KR20240044603A - 피로인산티아민 알부민 나노클러스터를 포함하는 항암치료용 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents
피로인산티아민 알부민 나노클러스터를 포함하는 항암치료용 조성물 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 피로인산티아민-알부민 나노클러스터(HSA-TPP NC)를 포함하는 항암치료용 조성물에 관한 것으로, 골종양 미세환경(bone tumor microenvironment, TME)에 표적화함으로써 골육종과 같은 골종양의 화학요법 시, 부작용을 줄이고 항암효율을 높여 골종양의 치료에 기여할 수 있다.
Description
본 발명은 피로인산티아민 알부민 나노클러스터를 포함하는 항암치료용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 골종양 미세환경(bone tumor microenvironment, TME)에 표적화함으로써 골육종과 같은 골종양의 화학요법 시, 부작용을 줄이고 항암효율을 높일 수 있는 항암치료용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
골육종(osteosarcoma)는 초기 골암의 주된 형태로, 약 60% 정도가 소아기나 청소년기의 젊은 연령층에서 발생하는 악성종양이다. 약 10% 정도는 20대에, 약 10%의 환자는 40~50대에 발생하나, 이 경우 이전에 시행했던 방사선 치료나, 전암성 병변으로부터 2차적으로 발생하는 경우가 많다. 골육종은 뼈 어느 곳에서든 생길 수 있으며, 주로 장골의 말단 부위에 생기는 경우가 많다. 가장 흔한 곳은 무릎 주위로, 80%에 달하며, 일반적으로 남성의 발생 빈도가 여성보다 약 1.5~2배 높다.
골육종의 발생 원인은 잘 알려지지 않았으며, 유전적 요인이 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들어 눈동자에 생기는 암인 유전성 망막모세포종이 있는 환자는 다른 사람에 비해 골육종이 더 잘 발생하며, 또한 방사능에 피폭되면 세포에 돌연변이가 일어나서 골육종이 생길 수도 있다.
골육종 치료를 위한 방법으로는 수술, 방사선치료, 면역요법, 항암화학요법 등이 있으며, 그 중 항암 화학요법으로는 단독 요법보다 다양한 항종양제를 사용한 병용 요법을 권장하고 있다. 선호되는 치료 옵션 중 하나는 메토트렉세이트(MTX), 독소루비신(DOX; 아드리아마이신) 및 시스플라틴(CDDP; 시스-디아민-디클로로-백금(II))의 조합 요법인 "MAP" 요법이다. 그러나 MAP 요법은 고용량의 시스플라틴, 독소루비신 및 메토트렉세이트를 다양한 용량과 주기로 사용하면서 건강한 세포 또한 공격받아 급성 신장 손상, 청력장애, 생식장애 등의 부작용을 유발하는 문제가 있다. 최근 연구는 보다 효과적인 전략을 추구하기 위해 주로 약물 조합을 수정하는 데 중점을 두고 있다. 그러나 어떤 항암제나 정상세포에 큰 위험부담을 주고 부작용을 발생시키는 점에서 항암제의 표적치료를 통하여 항암제 독성에 의한 부작용을 감소시키고 및 항암 효과의 증대시킬 수 있는 연구가 필요한 실정이다.
H. Ma, C. He, Y. Cheng, Z. Yang, J. Zang, J. Liu, X. Chen, ACS Appl. Mater. Interfaces 2015, 7, 27040.
B. Kim, B. Seo, S. Park, C. Lee, J. O. Kim, K. T. Oh, E. S. Lee, H. -G. Choi, Y. S. Youn, Colloids Surf. B 2017, 158, 157.
N.-W. Kang, J.-Y. Lee, D.-D Kim, J. Control. Release, 2022, 342, 111.
F. Paiva-Fonseca, A.-R. Santos-Silva, R. Della-Coletta, P.-A. Vargas, M.-A. Lopes, Med. Oral Patol. Oral Cir. Bucal, 2014, 19, e106
R. E. Marx, J. E. Cillo, J. J. Ulloa, J. Oral. Maxillofac. Surg. 2007, 65, 2397.
본 발명의 목적은 피로인산티아민-알부민 나노클러스터를 포함하는 항암치료용 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 피로인산티아민-알부민 나노클러스터를 포함하는 항암치료용 조성물을 제공한다.
상기 피로인산티아민-알부민 나노클러스터는,
DMSO에 용해된 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate, SMCC)를 pH 7.0의 포스페이트 완충액에 용해된 피로인산티아민(thiamine pyrophosphate, TPP)에 첨가하여 반응시켜 말레이미드 활성화 TPP 용액(maleimide-activated TPP solution)을 제조하는 단계 (1);
상기 (1) 단계에서 제조된 말레이미드 활성화 TPP 용액을 인간 혈청 알부민(Human serum albumin, HSA) 용액에 적가하여 HSA-TPP 접합체를 형성시키는 단계 (2);
상기 (2) 단계의 HSA-TPP 접합체를 포함하는 용액을 투석하여 비접합 TPP를 제거하는 단계 (3);를 포함하는 제조방법에 의하여 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 피로인산티아민-알부민 나노클러스터는, 골종양 미세환경(bone tumor microenvironment, TME)에 표적화함으로써 항암제를 흡착시켜 환자에 적용하는 경우 정상조직이 항암제에 노출됨으로써 유발되는 부작용을 최소화할 수 있으며, 치료 효율을 높일 수 있다. 이에 따라 상기 항암치료용 조성물의 항암치료는 유잉육종(Ewing's sarcoma), 연골육종 (Chondrosarcoma) 및 골육종(osteosarcoma)을 포함하는 뼈 암에 대한 항암치료일 수 있다.
