KR20240046394A - Pharmaceutical composition for preventing or treating retinal diseases comprising KDM3B protein or gene thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 KDM3B(Lysine Demethylase 3B) 단백질; 상기 KDM3B 단백질을 코딩하는 유전자; 상기 유전자를 포함하는 벡터; 또는 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 유효성분으로 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 망막에 존재하는 광수용체 세포의 세포사멸을 감소 또는 억제하고 광수용체 리본 시냅스의 수를 증가 또는 회복시키는 효과가 있어, 망막질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. The present invention relates to KDM3B (Lysine Demethylase 3B) protein; A gene encoding the KDM3B protein; A vector containing the above gene; Or, it relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of retinal disease comprising the host cell transformed with the vector as an active ingredient, wherein the composition reduces or inhibits apoptosis of photoreceptor cells present in the retina and photoreceptor ribbon synapse. It has the effect of increasing or restoring the number of, and can be usefully used in the prevention or treatment of retinal diseases.
Description
본 발명은 KDM3B 단백질, 상기 KDM3B 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a composition for preventing or treating retinal diseases comprising KDM3B protein, a gene encoding the KDM3B protein, a vector containing the gene, or a host cell transformed with the vector.
망막질환이란 노화, 유전적인 요인, 염증 등에 의해 망막의 기능이 떨어지면서 시력이 감소되고, 심할 경우 시력을 완전히 잃기도 하는 질환이다. 망막질환에는 황반변성, 망막염, 당뇨병성 망막증, 녹내장, 시신경병증, 망막 혈관 질환, 안혈관 질환, 녹내장 등이 있으며, 특히, 황반변성은 망막의 중심부위인 황반부에 변성이 일어나 시력 장애를 일으키는 안구 질환이다. 황반변성의 대표적인 발병 원인은 연령증가, 가족력, 인종, 흡연 등과 관련이 있다고 알려져 있다. 발병 초기에는 시야가 흐려지고 가까운 곳의 시력이 뒤틀려 보여 독서, 운전 등의 정교한 활동 수행이 어려울 수 있고, 심할 경우 실명으로 이루어진 매우 심각한 질병이다. Retinal disease is a disease in which retinal function deteriorates due to aging, genetic factors, inflammation, etc., resulting in decreased vision and, in severe cases, complete loss of vision. Retinal diseases include macular degeneration, retinitis, diabetic retinopathy, glaucoma, optic neuropathy, retinal vascular disease, ocular vascular disease, and glaucoma. In particular, macular degeneration is an eye disease that causes vision impairment due to degeneration of the macula, the central region of the retina. . It is known that the representative causes of macular degeneration are related to increasing age, family history, race, and smoking. In the early stages of the disease, vision becomes blurred and vision in nearby areas becomes distorted, making it difficult to perform sophisticated activities such as reading or driving. In severe cases, it is a very serious disease that can lead to blindness.
특히, 나이관련 황반변성(age-related macular degeneration, AMD)은 중증의 비가역적인 시력상실을 야기하며 50세 이상 인구에서 실명의 주요 원인으로 알려져 있다. 역학 연구에서 유병률은 미국 내 52~64세 인구의 1.2%인 것으로 보고되었으며, 75세 이상에서는 그 비율이 20-37%로서 더욱 높은 것으로 보고되어, 평균연령이 증가될수록 유병률이 증가한 것으로 나타난다. In particular, age-related macular degeneration (AMD) causes severe, irreversible vision loss and is known to be a major cause of blindness in people over 50 years of age. In epidemiological studies, the prevalence was reported to be 1.2% of the population aged 52 to 64 in the United States, and the rate was reported to be even higher at 20 to 37% in people aged 75 or older, showing that the prevalence increases as the average age increases.
황반변성은 건성 황반변성과 습성 황반변성이 있다. 건성 황반변성은 망막에 드루젠이라는 일종의 노화 퇴적물이나 망막색소상피의 위축과 같은 병변이 생긴 경우이며, 황반변성 환자의 약 90%는 건성 형태의 황반변성을 가지고 있다. 건성 황반변성은 황반에 있는 시세포가 서서히 위축되어 시간이 지날수록 시력이 점차 감소하게 되고, 심한 시력상실을 유발하지는 않지만 습성 형태로 발전할 수 있다. 습성 황반변성은 맥락막에 비정상적으로 신생혈관이 생겨, 이 혈관 자체 또는 혈관으로부터의 출혈, 삼출 등에 의해 심한 시력 손상이 발생하기 쉽다. 습성 황반변성은 발병 후 수개월-수년 사이에 원반형 위축, 심한 출혈 등으로 실명을 초래할 수 있다(Oh, M.J. & Lee, S.Y., 2012).Macular degeneration includes dry macular degeneration and wet macular degeneration. Dry macular degeneration is a condition in which lesions such as a type of aging deposit called drusen or atrophy of the retinal pigment epithelium occur on the retina. About 90% of patients with macular degeneration have a dry form of macular degeneration. Dry macular degeneration causes the optic cells in the macula to gradually atrophy, gradually reducing vision over time. Although it does not cause severe vision loss, it can develop into a wet form. Wet macular degeneration causes abnormal new blood vessels to form in the choroid, and severe vision damage is likely to occur due to the blood vessels themselves or bleeding or exudation from the blood vessels. Wet macular degeneration can cause blindness due to discoid atrophy and severe hemorrhage within months to years after onset (Oh, M.J. & Lee, S.Y., 2012).
황반변성의 치료는 새로운 혈관내피성장인자(VEGF) 저해제(RTH-258, abicipar pegol)와 add-on 치료제(Fovista, squalamine)가 알려져 있다. 그러나, 이러한 약물 치료법은 여러 번에 걸쳐 직접 눈에 주사해야 하므로 다양한 부작용을 초래할 수 있고, 유전적 요인에 의한 경우 일시적인 치료 방안에 불과하다는 단점이 있다. For the treatment of macular degeneration, new vascular endothelial growth factor (VEGF) inhibitors (RTH-258, abicipar pegol) and add-on treatments (Fovista, squalamine) are known. However, these drug treatments have the disadvantage of requiring multiple injections directly into the eye, which can cause various side effects, and that they are only a temporary treatment option in cases of genetic factors.
이에 본 발명자들은 황반변성과 관련된 KDM3B 유전자를 발견한 후, KDM3B 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자에 의한 황반변성의 예방 또는 치료 효과를 증명함으로써 본 발명을 완성하였다. Accordingly, the present inventors discovered the KDM3B gene related to macular degeneration and completed the present invention by demonstrating the prevention or treatment effect of macular degeneration by the KDM3B protein or the gene encoding it.
