않은 요소, 재료 또는 공정을 배제하지 않는다.As used in the present invention, “comprises” is an open description with the same meaning as expressions such as “comprises,” “contains,” “has,” or “characterized by” elements that are not additionally listed; Does not exclude materials or processes.
본 발명에 기재된, “진단”은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다.As used herein, “diagnosis” means confirming the presence or characteristics of a pathological condition.
본 발명에 기재된, “바이오마커”란 질환군과 대조군(정상군)을 대조하여 진단할 수 있는 물질로 대조군(정상군)에 비하여 질환군에서 증가를 보이는 유기 생체 분자를 말한다. 상기 유기 생체 분자로는 예를 들면, 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 및 당 등이 포함된다.As described in the present invention, “biomarker” refers to an organic biomolecule that can be diagnosed by comparing a disease group and a control group (normal group) and shows an increase in the disease group compared to the control group (normal group). The organic biomolecules include, for example, polypeptides, proteins, nucleic acids, lipids, glycolipids, glycoproteins, and sugars.
이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다. 이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail. At this time, if there is no other definition in the technical and scientific terms used, they have meanings commonly understood by those skilled in the art to which this invention pertains, and the following description will not unnecessarily obscure the gist of the present invention. Descriptions of possible notification functions and configurations are omitted.
본 발명은 보론산 기능화된 금 나노클러스터를 이용하는 당단백질의 농축방법을 제공하며, 구체적으로 상기 당단백질의 농축방법은 a) 하기 화학식 1로 표시되는 금 나노클러스터를 당단백질을 포함하는 시료와 혼합하는 단계; b) 당단백질과 복합화된 금 나노클러스터를 분리하는 단계; 및 c) 당단백질과 금 나노클러스터를 분리하는 단계;를 포함할 수 있다.The present invention provides a method for concentrating glycoproteins using boronic acid-functionalized gold nanoclusters. Specifically, the method for concentrating glycoproteins includes: a) mixing gold nanoclusters represented by the following formula (1) with a sample containing glycoproteins; steps; b) separating the gold nanocluster complexed with the glycoprotein; and c) separating the glycoprotein and the gold nanocluster.
[화학식 1][Formula 1]
[상기 화학식 1에서,[In Formula 1 above,
L1은 3가 연결기이고;L 1 is a trivalent linking group;
상기 3가 연결기는 -O-, -C(=O)-, -C(=O)O-, -NH- 및 -C(=O)NH-에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 연결기를 포함하며;The trivalent linking group includes one or two or more linking groups selected from -O-, -C(=O)-, -C(=O)O-, -NH-, and -C(=O)NH-;
R1은 각각 독립적으로 -OH 또는 이며;R 1 is each independently -OH or and;
y 단위 중 상기 R1의 적어도 하나 이상은 이고;At least one of the y units of R 1 is ego;
R2는 각각 독립적으로 수소 또는 -C(=O)O-R11Ar1이며;R 2 is each independently hydrogen or -C(=O)OR 11 Ar 1 ;
y 단위 중 상기 R2의 적어도 하나 이상은 -C(=O)O-R11Ar1이고;Among the y units, at least one of R 2 is -C(=O)OR 11 Ar 1 ;
R11은 C1-C20알킬렌이며,R 11 is C1-C20 alkylene,
Ar1은 C6-C30의 아릴이고;Ar 1 is aryl of C6-C30;
X는 10 내지 400의 정수이며;X is an integer from 10 to 400;
Y는 10 내지 100의 정수이다.]Y is an integer from 10 to 100.]
상기 L1은 -OH, -COOH 및 -NH2에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 치환기를 갖는 것일 수 있다.The L 1 may have one or more substituents selected from -OH, -COOH and -NH 2 .
또한 상기 화학식 1의 L1은 하기 화학식 2 또는 3으로 표시되는 3가 연결기일 수 있다.Additionally, L 1 in Formula 1 may be a trivalent linking group represented by Formula 2 or 3 below.
[화학식 2][Formula 2]
[화학식 3][Formula 3]
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 화학식 1의 R11은 C1-C5알킬렌이며; Ar1은 C6-C20의 아릴일 수 있고, 구체적으로 상기 화학식 1의 R11은 C1-C3알킬렌이며; Ar1은 C6-C12의 아릴일 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 화학식 1의 R11은 메틸렌 또는 에틸렌이며; Ar1은 페닐일 수 있다.R 11 in Formula 1 according to an embodiment of the present invention is C1-C5 alkylene; Ar 1 may be C6-C20 aryl, and specifically, R 11 in Formula 1 is C1-C3 alkylene; Ar 1 may be C6-C12 aryl, and more specifically, R 11 in Formula 1 is methylene or ethylene; Ar 1 may be phenyl.
