KR20240049331A - 인간 CD16a에 대한 항체 및 이의 변이체 - Google Patents
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Abstract
본 출원은 결합 분자를 제공한다. 결합 분자는 자연 살해(NK) 세포 표면에 발현된 CD16a(FcγRIIIA)에 특이적으로 결합되지만, CD16b(FcγRIIIB)에 결합되지 않는다. 또한 1차 인간 NK세포를 자극하고 활성화하기 위한 이러한 결합 분자의 용도를 개시한다.
Description
Fcγ 수용체(FcγR)는 면역글로불린G(IgG)의 Fc 영역에 결합되는 세포 표면 수용체이다. 이러한 수용체는 항체-항원 복합체를 형성하고, 이펙터 세포 반응에 관여한다. 예를 들어, 면역 복합체에 의한 크로스링킹되고 활성화된 Fcγ 수용체는 병원체의 식세포작용을 초래하여, 직접적인 세포독성을 통해 외래 세포 및 형질전환된 세포를 사멸시키고, 독성 물질을 제거하며 염증 반응을 유발할 수 있다. 항체 치료에서, IgG는 항원 결합 단편을 통해 표적을 인식하고, Fc도메인을 통해 백혈구에서 발현된 다양한 유형의 FcγR을 결합하여, 세포 매개 반응을 유발하여, 백혈병, 림프종, 종양, 자가면역질환 및 다른 질환을 치료한다.
Fcγ 수용체에는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII의 세 가지 종류가 있다. CD16으로도 지칭되는 FcγRIII는 항체 의존성 세포독성(ADCC)에 참여하는 것으로 알려진 일부 IgG의 Fc부분의 친화력이 낮은 수용체이며, NK세포 표적 세포 용해를 유발하는 역할을 하는 가장 전형적인 막 수용체이다. 인간 FcγRIII는 세포외 면역글로불린 결합 영역에서 96% 서열 동일성을 갖는 두 가지 아형, FcγRIIIA(CD16a) 및 FcγRIIIB(CD16b)로 존재한다. FcγRIIIA(CD16a)는 막횡단 수용체로서 대식세포, 비만 세포 및 NK세포에서 발현된다. 그러나, FcγRIIIB(CD16b)는 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 고정 수용체(FcγRIIIB아형)로 다형핵 과립구(PMN)에 존재하며, 종양 세포 사멸을 유발할 수 없다. 또한, FcγRIIIB는 가용성 수용체로 혈청에 존재하고, 항체에 결합된 후, 체내에서 면역 복합체를 형성하여 부작용을 일으킬 수 있다.
FcγR을 발현하는 이펙터 세포는 ADCC를 통해 종양 세포의 파괴에 참여하는 것으로 입증되었다. 이로 인해 FcγR 활성을 사용하는 암 치료를 위한 여러 가지 면역 치료 방법이 개발되었다. 선천 면역의 세포 매질로서, NK세포는 전문적인 세포 살해자이고, T세포와 달리, 추가적인 (사전) 자극 없이 구성형 활성화 상태로 존재하는 경우가 많다. 지금까지 생성된 대부분의 항CD16 항체는 두 가지 CD16아형인 FcγRIIIA 및 FcγRIIIB를 구별할 수 없다.
CD16b에 비해, CD16a에 특이적이고 원하는 치료 특징을 갖는 항CD16a 결합 분자 또는 항체가 필요하다.
일 양태에서, 본 개시는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공하고, 상기 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역을 포함하는 단량체 가변 도메인을 포함하되, 상기 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역은, 각각 SEQ ID NO: 2, 3 및 4; 또는 각각 SEQ ID NO: 6, 7 및 8; 또는 각각 SEQ ID NO: 14, 15 및 16; 또는 각각 SEQ ID NO: 14, 15 및 64; 또는 각각 SEQ ID NO: 14, 15 및 66; 또는 각각 SEQ ID NO: 18, 19 및 20; 또는 각각 SEQ ID NO: 26, 27 및 28; 또는 상기 CDR1 영역, 상기 CDR2 영역 및 상기 CDR3 영역의 어느 하나 또는 복수 중 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 변이체의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역은, 각각 SEQ ID NO: 2, 3 및 4; 또는 각각 SEQ ID NO: 6, 7 및 8; 또는 각각 SEQ ID NO: 18, 19 및 20; 또는 각각 SEQ ID NO: 26, 27 및 28; 또는 상기 CDR1 영역, 상기 CDR2 영역 및 상기 CDR3 영역의 어느 하나 또는 복수 중 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 변이체의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 인간 CD16a에 특이적으로 결합된다.
일부 실시예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 단일 도메인 항체(sdAb) 또는 VHH도메인을 포함하거나 단일 도메인 항체(sdAb) 또는 VHH도메인이다.
일부 실시예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 낙타과, 키메라, 인간 또는 인간화된 것이다.
일부 실시예에서, 단량체 가변 도메인은 SEQ ID NO: 1, 5, 13, 17, 25, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 및 62로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 단량체 가변 도메인은 SEQ ID NO: 1, 5, 13, 17, 25, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 및 62로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 단량체 가변 도메인은 SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 및 52로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 단량체 가변 도메인은 SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 및 52로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 단량체 가변 도메인은 SEQ ID NO: 42, 44, 45, 47 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 이들 실시예 중 일부에서, 단량체 가변 도메인은 SEQ ID NO: 42, 44, 45, 47 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시는 단량체 가변 도메인을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공하며, 상기 단량체 가변 도메인은 SEQ ID NO: 1, 5, 13, 17, 25, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 및 62로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 항체는 인간화 항체일 수 있고, 단량체 가변 도메인은 SEQ ID NO: 42, 44, 45, 47 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분 중 어느 하나에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 단량체 가변 도메인에 융합된 IgG Fc 영역을 추가로 포함할 수 있다. IgG Fc 영역은 인간 IgG4 Fc 영역 또는 마우스 IgG1 Fc 영역일 수 있다. 특정 실시예에서, 인간 IgG4 Fc 영역은 SEQ ID NO: 73의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 마우스 IgG1 Fc 영역은 SEQ ID NO: 74의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
추가 양태에서, 본 개시는 본 명세서에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 이중특이적 분자, 면역접합체 또는 키메라 항원 수용체를 제공한다.
추가 양태에서, 본 개시는 본 명세서에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분 또는 이의 이중특이적 분자, 면역접합체 또는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 추가 양태에서, 본 개시는 상기 핵산 분자를 함유하는 발현 벡터를 제공한다. 추가 양태에서, 본 개시는 상기 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다.
추가 양태에서, 본 개시는 본 명세서에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 또는 본 명세서에 따른 이중특이적 분자, 면역접합체 또는 키메라 항원 수용체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시예에서, 약물은 세포독성제를 추가로 포함할 수 있다. 추가 양태에서, 본 개시는 대상체에게 치료 유효량의 본 명세서에 따른 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 암 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 암 질환은 부신암, 방광암, 유방암, 대장암, 위암, 교모세포종, 신장암, 비소세포폐암, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 털세포 백혈병, 버킷 림프종, 미만성 거대 B세포 림프종, 여포성 림프종, 외투세포 림프종, 변연부 림프종, 비호지킨 림프종, 소림프구성 림프종, 다발성 골수종양, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 신장 세포암, 고환암 및 자궁암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 양태에서, 본 개시는 대상체에게 치료 유효량의 본 명세서에 따른 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 NK세포 증식을 촉진하는 방법을 제공한다.
도 1a-1 및 도 1a-2는 인간 CD16a 단백질에 대한 본 개시의 특정 실시예에서의 항체의 FACS 결합 곡선을 나타낸다.
도 2a-1 및 도 2a-2는 인간 CD16b 단백질에 대한 본 개시에서 특정 실시예의 항체의 FACS 결합 곡선을 나타낸다.
도 2b-1은 인간 CD16a 단백질에 대한 본 개시에서 특정 실시예의 항체의 FACS 결합 곡선을 나타낸다.
도 2b-2는 인간 CD16b 단백질에 대한 본 개시에서 특정 실시예의 항체의 FACS 결합 친화력을 나타낸다.
도 3은 NK세포의 세포독성 유발하는데 있어서 본 개시에서 특정 실시예의 항체의 세포독성 분석 결과를 나타낸다.
도 4a 및 도 4b는 인간 CD16a 단백질에 대한 본 개시의 특정 인간화 sdAb의 결합 친화력을 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 인간 CD16b 단백질에 대한 본 개시의 특정 인간화 sdAb의 결합 친화력을 나타낸다.
도 6a는 인간 CD16a 단백질에 대한 본 개시의 특정 인간화 sdAb의 FACS 결합 곡선 및 데이터를 나타내고; 도 6b는 인간 CD16b 단백질에 대한 이러한 인간화 sdAb의 FACS 결합 곡선 및 데이터를 나타낸다.