본 발명의 목적은 KDM3B(Lysine Demethylase 3B) 단백질을 유효성분으로 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다. The purpose of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating retinal diseases containing KDM3B (Lysine Demethylase 3B) protein as an active ingredient.
본 발명의 다른 목적은 KDM3B 단백질을 코딩하는 유전자; 상기 유전자를 포함하는 벡터; 및 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is a gene encoding KDM3B protein; A vector containing the above gene; and a host cell transformed with the vector as an active ingredient.
본 발명의 또 다른 목적은 KDM3B 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 망막질환의 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing or predicting prognosis of retinal disease, including an agent for measuring the expression level of KDM3B protein or the gene encoding it.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 망막질환의 진단 또는 예후 예측용 조성물을 포함하는 망막질환의 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing or predicting the prognosis of retinal disease, including the composition for diagnosing or predicting the prognosis of the retinal disease.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 KDM3B 단백질을 유효성분으로 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.To achieve the above object, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating retinal diseases containing KDM3B protein as an active ingredient.
또한, 본 발명은 KDM3B 단백질을 코딩하는 유전자; 상기 유전자를 포함하는 벡터; 및 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. In addition, the present invention provides a gene encoding KDM3B protein; A vector containing the above gene; It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating retinal disease, comprising as an active ingredient any one selected from the group consisting of host cells transformed with the vector.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 KDM3B 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the KDM3B protein may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 망막질환은 노인성 황반변성(AMD), 습성 황반변성, 건성 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 황반 부종, 낭포성 황반 부종, 색소성 망막염(RP), 레베르 선천 흑암시(LCA), 스타가르트병, 어셔 증후군, 맥락막 결여, 로드-콘 또는 콘-로드 디스트로피, 섬모병증, 진행성 망막 위축증, 맥락막 흑색종, 겸상 적혈구 망막증, 망막하 혈관신생, 맥락막 혈관신생, 망막 광수용체 질환, 망막 색소 상피-계 질환, 포도막염, 망막박리, 외상성 망막 손상, 의원성 망막 손상, 황반원공, 황반 모세관 확장증, 신경절 세포 질환, 시신경 세포 질환, 녹내장, 시신경병증, 허혈성 망막 질환, 미숙아 망막증, 망막 혈관 폐색, 결절맥락막혈관병증, 망막저산소증, 가족형 마크로아뉴리즘, 망막 혈관 질환, 안혈관 질환, 녹내장으로 인한 망막신경세포 퇴화 및 허혈성 시신경병증으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. In one embodiment of the present invention, the retinal disease is age-related macular degeneration (AMD), wet macular degeneration, dry macular degeneration, diabetic retinopathy, macular edema, cystic macular edema, retinitis pigmentosa (RP), and Leber. Amaurosis congenita (LCA), Stargardt disease, Usher syndrome, choroidal absence, Rod-con or Con-Rod dystrophy, ciliopathies, progressive retinal atrophy, choroidal melanoma, sickle cell retinopathy, subretinal neovascularization, choroidal vessels Neonatal, retinal photoreceptor disease, retinal pigment epithelial-system disease, uveitis, retinal detachment, traumatic retinal injury, iatrogenic retinal injury, macular hole, macular telangiectasia, ganglion cell disease, optic nerve cell disease, glaucoma, optic neuropathy, ischemic retina. It may be selected from the group consisting of diseases, retinopathy of prematurity, retinal vascular occlusion, nodular choroidal angiopathy, retinal hypoxia, familial macroneurism, retinal vascular disease, ocular vascular disease, retinal nerve cell degeneration due to glaucoma, and ischemic optic neuropathy. However, it is not limited to this.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 벡터는 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성 벡터인 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the vector may be a non-viral vector or a viral vector.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 비바이러스성 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 및 리포좀으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the non-viral vector may be selected from the group consisting of linear DNA, plasmid DNA, and liposome.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 바이러스성 벡터는 레트로바이러스(Retrovirus) 벡터, 아데노바이러스(Adenovirus) 벡터, 아데노부속바이러스(Adeno-associated virus) 벡터, 헤스페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 벡터 및 렌티바이러스(Lentivirus) 벡터로 이루어진 군에서 선택되는 것일수 있다. In one embodiment of the present invention, the viral vector is a retrovirus vector, an adenovirus vector, an Adeno-associated virus vector, or a Herpes simplex virus vector. and lentivirus vectors.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 숙주 세포는 줄기세포, 수지상 세포 및 종양세포로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the host cells may be selected from the group consisting of stem cells, dendritic cells, and tumor cells.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 망막에 존재하는 광수용체 세포의 세포사멸을 감소 또는 억제하는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the composition may reduce or inhibit apoptosis of photoreceptor cells present in the retina.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 광수용체 리본 시냅스(photoreceptor ribbon synapse)의 수를 증가 또는 회복시키는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the composition may increase or restore the number of photoreceptor ribbon synapses.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 비경구, 점막 전달, 경피, 국소 및 점안제 형태로 이루어진 군에서 선택되는 투여되는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the composition may be administered selected from the group consisting of parenteral, mucosal delivery, transdermal, topical, and eye drop forms.
또한, 본 발명은 KDM3B 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 망막질환의 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다. Additionally, the present invention provides a composition for diagnosing or predicting prognosis of retinal disease, including an agent for measuring the expression level of KDM3B protein or the gene encoding it.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 제제는 KDM3B 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레이티드, 압타머 및 항체로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the agent may be selected from the group consisting of primers, probes, antisense oligonucleotides, aptamers, and antibodies capable of specifically binding to the KDM3B protein or the gene encoding it. .
또한, 본 발명은 상기 망막질환의 진단 또는 예후 예측용 조성물을 포함하는 망막질환의 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다. In addition, the present invention provides a kit for diagnosing or predicting the prognosis of retinal disease, including the composition for diagnosing or predicting the prognosis of the retinal disease.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the kit may be an RT-PCR kit, a DNA chip kit, or a protein chip kit.
본 발명에 따른 조성물은 망막에 존재하는 광수용체 세포의 세포사멸을 감소 또는 억제하고 광수용체 리본 시냅스의 수를 증가 또는 회복시키는 효과가 있어, 망막질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. The composition according to the present invention has the effect of reducing or inhibiting apoptosis of photoreceptor cells present in the retina and increasing or restoring the number of photoreceptor ribbon synapses, and can be usefully used in the prevention or treatment of retinal diseases.
도 1은 1개월, 6개월 및 12개월의 KDM3B 유전자 결손 마우스 또는 정상 마우스의 망막 조직에서 ONL(Outer Nuclear Layer)의 두께를 측정한 결과이다 (+/+: wild type; 및 +/-: Kdm3b heterozygous knockout).