일 실시예에 따른 상기 화학식 1의 x는 18, 22, 25, 38, 67, 102, 144 또는 333이며; y는 14, 18, 24, 35, 44, 60 또는 79일 수 있다. 예를 들어, (x,y)일 때, (18,14), (22,18), (25,18), (38,24), (67,35), (102,44), (144,60) 또는 (333,79)를 만족하는 금 나노클러스터가 제조될 수 있으며, 세밀한 말단 결합 개수를 조절하기 위하여 바람직하게는 x는 18, 22 또는 25이며, y는 14 또는 18일 수 있으며, 예를 들어, (x,y)일 때, (18,14), (22,18) 또는 (25,18)를 만족할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In Formula 1 according to one embodiment, x is 18, 22, 25, 38, 67, 102, 144, or 333; y can be 14, 18, 24, 35, 44, 60 or 79. For example, when (x,y), (18,14), (22,18), (25,18), (38,24), (67,35), (102,44), (144) Gold nanoclusters satisfying ,60) or (333,79) can be produced, and in order to finely control the number of end bonds, x is preferably 18, 22, or 25, and y may be 14 or 18. For example, when (x,y), (18,14), (22,18), or (25,18) may be satisfied, but it is not limited thereto.
또한 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 화학식 1의 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 이며; y 단위 중 상기 R2는 적어도 하나 이상은 일 수 있다.In addition, R 2 in Formula 1 according to an embodiment of the present invention is each independently hydrogen or and; Among y units, R 2 is at least one It can be.
본 발명에 따른 보론산 기능화된 금 나노클러스터는 상기와 같은 구성을 가짐으로써, 물에 대한 용해도가 높아져 안정성이 향상되고 생체적합성이 뛰어날 수 있다. 또한 본 발명의 금 나노클러스터의 아민기가 상기 화학식 1의 R2로 보호되어 보다 구조적으로 단단하게 되고 따라서 나노클러스터의 안정성이 증대될 수 있다.By having the above-mentioned structure, the boronic acid-functionalized gold nanocluster according to the present invention can have increased solubility in water, improved stability, and excellent biocompatibility. In addition, the amine group of the gold nanocluster of the present invention is protected by R 2 of Chemical Formula 1, making it more structurally rigid, and thus the stability of the nanocluster can be increased.
또한 본 발명에 따른 금 나노클러스터는 원자적으로 규명된 표면 구조를 가져, 표면 작용기의 화학적 구조, 개수와 같은 정교한 조절이 가능하며, 따라서 당단백질과의 비특이성 결합이 현저하게 낮아질 수 있다.In addition, the gold nanocluster according to the present invention has an atomically determined surface structure, allowing precise control of the chemical structure and number of surface functional groups, and thus non-specific binding to glycoproteins can be significantly reduced.
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 금 나노클러스터의 입자크기는 1 내지 10 nm일 수 있으며, 구체적으로 1 내지 5 nm, 보다 구체적으로 1 내지 3 nm일 수 있다. 이와 같이 본 발명의 금 나노클러스터는 기존의 당단백질 농축에 이용되는 다른 고체상보다 작은 입자크기를 나타내어 용해도가 향상되고 넓은 표면적을 가져 우수한 농축효율을 나타낼 수 있다.The particle size of the gold nanocluster represented by Formula 1 of the present invention may be 1 to 10 nm, specifically 1 to 5 nm, and more specifically 1 to 3 nm. In this way, the gold nanocluster of the present invention has a smaller particle size than other solid phases used for concentrating existing glycoproteins, improves solubility, and has a large surface area, enabling excellent concentration efficiency.
본 발명의 일 실시예에 따른 당단백질의 농축방법은 아미노벤조보록졸(aminobenzoboroxole)과 당단백질의 시스-디올의 pH에 따른 결합 및 해리를 이용하는 것일 수 있다.The method for concentrating glycoproteins according to an embodiment of the present invention may use binding and dissociation of aminobenzoboroxole and cis-diol of glycoproteins depending on pH.
상기 아미노벤조보록졸(aminobenzoboroxole)과 당단백질의 시스-디올의 결합은 매우 특이적으로 결합될 수 있고, 결합 및 해리 후에도 당 또는 당쇄의 구조가 유지되어 특정 당 또는 당쇄를 나타내는 질병의 진단이 용이할 수 있다.The aminobenzoboroxole and the cis-diol of the glycoprotein can bind very specifically, and the structure of the sugar or sugar chain is maintained even after binding and dissociation, making it easy to diagnose diseases that exhibit a specific sugar or sugar chain. can do.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 a)단계의 금 나노클러스터의 농도는 1 내지 15 mg/mL일 수 있으며, 구체적으로 3 내지 12 mg/mL일 수 있고, 보다 구체적으로 5 내지 10 mg/mL일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The concentration of the gold nanoclusters in step a) according to an embodiment of the present invention may be 1 to 15 mg/mL, specifically 3 to 12 mg/mL, and more specifically 5 to 10 mg/mL. It may be, but is not limited to this.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 b)단계의 분리는 3k 내지 30k Da의 분자량 차단도(molecular weight cutoff, MWCO)를 가지는 한외여과막을 이용하는 것일 수 있으며, 구체적으로 5k 내지 17k Da의 분자량 차단도(molecular weight cutoff, MWCO)를 가지는 한외여과막, 보다 구체적으로 7k 내지 15k Da의 분자량 차단도(molecular weight cutoff, MWCO)를 가지는 한외여과막을 이용하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The separation in step b) according to an embodiment of the present invention may be performed using an ultrafiltration membrane having a molecular weight cutoff (MWCO) of 3k to 30k Da, specifically, a molecular weight cutoff of 5k to 17k Da. An ultrafiltration membrane having a molecular weight cutoff (MWCO), more specifically, an ultrafiltration membrane having a molecular weight cutoff (MWCO) of 7k to 15k Da may be used, but is not limited thereto.
