KR20240045159A - 염증, 2차 감염 및 질환 중증도를 검출하기 위한 미생물 세포-유리 핵산의 서열분석 - Google Patents

염증, 2차 감염 및 질환 중증도를 검출하기 위한 미생물 세포-유리 핵산의 서열분석 Download PDF

Info

Publication number
KR20240045159A
KR20240045159A KR1020237024847A KR20237024847A KR20240045159A KR 20240045159 A KR20240045159 A KR 20240045159A KR 1020237024847 A KR1020237024847 A KR 1020237024847A KR 20237024847 A KR20237024847 A KR 20237024847A KR 20240045159 A KR20240045159 A KR 20240045159A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
mcfna
infection
amount
subject
total
Prior art date
Application number
KR1020237024847A
Other languages
English (en)
Inventor
아심 아흐메드
라드하 두타굽타
게오르기오스 디. 키트시오스
Original Assignee
카리우스, 인코포레이티드
유니버시티 오브 피츠버그 - 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 카리우스, 인코포레이티드, 유니버시티 오브 피츠버그 - 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션 filed Critical 카리우스, 인코포레이티드
Publication of KR20240045159A publication Critical patent/KR20240045159A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2523/00—Reactions characterised by treatment of reaction samples
    • C12Q2523/10—Characterised by chemical treatment
    • C12Q2523/109—Characterised by chemical treatment chemical ligation between nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2535/00—Reactions characterised by the assay type for determining the identity of a nucleotide base or a sequence of oligonucleotides
    • C12Q2535/122—Massive parallel sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)

Abstract

환자, 특히 폐렴, COVID-19 감염 또는 COVID-19 폐렴인 1차 감염을 갖는 환자에서 2차 감염을 검출하는 방법이 본원에 기재된다. 일부 경우에, 2차 감염은 2차 박테리아 감염, 예를 들어 2차 박테리아성 폐렴이다. 일부 경우에, 본원에 제공된 방법은 과염증 반응 또는 질환의 중증도 (예를 들어 중증 COVID-19 감염을 나타내거나 또는 질환 (예를 들어, COVID-19)으로 인한 사망의 위험을 제공함)를 검출한다. 본 개시내용은 또한 대상체로부터의 혈장으로부터 미생물 세포-유리 핵산 (예를 들어, mdfDNA)을 정량화함으로써 대상체에서 국부 호흡기 감염을 검출하는 방법을 제공한다. 일부 경우에, 혈장이 대상체로부터 수집되는 경우에 대상체는 박테리아혈증이 아니다. 본 개시내용은 또한 특히 배양-음성 폐렴을 갖는 환자에서 2차 감염을 검출하기 위한 증가된 신뢰도를 갖는 시스템, 예컨대 핵산-서열분석 시스템을 제공한다.