도 7a는 인간 CD16a 단백질에 대한 본 개시의 특정 인간화 sdAb의 FACS 결합 곡선 및 데이터를 나타내고; 도 7b는 인간 CD16b 단백질에 대한 이러한 인간화 sdAb의 FACS 결합 곡선 및 데이터를 나타낸다.
도 8a는 인간 CD16a 단백질에 대한 본 개시의 특정 인간화 sdAb의 FACS 결합 곡선 및 데이터를 나타내고; 도 8b는 인간 CD16b 단백질에 대한 이러한 인간화 sdAb의 FACS 결합 곡선 및 데이터를 나타낸다.
도 9a는 인간 CD16a 단백질에 대한 본 개시의 특정 인간화 sdAb의 FACS 결합 곡선 및 데이터를 나타내고; 도 9b는 인간 CD16b 단백질에 대한 이러한 인간화 sdAb의 FACS 결합 곡선 및 데이터를 나타낸다.
도 10a는 인간 CD16a 단백질에 대한 본 개시의 특정 인간화 sdAb의 FACS 결합 곡선 및 데이터를 나타내고; 도 10b는 인간 CD16b 단백질에 대한 이러한 인간화 sdAb의 FACS 결합 곡선 및 데이터를 나타낸다.
도 11a 및 도 11b는 NK92/CD16a-158V/V세포를 사용하여 진행되는 인간 CD16a 단백질에 대한 본 개시의 특정 인간화 sdAb의 락테이트 탈수소효소(LDH) 세포독성 분석 결과를 나타낸다.
도 12는 NK92/CD16a-158V/V세포를 사용하여 진행되는 본 개시의 특정 인간화 sdAb가 인간 CD16a 단백질에 대한 용량 의존적 반응의 역ADCC 생물검정에서의 락테이트 탈수소효소(LDH) 세포독성 분석 결과를 나타낸다.
도 13a 및 도 13b는 인간 CD16a 단백질에 대한 본 개시의 특정 인간화 sdAb의 FACS Cyno 결합 곡선 및 데이터를 나타낸다.
도 2a-1 및 도 2a-2는 인간 CD16b 단백질에 대한 본 개시에서 특정 실시예의 항체의 FACS 결합 곡선을 나타낸다.
도 2b-1은 인간 CD16a 단백질에 대한 본 개시에서 특정 실시예의 항체의 FACS 결합 곡선을 나타낸다.
도 2b-2는 인간 CD16b 단백질에 대한 본 개시에서 특정 실시예의 항체의 FACS 결합 친화력을 나타낸다.
도 3은 NK세포의 세포독성 유발하는데 있어서 본 개시에서 특정 실시예의 항체의 세포독성 분석 결과를 나타낸다.
도 4a 및 도 4b는 인간 CD16a 단백질에 대한 본 개시의 특정 인간화 sdAb의 결합 친화력을 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 인간 CD16b 단백질에 대한 본 개시의 특정 인간화 sdAb의 결합 친화력을 나타낸다.
도 6a는 인간 CD16a 단백질에 대한 본 개시의 특정 인간화 sdAb의 FACS 결합 곡선 및 데이터를 나타내고; 도 6b는 인간 CD16b 단백질에 대한 이러한 인간화 sdAb의 FACS 결합 곡선 및 데이터를 나타낸다.
도 7a는 인간 CD16a 단백질에 대한 본 개시의 특정 인간화 sdAb의 FACS 결합 곡선 및 데이터를 나타내고; 도 7b는 인간 CD16b 단백질에 대한 이러한 인간화 sdAb의 FACS 결합 곡선 및 데이터를 나타낸다.
도 8a는 인간 CD16a 단백질에 대한 본 개시의 특정 인간화 sdAb의 FACS 결합 곡선 및 데이터를 나타내고; 도 8b는 인간 CD16b 단백질에 대한 이러한 인간화 sdAb의 FACS 결합 곡선 및 데이터를 나타낸다.
도 9a는 인간 CD16a 단백질에 대한 본 개시의 특정 인간화 sdAb의 FACS 결합 곡선 및 데이터를 나타내고; 도 9b는 인간 CD16b 단백질에 대한 이러한 인간화 sdAb의 FACS 결합 곡선 및 데이터를 나타낸다.
도 10a는 인간 CD16a 단백질에 대한 본 개시의 특정 인간화 sdAb의 FACS 결합 곡선 및 데이터를 나타내고; 도 10b는 인간 CD16b 단백질에 대한 이러한 인간화 sdAb의 FACS 결합 곡선 및 데이터를 나타낸다.
도 11a 및 도 11b는 NK92/CD16a-158V/V세포를 사용하여 진행되는 인간 CD16a 단백질에 대한 본 개시의 특정 인간화 sdAb의 락테이트 탈수소효소(LDH) 세포독성 분석 결과를 나타낸다.
도 12는 NK92/CD16a-158V/V세포를 사용하여 진행되는 본 개시의 특정 인간화 sdAb가 인간 CD16a 단백질에 대한 용량 의존적 반응의 역ADCC 생물검정에서의 락테이트 탈수소효소(LDH) 세포독성 분석 결과를 나타낸다.
도 13a 및 도 13b는 인간 CD16a 단백질에 대한 본 개시의 특정 인간화 sdAb의 FACS Cyno 결합 곡선 및 데이터를 나타낸다.
일 양태에서, 본 개시는 FcγRIIIA(CD16a)에 대한 특이성을 나타내지만, FcγRIIIB(CD16b)에 특이적으로 결합되지 않는 항CD16 라마 단일 도메인 항체를 제공한다. 본 개시는 이러한 라마 sdAb에 기반한 인간화 sdAb 및 이의 융합 단백질을 추가로 제공한다. 본 개시의 항체(또는 결합 분자)는 결합될 때 NK세포를 활성화할 수 있고, 질환 관련 세포에 대한 이중특이적 또는 다중특이적 결합 분자의 성분으로 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 항체의 용어 “항원 결합 부분”은 항원(예를 들어, CD16a단백질)에 결합되는 능력을 보유하는 항체의 하나 또는 복수의 단편을 의미한다. 이는 단일 가변 도메인을 함유하는 중쇄 가변 영역, 및 이러한 도메인과 이에 화학적으로 연결된 다른 폴리펩티드 단편을 포함하는 큰 분자를 포함할 수 있다. 이러한 단일 사슬 항체는 또한 용어 “항원 결합 부분”에 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서에 사용된 “단리된 항체”는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체를 기본적으로 함유하지 않는 항체를 의미한다. CD16a 단백질에 특이적으로 결합되는 단리된 항체는 CD16a 단백질에 결합되지 않는 항체를 기본적으로 함유하지 않는다. 인간 CD16a에 결합되는 단리된 항체는 인간 CD16b 단백질 또는 다른 종으로부터 유래된 CD16a 단백질과 같은 다른 항원에도 결합될 수 있다. 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학 물질을 기본적으로 함유하지 않을 수도 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “CD16a 결합 단백질”, “CD16a 항체” 및 “항CD16a 항체”는 상호 교환적으로 사용되고, VL 및/또는 VH도메인과의 상호 작용을 통해 CD16a에 결합되는 다양한 분자를 의미한다(Fc 매개 결합과 상이함). CD16a 결합 단백질의 구현예는 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체(예를 들어, 2가닥의 중쇄 및 2가닥의 경쇄를 포함), 이의 단편(예를 들어, Fab, Fab′, F(ab′)2 및 Fv단편), 이작용성 또는 다작용성 항체, 단일 사슬 항체, 융합 단백질(예를 들어, 파지 디스플레이 융합 단백질), “미니바디（minibodies）”(예를 들어, 미국특허번호 5,837,821 참조) 및 VL 및/또는 VH도메인 또는 이의 단편을 포함하는 다른 항원 결합 단백질을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 “단일 클론 항체”는 단일 분자 조성을 갖는 항체 분자의 제제를 의미한다.