일 실시예에 따른 당단백질의 농축방법에서 상기 a)단계 및 b)단계는 염기성 용액에서 수행되는 것일 수 있으며, 상세하게 pH7.5 내지 pH10.5인 용액에서 수행되는 것일 수 있고, 보다 상세하게 pH7 내지 pH10인 용액에서 수행되는 것일 수 있다.In the glycoprotein concentration method according to one embodiment, steps a) and b) may be performed in a basic solution, and may be performed in a solution of pH 7.5 to pH 10.5, in more detail. It may be performed in a solution with pH 7 to pH 10.
또한 상기 c)단계는 산성 용액에서 수행되는 것일 수 있으며, 상세하게 pH1 내지 pH4인 용액에서 수행되는 것일 수 있고, 보다 상세하게 pH2 내지 pH3인 용액에서 수행되는 것일 수 있다. Additionally, step c) may be performed in an acidic solution, specifically in a solution of pH 1 to pH 4, and more specifically in a solution of pH 2 to pH 3.
본 발명의 일 실시예에 따른 당단백질의 농축방법은 상기 c)단계를 수행한 후 산성용액을 추가로 첨가하는 과정을 더 포함할 수 있으며, 구체적으로 산성용액은 포름산 또는 아세트산일 수 있다. 이와 같이 산성용액을 천천히 첨가하면 보론산 기능화된 금 나노클러스터가 침전되고, 이로부터 용해되어있는 농축된 당단백질을 분리할 수 있다.The method for concentrating glycoprotein according to an embodiment of the present invention may further include adding an acidic solution after performing step c). Specifically, the acidic solution may be formic acid or acetic acid. When the acidic solution is slowly added like this, the boronic acid-functionalized gold nanoclusters are precipitated, and the concentrated dissolved glycoprotein can be separated from them.
본 발명에 따른 보론산 기능화된 금 나노클러스터는 아미노벤조보록졸(aminobenzoboroxole)과 당 또는 당쇄의 시스-디올과의 결합을 이용하는 것으로 pH의 조절만으로 용이하게 결합과 해리가 가능하며, 해리된 보론산 기능화된 금 나노클러스터의 재이용도 가능할 수 있어, 매우 경제적일 수 있다.The boronic acid-functionalized gold nanocluster according to the present invention uses the bond between aminobenzoboroxole and the cis-diol of a sugar or sugar chain, and can be easily bonded and dissociated just by adjusting the pH, and the dissociated boronic acid Reuse of functionalized gold nanoclusters may also be possible, making it very economical.
본 발명의 일 실시예에 따른 당단백질을 포함하는 시료는 세포, 세포배양액, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 소변, 뇌척수액, 난포액, 모유, 수정체액, 췌액 또는 이들의 가수분해된 폴리펩티드일 수 있으며, 상기 가수분해는 효소를 이용하여 수행되는 것일 수 있다.A sample containing a glycoprotein according to an embodiment of the present invention may be cells, cell culture fluid, blood, serum, plasma, saliva, urine, cerebrospinal fluid, follicular fluid, breast milk, lens fluid, pancreatic fluid, or hydrolyzed polypeptides thereof. , the hydrolysis may be performed using enzymes.
구체적으로 상기 효소는 아르기닌 C(Arg-C), 아스파르트산 N(Asp-N), 글루탐산 C(Glu-C), 라이신 C(Lys-C), 키모트립신(chymotrypsin) 및 트립신(trypsin)에서 선택되는 하나 또는 둘 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Specifically, the enzyme is selected from arginine C (Arg-C), aspartic acid N (Asp-N), glutamic acid C (Glu-C), lysine C (Lys-C), chymotrypsin, and trypsin. There may be one or more than one, but it is not limited thereto.
또한 본 발명의 일 실시예에 따른 농축방법에 이용되는 당단백질의 평균분자량은 1k 내지 200k Da일 수 있으며, 구체적으로 5k 내지 150k Da, 보다 구체적으로 10k 내지 100k Da 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, the average molecular weight of the glycoprotein used in the concentration method according to an embodiment of the present invention may be 1k to 200k Da, specifically 5k to 150k Da, and more specifically 10k to 100k Da, but is not limited thereto. no.
본 발명은 일 실시예에 따른 당단백질의 농축방법으로 농축된 당단백질을 질량분석하는 단계; 및 대조군에 비해 양이 유의적으로 변화한 펩티드를 탐색하는 단계;를 포함하는 질병 특이성 당단백질의 분석방법을 제공한다.The present invention includes the steps of performing mass spectrometry on a glycoprotein enriched by a glycoprotein enrichment method according to an embodiment; and a step of searching for peptides whose quantity is significantly changed compared to the control group.