본 발명은 약물을 흡착시킨 피로인산티아민-알부민 나노클러스터를 포함하는 항암치료용 조성물을 제공한다. 이때 상기 약물은 뼈의 질환 치료에 적용될 수 있는 약물, 특히 알부민을 이용한 나노클러스터로 자가조립이 가능한 소수성 약물이면 모두 가능하다. 예컨대, 파클리탁셀 (paclitaxel), 독소루비신(doxorubicin), 메소트렉세이트(methotrexate), 시스플라틴(cis-platin), 이포스파마이드(Isoffamide), 도데탁셀(docetaxel), 타목시펜(tamoxifen), 캄토세신(camtothecin), 아나스테로졸(anasterozole), 카보플라틴(carboplatin), 토포테칸(topotecan), 베로테칸(belotecan), 이리노테칸(irinotecan), 글리벡(gleevec) 및 빈크리스틴(vincristine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 항암제일 수 있다. 바람직하게는 상기 항암제는 독소루비신(Doxorubicin, DOX) 또는 메토트렉세이트(Methotrexate, MTX)이다.
이외 소수성 약물로 살리실레이트(salicylates), 이부프로펜(ibuprofen), 나프로센(naproxen), 페노프로펜(fenoprofen), 인도메타신(indomethacin), 페닐타존(phenyltazone), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 메클로에타민(mechlorethamine), 덱사메타손(dexamethasone), 프레드니솔론(prednisolone), 셀레콕시브(celecoxib), 발데콕시브(valdecoxib), 니메슐리드(nimesulide), 코르티손(cortisone) 및 코르티코스테로이드(corticosteroid)으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 약물을 포함할 수 있다.
상기 독소루비신을 흡착시킨 피로인산티아민-알부민 나노클러스터는
이중 탈이온수(DDW)에 용해된 독소루비신 염산(DOX HCl)을 클로로포름 및 트리에틸아민과 혼합하고, 클로로포름 상을 수집, 증발시켜 DOX 베이스를 제조하는 단계(a);
상기 (a) 단계에서 제조된 DOX 베이스를 DMSO에 용해시켜 DDW에 용해된 HSA-TPP와 혼합하여 혼합물을 만드는 단계 (b);
상기 (b) 단계의 혼합물에 초음파를 가하여 나노클러스터(nanocluster, NC)를 형성시키는 단계 (c);
상기 (c) 단계의 나노클러스터를 포함하는 용액으로부터 투석으로 잉여의 독소루비신을 제거하는 단계(d); 를 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
상기 독소루비신 흡착 피로인산티아민-알부민 나노클러스터(DOX/HSA-TPP NC)는 10 내지 500 nm의 직경을 가질 수 있으며, 바람직하게는 50 내지 300 nm이며, 더욱 바람직하게는 100 내지 200 nm이다.
상기 메토트렉세이트를 흡착시킨 피로인산티아민-알부민 나노클러스터는
메토트렉세이트를 DMSO에 용해시켜 DDW에 용해된 HSA-TPP와 혼합하여 혼합물을 만드는 단계 (a);
상기 (a) 단계의 혼합물에 초음파를 가하여 나노클러스터(nanocluster, NC)를 형성시키는 단계 (b);
상기 (b) 단계의 나노클러스터를 포함하는 용액으로부터 투석으로 잉여의 메토트렉세이트를 제거하는 단계(c); 를 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
상기 메토트렉세이트 흡착 피로인산티아민-알부민 나노클러스터(MTX/HSA-TPP NC)는 10 내지 100 nm의 직경을 가질 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 70 nm, 더욱 바람직하게는 10 내지 50 nm의 직경을 갖는다.
상기 독소루비신 흡착 피로인산티아민-알부민 나노클러스터(DOX/HSA-TPP NC) 및 상기 메토트렉세이트 흡착 피로인산티아민-알부민 나노클러스터(MTX/HSA-TPP NC) 모두 콜로이드 안정성을 가지며 주사제로 사용 가능하다.
본 발명은 동시에 또는 순차적으로 투여되는 독소루비신 흡착 피로인산티아민-알부민 나노클러스터(DOX/HSA-TPP NC), 메토트렉세이트 흡착 피로인산티아민-알부민 나노클러스터(MTX/HSA-TPP NC) 및 시스플라틴 용액의 조합을 포함하는 항암치료용 조성물을 제공한다. 상기 조합의 항암치료용 조성물은 종래의 MAP 요법을 통한 치료보다 종양 크기 감소 효과가 2.37배 뛰어나다.
상기 독소루비신 흡착 피로인산티아민-알부민 나노클러스터(DOX/HSA-TPP NC), 메토트렉세이트 흡착 피로인산티아민-알부민 나노클러스터(MTX/HSA-TPP NC) 및 시스플라틴 용액의 조합을 포함하는 항암치료용 조성물은 치료 상승 효과를 위하여 또다른 약물과 병용으로 사용될 수 있다.