Description

염증, 2차 감염 및 질환 중증도를 검출하기 위한 미생물 세포-유리 핵산의 서열분석
상호-참조
본 출원은 2020년 12월 21일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 63/128,552, 2021년 1월 3일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 63/199,497 및 2021년 1월 19일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 63/139,245를 우선권 주장하며, 이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
중증 COVID-19 폐렴은 2차 박테리아 또는 진균 감염에 의해 악화될 수 있지만, 고립성 SARS-CoV-2 감염과의 그의 임상적 구별은, 특히 COVID-19를 갖는 환자에서의 침습적 진단에 관한 보다 제한된 관행으로 인해 어렵다. 본 발명자들은 비-침습적, 배양-비의존성 메타게놈 접근법 (미생물 세포-유리 DNA 서열분석 - mcfDNA-Seq)을 사용하여 DNA 병원체 (박테리아, 진균 또는 바이러스)에 의한 2차 감염에 대해 포괄적으로 스크리닝하고, 또한 COVID-19에서의 숙주 반응에 대한 순환 mcfDNA의 생물학적 영향에 대해 조사하고자 하였다.
숙주 염증 반응에서의 가변성은 위중한 환자에서의 결과의 주요 예측인자로서 부상하였다. 집중 치료실 (ICU)에 입원 시 숙주 선천성 면역 및 염증의 상승된 바이오마커는 중증 폐렴 및 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)을 갖는 환자에서의 악화된 결과와 일관되게 연관되었다. 이러한 염증 반응의 특이적 자극 및 촉발에 관해서는 거의 알려져 있지 않지만, 최근 연구는 급성 호흡 부전을 갖는 환자에서의 폐 마이크로바이옴에 변동이 있다는 것을 암시한다. 낮은 지역사회 다양성 및 호흡기도 내 병원성 박테리아의 높은 존재비는 상승된 염증 바이오마커 및 악화된 임상 결과와 상관관계가 있을 가능성이 있다. 이러한 초기 전신 염증 반응이 폐포 공간 내 미생물과 면역 세포 사이의 국부 상호작용 또는 손상된 폐포 상피로부터 누출되는 순환 병원체-연관 분자 패턴 (PAMP)으로부터의 선천성 면역의 전신 활성화를 반영하는지 여부는 불명확하다. 이러한 구별은 중증 폐렴 발병기전을 이해하고 순환 PAMP에 대한 원인 메카니즘을 명확히 하는 데 중요하다.
순환 미생물 세포-유리 DNA (mcfDNA)에 대한 고감도 혈장 메타게놈 서열분석의 출현은 폐렴에서의 전신 숙주-반응에 대한 PAMP (mcfDNA)의 영향을 연구할 기회를 제공한다.
한 측면에서, 1차 감염을 갖는 대상체에서 2차 감염을 검출하는 방법으로서, (a) 1차 감염을 갖는 대상체로부터 수득된 혈액으로부터 혈장 샘플을 제조하며, 여기서 혈장 샘플은 적어도 2종의 상이한 미생물로부터의 미생물 세포-유리 핵산 (mcfNA)을 포함하는 것인 단계; (b) 어댑터에 부착된 mcfNA를 포함하는 서열분석 라이브러리를 생성하는 단계; (c) 어댑터에 부착된 mcfNA를 포함하는 서열분석 라이브러리에 대해 차세대 서열분석을 수행함으로써 혈장 샘플 내 총 mcfNA의 양을 측정하며, 여기서 총 mcfNA는 적어도 2종의 상이한 미생물로부터의 mcfNA를 포함하는 것인 단계; (d) 적어도 2종의 상이한 미생물로부터의 mcfNA를 포함하는 총 mcfNA의 양을 총 mcfNA의 한계치 양과 비교하는 단계; 및 (e) 적어도 2종의 상이한 미생물로부터의 mcfNA를 포함하는 총 mcfNA의 양이 총 mcfNA의 한계치 양을 초과하는 경우에 1차 감염과 상이한 2차 감염을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 1차 감염을 갖는 대상체에서 2차 감염을 검출하는 방법으로서, (a) 1차 감염을 갖는 대상체로부터 수득된 혈액으로부터 혈장 샘플을 제조하며, 여기서 혈장 샘플은 적어도 2종의 상이한 미생물로부터의 미생물 세포-유리 핵산 (mcfNA)을 포함하는 것인 단계; (b) 차세대 서열분석을 수행함으로써 혈장 샘플 내 총 mcfNA의 양을 측정하며, 여기서 총 mcfNA는 적어도 2종의 상이한 미생물로부터의 mcfNA를 포함하는 것인 단계; (c) 적어도 2종의 상이한 미생물로부터의 mcfNA를 포함하는 총 mcfNA의 양을 총 mcfNA의 한계치 양과 비교하는 단계; 및 (d) 적어도 2종의 상이한 미생물로부터의 mcfNA를 포함하는 총 mcfNA의 양이 총 mcfNA의 한계치 양을 초과하는 경우에 1차 감염과 상이한 2차 감염을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 1차 감염을 갖는 대상체에서 2차 감염을 치료하는 방법으로서, (a) 1차 감염을 갖는 대상체로부터 혈액 샘플을 수집하는 단계; (b) 혈액 샘플 내 적어도 2종의 미생물로부터의 미생물 세포-유리 핵산 (mcfNA)을 포함하는 총 mcfNA의 양이 총 mcfNA의 한계치 양을 초과하는 경우에 2차 감염을 검출하며, 여기서 총 mcfNA의 양은 차세대 서열분석에 의해 계산되는 것인 단계; 및 (c) 1차 감염을 갖는 대상체에게 치료 약물을 투여하여 2차 감염을 치료하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 경우에, 방법은 (d) 혈액 내 총 mcfNA의 양이 총 mcfNA의 한계치 양 이하의 값으로 감소할 때까지 (a), (b) 및 (c)를 반복하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 1차 감염을 갖는 대상체에서 2차 감염을 치료하는 방법으로서, (a) 1차 감염을 갖는 대상체로부터 혈액 샘플을 수집하는 단계; 및 (b) 혈액 샘플 내 적어도 2종의 미생물로부터의 미생물 세포-유리 핵산 (mcfNA)을 포함하는 총 mcfNA의 양이 총 mcfNA의 한계치 양을 초과하는 경우에 2차 감염을 검출하며, 여기서 총 mcfNA의 양은 차세대 서열분석에 의해 계산되는 것인 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 1차 감염은 COVID-19 감염이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 1차 감염은 바이러스 폐 감염이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 1차 감염은 COVID-19 폐렴이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 2차 감염은 박테리아 또는 진균 감염이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에서 적어도 1종의 박테리아, 진균 또는 기생충의 존재를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 1차 및 2차 감염은 상이한 미생물에 의해 유발된 호흡기 감염이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 1차 및 2차 감염은 상이한 미생물에 의해 유발된 폐렴이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 적어도 2종의 미생물은 호흡기 병원체이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 적어도 2종의 미생물은 에스. 아우레우스(S. aureus), 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 및 케이. 뉴모니아에(K. Pneumoniae)로 이루어진 군으로부터의 적어도 2종의 미생물이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 적어도 2종의 미생물은 표 2에 열거된 적어도 2종의 미생물이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 적어도 2종의 미생물은 표 2에 열거된 적어도 2종의 호흡기 병원체이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 1차 감염은 배양-양성 폐렴이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 1차 감염은 배양-음성 폐렴이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 적어도 2종의 미생물은 칸디다(Candida)를 포함한다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 총 mcfNA의 양은 샘플 내 각각의 유형의 mcfNA의 합한 양이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 총 mcfNA의 양은 샘플 내 총 박테리아 mcfNA의 합한 양이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 총 mcfNA의 양은 샘플 내 호흡기 병원체로부터의 총 mcfNA의 합한 양이다. 임의의 상기 방법에서, 총 mcfNA의 한계치 양은 건강한 또는 비감염 대상체의 혈장에서 측정된 mcfNA의 양이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 총 mcfNA의 양은 메타게놈 차세대 서열분석에 의해 측정된다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, mcfNA는 mcfDNA이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 혈장 또는 혈액 샘플에 알려진 농도의 합성 정규화 대조군이 스파이킹된다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, mcfNA는 대상체의 혈장으로부터 추출된다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, DNA 서열분석 라이브러리는 추출된 mcfNA로부터 구축되고, 서열 판독물은 서열분석 라이브러리로부터 생성된다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 샘플 내 mcfNA의 양을 측정하는 단계는 (a) 서열 판독물을 미생물 데이터베이스와 정렬하며, 여기서 미생물 라이브러리는 10,000개 초과의 게놈 참조 서열을 포함하는 것인 단계; (b) 높은 퍼센트 동일성 및 높은 쿼리 커버리지를 갖는 정렬을 포함하는 신뢰가능한 판독물을 보유하는 단계; (c) 신뢰가능한 판독물의 수 및 그의 정렬에 기초하여 각각의 분류군에 상대 존재비를 배정하는 단계; (d) 분류군 존재비의 각각의 추정치에 대한 통계적 유의성 값을 컴퓨터 계산하는 단계; (e) 분류군 존재비를 사용하여 mcfNA 농도를 결정하는 단계; 및/또는 (f) 스파이킹된 합성 정규화 대조군의 존재비를 사용하여 샘플 내 mcfNA의 마이크로리터당 분자 (MPM) 값을 계산하는 단계를 포함한다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 미생물 라이브러리는 적어도 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, 5000, 9000, 10000 또는 15000개의 게놈 참조 서열을 포함한다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 방법은 대상체의 혈장 샘플 내 선천성 면역 또는 상피 또는 내피 손상의 바이오마커의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 바이오마커는 IL-6, IL-8, IL-10, RAGE, TNFR1, 안지오포이에틴-2, 프로칼시토닌, 프랙탈카인, 펜트락신-3 및 ST2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 바이오마커는 IL-8 또는 ST2이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 바이오마커는 프로칼시토닌 또는 펜트락신-3이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 방법은 알고리즘을 사용하여 환자에서의 mcfNA의 양을 바이오마커 수준과 비교함으로써 시험 점수를 산출하는 단계를 추가로 포함한다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 방법은 시험 점수에 기초하여 환자에게 치료 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 치료 약물은 임의로 항미생물 약물, 항생 약물 또는 항진균 약물이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 양은 혈장 마이크로리터당 분자 (MPM)로 측정된다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 총 mcfNA의 한계치 양은 샘플 내 모든 유형의 mcfNA에 대해 400개 초과의 MPM이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 총 mcfNA가 적어도 100종의 상이한 미생물로부터의 서열을 포함하는 게놈 데이터베이스에 대해 서열 판독물을 정렬함으로써 결정되는 경우에 총 mcfNA의 한계치 양은 샘플 내 총 mcfNA에 대해 600개 초과의 MPM이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 총 mcfNA의 한계치 양은 샘플 내 호흡기 병원체로부터의 mcfNA에 대해 4000개 초과의 MPM이다. 임의의 상기 방법에서, 총 mcfNA가 적어도 100종의 상이한 미생물로부터의 서열을 포함하는 게놈 데이터베이스에 대해 서열 판독물을 정렬함으로써 결정되는 경우에 총 mcfNA의 한계치 양은 4000개 초과의 MPM이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, (a)에서의 대상체는 실험적 항생제를 받았다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 대상체는 박테리아혈증이 아니다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 방법은 합성 핵산을 혈장 샘플에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 방법은 합성 핵산의 차세대 서열분석을 수행하는 단계를 추가로 포함한다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 방법은 어댑터를 세포-유리 핵산에 부착하여 어댑터에 부착된 세포-유리 핵산을 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 어댑터는 세포-유리 핵산에 라이게이션된다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 어댑터는 프라이머 연장 반응에 의해 세포-유리 핵산에 부착된다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 어댑터는 대상체에 고유한 서열을 포함한다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 방법은 어댑터에 부착된 세포-유리 핵산을 상이한 대상체로부터 수득된 세포-유리 핵산과 조합하는 단계를 추가로 포함한다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 상이한 대상체로부터 수득된 세포-유리 핵산은 상이한 대상체에 고유한 서열을 포함하는 어댑터에 부착된다.
또 다른 측면에서, 환자에서 염증 반응을 검출하는 방법으로서, (a) 환자로부터 수득된 혈액으로부터 혈장 샘플을 제조하며, 여기서 혈장 샘플은 미생물 세포-유리 핵산 (mcfNA)을 포함하는 것인 단계; (b) 어댑터에 부착된 mcfNA를 포함하는 서열분석 라이브러리를 생성하는 단계; (c) 혈장 샘플 내 총 mcfNA의 양을 측정하며, 여기서 총 mcfNA는 적어도 2종의 상이한 미생물로부터의 mcfNA를 포함하는 것인 단계; (d) 총 mcfNA의 양을 mcfNA의 한계치 양과 비교하는 단계; 및 (e) 총 mcfNA의 양이 총 mcfNA의 한계치 양을 초과하는 경우에 염증 반응을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 환자에서 염증 반응을 검출하는 방법으로서, (a) 환자로부터 수득된 혈액으로부터 혈장 샘플을 제조하며, 여기서 혈장 샘플은 미생물 세포-유리 핵산 (mcfNA)을 포함하는 것인 단계; (b) 혈장 샘플 내 총 mcfNA의 양을 측정하며, 여기서 총 mcfNA는 적어도 2종의 상이한 미생물로부터의 mcfNA를 포함하는 것인 단계; (c) 총 mcfNA의 양을 mcfNA의 한계치 양과 비교하는 단계; 및 (d) 총 mcfNA의 양이 총 mcfNA의 한계치 양을 초과하는 경우에 염증 반응을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 환자에서 염증 반응을 치료하는 방법으로서, (a) 환자로부터 혈액 샘플을 수집하는 단계; (b) 혈액 샘플 내 총 mcfNA의 양이 적어도 2종의 상이한 미생물로부터의 mcfNA를 포함하고 총 mcfNA의 한계치 양을 초과하는 경우에 환자에서 염증 반응을 검출하는 단계; 및 (c) 환자에게 항염증 약물을 투여하여 염증 반응을 치료하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 환자에서 염증 반응을 치료하는 방법으로서, (a) 환자로부터 혈액 샘플을 수집하는 단계; 및 (b) 혈액 샘플 내 총 mcfNA의 양이 적어도 2종의 상이한 미생물로부터의 mcfNA를 포함하고 총 mcfNA의 한계치 양을 초과하는 경우에 환자에서 염증 반응을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 대상체는 폐렴을 갖는다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 폐렴은 배양-양성 폐렴이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, 폐렴은 배양-음성 폐렴이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, mcfNA는 mcfDNA이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, mcfNA의 한계치 양은 혈장 마이크로리터당 100,000개 초과의 분자 (MPM)이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, mcfNA의 한계치 양은 알려진 호흡기 병원체로부터의 mcfNA에 대해 혈장 마이크로리터당 100,000개 초과의 분자 (MPM)이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 혈장 샘플 내 선천성 면역 또는 상피 또는 내피 손상의 바이오마커의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 바이오마커는 IL-6, IL-8, IL-10, RAGE, TNFR1, 안지오포이에틴-2, 프로칼시토닌, 프랙탈카인, 펜트락신-3 및 ST2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 바이오마커는 IL-8 또는 ST2이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 바이오마커는 프로칼시토닌 또는 펜트락신-3이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 방법은 알고리즘을 사용하여 대상체에서의 mcfNA의 양을 바이오마커 수준과 비교함으로써 시험 점수를 산출하는 단계를 추가로 포함한다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 방법은 시험 점수에 기초하여 대상체에게 치료 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 대상체는 박테리아혈증이 아니다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 어댑터는 라이게이션에 의해 세포-유리 핵산에 부착된다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 어댑터는 프라이머 연장에 의해 세포-유리 핵산에 부착된다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 염증 반응은 과염증 반응이다.
또 다른 측면에서, COVID-19 감염을 갖는 환자에서 박테리아 감염을 검출하는 방법으로서, (a) COVID-19 감염을 갖는 환자로부터 수득된 혈액으로부터 혈장 샘플을 제조하며, 여기서 혈장 샘플은 미생물 세포-유리 핵산 (mcfNA)을 포함하는 것인 단계; (b) 어댑터에 부착된 mcfNA를 포함하는 서열분석 라이브러리를 생성하는 단계; (c) 서열분석 라이브러리에 대해 차세대 서열분석을 수행하여 mcfNA에 상응하는 서열 판독물을 생성하는 단계; (d) 서열 판독물을 적어도 1000개의 박테리아 참조 서열을 포함하는 데이터베이스로부터의 서열에 대해 정렬하는 단계; (e) 서열 판독물의 정렬에 기초하여 적어도 1종의 박테리아로부터의 mcfNA의 양을 결정하는 단계; 및 (f) 적어도 1종의 박테리아로부터의 mcNA의 양에 기초하여 환자에서 박테리아 감염을 확인하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, COVID-19 감염을 갖는 환자에서 박테리아 감염을 검출하는 방법으로서, (a) COVID-19 감염을 갖는 환자로부터 수득된 혈액으로부터 혈장 샘플을 제조하며, 여기서 혈장 샘플은 미생물 세포-유리 핵산 (mcfNA)을 포함하는 것인 단계; (b) 차세대 서열분석을 수행하여 mcfNA에 상응하는 서열 판독물을 생성하는 단계; (c) 서열 판독물을 적어도 1000개의 박테리아 참조 서열을 포함하는 데이터베이스로부터의 서열에 대해 정렬하는 단계; (d) 서열 판독물의 정렬에 기초하여 적어도 1종의 박테리아로부터의 mcfNA의 양을 결정하는 단계; 및 (e) 적어도 1종의 박테리아로부터의 mcNA의 양에 기초하여 환자에서 박테리아 감염을 확인하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, COVID-19 감염을 갖는 환자에서 박테리아 감염을 진단 및 치료하는 방법으로서, (a) COVID-19 감염을 갖는 환자로부터 혈액 샘플을 수집하는 단계; (b) 혈액 샘플 내 박테리아 mcfNA의 양이 mcfNA의 한계치 양을 초과하는 경우에 박테리아 감염을 검출하는 단계; 및 (c) 환자에게 치료 약물을 투여하여 박테리아 감염을 치료하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, COVID-19 감염을 갖는 환자에서 박테리아 감염을 진단 및 치료하는 방법으로서, (a) COVID-19 감염을 갖는 환자로부터 혈액 샘플을 수집하는 단계; 및 (b) 혈액 샘플 내 박테리아 mcfNA의 양이 mcfNA의 한계치 양을 초과하는 경우에 박테리아 감염을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 환자는 COVID-19 폐렴을 갖는다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 박테리아 감염은 호흡기 감염이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, mcfNA (예를 들어, mcfDNA)는 에스. 아우레우스, 피. 아에루기노사 또는 케이. 뉴모니아에로부터의 박테리아 mcfNA이다. 일부 실시양태에서, mcfNA (예를 들어, mcfDNA)는 표 2에 열거된 적어도 1종의 병원체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, mcfNA (예를 들어, mcfDNA)는 표 2에 열거된 적어도 1종의 호흡기 병원체로부터 유래된다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 환자는 배양-양성 폐렴을 갖는다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 환자는 배양-음성 폐렴을 갖는다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, mcfNA의 한계치 양은 건강한 또는 비감염 대상체의 혈장에서 측정된 mcfNA의 양이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, mcfNA의 양은 메타게놈 차세대 서열분석에 의해 측정된다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, mcfNA는 mcfDNA이다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 혈장에 알려진 농도의 합성 정규화 대조군이 스파이킹된다.
또 다른 측면에서, 1차 감염을 갖는 대상체에서 2차 감염을 검출하기 위한 핵산 서열분석 시스템으로서, (a) 플로우 셀 및 플로우 셀에서 수행된 측정으로부터 수집된 서열 판독물을 포함하는 데이터를 출력하는 컴퓨터 프로세서를 포함하는 차세대 서열분석 장치; 및 (b) (i) 서열 판독물을 미생물 참조 서열 판독물에 대해 정렬함으로써 적어도 2종의 상이한 미생물로부터의 미생물 세포-유리 핵산 (mcfNA)을 검출하고; (ii) 혈장 마이크로리터당 분자의 함수로서 총 mcfNA를 계산하고, 여기서 총 mcfNA는 적어도 2종의 상이한 미생물로부터의 mcfNA의 합한 값이고; (iii) 총 mcfNA가 한계치 값을 초과하는 경우에 2차 감염을 나타내는 사건을 생성하는 사건 생성기를 포함하는 총 mcfNA의 정량화 논리를 포함하는 컴퓨터 계산 장치를 포함하는 핵산 서열분석 시스템이 제공된다. 일부 실시양태에서, 총 미생물 세포-유리 핵산 (mcfNA)의 정량화 논리는 서열 판독물이 인간 참조 서열에 대해 정렬되는 경우에 이들 서열 판독물을 분석으로부터 배제하는 논리를 포함한다. 일부 실시양태에서, 총 미생물 세포-유리 핵산 (mcfNA)의 정량화 논리는 서열 판독물이 합성 핵산 참조물에 대해 정렬되는 경우에 이들 서열 판독물을 분석으로부터 배제하는 논리를 포함한다. 일부 실시양태에서, mcfNA는 미생물 세포-유리 DNA이다. 일부 실시양태에서, 한계치 값은 적어도 600개 MPM이다. 일부 실시양태에서, 한계치 값은 적어도 4000개 MPM이다.
또 다른 측면에서, 폐렴을 나타내는 대상체에서 2차 감염을 검출하는 방법으로서, (a) 상기 대상체로부터 혈장 샘플을 수득하는 단계; (b) 상기 샘플 내 미생물 세포-유리 핵산의 양을 평가하는 단계; (c) 미생물 세포-유리 핵산의 상기 양을 한계치 수준과 비교하는 단계; 및 (d) 미생물 세포-유리 핵산의 상기 양이 상기 한계치 수준을 초과하는 경우에 2차 감염을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 대상체는 COVID-19를 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 2차 감염은 박테리아 또는 진균 감염이다. 일부 실시양태에서, 방법은 상기 대상체에서 적어도 1종의 박테리아, 진균 또는 기생충의 존재 및 양을 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 바이러스 감염을 갖는 대상체에서 국부 부위에서의 2차 감염을 확인하는 방법으로서, (a) 상기 대상체로부터 혈장 샘플을 수득하는 단계; (b) 상기 샘플 내 미생물 세포-유리 핵산의 양을 평가하는 단계; (c) 미생물 세포-유리 핵산의 상기 양을 한계치 수준과 비교하는 단계; 및 (d) 미생물 세포-유리 핵산의 상기 양이 상기 한계치 수준을 초과하는 경우에 상기 대상체에서 국부 부위에서의 감염을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 국부 부위는 폐이다.
또 다른 측면에서, 폐렴을 나타내는 대상체에서 호흡기 감염을 검출하는 비-침습적 방법으로서, (a) 상기 대상체로부터 혈장 샘플을 수득하는 단계; (b) 상기 샘플 내 미생물 세포-유리 핵산의 양을 평가하는 단계; (c) 미생물 세포-유리 핵산의 상기 양을 한계치 수준과 비교하는 단계; 및 (d) 미생물 세포-유리 핵산의 상기 양이 상기 한계치 수준을 초과하는 경우에 호흡기 감염을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 대상체는 Covid-19를 갖고, 폐렴의 위험이 있다.
또 다른 측면에서, 2차 감염이 있는 것으로 의심되는 환자를 치료하는 방법으로서, 환자로부터의 샘플에서 미생물 세포-유리 핵산 수준 값 (양)을 결정하는 단계 및 환자로부터의 샘플에서 선천성 면역의 바이오마커 (예를 들어, IL-8 및 ST2) 및/또는 박테리아 감염의 바이오마커 (예를 들어, 프로칼시토닌 및 펜트락신-3)를 포함하는 바이오마커의 세트인 바이오마커의 세트의 수준을 결정하는 단계; 및 발현 수준 값을 바이오마커 수준과 비교하여 시험 점수를 산출하는 단계에 의해 환자가 항미생물 요법으로부터 이익을 얻을 것인지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 시험 점수에 기초하여 환자에게 항미생물 요법을 포함하는 치료 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 질환을 갖는 대상체에서 염증 반응의 위험 또는 예후를 평가하는 방법으로서, 대상체로부터의 혈액 샘플에 대해 적어도 1종의 면역검정을 수행하여 적어도 2종의 단백질 마커 (여기서 적어도 2종의 단백질 마커는 프랙탈카인, 인터류킨(IL)-6, IL-8, 펜트락신-3, 프로칼시토닌, 진행성 당화 최종 산물에 대한 수용체 (RAGE), 종양발생성 억제 (ST)-2 및 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR)-1로부터 선택된 적어도 2종의 마커를 포함함)에 대한 단백질 수준 데이터를 포함하는 제1 데이터세트를 생성하여 다중-바이오마커 염증 활성 점수 (MBDA)를 제공하는 단계; 대상체로부터의 혈액 샘플에 대해 적어도 1종의 검정을 수행하여 미생물 세포-유리 DNA (mcfDNA)의 밀리리터당 분자 (MPM)를 결정하는 단계; 및 mcfDNA MPM 및 MBDA 점수에 기초하여 상승된 염증 반응의 위험/예후를 결정하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 질환은 폐의 폐렴이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인공호흡기-연관 폐렴을 갖는다. 임의의 상기 방법에서, 일부 실시양태에서, 염증 반응은 과염증 반응이다.
또 다른 측면에서, 폐렴을 갖는 대상체에 대해 염증 진행 (IP) 위험 점수를 수득하는 방법으로서, 상기 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하거나 또는 수득하였던 단계; 상기 대상체에 대해 다중-바이오마커 염증 활성 점수 (MBDA)를 결정하는 단계; 미생물 세포-유리 DNA (mcfDNA)의 밀리리터당 분자 (MPM)를 결정하는 단계; 및 해석 함수를 사용하여 상기 대상체의 MBDA 및 MPM으로부터 IP 위험 점수를 수득하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 염증 반응은 과염증 반응이다.