상기 당단백질의 분석방법에서 농축된 당단백질을 전처리 없이 질량분석하는 단계를 수행하거나, 효소를 사용하여 가수분해를 수행한 후 질량분석하는 단계를 수행할 수 있다. 상기 효소는 아르기닌 C(Arg-C), 아스파르트산 N(Asp-N), 글루탐산 C(Glu-C), 라이신 C(Lys-C), 키모트립신(chymotrypsin) 및 트립신(trypsin)에서 선택되는 하나 또는 둘 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the glycoprotein analysis method, mass spectrometry can be performed on the concentrated glycoprotein without pretreatment, or hydrolysis using an enzyme and then mass spectrometry can be performed. The enzyme is one selected from arginine C (Arg-C), aspartic acid N (Asp-N), glutamic acid C (Glu-C), lysine C (Lys-C), chymotrypsin and trypsin. Or there may be two or more, but it is not limited thereto.
상기 농축된 당단백질을 질량분석하는 단계를 통하여 농축된 당단백질의 펩티드 시퀀싱이 가능하여 대조군과 질환군의 시퀀싱을 비교분석하여 당단백체학 기반의 바이오마커 발굴이 가능할 수 있으며, 이로부터 특정 질병 발생에 따른 특이적으로 당 또는 당쇄화된 당단백질의 정량적 변화를 추적하여 특정 질병에 대한 효율적인 진단이 가능할 수 있다.Through the step of mass spectrometry of the concentrated glycoprotein, peptide sequencing of the concentrated glycoprotein is possible, and it may be possible to discover a biomarker based on glycoproteomics by comparatively analyzing the sequencing of the control group and the disease group, and from this, it may be possible to identify a biomarker for the occurrence of a specific disease. Efficient diagnosis of a specific disease may be possible by tracking quantitative changes in specific sugars or glycoproteins.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명에 따른 보론산 기능화된 금 나노클러스터를 이용하는 당단백질의 농축방법 및 이를 포함하는 질병 특이성 당단백질의 분석방법에 대하여 더욱 상세히 설명한다.Hereinafter, the method for concentrating glycoproteins using boronic acid-functionalized gold nanoclusters according to the present invention and the method for analyzing disease-specific glycoproteins containing the same will be described in more detail through specific examples.
다만 하기 실시예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 하나의 참조일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 여러 형태로 구현될 수 있다. 또한 본 발명에서 설명에 사용되는 용어는 단지 특정 실시예를 효과적으로 기술하기 위함이고, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.However, the following examples are only a reference for explaining the present invention in detail, and the present invention is not limited thereto, and may be implemented in various forms. Additionally, the terms used in the description in the present invention are only intended to effectively describe specific embodiments and are not intended to limit the present invention.
[실시예 1] 보론산 기능화된 금 나노클러스터의 제조[Example 1] Preparation of boronic acid-functionalized gold nanoclusters
12.50 mL의 물에 용해 되어있는 0.25 mmol의 HAuCl4·3H2O 및 7.50 mL의 물에 용해되어 있는 0.37 mmol의 글루타티온(GS)을 230 mL의 물에 동시에 투입하고, 2 분 동안 교반시킨 후, 용액의 색상이 탁한 노란색으로 변하면 1 M NaOH를 넣어주어 pH를 12로 높여주었다. 상기 용액에 3.5 mM 농도의 NaBH4 0.1 mL를 한 방울씩 천천히 적하하였다. 이 후, 30 분 동안 교반 시킨 후, 1 M HCl을 이용하여 용액의 pH를 2.5로 낮춘 후, 상온에서 6 시간 동안 교반시켰다. 반응이 완결되면 회전 증발하여 용매를 완전히 제거한 후 10 mL의 물에 녹이고 12 mL의 이소프로판올을 투입하여 생기는 고체를 원심분리기를 이용하여 침전시키는 재결정과정을 통하여 Au22GS18 나노클러스터를 수득하였다.0.25 mmol of HAuCl 4 ·3H 2 O dissolved in 12.50 mL of water and 0.37 mmol of glutathione (GS) dissolved in 7.50 mL of water were simultaneously added to 230 mL of water and stirred for 2 minutes. When the color of the solution changed to cloudy yellow, 1 M NaOH was added to increase the pH to 12. 0.1 mL of NaBH 4 at a concentration of 3.5 mM was slowly added dropwise to the solution. After stirring for 30 minutes, the pH of the solution was lowered to 2.5 using 1 M HCl, and then stirred at room temperature for 6 hours. When the reaction was completed, the solvent was completely removed by rotary evaporation, then dissolved in 10 mL of water, and 12 mL of isopropanol was added. Au 22 GS 18 nanoclusters were obtained through a recrystallization process in which the resulting solid was precipitated using a centrifuge.