용어 “단일 도메인 항체” 또는 “sdAb”는 세 개의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 단일 단량체 가변 항체 도메인을 포함하는 단일 항원 결합 폴리펩티드를 의미하며, 이는 상응한 CDR 함유 폴리펩티드와 매칭되지 않고 항원에 결합될 수 있다. 일부 경우, 단일 도메인 항체는 낙타과 중쇄 항체(HCAb)로부터 조작된 것이고, HCAb의 VHH도메인 또는 단편이라고도 지칭된다. 단일 도메인 항체는 중쇄 항체만의 항원 결합 부분이다. VHH는 나노 항체라고도 지칭될 수 있다. 낙타과 sdAb는 알려진 가장 작은 항원 결합 항체 단편 중 하나이다(예를 들어, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-8 (1993); Greenberg et al., Nature 374:168-73 (1995); Hassanzadeh-Ghassabeh et al., Nanomedicine (Lond), 8:1013-26 (2013) 참조). 구현예로서, 본 개시의 구현예의 특정 단일 도메인 항체는 AR8866, AR8866-1.1, AR8804, AR8804-1.1 등과 같이 AR[숫자 및/또는 다른 기호]로 지칭된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, “인간 CD16a에 특이적으로 결합”되는 항체 또는 분자는 인간 CD16a 단백질에 결합되지만 비인간 CD16a 단백질의 단백질에 기본적으로 결합되지 않는 항체 또는 폴리펩티드 분자를 의미한다. 특히, 본 명세서에서 인간 CD16a에 특이적으로 결합되는 것으로 지칭되는 항체 또는 분자가 인간 CD16a에 대한 결합 친화력은 이가 인간 CD16b에 대한 결합 친화력보다 적어도 100배 높다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “융합 단백질(fused protein)”, “융합 단백질(fusion protein)”, “융합 항체(fusion antibody)” 또는 “융합 항체(fused antibody)”는 단일 도메인 항체(예를 들어, VHH) 부분 및 IgG 불변 영역Fc(예를 들어 인간 IgG4 Fc 영역 또는 마우스 IgG1 Fc 영역)를 동시에 포함하는 항체 분자를 의미하고, 여기서 이 두 부분은 예를 들어 재조합 방법에 의해 화학적으로 연결된다. 예를 들어, sdAb는 IgG의 천연 힌지 영역을 통해 IgG Fc 영역에 직접 융합될 수 있다. sdAb는 융합 항체에서 IgG Fc의 업스트림, 즉 sdAb 및 IgG Fc 영역이 힌지 영역에 의해 삽입되는 N말단에 더 접근한다. 융합된 항체 단백질은 그 구성 요소로 본 명세서에서 언급될 수 있고, 예를 들어, AR8776-sdAb-hIgG4Fc는 인간 IgG4 Fc 영역에 융합된 AR8776-sdAb로 구성된 융합 단백질 또는 항체를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “낙타과 항체”는 프레임워크 및 CDR 영역 모두가 낙타과 생식계열의 중쇄 항체 서열로부터만 유래된 가변 영역을 갖는 항체(또는 더욱 특히 단일 도메인 항체 또는 VHH단편)를 포함하도록 의도된다. 또한, 만약 상기 항체가 불변 영역을 함유하면, 상기 불변 영역은 낙타과 생식계열의 항체 서열로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 낙타과 항체는 낙타과 생식계열 항체 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 체외에서 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 도입된 돌연변이 또는 체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “낙타과 항체”는 다른 포유 동물 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 낙타과 프레임워크 서열에 이식된 항체를 포함하도록 의도되지 않는다.
용어 “키메라 항체”는 비인간(예를 들어, 낙타과)으로부터 유래된 유전 물질과 인간으로부터 유래된 유전 물질을 조합하여 제조한 항체를 의미한다. 또는 보다 일반적으로, 키메라 항체는 다른 종의 유전 물질로부터 생성된 상이한 부분을 갖는 항체를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “인간화 항체”는 비인간(예를 들어, 낙타과) 종으로부터 유래된 항체를 의미하고, 이의 단백질 서열은 천연적으로 발생하는 인간 항체 변이체와의 유사성을 증가하기 위해 변형되었다.
두 가지 또는 그 이상의 핵산 또는 단백질/펩티드와 관련하여 본 명세서에 사용된 용어 “동일성” 백분율은 최대 일치성을 위해 비교 및 정렬(필요하면, 갭 도입)할 때, 두 가지 또는 그 이상의 서열 또는 하위 서열이 동일한 특정 백분율의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 갖는 것을 의미하고, 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존적 아미노산 치환도 고려하지 않는다. 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 사용하거나 육안 검사를 통해 동일성 백분율을 측정할 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 정렬을 획득하기 위해 사용될 수 있는 다양한 알고리즘 및 소프트웨어는 당업계에 공지된 것이다. 여기에는 BLAST, ALIGN, Megalign, BestFit, GCG Wisconsin Package 및 이들의 변이체가 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “대상체”는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 “비인간 동물”은 포유 동물 및 비포유 동물과 같은 모든 척추동물을 포함한다. 일부 실시예에서, 대상체는 사람이다.
당업자는 다양한 방법/시스템을 사용하여 항체의 CDR을 정의한다. 이러한 시스템 및/또는 정의는 수년에 걸쳐 개발되고 개선되었으며, Kabat, Chothia, IMGT, AbM 및 Contact를 포함한다. Kabat 정의는 서열 가변성을 기반으로 하고, 일반적으로 사용된다. Chothia 정의는 구조적 고리 영역의 위치를 기반으로 한다. IMGT 시스템은 가변 도메인 구조 내의 서열 가변성과 위치를 기반으로 한다. AbM 정의는 Kabat와 Chothia 사이의 절충안이다. Contact 정의는 이용 가능한 항체 결정 구조 분석을 기반으로 한다. 예시적인 시스템은 Kabat 및 Chothia의 조합이다.
CD16a의 단백질 및 핵산 서열은 Genbank에 등록 번호 P08637(단백질) 및 X52645(핵산)로 보고되어 있고, SWISS-PROT에 등록 번호 CAA36870으로 보고되어 있다. CD16b의 단백질 및 핵산 서열은 Genbank에 등록 번호 O75015(단백질) 및 X16863(핵산)로 보고되어 있고, SWISS-PROT에 CAA34753으로 보고되어 있다.
인간 CD16a를 표적으로 하는 항체(또는 항인간 CD16a 항체)
일 양태에서, 본 개시는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공하고, 상기 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역을 함유하는 단량체 가변 도메인을 포함하되, 상기 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역은, 각각 SEQ ID NO: 2, 3 및 4; 또는 각각 SEQ ID NO: 6, 7 및 8; 또는 각각 SEQ ID NO: 14, 15 및 16; 또는 각각 SEQ ID NO: 14, 15 및 64; 또는 각각 SEQ ID NO: 14, 15 및 66; 또는 각각 SEQ ID NO: 18, 19 및 20; 또는 각각 SEQ ID NO: 26, 27 및 28; 또는 상기 CDR1 영역, 상기 CDR2 영역 및 상기 CDR3 영역의 어느 하나 또는 복수 중 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 변이체의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역은, 각각 SEQ ID NO: 2, 3 및 4; 또는 각각 SEQ ID NO: 6, 7 및 8; 또는 각각 SEQ ID NO: 18, 19 및 20; 또는 각각 SEQ ID NO: 26, 27 및 28; 또는 상기 CDR1 영역, 상기 CDR2 영역 및 상기 CDR3 영역의 어느 하나 또는 복수 중 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 변이체의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 인간 CD16a에 특이적으로 결합된다.
일부 실시예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 단일 도메인 항체(sdAb) 또는 VHH도메인을 포함하거나 단일 도메인 항체(sdAb) 또는 VHH도메인이다.
일부 실시예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 낙타과, 키메라, 인간 또는 인간화된 것이다.
일부 실시예에서, 단량체 가변 도메인은 SEQ ID NO: 1, 5, 13, 17, 25, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 및 62로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 단량체 가변 도메인은 SEQ ID NO: 1, 5, 13, 17, 25, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 및 62로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 단량체 가변 도메인은 SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 및 52로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 단량체 가변 도메인은 SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 및 52로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 단량체 가변 도메인은 SEQ ID NO: 42, 44, 45, 47 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 이들 실시예 중 일부에서, 단량체 가변 도메인은 SEQ ID NO: 42, 44, 45, 47 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시는 단량체 가변 도메인을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공하며, 상기 단량체 가변 도메인은 SEQ ID NO: 1, 5, 13, 17, 25, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 및 62로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 항체는 인간화 항체일 수 있고, 단량체 가변 도메인은 SEQ ID NO: 42, 44, 45, 47 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 단량체 가변 도메인에 융합된 IgG Fc 영역을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, IgG Fc 영역은 인간 IgG4 Fc 영역 또는 마우스 IgG1 Fc 영역일 수 있다. 특정 실시예에서, 인간 IgG4 Fc 영역은 SEQ ID NO: 73의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 마우스 IgG1 Fc 영역은 SEQ ID NO: 74의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
추가 양태에서, 본 개시는 본 명세서에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 이중특이적 분자, 면역접합체(또는 항체 약물 접합체) 또는 키메라 항원 수용체를 제공한다.
용어 “이중특이적 분자”는 예를 들어 다른 펩티드 또는 단백질(예를 들어, 다른 항체 또는 수용체 리간드)과 같은 적어도 하나의 다른 기능성 분자에 연결된 본 개시의 항체를 의미한다. 이중특이적 분자는 적어도 두 개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자를 가질 수 있고, 세 가지 또는 그 이상의 특이성을 갖는 분자를 포함할 수 있다.