또 다른 측면에서, 대상체에서 국부 호흡기 감염을 검출하는 방법으로서, 대상체로부터 혈장 샘플을 수득 또는 제공하며, 여기서 대상체는 박테리아혈증이 아니고, 혈장 샘플은 세포-유리 핵산을 포함하는 것인 단계; 혈장 샘플로부터의 세포-유리 핵산에 대해 차세대 서열분석 또는 메타게놈 서열분석을 수행하고, 서열 판독물을 생성하는 단계; 및 서열 판독물을 호흡기 병원체의 서열과 정렬하여 적어도 1종의 호흡기 병원체의 존재 및 양을 검출하며, 여기서 적어도 1종의 호흡기 병원체는 국부 호흡기 감염과 연관된 것인 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포-유리 핵산은 세포-유리 DNA이다. 일부 실시양태에서, 호흡기 병원체의 서열과 정렬된 서열 판독물은 미생물 세포-유리 DNA에 상응한다. 일부 실시양태에서, 호흡기 감염은 폐렴이다. 일부 실시양태에서, 호흡기 감염은 박테리아성 폐렴이다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 호흡기 병원체는 호흡기 감염과 연관된 적어도 1종의 박테리아이다. 일부 실시양태에서, 호흡기 감염은 박테리아성 호흡기 감염이다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 호흡기 병원체는 에스. 아우레우스, 피. 아에루기노사 또는 케이. 뉴모니아에이다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 호흡기 병원체는 표 2에 열거된 적어도 1종의 호흡기 병원체이다. 일부 실시양태에서, 방법은 합성 핵산을 혈장 샘플에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 합성 핵산에 대해 차세대 서열분석을 수행하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 합성 핵산은 정규화 대조군이다. 일부 실시양태에서, 방법은 어댑터를 세포-유리 핵산에 부착하여 어댑터에 부착된 세포-유리 핵산을 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 어댑터는 세포-유리 핵산에 라이게이션된다. 일부 실시양태에서, 어댑터는 프라이머 연장 반응에 의해 세포-유리 핵산에 부착된다. 일부 실시양태에서, 어댑터는 대상체에 고유한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 어댑터에 부착된 세포-유리 핵산을 상이한 대상체로부터 수득된 세포-유리 핵산과 조합하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상이한 대상체로부터 수득된 세포-유리 핵산은 상이한 대상체에 고유한 서열을 포함하는 어댑터에 부착된다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 치료 (예를 들어, 항생제)를 투여하여 호흡기 감염을 치료하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항생제를 투여하여 호흡기 감염과 연관된 적어도 1종의 병원체를 치료하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 대상체는 혈액 배양 음성이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 혈액 배양 양성이다. 일부 실시양태에서, 호흡기도로부터의 분비물의 배양은 양성이다. 일부 실시양태에서, 호흡기도 분비물의 배양은 음성이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 박테리아성 폐렴 및 바이러스성 폐렴을 갖는다. 일부 경우에, 바이러스성 폐렴은 SARS-CoV-2 바이러스에 의해 유발된다. 일부 실시양태에서, 박테리아성 폐렴은 에스. 아우레우스, 피. 아에루기노사 또는 케이. 뉴모니아에에 의해 유발된다. 일부 실시양태에서, 박테리아성 폐렴은 표 2에 열거된 호흡기 병원체에 의해 유발된다.
참조로 포함됨
본 명세서에서 언급된 모든 공개물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 공개물, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 나타내어지는 것과 동일한 정도로 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
도 1a는 배양-양성 폐렴, 비감염 대조군, 배양-음성 폐렴 및 COVID-19를 갖는 환자에 대한 총 mcfDNA (MPM)를 보여준다. 평균 값은 수평 막대로 제시되고, 표준 편차는 직사각형으로 제시된다. 통계적 유의성 (별표)이 배양-양성 폐렴 대 COVID-19 (p<0.001) 및 비감염 대조군 대 COVID-19 (p<0.05)에 대해 제시된다. 도 1b는 상이한 경로와 연관된 바이오마커의 회귀 계수 (95% CI) 및 p-값을 보여준다.
도 2a 및 도 2b는 중증 COVID-19 감염의 비-생존자가 생존자와 비교하여 메타게놈 서열분석에 의해 혈장 마이크로리터당 더 많은 미생물 세포-유리 DNA 분자를 가졌고 (중앙값 [사분위간 범위]: 11,125 [650-26,436] 대 661 [1], 윌콕슨 검정 p-값 = 0.04), 샘플당 더 많은 수의 확인된 미생물에 대한 경향을 가졌다는 것을 보여준다 (3.5 [1.8-4.3] 대 1.0 [0-2.5], 윌콕슨 검정 p-값 = 0.06). 도 2a는 마이크로리터당 총 mcfDNA 분자를 보여준다. 도 2b는 혈장 메타게놈학에 의해 검출된 미생물의 수를 보여준다.
도 3은 도시된 임상 진단, 혈장 미생물 세포-유리 DNA 메타게놈학 및 생존 결과에 의한 COVID-19를 갖는 15명의 위중한 환자의 사례-기반 분석을 보여준다. Y-축 가장자리는 임상 진단의 2개 군을 나타낸다: 군 A는 미생물학적으로 확인된 감염 (n = 3) 또는 미생물학적 정밀검사 음성에도 불구하고 임상적으로 의심되는 감염 (n = 8)에 대해 항생제를 받은 11명의 환자를 포함하는 반면, 군 B는 2차 감염에 대한 임상적 의심이 낮고 샘플링 시에 항생제 요법이 없는 4명의 환자를 포함한다. Y-축 눈금은 각각의 환자 샘플을 나타내고, 각각의 적층된 막대의 x-높이는 메타게놈 서열분석에 의한 혈장 마이크로리터당 미생물 세포-유리 DNA 분자의 수 (MPM)를 나타내며, 순위화된 존재비에 의해 상위 10종의 미생물에 대해 색상이 상이하다. "기타" 카테고리 (회색으로 제시됨)는 공생 기원의 보다 낮은 존재비 분류군의 합계를 나타낸다. 군 A의 11명의 대상체 중 5명 (45%, 대상체 1-5)은 개연성 있는 호흡기 병원체에 대해 높은 MPM 신호를 가진 반면, 나머지 6/11명의 대상체에서는 공동-감염 박테리아 병원체의 증거가 없었다. 대상체 7은 배양-음성 패혈증으로 임상적으로 진단되었고, COVID-19로부터의 불응성 저산소혈증 호흡 부전에 대한 체외 막 산소화 지원 하에 장기간 과정의 실험적 광역 항생제로 치료되었으며; 씨. 트로피칼리스(C. tropicalis)에 대한 높은 mcfDNA 신호 (2,490개 MPM)는 비진단 침습성 칸디다증에 관한 것으로, 연구 샘플 획득 후 제5일, 제9일 및 제14일에 수득된 임상 기관지폐포 세척 샘플로부터의 효모 유기체 (추가로 종분화되지 않음)의 지속적 성장에 의해 확증되었다. 생존하지 않고 실험적 항미생물제를 받지 않은 군 B의 4명의 환자 중 2명 (대상체 12 및 13)은 개연성 있는 호흡기 병원체의 높은 mcfDNA 신호 (> 4000개의 총 MPM)를 갖는 것으로 밝혀졌으며, 이는 비진단 (및 비치료) 2차 감염을 나타낸다.
도 4a는 배양-음성 폐렴 및 비감염 대조군과 비교하여, 그리고 배양-음성 폐렴 환자와 비교하여 배양-양성 폐렴에서 혈장 미생물 세포-유리 DNA 수준이 상승된다는 것을 보여준다 (벤자미니-호크베르크 방법에 의해 사후 조정된 쌍별 비교). *, 사후 p<0.05; ***, 사후 p<0.005; ****, 사후 p<0.001. 도 4b는 파이 차트에 도시된 배양-양성, 배양-음성 폐렴 및 비감염 대조군에서 검출된 mcfDNA (박테리아, 진균 또는 바이러스)의 유형을 보여준다. 파이 차트의 반경은 각각의 환자 하위군 내에서 검출된 mcfDNA MPM의 합계에 2차적으로 비례한다. 바이러스 mcfDNA의 비율은 배양-양성 폐렴 (1.6%) 군과 비교하여 배양-음성 (18.0%) 군에서 유의하게 더 높았다 (비율의 비교의 z 검정에 대해 p<0.0001).
도 5a 및 도 5b는 순환 mcfDNA가 폐렴을 갖는 환자에서 숙주 염증 반응과 연관된다는 것을 보여준다. 도 5a는 (i) 미생물 접종물의 대용물 (배양-양성 대 음성 분류), (ii) 폐 손상의 정도 (방사선촬영으로 RSI에 의해 및 상피 손상 바이오마커인 진행성 당화 최종 산물에 대한 수용체 - RAGE에 의해 도시된 바와 같음) 및 (iii) 숙주 선천성 면역 상태 (연령, 만성 폐쇄성 폐 질환 및 면역억제)를 포함한, 선험적으로 선택된 잠재적 혼동요인에 대한 조정된 모델 뿐만 아니라 비조정 모델에서 혈장 mcfDNA 수준 (예측인자, x-축에 제시됨)에 대한 혈장 바이오마커 (결과, y-축에 제시됨)의 선형 회귀 모델의 그래프 표현이다. 각각의 혈장 바이오마커에 대한 mcfDNA의 회귀 계수에 대한 효과 크기의 방향 및 상응하는 통계적 유의성은 각각 색 및 크기 코딩에 의해 가시적으로 제시되며; 회귀 결과는 표 4에 상세히 열거된다. 도 5b는 숙주-반응 하위표현형의 그래프이다. 과염증 하위표현형에 배정된 폐렴을 갖는 환자는 저염증 환자와 비교하여 유의하게 더 높은 mcfDNA를 가졌다 (각각 중앙값 7,731, 사분위간 범위-IQR, MPM, [3,100-79,849] 대 546 [0-4,609], p<0.05). 본 발명자들은 안지오포이에틴-2, 프로칼시토닌, TNFR1 및 비카르보네이트의 수준을 이용하는 엄격한 예측 모델에 기초하여 환자를 과염증 대 저염증 하위표현형으로 배정하였다.
도 6a 및 도 6b는 폐렴을 갖는 환자에서 mcfDNA 및 프로칼시토닌 수준에 대한 샘플링 및 항생제 노출의 시기의 영향을 보여준다. 도 6a는 배양 양성 환자와 배양 음성 환자 사이의 ICU 입원으로부터의 샘플링 시간을 보여준다. 도 6b는 배양 양성 환자와 배양 음성 환자 사이의 삽관으로부터의 샘플링 시간을 보여준다. 배양-양성 환자는 배양-음성 환자와 비교하여 삽관으로부터 비교적 더 짧은 시간 간격을 가졌다 (p = 0.014, 윌콕슨 검정). 도 6c 및 도 6d는 프로칼시토닌 수준이 ICU 입원 (도 6d) 또는 삽관 (도 6c)으로부터의 샘플링 시간에 따라 상이하지 않았다는 것을 보여준다. 도 6e 및 도 6f는 mcfDNA 수준이 ICU 입원 (도 6f) 또는 삽관 (도 6e)으로부터의 샘플링 시간에 따라 상이하지 않았다는 것을 보여준다. 도 6g 및 도 6h는 프로칼시토닌 (도 6g) 및 mcfDNA 수준 (도 6h)이 이전에 기재된 바와 같이 적용된 항생제 노출 점수와 유의하게 연관되지 않았다는 것을 보여준다. 문헌 [Kitsios 2020; Zhao, 2014, Sci Rep, 4:4345].
도 7a 및 도 7b는 인식된 호흡기 병원체의 mcfDNA가 폐렴 및 염증 바이오마커 수준의 임상 진단과 유의하게 연관되었다는 것을 예시한다. 각각의 혈장 바이오마커에 대한 mcfDNA의 회귀 계수에 대한 효과 크기의 방향 및 상응하는 통계적 유의성은 각각 색 및 크기 코딩에 의해 가시적으로 제시된다. 약어: Ang-2, 안지오포이에틴-2; IL, 인터류킨; RAGE, 진행성 당화 산물에 대한 수용체; ST-2, 종양발생성 억제-2; TNFR-1, 종양 괴사 인자 수용체 1.
도 8a 및 도 8b는 마이크로리터당 분자 (MPM)로서 정량화된, 분류군별로 모든 참가자에 걸쳐 검출된 mcfDNA 로드의 합계를 보여준다. 도 8a는 인식된 호흡기 병원체 분류군의 mcfDNA를 보여주고; 도 8b는 임상 중요성이 불명확한 미생물의 mcfDNA를 보여준다.
본 발명은 이제 단지 하기 정의 및 실시예를 사용하여 참조로 상세히 기재될 것이다. 본원에 언급된 모든 특허 및 공개물 (이러한 특허 및 공개물 내에 개시된 모든 서열 포함)은 그 전문이 명백하게 참조로 포함된다.
개관
대상체에서의 2차 감염, 대상체에서의 과염증 반응 또는 대상체에서의 감염의 중증도를 검출하거나 또는 예측하거나 또는 달리 평가하기 위해, 총 미생물 세포-유리 핵산, 특히 총 미생물 세포-유리 DNA ("총 mcfDNA")를 분석하기 위한 방법, 장치 및 시스템이 본원에 제공된다. 일부 경우에, 총 미생물 세포-유리 핵산 (예를 들어, 총 mcfDNA)은 환자 (예를 들어, COVID-19를 갖는 환자)가 생존할 가능성이 있는지 여부를 검출하거나 또는 예측하거나 또는 달리 평가하는 데 사용된다. 종종, 대상체는 샘플이 환자로부터 수집될 시에 2차 감염 또는 과염증 반응을 유발할 수 있는 박테리아 또는 바이러스 병원체에 대해 배양-음성이다. 본 개시내용에 사용된 샘플은 일반적으로 혈장 샘플 또는 비교적 비-침습적으로 수득될 수 있는 다른 샘플이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 폐렴을 갖는다. 일부 경우에, 대상체는 배양-양성 폐렴을 갖는다. 일부 경우에, 대상체는 배양-음성 폐렴을 갖는다. 일부 경우에, 대상체는 COVID-19 감염을 갖는다. 일부 경우에, 대상체는 COVID-19 폐렴 또는 중증 COVID-19를 갖는다. 일부 경우에, 총 미생물 세포-유리 핵산 (예를 들어, mcfDNA)에 대한 한계치 값은 적어도 2종의 상이한 미생물로부터의 mcfNA (예를 들어, mcfDNA)에 대한 합한 값이다. 일부 실시양태에서, 총 mcfNA (예를 들어, 총 mcfDNA)에 대한 한계치 값은 혈장 마이크로리터당 400개 분자 (MPM), 600개 MPM, 1000개 MPM, 5000개 MPM, 10000개 MPM 또는 100000개 MPM이다. 일부 경우에, 총 mcfDNA는 박테리아 미생물로부터 유래된 총 mcfDNA를 반영한다. 일부 경우에, 총 mcfDNA는 호흡기 병원체로부터 유래된 총 mcfDNA를 반영한다. 일부 실시양태에서, 호흡기 병원체는 임의의 조합의 표 2에 열거된 적어도 1종의 호흡기 병원체이다. 일부 실시양태에서, 호흡기 병원체는 스트렙토코쿠스(streptococcus), 슈도모나스(pseudomonas) 또는 클레브시엘라(klebsiella) 박테리아이다. 일부 실시양태에서, 호흡기 병원체는 표 2에 열거된 임의의 속으로부터의 것이다. 일부 경우에, 호흡기 병원체는 악티노미세스(Actinomyces), 아스페르길루스(Aspergillus), 박테로이데스(Bacteroides), 시트로박터(Citrobacter), 시토메갈로바이러스(Cytomegalovirus), 엔테로박터(Enterobacter), 에스케리키아(Escherichia), 엔테로코쿠스(Enterococcus), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 클레브시엘라(Klebsiella) 및/또는 헤모필루스(Haemophilus) 속으로부터의 것이다. 일부 경우에, 호흡기 병원체는 임의의 조합의 에스. 아우레우스, 피. 아에루기노사 및/또는 케이. 뉴모니아에이다.
일부 경우에, 방법은 COVID-19를 갖는 환자에서 2차 감염을 검출하는 것을 포함하며, 여기서 방법은 대상체로부터 수득된 샘플 (예를 들어, 혈장)로부터 수득된 미생물 세포-유리 핵산 (예를 들어, 미생물 세포-유리 DNA (mcfDNA))에 대해 차세대 서열분석 (예를 들어, 메타게놈 차세대 서열분석)을 수행함으로써 2차 감염과 연관된 적어도 1종의 미생물을 검출하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 2차 감염은 박테리아 감염이고, COVID-19 환자는 박테리아 감염에 대해 배양 음성이다. 일부 경우에, 2차 감염은 호흡기 미생물에 의해 유발되는 박테리아 감염 (예를 들어, 호흡기 감염 또는 폐렴을 유발하는 박테리아)이다. 일부 경우에, 2차 감염은 박테리아성 폐렴 감염이다.
본원에 제공된 방법은 다수의 용도 및 이점을 갖는다. 예를 들어, 방법은 특히 2차 감염이 배양에 의해 검출가능하지 않은 경우에 환자에서 2차 감염을 검출하기 위한 신뢰가능한 방법을 제공한다. 방법은 또한, 특히 2차 폐렴과 COVID-19 폐렴 사이의 임상적 구별이 어렵거나 심지어 가능하지 않은 경우에, COVID-19 폐렴을 갖는 환자에서 2차 폐렴의 병원체를 확인하는 것을 도울 수 있다. 방법은 일부 경우에 미생물학적 연구의 감도를 제한할 수 있는 항생제를 환자에게 투여한 경우에도 2차 폐렴과 연관된 병원체를 검출하는 추가의 이점을 제공한다. 본원에 제공된 방법의 비-침습적 성질은 또한 환자가 기관지경검사와 연관된 불편 및 위험을 겪게 하는 것을 피하도록 할 뿐만 아니라 기관지경검사 절차 동안 잠재적으로 에어로졸화되는 SARS-COV-2에 대한 건강관리 인력의 노출을 제한하는 이점을 갖는다.
본원에 제공된 표제는 본 명세서를 참조로 할 수 있는 본 발명의 다양한 측면 또는 실시양태의 제한이 아니다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어는 본 명세서를 참조하여 보다 완전히 정의된다.
구체적으로 언급되든 아니든 본원에 기재된 모든 정의는 명세서 및 첨부된 청구범위 전반에 걸쳐 사용된 정의를 지칭하는 것으로 해석되어야 한다.
본 개시내용에서, 측면이 용어 "포함하는"과 함께 본원에 기재된 모든 경우에, "로 이루어진" 및/또는 "로 본질적으로 이루어진"의 용어로 기재된 다른 유사한 측면이 또한 제공된다.
수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "약"은 일반적으로, 용법의 문맥에 의해 달리 나타내지 않는 한, 값을 포함한, 값의 플러스 또는 마이너스 10 퍼센트 (10%)를 의미한다. 예를 들어, "약 100"은 100을 포함한, 90 내지 110의 임의의 수를 지칭한다.
용어 "적어도", "초과" 또는 "이상"이 일련의 2개 이상의 수치 값에서 제1 수치 값에 선행하는 경우 언제든지, 용어 "적어도", "초과" 또는 "이상"은 그 일련의 수치 값에서 각각의 수치 값에 적용된다. 예를 들어, 1, 2 또는 3 이상은 1 이상, 2 이상 또는 3 이상과 동등하다.
용어 "이하", "미만", "최대" 또는 "이하"가 일련의 2개 이상의 수치 값에서 제1 수치 값에 선행하는 경우 언제든지, 용어 "이하", "최대", "미만" 또는 "이하"는 그 일련의 수치 값에서 각각의 수치 값에 적용된다. 예를 들어, 3, 2 또는 1 이하는 3 이하, 2 이하 또는 1 이하와 동등하다.
달리 나타내지 않는 한, 각각, 핵산은 좌측에서 우측으로 5'에서 3' 방향으로 기재되고; 아미노산 서열은 좌측에서 우측으로 아미노에서 카르복시 방향으로 기재된다.
용어 "부착하다" 및 그의 문법적 등가물은 임의의 부착 방식을 사용하여 2개의 분자를 연결하는 것을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 부착은 화학 결합 또는 다른 방법에 의해 2개의 분자를 연결하여 새로운 분자를 생성하는 것을 지칭할 수 있다. 어댑터를 핵산에 부착시키는 것은 어댑터와 핵산 사이에 화학 결합을 형성하는 것을 지칭할 수 있다. 일부 경우에, 부착은 라이게이션에 의해, 예를 들어 리가제를 사용하여 수행된다. 예를 들어, 핵산 어댑터는 리가제에 의해 촉매되는 포스포디에스테르 결합의 형성을 통한 라이게이션에 의해 표적 핵산에 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 부착은 프라이머 연장 반응의 수행을 통한 부착을 포함하며, 여기서 부착될 서열은 프라이머에 존재한다.
본원에 사용된 용어 "또는"은, 달리 나타내지 않는 한, 비배타적인 것을 지칭하는 데 사용되거나, 또는 예컨대 "A 또는 B"는 "A이지만 B는 아님", "B이지만 A는 아님" 및 "A 및 B"를 포함한다.
본원에 사용된 단수형은 달리 명백하게 또는 문맥에 의해 제한되지 않는 한 복수 지시대상을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "해석 함수"는 관찰된 데이터의 세트를 특히 관심있는 의미있는 결정으로 변환하는 것을 의미하며; 예를 들어, 해석 함수는 관찰된 바이오마커 데이터 및/또는 MPM의 데이터세트를 대상체의 질환 활성 또는 질환 상태의 의미있는 결정으로 변환하기 위해 1종 이상의 통계적 알고리즘을 이용함으로써 생성되는 예측 모델일 수 있다.
"다중-바이오마커 질환 활성 점수", "다중-바이오마커 질환 활성 지수 점수", "MBDA 점수" 또는 간단히 "MBDA"는 대상체에서의 염증성 질환 활성 또는 염증성 질환 상태의 반-정량적 척도를 제공하는 점수로 의도된다. 해석 함수는, 일부 실시양태에서, 통계적 알고리즘에 기초한 예측 또는 다변량 모델링으로부터 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 해석 함수에 대한 입력은 1종 이상, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상, 6종 이상, 7종 이상, 8종 이상, 9종 이상, 10종 이상, 11종 이상, 15종 이상, 20종 이상, 50종 이상 또는 100종 이상의 바이오마커를 단독으로 또는 본원에 또한 기재된 미생물 세포-유리 DNA 측정치와 조합하여 시험한 결과를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, MBDA 점수는 염증성 질환 활성의 간접적 척도이다. 일부 실시양태에서, MBDA 점수는 염증성 질환 활성의 정량적 척도이다.
일부 실시양태에서, 해석 함수는 예측 모델에 기초한다. 모델로서 유용하거나 또는 예측 모델을 설계하는 데 유용한 확립된 통계적 알고리즘 및 방법은 하기를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다: 특히, 분산 분석 (ANOVA); 베이지안 네트워크; 부스팅 및 Ada-부스팅; 부트스트랩 어그리게이팅 (또는 배깅) 알고리즘; 의사결정 트리 분류 기술, 예컨대 분류 및 회귀 트리 (CART), 부스팅된 CART, 랜덤 포레스트 (RF), 재귀적 분할 트리 (RPART) 등; 커드 앤드 웨이 (CW); 커드 앤드 웨이-라쏘; 차원 축소 방법, 예컨대 주성분 분석 (PCA) 및 요인 회전 또는 요인 분석; 선형 판별 분석 (LDA), 고유유전자 선형 판별 분석 (ELDA) 및 2차 판별 분석을 포함한 판별 분석; 판별 함수 분석 (DFA); 요인 회전 또는 요인 분석; 유전자 알고리즘; 은닉 마르코프 모델; 커널 기반 기계 알고리즘, 예컨대 커널 밀도 추정, 커널 부분 최소 제곱 알고리즘, 커널 매칭 퍼슈잇 알고리즘, 커널 피셔 판별 분석 알고리즘 및 커널 주성분 분석 알고리즘; 전진 선형 단계적 회귀, 라쏘 (또는 LASSO) 수축 및 선택 방법, 및 엘라스틱 네트 규칙화 및 선택 방법을 포함하거나 이용하는 선형 회귀 및 일반화 선형 모델; glmnet (라쏘 및 엘라스틱 네트-규칙화 일반화 선형 모델); 로지스틱 회귀 (LogReg); 메타-러너 알고리즘; 분류 또는 회귀를 위한 최근접 이웃 방법, 예를 들어 Kth-최근접 이웃 (KNN); 비-선형 회귀 또는 분류 알고리즘; 신경망; 부분 최소 제곱; 규칙 기반 분류기; 슈렁큰 센트로이드 (SC); 분할 역회귀; 제품 모델 데이터의 교환에 대한 표준, 응용 해석 구조 (StepAIC); 초주성분 (SPC) 회귀; 및 서포트 벡터 머신 (SVM) 및 재귀적 서포트 벡터 머신 (RSVM). 추가적으로, 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 클러스터링 알고리즘은 대상 하위군을 결정하는 데 유용할 수 있다.
로지스틱 회귀는 이분 반응 변수; 예를 들어, 치료 1 대 치료 2에 대한 선택의 전통적인 예측 모델링 방법이다. 이는 데이터 변수의 선형 및 비-선형 측면 둘 다를 모델링하는 데 사용될 수 있고, 용이하게 해석가능한 오즈비를 제공한다.
판별 함수 분석 (DFA)은 분석물의 세트를 변수 (루트)로서 사용하여 2개 이상의 자연 발생 군을 판별한다. DFA는 군 사이에 유의하게 상이한 분석물을 시험하는 데 사용된다. 전진 단계적 DFA는 연구된 군 중에서 최대로 판별되는 분석물의 세트를 선택하는 데 사용될 수 있다. 구체적으로, 각각의 단계에서 모든 변수를 검토하여 어느 것이 군 중에서 최대로 판별될 것인지를 결정할 수 있다. 이어서, 이러한 정보는 군 구성원의 예측을 위한 분석물 농도의 선형 조합으로 이루어진 방정식인 루트로 표시되는 판별 함수에 포함된다. 최종 방정식의 판별 가능성은 각각의 군에 대해 수득된 루트 값의 선 플롯으로서 관찰될 수 있다. 이러한 접근법은 농도 수준의 변화가 프로파일을 서술하고, 진단하고, 치료 효능을 평가하는 데 사용될 수 있는 분석물 군을 확인한다. DFA 모델은 또한 새로운 대상체를 "건강한" 또는 "이환된" 자로 분류할 수 있는 임의적인 점수를 생성할 수 있다. 의학계에서의 이 점수의 사용을 용이하게 하기 위해, 점수는 0의 값이 건강한 개체를 나타내고 0 초과의 점수가 증가하는 위험을 나타내도록 재척도화될 수 있다.
분류 및 회귀 트리 (CART)는 데이터의 논리적 분할 (if/then)을 수행하여 의사결정 트리를 생성한다. 각각의 노드에 속하는 모든 관찰은 그 노드에서 가장 흔한 결과에 따라 분류된다. CART 결과는 용이하게 해석가능하다 - 분류 결과까지 일련의 if/then 트리 가지를 따른다.
서포트 벡터 머신 (SVM)은 대상을 2개 이상의 부류로 분류한다. 부류의 예는 치료 대안의 세트, 진단 대안의 세트 또는 예후 대안의 세트를 포함한다. 각각의 대상은 각각의 대상의 정확한 부류 배정이 알려져 있는 훈련 데이터 세트 내의 대상과의 유사성 (또는 그로부터의 거리)에 기초하여 부류에 배정된다. 알려진 대상에 대한 새로운 대상의 유사성의 척도는 잠재적으로 고차원 공간 (>R6) 내의 영역을 규정하는 서포트 벡터를 사용하여 결정된다.
부트스트랩 어그리게이팅 또는 "배깅"의 과정은 컴퓨터적으로 간단하다. 제1 단계에서, 주어진 데이터세트를 명시된 횟수 (예를 들어, 수천회)로 무작위로 리샘플링하여, 데이터의 "부트스트랩핑된 리샘플"로 지칭되는 새로운 데이터세트의 수를 효과적으로 제공하며, 이어서 이들 각각을 사용하여 모델을 구축할 수 있다. 이어서, 분류 모델의 예에서, 모든 새로운 관찰의 부류를 제1 단계에서 생성된 분류 모델의 수에 의해 예측한다. 최종 부류 결정은 분류 모델의 "다수결 투표"에 기초하며; 즉, 최종 분류 호출은 새로운 관찰이 주어진 군으로 분류되는 횟수를 카운팅하고 다수결 분류 (3-부류 시스템의 경우 33%+)를 취함으로써 결정된다. 로지스틱 회귀 모델의 예에서, 로지스틱 회귀가 1000회 배깅되면, 1000개의 로지스틱 모델이 존재할 것이고, 각각은 부류 1 또는 2에 속하는 샘플의 확률을 제공할 것이다.
보통 최소 제곱법 (OLS)을 사용하는 커드 앤드 웨이 (CW)는 또 다른 예측 모델링 방법이다. 문헌 [Breiman, 1997, J. Royal. Stat. Soc. B, 59:3-54]. 이 방법은 예측 변수 X의 공통 세트에 대해 각각의 반응 변수의 개별 회귀를 수행하는 통상의 절차와 비교하여 예측 정확도를 개선시키기 위해 반응 변수들 사이의 상관관계를 이용한다. CW에서, Y = XB * S이고, 여기서 Y = (ykj)이고, k번째 환자에 대해 k이고 j번째 반응에 대해 j이고 (TJC에 대해 j = 1, SJC에 대해 j = 2 등), B는 OLS를 사용하여 수득되고, S는 정규 좌표계로부터 계산된 수축 행렬이다. 또 다른 방법은 조합된 커드 앤드 웨이와 라쏘 (CW-라쏘)이다. CW에서와 같이 B를 수득하기 위해 OLS를 사용하는 대신에, 여기서 라쏘가 사용되고, 그에 따라 라쏘 접근법을 위해 파라미터가 조정된다.
이들 기술 중 다수는 바이오마커 선택 기술 (예컨대, 예를 들어 전진 선택, 후진 선택 또는 단계적 선택)과 조합되어 유용하거나 또는 주어진 크기의 모든 잠재적 패널 또는 유전자 알고리즘의 완전한 계수를 위해 유용하거나, 또는 이들은 그 자체로 그 자신의 기술에 바이오마커 선택 방법론을 포함할 수 있다. 이들 기술은 정보 기준, 예컨대 아카이케(Akaike)의 정보 기준 (AIC), 베이즈(Bayes)의 정보 기준 (BIC) 또는 교차 검증과 커플링되어, 추가의 바이오마커의 포함과 모델 개선 사이의 균형을 정량화하고, 과적합을 최소화할 수 있다. 생성된 예측 모델은, 예를 들어 리브-원-아웃 (LOO) 및 10-배 교차-검증 (10-배 CV)과 같은 기술을 사용하여, 다른 연구에서 검증될 수 있거나 또는 이들이 원래 훈련된 연구에서 교차-검증될 수 있다.
"예후"는 질환의 가능성 있는 결과에 관한 예측을 의도한다. 예후 추정치는 특히 대상체에 대한 적절한 치료 요법을 결정하는 데 유용하다.
본원에 사용된 "멀티플렉스 검정"은 검정의 단일 실행 또는 사이클에서 다수의 분석물, 예를 들어 다수의 핵산 분석물, 다수의 DNA 분석물, 다수의 세포-유리 DNA 분석물, 다수의 단백질 분석물을 동시에 측정하는 검정을 지칭한다.
"예측 모델" (이 용어는 본원에서 "다변량 모델" 또는 간단히 "모델"과 동의어로 사용될 수 있음)은 데이터 세트를 분류하기 위한 통계적 알고리즘 또는 알고리즘들을 사용하여 개발된 수학적 구축물이다. 용어 "예측하는"은 데이터포인트를 생성하기 위해 통상적으로 또는 달리 요구되는 임상 진단 절차를 실제로 수행하지 않으면서 데이터포인트에 대한 값을 생성하는 것을 지칭하며; 이 모델링 문맥에 사용된 "예측하는"은 단지 특정한 결과를 예측하는 모델의 능력을 지칭하는 것으로만 이해되어서는 안된다. 예측 모델은 해석 함수를 제공할 수 있으며; 예를 들어, 예측 모델은 1개 이상의 통계적 알고리즘 또는 방법을 이용하여 관찰된 데이터의 데이터세트를 대상체의 위험 점수 또는 질환 상태의 의미있는 결정으로 변환함으로써 생성될 수 있다.
본 발명의 교시에 사용된 "정량적 데이터세트" 또는 "정량적 데이터"는, 예를 들어 대상체 샘플 내의 복수의 바이오마커 (즉, 2종 이상)의 발현의 검출 및 복합 측정으로부터 유래된 데이터를 지칭한다. 정량적 데이터세트는 질환 상태의 확인, 모니터링 및 치료를 위한 점수를 생성하는 데 및 대상체의 생물학적 상태를 특징화하는 데 사용될 수 있다. 관심 질환 상태 또는 생리학적 상태에 따라 상이한 바이오마커가 검출될 가능성이 있다.
본 개시내용의 문맥에서 "바이오마커", "바이오마커들", "마커" 또는 "마커들"은, 비제한적으로, 시토카인, 케모카인, 성장 인자, 단백질, 펩티드, 핵산, 올리고뉴클레오티드 및 대사물을, 그의 관련 대사물, 돌연변이, 이소형, 변이체, 다형성, 변형, 단편, 서브유닛, 분해 산물, 요소 및 다른 분석물 또는 샘플-유래 척도와 함께 포괄한다. 바이오마커는 또한 돌연변이된 단백질, 돌연변이된 핵산, 카피수의 변동 및/또는 전사체 변이체를 포함할 수 있다. 바이오마커는 또한 건강 상태의 비-혈액 매개 인자 및 비-분석물 생리학적 마커 및/또는 샘플 (예를 들어, 생물학적 샘플, 예컨대 체액)로부터 측정되지 않은 다른 인자 또는 마커, 예컨대 임상 평가를 위한 임상 파라미터 및 전통적인 인자를 포괄한다. 바이오마커는 또한 수학적으로 계산되고/거나 생성된 임의의 지수를 포함할 수 있다. 바이오마커는 또한, 시간적 경향 및 차이를 포함한 상기 측정치 중 어느 1종 이상의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 하기: 프랙탈카인, 인터류킨-8, 프로칼시토닌, 펜트락신-3, 종양발생성 억제-2 (ST-2) 및 가용성 종양 괴사 인자 수용체-1 (TNFR-1) 중 2종 이상이다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 하기: 프랙탈카인, 인터류킨-8, 프로칼시토닌, 펜트락신-3, 종양발생성 억제-2 (ST-2) 및 가용성 종양 괴사 인자 수용체-1 (TNFR-1) 중 1종 이상, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상 또는 6종이다.
대상체
"대상체"는 일반적으로 포유동물, 특히 인간, 예컨대 인간 환자를 의도한다. 용어 "포유동물"은 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 마우스, 래트, 소, 말, 돼지, 양 및 낙타를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 인간 이외의 다른 포유동물은 염증 또는 2차 감염의 동물 모델을 나타내는 대상체로서 유리하게 사용될 수 있다. 대상체는 남성, 여성, 성인, 비성인 또는 청년일 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체는 1차 감염, 예를 들어 바이러스 감염, COVID-19 감염, 폐렴, 바이러스성 폐렴, 배양-양성 감염, 배양-음성 감염, 배양-양성 폐렴, 배양-음성 폐렴을 갖는다. 대상체는 이전에 염증성 질환을 갖는 것으로 진단되거나 확인된 자일 수 있다. 대상체는 염증성 질환에 대한 치료적 개입을 이미 받았거나 받고 있는 자일 수 있다. 대상체는 또한 이전에 염증성 질환을 갖는 것으로 진단되지 않은 대상체일 수 있으며; 예를 들어 대상체는 염증성 상태에 대해 1종 이상의 증상 또는 위험 인자를 나타내는 대상체이거나, 또는 염증성 상태에 대해 증상 또는 위험 인자를 나타내지 않는 대상체 또는 염증성 질환에 대해 무증상인 대상체일 수 있다. 일부 경우에, 염증성 상태는 과염증 반응이다.