본 발명은 DMSO에 용해된 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate, SMCC)를 pH 7.0의 포스페이트 완충액에 용해된 피로인산티아민(thiamine pyrophosphate, TPP)에 첨가하여 반응시켜 말레이미드 활성화 TPP 용액(maleimide-activated TPP solution)을 제조하는 단계 (1);
상기 (1) 단계에서 제조된 말레이미드 활성화 TPP 용액을 인간 혈청 알부민(Human serum albumin, HSA) 용액에 적가하여 HSA-TPP 접합체를 형성시키는 단계 (2);
상기 (2) 단계의 HSA-TPP 접합체를 포함하는 용액을 투석하여 비접합 TPP를 제거하는 단계 (3);를 포함하는 피로인산티아민-알부민 나노클러스터(HSA-TPP NC)의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 이중 탈이온수(DDW)에 용해된 독소루비신 염산(DOX HCl)을 클로로포름 및 트리에틸아민과 혼합하고, 클로로포름 상을 수집, 증발시켜 DOX 베이스를 제조하는 단계(a);
상기 (a) 단계에서 제조된 DOX 베이스를 DMSO에 용해시켜 DDW에 용해된 HSA-TPP와 혼합하여 혼합물을 만드는 단계 (b);
상기 (b) 단계의 혼합물에 초음파를 가하여 나노클러스터(nanocluster, NC)를 형성시키는 단계 (c);
상기 (c) 단계의 나노클러스터를 포함하는 용액으로부터 투석으로 잉여의 독소루비신을 제거하는 단계(d); 를 포함하는 독소루비신 흡착 피로인산티아민-알부민 나노클러스터(DOX/HSA-TPP NC)의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 메토트렉세이트를 DMSO에 용해시켜 DDW에 용해된 HSA-TPP와 혼합하여 혼합물을 만드는 단계 (a);
상기 (a) 단계의 혼합물에 초음파를 가하여 나노클러스터(nanocluster, NC)를 형성시키는 단계 (b);
상기 (b) 단계의 나노클러스터를 포함하는 용액으로부터 투석으로 잉여의 메토트렉세이트를 제거하는 단계(c); 를 포함하는 메토트렉세이트 흡착 피로인산티아민-알부민 나노클러스터(MTX/HSA-TPP NC)의 제조방법을 제공한다.
상기 피로인산티아민-알부민 나노클러스터(HSA-TPP NC) 또는 약물이 흡착된 피로인산티아민-알부민 나노클러스터(HSA-TPP NC)를 포함하는 항암치료용 조성물은 피로인산티아민-알부민 나노클러스터(HSA-TPP NC)가 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001~99중량%, 더 바람직하게는 0.001~50중량%, 가장 바람직하게는 0.001~30중량%로 하여 첨가될 수 있다.
상기 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 액제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 바람직하게는 주사제이다. 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 감미제, 산미제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)-61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여 경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 500㎎/㎏/일의 범위이다. 바람직한 투여량은 0.1㎎/㎏/일 내지 200㎎/㎏/일이며, 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 200㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사 및 피부 도포에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 피로인산티아민-알부민 나노클러스터(HSA-TPP NC)를 포함하는 항암치료용 조성물에 관한 것으로, 골종양 미세환경(bone tumor microenvironment, TME)에 표적화함으로써 골육종과 같은 골종양의 화학요법 시, 부작용을 줄이고 항암효율을 높여 골종양의 이환율 및 사망률의 개선에 중요한 역할을 할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 골육종에 대한 HSA-TPP NC 기반 MAP 요법의 개략도이다.
도 2는 약물 흡착 HSA-TPP NC의 생성을 보여주는 결과이다. 네이티브 HSA 및 HSA-TPP의 (A) SDS-PAGE (B) MALDI-TOF 분석 (C) 31P-NMR 스펙트럼
도 3은 유리 약물 및 약물 흡착의 수성 현탁액의 시각적 외관을 보여주는 사진이다. (약물 농도 : 50 μg mL-1)
도 4는 본 발명에 따른 약물 흡착 HSA-TPP NCs의 강도 가중 및 숫자 가중(삽입) 크기 분포 다이어그램이다. (각 피크의 NMD값 표시)
도 5는 본 발명에 따른 약물 흡착 HSA-TPP NCs의 TEM 사진이다. (NC는 음성으로 염색됨, 스케일 바: DOX 흡착 NC의 경우 200 nm, MTX 흡착 NC의 경우 100 nm)