도 2는 1개월 및 12개월의 KDM3B 유전자 결손 마우스 또는 정상 마우스에서 ONL(Outer Nuclear Layer)에 존재하는 원추세포(Cone cell)와 간상세포(Rod cell)의 수를 측정한 결과이다.
도 3은 1개월 및 12개월의 KDM3B 유전자 결손 마우스 또는 정상 마우스에서 GFAP(glial fibrillary acidic protein) 유전자의 발현량 및 Cytochrome c의 발현량을 측정한 결과이다.
도 4는 12개월의 KDM3B 유전자 결손 마우스 또는 정상 마우스에서 Cytochrome c의 강도(intensity) 및 BrdU 강도(intensity)를 측정한 결과이다.
도 5는 12개월의 KDM3B 유전자 결손 마우스 또는 정상 마우스에서 시냅스 면적과 리본 시냅스의 수를 측정한 결과(위쪽 패널); 및 광수용체 시냅스 영역(photoreceptor synaptic regions)을 투과전자현미경(TEM)으로 확인한 결과(아래쪽 패널)이다.
도 6은 6개월의 KDM3B 유전자 결손 마우스 또는 정상 마우스에서 암조건 및 명조건에서 망막전위도(electroretinogram, ERG)를 측정한 결과이다.
도 7은 KDM3B 과발현 컨스트럭트 및 이를 통한 실험 스케줄 (위쪽 패널); 및 8개월의 KDM3B 유전자 결손 마우스에 KDM3B 과발현 컨스트럭트를 주입한 군(Kdm3b-T2A-GFP) 또는 대조군(pCMV-GFP)에서 Cytochrome c의 발현량을 측정한 결과이다.
도 8은 8개월의 KDM3B 유전자 결손 마우스에 KDM3B 과발현 컨스트럭트를 주입한 군(Kdm3b-T2A-GFP) 또는 대조군(pCMV-GFP)에서 리본 시냅스를 표지할 수 있는 CtBP2 유전자의 발현을 측정한 결과이다. Figure 1 shows the results of measuring the thickness of ONL (Outer Nuclear Layer) in retinal tissue of KDM3B gene-deficient mice or normal mice at 1 month, 6 months, and 12 months (+/+: wild type; and +/-: Kdm3b heterozygous knockout).
Figure 2 shows the results of measuring the number of cone cells and rod cells present in the ONL (Outer Nuclear Layer) in KDM3B gene-deficient mice or normal mice at 1 and 12 months.
Figure 3 shows the results of measuring the expression level of GFAP (glial fibrillary acidic protein) gene and Cytochrome c in KDM3B gene-deficient mice or normal mice at 1 and 12 months.
Figure 4 shows the results of measuring the intensity of Cytochrome c and BrdU in 12-month-old KDM3B gene-deficient mice or normal mice.
Figure 5 shows the results of measuring synapse area and number of ribbon synapses in 12-month-old KDM3B gene-deficient mice or normal mice (upper panel); And the photoreceptor synaptic regions were confirmed using transmission electron microscopy (TEM) (lower panel).
Figure 6 shows the results of electroretinogram (ERG) measurements in dark and light conditions in 6-month-old KDM3B gene-deficient mice or normal mice.
Figure 7 shows KDM3B overexpression construct and experimental schedule using it (upper panel); And this is the result of measuring the expression level of Cytochrome c in the group (Kdm3b-T2A-GFP) or the control group (pCMV-GFP) injected with the KDM3B overexpression construct into 8-month-old KDM3B gene-deficient mice.
Figure 8 shows the results of measuring the expression of the CtBP2 gene, which can mark ribbon synapses, in the group (Kdm3b-T2A-GFP) or the control group (pCMV-GFP) injected with a KDM3B overexpression construct into 8-month-old KDM3B gene-deficient mice. am.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명에 사용되는 용어는 본 발명의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 기술분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 임의로 선정된 용어도 있으며, 이 경우 해당 실시예의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서, 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.The terms used in the present invention are general terms that are currently widely used as much as possible while considering the function of the present invention, but this may vary depending on the intention of a technician working in the art or the emergence of new technology. In addition, in certain cases, there are terms that are arbitrarily selected, and in this case, the meaning will be described in detail in the description of the relevant embodiment. Therefore, the terms used in the present invention should be defined based on the meaning of the term and the overall content of the present invention, rather than simply the name of the term.
본 발명에서 어느 구성요소 또는 어느 단계를 "포함한다"고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소 또는 다른 단계를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소 또는 다른 단계를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.In the present invention, when it is said to “include” a component or a step, this does not mean excluding other components or steps unless specifically stated to the contrary, but may further include other components or steps. it means.
본 발명은 KDM3B(Lysine Demethylase 3B) 단백질을 유효성분으로 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating retinal diseases containing KDM3B (Lysine Demethylase 3B) protein as an active ingredient.
또한, 본 발명은 KDM3B 단백질을 코딩하는 유전자; 상기 유전자를 포함하는 벡터; 및 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. In addition, the present invention provides a gene encoding KDM3B protein; A vector containing the above gene; It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating retinal disease, comprising as an active ingredient any one selected from the group consisting of host cells transformed with the vector.
본 발명에 있어서, 상기 KDM3B 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것이거나, 서열번호 1의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 가진 펩타이드인 것일 수 있다. 상기 서열번호 1은 인간(Homo sapiens) KDM3B 단백질의 아미노산 서열(NCBI Reference Sequence: NP_057688.3)이며, 상기 서열번호 2는 마우스(Mus musculus) KDM3B 단백질의 아미노산 서열(NCBI Reference Sequence: NP_001074725.1)이다. In the present invention, the KDM3B protein contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, It may be a peptide with more than 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% homology. SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of the human ( Homo sapiens ) KDM3B protein (NCBI Reference Sequence: NP_057688.3), and SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of the mouse ( Mus musculus ) KDM3B protein (NCBI Reference Sequence: NP_001074725.1) am.