대상체에서 염증 진행 (IP)의 위험을 확인하는 것은 질환의 예후를 가능하게 하고, 따라서 대상체의 보다 진행된 질환 상태, 예를 들어 과염증 반응으로의 진행을 지연, 감소 또는 예방하기 위한 다양한 치료 요법의 사전 선택, 개시, 조정 또는 증가 또는 감소를 가능하게 할 수 있다. 대상체는 IP의 특정한 위험을 갖는 것으로 확인될 수 있고, 따라서 염증성 질환의 추가의 진행을 예방하거나 지연시키기 위한 치료를 시작하거나 가속화하도록 선택될 수 있다. 일부 경우에, 대상체는 IP의 낮은 또는 중간 위험을 갖는 것으로 확인될 수 있고, 따라서 그의 치료가 감소되거나 중단되도록 선택될 수 있다. 다른 실시양태에서, 대상체는 그의 IP 위험 점수에 의해 IP에 대한 특정한 위험이 있는 것으로 확인될 수 있고, IP 위험에 기초하여 선택된 요법을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체는 박테리아, 진균, 바이러스, 기생충 또는 그의 임의의 조합에 의한 감염을 갖거나, 갖는 것으로 의심되거나 또는 가질 위험이 있다. 이러한 감염은 2차 감염, 예컨대 바이러스성 폐렴, COVID-19 감염, 바이러스 감염, COVID-19 폐렴 또는 다른 1차 감염에 2차적인 감염일 수 있다. 일부 실시양태에서, 박테리아, 진균, 바이러스, 기생충 또는 그의 임의의 조합에 의한 감염은 호흡기 감염, 예를 들어 폐렴이다. 일부 실시양태에서, 감염은 진균 감염이다. 일부 실시양태에서, 감염은 박테리아 감염이다. 일부 실시양태에서, 박테리아 또는 진균 감염은 바실루스(Bacillus) 종, 클로스트리디움(Clostridium) 종, 코리네박테리움 제이케이움(Corynebactehum jeikeium), 엔테로코쿠스(Enterococcus) 종, 락토바실루스(Lactobacillus) 종, 로티아(Rothia) 종, 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 종, 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 종, 시트로박터(Citrobacter) 종, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 클레브시엘라(Klebsiella) 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia) 및 칸디다(Candida) 종으로 이루어진 군으로부터 선택된 유기체에 의한 감염을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 박테리아 감염은 그람-음성 박테리아 감염이다. 일부 실시양태에서, 박테리아 감염은 그람-양성 박테리아 감염이다. 일부 실시양태에서, 박테리아 또는 진균 감염은 실험적 항미생물 요법에 감수성이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 본원에 개시된 방법을 사용하여 감염을 갖거나 과염증 반응을 갖는 것으로 진단된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 중증 질환을 가질 증가된 위험 또는 감염으로 인한 사망의 증가된 위험을 갖는 것으로 진단된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 방법은 대상체가 중증 COVID-19의 증가된 위험, 과염증 반응의 위험 및/또는 COVID-19로 인한 사망의 높아진 위험을 갖는다는 것을 검출할 수 있다.
일부 경우에, 대상체는 국부 감염을 갖는다. 일부 실시양태에서, 국부 감염은 국부 폐 감염, 예를 들어 폐렴이다. 일부 경우에, 대상체는 박테리아혈증이 아니다. 일부 경우에, 병원체 (예를 들어, 호흡기 병원체)로부터 유래된 mcfDNA는 박테리아혈증의 부재 하의 대상체에서 검출된다. 일부 경우에, 이러한 mcfDNA는 대상체의 혈장에서 검출된다. 예를 들어, 일부 경우에, 본원에 제공된 방법은 국부 감염 (예를 들어, 폐렴)을 갖고 박테리아혈증을 갖지 않는 대상체의 혈장 샘플에서 호흡기 병원체 (예를 들어, 호흡기 감염과 연관된 박테리아 병원체)로부터 유래된 mcfDNA의 검출을 가능하게 한다.
샘플
본 개시내용의 문맥에서 "샘플"은 대상체로부터 단리된 임의의 생물학적 샘플을 지칭한다. 샘플은, 비제한적으로, 단일 세포 또는 다수의 세포, 세포의 단편, 체액의 분취물, 전혈, 혈소판, 혈청, 혈장, 적혈구, 백혈구 세포 또는 백혈구, 내피 세포, 조직 생검, 활액, 림프액, 복수액 또는 간질액 또는 세포외액을 포함할 수 있다. 용어 "샘플"은 또한 일반적으로 활액, 치은 열구액, 골수, 뇌척수액 (CSF), 타액, 점액, 객담, 정액, 땀, 소변 또는 체액을 포함한, 유체를 생성하는 조직 사이의 또는 조직 외부의 공간 내의 유체를 포괄한다. "혈액 샘플"은 전혈 또는 혈액 세포, 적혈구, 백혈구, 혈소판, 혈청 및 혈장을 포함하나 이에 제한되지는 않는 그의 임의의 분획을 지칭할 수 있다. 샘플은 정맥천자, 배설, 생검, 바늘 흡인, 세척, 스크레이핑, 외과적 절개 또는 개입 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 대상체로부터 수득될 수 있다.
일부 실시양태에서, 샘플은 대상체 (예를 들어, 환자)로부터 수집된다. 샘플은 정맥천자, 배설, 생검, 바늘 흡인, 세척, 스크레이핑을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 대상체로부터 수득될 수 있다.
일부 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 전혈 샘플이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 세포-유리 샘플, 예컨대 혈장 샘플 또는 세포-유리 혈장 샘플이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 단리 또는 추출된 핵산 (예를 들어, DNA, RNA, 세포-유리 DNA)의 샘플이다. 일부 실시양태에서, 혈장 샘플은 정맥천자를 통해 혈액을 수집함으로써 수집된다. 일부 실시양태에서, 시편은 수집 직후에 첨가제와 혼합된다. 일부 경우에, 첨가제는 항응고제이다. 일부 경우에, 첨가제는 핵산의 분해를 방지한다. 일부 경우에, 첨가제는 EDTA이다. 일부 실시양태에서, 용혈 또는 지혈증을 피하기 위한 조치가 취해질 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 가공 또는 비가공된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플로부터 핵산을 추출함으로써 가공된다. 일부 실시양태에서, DNA는 샘플로부터 추출된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 샘플로부터 추출되지 않는다. 일부 실시양태에서, 샘플은 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 본질적으로 핵산으로 이루어진다.
일부 경우에, 본원에 제공된 방법은 전혈을 혈장 샘플로 가공하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 가공은 혈액 세포로부터 혈장을 분리하기 위해 전혈을 원심분리하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 방법은 박테리아 세포 및 세포 파편을 제거하기 위해 혈장을 종종 보다 높은 속도의 제2 원심분리에 적용하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 제2 원심분리는 적어도 약 4,000 rcf, 적어도 약 5,000 rcf, 적어도 약 6,000 rcf, 적어도 약 8,000 rcf, 적어도 약 10,000 rcf, 적어도 약 12,000 rcf, 적어도 약 14,000 rcf, 적어도 약 16,000 rcf 또는 적어도 약 20,000 rcf의 상대 원심력 (rcf)으로 이루어진다.
대상체로부터의 샘플의 수집 시에, 대상체는 본원에 제공된 방법에 의해 후속적으로 검출되는 미생물에 대해 배양-음성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 샘플의 수집 시에, 대상체는 본원에 제공된 방법에 의해 후속적으로 검출되는 미생물에 대해 배양-음성이고, 대상체는 이후에 샘플의 수집 후 한 시점에 미생물에 대해 배양-양성이 된다. 일부 경우에, 대상체로부터의 샘플의 수집 시에, 대상체는 본원에 제공된 방법에 의해 후속적으로 검출되는 미생물에 대해 배양-양성이다.
종종, 본원에 개시된 샘플은 표적 핵산 (예를 들어, 표적 DNA, 표적 RNA)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 세포-유리 핵산 또는 순환 세포-유리 핵산이다. 예를 들어, 샘플은 미생물 표적 DNA (예를 들어, 병원성 미생물을 포함할 수 있는 미생물로부터 유래된 mcfDNA)를 포함하는 미생물 세포-유리 핵산 (예를 들어, mcfDNA)을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 방법에 의해 검출될 수 있는 예시적인 미생물은 박테리아, 진균, 기생충 및 바이러스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포-유리 핵산은 순환 세포-유리 핵산이다. 일부 실시양태에서, 세포-유리 핵산은 세포-유리 DNA를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산 (예를 들어, 세포-유리 핵산, 세포-유리 DNA, RNA 또는 그의 임의의 조합의 다른 핵산)은 샘플로부터 추출된다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산 (예를 들어, 추출된 DNA)은 DNA 라이브러리를 제조하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 라이브러리는 핵산에 어댑터를 부착시킴으로써 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 어댑터는 핵산의 서열분석에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 DNA를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 어댑터를 함유하는 핵산은 서열 판독물을 수득하기 위해 서열분석될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 (예를 들어, mcfDNA를 포함하는 혈장 샘플)은 샘플로부터 핵산 또는 DNA를 추출하기 전에 어댑터와 혼합된다. 일부 실시양태에서, 샘플 (예를 들어, mcfDNA를 포함하는 혈장 샘플)로부터 추출된 핵산은 추출 후에 어댑터에 부착된다. 일부 실시양태에서, 서열 판독물은 고처리량 서열분석 (HTS)을 통해 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, HTS는 차세대 서열분석 (NGS)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, HTS는 메타게놈 서열분석 또는 메타게놈 차세대 서열분석이다. 일부 실시양태에서, 서열 판독물은 참조 데이터세트 내의 서열에 대해 정렬될 수 있다. 일부 경우에, 참조 데이터세트는 적어도 2, 5, 7, 10, 50, 100, 500, 750, 800, 900, 1000 또는 2000종의 상이한 미생물 (예를 들어, 박테리아, 바이러스, 기생충, 진균)로부터의 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열은 호흡기 병원체, 특히 호흡기 감염과 연관된 박테리아의 조합으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 서열은 정렬된 서열 판독물을 수득하기 위해 참조 데이터세트에 대해 정렬된 박테리아 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열은 정렬된 서열 판독물을 수득하기 위해 참조 데이터세트에 대해 정렬된 진균 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 정렬된 박테리아 서열, 진균 서열 또는 그의 조합은 수득된 정렬된 서열 판독물에 기초하여 박테리아 서열 또는 진균 서열에 대해 정량화될 수 있다.
본원에 제공된 방법에서, 핵산은 단리, 추출 또는 정제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 액체 추출을 사용하여 추출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 액체 추출은 페놀-클로로포름 추출을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 페놀-클로로포름 추출은 트리졸(Trizol)TM, DNA졸(DNAzol)TM 또는 그의 임의의 조합의 사용을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 칼럼에서 선택적 필터를 통한 원심분리를 사용하여 추출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 단지 예로서 원심분리를 포함한 공지된 방법에 의해 농축 또는 침전될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 정제 목적을 위해 선택적 막 (예를 들어, 실리카)에 결합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 상업적으로 입수가능한 키트 (예를 들어, 퀴아앰프 순환 핵산 키트(QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit)TM, 퀴아젠 DN이지 키트(Qiagen DNeasy kit)TM, 퀴아앰프 키트(QIAamp kit)TM, 퀴아젠 미디 키트(Qiagen Midi kit)TM, 퀴아프렙 스핀 키트(QIAprep spin kit)TM 또는 그의 임의의 조합)를 사용하여 추출될 수 있다. 핵산은 또한 목적하는 길이의 단편, 예를 들어 1000, 500, 400, 300, 200 또는 100개 미만의 염기 쌍 길이의 단편이 풍부화되어 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 크기에 기초한 풍부화는, 예를 들어 PEG-유도된 침전, 전기영동 겔 또는 크로마토그래피 물질 (Huber et al. (1993) Nucleic Acids Res. 21:1061-6), 겔 여과 크로마토그래피 또는 TSK겔 (Kato et al. (1984) J. Biochem, 95:83-86)을 사용하여 수행될 수 있으며, 상기 공개물은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 핵산 샘플은 표적 핵산이 풍부화되어 있다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 미생물 세포-유리 핵산이다.
일부 실시양태에서, 표적 (예를 들어, 병원체, 미생물) 핵산은, 예를 들어 풀-다운 (예를 들어, 비오틴 태그와 같은 표지에 접합된 상보적 올리고뉴클레오티드에 표적 핵산을 혼성화하고, 예를 들어 고체 지지체에 부착된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 사용함으로써, 풀-다운 검정에서 표적 핵산을 우선적으로 풀 다운시킴), 표적화 PCR 또는 다른 방법에 의해, 샘플 내 배경 (예를 들어, 대상체) 핵산에 비해 풍부화된다. 풍부화 기술의 예는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: (a) 핵산의 샘플 내 주요 집단이 샘플 내 부차적 집단보다 더 신속하게 자기-혼성화하는 자기-혼성화 기술; (b) 유리 DNA로부터 뉴클레오솜-연관 DNA의 고갈; (c) 특정 길이 간격의 DNA의 제거 및/또는 단리; (d) 엑소솜 고갈 또는 풍부화; 및 (e) 관심 영역의 전략적 포획.
일부 실시양태에서, 풍부화 단계는 약 120, 약 150, 약 200 또는 약 250개 염기 길이 초과인 핵산을 샘플로부터 우선적으로 제거하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 풍부화 단계는 약 10개 염기 내지 약 60개 염기 길이, 약 10개 염기 내지 약 120개 염기 길이, 약 10개 염기 내지 약 150개 염기 길이, 약 10개 염기 내지 약 300개 염기 길이, 약 30개 염기 내지 약 60개 염기 길이, 약 30개 염기 내지 약 120개 염기 길이, 약 30개 염기 내지 약 150개 염기 길이, 약 30개 염기 내지 약 200개 염기 길이 또는 약 30개 염기 내지 약 300개 염기 길이인 핵산을 샘플로부터 우선적으로 풍부화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 풍부화 단계는 숙주 (예를 들어, 대상체)로부터 유래된 핵산을 우선적으로 소화시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 풍부화 단계는 비-숙주 핵산을 우선적으로 복제하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산 라이브러리가 제조된다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 DNA 라이브러리, 단일-가닥 DNA 라이브러리 또는 RNA 라이브러리가 제조된다. dsDNA 라이브러리를 제조하는 방법은 어댑터 서열을 dsDNA 단편의 한쪽 또는 양쪽 말단 상에 라이게이션시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 어댑터 서열은 프라이머 도킹 서열을 포함한다. 일부 경우에, 방법은 프라이머 도킹 서열에 프라이머를 혼성화시키는 단계 및 어댑터에 부착된 핵산의 증폭 또는 서열분석을 개시하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이머 또는 프라이머 도킹 서열은 차세대 서열분석 플랫폼에 커플링하는 어댑터 서열의 적어도 한 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 듀플렉스를 생성하기 위한 혼성화된 프라이머의 연장을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 듀플렉스는 원래의 ssDNA 단편 및 연장된 프라이머 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 연장된 프라이머 가닥은 원래의 ssDNA 단편으로부터 분리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 연장된 프라이머 가닥이 수집될 수 있으며, 여기서 연장된 프라이머 가닥은 ssDNA 라이브러리의 구성원이다.
일부 경우에, 라이브러리는 비편향 방식으로 제조된다. 예를 들어, 일부 경우에, 라이브러리는 미생물 핵산에 특이적으로 혼성화하는 프라이머를 사용하지 않고 제조된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 샘플에 대해 수행되는 유일한 증폭은 샘플 내 핵산에 부착된 1개 이상의 어댑터의 서열에 특이적인 프라이머의 사용을 수반한다. 일부 경우에, 어댑터의 부착 전에 라이브러리를 제조하는 데 전체 게놈 증폭이 사용된다. 일부 경우에, 라이브러리를 제조하는 데 전체 게놈 증폭은 사용되지 않는다. 일부 경우에, 미생물 핵산 (예를 들어, 병원체, 바이러스, 진균, 박테리아 또는 기생충 핵산)에 특이적으로 혼성화하는 1종 이상의 프라이머가 샘플을 증폭시키는 데 사용된다.
일부 경우에, 상이한 샘플 (예를 들어, 상이한 환자 또는 대상체로부터의 샘플)로부터의 다수의 DNA 라이브러리는 조합된 다음, 차세대 서열분석 검정에 적용된다. 일부 경우에, 라이브러리는 어느 라이브러리가 어느 샘플에 상응하는 지를 추적하기 위해 조합 전에 인덱싱된다. 인덱싱은 어댑터, 예를 들어 분석될 핵산에 부착되는 어댑터에 대한 특이적 코드 또는 바코드의 포함을 수반할 수 있다. 일부 경우에, 샘플은 음성 대조군 샘플 또는 양성 대조군 샘플 또는 음성 대조군 샘플 및 양성 대조군 샘플 둘 다를 포함한다.
일부 경우에, 상이한 샘플 (예를 들어, 상이한 환자 또는 대상체로부터의 샘플)로부터의 다수의 DNA 라이브러리는 조합된 다음, 차세대 서열분석 검정에 적용된다. 일부 경우에, 샘플은 음성 대조군 샘플 또는 양성 대조군 샘플을 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산의 길이는 달라질 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 또는 핵산 단편 (예를 들어, dsDNA 단편, RNA 또는 무작위 크기의 cDNA)은 1000 bp 미만, 800 bp 미만, 700 bp 미만, 600 bp 미만, 500 bp 미만, 400 bp 미만, 300 bp 미만, 200 bp 미만 또는 100 bp 미만일 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 단편은 약 40 내지 약 100 bp, 약 50 내지 약 125 bp, 약 100 내지 약 200 bp, 약 150 내지 약 400 bp, 약 300 내지 약 500 bp, 약 100 내지 약 500 bp, 약 400 내지 약 700 bp, 약 500 내지 약 800 bp, 약 700 내지 약 900 bp, 약 800 내지 약 1000 bp 또는 약 100 내지 약 1000 bp일 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 또는 핵산 단편 (예를 들어, dsDNA 단편, RNA 또는 무작위 크기의 cDNA)은 약 20 내지 약 200 bp 범위 내, 예컨대 약 40 내지 약 100 bp 범위 내일 수 있다.
일부 실시양태에서, dsDNA 단편의 말단은 연마되거나 (예를 들어, 평활-말단) 또는 말단-복구에 적용되어 평활 말단을 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 단편의 말단은 폴리머라제를 사용한 처리에 의해 연마될 수 있다. 일부 실시양태에서, 연마는 3' 오버행의 제거, 5' 오버행의 충전 또는 그의 조합을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 교정 폴리머라제 (예를 들어, 3'에서 5' 엑소뉴클레아제 활성을 포함함)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 교정 폴리머라제는, 예를 들어 T4 DNA 폴리머라제, Pol 1 클레나우 단편 또는 Pfu 폴리머라제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 연마는 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단을 사용하여 손상된 뉴클레오티드 (예를 들어, 무염기성 부위)의 제거를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산 단편의 3' 말단에 대한 어댑터의 라이게이션은 단편의 3' OH 기와 어댑터의 5' 포스페이트 사이의 결합의 형성을 포함할 수 있다. 따라서, 핵산 단편으로부터의 5' 포스페이트의 제거는 2개의 라이브러리 구성원의 이상 라이게이션을 최소화할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 5' 포스페이트는 핵산 단편으로부터 제거된다. 일부 실시양태에서, 5' 포스페이트는 샘플 내 핵산 단편의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 95% 초과로부터 제거된다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 모든 포스페이트 기가 핵산 단편으로부터 제거된다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 모든 포스페이트가 샘플 내 핵산 단편의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 95% 초과로부터 제거된다. 핵산 샘플로부터의 포스페이트 기의 제거는 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의한 것일 수 있다. 포스페이트 기의 제거는 샘플을 열-불안정성 포스파타제로 처리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 포스페이트 기는 핵산 샘플로부터 제거되지 않는다. 일부 실시양태에서, 핵산 단편의 5' 말단에 대한 어댑터의 라이게이션이 수행된다.
예시적인 샘플 가공 및 분석
하기는 본 개시내용에 의해 제공되는 방법의 예이다. 일부 경우에, 혈장에 알려진 농도의 합성 정규화 분자 대조군이 스파이킹된다. 일부 경우에, 혈장은 이어서 세포-유리 NA (cfNA) 추출 (예를 들어, 세포-유리 DNA의 추출)에 적용된다. 추출된 cfNA는 말단-복구에 의해 프로세싱되고, 말단-복구된 cfDNA에 대한 특이적 인덱스를 함유하는 어댑터에 라이게이션될 수 있다. 라이게이션 생성물은 비드에 의해 정제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 어댑터에 라이게이션된 cfDNA는 P5 및 P7 프라이머로 증폭될 수 있고, 증폭된, 어댑터 부착된 cfDNA는 정제된다.
정제된 cfDNA (혈장 샘플로부터 유래된, 어댑터에 부착된 것)은 DNA 서열분석 라이브러리 내로 혼입될 수 있다. 여러 혈장 샘플로부터의 서열분석 라이브러리는 대조군 샘플과 함께 풀링되고, 정제되고, 일부 실시양태에서, 일루미나(Illumina) 서열분석기 상에서 75-사이클 단일-말단 이중 인덱스 서열분석 키트를 사용하여 서열분석될 수 있다. 1차 서열분석 출력물은 디멀티플렉스화된 후 판독물의 품질 트리밍이 이어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 품질 필터를 통과한 판독물은 인간 및 합성 참조물에 대해 정렬된 다음, 분석으로부터 배제되거나 또는 달리 보관된다. 인간 위성 DNA를 잠재적으로 나타내는 판독물은 또한, 예를 들어 k-mer-기반 방법을 통해 필터링될 수 있으며; 이어서 나머지 판독물은 미생물 참조 데이터베이스 (예를 들어, 고품질 게놈 참조물의 20,963개의 조립물을 갖는 데이터베이스)와 정렬될 수 있다. 일부 실시양태에서, 높은 퍼센트 동일성 및/또는 높은 쿼리 커버리지 둘 다를 나타내는 정렬을 갖는 판독물은, 예를 들어 임의의 미토콘드리아 또는 플라스미드 참조 서열과 정렬된 판독물을 제외하고는 보유될 수 있다. PCR 중복물은 그의 정렬에 기초하여 제거될 수 있다. 상대 존재비는 서열분석 판독물 및 그의 정렬에 기초하여 샘플 내 각각의 분류군에 배정될 수 있다.
판독물과 분류군의 각각의 조합에 대해, 샘플에 존재하는 미생물과 데이터베이스 내 참조 조립물 사이의 차이를 설명하는 판독 서열 확률이 정의될 수 있다. 혼합 모델은 판독 서열 확률 및 샘플 내 각각의 분류군의 (비관찰) 존재비를 포함한 서열분석 판독물의 완전한 수집에 대한 가능도를 배정하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 기대치-최대화 알고리즘은 각각의 분류군 존재비의 최대 가능도 추정치를 컴퓨터 계산하는 데 적용된다. 이들 존재비로부터, 각각의 분류군으로부터 발생하는 판독물의 수는 분류학적 트리로 집계될 수 있다. 배치 내의 주형 부재 대조군 (NTC) 샘플로부터의 추정된 분류군 존재비를 조합하여 노이즈를 카운팅함으로써 구동된 변동이 있는 환경으로부터 발생한 판독물 존재비의 모델을 파라미터화할 수 있다. 이어서, 각각의 환자 샘플에서 분류군 존재비의 각각의 추정치에 대해 통계적 유의성 값이 컴퓨터 계산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 높은 유의성 수준을 나타내고 보고가능한 범위 내 1449개의 분류군 중 하나인 분류군은 후보 호출을 포함한다. 최종 호출은 추가의 필터링이 적용된 후에 이루어질 수 있으며, 이는 판독 위치 균일성 뿐만 아니라 보다 높은 존재비 호출로부터 기원하는 교차-반응성 위험을 설명한다. 이들 필터를 통과한 미생물 호출은 분류군에 대한 고유한 판독물과 정규화 분자의 관찰된 고유한 판독물의 수 사이의 비를 사용하여 추정된 바와 같은 MPM의 존재비와 함께 보고된다.
이어서, 각각의 샘플 내 mcfDNA 혈장 농도의 양은 혈장에 초기에 스파이킹된 합성 분자의 측정된 상대 존재비를 사용함으로써 정량화될 수 있다.
일부 경우에, 혈장 mcfDNA-seq를 사용한 시험은 각각의 BSI 에피소드 전 7일 내지 그 후 4일에 수집된 이용가능한 샘플에 대해 수행되고, 2개의 음성 대조군 샘플이 각각의 BSI 에피소드에 대해 첨가된다. 일부 경우에, 샘플은 침습성 진균 감염의 혈류 감염의 적어도 3일 전에 수집된다. 실험실은 서열분석이 완료되고 보고될 때까지 예상된 결과에 대해 맹검일 수 있다.
분석
일부 실시양태에서, 핵산을 분석하는 방법이 본원에 개시된다. 이러한 분석 방법은 핵산의 서열분석 뿐만 아니라 서열분석 결과 (예를 들어, 서열 판독물)의 생물정보학적 분석을 포함한다.
일부 실시양태에서, 서열분석은 차세대 서열분석 검정을 사용하여 수행된다. 본원에 사용된 용어 "차세대"는 일반적으로 하기 중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 고처리량 서열분석 접근법을 지칭한다: 대규모-병렬 시그너쳐 서열분석, 파이로시퀀싱 (예를 들어, 로슈(Roche) 454 게놈 애널라이저(Genome Analyzer)TM 서열분석 장치를 사용함), 일루미나(Illumina)TM (솔렉사(Solexa)TM) 서열분석 (예를 들어, 일루미나 NextSeqTM 500을 사용함), 합성에 의한 서열분석 (일루미나TM), 이온 반도체 서열분석 (이온 토렌트(Ion torrent)TM), 라이게이션에 의한 서열분석 (예를 들어, SOLiDTM 서열분석), 단일 분자 실시간 (SMRT) 서열분석 (예를 들어, 퍼시픽 바이오사이언스(Pacific Bioscience)TM), 폴로니 서열분석, DNA 나노볼 서열분석 (컴플리트 게노믹스(Complete Genomics)TM), 헬리스코프 단일 분자 서열분석 (헬리코스 바이오사이언시스(Helicos Biosciences)TM) 및 나노포어 서열분석 (예를 들어, 옥스포드 나노포어(Oxford Nanopore)TM). 일부 실시양태에서, 서열분석 검정은 나노포어 서열분석을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열분석 검정은 일부 형태의 생어 서열분석을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열분석은 샷건 서열분석을 수반할 수 있고; 일부 실시양태에서, 서열분석은 가교 증폭 PCR을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열분석은 광범위할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열분석은 표적화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 서열분석 검정은 길버트 서열분석 방법을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 길버트 서열분석 방법은 핵산 (예를 들어, DNA)을 화학적으로 변형시킨 다음, 이를 특정 염기에서 절단하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열분석 검정은 디데옥시뉴클레오티드 쇄 종결 또는 생어-서열분석을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 합성에 의한 서열분석 접근법이 본원에 제공된 방법에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 형광-표지된 가역적-종결인자 뉴클레오티드는 유리 플로우셀의 표면 상에 고정화된 클론-증폭된 DNA 주형에 도입된다. 각각의 서열분석 사이클 동안, 단일 표지된 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 (dNTP)가 핵산 쇄에 첨가될 수 있다. 표지된 종결인자 뉴클레오티드는 염기를 확인하기 위해 첨가될 때 영상화될 수 있고, 이어서 다음 뉴클레오티드의 혼입이 가능하도록 효소적으로 절단될 수 있다. 모든 4종의 가역적 종결인자-결합된 dNTP (A, C, T, G)는 일반적으로 단일, 별개의 분자로서 존재하기 때문에, 자연 경쟁은 혼입 편향을 최소화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 단일-분자 실시간 (SMRT)으로 불리는 방법이 사용된다. 이러한 접근법에서, 핵산 (예를 들어, DNA)은 웰의 바닥에 포획 도구가 위치하는 작은 웰-유사 용기인 제로-모드 도파관 (ZMW)에서 합성된다. 서열분석은 비변형된 폴리머라제 (ZMW 바닥에 부착됨) 및 용액 중에서 자유롭게 유동하는 형광 표지된 뉴클레오티드를 사용하여 수행된다. 형광 표지는 DNA 가닥 내로의 그의 혼입 시 뉴클레오티드로부터 탈착되어, 비변형된 DNA 가닥을 남긴다. 이어서 검출기, 예컨대 카메라가 발광을 검출하는 데 사용될 수 있고; 데이터는 서열 정보를 수득하기 위해 생물정보학적으로 분석될 수 있다.