도 6은 본 발명에 따른 약물 흡착 HSA-TPP NCs의 콜로이드 안정성(A) 및 약물 방출 특성(B)을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 약물 흡착 HSA-TPP NCs의 뼈 TME 및 시험관내 항종양 효능에 대한 친화도를 나타낸 결과이다. (A) HAp 존재하에서 배양된 HOS/MNNG 세포의 유세포 분석(ARS는 칼슘염색을 위한 염료로 사용됨) (B) HAp 비드의 존재/부존재 배양 후 HOS/MNNG 세포의 FSC 및 SSC 비교 (C) SSC-낮음(G1) 및 SSC-높음(G2) 하위 집합의 평균 ARS 형광 강도 (D) ARS 형광 강도와 SSC-H 값 사이의 피어슨 상관 계수 (*p < 0.01, **p < 0.001, ***p < 0.0001)
도 8은 본 발명에 따른 약물 흡착 HSA-TPP NCs의 스캐폴드 배양 골육종 모델에서 뼈 TME 및 시험관내 항종양 효능에 대한 친화도를 나타낸 결과이다. (A) 각 NC와 12시간 배양 후 스캐폴드 배양 골육종 모델의 Z 스택 공초점 현미경 이미지. (빨간색: DOX, 파란색: MTX의 형광) (B) (A)에 대응하는 최대 강도 투사 이미지 (C) 유리 약물 또는 약물 흡착 NC와 배양 후 HAp 비드의 유세포 분석 분석 결과 (D) 관찰된 약물 효과 수준에서 CI 값을 기반으로 HOS/MNNG 세포에 대한 단일 요법 및 MAP의 시험관내 항종양 효능 (E) (D)의 계산된 CI 값 (*p < 0.01, **p < 0.001, ***p < 0.0001)
도 9는 본 발명에 따른 약물 흡착 HSA-TPP NCs의 동소성 골육종 마우스 모델 적용 후, NIRF 이미징에 의한 생체 내 생체 분포를 보여주는 결과이다. (A) 동소성 골육종 마우스 모델 구축 계획. (B) Cy5.5 표지된 NC의 정맥 주사 후 시간 경과 전신 스캐닝 이미지. (점선 원은 종양 영역). (C) 주사 후 경과 시간의 기능에서 종양 영역의 평균 RE. (D) 주사 후 24시간에 주요 기관 및 다리의 생체외 NIRF 이미지 (E) (D)의 해당 평균 RE 값. (*p < 0.05; ns: 유의하지 않음)
도 10은 본 발명에 따른 약물 흡착 HSA-TPP NCs의 동소성 골육종 마우스 모델에서의 생체 내 항종양 효능을 보여주는 결과이다. (A) 동소성 골육종 마우스 모델 수립 및 MAP 치료 일정. (B) 17일 동안의 종양 성장 프로파일 (C) 마우스의 체중 프로파일 (D) 17일째에 각 그룹의 대표적인 마우스 외관 (E) 17일째에 절제된 각 그룹의 대표적인 종양이 있는 다리 외관 (F) 각 그룹의 종양 질량 (종양이 있는 다리의 무게 - 정상 다리의 무게) (G) 다리 종양 부위 조직의 현미경 사진 (T: 종양; B: 뼈; 및 M: 근육. 눈금 막대 : 100 μm)
도 11은 본 발명에 따른 약물 흡착 HSA-TPP NCs를 이용한 MAP 요법 치료 3주기 후 종양에서 항-세포자멸사 단백질의 무처리군에 대한 상대적 발현을 나타낸 프로파일이다.
도 12는 3주기의 본 발명에 따른 HSA-TPP NCs를 이용한 MAP 요법 후 표적 이외 장기 심장, 폐, 간, 신장 및 비장의 독성 평가 결과이다. (H&E 염색 후 주요 장기에 대한 조직학적 분석, 눈금 막대 : 100 μm)
도 2는 약물 흡착 HSA-TPP NC의 생성을 보여주는 결과이다. 네이티브 HSA 및 HSA-TPP의 (A) SDS-PAGE (B) MALDI-TOF 분석 (C) 31P-NMR 스펙트럼
도 3은 유리 약물 및 약물 흡착의 수성 현탁액의 시각적 외관을 보여주는 사진이다. (약물 농도 : 50 μg mL-1)
도 4는 본 발명에 따른 약물 흡착 HSA-TPP NCs의 강도 가중 및 숫자 가중(삽입) 크기 분포 다이어그램이다. (각 피크의 NMD값 표시)
도 5는 본 발명에 따른 약물 흡착 HSA-TPP NCs의 TEM 사진이다. (NC는 음성으로 염색됨, 스케일 바: DOX 흡착 NC의 경우 200 nm, MTX 흡착 NC의 경우 100 nm)
도 6은 본 발명에 따른 약물 흡착 HSA-TPP NCs의 콜로이드 안정성(A) 및 약물 방출 특성(B)을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 약물 흡착 HSA-TPP NCs의 뼈 TME 및 시험관내 항종양 효능에 대한 친화도를 나타낸 결과이다. (A) HAp 존재하에서 배양된 HOS/MNNG 세포의 유세포 분석(ARS는 칼슘염색을 위한 염료로 사용됨) (B) HAp 비드의 존재/부존재 배양 후 HOS/MNNG 세포의 FSC 및 SSC 비교 (C) SSC-낮음(G1) 및 SSC-높음(G2) 하위 집합의 평균 ARS 형광 강도 (D) ARS 형광 강도와 SSC-H 값 사이의 피어슨 상관 계수 (*p < 0.01, **p < 0.001, ***p < 0.0001)
도 8은 본 발명에 따른 약물 흡착 HSA-TPP NCs의 스캐폴드 배양 골육종 모델에서 뼈 TME 및 시험관내 항종양 효능에 대한 친화도를 나타낸 결과이다. (A) 각 NC와 12시간 배양 후 스캐폴드 배양 골육종 모델의 Z 스택 공초점 현미경 이미지. (빨간색: DOX, 파란색: MTX의 형광) (B) (A)에 대응하는 최대 강도 투사 이미지 (C) 유리 약물 또는 약물 흡착 NC와 배양 후 HAp 비드의 유세포 분석 분석 결과 (D) 관찰된 약물 효과 수준에서 CI 값을 기반으로 HOS/MNNG 세포에 대한 단일 요법 및 MAP의 시험관내 항종양 효능 (E) (D)의 계산된 CI 값 (*p < 0.01, **p < 0.001, ***p < 0.0001)