제조된 10 mg의 Au22GS18 나노클러스터를 20 mL의 바이알에 담긴 1 mL의 증류수에 녹인 후, 1 mg의 NaHCO3를 첨가하였다. 20 μL의 CBz(Benzyl chloroformate)를 1 mL의 테트라하이드로퓨란(THF)에 용해시킨 용액을 첨가하여 3시간 동안 교반시켰다. 상기 투입 비율은 CBz/Au22=270으로 GS 1개 당 CBz 10배의 조성비로 투입된 것이다. 이 후, 반응하지 않은 CBz(Benzyl chloroformate)는 3k Da의 탈이온 컬럼(desalting column)을 통해 제거하여 Au22-CBz18 나노클러스터를 얻었다.10 mg of the prepared Au 22 GS 18 nanocluster was dissolved in 1 mL of distilled water in a 20 mL vial, and then 1 mg of NaHCO 3 was added. A solution of 20 μL of CBz (Benzyl chloroformate) dissolved in 1 mL of tetrahydrofuran (THF) was added and stirred for 3 hours. The input ratio is CBz/Au 22 = 270, which means that 10 times the amount of CBz per GS. Afterwards, unreacted CBz (Benzyl chloroformate) was removed through a 3k Da deionizing column to obtain Au 22 -CBz 18 nanoclusters.
제조된 10 mg의 Au22-CBz18 나노클러스터를 20 mL의 바이알에 담긴 25 mM 농도의 PBS(phosphate buffered saline) 1 mL에 녹인 후, 21 mg의 NHS(N-hydroxyl succinimide)를 첨가하였다. 30.2 mg의 DCC(Dicyclohexylcarbodiimide)를 2 mL의 테트라하이드로퓨란(THF)에 용해시킨 용액을 첨가하여 30분 동안 교반시켰다. 33.9 mg의 BX(5-aminobenzoboroxole)을 3 mL의 테트라하이드로퓨란(THF)에 용해시킨 용액을 첨가하고, 0.3 mL의 물을 첨가하여 24시간 동안 교반시켰다. 이 후, 반응하지 않은 BX(5-aminobenzoboroxole)는 10k Da의 탈이온 컬럼(desalting column)을 통해 제거한 뒤, PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)를 150V에서 2시간 이상 실시하여 보론산 기능화된 금 나노클러스터인 Au22-CBz18-BX24 나노클러스터를 얻었다.10 mg of the prepared Au 22 -CBz 18 nanocluster was dissolved in 1 mL of 25 mM phosphate buffered saline (PBS) contained in a 20 mL vial, and then 21 mg of N-hydroxyl succinimide (NHS) was added. A solution of 30.2 mg of DCC (Dicyclohexylcarbodiimide) dissolved in 2 mL of tetrahydrofuran (THF) was added and stirred for 30 minutes. A solution of 33.9 mg of BX (5-aminobenzoboroxole) dissolved in 3 mL of tetrahydrofuran (THF) was added, 0.3 mL of water was added, and the mixture was stirred for 24 hours. Afterwards, unreacted BX (5-aminobenzoboroxole) was removed through a 10k Da desalting column, and then PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) was performed at 150 V for more than 2 hours to produce boronic acid-functionalized gold nanoclusters. Au 22 -CBz 18 -BX 24 nanoclusters were obtained.
[비교예 1] 금 나노클러스터의 제조[Comparative Example 1] Preparation of gold nanoclusters
12.50 mL의 물에 용해 되어있는 0.25 mmol의 HAuCl4·3H2O 및 7.50 mL의 물에 용해되어 있는 0.37 mmol의 글루타티온(GS)을 230 mL의 물에 동시에 투입하고, 2 분 동안 교반시킨 후, 용액의 색상이 탁한 노란색으로 변하면 1 M NaOH를 넣어주어 pH를 12로 높여주었다. 상기 용액에 3.5 mM 농도의 NaBH4 0.1 mL를 한 방울씩 천천히 적하하였다. 이 후, 30 분 동안 교반 시킨 후, 1 M HCl을 이용하여 용액의 pH를 2.5로 낮춘 후, 상온에서 6 시간 동안 교반시켰다. 반응이 완결되면 회전 증발하여 용매를 완전히 제거한 후 10 mL의 물에 녹이고 12 mL의 이소프로판올을 투입하여 생기는 고체를 원심분리기를 이용하여 침전시키는 재결정과정을 통하여 Au22GS18 나노클러스터를 수득하였다.0.25 mmol of HAuCl 4 ·3H 2 O dissolved in 12.50 mL of water and 0.37 mmol of glutathione (GS) dissolved in 7.50 mL of water were simultaneously added to 230 mL of water and stirred for 2 minutes. When the color of the solution changed to cloudy yellow, 1 M NaOH was added to increase the pH to 12. 0.1 mL of NaBH 4 at a concentration of 3.5 mM was slowly added dropwise to the solution. After stirring for 30 minutes, the pH of the solution was lowered to 2.5 using 1 M HCl, and then stirred at room temperature for 6 hours. When the reaction was completed, the solvent was completely removed by rotary evaporation, then dissolved in 10 mL of water, and 12 mL of isopropanol was added. Au 22 GS 18 nanoclusters were obtained through a recrystallization process in which the resulting solid was precipitated using a centrifuge.