용어 “면역접합체”는 본 개시의 항체가 치료제와 접합된 것을 의미하고, 상기 치료제는 예를 들어 세포독소, 알킬화제, DNA 작은 홈 결합제, DNA 삽입제, DNA 가교결합제, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 핵수출 억제제, 프로테아좀 억제제, 토포이소머라제I 또는 II억제제 등이다. ADC에서, 항체 및 치료제는 절단 가능한 링커(예를 들어 펩티딜기, 이황화물)를 통해 접합될 수 있다.
용어 “키메라 항원 수용체” 또는 “CAR”은 확정된 특이성을 면역 이펙터 세포(전형적으로 T세포)에 이식하고 T세포 기능을 향상시키는 조작된 수용체를 의미한다. 새로운 세대의 CAR은 단일 도메인 항체, 힌지 영역, 막횡단 도메인 및 세포내 신호 전달 도메인(주로 CD3-ζ의 세포내 도메인이고, 이는 T세포 활성화 신호의 주요 전달자에 하나 또는 복수의 공동 자극 도메인을 추가)을 포함하는 세포외 결합 도메인을 포함한다. CAR은 사이토카인 및 공동 자극 리간드와 같은 T세포 증폭, 지속성 및 항종양 활성을 향상시키는 인자를 추가로 가질 수 있다.
추가 양태에서, 본 개시는 본 명세서에 개시된 임의의 항체(또는 이의 항원 결합 부분) 또는 이중특이적 분자, 면역접합체 또는 키메라 항원 수용체의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포(예를 들어, CHO세포 또는 림프구, 또는 대장균과 같은 미생물, 및 효모와 같은 진균)는 본 개시의 항체, 바람직하게는 단일 도메인 항체를 생성하는데 사용될 수 있다.
단일 도메인 항체를 제조하는 방법은 이미 설명되었다. 예를 들어, Els Pardon et al., Nature Protocol, 2014; 9(3): 674를 참조한다. 단일 도메인 항체 제조의 일반적인 방법은 CD16a와 같은 표적 항원을 사용하여 낙타과 종을 면역화하고, 면역화된 동물로부터 림프구를 회수하며, cDNA를 제조하고, 표준 클로닝 방안을 사용하여 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하며, 3~4라운드에 걸친 파지 스크리닝을 사용하여 항원 특이적 접합제를 농축한다. 합성 방식을 통해 다양성을 VHH스캐폴드에 도입하여 다양한 단일 도메인 항체 라이브러리를 제조할 수도 있다.
단일 도메인 항체는 낙타과 단일 도메인 항체를 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 분리될 수도 있다. 파지 라이브러리의 스크리닝은 당업계에 공지된 다양한 기술에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, CD16a 단백질의 수용체 결합 도메인으로 코팅된 컬러 플레이트를 사용하여 점차 엄격해지는 여러 라운드의 선택을 통해 용액 패닝을 수행하여 낙타과 천연 단일 도메인 항체 라이브러리에서 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합되는 항체를 스크리닝한다. 분리물은 먼저 단일 도메인 항체로 발현되고 ELISA에 의해 수용체 결합 도메인에 대한 결합을 스크리닝할 수 있으며, 이후 선택된 분리물은 IgG4 또는 IgG1 Fc 영역에 연결된 단일 도메인 항체로 클로닝 및 발현할 수 있고, ELISA 및/또는 SPR에 의해 CD16a 단백질에 대한 결합 및 기능적 활성을 재분석하며, CHO 포유 동물 세포주에서 형질감염을 수행하여 단일 도메인 항체를 발현한다.
일 실시예에서, 본 개시의 단일 도메인 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 코딩하는 DNA는 표준 분자 생물학 기술에 의해 획득하고, 유전자가 전사 및 번역 조절 서열에 작동 가능하게 연결되도록 하나 또는 복수의 발현 벡터에 삽입된다. 용어 “작동 가능하게 연결”은 항체 유전자가 벡터에 연결되어, 벡터의 전사 및 번역 조절 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 예기된 기능을 발휘하도록 의도된다. 용어 “조절 서열”은 항체 유전자의 전사 및 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하도록 의도된다. 이러한 조절 서열은 예를 들어 Goeddel(Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990))에 설명되었다. 포유 동물 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열은 거대세포바이러스(CMV), 유인원 바이러스(Simian Virus)40(SV40), 아데노바이러스(예를 들어 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)) 및 폴리오마바이러스로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서와 같은 포유 동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소를 포함한다. 대안적으로, 유비퀴틴 프로모터 또는 β-글로빈 프로모터와 같은 비바이러스 조절 서열을 사용할 수 있다. 나아가, 조절 요소는 상이한 유래의 서열로 구성되고, 예를 들어 SV40 초기 프로모터 서열 및 인간 T세포 백혈병 1형 바이러스로부터 유래된 긴 말단 반복 서열을 함유하는 SRα 프로모터 시스템이다(Takebe et al., (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472). 사용된 발현 숙주 세포와 상용되는 발현 벡터 및 발현 제어 서열을 선택한다.
DNA를 코딩하는 항체를 발현 벡터에 삽입할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 촉진하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 신호 펩티드가 항체를 코딩하는 DNA의 아미노기 말단에 프레임워크 내로 연결되도록 항체를 코딩하는 DNA를 벡터에 클로닝할 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드(즉, 비면역글로불린으로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
sdAb(또는 sdAb-IgGFc)를 발현하기 위해, 표준 기술에 의해 항체 사슬을 코딩하는 하나 또는 복수의 발현 벡터를 숙주 세포 내로 형질감염시킬 수 있다. 상이한 형태의 용어 “형질감염”은 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등과 같이 외인성 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 도입하기 위해 일반적으로 사용되는 다양한 기술을 포괄하도록 의도된다. 본 개시의 항체의 발현을 위한 포유 동물 숙주 세포는 HEK293세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO세포), NSO골수종 세포, COS세포 및 SP2세포를 포함한다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 포유 동물 숙주 세포에 도입하는 경우, 숙주 세포를 충분한 시간 동안 배양하여 숙주 세포에서 항체의 발현을 허용하거나, 보다 바람직하게는 숙주 세포가 성장하는 배지 내로의 항체의 분비를 허용하여 항체를 생성한다. 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배지에서 항체를 회수할 수 있다.
약학 조성물 및 치료 방법
다른 양태에서, 본 개시는 하나 또는 복수의 본 발명의 항체, 또는 본 명세서에 개시된 이중특이적 분자, 면역접합체 또는 키메라 항원 수용체, 및 통상적인 기술의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 다른 항체, 세포독성제 또는 항종양제와 같은 약물과 같은 하나 또는 복수의 추가적인 약학적 활성 성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 예를 들어 다른 항암제, 다른 항염증제 등과의 조합 치료로 투여될 수도 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, “약학적으로 허용 가능한 담체”는 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정제를 포함한다. 이는 생리학적으로 상용하는 용매, 분산 매질, 코팅제, 항세균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 계면활성제, 증점제 또는 유화제, 고체 접착제, 분산 또는 현탁 보조제, 가용화제, 착색제, 향미제, 붕해제, 윤활제, 감미료, 방부제, 등장화제 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 적합한 담체의 선택은 당업자의 지식 범위 내에 있다.
상기 약학 조성물은 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 표피 및 다른 투여 경로에 적용될 수 있다. 투여 경로에 따라, 활성 성분은 한 가지 물질로 코팅되거나 다른 방식으로 한 가지 물질 또는 구조에 로딩되어, 활성 성분을 산 및 불활성화할 수 있는 다른 자연 조건의 작용으로부터 보호할 수 있다. 본 명세서에 사용된 문구 “비경구 투여”는 일반적으로 주사에 의한 장내 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 낭내, 안구내, 심장내, 진피내, 복막내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 낭하, 지주막하, 척추내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 대안적으로, 본 발명의 항체는 국소, 경피 또는 경점막 투여 경로와 같은 비경구 경로로 투여될 수 있고, 예를 들어 비강내, 경구, 질, 직장, 설하 또는 국소를 통해 투여될 수 있다.
다른 양태에서, 본 개시는 대상체에게 치료 유효량의 본 명세서에 개시된 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체(예를 들어, 인간 또는 비인간 포유 동물)의 면역 매개 질환(예를 들어 암)을 치료하는 방법을 제공한다. 암은 부신암, 방광암, 유방암, 대장암, 위암, 교모세포종, 신장암, 비소세포폐암, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 털세포 백혈병, 버킷 림프종, 미만성 거대 B세포 림프종, 여포성 림프종, 외투세포 림프종, 변연부 림프종, 비호지킨 림프종, 소림프구성 림프종, 다발성 골수종양, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 신장 세포암, 고환암 및 자궁암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
다른 양태에서, 본 개시는 대상체에게 치료 유효량의 본 명세서에 개시된 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 NK세포 증식을 촉진하는 방법을 제공한다.