도 9는 본 발명에 따른 약물 흡착 HSA-TPP NCs의 동소성 골육종 마우스 모델 적용 후, NIRF 이미징에 의한 생체 내 생체 분포를 보여주는 결과이다. (A) 동소성 골육종 마우스 모델 구축 계획. (B) Cy5.5 표지된 NC의 정맥 주사 후 시간 경과 전신 스캐닝 이미지. (점선 원은 종양 영역). (C) 주사 후 경과 시간의 기능에서 종양 영역의 평균 RE. (D) 주사 후 24시간에 주요 기관 및 다리의 생체외 NIRF 이미지 (E) (D)의 해당 평균 RE 값. (*p < 0.05; ns: 유의하지 않음)
도 10은 본 발명에 따른 약물 흡착 HSA-TPP NCs의 동소성 골육종 마우스 모델에서의 생체 내 항종양 효능을 보여주는 결과이다. (A) 동소성 골육종 마우스 모델 수립 및 MAP 치료 일정. (B) 17일 동안의 종양 성장 프로파일 (C) 마우스의 체중 프로파일 (D) 17일째에 각 그룹의 대표적인 마우스 외관 (E) 17일째에 절제된 각 그룹의 대표적인 종양이 있는 다리 외관 (F) 각 그룹의 종양 질량 (종양이 있는 다리의 무게 - 정상 다리의 무게) (G) 다리 종양 부위 조직의 현미경 사진 (T: 종양; B: 뼈; 및 M: 근육. 눈금 막대 : 100 μm)
도 11은 본 발명에 따른 약물 흡착 HSA-TPP NCs를 이용한 MAP 요법 치료 3주기 후 종양에서 항-세포자멸사 단백질의 무처리군에 대한 상대적 발현을 나타낸 프로파일이다.
도 12는 3주기의 본 발명에 따른 HSA-TPP NCs를 이용한 MAP 요법 후 표적 이외 장기 심장, 폐, 간, 신장 및 비장의 독성 평가 결과이다. (H&E 염색 후 주요 장기에 대한 조직학적 분석, 눈금 막대 : 100 μm)
고용량의 시스플라틴, 독소루비신 및 메토트렉세이트를 사용하는 MAP 요법은 대상 골육종 환자 60%에서 상당한 치료 효과를 나타내는 것으로 알려져 있으나, 항암제 독성에 의한 신장 손상 등의 부작용이 유발되는 문제가 있었다. 이에 따라 이들 항암제에 나노 약물 전달 시스템(NDDS)을 적용하는 시도는 골육종 치료에 유망한 전략이 될 수 있다.
골육종은 뼈와 같은 광물화된 세포외 기질을 특징으로 하기 때문에 선행연구에서는 뼈의 주요 미네랄 성분인 하이드록시아파타이트(HAp)에 대한 강력한 결합 친화력을 갖는 비스포스포네이트를 이용하여 뼈 표적화 능력을 가진 나노 약물 전달 시스템(NDDS)에 대한 연구가 진행되었다. 본 발명자 그룹은 선행 연구를 통해 소수성 약물의 볼 밀링 보조 흡착을 통해 알부민 분자의 자가 조립을 유도하여 제조된 알렌드로네이트 장식 알부민 나노클러스터(NC)를 보고했다(N.-W. Kang. et al., 2022). 즉, 화학적으로 가교된 종래의 알부민 나노입자와 달리, 볼 밀링 보조 흡착을 통한 알부민 분자 자가 조립을 통하여 제조된 알부민 나노클러스터는 농도 의존적 크기 감소를 나타내며, 희석 시 NC 구조가 분해되면서 NDDS의 표적 외 축적 및 잔류 독성을 최소화할 수 있게 되었다. 그러나 비스포스포네이트를 뼈 표적화 물질로 사용하는 경우, 비스포스포네이트의 항파골세포 활성으로 인하여 비스포스포네이트 함유 나노물질은 골괴사의 위험을 증가시킬 수 있다(F. Paiva-Fonseca, et al., 2014; R. E. Marx, et al., 2007).
이에 본 발명자 그룹은 HAp와 안정적인 결합 부위를 가지면서도 매우 고농도(하루 500 mg씩 한달 적용)에도 독성을 나타내지 않는 매우 안전한 화합물인 비타민 B1의 내인성 유도체 티아민 피로포스페이트(thiamine pyrophosphate, TPP)를 NDDS의 표면에 부착함으로써 골육종 표적화로 골육종 치료에 효과적이면서도 골괴사로부터 안전한 새로운 NDDS 기반 MAP 요법을 개발하는 과정에서 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명에 따른 골육종에 대한 HSA-TPP NC 기반 MAP 요법의 개략도를 도 1에 나타내었다. 종래 골종양 치료를 위한 NDDS는 대부분 단독 요법으로 제한된다. 본 발명은 골육종의 화합요법에 가장 선호되는 MAP의 유리 TX 및 DOX를 알부민 NC로 대체한 NDDS 기반의 병용요법의 치료 이점을 평가하였다. 골종양 표적능을 갖는 알부민 NC를 제조하기 위하여 뛰어난 종양 표적능을 갖는 것으로 알려진 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 핵심 프레임워크로 채택하였으며, TPP를 HSA에 접합시켜 골종양 미세 환경(bone tumor microenvironment, TME)에 대한 표적화 능력을 부여했다. 도 1에서와 같이, TPP로 장식된 HSA(HSA-TPP)는 이전에 보고된 알렌드로네이트-변형(alendronate-modified) HSA와 유사하게 MAP 요법의 소수성 성분인 DOX 또는 MTX의 흡착에 따라 NC로 자가조립될 수 있다. 약물 흡착 HSA-TPP NC는 HAp와 강한 전하-전하 상호작용을 형성할 수 있으며, 이는 변형되지 않은 HSA NC와 비교하여 효율적으로 골 종양에 축적될 수 있다. 이러한 골 종양 표적화는 MTX, DOX 및 CDDP 복합제의 상승 효과를 증가시켜 골육종 치료에서 MAP의 치료 효능을 향상시킬 수 있다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 여기서 소개되는 내용은 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
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실시예
1.