일부 실시양태에서, 라이게이션 접근법에 의한 서열분석은 샘플 내 핵산을 서열분석하는 데 사용된다. 한 예는 SOLiD (올리고뉴클레오티드 라이게이션 및 검출에 의한 서열분석) 서열분석 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies))의 차세대 서열분석 방법이다. 이러한 차세대 기술은 한 번에 수억 내지 수십억개의 작은 서열 판독물을 생성할 수 있다. 서열분석 방법은 서열분석될 샘플로부터 DNA 단편의 라이브러리를 제조하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 단지 하나의 단편 종만이 각각의 비드 (예를 들어, 자기 비드)의 표면 상에 존재하는 클론 비드 집단을 제조하는 데 사용된다. 자기 비드에 부착된 단편은 모든 단편의 출발 서열이 공지된 것이면서 또한 동일하도록 범용 P1 어댑터 서열이 부착되어 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 PCR 또는 에멀젼 PCR을 추가로 수반할 수 있다. 예를 들어, 에멀젼 PCR은 PCR을 위한 시약을 함유하는 마이크로반응기의 사용을 수반할 수 있다. 이어서, 생성된 비드에 부착된 PCR 생성물은 유리 슬라이드에 공유 결합될 수 있다. 서열분석 검정, 예컨대 SOLiD 서열분석 검정 또는 라이게이션 검정에 의한 다른 서열분석은 프라이머의 사용을 수반하는 단계를 포함할 수 있다. 프라이머는 P1 어댑터 서열 또는 라이브러리 주형 내 다른 서열에 혼성화할 수 있다. 방법은 서열분석 프라이머에의 라이게이션에 대해 경쟁하는 4종의 형광 표지된 이-염기 프로브를 도입하는 단계를 추가로 수반할 수 있다. 이-염기 프로브의 특이성은 각각의 라이게이션 반응에서 모든 제1 및 제2 염기를 조사함으로써 달성될 수 있다. 라이게이션, 검출 및 절단의 다수의 사이클은 최종 판독물 길이를 결정하는 사이클의 수로 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 일련의 라이게이션 사이클 후에, 연장 생성물은 제거될 수 있고, 주형은 라이게이션 사이클의 제2 라운드를 위해 n-1 위치에 상보적인 프라이머로 리셋될 수 있다. 프라이머 리셋의 다수의 라운드 (예를 들어, 5회 라운드)가 각각의 서열 태그에 대해 완료될 수 있다. 프라이머 리셋 과정을 통해, 각각의 염기는 2개의 상이한 프라이머에 의해 2개의 독립적인 라이게이션 반응에서 조사될 수 있다. 예를 들어, 판독물 위치 5에서의 염기는 라이게이션 사이클 2에서 프라이머 번호 2에 의해 및 라이게이션 사이클 1에서 프라이머 번호 3에 의해 검정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 검출 또는 정량화 분석은 서열분석에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전체 합성된 올리고뉴클레오티드는 본원에 기재된 서열분석 방법을 포함한, 예를 들어 일루미나 HiSeq 2500TM에 의한 모든 올리고뉴클레오티드의 완전 서열분석을 통해 검출될 수 있다.
일부 실시양태에서, 서열분석은 관련 기술분야에 널리 공지된 전형적 생어 서열분석 방법을 통해 달성될 수 있다. 서열분석은 또한 고처리량 시스템을 사용하여 달성될 수 있으며, 이들 중 일부는 성장 가닥 내로의 그의 혼입 직후 또는 그의 혼입 시 서열분석된 뉴클레오티드의 검출, 예를 들어 실시간으로 또는 실질적으로 실시간으로의 서열의 검출을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 고처리량 서열분석은 시간당 적어도 1,000, 적어도 5,000, 적어도 10,000, 적어도 20,000, 적어도 30,000, 적어도 40,000, 적어도 50,000, 적어도 100,000 또는 적어도 500,000개의 서열 판독물을 생성한다. 일부 실시양태에서, 각각의 판독물은 판독물당 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 120 또는 적어도 150개의 염기이다. 일부 실시양태에서, 각각의 판독물은 판독물당 2000개 이하, 1000개 이하, 900개 이하, 800개 이하, 700개 이하, 600개 이하, 500개 이하, 400개 이하, 300개 이하, 200개 이하 또는 100개 이하의 염기이다. 긴 판독물 서열분석은 판독물당 500개 초과의 염기, 800개 초과의 염기, 1000개 초과의 염기, 1500개 초과의 염기, 2000개 초과의 염기, 3000개 초과의 염기 또는 4500개 초과의 염기의 인접 서열 판독물을 제공하는 서열분석을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 고처리량 서열분석은 일루미나의 게놈 애널라이저 IIXTM, MiSeq 퍼스널 시퀀서 TM 또는 HiSeq TM 시스템, 예컨대 HiSeq 2500 TM, HiSeq 1500 TM, HiSeq 2000 TM 또는 HiSeq 1000 TM을 사용하는 시스템에 의해 이용가능한 기술의 사용을 수반할 수 있다. 이들 기계는 합성 화학에 의한 가역적 종결인자-기반 서열분석을 사용한다. 이들 기계는 8일 내에 2천억개 이상의 판독물을 서열분석할 수 있다. 보다 작은 시스템은 3, 2 또는 1일 또는 그 미만의 시간 내에서의 실행을 위해 이용될 수 있다. 짧은 합성 사이클은 서열분석 결과를 수득하는 데 걸리는 시간을 최소화하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 고처리량 서열분석은 ABI 솔리드 시스템(ABI Solid System)에 의해 이용가능한 기술의 사용을 수반한다. 이러한 유전자 분석 플랫폼은 클론-증폭된, 비드에 연결된 DNA 단편의 대규모 병렬 서열분석을 가능하게 할 수 있다. 서열분석 방법론은 염료-표지된 올리고뉴클레오티드와의 순차적 라이게이션에 기초한다.
일부 실시양태에서, 차세대 서열분석은 이온 반도체 서열분석 (예를 들어, 라이프 테크놀로지스TM로부터의 기술 (이온 토렌트TM)을 사용함)을 포함할 수 있다. 이온 반도체 서열분석은 뉴클레오티드가 DNA의 가닥 내로 혼입되는 경우에 이온이 방출될 수 있다는 사실을 이용할 수 있다. 이온 반도체 서열분석을 수행하기 위해, 마이크로기계화된 웰의 고밀도 어레이가 형성될 수 있다. 각각의 웰은 단일 DNA 주형을 보유할 수 있다. 웰 아래는 이온 감수성 층일 수 있고, 이온 감수성 층 아래는 이온 센서일 수 있다. 뉴클레오티드가 DNA에 첨가될 때, H+ 이온이 방출될 수 있으며, 이는 pH의 변화로서 측정될 수 있다. H+ 이온은 전압으로 전환되고, 반도체 센서에 의해 기록될 수 있다. 어레이 칩은 하나의 뉴클레오티드 뒤에 또 다른 것으로 순차적으로 플러딩될 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐닝, 광 또는 카메라가 요구되지 않는다. 일부 실시양태에서, 이온프로톤(IONPROTON)™ 서열분석기가 핵산을 서열분석하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 이온PGM(IONPGM)™ 서열분석기가 사용된다. 이온 토렌트 퍼스널 게놈 머신(Ion Torrent Personal Genome Machine)™ (PGM)은 2시간 내에 1천만개의 판독물을 서열분석할 수 있다.
일부 실시양태에서, 고처리량 서열분석은 헬리코스 바이오사이언시스 코포레이션(Helicos BioSciences Corporation)™ (매사추세츠주 캠브리지)에 의해 이용가능한 기술, 예컨대 합성에 의한 단일 분자 서열분석 (SMSS) 방법의 사용을 수반한다. SMSS는 최대 24시간 내에 전체 인간 게놈의 서열분석을 가능하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, SMSS는 혼성화 전에 예비 증폭 단계를 요구하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, SMSS는 어떠한 증폭도 요구하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, SMSS를 사용하는 방법은 미국 공개 출원 번호 20060024711에 부분적으로 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 고처리량 서열분석은 454 라이프사이언시스, 인크.(454 Lifesciences, Inc.)™ (코네티컷주 브랜포드)에 의해 이용가능한 기술, 예컨대 기기 내 전하-커플링 장치 (CCD) 카메라에 의해 기록될 서열분석 반응에 의해 생성된 화학발광 신호를 전송하는 섬유 광학 플레이트를 포함하는 피코 타이터 플레이트(Pico Titer Plate)™ 장치의 사용을 수반한다. 이러한 섬유 광학의 사용은 4.5시간 내에 최소 2천만개의 염기 쌍의 검출을 가능하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비드 증폭에 이어서 섬유 광학 검출을 사용하는 방법은 미국 공개 출원 번호 20020012930; 20030058629; 20030100102; 20030148344; 20040248161; 20050079510, 20050124022; 및 20060078909에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 고처리량 서열분석은 클론 단일 분자 어레이 (솔렉사, 인크.™) 또는 가역적 종결인자 화학을 이용하는 합성에 의한 서열분석 (SBS)을 사용하여 수행된다.
일부 실시양태에서, 차세대 서열분석은 나노포어 서열분석이다. 나노포어는, 예를 들어 대략적으로 약 1 나노미터 직경의 작은 홀일 수 있다. 전도성 유체 내 나노포어의 침지 및 그에 걸친 전위의 인가는 나노포어를 통한 이온의 전도로 인해 약간의 전류를 생성할 수 있다. 흐르는 전류의 양은 나노포어의 크기에 감수성일 수 있다. DNA 분자가 나노포어를 통과할 때, DNA 분자 상의 각각의 뉴클레오티드는 상이한 정도로 나노포어를 폐쇄할 수 있다. 따라서, DNA 분자가 나노포어를 통과할 때 나노포어를 통과하는 전류의 변화는 DNA 서열의 판독을 나타낼 수 있다. 나노포어 서열분석 기술은 옥스포드 나노포어 테크놀로지스(Oxford Nanopore Technologies)™; 예를 들어, 그리드이온(GridION)™ 시스템으로부터의 것일 수 있다. 단일 나노포어는 마이크로웰의 상단에 걸쳐 중합체 막에 삽입될 수 있다. 각각의 마이크로웰은 개별 센싱을 위한 전극을 가질 수 있다. 마이크로웰은 칩당 100,000개 이상의 마이크로웰 (예를 들어, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000 또는 1,000,000개 초과)을 갖는 어레이 칩으로 제작될 수 있다. 기기 (또는 노드)는 칩을 분석하는 데 사용될 수 있다. 데이터는 실시간으로 분석될 수 있다. 1개 이상의 기기는 한 번에 작동될 수 있다. 나노포어는 단백질 나노포어, 예를 들어 칠량체 단백질 포어인 단백질 알파-용혈소일 수 있다. 나노포어는, 예를 들어 합성 막 (예를 들어, SiNx, 또는 SiO2)에 형성된 나노미터 크기의 홀로 제조된 고체-상태 나노포어일 수 있다. 나노포어는 하이브리드 포어 (예를 들어, 고체-상태 막 내로의 단백질 포어의 통합)일 수 있다. 나노포어는 통합된 센서 (예를 들어, 터널링 전극 검출기, 정전용량 검출기 또는 그래핀 기반 나노-갭 또는 에지 상태 검출기 (예를 들어, 문헌 [Garaj et al. (2010) Nature vol. 67, doi: 10.1038/nature09379] 참조))를 갖는 나노포어일 수 있다. 나노포어는 특정 유형의 분자 (예를 들어, DNA, RNA 또는 단백질)를 분석하기 위해 관능화될 수 있다. 나노포어 서열분석은 DNA가 포어를 전위시킴에 따라 무손상 DNA 중합체가 실시간 서열분석으로 단백질 나노포어를 통과할 수 있는 "가닥 서열분석"을 포함할 수 있다. 효소는 이중 가닥 DNA의 가닥을 분리하고, 나노포어를 통해 가닥을 공급할 수 있다. DNA는 한쪽 말단에 헤어핀을 가질 수 있고, 시스템은 양쪽 가닥을 판독할 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노포어 서열분석은 개별 뉴클레오티드가 진행성 엑소뉴클레아제에 의해 DNA 가닥으로부터 절단될 수 있고 뉴클레오티드가 단백질 나노포어를 통과할 수 있는 "엑소뉴클레아제 서열분석"이다. 뉴클레오티드는 포어 내 분자 (예를 들어, 시클로덱스트란)에 일시적으로 결합할 수 있다. 전류에서의 특징적인 중단이 염기를 확인하는 데 사용될 수 있다. 이들 기술을 사용하는 방법은 문헌 [Soni GV and Meller A. (2007) Clin Chem 53: 1996-2001]에 부분적으로 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 제니아(GENIA)™로부터의 나노포어 서열분석 기술이 사용될 수 있다. 조작된 단백질 포어는 지질 이중층 막에 포매될 수 있다. "능동 제어" 기술은 효율적인 나노포어-막 조립 및 채널을 통한 DNA 이동의 제어를 가능하게 하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노포어 서열분석 기술은 NABsys™로부터의 것이다. 게놈 DNA는 약 100 kb의 평균 길이의 가닥으로 단편화될 수 있다. 100 kb 단편은 단일 가닥으로 제조되고, 후속적으로 6-mer 프로브와 혼성화될 수 있다. 프로브를 갖는 게놈 단편은 나노포어를 통해 구동될 수 있으며, 이는 전류-대-시간 트레이싱을 생성할 수 있다. 전류 트레이싱은 각각의 게놈 단편 상에 프로브의 위치를 제공할 수 있다. 게놈 단편은 게놈을 위한 프로브 맵을 생성하도록 배열될 수 있다. 과정은 프로브의 라이브러리에 대해 병렬로 수행될 수 있다. 각각의 프로브에 대한 게놈-길이 프로브 맵이 생성될 수 있다. 오류는 "혼성화에 의한 이동 윈도우 서열분석 (mwSBH)"으로 명명된 과정으로 수정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노포어 서열분석 기술은 IBM™ 또는 로슈™로부터의 것이다. 전자 빔은 마이크로칩에서 나노포어 크기의 개구를 제조하는 데 사용될 수 있다. 전기장은 나노포어를 통한 DNA의 풀링 또는 스레딩에 사용될 수 있다. 나노포어 내 DNA 트랜지스터 장치는 교대하는 나노미터 크기의 금속 및 유전체 층을 포함할 수 있다. DNA 백본 내 별개의 전하는 DNA 나노포어 내부의 전기장에 의해 포획될 수 있다. 게이트 전압의 턴 오프 및 턴 온은 DNA 서열이 판독되도록 할 수 있다.
차세대 서열분석은 DNA 나노볼 서열분석을 포함할 수 있다 (예를 들어, 컴플리트 게노믹스™에 의해 수행됨; 예를 들어, 문헌 [Drmanac et al. (2010) Science 327: 78-81] 참조, 이는 본원에 참조로 포함됨). DNA는 단리되고, 단편화되고, 크기 선택될 수 있다. 예를 들어, DNA는 약 500 bp의 평균 길이로 단편화될 수 있다 (예를 들어, 초음파처리에 의해). 어댑터 (Adl)는 단편의 말단에 부착될 수 있다. 어댑터는 서열분석 반응을 위한 앵커에 혼성화하는 데 사용될 수 있다. 각각의 말단에 어댑터가 결합된 DNA는 PCR 증폭될 수 있다. 어댑터 서열은 상보적 단일 가닥 말단이 서로에 대해 결합하여 원형 DNA를 형성하도록 변형될 수 있다. DNA는 후속 단계에서 사용되는 유형 IIS 제한 효소에 의한 절단으로부터 이를 보호하기 위해 메틸화될 수 있다. 어댑터 (예를 들어, 우측 어댑터)는 제한 인식 부위를 가질 수 있고, 제한 인식 부위는 비-메틸화된 채로 남아있을 수 있다. 어댑터 내 비-메틸화 제한 인식 부위는 제한 효소 (예를 들어, Acul)에 의해 인식될 수 있고, DNA는 우측 어댑터의 우측으로 13 bp에서 Acul에 의해 절단되어 선형 이중 가닥 DNA를 형성할 수 있다. 제2 라운드의 우측 및 좌측 어댑터 (Ad2)는 선형 DNA의 어느 한 말단 상에 라이게이션될 수 있고, 둘 다의 어댑터가 결합된 모든 DNA는 (예를 들어, PCR에 의해) PCR 증폭될 수 있다. Ad2 서열은 이들이 서로 결합하여 원형 DNA를 형성하도록 변형될 수 있다. DNA는 메틸화될 수 있지만, 제한 효소 인식 부위는 좌측 Adl 어댑터 상에서 비-메틸화된 채로 남아있을 수 있다. 제한 효소 (예를 들어, Acul)가 적용될 수 있고, DNA는 Adl의 좌측으로 13 bp에서 절단되어 선형 DNA 단편을 형성할 수 있다. 제3 라운드의 우측 및 좌측 어댑터 (Ad3)는 선형 DNA의 우측 및 좌측 플랭크에 라이게이션될 수 있고, 생성된 단편은 PCR 증폭될 수 있다. 어댑터는 이들이 서로 결합하여 원형 DNA를 형성할 수 있도록 변형될 수 있다. 유형 III 제한 효소 (예를 들어, EcoP15)가 첨가될 수 있으며; EcoP15는 Ad3의 좌측으로 26 bp 및 Ad2의 우측으로 26 bp에서 DNA를 절단할 수 있다. 이러한 절단은 DNA의 큰 절편을 제거하고 DNA를 다시 한번 선형화할 수 있다. 제4 라운드의 우측 및 좌측 어댑터 (Ad4)는 DNA에 라이게이션될 수 있고, DNA는 (예를 들어, PCR에 의해) 증폭될 수 있고, 이들이 서로 결합하고 완성된 원형 DNA 주형을 형성하도록 변형될 수 있다.
롤링 서클 복제 (예를 들어, Phi 29 DNA 폴리머라제를 사용함)는 DNA의 작은 단편을 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 4개의 어댑터 서열은 혼성화할 수 있는 팔린드롬성 서열을 함유할 수 있고, 단일 가닥은 그 자체로 폴딩되어 평균 직경이 대략 200-300 나노미터일 수 있는 DNA 나노볼 (DNB™)을 형성할 수 있다. DNA 나노볼은 마이크로어레이 (서열분석 플로우셀)에 (예를 들어, 흡착에 의해) 부착될 수 있다. 플로우 셀은 이산화규소, 티타늄 및 헥사메틸디실라잔 (HMDS) 및 내광성 물질로 코팅된 실리콘 웨이퍼일 수 있다. 서열분석은 형광 프로브를 DNA에 라이게이션함으로써 언체인드 서열분석에 의해 수행될 수 있다. 조사된 위치의 형광의 색은 고해상도 카메라에 의해 가시화될 수 있다. 어댑터 서열 사이의 뉴클레오티드 서열의 동일성이 결정될 수 있다.
본원에 제공된 방법은 DNA 또는 RNA 서열 정보를 생성하기 위한 핵산 서열분석기 (예를 들어, DNA 서열분석기, RNA 서열분석기)를 함유하는 시스템의 사용을 포함할 수 있다. 시스템은 DNA 또는 RNA 서열 정보에 대한 생물정보학적 분석을 수행하는 소프트웨어를 포함하는 컴퓨터를 포함할 수 있다. 생물정보학적 분석은, 비제한적으로, 서열 데이터를 조립하는 것, 샘플에서 배선 변이체 및 체세포 변이체 (예를 들어, 암 또는 전암성 상태와 연관된 유전자 변이, 감염과 연관된 유전자 변이 또는 그의 조합)를 포함한 유전자 변이체를 검출 및 정량화하는 것을 포함할 수 있다.
서열분석 데이터는 유전자 서열 정보, 배수성 상태, 1종 이상의 유전자 변이체의 정체, 뿐만 아니라 상대 및 절대 상대 척도를 포함한 변이체의 정량적 척도를 결정하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 서열분석은 게놈의 서열분석을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 게놈은 본원에 개시된 바와 같은 병원체의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 게놈의 서열분석은 전체 게놈 서열분석 또는 부분 게놈 서열분석을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열분석은 비편향될 수 있고, 샘플 내 모든 또는 실질적으로 모든 (예를 들어, 70%, 80%, 90% 초과의) 핵산을 서열분석하는 것을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 게놈의 서열분석은 선택적일 수 있으며, 예를 들어 관심 게놈의 부분에 대해 지시될 수 있다. 일부 실시양태에서, 선택 유전자 또는 유전자의 부분의 서열분석은 목적하는 분석에 충분할 수 있다. 일부 실시양태에서, 게놈 내 특이적 유전자좌에 맵핑되는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 서열 포획 또는 부위-특이적 증폭에 의한 서열분석을 위해 단리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 분석, 계산, 정량화의 과정 또는 그의 조합을 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 방법은 박테리아 및 진균 서열 판독물의 양을 결정하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 박테리아 서열, 진균 서열의 양 또는 그의 조합을 결정하기 위한 측정기준이 생성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서 확인된 각각의 유기체에 대한 양은 생물학적 유체 (예를 들어, 혈장)의 마이크로리터당 분자 (MPM), 혈장의 마이크로리터당 존재하는 보고된 유기체로부터의 DNA 서열분석 판독물의 수로 표현된다. 일부 경우에, 감염의 (또는 감염의 중증도의 또는 과염증 반응의 또는 COVID-19로 인한 사망률의) 검출 또는 예측은 MPM이 한계치 값 초과인 경우에 발생한다. 일부 경우에, 이러한 MPM의 한계치 값은 10, 15, 20, 30, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 7000, 10000, 20000, 30000 또는 40000개이다. 일부 경우에, 한계치 값은 100개 MPM이다. 일부 경우에, 한계치 값은 100개 MPM이다. 일부 경우에, 100개 초과의 MPM인 총 MPM (예를 들어, 호흡기 병원체로부터의 총 MPM)은 2차 감염을 나타낸다. 일부 경우에, 100개 초과의 MPM인 총 MPM은 과염증 반응을 나타낸다. 일부 경우에, 한계치 값은 400개 MPM이다. 일부 경우에, 400개 초과의 MPM인 총 MPM (예를 들어, 호흡기 병원체로부터의 총 MPM)은 2차 감염을 나타낸다. 일부 경우에, 400개 초과의 MPM인 총 MPM은 과염증 반응을 나타낸다. 일부 경우에, 한계치 값은 3000개 MPM이다. 일부 경우에, 3000개 초과의 MPM인 총 MPM (예를 들어, 호흡기 병원체로부터의 총 MPM)은 2차 감염을 나타낸다. 일부 경우에, 3000개 초과의 MPM인 총 MPM은 과염증 반응을 나타낸다. 일부 경우에, 한계치 값은 4000개 MPM이다. 일부 경우에, 4000개 초과의 MPM인 총 MPM (예를 들어, 호흡기 병원체로부터의 총 MPM)은 2차 감염을 나타낸다. 일부 경우에, 4000개 초과의 MPM인 총 MPM은 과염증 반응을 나타낸다. 일부 경우에, 이러한 MPM의 한계치 값은 적어도 10, 15, 20, 30, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 7000, 10000, 20000, 30000 또는 40000개 (또는 그 초과)이다. 일부 경우에, MPM 한계치는 특정한 유기체에 대해 결정된다. 일부 경우에, MPM 한계치는 하나 초과의 단일 유기체로부터의 mcfNA (예를 들어, mcfDNA)의 합한 양 (예를 들어, 박테리아, 호흡기 병원체, 호흡기 박테리아, 박테리아 및 진균 또는 특정 세트의 병원체로부터의 mcfNA의 합한 양)인 값이다. 일부 실시양태에서, 호흡기 병원체는 임의의 조합의 표 2에 열거된 적어도 1종의 호흡기 병원체이다. 일부 실시양태에서, 호흡기 병원체는 스트렙토코쿠스, 슈도모나스 또는 클레브시엘라 박테리아이다. 일부 실시양태에서, 호흡기 병원체는 표 2에 열거된 임의의 속으로부터의 것이다. 일부 경우에, 호흡기 병원체는 악티노미세스, 아스페르길루스, 박테로이데스, 시트로박터, 시토메갈로바이러스, 엔테로박터, 에스케리키아, 엔테로코쿠스, 스트렙토코쿠스, 슈도모나스, 클레브시엘라 및/또는 헤모필루스 속으로부터의 것이다. 일부 경우에, 호흡기 병원체는 임의의 조합의 에스. 아우레우스, 피. 아에루기노사 및/또는 케이. 뉴모니아에이다. 일부 경우에, 임의의 상기 감염에 대한 MPM 한계치는 "약" (본원에 정의된 바와 같음) 임의의 상기 값이다.
일부 경우에, MPM 한계치는 비감염 또는 건강한 대조군에 대한 MPM을 나타낸다. 일부 경우에, MPM 한계치는 질환 중증도 또는 사망률의 위험을 나타내는 한계치 (예를 들어, 1000, 4000, 5000, 7000 또는 10000개 초과)를 지칭하며, Covid-19로 인한 비-생존의 높은 위험을 나타낼 수 있다.
서열분석 시스템
본 개시내용은 또한 핵산 또는 DNA 서열분석을 위한 서열분석 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열분석 시스템은 1차 감염을 갖는 대상체에서 2차 감염을 검출하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 시스템은 플로우 셀 및 플로우 셀에서 수행된 측정으로부터 수집된 서열 판독물을 포함하는 데이터를 출력하는 컴퓨터 프로세서를 포함하는 차세대 서열분석 장치를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스템은 (i) 서열 판독물을 미생물 참조 서열 판독물에 대해 정렬함으로써 적어도 2종의 상이한 미생물로부터의 미생물 세포-유리 핵산 (mcfNA)을 검출하고; (ii) 혈장 마이크로리터당 분자의 함수로서 총 mcfNA를 계산하고, 여기서 총 mcfNA는 적어도 2종의 상이한 미생물로부터의 mcfNA의 합한 값이고; (iii) 총 mcfNA가 한계치 값을 초과하는 경우에 2차 감염을 나타내는 사건을 생성하는 사건 생성기를 포함하는 총 mcfNA의 정량화 논리를 포함하는 컴퓨터 계산 장치를 포함하거나 또는 추가로 포함한다. 일부 경우에, 게놈 참조물은 표 2의 병원체로부터의 서열을 포함한다.
일부 경우에, 한계치 값은 적어도 50개 MPM, 70개 MPM, 100개 MPM, 200개 MPM, 500개 MPM, 1000개 MPM, 2000개 MPM, 3000개 MPM, 4000개 MPM, 5000개 MPM, 10000개 MPM, 50000개 MPM 또는 100000개 MPM이다. 일부 경우에, 한계치 값은 "약" 임의의 상기 MPM 값이다. 일부 경우에, 한계치 값은 건강한 또는 비감염 대상체 또는 저염증 반응을 갖는 대상체로부터의 미생물 세포-유리 핵산 (예를 들어, mcfDNA)에 대한 MPM과 연관된 값이다.
치료
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 비제한적 방법은 대상체에게 치료를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 치료는, 예컨대 질환 또는 장애의 증상 또는 징후를 감소시킴으로써 질환 또는 장애를 치료한다. 일부 경우에, 질환 또는 장애는 감염 (예를 들어, 박테리아 감염, 진균 감염, 호흡기 감염, 폐렴, 박테리아성 폐렴, 바이러스성 폐렴)이다. 일부 경우에, 질환 또는 장애는 염증이다. 일부 경우에, 치료는 감염 또는 염증의 발병 전에 및 일부 실시양태에서는 감염의 1종 이상의 증상 (예를 들어, 열, 상승된 심박수, 저혈압, 과다호흡)의 발병 전에 발생한다. 일부 실시양태에서, 치료는 대상체가 치료의 표적인 유기체에 대해 혈액 배양 음성인 경우에 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 감염은 대상체가 혈액 배양 음성인 경우에 본원에 제공된 방법에 의해 검출 또는 예측되지만, 치료는 대상체가 혈액 배양 양성인 경우에 투여된다. 일부 실시양태에서, 감염은 대상체가 혈액 배양 음성인 경우에 본원에 제공된 방법에 의해 검출 또는 예측되고, 치료는 대상체가 혈액 배양 음성인 경우에 투여된다. 일부 실시양태에서, 감염은 대상체가 혈액 배양 양성인 경우에 본원에 제공된 방법에 의해 검출 또는 예측되고, 치료는 대상체가 혈액 배양 양성인 경우에 투여된다. 일부 경우에, 치료는 대상체가 혈액 배양을 갖지 않은 경우에 또는 혈액 배양이 비-결정적인 경우에 제공된다. 일부 실시양태에서, 치료는 무증상 감염이 증상 감염으로 진행되는 것을 방지하는 선제적 치료이다. 일부 실시양태에서, 치료는 감염의 발병을 방지하는 예방적 치료이다. 일부 실시양태에서, 치료는 감염의 증상을 치료하거나 감소시킨다.
본원에 제공된 다양한 비제한적 치료가 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료는 광역 항미생물 약물 또는 특정 미생물 또는 특정 부류의 미생물을 표적화하는 항미생물 약물이다. 일부 실시양태에서, 치료는 박테리아 및/또는 진균, 특히 본원에서 (예를 들어, 본 출원의 실시예 섹션에서) 확인된 임의의 미생물 유기체를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 약물의 조합 (예를 들어, 다수의 항생제, 다수의 항진균 약물 또는 항생제 및 항진균 약물 둘 다의 조합)으로 치료된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 광역 항생제의 조합, 광역 및 협역 항생제의 조합, 협역 항생제의 조합, 광역 항진균제의 조합, 광역 및 협역 항진균제의 조합 또는 협역 항진균제의 조합으로 치료된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 광역 항생제, 협역 항생제, 광역 항진균제, 협역 항진균제 또는 그의 임의의 조합으로 치료된다.
일부 실시양태에서, 치료는 항미생물제이다. 일부 실시양태에서, 항미생물제는 본원에 사용된 바와 같이 및/또는 임상의에 의해 권장된 바와 같이 단독으로 또는 그의 임의의 조합으로 사용되는 베타-락탐, 아미노글리코시드, 퀴놀론, 옥사졸리디논, 술폰아미드, 마크롤리드, 테트라시클린, 안사마이신, 스트렙토그라민, 리포펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료는 광역 치료이다. 일부 실시양태에서, 광역 치료는 광역 항생제, 광역 항박테리아 약물, 광역 항진균제 또는 그의 임의의 조합이다. 본원에 사용된 용어 "광역 항생제"는 일반적으로 그람 음성 및 그람-양성 박테리아 둘 다에 작용하고/거나, 다수의 유형의 그람-음성 박테리아에 작용하고/거나, 다수의 유형의 그람-양성 박테리아에 작용하는 약물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 광역 치료는 다수의 유형의 진균 감염에 작용한다. 일부 실시양태에서, 약물은 베타-락탐 페니실린, 예컨대 플루클록사실린, 암피실린 (또는 아목시실린)이다. 일부 실시양태에서, 광역 약물은 베타-락탐, 예컨대 세팔로스포린 항생제 (예를 들어, 세프트리악손, 세페핌)이다. 세팔로스포린 약물은, 일부 실시양태에서, 제1, 제2, 제3 또는 제4 세대 세팔로스포린 약물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 광역 항생제는 퀴놀론 약물 (예를 들어, 레보플록사신), 카르바페넴-유형 항생제 (예를 들어, 메로페넴) 또는 메트로니다졸이다.
일부 경우에, 치료는 항생제이다. 일부 실시양태에서, 치료는 그람-양성 박테리아에 대해 활성인 당펩티드 항생제이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치료는 반코마이신이다. 일부 실시양태에서, 치료는 표 5에 열거된 1종 이상의 항생제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 치료는 항진균 약물이다. 일부 실시양태에서, 치료는 광역 항진균 약물이다. 일부 실시양태에서, 항진균 약물은, 예를 들어 세페핌, 클로트리마졸, 에코나졸, 미코나졸, 테르비나핀, 플루코나졸, 케토코나졸, 니스타틴, 암포테리신 B 또는 임의의 다른 공지된 항진균 약물 및/또는 그의 조합이다.