대상체에게 조성물을 투여할 때, 원하는 최적의 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 투여량 방안을 조정할 수 있다. 대상체, 치료하고자 하는 질환 등에 기반하여 단일 볼루스 또는 분할 투여량으로 투여할 수 있다. 본 명세서에 사용된 투여량 단위 형태는 치료할 대상체에 대한 단위 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미한다. 각 단위에는 예정량의 활성 성분이 함유되고, 상기 활성 성분은 계산을 통해 필요한 약학적 담체와 결합하여 원하는 치료 효과를 발생하도록 한다. 서방형 제제를 사용할 수 있으며, 이 경우 투여 빈도를 줄여야 한다.
본 개시의 항체의 투여에 있어서, 투여량 범위는 대상체 체중의 약 0.0001 내지 100 mg/kg일 수 있고, 보다 일반적으로 0.01 내지 5 mg/kg이다. 예를 들어, 투여량은 0.3 mg/kg 체중, 1 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중, 5 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중 또는 1-10 mg/kg 범위 내에 있다. 적합한 치료 방안은 주 1회, 2주에 1회, 3주에 1회, 4주에 1회, 월 1회 등일 수 있다. 본 발명의 항CD16a 항체의 구현예의 투여량 방안은 정맥내 투여를 통한 1 mg/kg의 체중 또는 3 mg/kg의 체중을 포함할 수 있다.
“치료 유효량” 또는 본 발명의 CD16a 표적화 항체의 “치료 유효량”은 바람직하게는 질환 증상의 중증도 감소, 질환의 무증상 기간의 빈도 및/또는 지속 기간의 증가, 질환으로 인한 부상 또는 장애 가능성의 예방 또는 감소, 질환의 진행 억제 또는 지연을 초래한다. 예를 들어, 종양 보유 대상체의 치료에 있어서, 치료되지 않은 대상체에 비해, “치료 유효량”의 항체 조성물은 종양 성장을 적어도 약 20%, 보다 바람직하게는 적어도 약 40%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 60%, 여전히 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 억제할 수 있다.
구현예
이하의 구현예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 따라서 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이하의 구현예 및 상세한 설명은 예시로서 제공되며 한정으로서 제공되지 않는다.
구현예1: 항CD16a 라마 단일 도메인 항체(sdAb)의 생성
면역
현행 동물 보호 규례에 따라, 재조합 인간 CD16a-His 단백질(Acro Biosystems; 카탈로그 번호: CDA-H52S1)로 라마를 면역화하였다. 면역화를 위해, 항원은 PBS 용액의 형태로 투여되거나 항원을 CFA(완전 프로인트 보조제; 1차 면역화) 또는 IFA(불완전 프로인트 보조제; 추가 면역화)와 함께 에멀젼으로 조제된다. 항원을 경부에 피하 투여한다. 동물은 6회의 에멀젼 주사를 진행하되, CFA 에멀젼에 포함된 200 μg의 항원으로 1차 면역화를 수행한 후, 1주 간격으로 IFA 에멀젼에 포함된 100 μg의 항원으로 3회 추가 면역화를 수행하고, 이후 1주 간격으로 IFA 에멀젼에 포함된 50 μg의 항원으로 2회 주사하였다. 여러 라운드의 면역화 후, 100 ml의 혈액 샘플을 수집하였다. 라마 중쇄 항체(HCAb)의 유전적 공급원으로서, 구배 원심분리에 의해 혈액 샘플에서 말초 혈액 림프구(PBL)를 분리하였다. AFM13으로부터 유래된 CD16a 표적화 가변 단편(특허 번호: US 9,035,026 B2, Affirmed GMBH, 독일)을 양성 대조군(및 참조 항체)으로 인간 IgG4 또는 마우스 IgG1 형태에 통합시키고, 정상 인간 IgG4 또는 마우스 IgG1을 각각 동종형(isotype) 대조군으로 설정하였다.
파지 디스플레이 라이브러리 구축
제조사의 방안에 따라, TRIZOL 시약(Thermo Fisher, 카탈로그 번호 15596026)을 사용하여 단리된 림프구로부터 총 RNA를 추출하고, sdAb를 코딩하는 유전자 단편을 증폭시키기 위한 RT-PCR의 출발 물질로 사용하였다. 유전자 증폭을 위해, 제조사의 방안에 따라, PRIMESCRIPT 첫 번째 사슬 cDNA 합성 키트(Takara, 카탈로그 번호 6110A)를 사용하여, 올리고(dT)20 프라이머를 사용하여 단리된 RNA를 cDNA로 역전사시켰다. VHH단편을 증폭시키기 위해 6개의 정방향 및 2개의 역방향 특정 축퇴 프라이머를 설계하였다.
2단계 PCR 방법으로 VHH단편의 가변 영역을 증폭시켰다. 첫 번째 PCR의 DNA 산물을 두 번째 PCR에서 주형으로 사용하였다. VHH PCR 단편을 포함하는 증폭된 제2 PCR 산물을 겔 정제하고 효소로 소화한 후, 파지미드 플라스미드에 삽입하였다. 전기천공을 통해 재조합 플라스미드를 대장균 세포에 도입하고, 크기가 1 × 109보다 큰 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하였다. 표준 방안에 따라 라이브러리 파지를 제조하고, 여과 멸균 후 -80℃에서 스톡으로 보관하였다.
파지 디스플레이 패닝
구축된 파지 라이브러리는 인간 CD16a세포를 과발현하는 CHO-K1세포(ATCC; 카탈로그 번호: CCL-61)(Genscript에 의해 구축)로 스크리닝하거나, 먼저 인간 CD16b세포를 과발현하는 CHO-K1세포(Genscript에 의해 구축)로 카운터 스크리닝한 후, GenScript에서 개발한 표준 프로그램을 사용하여 인간 CD16a를 과발현하는 CHO-K1세포로 패닝을 수행한다. 적어도 두 라운드의 선택을 수행하고, 각 선택 출력의 농축 인자(대조군과 비교하여 용출액에 존재하는 파지의 개수), 다양성 및 CD16a 양성 CD16b 음성 또는 약한 클론의 비율을 분석하였다.
이러한 파라미터를 기반으로, 추가 스크리닝을 위해 최적의 선택적 클로닝을 선택하고, 높은 처리량 스크리닝을 위해 가용성 발현 벡터에 라이브러리로 서브클로닝되었다. sdAb 코딩 서열을 갖는 프레임워크에서, 벡터는C말단 His태그를 코딩하였다. 콜로니를 골라 96딥웰 플레이트(1 ml 부피)에서 성장시키고, IPTG 및 0.1% Triton을 첨가하여 상청액에서의 sdAb 발현을 유도하였다. 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)을 통해 상청액을 스크리닝하였다. 간략하게, 96웰 플레이트를 각각 0.5 μg/ml CD16a 및 CD16b 단백질로 코팅하고, 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션한 후, 3% MPBS로 차단하였다. 각 웰에 50 μl의 상청액을 첨가하여 1차 항체 인큐베이션을 수행하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 다음, 100 μl의 항VHH 2차 항체(Genscript; 카탈로그 번호: A01861)를 각 웰에 피펫팅하였다. 다음 플레이트를 실온(RT)에서 60 min 동안 인큐베이션하였다. 0.05% PBST로 세척한 후, 각 웰에 100 μl TMB를 첨가하였다. 다음 플레이트를 RT에서 15 min 동안 인큐베이션하고, 50 μl의 1 M HCL을 첨가하여 반응을 정지하였다. 450 nm에서 플레이트를 판독하였다.
sdAb-Fc 융합 단백질의 생성
항CD16a sdAb를 인간 IgG4(또는 마우스 IgG1) Fc 영역에 융합시켜 항CD16a sdAb-Fc 융합 단백질 작제물을 생성하였다. CHO-3E7 세포에서 일시적인 발현을 위해 작제물의 maxiprep을 제조하였다. 단백질A 아가로스 수지가 함유된 컬럼을 통과시키고, 크로마토그래피로 정제되고 발현된 항CD16a sdAb-Fc 융합 단백질을 정제하였다. 22개 분자를 생성하였다.
구현예2: 항CD16a sdAb의 체외 특성화
CD16a에 대한 항CD16a sdAb의 특이적 친화력
상술한 바와 같이, 인간 CD16은 두 가지 아형 CD16a 및 CD16b로 발현될 수 있고, 이들은 고도로 상동적이며, 이들의 세포외 면역글로불린 결합 영역은 96% 서열 동일성을 갖는다. 또한, CD16b는 가용성 수용체로 혈청에 존재할 수 있고, 항체에 결합된 후, 체내에서 면역 복합체를 형성하여 부작용을 유발할 수 있다. CD16a 특이적 항체는 질환 관련 세포에 대한 이중특이적 또는 다중특이적 항체 구축에 특히 유용하다. 이 경우, 항체는 주로 NK세포를 모집하고, 순환하는 가용성 CD16b에 의해 결합되지 않거나 호중구 또는 활성화된 호산구에 결합되어 NK세포 결합에서 전이된다.