HSA
-
TPP의
합성>
1.1
HSA
-
TPP의
합성
인간 혈청 알부민과 티아민 피로포스페이트 접합분자인 HSA-TPP는 succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(SMCC), succinimide와 maleimide 그룹 모두를 가진 이종이작용성 가교제(heterobifunctional crosslinker)를 사용하여 합성하였다. 먼저, TPP를 pH 7.0에서 SMCC와 반응시켜 숙신이미드(succinimide)의 친핵성 치환을 TPP의 아민기로 유도하고 말레이미드 부분을 남겨두었다. 그 후, 말레이미드가 활성화된 TPP를 HSA에 접합하여 pH를 7.5 이상으로 유지하여 말레이미드가 HSA의 유리 티올 및 아민기와 반응할 수 있도록 하였다.
구체적으로는, 디메틸 설폭사이드(DMSO, 2mL)에 용해된 SMCC(2.51mg)를 포스페이트 완충액(2mL, pH 7.0)에 용해된 TPP(35mg)에 첨가하고 상기 혼합물을 40℃에서 3시간 동안 교반하였다. 이 때 생성된 말레이미드 활성화 TPP 용액을 HSA 용액(1 mg mL-1; 20 mL; pH 7.6)에 적가하고 혼합물을 40℃에서 20시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 용액을 반투과성 백(molecular weight cutoff [MWCO]: 6-8 kDa; Cellu×Sep; Membrane Filtration Products, Inc., Seguin, TX, USA)을 사용하여 투석하여 비접합 TPP를 제거하였다. 이후 생성된 HSA-TPP 접합체를 -80°C에서 2일 동안 동결건조하고 사용할 때까지 -20°C에서 보관하였다.
1.2
HSA
-
TPP
확인
HSA-TPP의 생성 여부는 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 매트릭스 보조 레이저 탈착 및 이온화 비행 시간(MALDI-TOF) 분석을 통해 TPP 접합에 의하여 HSA의 분자량이 증가한 것으로 확인하였다.
8% 겔을 사용하는 SDS-PAGE에서 평가를 위해 HSA 및 HSA-TPP를 80V에서 20분 동안 전기영동한 다음, 하고 겔 샘플을 쿠마시 블루로 염색하여 도 2A에 나타내었다. 도 2A에서 보는 바와 같이, HSA-TPP 밴드가 HSA의 밴드와 비교하여 위쪽으로 이동하였으며, 밴드 두께도 더 넓어졌다.
HSA 및 HSA-TPP의 평균 분자량은 MALDI-TOF 질량 분석기(Voyager DE-STR, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 측정하여 도 2B에 나타내었다. 도 2B에서 보는 바와 같이, MALDI-TOF 스펙트럼에서 HSA-TPP는 기본 HSA(m/z 66,521)보다 더 높은 중심 질량 대 전하 비율(m/z 69,809)과 더 넓은 피크를 나타냈다. 이때 말레이미드로 활성화된 TPP의 분자량(644.55g mol- 1)을 고려하면 HSA 분자당 접합된 TPP 분자의 평균 수는 5.11로 계산되었다.
또한, HSA에 대한 TPP의 접합은 31P-NMR(Avance III-600; Bruker, Billerica, MA, USA)로 확인하였다. NMR 샘플은 D2O에 HSA, TPP 또는 HSA-TPP를 용해하여 준비하였으며, 31P-NMR 결과를 도 2C에 나타내었다. 도 2C에서 보는 바와 같이, 네이티브 HSA는 유의미한 인 신호를 나타내지 않았으며, 유리 TPP의 31P-NMR 스펙트럼은 -11.10, -11.18, -11.68 및 -11.77ppm에서 피로인산염 피크를 보여주었으나, HSA-TPP는 -10.12, -10.20, -11.41 및 -11.49 ppm에서 피로인산염의 이중선 신호 특성을 나타어 HSA에 TPP 부분이 도입되었음을 확인하였다. HSA-TPP 스펙트럼에서 0.20ppm(오르토인산염)의 단일항은 합성 후 남은 인산염(즉, 용매로서의 인산염 완충액)에 기인할 수 있다.