일부 실시양태에서, 치료는 다양한 협역 약물, 예를 들어 플루시토신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 협역 약물은 옥사졸리디논, 예를 들어 리네졸리드, 포시졸리드, 라데졸리드, 페니실린 VK 또는 그의 임의의 조합이다.
일부 실시양태에서, 항미생물 약물은 환제, 겔, 정제, 코팅된 정제 또는 그의 임의의 조합이고, 대상체에게 경구로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항진균제를 사용한 치료는 대상체에게 국소적으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료는 캡슐, 정제, 액체, 주사제, 페사리 또는 그의 임의의 조합의 형태로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항미생물 약물은 주입으로서 제제화되고, 대상체에게 바늘 또는 카테터를 통해 정맥내로 투여될 수 있다.
일부 경우에, 치료는 항염증 약물이다. 예를 들어, 일부 경우에, 치료는 비-스테로이드성 항염증 약물 (NSAID)이다. 일부 경우에, 항염증 약물은 스테로이드이다. 일부 경우에, 약물은 코르티코스테로이드이다. 일부 경우에, 약물은 덱사메타손이다. 일부 경우에, 약물은 프레드니손이다.
일부 경우에, 치료는 COVID-19에 대한 치료이다. 일부 경우에, 치료는 렘데시비르이다. 일부 경우에, 약물은 모노클로날 항체이다. 일부 경우에, 본원에 제공된 방법은 대상체가 중증 COVID-19의 위험 또는 COVID-19에서 생존하지 않을 위험을 갖는다는 것을 나타낼 수 있고, 대상체는 중증 COVID-19를 치료 또는 예방하기 위한 약물, 예컨대 렘데시비르 또는 모노클로날 항체를 투여받을 수 있다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 상세하게 기재되며, 이는 어떠한 방식으로도 청구된 바와 같은 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 첨부된 도면은 본 발명의 명세서 및 설명의 필수 부분으로서 간주되는 것으로 의도된다. 인용된 모든 참고문헌은 그 안에 기재된 모든 것에 대해 참조로 본원에 구체적으로 포함된다. 하기 실시예는 청구된 발명을 예시하기 위해 제공되지만, 이에 제한되지는 않는다.
하기 실험 개시내용에서, 하기 약어가 적용된다: eq (당량); M (몰); μM (마이크로몰); N (노르말); mol (몰); mmol (밀리몰); μmol (마이크로몰); nmol (나노몰); g (그램); mg (밀리그램); kg (킬로그램); μg (마이크로그램); L (리터); ml (밀리리터); μl (마이크로리터); cm (센티미터); mm (밀리미터); μm (마이크로미터); nm (나노미터); ℃. (섭씨 온도); h (시간); min (분); sec (초); msec (밀리초).
실시예 1
본 실시예는 혈장 mcfDNA 메타게놈 서열분석을 예시한다. 이전에 기재된 바와 같이, 혈장 mcfDNA 메타게놈 서열분석은 문헌 [Blauwkamp 2019]에 따라 수행될 수 있다.
간략하게, 혈장에 알려진 농도의 합성 정규화 분자 대조군을 스파이킹하고, 이어서 세포-유리 DNA를 추출한다. 추출된 cfDNA를 말단-복구에 의해 프로세싱하고, 말단-복구된 cfDNA에 대한 특이적 인덱스를 함유하는 어댑터에 라이게이션한다. 라이게이션 생성물을 비드에 의해 정제한다. 어댑터에 부착된 cfDNA를 P5 및 P7 프라이머로 증폭시키고, 증폭된 cfDNA를 정제한다.
정제된 cfDNA (혈장 샘플로부터 유래된 것)를 DNA 서열분석 라이브러리 내로 혼입시킨다. 여러 혈장 샘플로부터의 서열분석 라이브러리를 대조군 샘플과 함께 풀링하고, 정제하고, 일루미나 서열분석기 상에서 75-사이클 단일-말단 이중 인덱스 서열분석 키트를 사용하여 서열분석할 수 있다. 1차 서열분석 출력물을 디멀티플렉스화한 다음, 판독물을 품질 트리밍하고, 품질 필터를 통과한 판독물을 인간 및 합성 참조물에 대해 정렬하고, 보관한다. 인간 위성 DNA를 잠재적으로 나타내는 판독물을 또한 k-mer-기반 방법을 통해 필터링하고; 이어서 나머지 판독물을 고품질 게놈 참조물의 20,963개의 조립물로 이루어진 미생물 참조 데이터베이스와 정렬한다. 높은 퍼센트 동일성 및 높은 쿼리 커버리지 둘 다를 나타내는 정렬을 갖는 판독물을, 임의의 미토콘드리아 또는 플라스미드 참조 서열과 정렬된 판독물을 제외하고는 보유한다. PCR 중복물을 그의 정렬에 기초하여 제거한다. 상대 존재비를 서열분석 판독물 및 그의 정렬에 기초하여 샘플 내 각각의 분류군에 배정한다.
판독물과 분류군의 각각의 조합에 대해, 샘플에 존재하는 미생물과 데이터베이스 내 참조 조립물 사이의 차이를 설명하는 판독 서열 확률을 정의한다. 혼합 모델을 사용하여 판독 서열 확률 및 샘플 내 각각의 분류군의 (비관찰) 존재비를 포함한 서열분석 판독물의 완전한 수집에 대한 가능도를 배정한다. 기대치-최대화 알고리즘을 적용하여 각각의 분류군 존재비의 최대 가능도 추정치를 컴퓨터 계산할 수 있다. 이들 존재비로부터, 각각의 분류군으로부터 발생하는 판독물의 수를 분류학적 트리로 집계한다. 배치 내의 주형 부재 대조군 (NTC) 샘플로부터의 추정된 분류군 존재비를 조합하여 노이즈를 카운팅함으로써 구동된 변동이 있는 환경으로부터 발생한 판독물 존재비의 모델을 파라미터화한다. 이어서, 각각의 환자 샘플에서 분류군 존재비의 각각의 추정치에 대해 통계적 유의성 값을 컴퓨터 계산한다. 높은 유의성 수준을 나타내고 보고가능한 범위 내 1449개의 분류군 중 하나인 분류군은 본 발명자들의 후보 호출을 포함한다. 최종 호출은 추가의 필터링이 적용된 후에 이루어지며, 이는 판독 위치 균일성 뿐만 아니라 보다 높은 존재비 호출로부터 기원하는 교차-반응성 위험을 설명한다. 이들 필터를 통과한 미생물 호출을 분류군에 대한 고유한 판독물과 정규화 분자의 관찰된 고유한 판독물의 수 사이의 비를 사용하여 추정된 바와 같은 MPM의 존재비와 함께 보고한다.
각각의 샘플 내 mcfDNA 혈장 농도의 양을 혈장에 초기에 스파이킹된 합성 분자의 측정된 상대 존재비를 사용하여 정량화한다.
실시예 2
COVID-19를 갖는 42명의 입원 환자를 전향적으로 등록시키고, 배양-양성 폐렴 (n=27) 대 배양-음성 폐렴 (n=40) 또는 임상 감염 부재 (n=18 대조군)의 기계적 환기 환자의 과거 코호트와 비교하였다. 혈장 샘플로부터, mcfDNA-Seq를 사용하여 선천성 면역 및 상피/내피 손상의 10종의 숙주 반응 바이오마커 (IL-6, IL-8, IL-10, RAGE, TNFR1, 안지오포이에틴-2, 프로칼시토닌, 프랙탈카인, 펜트락신-3, ST2)를 측정하였다. mcfDNA의 수준을 임상군 사이에서 비교하고, mcfDNA와 바이오마커 수준의 연관성을 선형 회귀 모델로 조사하였다.
McfDNA-Seq는 COVID-19를 갖는 환자로부터의 33/42개 (79%) 기준선 샘플에서 성공적이었으며, 9개 샘플은 QC 요건에 실패하였다. McfDNA는 21/33개 (64%)의 COVID-19 샘플에서 검출가능하였으며, 이는 배양-양성 폐렴 (96%)보다 유의하게 더 낮은 비율, 비감염 대조군 (33%) 및 유사한 배양-음성 폐렴 (56%)보다 더 높은 비율이다 (군 사이의 피셔 정확 검정 p<0.001). mcfDNA 수준에 대해 유사한 분포가 관찰되었으며, COVID-19 내 mcfDNA 로드는 비-COVID 배양-음성 폐렴과 유사하게 분포되었다 (도 1a). McfDNA는 보다 높은 수준의 숙주 반응 바이오마커와 유의하게 연관되었으며 (도 1b), 선천성 면역 (IL-8 및 ST2) 및 박테리아 감염 (프로칼시토닌 및 펜트락신-3)의 바이오마커에 대해 보다 강한 효과 크기가 관찰되었다.
COVID-19를 갖는 환자에서의 혈장 메타게놈학은 COVID-19를 갖지 않고 임상적으로 의심되는 감염을 갖지만 미생물 배양 음성인 위중한 환자에서와 유사한 규모의 mcfDNA 로드를 밝혀냈다. mcfDNA와 숙주 염증의 유의한 연관성은 검출가능한 순환 mcfDNA의 생물학적 관련성을 지지한다. 본 발명자들의 예비 결과는 항미생물 치료 안내를 위한 비-침습적 분자 진단학의 임상 유용성을 정의하기 위해 COVID-19를 갖는 입원 환자에서의 2차 감염의 추가 연구를 정당화한다.
실시예 3
COVID-19를 갖는 15명의 위중한 환자 (SARS-CoV-2에 대한 비인두 qPCR에 의해 확인됨)를 전향적 ICU 코호트 연구에 등록시켰다. mcfDNA-Seq를 수행하기 위한 혈장 샘플을 문헌 [Blauwkamp, 2019, Nature Microbiol, 4:663-74] (본원에 참조로 포함됨)에 기재된 방법에 따라 분석하였다. mcfDNA의 검출을 임상 진단 및 처방된 항미생물 요법과 관련하여 치료 의사에 의해 평가하고, 임상 결과와의 연관성에 대해 조사하였다.
분석된 15명의 환자 (중앙 연령 63세, 53% 여성, 73% 기계적으로 환기됨) 중에서, 등록으로부터 30일 내에 6명 (40%)이 사망하였다. 샘플을 COVID-19 증상 발병으로부터 중앙값 (사분위간 범위-IQR) 10일 (4-12일)에서 수득하였으며, 각각의 샘플은 중앙값 837개 (111-4638개)의 총 mcfDNA 분자/마이크로리터 (MPM) 및 2개 (1-4개)의 확인된 유기체를 함유하였다. 15개의 샘플에 걸쳐 보고된 총 92,791개의 MPM 중에서, 90%는 전형적인 병원성 박테리아 (예를 들어, 이. 콜라이 및 케이. 뉴모니아에)에 속하였으며, 나머지 MPM은 공생 박테리아 (5%, 예를 들어 구강 스트렙토코쿠스 종), 진균 (4%, 칸디다 종) 및 DNA 바이러스 (1%)에 대해 정렬되었다. 생존자와 비교하여, 비-생존자는 더 높은 총 mcfDNA (p = 0.04), 더 높은 병원성 박테리아 MPM (p = 0.02) 및 샘플당 더 많은 수의 확인된 유기체에 대한 경향 (p = 0.06)을 가졌다. (도 2). 2차 폐렴은 11/15명 (73%)의 환자 (군 A, 도 3)에서 치료 의사에 의해 임상적으로 의심되거나 진단되었고, 3/11명의 대상체 (27%)에서 호흡기 배양 양성에 의해 미생물학적으로 확인되었으며; 이들 3명의 환자는 통상의 박테리아 병원체, 예컨대 이. 콜라이 및 피에스. 아에루기노사에 대해 높은 혈장 mcfDNA MPM을 가졌다. 임상적으로 의심되는 감염 및 실험적 항생제 치료를 갖는 나머지 8명의 환자 중에서, 개연성 있는 박테리아 병원체의 높은 mcfDNA MPM이 2/8명의 환자에서 검출되었다 (공동-감염 피에스. 아에루기노사 및 케이. 뉴모니아에; 각각 라오울텔라 오르니티놀리티카). 추가의 6명의 환자에서, 공동-감염 박테리아 병원체의 증거가 존재하지 않은 반면, 1명의 환자 (대상체 7, 도 2)에서는 비진단 침습성 칸디다증에 관한 칸디다 트로피칼리스에 대한 높은 신호 (2,490개 MPM)가 있었다. 도 2a 및 도 2b는 중증 COVID-19 감염의 비-생존자가 생존자와 비교하여 메타게놈 서열분석에 의해 혈장 마이크로리터당 더 많은 미생물 세포-유리 DNA 분자를 가졌고 (중앙값 [사분위간 범위]: 11,125 [650-26,436] 대 661 [1], 윌콕슨 검정 p-값 = 0.04), 샘플당 더 많은 수의 확인된 미생물에 대한 경향을 가졌다는 것을 보여준다 (3.5 [1.8-4.3] 대 1.0 [0-2.5], 윌콕슨 검정 p-값 = 0.06). 도 2a는 마이크로리터당 총 mcfDNA 분자를 보여준다. 도 2b는 혈장 메타게놈학에 의해 검출된 미생물의 수를 보여준다.
호흡기 병원체 MPM (에스. 아우레우스, 피에스. 아에루기노사 및 케이. 뉴모니아에)은 2차 감염에 대한 의심이 낮은 3/4명의 대상체에서 검출되었다 (군 B, 도 3). 이들 환자에서, 호흡기 시편 배양은 수득되지 않았고, 항생제는 연구 샘플링 시점까지 혈액 배양 음성에 기초하여 개시되지 않았거나 중단되었다. 이들 개체 중 2명은 지속적인 혈관확장성 쇼크를 경험하였고, 고립성 SARS-CoV-2 감염에 기인하는 다기관 기능장애로 사망하였다. 도 3은 도시된 임상 진단, 혈장 미생물 세포-유리 DNA 메타게놈학 및 생존 결과에 의한 COVID-19를 갖는 15명의 위중한 환자의 사례-기반 분석을 보여준다. Y-축 가장자리는 임상 진단의 2개 군을 나타낸다: 군 A는 미생물학적으로 확인된 감염 (n = 3) 또는 미생물학적 정밀검사 음성에도 불구하고 임상적으로 의심되는 감염 (n = 8)에 대해 항생제를 받은 11명의 환자를 포함하는 반면, 군 B는 2차 감염에 대한 임상적 의심이 낮고 샘플링 시에 항생제 요법이 없는 4명의 환자를 포함한다. Y-축 눈금은 각각의 환자 샘플을 나타내고, 각각의 적층된 막대의 x-높이는 메타게놈 서열분석에 의한 혈장 마이크로리터당 미생물 세포-유리 DNA 분자의 수 (MPM)를 나타내며, 순위화된 존재비에 의해 상위 10종의 미생물에 대해 색상이 상이하다. "기타" 카테고리 (회색으로 제시됨)는 공생 기원의 보다 낮은 존재비 분류군의 합계를 나타낸다. 군 A의 11명의 대상체 중 5명 (45%, 대상체 1-5)은 개연성 있는 호흡기 병원체에 대해 높은 MPM 신호를 가진 반면, 나머지 6/11명의 대상체에서는 공동-감염 박테리아 병원체의 증거가 없었다. 대상체 7은 배양-음성 패혈증으로 임상적으로 진단되었고, COVID-19로부터의 불응성 저산소혈증 호흡 부전에 대한 체외 막 산소화 지원 하에 장기간 과정의 실험적 광역 항생제로 치료되었으며; 씨. 트로피칼리스에 대한 높은 mcfDNA 신호 (2,490개 MPM)는 비진단 침습성 칸디다증에 관한 것으로, 연구 샘플 획득 후 제5일, 제9일 및 제14일에 수득된 임상 기관지폐포 세척 샘플로부터의 효모 유기체 (추가로 종분화되지 않음)의 지속적 성장에 의해 확증되었다. 생존하지 않고 실험적 항미생물제를 받지 않은 군 B의 4명의 환자 중 2명 (대상체 12 및 13)은 개연성 있는 호흡기 병원체의 높은 mcfDNA 신호 (> 4000개의 총 MPM)를 갖는 것으로 밝혀졌으며, 이는 비진단 (및 비치료) 2차 감염을 나타낸다.
COVID-19를 갖는 환자에서의 McfDNA-Seq는 이전에 인식된 것보다 개연성 있는 2차 감염의 더 높은 발생률을 나타낸다. mcfDNA와 30-일 사망률 사이의 유의한 연관성은 COVID-19 중증도가 2차 폐렴으로부터 또는 COVID-19에 의해 손상된 폐의 파괴된 폐포/상피 표면을 따른 콜로니화 미생물총의 가능한 전위로부터 순환 박테리아 단편에 의해 영향을 받을 수 있다는 것을 시사한다. 문헌 [Kitsios, 2019, Open Forum Infect Dis, 6:S138]. mcfDNA 검출과 임상 데이터의 통합은 감염이 의심되는 환자에서의 항생제 관리에 대한 기회를 입증한다. 다른 한편으로, 비진단 및 비치료 2차 감염에 대한 신호는 중증 COVID-19를 갖는 환자에 대한 경계와 철저한 진단 정밀검사를 요청하는 역할을 해야 한다.
실시예 4
ICU 코호트로부터 중증 폐렴을 갖는 및 갖지 않는 기계적 환기 환자의 중첩 사례-대조군 연구를 수행하였다. 지역사회 또는 병원-획득 폐렴을 확립된 기준에 따라 정의하였다 (Gong, 2005, Crit Care Med, 33:1191-98). 분류된 환자는 병원성 미생물 종이 호흡기 시편 또는 혈액 배양으로부터 단리된 경우 배양-양성으로 정의하고, 이에 비해 어느 배양에서나 성장이 없거나 호흡기 배양에서 단지 정상 호흡기 균총만이 보고된 경우 배양-음성으로 정의하였다. 방사선학적 중증도 지수 (RSI)를 삽관 후 처음 이용가능한 흉부 방사선사진 상에서 정량화하고, 이용가능한 데이터로부터 임상 폐 감염 점수 (CPIS)를 계산하였다. 문헌 [Zilberberg, 2010, Clin Infect Dis, 51, S131-35; 및 Sheshadri, 2019, BMJ Open Respir Res, 6:e000471] (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 비감염 대조군은 기도 보호를 위해 또는 비대상성 울혈성 심부전으로부터의 저산소혈증을 위해 삽관된 환자였다. 혈장 mcfDNA 메타게놈학을 실시예 1에 개시된 바와 같이 수행하였다. 9종의 숙주-반응 바이오마커를 측정하고, 환자를 과염증 대 저염증 하위표현형으로 분류하였다. 메타게놈 서열을 마이크로리터당 mcfDNA 분자 (MPM)로서 정량화하였다. 임상 변수를 3개의 임상군 (배양-양성 폐렴, 배양-음성 폐렴 및 비감염 대조군) 사이의 바이오마커 및 mcfDNA 수준과 비교하고, 쌍별 비교를 위해 비-파라미터 검정 및 사후 조정을 수행하였다. 바이오마커와 mcfDNA 농도 (MPM) 사이의 연관성을 로그 변환 후 다변량 조정된 선형 모델로 조사하였다.
임상 코호트 및 샘플 수집 - 삽관되고 기계적으로 환기된 연속적인 성인 환자의 편의 샘플을 전향적으로 등록시켰다. 등록 시에, 원심분리, 혈장의 분리 및 숙주 염증 반응 바이오마커의 정량화 뿐만 아니라 mcfDNA 메타게놈 서열분석을 위해 혈액 샘플을 수집하였다.
혈장 바이오마커 측정 - 프랙탈카인, 인터류킨 (IL)-6, IL-8, 펜트락신-3, 프로칼시토닌, 진행성 당화 최종 산물에 대한 수용체 (RAGE), 종양발생성 억제 (ST)-2 및 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR)-1을 포함한, 폐렴 및 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)에서의 확립된 예후 유용성을 갖는 바이오마커의 혈장 수준을 측정하기 위해 맞춤 루미넥스(Luminex) 다중-분석물 패널 (알앤디 시스템즈(R&D Systems), 미네소타주)을 구축하였다.
과염증 및 저염증 하위표현형 배정 - 여러 임상 및 바이오마커 변수를 이용하는 잠재적 부류 분석에 의해 이전에 정의된 숙주-반응의 과염증 대 저염증 하위표현형으로 환자를 분류하는 데 4-변수의 엄격한 모델을 사용하였다. 문헌 [Drohan, 2020, Host-Response Subphenotypic Classification with A Parsimonious Model Offers Prognostic Information in Patients with Acute Respiratory Failure: A Prospective Cohort Study, doi:10.21203/rs.3.rs-57907/v1]. 저염증 하위표현형 분류 확률의 로짓을 0.8739604-8.798345e-05*(안지오포이에틴-2) - 6.049412e-04*(프로칼시토닌) - 4.048723e04*(TNFR-1) + 2.883218e-01*(비카르보네이트)로서 계산하였다.
실시예 5
mcfDNA 및 바이오마커와 염증 예후의 연관성을 결정하기 위해, 27명의 배양-양성 폐렴 환자, 40명의 배양-음성 폐렴 환자 및 16명의 비감염 대조군을 조사하였다. 표 1의 데이터는 연속 변수의 경우 중앙값과 사분위간 범위로 제시되고, 범주형 변수의 경우 N과 백분율로 제시된다. 3개의 임상 카테고리 사이의 비교에 대한 P-값을 연속 변수의 경우 크루스칼 왈리스 검정으로부터 수득하고, 범주형 변수의 경우 피셔 정확 검정으로부터 수득하였다. 배양-양성 대 배양-음성 폐렴 환자 사이의 비교에 대한 P-값을 3개의 군 비교로부터 벤자미니-호크베르크 보정 사후 검정으로 다수의 검정에 대해 조정하였다. 대조군 대비 폐렴 (배양-양성 및 음성 둘 다)을 갖는 환자 사이의 비교에 대한 P-값을 연속 변수의 경우 윌콕슨 검정으로부터 수득하고, 범주형 변수의 경우 피셔 정확 검정으로부터 수득하였다. 16명의 비감염 대조군 중에서, 12명의 환자에게 호흡기 감염의 어떠한 증거도 없이 기도 보호를 위해 삽관하고, 나머지 4명에게 비대상성 울혈성 심부전으로 인한 심인성 폐 부종을 위해 삽관하였다.
폐렴 (배양-양성 또는 음성)을 갖는 환자는 대조군과 비교하여 더 적은 인공호흡기-부재 일수, 더 높은 CPIS, RSI 및 염증 바이오마커 수준을 가졌다 (표 1, p<0.05). 배양-양성 환자는 다른 군과 비교하여 더 높은 순환 mcfDNA를 가졌다 (사후 p<0.001, 도 4a). 혈장 내에 검출가능한 mcfDNA를 갖는 24명의 배양-양성 환자 중에서, 단지 3명 (13%)만이 박테리아혈증이었다. 모든 검출된 mcfDNA 서열의 대다수 (92%)는 박테리아에 속하였고 (도 4b), 서열의 64%는 확립된 호흡기 병원체 (예를 들어, 스타필로코쿠스 아우레우스 및 슈도모나스 아에루기노사)에 배정되었다. 인식된 호흡기 병원체 (지지 문헌에 의함) 및 폐렴과 관련하여 임상 중요성이 불명확한 병원체의 목록을 분류하고 있는 표 2를 참조한다. 도 4a는 배양-음성 폐렴 및 비감염 대조군과 비교하여, 그리고 배양-음성 폐렴 환자와 비교하여 배양-양성 폐렴에서 혈장 미생물 세포-유리 DNA 수준이 상승된다는 것을 보여준다 (벤자미니-호크베르크 방법에 의해 사후 조정된 쌍별 비교). *, 사후 p<0.05; ***, 사후 p<0.005; ****, 사후 p<0.001. 도 4b는 파이 차트에 도시된 배양-양성, 배양-음성 폐렴 및 비감염 대조군에서 검출된 mcfDNA (박테리아, 진균 또는 바이러스)의 유형을 보여준다. 파이 차트의 반경은 각각의 환자 하위군 내에서 검출된 mcfDNA MPM의 합계에 2차적으로 비례한다. 바이러스 mcfDNA의 비율은 배양-양성 폐렴 (1.6%) 군과 비교하여 배양-음성 (18.0%)에서 유의하게 더 높았다 (비율의 비교의 z 검정에 대해 p<0.0001). 분류군별로 검출된 mcfDNA의 로드가 도 8에 가시화된다. 도 8a 및 도 8b는 마이크로리터당 분자 (MPM)로서 정량화된, 분류군별로 모든 참가자에 걸쳐 검출된 mcfDNA 로드의 합계를 보여준다. 도 8a는 인식된 호흡기 병원체 분류군의 mcfDNA를 보여주고; 도 8b는 임상 중요성이 불명확한 미생물의 mcfDNA를 보여준다. mcfDNA 서열분석과 배양 결과 사이의 비교가 표 3에 제시된다. mcfDNA 서열분석을 위한 샘플을 삽관 72시간 내에 수집하였다. mcfDNA 로드에 대한 샘플 획득 시기 (삽관 또는 ICU 입원으로부터) 또는 샘플링 전 항생제 노출의 강도의 유의한 효과는 발견되지 않았다 (도 6). 도 6a 및 도 6b는 폐렴을 갖는 환자에서 mcfDNA 및 프로칼시토닌 수준에 대한 샘플링 및 항생제 노출의 시기의 영향을 보여준다. 도 6a는 배양 양성 환자와 배양 음성 환자 사이의 ICU 입원으로부터의 샘플링 시간을 보여준다. 도 6b는 배양 양성 환자와 배양 음성 환자 사이의 삽관으로부터의 샘플링 시간을 보여준다. 배양-양성 환자는 배양-음성 환자와 비교하여 삽관으로부터 비교적 더 짧은 시간 간격을 가졌다 (p = 0.014, 윌콕슨 검정). 도 6c 및 도 6d는 프로칼시토닌 수준이 ICU 입원 (도 6d) 또는 삽관 (도 6c)으로부터의 샘플링 시간에 따라 상이하지 않았다는 것을 보여준다. 도 6e 및 도 6f는 mcfDNA 수준이 ICU 입원 (도 6f) 또는 삽관 (도 6e)으로부터의 샘플링 시간에 따라 상이하지 않았다는 것을 보여준다. 도 6g 및 도 6h는 프로칼시토닌 (도 6g) 및 mcfDNA 수준 (도 6h)이 이전에 기재된 바와 같이 적용된 항생제 노출 점수와 유의하게 연관되지 않았다는 것을 보여준다. 문헌 [Kitsios 2020; Zhao, 2014, Sci Rep, 4:4345].
숙주 반응의 경우, 단지 펜트락신-3만이 폐렴을 갖는 환자 중 배양-음성 참가자 대비 배양-양성 참가자에서 유의하게 상승하였다 (사후 p=0.05, 표 1). 선험적으로 선택된 잠재적 혼동요인에 대한 조정된 모델 뿐만 아니라 비조정 모델에서 혈장 바이오마커 (결과)를 혈장 mcfDNA 수준 (예측인자)과 비교하는 선형 회귀 모델을 구축하였다. 도 7a는 배양-양성 폐렴 환자가 배양-음성 폐렴 환자와 비교하여 인식된 호흡기 병원체에 상응하는 혈장 mcfDNA MPM의 더 높은 수준을 가졌다는 것을 보여주며 (표 2), 배양-음성 폐렴 환자는 차례로 또한 비감염 대조군과 비교하여 더 높은 mcfDNA 수준을 가졌다 (벤자미니-호크베르크 방법에 의해 사후 조정된 쌍별 비교). *, 사후 p<0.05; ****, 사후 p<0.001. 도 7b는 (i) 미생물 접종물의 대용물 (배양-양성 대 음성 분류), (ii) 폐 손상의 정도 (방사선촬영으로 RSI에 의해 및 상피 손상 바이오마커인 진행성 당화 최종 산물에 대한 수용체 - RAGE에 의해 도시된 바와 같음) 및 (iii) 숙주 선천성 면역 상태 (연령, 만성 폐쇄성 폐 질환 및 면역억제)를 포함한, 선험적으로 선택된 잠재적 혼동요인에 대한 조정된 모델 뿐만 아니라 비조정 모델에서 인식된 호흡기 병원체의 혈장 mcfDNA 수준 (예측인자, x-축에 제시됨)에 대한 혈장 바이오마커 (결과, y-축에 제시됨)의 선형 회귀 모델의 그래프 표현을 보여준다.
표 4는 mcfDNA 대 혈장 염증 바이오마커의 유의성에 대한 추정 회귀 계수, 95% 신뢰 구간 및 p 값의 계산의 각각의 회귀 모델에 대한 결과를 보고한다. 분석을 총 mcfDNA, 뿐만 아니라 인식된 호흡기 병원체에 상응하는 mcfDNA에 대해 수행하였다. 모든 mcfDNA MPM 및 바이오마커 측정치를 로그 변환하였으며; p<0.05를 갖는 회귀 모델은 볼드체로 제시된다. 폐렴을 갖는 환자에서의 mcfDNA에 대한 숙주-반응 바이오마커의 단일변량 선형 회귀 모델에서, 프랙탈카인, 인터류킨-8, 프로칼시토닌, 펜트락신-3, 종양발생성 억제-2 (ST-2) 및 가용성 종양 괴사 인자 수용체-1 (TNFR-1) 수준에 대한 유의한 연관성이 검출되었다 (모두 p<0.05, 도 5a 및 표 4). 다변량 회귀 모델에서, 프랙탈카인, 프로칼시토닌, 펜트락신-3 및 ST-2에 대한 연관성은 여전히 통계적으로 유의한 것으로 남아있으며 (도 5a 및 표 4), 이는 염증 반응에 대한 순환 mcfDNA의 독립적인 효과를 시사한다. 유해한 과염증 하위표현형에 배정된 폐렴을 갖는 환자 (n=9, 13%)는 저염증 환자와 비교하여 유의하게 더 높은 mcfDNA 수준을 가졌다 (p<0.01, 도 5b). 도 5a 및 도 5b는 순환 mcfDNA가 폐렴을 갖는 환자에서 숙주 염증 반응과 연관된다는 것을 보여준다. 도 5a는 (i) 미생물 접종물의 대용물 (배양-양성 대 음성 분류), (ii) 폐 손상의 정도 (방사선촬영으로 RSI에 의해 및 상피 손상 바이오마커인 진행성 당화 최종 산물에 대한 수용체 - RAGE에 의해 도시된 바와 같음) 및 (iii) 숙주 선천성 면역 상태 (연령, 만성 폐쇄성 폐 질환 및 면역억제)를 포함한, 선험적으로 선택된 잠재적 혼동요인에 대한 조정된 모델 뿐만 아니라 비조정 모델에서 혈장 mcfDNA 수준 (예측인자, x-축에 제시됨)에 대한 혈장 바이오마커 (결과, y-축에 제시됨)의 선형 회귀 모델의 그래프 표현이다. 각각의 혈장 바이오마커에 대한 mcfDNA의 회귀 계수에 대한 효과 크기의 방향 및 상응하는 통계적 유의성은 각각 색 및 크기 코딩에 의해 가시적으로 제시되며; 회귀 결과는 표 4에 상세히 열거된다. 도 5b는 숙주-반응 하위표현형의 그래프이다. 과염증 하위표현형에 배정된 폐렴을 갖는 환자는 저염증 환자와 비교하여 유의하게 더 높은 mcfDNA를 가졌다 (각각 중앙값 7,731, 사분위간 범위-IQR, MPM, [3,100-79,849] 대 546 [0-4,609], p<0.05). 본 발명자들은 안지오포이에틴-2, 프로칼시토닌, TNFR1 및 비카르보네이트의 수준을 이용하는 엄격한 예측 모델에 기초하여 환자를 과염증 대 저염증 하위표현형으로 배정하였다.
결과는 중증 폐렴을 갖는 환자에서의 순환 mcfDNA와 전신 염증 사이의 신규 연관성을 밝혀냈으며, 이는 전신 순환에서의 생물학적 미생물-숙주 상호작용을 시사한다. 순환 mcfDNA는 강화된 염증성 숙주-반응과 연관되었으며, 이는 중증 폐렴에서의 악화된 임상 결과와 재현가능하게 연관되었다. 문헌 [Kitsios 2019]. 과염증 하위표현형에 배정된 환자에서의 보다 높은 mcfDNA 로드의 발견은 또한 미생물총 및 환자-수준 결과와 연관되었다.
호흡기 병원체의 McfDNA는 각각 배양-양성 및 -음성 환자의 82% 및 38%에서 검출되었다. 표 2. 이들 중, 1종 이상의 이전에 확인된 폐렴 병원체가 폐렴을 갖는 위중한 환자의 12/18명 (67%)에서 발견되었다.
주목할 만하게, mcfDNA와 프랙탈카인, 프로칼시토닌, 펜트락신-3 및 ST-2 사이의 유의한 연관성은 폐 손상의 정도에 대한 본 발명자들의 방사선촬영 (RSI) 및 바이오마커 (RAGE) 측정치와 독립적이었다. 미생물 DNA는 선천성 면역 세포에서 패턴 인식 수용체 (PRR)를 자극하여 하류 염증성 신호전달을 활성화시킬 수 있는 확립된 병원체-연관 분자 패턴 (PAMP)이다. 예를 들어, 문헌 [Mogensen, 2009, Clin Microbiol Rev, 22:240-73]을 참조한다.
본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 예시적 목적을 위한 것이고, 그에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 제안될 것이며, 본 출원의 취지 및 범위 및 첨부된 청구범위의 범주 내에 포함되어야 하는 것으로 이해된다. 본원에 인용된 모든 공개물, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
표 1. 기준선 특징, 숙주 반응 바이오마커 및 임상 진단에 의한 결과.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
$ = SOFA 점수 계산은 신경계 성분을 포함하지 않았는데, 모든 환자가 삽관되고 진정제 의약을 받았기 때문이며, 이는 일관되고 재현가능한 방식으로 글래스고 혼수 척도의 평가를 수행하는 본 발명자들의 능력을 손상시켰다.
약어: COPD, 만성 폐쇄성 폐 질환; BMI, 체질량 지수; VFD, 인공호흡기 부재 일수; CPIS, 임상 폐 감염 점수; RAGE, 진행성 당화 최종 산물에 대한 수용체; RSI, 방사선학적 중증도 지수; SOFA, 순차적 기관 부전 평가; IL, 인터류킨; ST-2, 종양발생성 억제-2; TNFR-1, 종양 괴사 인자 수용체-1; mcfDNA, 미생물 세포-유리 DNA; MPM, 혈장 마이크로리터당 미생물 세포-유리 DNA.
표 2: mcfDNA 서열분석에 의해 확인된 미생물
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
표 3: 호흡기 및 혈액 배양 결과와 혈장 mcfDNA 서열분석 사이의 비교.
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
약어: N/A, 시간 기간으로부터 어떠한 상응하는 샘플도 획득하지 않았음; *, 박테리아혈증을 갖는 사례; Cx, 배양; MPM, 마이크로리터당 mcfDNA 분자; MRSA, 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스; MSSA, 메티실린 감수성 에스. 아우레우스; neg, 음성; NRF, 정상 호흡기 균총; pos, 양성.
표 4: mcfDNA 및 염증 바이오마커에 대한 선형 회귀 결과.
Figure pct00018
약어: Ang-2, 안지오포이에틴-2; IL, 인터류킨; RAGE, 진행성 당화 최종 산물에 대한 수용체; ST-2, 종양발생성 억제-2; TNFR-1, 종양 괴사 인자 수용체 1.
표 5: 입원 동안 및 혈장 샘플링 전에 투여된 항생제에 대한 가중치 점수 및 항미생물 스펙트럼 분류. 항생제 노출을 투여 지속기간, 투여 시기 및 특정 항생제 유형을 고려한 공개된 점수 (Han, 2006, J Clin Microbiol, 44:160-65)로 모델링하였다.
Figure pct00019
본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 제시되고 기재되었지만, 이러한 실시양태는 단지 예로서 제공된다. 수많은 변형, 변화 및 치환이 본 발명의 범주 내에서 가능하다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 하기 청구범위는 본 발명의 범주를 정의하고, 이들 청구범위의 범주 내 방법 및 구조 및 그의 등가물이 그에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.