CD16b에 대한 결합 특이성이 아닌, 인간 CD16a에 대한 22가지 sdAb의 결합 특이성을 확정하기 위하여, 인간 CD16a(Acro Biosystems; 카탈로그 번호: CDA-H52S1) 또는 CD16b(Acro Biosystems; 카탈로그 번호: CDB-H5227)를 ELISA 플레이트(0.5 μg/ml, 100 μl)에 4℃에서 밤새 사전 코팅하였다. 다음날, 웰을 3배 연속 희석된 sdAb 융합 단백질(hIgG4 Fc 영역을 갖고, SEQ ID NO: 73)(초기 농도 1.0 μg/ml)과 함께 인큐베이션한 후, HRP-접합 염소 항인간IgG(H+L)(Rockland)와 함께 인큐베이션하여 기질 TMB 발색 반응을 수행하였다. 450 nm에서의 광학 밀도 판독값을 사용하여 결합을 정량화하였다. 인간 CD16a에 대해 특이적 친화력을 나타내지만, CD16b에 대해서는 친화력이 없거나 무시할 수 있는 낮은 친화력을 갖는 sdAb를 추가로 스크리닝하였다. 결과(도 1a-1, 도 1a-2, 도 2a-1, 도 2a-2)에 따라, 총 7개의 sdAb 분자, 즉 AR8804, AR8820, AR8776, AR8875, AR8866, AR8887, AR8861(SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25)을 선택하여 추가로 검증하였다. 다음 이러한 선택된 앞쪽의 서열을 추가 연구를 위해 마우스 IgG1 Fc에 융합시켰다.
구현예3: sdAb의 NK세포독성 유발 효능
이 부분에서는, AR8776, AR8804, AR8820, AR8861, AR8866, AR8875 및 AR8887 sdAb를 마우스 IgG1 Fc 형태(SEQ ID NO: 74)에 재연결시키고, ELISA로 CD16a에 대한 친화력 특이성을 검증하였다. 간략하여, CD16a 결합 분석을 위해, 인간 CD16a(Acro Biosystems; 카탈로그 번호: CDA-H52S1)를 ELISA 플레이트(1 μg/ml, 100 μl)에 4℃에서 밤새 사전 코팅하였다. 다음날, 웰을 3배 연속 희석된 sdAb 융합 단백질(mIgG1 Fc 포함)(초기 농도는 1.0 μg/ml)과 함께 인큐베이션한 후, HRP-접합 염소 항마우스IgG(H+L)(Rockland; 카탈로그 번호: 610-103-121)와 함께 인큐베이션하여 기질 TMB 발색 반응을 수행하였다. CD16b 결합 분석을 위해, CD16b(Acro Biosystems; 카탈로그 번호: CDB-H5227)를 ELISA 플레이트(1 μg/ml, 100 μl)에 4℃에서 밤새 사전 코팅하였다. 다음날, 웰을 단일 투여량 1.0 μg/ml의 sdAb 융합 단백질(mIgG1 Fc 포함)과 함께 인큐베이션하여, HRP-접합 염소 항마우스IgG(H+L)(Rockland; 카탈로그 번호: 610-103-121)와 함께 인큐베이션하여 기질 TMB 발색 반응을 수행하였다. 재연결된 분자는 CD16a에 대한 친화력 특이성을 유지하였다(도 2b-1, 도 2b-2). AFM-CD16a-mIgG1(CD16a-mLCK-IgG1 또는 AFM13-CD16a-mIgG1로도 지칭)은 참조 대조군 샘플로 사용되었고, 마우스 IgG는 동종형 대조군으로 사용되었다. 11H1D3은 인간 CD16a에 대한 내부 mAb-마우스 IgG1 항체로서, 인간 CD16b에 대해 높은 친화력을 갖는 것으로 입증되었고, 본 실험에서 양성 샘플로 사용되었다. ELISA 실험 후 역ADCC 분석을 통해, NK세포의 세포독성을 유발하는 이러한 분자의 강도를 측정하였다. 간략하여, 10,000개의 인간NK-92 158 V/V세포를 5 μg/ml sdAb로 전처리된 마우스 P815 표적 세포(SailyBio, 상해)와 5:1의 E/T 비율로4시간 동안 공동 배양하였다. 다음, LDH 세포독성 키트(Roche)를 사용하여 특이적 용해의 비율을 계산하였다. AFM-CD16a-mIgG1(CD16a-mLCK-IgG1로도 지칭)은 참조 대조군 샘플로 사용되었고, 마우스 IgG는 동종형 대조군으로 사용되었다. 결과에 따르면, AR8887을 제외한 모든 sdAb가 모두 상당한 세포독성 유발 활성을 나타냈고, 그중 분자 AR8861, AR8866 및 AR8875는 참조 항체보다 우수한 세포독성 유발 활성을 나타냈다(도 3). 따라서, AR8804, AR8820, AR8861, AR8866 및 AR8875 분자를 선택하여 인간화를 수행하였다.
구현예4: 인간화 항체의 생성과 분석
후보 항체의 인간화 설계
기능적 분석에서의 항체의 효능 및 이의 가변 도메인 서열을 기반으로, CDR, HV 고리 및 FR을 분석하고 상동성 모델링을 수행하여 AR8804, AR8820, AR8861, AR8866 및 AR8875에 대한 sdAb의 모델링 구조를 획득하였다. 프레임워크 잔기의 용매 접근 가능 표면적을 계산하였다. 결과에 기반하여, 매립된 프레임워크 잔기(즉 용매 접근 가능 표면적 < 15%)가 확인되었다. 라마 대조군과 가장 높은 서열 동일성을 갖는 여러 가지 VH의 인간 수용체를 선택하였다. 라마 항체의 CDR을 인간 수용체 프레임워크에 직접 이식하여, 이식된 항체의 서열을 획득하였다. 탈아미드화, 이성질화 산화 및 글리코실화를 포함한 개발 전망성 평가를 통해 이식된 서열의 번역 후 변형 및 화학적 분해를 분석하였다. 이식된 항체의 결합 활성 및 제조 가능성에 영향을 미칠 수 있는 N-글리코실화 부위, 비정상적인 프롤린 잔기, 탈아미드화 부위, 이성질체화 부위, 산화 부위 및 매칭되지 않은 시스테인 잔기와 같은 PTM 핫스팟이 확인되었다. 인간화 항체를 코딩하는 DNA 서열을 합성하였다. 항체 특징을 비교하여 최적의 후보 항체를 선택하였다. 이러한 인간화 분자를 성공적으로 생성하였다.
인간화 항체의 생성
인간화 항체의 생성을 위해, 발명자는 인간화 항CD16a sdAb를 인간 IgG4(또는 마우스 IgG1) Fc 영역의 N말단에 융합시켜, 항CD16a sdAb-Fc 융합 단백질을 생성하였다. 각 항CD16a sdAb-Fc 융합 단백질을 발현하는 DNA 서열을 pTT5벡터의EcoRI과 HindIII 제한 부위 사이에 삽입하였다. 37℃ 및 100 rpm에서 이러한 발현 플라스미드로 형질감염된 CHO-3E7 세포를 6일 동안 배양하였다. 상청액 부분을 원심분리를 통해 수집하고, 단백질A 컬럼을 통해 단백질을 정제하였다.
인간화 항체 특이적 결합 친화력 분석 ELISA
위에서 논의된 바와 같이, CD16a 특이적 항체는 질환 관련 세포에 대한 이중특이적 또는 다중특이적 항체 구축에 특히 유용하다. ELISA에 의해 인간화 sdAb의 단백질 결합 특이성을 분석하기 위하여, 41가지 정제된 유도체화된 인간화 sdAb-mIgG1 Fc 융합 단백질을 ELISA 플레이트(0.5 μg/ml, 100 μl)에 4℃에서 밤새 사전 코팅하였다. 다음날, 웰을 1.0 μg/ml의 1차 항체와 함께 인큐베이션한 후, HRP-접합 염소 항마우스IgG(H+L)(Rockland; 카탈로그 번호: 610-103-121)와 함께 인큐베이션하여 기질 TMB 발색 반응을 수행하였다. 450 nm에서의 광학 밀도 판독값을 사용하여 항체-CD16a 및 CD16b 결합(도 4a-4b, 도 5a-5b)을 정량화하고, CD16a에 대한 특이적 친화력을 갖는 후보를 선택하여 추가로 스크리닝하였다. AFM-CD16a-mIgG1은 참조 대조군 샘플로 사용되었고, 마우스 IgG는 동종형 대조군으로 사용되었다.