본 발명에 있어서, 상기 망막질환은 노인성 황반변성(AMD), 습성 황반변성, 건성 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 황반 부종, 낭포성 황반 부종, 색소성 망막염(RP), 레베르 선천 흑암시(LCA), 스타가르트병, 어셔 증후군, 맥락막 결여, 로드-콘 또는 콘-로드 디스트로피, 섬모병증, 진행성 망막 위축증, 맥락막 흑색종, 겸상 적혈구 망막증, 망막하 혈관신생, 맥락막 혈관신생, 망막 광수용체 질환, 망막 색소 상피-계 질환, 포도막염, 망막박리, 외상성 망막 손상, 의원성 망막 손상, 황반원공, 황반 모세관 확장증, 신경절 세포 질환, 시신경 세포 질환, 녹내장, 시신경병증, 허혈성 망막 질환, 미숙아 망막증, 망막 혈관 폐색, 결절맥락막혈관병증, 망막저산소증, 가족형 마크로아뉴리즘, 망막 혈관 질환, 안혈관 질환, 녹내장으로 인한 망막신경세포 퇴화 및 허혈성 시신경병증으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. In the present invention, the retinal disease includes age-related macular degeneration (AMD), wet macular degeneration, dry macular degeneration, diabetic retinopathy, macular edema, cystic macular edema, retinitis pigmentosa (RP), and Leber congenital amaurosis ( LCA), Stargardt disease, Usher syndrome, choroidal absence, Rod-con or Con-Rod dystrophy, ciliopathies, progressive retinal atrophy, choroidal melanoma, sickle cell retinopathy, subretinal neovascularization, choroidal neovascularization, retinal light Receptor disease, retinal pigment epithelial-system disease, uveitis, retinal detachment, traumatic retinal injury, iatrogenic retinal injury, macular hole, macular telangiectasia, ganglion cell disease, optic nerve cell disease, glaucoma, optic neuropathy, ischemic retinal disease, retinopathy of prematurity , retinal vascular occlusion, nodular choroidal angiopathy, retinal hypoxia, familial macroneurism, retinal vascular disease, ocular vascular disease, retinal nerve cell degeneration due to glaucoma, and ischemic optic neuropathy, but is limited to these. It doesn't work.
본 발명에 있어서, 상기 벡터는 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성 벡터인 것일 수 있다. 상기 비바이러스성 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 및 리포좀으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. 또한, 상기 바이러스성 벡터는 레트로바이러스(Retrovirus) 벡터, 아데노바이러스(Adenovirus) 벡터, 아데노부속바이러스(Adeno-associated virus) 벡터, 헤스페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 벡터 및 렌티바이러스(Lentivirus) 벡터로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. In the present invention, the vector may be a non-viral vector or a viral vector. The non-viral vector may be selected from the group consisting of linear DNA, plasmid DNA, and liposome. In addition, the viral vectors include Retrovirus vectors, Adenovirus vectors, Adeno-associated virus vectors, Herpes simplex virus vectors, and Lentivirus vectors. It may be selected from the group consisting of, but is not limited to this.
본 발명에 있어서, 상기 숙주 세포는 줄기세포, 수지상 세포 및 종양세포로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. In the present invention, the host cells may be selected from the group consisting of stem cells, dendritic cells, and tumor cells, but are not limited thereto.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 망막에 존재하는 광수용체 세포의 세포사멸을 감소 또는 억제하는 것일 수 있다. In the present invention, the composition may reduce or inhibit apoptosis of photoreceptor cells present in the retina.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 광수용체 리본 시냅스(photoreceptor ribbon synapse)의 수를 증가 또는 회복시키는 것일 수 있다. In the present invention, the composition may increase or restore the number of photoreceptor ribbon synapses.
본 발명에 따른 약학 조성물은 본 발명의 유효성분을 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. The pharmaceutical composition according to the present invention may contain the active ingredient of the present invention alone or may be formulated in a suitable form together with a pharmaceutically acceptable carrier, and may additionally contain an excipient or diluent. In the above, 'pharmaceutically acceptable' refers to a non-toxic composition that is physiologically acceptable and does not usually cause allergic reactions such as gastrointestinal disorders, dizziness, or similar reactions when administered to humans.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).Pharmaceutically acceptable carriers may further include, for example, carriers for oral administration or carriers for parenteral administration. Carriers for oral administration may include lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid, etc. In addition, it may contain various drug delivery substances used for oral administration of peptide preparations. Additionally, the carrier for parenteral administration may include water, suitable oil, saline solution, aqueous glucose, glycol, etc., and may further include stabilizers and preservatives. Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium bisulfite, sodium sulfite or ascorbic acid. Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol. The pharmaceutical composition of the present invention may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, etc. in addition to the above components. Other pharmaceutically acceptable carriers and agents may be referred to as described in the following literature (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하, 직장내, 점막 전달 또는 점안제 형태 투여일 수 있고, 바람직하게는 점막 전달, 경피, 국소 또는 점안제 형태 투여인 것일 수 있다. The composition of the present invention can be administered to mammals, including humans, by any method. For example, it can be administered orally or parenterally. Parenteral administration methods include, but are not limited to, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, enteral, topical, sublingual, intrarectal, etc. It may be administered in the form of mucosal delivery or eye drops, and preferably may be administered in the form of mucosal delivery, transdermal, topical, or eye drops.
본 발명의 약학 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화할 수 있고, 바람직하게는 비경구 투여용 제제로 제형화할 수 있다. 예를 들어, 비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸, 비강 흡입제 및 점안제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be formulated as a formulation for oral administration or parenteral administration according to the administration route described above, and is preferably formulated as a formulation for parenteral administration. For example, in the case of preparations for parenteral administration, they can be formulated in the form of injections, creams, lotions, external ointments, oils, moisturizers, gels, aerosols, nasal inhalants and eye drops by methods known in the art. . These formulations are described in Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995, a commonly known text in all pharmaceutical chemistry.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 500mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.The total effective amount of the composition of the present invention can be administered to a patient in a single dose, or can be administered by a fractionated treatment protocol in which multiple doses are administered over a long period of time. The pharmaceutical composition of the present invention may vary the content of the active ingredient depending on the severity of the disease. Preferably, the total preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may be about 0.01 μg to 10,000 mg, most preferably 0.1 μg to 500 mg per kg of patient body weight per day. However, the dosage of the pharmaceutical composition is determined by considering various factors such as the formulation method, administration route, and number of treatments, as well as the patient's age, weight, health status, gender, severity of the disease, diet, and excretion rate. Therefore, taking this into account, anyone skilled in the art will be able to determine an appropriate effective dosage of the composition of the present invention. The pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited in its formulation, administration route, and administration method as long as it exhibits the effects of the present invention.
또한, 본 발명은 KDM3B 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 망막질환의 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다. Additionally, the present invention provides a composition for diagnosing or predicting prognosis of retinal disease, including an agent for measuring the expression level of KDM3B protein or the gene encoding it.
상기 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 폐암의 발병 여부를 확인하는 것을 의미하며, 폐암의 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다. The term “diagnosis” means confirming the presence or characteristics of a pathological condition. For the purpose of the present invention, it means confirming the occurrence of lung cancer, and also includes determining the development and reduction of lung cancer.
상기 용어, "예후(prognosis)"는 질병을 진단하여 판단된 장래의 증세 또는 경과에 대한 전망하는 것을 의미한다. The term “prognosis” refers to the prediction of future symptoms or progress determined by diagnosing a disease.