Claims (94)

1차 감염을 갖는 대상체에서 2차 감염을 검출하는 방법으로서,
(a) 1차 감염을 갖는 대상체로부터 수득된 혈액으로부터 혈장 샘플을 제조하며, 여기서 혈장 샘플은 적어도 2종의 상이한 미생물로부터의 미생물 세포-유리 핵산 (mcfNA)을 포함하는 것인 단계;
(b) 어댑터에 부착된 mcfNA를 포함하는 서열분석 라이브러리를 생성하는 단계;
(c) 어댑터에 부착된 mcfNA를 포함하는 서열분석 라이브러리에 대해 차세대 서열분석을 수행함으로써 혈장 샘플 내 총 mcfNA의 양을 측정하며, 여기서 총 mcfNA는 적어도 2종의 상이한 미생물로부터의 mcfNA를 포함하는 것인 단계;
(d) 적어도 2종의 상이한 미생물로부터의 mcfNA를 포함하는 총 mcfNA의 양을 총 mcfNA의 한계치 양과 비교하는 단계; 및
(e) 적어도 2종의 상이한 미생물로부터의 mcfNA를 포함하는 총 mcfNA의 양이 총 mcfNA의 한계치 양을 초과하는 경우에 1차 감염과 상이한 2차 감염을 검출하는 단계
를 포함하는 방법.
1차 감염을 갖는 대상체에서 2차 감염을 치료하는 방법으로서,
(a) 1차 감염을 갖는 대상체로부터 혈액 샘플을 수집하는 단계;
(b) 혈액 샘플 내 적어도 2종의 미생물로부터의 미생물 세포-유리 핵산 (mcfNA)을 포함하는 총 mcfNA의 양이 총 mcfNA의 한계치 양을 초과하는 경우에 2차 감염을 검출하며, 여기서 총 mcfNA의 양은 차세대 서열분석에 의해 계산되는 것인 단계; 및
(c) 1차 감염을 갖는 대상체에게 치료 약물을 투여하여 2차 감염을 치료하는 단계
를 포함하는 방법.
제2항에 있어서,
(d) 혈액 내 총 mcfNA의 양이 총 mcfNA의 한계치 양 이하의 값으로 감소할 때까지 (a), (b) 및 (c)를 반복하는 단계
를 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 1차 감염이 COVID-19 감염인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 1차 감염이 바이러스 폐 감염인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 1차 감염이 COVID-19 폐렴인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 2차 감염이 박테리아 또는 진균 감염인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 적어도 1종의 박테리아, 진균 또는 기생충의 존재를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 1차 및 2차 감염이 상이한 미생물에 의해 유발된 호흡기 감염인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 1차 및 2차 감염이 상이한 미생물에 의해 유발된 폐렴인 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2종의 미생물이 적어도 2종의 호흡기 병원체를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2종의 미생물이 에스. 아우레우스(S. aureus), 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 및 케이. 뉴모니아에(K. Pneumoniae)로 이루어진 군으로부터의 적어도 2종의 미생물인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 1차 감염이 배양-양성 폐렴인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 1차 감염이 배양-음성 폐렴인 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2종의 미생물이 칸디다(Candida)를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 총 mcfNA의 양이 샘플 내 각각의 유형의 mcfNA의 합한 양인 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 총 mcfNA의 양이 샘플 내 총 박테리아 mcfNA의 합한 양인 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 총 mcfNA의 양이 샘플 내 호흡기 병원체로부터의 총 mcfNA의 합한 양인 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 총 mcfNA의 한계치 양이 건강한 또는 비감염 대상체의 혈장에서 측정된 mcfNA의 양인 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 총 mcfNA의 양이 메타게놈 차세대 서열분석에 의해 측정되는 것인 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, mcfNA가 mcfDNA인 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 혈장 또는 혈액 샘플에 알려진 농도의 합성 정규화 대조군이 스파이킹되는 것인 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, mcfNA가 대상체의 혈장으로부터 추출되는 것인 방법.
제23항에 있어서, DNA 서열분석 라이브러리가 추출된 mcfNA로부터 구축되고, 서열 판독물이 서열분석 라이브러리로부터 생성되는 것인 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 내 mcfNA의 양을 측정하는 단계가
(a) 서열 판독물을 미생물 데이터베이스와 정렬하며, 여기서 미생물 라이브러리는 10,000개 초과의 게놈 참조 서열을 포함하는 것인 단계;
(b) 높은 퍼센트 동일성 및 높은 쿼리 커버리지를 갖는 정렬을 포함하는 신뢰가능한 판독물을 보유하는 단계;
(c) 신뢰가능한 판독물의 수 및 그의 정렬에 기초하여 각각의 분류군에 상대 존재비를 배정하는 단계;
(d) 분류군 존재비의 각각의 추정치에 대한 통계적 유의성 값을 컴퓨터 계산하는 단계; 및
(e) 분류군 존재비를 사용하여 mcfNA 농도를 결정하는 단계; 및/또는
(f) 스파이킹된 합성 정규화 대조군의 존재비를 사용하여 샘플 내 mcfNA의 마이크로리터당 분자 (MPM) 값을 계산하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 혈장 샘플 내 선천성 면역 또는 상피 또는 내피 손상의 바이오마커의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제26항에 있어서, 바이오마커가 IL-6, IL-8, IL-10, RAGE, TNFR1, 안지오포이에틴-2, 프로칼시토닌, 프랙탈카인, 펜트락신-3 및 ST2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제27항에 있어서, 바이오마커가 IL-8 또는 ST2를 포함하는 것인 방법.
제27항에 있어서, 바이오마커가 프로칼시토닌 또는 펜트락신-3을 포함하는 것인 방법.
제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 알고리즘을 사용하여 환자에서의 mcfNA의 양을 바이오마커 수준과 비교함으로써 시험 점수를 산출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제30항에 있어서, 시험 점수에 기초하여 환자에게 치료 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 치료 약물은 임의로 항미생물 약물, 항생 약물 또는 항진균 약물인 방법.
제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 양이 혈장 마이크로리터당 분자 (MPM)로 측정되는 것인 방법.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 총 mcfNA의 한계치 양이 샘플 내 mcfNA의 모든 유형에 대해 400개 초과의 MPM인 방법.
제33항에 있어서, 총 mcfNA가 적어도 100종의 상이한 미생물로부터의 서열을 포함하는 게놈 데이터베이스에 대해 서열 판독물을 정렬함으로써 결정되는 경우에 총 mcfNA의 한계치 양이 샘플 내 총 mcfNA에 대해 600개 초과의 MPM인 방법.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 총 mcfNA의 한계치 양이 샘플 내 호흡기 병원체로부터의 mcfNA에 대해 4000개 초과의 MPM인 방법.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 총 mcfNA가 적어도 100종의 상이한 미생물로부터의 서열을 포함하는 게놈 데이터베이스에 대해 서열 판독물을 정렬함으로써 결정되는 경우에 총 mcfNA의 한계치 양이 4000개 초과의 MPM인 방법.
제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, (a)에서의 대상체가 실험적 항생제를 받은 것인 방법.
환자에서 염증 반응을 검출하는 방법으로서,
(a) 환자로부터 수득된 혈액으로부터 혈장 샘플을 제조하며, 여기서 혈장 샘플은 미생물 세포-유리 핵산 (mcfNA)을 포함하는 것인 단계;
(b) 어댑터에 부착된 mcfNA를 포함하는 서열분석 라이브러리를 생성하는 단계;
(c) 혈장 샘플 내 총 mcfNA의 양을 측정하며, 여기서 총 mcfNA는 적어도 2종의 상이한 미생물로부터의 mcfNA를 포함하는 것인 단계;
(d) 총 mcfNA의 양을 mcfNA의 한계치 양과 비교하는 단계; 및
(e) 총 mcfNA의 양이 총 mcfNA의 한계치 양을 초과하는 경우에 염증 반응을 검출하는 단계
를 포함하는 방법.
환자에서 염증 반응을 치료하는 방법으로서,
(a) 환자로부터 혈액 샘플을 수집하는 단계;
(b) 혈액 샘플 내 총 mcfNA의 양이 적어도 2종의 상이한 미생물로부터의 mcfNA를 포함하고 총 mcfNA의 한계치 양을 초과하는 경우에 환자에서 염증 반응을 검출하는 단계; 및
(c) 환자에게 항염증 약물을 투여하여 염증 반응을 치료하는 단계
를 포함하는 방법.
제38항 또는 제39항에 있어서, 대상체가 폐렴을 갖는 것인 방법.
제40항에 있어서, 폐렴이 배양-양성 폐렴인 방법.
제40항에 있어서, 폐렴이 배양-음성 폐렴인 방법.
제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, mcfNA가 mcfDNA인 방법.
제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, mcfNA의 한계치 양이 혈장 마이크로리터당 100,000개 초과의 분자 (MPM)인 방법.
제38항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, mcfNA의 한계치 양이 알려진 호흡기 병원체로부터의 mcfNA에 대해 혈장 마이크로리터당 100,000개 초과의 분자 (MPM)인 방법.
제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 환자의 혈장 샘플 내 선천성 면역 또는 상피 또는 내피 손상의 바이오마커의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제46항에 있어서, 바이오마커가 IL-6, IL-8, IL-10, RAGE, TNFR1, 안지오포이에틴-2, 프로칼시토닌, 프랙탈카인, 펜트락신-3 및 ST2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제46항에 있어서, 바이오마커가 IL-8 또는 ST2인 방법.
제46항에 있어서, 바이오마커가 프로칼시토닌 또는 펜트락신-3인 방법.
제38항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 알고리즘을 사용하여 대상체에서의 mcfNA의 양을 바이오마커 수준과 비교함으로써 시험 점수를 산출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제50항에 있어서, 시험 점수에 기초하여 대상체에게 치료 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
COVID-19 감염을 갖는 환자에서 박테리아 감염을 검출하는 방법으로서,
(a) COVID-19 감염을 갖는 환자로부터 수득된 혈액으로부터 혈장 샘플을 제조하며, 여기서 혈장 샘플은 미생물 세포-유리 핵산 (mcfNA)을 포함하는 것인 단계;
(b) 어댑터에 부착된 mcfNA를 포함하는 서열분석 라이브러리를 생성하는 단계;
(c) 서열분석 라이브러리에 대해 차세대 서열분석을 수행하여 mcfNA에 상응하는 서열 판독물을 생성하는 단계;
(d) 서열 판독물을 적어도 1000개의 박테리아 참조 서열을 포함하는 데이터베이스로부터의 서열에 대해 정렬하는 단계;
(e) 서열 판독물의 정렬에 기초하여 적어도 1종의 박테리아로부터의 mcfNA의 양을 결정하는 단계; 및
(f) 적어도 1종의 박테리아로부터의 mcNA의 양에 기초하여 환자에서 박테리아 감염을 확인하는 단계
를 포함하는 방법.
COVID-19 감염을 갖는 환자에서 박테리아 감염을 진단 및 치료하는 방법으로서,
(a) COVID-19 감염을 갖는 환자로부터 혈액 샘플을 수집하는 단계;
(b) 혈액 샘플 내 박테리아 mcfNA의 양이 mcfNA의 한계치 양을 초과하는 경우에 박테리아 감염을 검출하는 단계; 및
(c) 환자에게 치료 약물을 투여하여 박테리아 감염을 치료하는 단계
를 포함하는 방법.
제52항 또는 제53항에 있어서, 환자가 COVID-19 폐렴을 갖는 것인 방법.
제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 감염이 호흡기 감염인 방법.
제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, mcfNA가 에스. 아우레우스, 피. 아에루기노사 또는 케이. 뉴모니아에로부터의 박테리아 mcfNA인 방법.
제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 배양-양성 폐렴을 갖는 것인 방법.
제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 배양-음성 폐렴을 갖는 것인 방법.
제52항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, mcfNA의 한계치 양이 건강한 또는 비감염 대상체의 혈장에서 측정된 mcfNA의 양인 방법.
제52항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, mcfNA의 양이 메타게놈 차세대 서열분석에 의해 측정되는 것인 방법.
제52항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, mcfNA가 mcfDNA인 방법.
제52항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 혈장에 알려진 농도의 합성 정규화 대조군이 스파이킹되는 것인 방법.
1차 감염을 갖는 대상체에서 2차 감염을 검출하기 위한 핵산 서열분석 시스템으로서,
(a) 플로우 셀 및 플로우 셀에서 수행된 측정으로부터 수집된 서열 판독물을 포함하는 데이터를 출력하는 컴퓨터 프로세서를 포함하는 차세대 서열분석 장치; 및
(b) (i) 서열 판독물을 미생물 참조 서열 판독물에 대해 정렬함으로써 적어도 2종의 상이한 미생물로부터의 미생물 세포-유리 핵산 (mcfNA)을 검출하고;
(ii) 혈장 마이크로리터당 분자의 함수로서 총 mcfNA를 계산하고, 여기서 총 mcfNA는 적어도 2종의 상이한 미생물로부터의 mcfNA의 합한 값이고;
(iii) 총 mcfNA가 한계치 값을 초과하는 경우에 2차 감염을 나타내는 사건을 생성하는 사건 생성기를 포함하는
총 mcfNA의 정량화 논리를 포함하는 컴퓨터 계산 장치
를 포함하는 핵산 서열분석 시스템.
제63항에 있어서, 총 미생물 세포-유리 핵산 (mcfNA)의 정량화 논리가, 서열 판독물이 인간 참조 서열에 대해 정렬되는 경우에 이들 서열 판독물을 분석으로부터 배제하는 논리를 포함하는 것인 핵산 서열분석 시스템.
제63항 또는 제64항에 있어서, 총 미생물 세포-유리 핵산 (mcfNA)의 정량화 논리가, 서열 판독물이 합성 핵산 참조물에 대해 정렬되는 경우에 이들 서열 판독물을 분석으로부터 배제하는 논리를 포함하는 것인 핵산 서열분석 시스템.
제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, mcfNA가 미생물 세포-유리 DNA인 핵산 서열분석 시스템.
제63항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 한계치 값이 적어도 600개 MPM인 핵산 서열분석 시스템.
제63항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 한계치 값이 적어도 4000개 MPM인 핵산 서열분석 시스템.
대상체에서 국부 호흡기 감염을 검출하는 방법으로서,
(a) 대상체로부터 혈장 샘플을 수득 또는 제공하며, 여기서 대상체는 박테리아혈증이 아니고, 혈장 샘플은 세포-유리 핵산을 포함하는 것인 단계;
(b) 혈장 샘플로부터의 세포-유리 핵산에 대해 차세대 서열분석 또는 메타게놈 서열분석을 수행하고, 서열 판독물을 생성하는 단계; 및
(c) 서열 판독물을 호흡기 병원체의 서열과 정렬하여 적어도 1종의 호흡기 병원체의 존재 및 양을 검출하며, 여기서 적어도 1종의 호흡기 병원체는 국부 호흡기 감염과 연관된 것인 단계
를 포함하는 방법.
제69항에 있어서, 세포-유리 핵산이 세포-유리 DNA인 방법.
제69항 또는 제70항에 있어서, 호흡기 병원체의 서열과 정렬된 서열 판독물이 미생물 세포-유리 DNA에 상응하는 것인 방법.
제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 호흡기 감염이 폐렴인 방법.
제72항에 있어서, 호흡기 감염이 박테리아성 폐렴인 방법.
제69항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 호흡기 병원체가 호흡기 감염과 연관된 적어도 1종의 박테리아인 방법.
제74항에 있어서, 호흡기 감염이 박테리아성 호흡기 감염인 방법.
제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 호흡기 병원체가 에스. 아우레우스, 피. 아에루기노사 또는 케이. 뉴모니아에인 방법.
제69항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 핵산을 혈장 샘플에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제77항에 있어서, 합성 핵산에 대해 차세대 서열분석을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제69항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 어댑터를 세포-유리 핵산에 부착하여 어댑터에 부착된 세포-유리 핵산을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제79항에 있어서, 어댑터가 세포-유리 핵산에 라이게이션되는 것인 방법.
제79항에 있어서, 어댑터가 프라이머 연장 반응에 의해 세포-유리 핵산에 부착되는 것인 방법.
제79항에 있어서, 어댑터가 대상체에 고유한 서열을 포함하는 것인 방법.
제82항에 있어서, 어댑터에 부착된 세포-유리 핵산을 상이한 대상체로부터 수득된 세포-유리 핵산과 조합하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제83항에 있어서, 상이한 대상체로부터 수득된 세포-유리 핵산이 상이한 대상체에 고유한 서열을 포함하는 어댑터에 부착되는 것인 방법.
폐렴을 나타내는 대상체에서 2차 감염을 검출하는 방법으로서, (a) 상기 대상체로부터 혈장 샘플을 수득하는 단계; (b) 상기 샘플 내 미생물 세포-유리 핵산의 양을 평가하는 단계; (c) 미생물 세포-유리 핵산의 상기 양을 한계치 수준과 비교하는 단계; 및 (d) 미생물 세포-유리 핵산의 상기 양이 상기 한계치 수준을 초과하는 경우에 2차 감염을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
제85항에 있어서, 상기 대상체가 COVID-19를 갖는 것인 방법.
제85항에 있어서, 상기 2차 감염이 박테리아 또는 진균 감염인 방법.
제85항에 있어서, 상기 대상체에서 적어도 1종의 박테리아, 진균 또는 기생충의 존재 및 양을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
바이러스 감염을 갖는 대상체에서 국부 부위에서의 2차 감염을 확인하는 방법으로서, (a) 상기 대상체로부터 혈장 샘플을 수득하는 단계; (b) 상기 샘플 내 미생물 세포-유리 핵산의 양을 평가하는 단계; (c) 미생물 세포-유리 핵산의 상기 양을 한계치 수준과 비교하는 단계; 및 (d) 미생물 세포-유리 핵산의 상기 양이 상기 한계치 수준을 초과하는 경우에 상기 대상체에서 국부 부위에서의 감염을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
제89항에 있어서, 상기 국부 부위가 폐인 방법.
폐렴을 나타내는 대상체에서 호흡기 감염을 검출하는 비-침습적 방법으로서, (a) 상기 대상체로부터 혈장 샘플을 수득하는 단계; (b) 상기 샘플 내 미생물 세포-유리 핵산의 양을 평가하는 단계; (c) 미생물 세포-유리 핵산의 상기 양을 한계치 수준과 비교하는 단계; 및 (d) 미생물 세포-유리 핵산의 상기 양이 상기 한계치 수준을 초과하는 경우에 호흡기 감염을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
제91항에 있어서, 상기 대상체가 Covid-19를 갖고, 폐렴의 위험이 있는 것인 방법.
2차 감염을 갖는 것으로 의심되는 환자를 치료하는 방법으로서,
환자로부터의 샘플에서 미생물 세포-유리 핵산 수준 값 (양)을 결정하는 단계 및 환자로부터의 샘플에서 선천성 면역의 바이오마커 (예를 들어, IL-8 및 ST2) 및/또는 박테리아 감염의 바이오마커 (예를 들어, 프로칼시토닌 및 펜트락신-3)를 포함하는 바이오마커 유전자의 세트인 바이오마커의 세트의 수준을 결정하는 단계; 및 단계 (1)에서 결정된 발현 수준 값을 단계 (2)의 바이오마커 수준과 비교하여 시험 점수를 산출하는 단계
에 의해 환자가 항미생물 요법으로부터 이익을 얻을 것인지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
제93항에 있어서, 시험 점수에 기초하여 환자에게 항미생물 요법을 포함하는 치료 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
KR1020237024847A 2020-12-21 2021-12-20 염증, 2차 감염 및 질환 중증도를 검출하기 위한 미생물 세포-유리 핵산의 서열분석 KR20240045159A (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063128552P 2020-12-21 2020-12-21
US63/128,552 2020-12-21
US202163199497P 2021-01-03 2021-01-03
US63/199,497 2021-01-03
US202163139245P 2021-01-19 2021-01-19
US63/139,245 2021-01-19
PCT/US2021/064445 WO2022140302A1 (en) 2020-12-21 2021-12-20 Sequencing microbial cell-free nucleic acids to detect inflammation, secondary infection, and disease severity