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실시예
2. 약물 흡착
HSA
-
TPP의
합성 및 특성화>
2.1 약물 흡착
HSA
-
TPP의
합성
MAP 요법의 구성 요소 중 DOX와 MTX는 소수성이므로 알부민 유도체의 카고 분자로 선택하였다. 먼저, DOX 베이스는 액체-액체 추출 방법을 사용하여 준비하였다. 이중 탈이온수(DDW; 30mL)에 용해된 DOX HCl(50mg)을 분별 깔때기에서 클로로포름(20mL) 및 트리에틸아민(25μL)과 혼합하고, 클로로포름 상을 수집하여 회전 증발기(Rotary Evaporator N-1300V, EYELA, Tokyo, Japan)를 사용하여 증발시켰다. 침전된 DOX 베이스를 최소량의 DMSO에 용해시키고 동결건조시켰다.
이후, 약물 흡착 NC는 초음파 처리기(VC-750; Sonics & Materials, Inc., Newtown, CT, USA)를 사용하여 제작하였다. 상기 제작된 DOX 베이스(2mg) 또는 MTX(3mg)를 DMSO(100μL)에 용해시킨 것과 DDW(900μL, 단백질로서 83.3μM)에 용해된 HSA 또는 HSA-TPP를 30초 동안 부드럽게 볼텍스 혼합한 후, 얼음 욕조에서 20%의 진폭의 초음파를 2초간 온 및 3초간 오프를 1분 동안 반복하여 분산시켰다. 이후 상기 용액을 동결건조하여 용매를 제거하고, DDW(1mL)에 재현탁한 다음, 시린지 필터(포어 크기: 0.45μm; Minisart RC15; Sartorius, Gttingen, Germany)를 통해 여과하여 흡착되지 않은 DOX 또는 MTX를 제거하였다. CDDP 용액은 CDDP를 0.9% 염화나트륨 용액에 초음파 처리를 사용하여 용해시켰다.
2.2 약물 흡착
HSA
-
TPP
NC의 확인
약물 흡착
HSA
-
TPP
NC의 용해도
도 3에 유리 약물(DOX, MTX) 및 약물(DOX, MTX)이 HSA 또는 HSA-TPP에 흡착한 약물 흡착 NC의 수성 현탁액을 나타내었다. 도 3에서 보는 바와 같이, 50 μg mL-1의 약물 농도에서 유리 DOX와 MTX는 침전을 보였으며, 약물을 알부민에 흡착시킨 NC의 수성 현탁액은 겉보기 용해도가 크게 증가하였다. 이를 통해 단백질 결합 메커니즘을 통해 약물을 효율적으로 로딩할 수 있음을 확인하였다.
약물 흡착
HSA
-
TPP
NC의 평균
직경
,
다분산
지수 제타 전위 및 약물 흡착 효율
약물 흡착 NC의 평균 직경, 다분산 지수 및 제타 전위(pH 7.4) 값을 각각 Zetasizer Ultra 기기(Malvern Instruments Ltd. 맬번, 영국)를 사용하여 DLS 및 레이저 도플러 전기영동으로 측정하였다. DOX AE를 계산하기 위해 DOX에 흡착된 NC를 DMSO(희석 계수: 20)에 희석하고 UV-Vis 분광 광도계(Multiskan GO; Thermo Scientific Inc., Waltham, MA, USA)를 사용하여 492 nm에서 분석했다. MTX AE는 역상 컬럼(Kinetex C18, 4.6 × 100 mm, 2.6 μm; Phenomenex, Torrance, CA, USA) 및 가드 컬럼(C18, 4 × 2.0 mm; Phenomenex)이 장착된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템(Agilent 1260 infinity; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)을 사용하여 결정하였다. MTX가 흡착된 NC를 인산칼륨 완충액(5mM, pH 2.5)과 아세토니트릴(ACN)(85:15, v/v)로 구성된 이동상(희석인자: 300)으로 희석하였다. MTX의 검출 파장과 유속은 각각 303 nm와 1.0 mL min-1로 설정하였고, 주입 부피와 컬럼 온도는 각각 20μL 및 25℃로 설정하였다. 이의 결과를 표 1에 나타내었다.
| Composition | Mean diameter [nm] | Polydispersity index | Zeta potential [mV] | Drug adsorption efficiency [ % ] a) |
| DOX/HSA | 188.7 ± 6.6 | 0.11 ± 0.05 | -22.5 ± 0.7 | 33.4 ± 0.6 |
| DOX/HSA-TPP | 195.0 ± 6.6 | 0.07 ± 0.02 | -30.0 ± 0.9 | 47.4 ± 7.1 |
| MTX/HSA | 14.2 ± 0.6 | 0.59 ± 0.08 | -12.0 ± 1.5 | 80.1 ± 0.3 |
| MTX/HSA-TPP | 39.1 ± 0.3 | 0.85 ± 0.08 | -23.3 ± 3.8 | 95.5 ± 1.0 |
데이터는 평균 ± 표준 편차(n = 3)로 표시됨. a) 약물 흡착 효율(%) = (NCs의 실제 약물 양) × 100 / (NCs의 이론상 약물 양).