본 발명에 있어서, 상기 제제는 KDM3B 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레이티드, 압타머 및 항체로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. In the present invention, the agent may be selected from the group consisting of primers, probes, antisense oligonucleotides, aptamers, and antibodies capable of specifically binding to the KDM3B protein or the gene encoding it, but is limited thereto. That is not the case.
상기 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기서열로서, 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고, 템플레이트 가닥 복사을 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 염기서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머레이트 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 본 발명이 속하는 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.The term "primer" refers to a base sequence with a short free 3' hydroxyl group, capable of forming base pairs with a complementary template, and serving as a starting point for copying the template strand. It refers to base sequence. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and a reagent for polymerization (i.e., DNA polymerase or reverse transcriptase) in an appropriate buffer solution and temperature. PCR conditions and lengths of sense and antisense primers can be appropriately selected according to techniques known in the art to which the present invention pertains.
상기 용어, "프로브"는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 표지되어 있어 특정 유전자의 존재 유무 및 발현량을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 본 발명이 속하는 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.The term "probe" refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA that can specifically bind to a gene, and is labeled so that the presence or absence and expression level of a specific gene can be confirmed. Probes may be manufactured in the form of oligonucleotide probes, single strand DNA probes, double strand DNA probes, RNA probes, etc. Selection of an appropriate probe and hybridization conditions can be appropriately selected according to techniques known in the field to which the present invention pertains.
상기 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 유전자들의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. The term "antisense oligonucleotide" refers to DNA or RNA or derivatives thereof containing a nucleic acid sequence complementary to the sequence of a specific mRNA, and has the effect of inhibiting the translation of mRNA into protein by binding to the complementary sequence in the mRNA. do. Antisense oligonucleotide sequence refers to a DNA or RNA sequence that is complementary to the mRNA of the genes and is capable of binding to the mRNA.
상기 용어, "압타머"는 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다. 압타머 생산은 본 발명이 속하는 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있고, 제조되어 상업적으로 판매되는 항체를 이용할 수 있다.The term "aptamer" refers to a polynucleotide composed of a special type of single-stranded nucleic acid (DNA, RNA or modified nucleic acid) that has a stable tertiary structure and the ability to bind to a target molecule with high affinity and specificity. means a type of Aptamers can specifically bind to antigenic substances in the same way as antibodies, but are composed of polynucleotides that are more stable than proteins, have a simpler structure, and are easier to synthesize, so they can be used as replacements for antibodies. Aptamer production can be easily produced using techniques well known in the field to which the present invention pertains, and antibodies that have been manufactured and sold commercially can be used.
상기 용어, "항체"는 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 이들의 조합을 모두 포함한다. 또한, 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 및 항체 분자의 기능적인 단편, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2및 Fv를 모두 포함한다. 항체 생산은 본 발명이 속하는 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있고, 제조되어 상업적으로 판매되는 항체를 이용할 수 있다.The term “antibody” refers to a specific immunoglobulin directed against an antigenic site, and includes polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, recombinant antibodies, and combinations thereof. Additionally, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, recombinant antibodies and intact forms having two full-length light chains and two full-length heavy chains, as well as functional fragments of the antibody molecule, such as Fab, F(ab') , F(ab')2 and Fv. Antibodies can be easily produced using techniques well known in the field to which the present invention pertains, and antibodies that have been manufactured and sold commercially can be used.
또한, 본 발명은 상기 망막질환의 진단 또는 예후 예측용 조성물을 포함하는 망막질환의 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다. In addition, the present invention provides a kit for diagnosing or predicting the prognosis of retinal disease, including the composition for diagnosing or predicting the prognosis of the retinal disease.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. In the present invention, the kit may be an RT-PCR kit, a DNA chip kit, or a protein chip kit, but is not limited thereto.
상기 RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 세트 외에 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함할 수 있다. The RT-PCR kit contains, in addition to each primer set specific for the marker gene, test tubes or other suitable containers, reaction buffer (pH and magnesium concentration vary), deoxynucleotides (dNTPs), Taq-polymerase and reverse transcriptase. It may include enzymes such as DNase, RNAse inhibitors, DEPC-water, sterilized water, etc. Additionally, it may include a primer set specific to the gene used as a quantitative control.
상기 DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.The DNA chip kit may include a substrate to which a cDNA corresponding to a gene or a fragment thereof is attached as a probe, and reagents, agents, enzymes, etc. for producing a fluorescent label probe. Additionally, the substrate may include cDNA corresponding to a quantitative control gene or a fragment thereof.
상기 단백질 칩 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.The protein chip kit may include a substrate, an appropriate buffer solution, a secondary antibody labeled with a chromogenic enzyme or a fluorescent substance, a chromogenic substrate, etc. for immunological detection of antibodies. In the above, the substrate may be a nitrocellulose membrane, a 96-well plate synthesized from polyvinyl resin, a 96-well plate synthesized from polystyrene resin, and a glass slide glass, and the coloring enzyme may be peroxidase or alkaline phosphatase. Alkaline phosphatase can be used, the fluorescent substance can be FITC, RITC, etc., and the coloring substrate solution is ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid). ) or OPD (o-phenylenediamine) or TMB (tetramethyl benzidine) may be used.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are for illustrating the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예 1. KDM3B 유전자 결손(반수부족)의 동물모델에서 망막세포의 표현형 차이 분석 결과Example 1. Results of analysis of phenotypic differences in retinal cells in an animal model of KDM3B gene deletion (haploinsufficiency)
본 발명자들은 KDM3B 유전자의 기능을 확인하기 위해 KDM3B 유전자 결손(반수부족)의 마우스 동물모델(Kdm3b heterozygous knockout mice)를 제작한 후 망막세포의 표현형적 차이를 분석하였다. 마우스는 물과 사료를 자유롭게 공급하고 12시간 명암주기(저녁 8시 소등)의 환경에서 생육하였다. 정상 마우스 및 망막질환 모델 마우스는 각각 1개월, 6개월 및 12개월에 희생시킨 후 망막 조직을 분리하였고, 4% 파라포름알데히드에 고정시킨 후 조직 절편을 준비하고, 세포핵을 염색할 수 있는 DAPI와 H&E 염색을 수행하였다. To confirm the function of the KDM3B gene, the present inventors created a KDM3B gene deletion mouse model ( Kdm3b heterozygous knockout mice) and analyzed the phenotypic differences in retinal cells. Mice were provided with water and food freely and were raised in an environment with a 12-hour light/dark cycle (lights off at 8 p.m.). Normal mice and retinal disease model mice were sacrificed at 1, 6, and 12 months, respectively, and the retinal tissues were isolated, fixed in 4% paraformaldehyde, prepared for tissue sections, and DAPI, which can stain cell nuclei, was used. H&E staining was performed.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 1개월의 KDM3B 유전자 결손의 마우스(Kdm3b+/-, heterozygous)와 정상 마우스(Kdm3b+/+, wild type)는 광수용체 세포(원추세포; Cone cell, 간상세포; Rod cell)가 존재하는 ONL(Outer Nuclear Layer)의 두께에 유의미한 차이가 나타나지 않았다. 그러나, KDM3B 유전자 결손의 마우스는 정상 마우스에 비해 시간이 지날수록 ONL의 두께에 얇아졌고, 특히, 12개월의 노화가 진행된 KDM3B 유전자 결손의 마우스에서는 정상 마우스에 비해 ONL의 두께가 현저히 감소하였음을 확인하였다. As a result, as shown in Figure 1, 1-month-old mice with KDM3B gene deletion ( Kdm3b +/-, heterozygous) and normal mice ( Kdm3b +/+, wild type) have photoreceptor cells (cone cells, rods). There was no significant difference in the thickness of ONL (Outer Nuclear Layer) where rod cells were present. However, compared to normal mice, the ONL thickness of mice with KDM3B gene deletion became thinner over time, and in particular, in mice with KDM3B gene deletion after 12 months of aging, the thickness of the ONL was significantly reduced compared to normal mice. did.