제조된 10 mg의 Au22GS18 나노클러스터를 20 mL의 바이알에 담긴 1 mL의 증류수에 녹인 후, 1 mg의 NaHCO3를 첨가하였다. 20 μL의 CBz(Benzyl chloroformate)를 1 mL의 테트라하이드로퓨란(THF)에 용해시킨 용액을 첨가하여 3시간 동안 교반시켰다. 상기 투입 비율은 CBz/Au22=270으로 GS 1개 당 CBz 10배의 조성비로 투입된 것이다. 이 후, 반응하지 않은 CBz(Benzyl chloroformate)는 3k Da의 탈이온 컬럼(desalting column)을 통해 제거하여 Au22-CBz18 나노클러스터를 얻었다.10 mg of the prepared Au 22 GS 18 nanocluster was dissolved in 1 mL of distilled water in a 20 mL vial, and then 1 mg of NaHCO 3 was added. A solution of 20 μL of CBz (Benzyl chloroformate) dissolved in 1 mL of tetrahydrofuran (THF) was added and stirred for 3 hours. The input ratio is CBz/Au 22 = 270, which means that 10 times the amount of CBz per GS. Afterwards, unreacted CBz (Benzyl chloroformate) was removed through a 3k Da deionizing column to obtain Au 22 -CBz 18 nanoclusters.
[실험예 1][Experimental Example 1]
0.5 mg의 실시예 1을 0.1 M PBS 완충액(pH=9) 100 μL에 용해시킨 뒤, 표준 당펩티드인 Vancomycin 1.3 mg을 첨가하고 상온에서 30 분 동안 incubation시킨다. 이후 10k MWCO 한외여과막을 이용하여 7 분 동안 4000rpm으로 원심분리를 3회 진행하여 당펩티드와 복합화된 금 나노클러스터를 분리시킨다. 분리된 당펩티드와 복합화된 금 나노클러스터를 ACN:DIW: TEA=50:49:1용액에 넣고 당단백질과 금 나노클러스터를 분리시키고, 0.1 % 포름산을 dropwise하여 금 나노클러스터를 침전시킨 뒤, 여과하고 탈염과정을 수행하여 농축된 당펩티드를 수득하였다.0.5 mg of Example 1 was dissolved in 100 μL of 0.1 M PBS buffer (pH=9), then 1.3 mg of Vancomycin, a standard glycopeptide, was added and incubated at room temperature for 30 minutes. Afterwards, centrifugation was performed three times at 4000 rpm for 7 minutes using a 10k MWCO ultrafiltration membrane to separate the gold nanocluster complexed with the glycopeptide. The gold nanocluster complexed with the separated glycopeptide was placed in ACN:DIW: TEA=50:49:1 solution, the glycoprotein and gold nanocluster were separated, 0.1% formic acid was added dropwise to precipitate the gold nanocluster, and then filtered. Then, a desalting process was performed to obtain concentrated glycopeptides.
UV-vis-NIR 분광광도계(UV-3600, Shimadzu)를 이용하여 초기 당펩티드 및 농축된 당펩티드를 분석하여 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 35.9 %의 회수율을 나타내어 본 발명의 당단백질의 농축방법의 실효성을 확인할 수 있다.The initial and concentrated glycopeptides were analyzed using a UV-vis-NIR spectrophotometer (UV-3600, Shimadzu) and are shown in Figure 3. As shown in Figure 3, the recovery rate was 35.9%, confirming the effectiveness of the glycoprotein concentration method of the present invention.
[실험예 2][Experimental Example 2]
상기 실험예 1에서 Vancomycin을 사용하는 대신 Vancomycin 및 Teicoplanin을 각각 이용하여 실험예 1과 동일하게 농축된 당펩티드를 수득한 뒤, 질량분석기기(MALDI-TOF-MS, Autoflex Max, Bruker)를 이용하여 질량분석을 수행하여 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, Vancomycin 및 Teicoplanin이 분석되어 본 발명의 당단백질의 농축방법의 실효성을 확인할 수 있다.Instead of using Vancomycin in Experimental Example 1, Vancomycin and Teicoplanin were used respectively to obtain concentrated glycopeptides in the same manner as in Experimental Example 1, and then using a mass spectrometry device (MALDI-TOF-MS, Autoflex Max, Bruker) Mass spectrometry was performed and is shown in Figure 4. As shown in Figure 4, Vancomycin and Teicoplanin were analyzed to confirm the effectiveness of the glycoprotein concentration method of the present invention.
[실험예 3][Experimental Example 3]
상기 실험예 1에서 실시예 1을 사용하는 대신 실시예 1 및 비교예 1을, Vancomycin을 사용하는 대신 Vancomycin 및 Teicoplanin을 각각 이용하여 실험예 1과 동일하게 농축된 당펩티드를 수득한 뒤, UV-vis-NIR 분광광도계(UV-3600, Shimadzu)를 이용하여 초기 당펩티드 및 농축된 당펩티드를 분석하여 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다. In Experimental Example 1, instead of using Example 1, Example 1 and Comparative Example 1 were used, and instead of using Vancomycin, Vancomycin and Teicoplanin were used respectively to obtain concentrated glycopeptides in the same manner as in Experimental Example 1, and then UV- The initial glycopeptides and concentrated glycopeptides were analyzed using a vis-NIR spectrophotometer (UV-3600, Shimadzu), and the results are shown in Table 1 below.