인간 CD16a에 대해 상당한 친화력을 갖지만 인간 CD16b에 대해서는 친화력이 없거나 무시할 수 있는 친화력을 갖는 총 34가지 인간화 분자를 선택하여 FACS에 의해 추가로 확인하였다. 간략하여, sdAb 산물의 세포 표면 CD16a 결합 EC50을 분석하기 위하여, 인간 CD16a를 발현하는 HEK293세포(Genscript에 의해 구축)를 수득하고, 연속 희석된 항CD16a sdAb(최대 농도: 100 nM, 3배 희석)와 함께 인큐베이션한 후, 형광단(iFluor 647) 표지된 염소 항마우스IgG(H+L) 2차 항체(Jackson immuno research; 카탈로그 번호: 115-605-062)와 함께 인큐베이션하였다. 다음 유세포 분석을 사용하여 샘플을 분석하였다. GraphPad Prism v6.02 소프트웨어를 사용하여 원래 데이터를 그래프로 작성하였고, 4개 파라미터 최적의 피팅값 프로그램을 사용하여 EC50을 분석하였다. AFM-CD16a-mIgG1(CD16a-mIgG1)은 참조 대조군 샘플로 사용되었고, 마우스 IgG는 동종형 대조군으로 사용되었다. 결과(도 6a/6b/7a/7b/8a/8b/9a/9b/10a/10b)는 선택된 분자의 친화력 특이성을 입증하였다. 그러나, 분자 AR8866으로부터 유래된 모든 유도체(총 10개)는 다른 모 분자로부터 유래된 유도체보다 훨씬 약한 친화력을 나타냈다.
인간화 sdAb의 NK세포독성 유발 효능
상술한 바와 같이, 역ADCC 분석을 통해 인간화 sdAb가 NK세포의 세포독성을 유발하는 강도를 측정하였다. 간략하여, 10,000개의 인간NK-92 158V/V세포를 0.008 μg/ml sdAb-mIgG1 Fc 융합 단백질(pTT5인간화 sdAb-m IgG1Fc)을 사용하여 전처리된 마우스 P815 표적 세포(SailyBio, 상해)와 5:1의 E/T 비율로4시간 동안 공동 배양하였다. 다음, LDH 세포독성 키트(Roche)를 사용하여 특이적 용해의 비율을 계산하였다. AFM13-CD16a-mIgG1은 참조 대조군으로 사용되었고, 마우스 IgG는 동종형 대조군으로 사용되었다. 도 11a 및 도 11b에 도시된 바와 같이, 결과에 따르면, pTT5-AR8861-1.1 mIgG1Fc, pTT5-AR8861-1.2 mIgG1Fc, pTT5-AR8861-2.1 mIgG1Fc, pTT5-AR8861-2.2 mIgG1Fc, pTT5-AR8861-1.3 mIgG1Fc, pTT5-AR8861-4.1 mIgG1Fc, pTT5-AR8861-4.2 mIgG1Fc, pTT5-AR8861-5.1 mIgG1Fc, pTT5-AR8861-5.2 mIgG1Fc, pTT5-AR8861-6 mIgG1Fc, pTT5-AR8804-3.1 mIgG1Fc, pTT5-AR8804-3.3 mIgG1Fc, pTT5-AR8804-1.3 mIgG1Fc, pTT5-AR8820-1.1 mIgG1Fc, pTT5-AR8820-1.3 mIgG1Fc 및 pTT5-AR8820-3.1 mIgG1Fc를 포함한 16가지 분자는, NK세포의 세포독성을 유발하는 측면에서 상당한 효능을 나타냈다(도 11a/11b).
체외 활성을 추가로 입증하기 위하여, 그중 일부 항인간 CD16a sdAb 앞쪽의 서열을 선택하여 역ADCC 생물검정에 의한 용량 의존적 반응을 수행하였다. 간략하여, 10,000개의 인간NK-92 158V/V세포를 5배 연속 희석된 샘플(초기 농도 1.0 μg/ml로부터 희석)을 사용하여 전처리된 마우스 P815 표적 세포(SailyBio, 상해)와 5:1의 E/T 비율로4시간 동안 공동 배양하였다. 다음, LDH 세포독성 키트(Roche)를 사용하여 특이적 용해의 비율을 계산하였다. 도 12에 도시된 바와 같이, 선택된 앞쪽의 서열인 pTT5-AR8804-3.1 mIgG1Fc, pTT5-AR8804-3.3 mIgG1Fc 및 pTT5-AR8820-1.3 mIgG1Fc는 AFM13-CD16a-mIgG1의 참조 항체보다 훨씬 더 높은 활성을 나타냈다.
항CD16a 인간화 항체와 시노몰구스 원숭이 CD16a 단백질의 종간 반응
항체 산물의 교차 반응을 확정하기 위하여, 시노몰구스 원숭이 CD16a를 발현하는 HEK293세포(Genscript에 의해 구축)를 수득하고, 연속 희석된 항CD16a 인간화 sdAb-mIgG1Fc(최대 농도: 100 nM, 3배 희석)와 각각 함께 인큐베이션한 후, 형광단(iFluor 647) 표지된 염소 항마우스IgG(H+L) 2차 항체(Jackson immuno research; 카탈로그 번호: 115-605-062)와 함께 인큐베이션하였다. 다음 유세포 분석을 사용하여 샘플을 분석하였다. GraphPad Prism v6.02 소프트웨어를 사용하여 원래 데이터를 그래프로 작성하였고, 4개 파라미터 최적의 피팅값 프로그램을 사용하여 EC50을 분석하였다. pTT5-AR8804-3.2 mIgG1Fc, pTT5-AR8804-3.3 mIgG1Fc, pTT5-AR8820-1.1 mIgG1Fc, pTT5-AR8820-1.2 mIgG1Fc, pTT5-AR8820-1.3 mIgG1Fc, pTT5-AR8820-2.1 mIgG1Fc, pTT5-AR8820-2.3 mIgG1Fc, pTT5-AR8820-3.1 mIgG1Fc 및 pTT5-AR8820-3.3 mIgG1Fc의 분자는 시노몰구스 원숭이 CD16a 단백질과의 양호한 교차 반응을 나타냈다(도 13).
서열목록
밑줄 그은 아미노산 서열은 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3이다.
낙타과 sdAb
> AR8804
AVQLVDSGGGLVQAGGSLRLSCAASGSSVSRYAMAWYRQAPGKERELVAVVRITGIPIYADFVKGRFTISRDNAKNTVLLQMNSLEPEDTAIYYCNTGNFNTYTRRYSPSETWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1)
AR8804의 CDR1: RYAMA(SEQ ID NO:2)
AR8804의 CDR2: VVRITGIPIYADFVKG(SEQ ID NO:3)
AR8804의 CDR3: GNFNTYTRRYSPSET(SEQ ID NO:4)
> AR8820
QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSSISRYAMAWYRQGPGKERELVAVVRITGSPIYADFVGGRFTISRDNAKSTVLLQMNSLKPEDTAIYYCNTGNFNTYTRRYSPSETWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:5)
AR8820의 CDR1: RYAMA(SEQ ID NO:6)
AR8820의 CDR2: VVRITGSPIYADFVGG(SEQ ID NO:7)
AR8820의 CDR3: GNFNTYTRRYSPSET(SEQ ID NO:8)
> AR8776
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSSINRGGSITNYADSVKGRFAISRDNAKNTIYLQMNNLRPEDTAQYSCARGDSTYSRLSAAYRGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:9)
AR8776의 CDR1: NYAMS(SEQ ID NO:10)
AR8776의 CDR2: SINRGGSITNYADSVKG(SEQ ID NO:11)
AR8776의 CDR3: GDSTYSRLSAAY(SEQ ID NO:12)
> AR8875
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPGKGLEWVSSIDRGGSITSYADSVKGRFAISRDNAKNTMYLQMNNLRPEDTARYVCARGDSTYSRLTAAYRGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:13)
AR8775의 CDR1: NYAMT(SEQ ID NO:14)
AR8775의 CDR2: SIDRGGSITSYADSVKG(SEQ ID NO:15)
AR8775의 CDR3: GDSTYSRLTAAY(SEQ ID NO:16)
> AR8866
QVKLEESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSVWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGIYTTYADSVKGRFTISRDNAKNTLWLQLNALKPEDTAVYYCAQGNRRNSMLSGTLRGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:17)
AR8866의 CDR1: VWTMS(SEQ ID NO:18)
AR8866의 CDR2: DISHSGIYTTYADSVKG(SEQ ID NO:19)
AR8866의 CDR3: GNRRNSMLSGTL(SEQ ID NO:20)
> AR8887
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAVSGFLYYSIGWFRQAPGKEREWVSCISRSGAGTSYANSVKGRSTISRDNDKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCARRATSSCTATMTRGQYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:21)
AR8887의 CDR1: YSIG(SEQ ID NO:22)
AR8887의 CDR2: CISRSGAGTSYANSVKG(SEQ ID NO:23)
AR8887의 CDR3: RATSSCTATMTRGQYDY(SEQ ID NO:24)
> AR8861
AVQLVDSGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNAKNTLWLQLNALKPEDTAVYYCAQGNRRTSMLSGTLRGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:25)
AR8861의 CDR1: IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861의 CDR2: DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861의 CDR3: GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)
이하는 인간화 sdAb
> AR8861-1.1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:29)
AR8861-1.1의 CDR1: IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861-1.1의 CDR2: DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861-1.1의 CDR3: GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)
> AR8861-1.2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:30)
AR8861-1.2의 CDR1: IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861-1.2의 CDR2: DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861-1.2의 CDR3: GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)
> AR8861-2.1
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:31)
AR8861-2.1의 CDR1: IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861-2.1의 CDR2: DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861-2.1의 CDR3: GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)
> AR8861-2.2
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:32)
AR8861-2.2의 CDR1: IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861-2.2의 CDR2: DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861-2.2의 CDR3: GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)
> AR8861-3
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLVWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:33)
AR8861-3의 CDR1: IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861-3의 CDR2: DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861-3의 CDR3: GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)
> AR8861-4.1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:34)
AR8861-4.1의 CDR1: IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861-4.1의 CDR2: DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861-4.1의 CDR3: GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)
> AR8861-4.2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:35)