또한, ONL(Outer Nuclear Layer)에 존재하는 원추세포(Cone cell)와 간상세포(Rod cell)의 수를 측정하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 12개월의 노화가 진행된 KDM3B 유전자 결손의 마우스에서는 정상 마우스에 비해 원추세포(Cone cell)의 수가 유의하게 감소하였음을 확인하였다 (도 2). 다만, 간상세포(Rod cell)의 수에는 유의미한 차이가 나타나지 않았다. Additionally, an experiment was performed to measure the number of cone cells and rod cells present in the ONL (Outer Nuclear Layer). As a result, it was confirmed that the number of cone cells was significantly reduced in KDM3B gene-deficient mice with 12 months of aging compared to normal mice (Figure 2). However, there was no significant difference in the number of rod cells.
상기 결과로부터, 본 발명에서는 노화가 진행된 KDM3B 유전자 결손의 마우스에서 광수용체 세포가 존재하는 ONL의 두께가 감소하고, 특히, 원추세포의 수가 현저히 감소한 것을 확인함으로써, KDM3B 유전자 결손이 망막질환과 관련됨을 확인하였다. From the above results, the present invention confirmed that the thickness of the ONL, where photoreceptor cells are present, was reduced in aged KDM3B gene-deficient mice, and in particular, the number of cone cells was significantly reduced, confirming that the KDM3B gene defect is related to retinal disease. Confirmed.
실시예 2. KDM3B 유전자 결손의 동물모델에서 망막세포 손상 관련 유전자의 발현 분석 및 세포사멸 분석 결과Example 2. Results of expression analysis and apoptosis analysis of genes related to retinal cell damage in an animal model of KDM3B gene deletion
노화가 진행된 KDM3B 유전자 결손의 마우스에서 망막세포의 손상을 확인할 수 있는 유전자인 뮬러 신경세포의 마커인 GFAP(glial fibrillary acidic protein) 유전자의 발현량을 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 12개월의 노화가 진행된 KDM3B 유전자 결손의 마우스에서는 정상 마우스에 비해 GFAP 유전자의 발현량이 유의하게 증가하였음을 확인하였다 (도 3 왼쪽 패널). An experiment was performed to check the expression level of the GFAP (glial fibrillary acidic protein) gene, a marker for Müller neurons, a gene that can identify damage to retinal cells, in mice with an advanced KDM3B gene deletion. As a result, it was confirmed that the expression level of the GFAP gene was significantly increased in KDM3B gene-deficient mice with 12 months of aging compared to normal mice (left panel of Figure 3).
또한, KDM3B 유전자 결손의 마우스에서 노화가 진행됨에 따라 망막세포의 손상이 세포사멸(apoptosis)의 증가를 통해 발생하는지 확인하기 위해 주요 세포사멸(apoptosis) 마커인 Cytochrome c의 발현량을 측정하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 노화가 진행된 KDM3B 유전자 결손의 마우스의 망막세포에서는 정상 마우스에 비해 Cytochrome c의 발현량이 현저하게 증가하였음을 확인하였다 (도 3 오른쪽 패널). In addition, to determine whether damage to retinal cells occurs through increased apoptosis as aging progresses in KDM3B gene-deficient mice, an experiment was conducted to measure the expression level of Cytochrome c, a major apoptosis marker. carried out. As a result, it was confirmed that the expression level of Cytochrome c was significantly increased in retinal cells of mice with an advanced KDM3B gene deletion compared to normal mice (right panel of Figure 3).
또한, 세포사멸 시 일어나는 DNA fragmentation을 검출하기 위해 TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase biotin-dUTP nick end labeling) assay를 수행하였다. 그 결과, 노화가 진행된 KDM3B 유전자 결손의 마우스에서는 정상 마우스에 비해 원추세포 내의 세포사멸이 유의하게 증가하였음을 확인하였다 (도 4). Additionally, TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase biotin-dUTP nick end labeling) assay was performed to detect DNA fragmentation that occurs during apoptosis. As a result, it was confirmed that apoptosis in cone cells was significantly increased in aged KDM3B gene-deficient mice compared to normal mice (FIG. 4).
상기 결과로부터, 본 발명에서는 노화가 진행된 KDM3B 유전자 결손의 마우스에서 망막세포가 손상되며 원추세포 내의 세포사멸이 유의하게 증가하였고, 이로써 KDM3B 유전자 결손이 원추세포의 세포사멸 증가와 관련됨을 확인하였다. From the above results, in the present invention, retinal cells were damaged and apoptosis in cone cells was significantly increased in mice with KDM3B gene deletion in advanced aging stages, and it was confirmed that KDM3B gene deletion is associated with increased apoptosis of cone cells.