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예에서 우수한 회수율을 나타내어 매우 향상된 농축효율을 나타내는 것을 알 수 있다. 또한 실시예 1의 금 나노클러스터 당 결합된 당펩티드 수의 결과에서 화합물내에 시스-디올을 1개 가지는 Vancomycin과 화합물내에 시스-디올을 4개 가지는 Teicoplanin의 결과값이 4배의 차이를 나타냄으로써 농축효율이 당펩티드의 결합위치의 수에 따라 정비례로 향상되는 것을 알 수 있으며, 따라서 본 발명의 보론산 기능화된 금 나노클러스터를 이용하는 당단백질의 농축방법이 우수한 선택성을 내타내는 것을 확인 할 수 있다.As shown in Table 1, it can be seen that the examples of the present invention showed excellent recovery rates and greatly improved concentration efficiency. In addition, in the results of the number of glycopeptides bound to each gold nanocluster in Example 1, the results of Vancomycin, which has one cis-diol in the compound, and Teicoplanin, which has four cis-diols in the compound, show a four-fold difference, showing concentration. It can be seen that the efficiency improves in direct proportion to the number of binding sites of the glycopeptide, and thus it can be confirmed that the glycoprotein concentration method using the boronic acid-functionalized gold nanocluster of the present invention exhibits excellent selectivity.
본 발명의 보론산 기능화된 금 나노클러스터는 작은 입자크기로 우수한 용해도와 넓은 표면적, 우수한 시스-디올과의 결합력을 가져 매우 향상된 농축효율을 나타낼 수 있으며, 원자적으로 규명된 표면 구조를 가지고 있어 정규한 표면 작용기의 조절이 가능하여 비특이성 결합을 최소화할 수 있고, pH에 따라 당 또는 당쇄의 형태나 구조의 변경없이 결합 및 해리가 가능하여 보다 명확한 질병의 진단이 가능하다.The boronic acid-functionalized gold nanoclusters of the present invention have a small particle size, excellent solubility, a large surface area, and excellent cis-diol binding ability, and can exhibit greatly improved concentration efficiency. It has an atomically determined surface structure, so it can be used as a regular By controlling one surface functional group, non-specific binding can be minimized, and binding and dissociation are possible without changing the form or structure of the sugar or sugar chain depending on pH, enabling a clearer diagnosis of the disease.
또한 본 발명의 보론산 기능화된 금 나노클러스터는 pH에 따라 용이하게 분리되고 재이용할 수 있어 보다 경제적이고 우수한 효율을 나타내는 당단백질의 농축방법으로 이용될 수 있다.In addition, the boronic acid-functionalized gold nanoclusters of the present invention can be easily separated and reused depending on pH, so they can be used as a more economical and highly efficient method for concentrating glycoproteins.
이상과 같이 본 발명에서는 특정된 사항들과 한정된 실시예 및 비교예에 의해 설명되었으나 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다.As described above, the present invention has been described with specific details and limited examples and comparative examples, but these are provided only to facilitate a more general understanding of the present invention, and the present invention is not limited to the above examples. Those skilled in the art can make various modifications and variations from this description.
따라서, 본 발명의 사상은 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등하거나 등가적 변형이 있는 모든 것들은 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.Accordingly, the spirit of the present invention should not be limited to the described embodiments, and the scope of the patent claims described later as well as all things that are equivalent or equivalent to the scope of this patent claim shall fall within the scope of the spirit of the present invention. .
Claims (15)
b) 당단백질과 복합화된 금 나노클러스터를 분리하는 단계; 및
c) 당단백질과 금 나노클러스터를 분리하는 단계;
를 포함하는 당단백질의 농축방법.
[화학식 1]
[상기 화학식 1에서,
L1은 3가 연결기이고;
상기 3가 연결기는 -O-, -C(=O)-, -C(=O)O-, -NH- 및 -C(=O)NH-에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 연결기를 포함하며;
R1은 각각 독립적으로 -OH 또는 이며;
y 단위 중 상기 R1의 적어도 하나 이상은 이고;
R2는 각각 독립적으로 수소 또는 -C(=O)O-R11Ar1이며;
y 단위 중 상기 R2의 적어도 하나 이상은 -C(=O)O-R11Ar1이고;
R11은 C1-C20알킬렌이며,
Ar1은 C6-C30의 아릴이고;
X는 10 내지 400의 정수이며;
Y는 10 내지 100의 정수이다.]a) mixing gold nanoclusters represented by Formula 1 below with a sample containing glycoprotein;
b) separating the gold nanocluster complexed with the glycoprotein; and
c) separating the glycoprotein and gold nanoclusters;
Method for concentrating glycoprotein comprising.