AR8861-4.2의 CDR1: IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861-4.2의 CDR2: DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861-4.2의 CDR3: GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)
> AR8861-5.1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:36)
AR8861-5.1의 CDR1: IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861-5.1의 CDR2: DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861-5.1의 CDR3: GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)
> AR8861-5.2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVSDISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:37)
AR8861-5.2의 CDR1: IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861-5.2의 CDR2: DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861-5.2의 CDR3: GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)
> AR8861-6
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSIWTMSWVRQAPGKGLEWVADISHSGLYTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGNRRTSMLSGTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:38)
AR8861-6의 CDR1: IWTMS(SEQ ID NO:26)
AR8861-6의 CDR2: DISHSGLYTTYADSVKG(SEQ ID NO:27)
AR8861-6의 CDR3: GNRRTSMLSGTL(SEQ ID NO:28)
> AR8804-1.1
EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGSSVSRYAMAWYRQAPGKGRELVSVVRITGIPIYADFVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATGNFNTYTRRYSPSETWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:39)
AR8804-1.1의 CDR1: RYAMA(SEQ ID NO:2)
AR8804-1.1의 CDR2: VVRITGIPIYADFVKG(SEQ ID NO:3)
AR8804-1.1의 CDR3: GNFNTYTRRYSPSET(SEQ ID NO:4)
> AR8804-1.3
EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGSSVSRYAMAWYRQAPGKGRELVSVVRITGIPIYADFVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCNTGNFNTYTRRYSPSETWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:40)
AR8804-1.3의 CDR1: RYAMA(SEQ ID NO:2)
AR8804-1.3의 CDR2: VVRITGIPIYADFVKG(SEQ ID NO:3)
AR8804-1.3의 CDR3: GNFNTYTRRYSPSET(SEQ ID NO:4)
> AR8804-2.3
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSSVSRYAMAWVRQAPGKGRELVAVVRITGIPIYADFVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCNTGNFNTYTRRYSPSETWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:41)
AR8804-2.3의 CDR1: RYAMA(SEQ ID NO:2)
AR8804-2.3의 CDR2: VVRITGIPIYADFVKG(SEQ ID NO:3)
AR8804-2.3의 CDR3: GNFNTYTRRYSPSET(SEQ ID NO:4)
> AR8804-3.1
QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSSVSRYAMAWYRQAPGKGRELVAVVRITGIPIYADFVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATGNFNTYTRRYSPSETWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:42)
AR8804-3.1의 CDR1: RYAMA(SEQ ID NO:2)
AR8804-3.1의 CDR2: VVRITGIPIYADFVKG(SEQ ID NO:3)
AR8804-3.1의 CDR3: GNFNTYTRRYSPSET(SEQ ID NO:4)
> AR8804-3.2
QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSSVSRYAMAWYRQAPGKGREWVAVVRITGIPIYADFVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATGNFNTYTRRYSPSETWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:43)
AR8804-3.2의 CDR1: RYAMA(SEQ ID NO:2)
AR8804-3.2의 CDR2: VVRITGIPIYADFVKG(SEQ ID NO:3)
AR8804-3.2의 CDR3: GNFNTYTRRYSPSET(SEQ ID NO:4)
> AR8804-3.3
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>AR8875-6
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AR8875-6의 CDR1: NYAMT(SEQ ID NO:14)
AR8875-6의 CDR2: SIDRGGSITSYADSVKG(SEQ ID NO:15)
AR8875-6의 CDR3: ADSTYSRLTAAY(SEQ ID NO:64)
인간 IgG4 Fc
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:73)
마우스 IgG1 Fc
VPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO:74)
Claims (24)
- 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로서,
상기 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분은,
CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역을 포함하는 단량체 가변 도메인을 포함하되, 상기 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역은,
각각 SEQ ID NO: 2, 3 및 4; 또는
각각 SEQ ID NO: 6, 7 및 8; 또는
각각 SEQ ID NO: 14, 15 및 16; 또는
각각 SEQ ID NO: 14, 15 및 64; 또는
각각 SEQ ID NO: 14, 15 및 66; 또는
각각 SEQ ID NO: 18, 19 및 20; 또는
각각 SEQ ID NO: 26, 27 및 28; 또는
상기 CDR1 영역, 상기 CDR2 영역 및 상기 CDR3 영역의 어느 하나 또는 복수 중 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분. - 제1항에 있어서,
상기 CDR1 영역, 상기 CDR2 영역 및 상기 CDR3 영역은,
각각 SEQ ID NO: 2, 3 및 4; 또는
각각 SEQ ID NO: 6, 7 및 8; 또는
각각 SEQ ID NO: 18, 19 및 20; 또는
각각 SEQ ID NO: 26, 27 및 28; 또는
상기 CDR1 영역, 상기 CDR2 영역 및 상기 CDR3 영역의 어느 하나 또는 복수 중 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 항원 결합 부분. - 제1항에 있어서,
상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 인간 CD16a에 특이적으로 결합되는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분. - 제1항에 있어서,
상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 단일 도메인 항체(sdAb) 또는 VHH도메인인 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 낙타과, 키메라, 인간 또는 인간화된 것인 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분. - 제1항에 있어서,
상기 단량체 가변 도메인은 SEQ ID NO: 1, 5, 13, 17, 25, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 및 62로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분. - 제6항에 있어서,
상기 단량체 가변 도메인은 SEQ ID NO: 1, 5, 13, 17, 25, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 및 62로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단량체 가변 도메인은 SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 및 52로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분. - 제8항에 있어서,
상기 단량체 가변 도메인은 SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 및 52로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단량체 가변 도메인은 SEQ ID NO: 42, 44, 45, 47 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분. - 제10항에 있어서,
상기 단량체 가변 도메인은 SEQ ID NO: 42, 44, 45, 47 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분. - 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로서,
상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 단량체 가변 도메인을 포함하되, 상기 단량체 가변 도메인은 SEQ ID NO: 1, 5, 13, 17, 25, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 및 62로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분. - 제12항에 있어서,
상기 항체는 인간화 항체이고, 상기 단량체 가변 도메인은 SEQ ID NO: 42, 44, 45, 47 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 상기 단량체 가변 도메인에 융합된 IgG Fc 영역을 추가로 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분. - 제14항에 있어서,
상기 IgG Fc 영역은 인간 IgG4 Fc 영역 또는 마우스 IgG1 Fc 영역인 항체 또는 이의 항원 결합 부분. - 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 이중특이적 분자, 면역접합체 또는 키메라 항원 수용체.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분 또는 제16항에 따른 이중특이적 분자, 면역접합체 또는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 분자.
- 제17항에 따른 핵산 분자를 함유하는 발현 벡터.
- 제18항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분 또는 제16항에 따른 이중특이적 분자, 면역접합체 또는 키메라 항원 수용체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
- 제20항에 있어서,
세포독성제를 추가로 포함하는 약학 조성물. - 대상체에게 치료 유효량의 제20항 또는 제21항에 따른 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 암 질환을 치료하는 방법.
- 제22항에 있어서,
상기 암 질환은 부신암, 방광암, 유방암, 대장암, 위암, 교모세포종, 신장암, 비소세포폐암, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 털세포 백혈병, 버킷 림프종, 미만성 거대 B세포 림프종, 여포성 림프종, 외투세포 림프종, 변연부 림프종, 비호지킨 림프종, 소림프구성 림프종, 다발성 골수종양, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 신장 세포암, 고환암 및 자궁암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법. - 대상체에게 치료 유효량의 제20항 또는 제21항에 따른 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 NK세포 증식을 촉진하는 방법.
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