실시예 3. KDM3B 유전자 결손의 동물모델에서 광수용체 리본 스냅스의 형태학적 분석 결과Example 3. Morphological analysis results of photoreceptor ribbon snaps in an animal model of KDM3B gene deletion
광수용체 리본 시냅스(Photoreceptor ribbon synapse)는 망막에서 외부 플렉시폼층(outer plexiform layer)에 존재하며, 시각 신호를 전달하는 역할을 한다. 이에 본 발명자들은 KDM3B 유전자가 결손된 마우스의 망막 원추세포에서 리본 시냅스의 형태학적 변화를 확인하기 위해 원추세포 시냅스 말단부위에서 시냅스 면적과 리본 시냅스의 수(리본 시냅스를 표지할 수 있는 CtBP2 유전자의 발현을 측정함)를 측정하였다. 그 결과, 12개월의 노화가 진행된 KDM3B 유전자가 마우스에서는 정상 마우스에 비해 시냅스 면적과 리본 시냅스의 수가 감소되었음을 확인하였다 (도 5 위쪽 패널). Photoreceptor ribbon synapse exists in the outer plexiform layer of the retina and plays a role in transmitting visual signals. Accordingly, the present inventors measured the synapse area and the number of ribbon synapses (expression of the CtBP2 gene, which can mark ribbon synapses) at the cone cell synapse terminal site to confirm the morphological changes in ribbon synapses in retinal cone cells of mice lacking the KDM3B gene. measured) was measured. As a result, it was confirmed that the synapse area and number of ribbon synapses were reduced in KDM3B gene mice with 12 months of aging compared to normal mice (upper panel of Figure 5).
또한, 광수용체 시냅스 영역(photoreceptor synaptic regions)을 투과전자현미경(TEM)으로 확인하였다. 그 결과, 원추세포의 리본 시냅스에 부착된 소포(vesicles)의 수가 감소하였다 (도 5 아래쪽 패널). 다만, 원추세포와 간상세포의 시냅스 소포(synaptic vesicle)의 수 및 크기에는 유의적인 차이가 없었다. Additionally, photoreceptor synaptic regions were confirmed using transmission electron microscopy (TEM). As a result, the number of vesicles attached to the ribbon synapse of cone cells decreased (lower panel of Figure 5). However, there was no significant difference in the number and size of synaptic vesicles between cone cells and rod cells.
상기 결과로부터, 본 발명에서는 KDM3B 유전자 결손이 원추세포의 리본 시냅스에 부착된 소포의 수의 감소와 관련됨을 확인하였다. From the above results, the present invention confirmed that KDM3B gene deletion is associated with a decrease in the number of vesicles attached to the ribbon synapse of cone cells.
실시예 4. KDM3B 유전자 결손의 동물모델에서 KDM3B 유전자의 생리학적 역할 분석 결과Example 4. Results of analysis of the physiological role of the KDM3B gene in an animal model of KDM3B gene deletion
본 발명자들은 KDM3B 유전자의 생리학적 역할을 확인하기 위해 암조건 및 명조건에서 망막전위도(electroretinogram, ERG)를 측정하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 상기 실시예의 결과와 일치하게, KDM3B 유전자가 결손된 마우스는 색을 구분하는 원추세포의 생리학적 기능이 현저히 감소한 반면 (도 6 아래쪽 패널), 어두운 환경에서 명암을 구분하는 간상세포의 생리학적 기능에는 유의적인 차이가 나타나지 않았다 (도 6 위쪽 패널). The present inventors performed an experiment measuring electroretinogram (ERG) in dark and light conditions to confirm the physiological role of the KDM3B gene. As a result, consistent with the results of the above example, mice lacking the KDM3B gene had a significantly reduced physiological function of cones that distinguish colors (lower panel of FIG. 6), while the physiological functions of rod cells that distinguish between light and dark in a dark environment were significantly reduced. No significant differences were observed in academic function (Figure 6 upper panel).
실시예 5. KDM3B 과발현 컨스트럭트의 제작 및 이의 망막질환의 치료 효능 분석 결과Example 5. Production of KDM3B overexpression construct and analysis of its efficacy in treating retinal diseases
본 발명자들은 KDM3B 유전자의 발현 증가를 통해 KDM3B 유전자 결손에 따른 원추세포의 손상을 회복할 수 있는지 확인하기 위해 KDM3B 유전자를 과발현할 수 있는 컨스트럭트(construct)를 제작하였다. 간단히, 본 발명의 KDM3B 과발현 컨스트럭트는 CMV 프로모터가 KDM3B 유전자와 작동가능하게 연결되며, CMV 프로모터와 KDM3B 유전자 사이에 Kozak 서열을 추가적으로 더 포함하고 있다 (도 7 위쪽 패널). The present inventors created a construct capable of overexpressing the KDM3B gene to determine whether damage to cones due to KDM3B gene deletion could be recovered by increasing the expression of the KDM3B gene. Briefly, the KDM3B overexpression construct of the present invention has the CMV promoter operably linked to the KDM3B gene, and additionally contains a Kozak sequence between the CMV promoter and the KDM3B gene (upper panel of FIG. 7).
이후, 8개월의 KDM3B 유전자 결손의 마우스에 상기 제작된 KDM3B 과발현 컨스트럭트를 망막하 주사(subretinal injection)로 주입한 후 원추세포의 손상을 회복하는 효과가 있는지 확인하는 위해 세포사멸(apoptosis) 마커인 Cytochrome c의 발현을 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과, KDM3B 과발현 컨스트럭트(Kdm3b-T2A-GFP)가 주입된 마우스에서는 대조군(pCMV-GFP)에 비해 Cytochrome c의 발현이 현저하게 감소하였음을 확인하였다 (도 7 아래쪽 패널).Afterwards, the KDM3B over-expression construct produced above was injected into 8-month-old KDM3B gene-deficient mice by subretinal injection, and then an apoptosis marker was used to determine whether it had an effect in recovering damage to cone cells. An experiment was performed to confirm the expression of Cytochrome c. As a result, it was confirmed that the expression of Cytochrome c was significantly reduced in mice injected with the KDM3B overexpression construct ( Kdm3b -T2A-GFP) compared to the control group (pCMV-GFP) (lower panel of Figure 7).
또한, 원추세포의 리본 시냅스의 수를 확인하기 위해 리본 시냅스를 표지할 수 있는 CtBP2 유전자의 발현을 측정하는 실험을 수행하였다. 그 결과, KDM3B 과발현 컨스트럭트(Kdm3b-T2A-GFP)가 주입된 마우스에서는 대조군(pCMV-GFP)에 비해 원추세포의 리본 시냅스의 수가 유의하게 증가하였음을 확인하였다 (도 8). Additionally, to confirm the number of ribbon synapses in cone cells, an experiment was performed to measure the expression of the CtBP2 gene, which can mark ribbon synapses. As a result, it was confirmed that the number of ribbon synapses of cone cells was significantly increased in mice injected with the KDM3B overexpression construct ( Kdm3b -T2A-GFP) compared to the control group (pCMV-GFP) (FIG. 8).