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20240045159A true KR20240045159A (ko) 2024-04-05

Family

ID=82158381

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237024847A KR20240045159A (ko) 2020-12-21 2021-12-20 염증, 2차 감염 및 질환 중증도를 검출하기 위한 미생물 세포-유리 핵산의 서열분석

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20240132978A1 (ko)
EP (1) EP4263866A1 (ko)
KR (1) KR20240045159A (ko)
WO (1) WO2022140302A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3610034B1 (en) 2017-04-12 2022-06-08 Karius, Inc. Sample preparation methods, systems and compositions
CN116598005B (zh) * 2023-07-17 2023-10-03 中日友好医院(中日友好临床医学研究所) 基于宿主序列信息的下呼吸道感染概率预测系统及装置

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019213624A1 (en) * 2018-05-04 2019-11-07 The Regents Of The University Of California Spiked primers for enrichment of pathogen nucleic acids among background of nucleic acids
EP3884087A4 (en) * 2018-11-21 2022-09-07 Karius Inc. DETECTION AND PREDICTION OF INFECTIOUS DISEASES

Also Published As

Publication number Publication date
US20240132978A1 (en) 2024-04-25
EP4263866A1 (en) 2023-10-25
WO2022140302A1 (en) 2022-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220325348A1 (en) Biomarker signature method, and apparatus and kits therefor
US20240132978A1 (en) Sequencing microbial cell-free nucleic acids to detect inflammation, secondary infection, and disease severity
EP3356558B1 (en) Sirs pathogen biomarkers and uses therefor
JP2017506510A (ja) 敗血症の発症を予測するための装置、キット及び方法
ES2781703T3 (es) Predictores moleculares de sepsis
WO2016050111A1 (en) Biomarkers for rheumatoid arthritis and usage thereof
US20200081008A1 (en) Methods for cancer detection
CN112011607B (zh) 源于肠道与脑卒中诊断和治疗效果相关的菌群及其应用
US20240150851A1 (en) Rapid, non-invasive detection and serial monitoring of infections in subjects using microbial cell-free dna sequencing
US20230058214A1 (en) Identification of Unique Blood-Based Gene Expression Profiles in Children with Regressive Autism Spectrum Disorder (ASD) and Ileocolitis
CA3207956A1 (en) Metagenomic next-generation sequencing of microbial cell-free nucleic acids in subjects with lyme disease
WO2015117205A1 (en) Biomarker signature method, and apparatus and kits therefor
CN112226501B (zh) 一种重症肌无力的肠道菌群标志物及其应用
CN111996248B (zh) 检测微生物的试剂及其在重症肌无力诊断中的应用
WO2024119057A2 (en) Plasma cell-free rna signatures of tuberculosis
WO2022064162A1 (en) Apparatus, kits and methods for predicting the development of sepsis
US20140336055A1 (en) Genetic markers for macular degeneration disorder treatment
CN112011604A (zh) 一种用于评估重症肌无力风险的微生物标志物及其应用
CN115074455A (zh) 肠道菌群在急性胰腺炎诊断中的应用
CN115786487A (zh) 生物标志物nr4a2及其应用
CN112522414A (zh) 胃癌诊断用生物标志物及其衍生产品