[Formula 1]
[In Formula 1 above,
L 1 is a trivalent linking group;
The trivalent linking group includes one or two or more linking groups selected from -O-, -C(=O)-, -C(=O)O-, -NH-, and -C(=O)NH-;
R 1 is each independently -OH or and;
At least one of the y units of R 1 is ego;
R 2 is each independently hydrogen or -C(=O)OR 11 Ar 1 ;
Among the y units, at least one of R 2 is -C(=O)OR 11 Ar 1 ;
R 11 is C1-C20 alkylene,
Ar 1 is aryl of C6-C30;
X is an integer from 10 to 400;
Y is an integer from 10 to 100.]
상기 L1은 -OH, -COOH 및 -NH2에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 치환기를 갖는 것인, 당단백질의 농축방법.According to paragraph 1,
Wherein L 1 has one or more substituents selected from -OH, -COOH and -NH 2 .
화학식 1의 L1은 하기 화학식 2 또는 3으로 표시되는 3가 연결기인, 당단백질의 농축방법.
[화학식 2]
[화학식 3]
According to paragraph 1,
A method for concentrating glycoproteins, wherein L 1 of Formula 1 is a trivalent linkage group represented by Formula 2 or 3 below.
[Formula 2]
[Formula 3]
상기 화학식 1의 R11은 C1-C5알킬렌이며;
Ar1은 C6-C20의 아릴인, 당단백질의 농축방법.According to paragraph 1,
R 11 in Formula 1 is C1-C5 alkylene;
Ar 1 is a C6-C20 aryl, method for concentrating glycoproteins.
상기 화학식 1의 x는 18, 22, 25, 38, 67, 102, 144 또는 333이며;
y는 14, 18, 24, 35, 44, 60 또는 79인, 당단백질의 농축방법.According to paragraph 1,
x in Formula 1 is 18, 22, 25, 38, 67, 102, 144, or 333;
y is 14, 18, 24, 35, 44, 60 or 79. Method for concentrating glycoproteins.
상기 화학식 1의 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 이며;
y 단위 중 상기 R2는 적어도 하나 이상은 인, 당단백질의 농축방법.According to paragraph 1,
R 2 in Formula 1 is each independently hydrogen or and;
Among y units, R 2 is at least one Method for concentrating phosphorus and glycoproteins.
상기 화학식 1로 표시되는 금 나노클러스터의 입자크기는 1 내지 10 nm인, 당단백질의 농축방법.According to paragraph 1,
A method for concentrating glycoproteins, wherein the particle size of the gold nanoclusters represented by Formula 1 is 1 to 10 nm.
상기 b)단계의 분리는 3k 내지 30k Da의 분자량 차단도(molecular weight cutoff, MWCO)를 가지는 한외여과막을 이용하는 것인, 당단백질의 농축방법According to paragraph 1,
The separation in step b) is a method of concentrating glycoproteins using an ultrafiltration membrane with a molecular weight cutoff (MWCO) of 3k to 30k Da.
상기 a)단계 및 b)단계는 염기성 용액에서 수행되는 것인, 당단백질의 농축방법.According to paragraph 1,
Step a) and step b) are carried out in a basic solution.
상기 c)단계는 산성 용액에서 수행되는 것인, 당단백질의 농축방법.According to paragraph 1,
Step c) is a method for concentrating glycoproteins, wherein the step is performed in an acidic solution.
상기 당단백질을 포함하는 시료는 세포, 세포배양액, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 소변, 뇌척수액, 난포액, 모유, 수정체액, 췌액 또는 이들의 가수분해된 폴리펩티드인, 당단백질의 농축방법.According to paragraph 1,
The sample containing the glycoprotein is a cell, cell culture fluid, blood, serum, plasma, saliva, urine, cerebrospinal fluid, follicular fluid, breast milk, lens fluid, pancreatic fluid, or hydrolyzed polypeptides thereof. Method of concentrating glycoprotein.
상기 가수분해는 효소를 이용하여 수행되는 것인, 당단백질의 농축방법.According to clause 11,
A method for concentrating glycoproteins, wherein the hydrolysis is performed using enzymes.
상기 당단백질의 평균분자량은 1k 내지 200k Da인, 당단백질의 농축방법.According to paragraph 1,
Method for concentrating glycoproteins, wherein the average molecular weight of the glycoprotein is 1k to 200k Da.
상기 당단백질의 농축방법은 아미노벤조보록졸(aminobenzoboroxole)과 당단백질의 시스-디올의 pH에 따른 결합 및 해리를 이용하는 것인, 당단백질의 농축방법.According to paragraph 1,
The method for concentrating glycoproteins uses pH-dependent binding and dissociation of aminobenzoboroxole and cis-diol of glycoproteins.
대조군에 비해 양이 유의적으로 변화한 펩티드를 탐색하는 단계;
를 포함하는 질병 특이성 당단백질의 분석방법.Performing mass spectrometry on the glycoprotein concentrated using the glycoprotein enrichment method according to claim 1; and
Searching for peptides whose quantity has changed significantly compared to the control group;
Analysis method of disease-specific glycoprotein comprising.
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