상기 결과로부터, 본 발명에서는 KDM3B 과발현 컨스트럭트가 원추세포의 세포사멸을 억제하고 원추세포의 리본 시냅스의 수를 증가시킴으로써 망막질환의 예방 또는 치료에 효과가 있음을 확인하였다. From the above results, the present invention confirmed that the KDM3B overexpression construct is effective in preventing or treating retinal diseases by suppressing apoptosis of cone cells and increasing the number of ribbon synapses of cone cells.
이로써, 본 발명은 KDM3B 유전자 또는 단백질이 망막질환, 특히 노인성 망막질환인 황반변성의 예방 또는 치료에 현저한 효과가 있음을 확인하였다. As a result, the present invention confirmed that the KDM3B gene or protein has a significant effect in preventing or treating retinal diseases, especially macular degeneration, which is an age-related retinal disease.
Claims (15)
A pharmaceutical composition for preventing or treating retinal diseases containing KDM3B (Lysine Demethylase 3B) protein as an active ingredient.
A gene encoding the KDM3B protein; A vector containing the above gene; A pharmaceutical composition for preventing or treating retinal disease, comprising as an active ingredient any one selected from the group consisting of host cells transformed with the vector.
상기 KDM3B 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가진 펩타이드인 것인, 약학 조성물.
The method of claim 1 or 2,
A pharmaceutical composition wherein the KDM3B protein is a peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or having more than 70% homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
상기 망막질환은 노인성 황반변성(AMD), 습성 황반변성, 건성 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 황반 부종, 낭포성 황반 부종, 색소성 망막염(RP), 레베르 선천 흑암시(LCA), 스타가르트병, 어셔 증후군, 맥락막 결여, 로드-콘 또는 콘-로드 디스트로피, 섬모병증, 진행성 망막 위축증, 맥락막 흑색종, 겸상 적혈구 망막증, 망막하 혈관신생, 맥락막 혈관신생, 망막 광수용체 질환, 망막 색소 상피-계 질환, 포도막염, 망막박리, 외상성 망막 손상, 의원성 망막 손상, 황반원공, 황반 모세관 확장증, 신경절 세포 질환, 시신경 세포 질환, 녹내장, 시신경병증, 허혈성 망막 질환, 미숙아 망막증, 망막 혈관 폐색, 결절맥락막혈관병증, 망막저산소증, 가족형 마크로아뉴리즘, 망막 혈관 질환, 안혈관 질환, 녹내장으로 인한 망막신경세포 퇴화 및 허혈성 시신경병증으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약학 조성물.
The method of claim 1 or 2,
The above retinal diseases include age-related macular degeneration (AMD), wet macular degeneration, dry macular degeneration, diabetic retinopathy, macular edema, cystic macular edema, retinitis pigmentosa (RP), Leber congenital amaurosis (LCA), and Starga. RT's disease, Usher syndrome, choroidal absence, Rod-con or Con-Rod dystrophy, ciliopathies, progressive retinal atrophy, choroidal melanoma, sickle cell retinopathy, subretinal neovascularization, choroidal neovascularization, retinal photoreceptor disease, retinal pigment. Epithelial-system diseases, uveitis, retinal detachment, traumatic retinal injury, iatrogenic retinal injury, macular hole, macular telangiectasia, ganglion cell disease, optic nerve cell disease, glaucoma, optic neuropathy, ischemic retinal disease, retinopathy of prematurity, retinal vascular occlusion, A pharmaceutical composition selected from the group consisting of nodular choroidal angiopathy, retinal hypoxia, familial macroneurism, retinal vascular disease, ocular vascular disease, retinal nerve cell degeneration due to glaucoma, and ischemic optic neuropathy.
상기 벡터는 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성 벡터인 것인, 약학 조성물.
According to claim 2,
A pharmaceutical composition, wherein the vector is a non-viral vector or a viral vector.
상기 비바이러스성 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 및 리포좀으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약학 조성물.
According to claim 5,
A pharmaceutical composition, wherein the non-viral vector is selected from the group consisting of linear DNA, plasmid DNA, and liposome.
상기 바이러스성 벡터는 레트로바이러스(Retrovirus) 벡터, 아데노바이러스(Adenovirus) 벡터, 아데노부속바이러스(Adeno-associated virus) 벡터, 헤스페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 벡터 및 렌티바이러스(Lentivirus) 벡터로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약학 조성물.
According to claim 5,
The viral vector consists of a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a Herpes simplex virus vector, and a lentivirus vector. A pharmaceutical composition selected from the group.
상기 숙주 세포는 줄기세포, 수지상 세포 및 종양세포로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약학 조성물.
According to claim 2,
A pharmaceutical composition wherein the host cells are selected from the group consisting of stem cells, dendritic cells, and tumor cells.
상기 조성물은 망막에 존재하는 광수용체 세포의 세포사멸을 감소 또는 억제하는 것인, 약학 조성물.
The method of claim 1 or 2,
The composition is a pharmaceutical composition that reduces or inhibits apoptosis of photoreceptor cells present in the retina.
상기 조성물은 광수용체 리본 시냅스(photoreceptor ribbon synapse)의 수를 증가 또는 회복시키는 것인, 약학 조성물.
The method of claim 1 or 2,
The composition is a pharmaceutical composition that increases or restores the number of photoreceptor ribbon synapses.
상기 조성물은 비경구, 점막 전달, 경피, 국소 및 점안제 형태로 이루어진 군에서 선택되는 투여되는 것인, 약학 조성물.
The method of claim 1 or 2,
A pharmaceutical composition, wherein the composition is administered selected from the group consisting of parenteral, mucosal delivery, transdermal, topical, and eye drop forms.
A composition for diagnosing or predicting prognosis of retinal disease, comprising an agent for measuring the expression level of KDM3B protein or the gene encoding it.
상기 제제는 KDM3B 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레이티드, 압타머 및 항체로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 조성물.
According to claim 12,
The composition is one selected from the group consisting of primers, probes, antisense oligonucleotides, aptamers, and antibodies capable of specifically binding to the KDM3B protein or the gene encoding it.
A kit for diagnosing or predicting prognosis of retinal disease, comprising the composition according to claim 12 or 13.
상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것인, 키트.
According to claim 14,
The kit is an RT-PCR kit, a DNA chip kit, or a protein chip kit.
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|---|---|---|---|
| KR1020220125798A KR20240046394A (en) | 2022-09-30 | 2022-09-30 | Pharmaceutical composition for preventing or treating retinal diseases comprising KDM3B protein or gene thereof |
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ID=90707721
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|---|---|---|---|---|
| KR20220046965A (en) | 2020-10-08 | 2022-04-15 | 중앙대학교 산학협력단 | Pharmaceutical composition for preventing or treating retinal diseases comprising Smug1 gene or protein |
-
2022
- 2022-09-30 KR KR1020220125798A patent/KR20240046394A/en unknown
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