표 1에서 보는 바와 같이, DOX/HSA 및 DOX/HSA-TPP의 약물 흡착 효율(AE, 약물 캡슐화 효율)은 각각 33.4 ± 0.6% 및 47.4 ± 7.1%로, 상당한 양의 큰 NC가 DOX 흡착 후 형성되고 여과 절차 동안 제거될 수 있음을 나타내었다. 그러나 MTX/HSA 및 MTX/HSA-TPP는 각각 80.1 ± 0.3% 및 95.5 ± 1.0%의 AE 값을 보여 MTX 흡착 후 생성된 대부분의 NC가 주사 가능한 입자 크기(<0.45 μm)를 갖는 것을 알 수 있었다. 또한 도 4에 알부민 NC의 강도 및 수 가중 크기 분포를 나타내었다. 도 4에서 보는 바와 같이, DOX/HSA와 DOX/HSA-TPP는 모두 단봉 크기 분포를 보였으며, MTX/HSA 및 MTX/HSA-TPP는 약 15 및 40 nm의 MID를 갖고 강도 가중 크기 분포 다이어그램에서 이중 모드로 나타났다. 종래의 Abraxane® 및 본 발명자의 선행 연구에서의 제형과 유사하게, 100 nm 보다 큰 입자 크기에 해당하는 피크는 약물 흡착 알부민 유도체의 클러스터링을 시사하는 반면, 약 10 nm에서의 피크는 분자적으로 분산된 부분의 존재하는 것을 의미한다 (cf. HSA의 MID 
6 nm). 또한, DOX 흡착 NC의 평균 수 가중 직경(mean number-weighted diameter, MND)은 100 nm를 초과한 반면, MTX 흡착 NC의 MND는 대부분 10 nm 미만이었다(도 4 내 삽입 그래프). 이러한 차이는 TEM(JEM-F200; JEOL, Tokyo, Japan)을 통해 추가로 조사하였다. 재현탁된 NC를 200 메시 탄소 코팅된 구리 그리드에 놓고 우라닐 아세테이트로 음성 염색하여 약물이 흡착된 NC의 형태를 확인하였다. 도 5에서 보는 바와 같이, DOX 흡착 NC에서는 큰 응집체(>100 nm)가 관찰된 반면, MTX 흡착 NC에서는 실질적으로 더 작은 입자(<20 nm)가 우세했으며, 이는 각각의 수 가중 크기 분포 플롯과 잘 일치하는 것을 확인하였다.
약물 흡착
HSA
-
TPP
NC의 콜로이드 안정성 및 약물 방출 특성
약물 흡착 HSA-TPP NC를 포함하는 각 제형의 콜로이드 안정성은 50% 소 태아 혈청(FBS)에서 평균 강도 가중치 직경(mean intensity-weighted diameters, MID)의 시간 경과 변화를 모니터링하여 평가하였다. 각 NC를 진탕 수조(37°C, 50rpm)에서 배양하고, 배양 0, 1.5, 3, 6, 9, 12 및 24 시간에 이들의 평균 직경을 Zetasizer Ultra(Malvern Instruments Ltd.)를 사용하여 모니터링하여 도 6A에 나타내었다. 모든 그룹은 24시간 동안 응집 또는 침전의 징후를 나타내지 않고 초기 MID를 유지했으며, 이는 정맥 주사 후 혈청 성분의 비특이적 흡착 또는 자가 응집이 무시할 정도로 적음을 시사한다. 또한 상기 표 1에서 보는 바와 같이, 생리학적 pH에서 DOX/HSA 및 MTX/HSA의 제타 전위는 각각 -22.5 ± 0.7 및 -12.0 ± 1.5 mV의 음의 값을 나타낸다. NC는 TPP로 장식될 때 더 음으로 대전되어 DOX/HSA-TPP 및 MTX/HSA-TPP에 대해 각각 -30.0 ± 0.9 및 -23.3 ± 3.8mV이었다. 이와 같이 혈청의 콜로이드 안정성은 NC의 음의 표면 전하에 기인할 수 있다.
NC로부터의 약물 방출은 각각 산성 TME 및 혈장 조건을 나타내는 pH 6.7 및 7.4로 조정된 신생아 송아지 혈청(NBCS)에서 평가하여 도 6B에 나타내었다. 약물이 흡착된 NC(약물 농도: 0.5 mg mL-1, 150 μL)를 미니 GeBAflex 튜브(MWCO: 6-8 kDa, Gene Bio-Application Ltd., Yavne, Israel)에 넣었고, 각 튜브를 방출 배지(2mL, 20% NBCS, pH 6.7 및 7.4)에 담근 후 진탕 수조(50rpm, 37°C)에서 인큐베이션했다. 이후, NC가 채워진 튜브를 1, 3, 6, 24, 48 및 96 시간의 인큐베이션 후 새로운 방출 배지(2mL)로 채워진 새 용기로 옮겼다. 수집된 시료(50μL)를 포름산(0.1%, v/v) 및 내부 표준물질(IS, docetaxel, 100ng mL- 1)을 포함하는 ACN(150μL)과 혼합한 후, 혼합물을 3분 동안 볼텍싱하고 20,378 × g에서 3분 동안 원심분리했다. 이후, 상층액을 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법으로 분석하였다. 크로마토그래피 분리는 역상 컬럼(Kinetex C18, 100 × 4.6 mm, 2.6 μm; Phenomenex)과 가이드 컬럼(C18, 4 × 2.0mm, Phenomenex)을 장착한 Shimadzu Nexera XR Modular HPLC system (Shimadzu, Kyoto, Japan)으로 수행되었다. 용출은 25°C 0.4 mL min-1의 유속의 등용매 조건에서 수행되었다. 이동상은 ACN(0.1% formic acid, v/v) 및 DDW(0.2% formic acid, v/v)(70:30, v/v)로 구성되었으며, 주입량과 정량 하한은 각각 5μL 및 50ng mL-1이었다. 이온화된 분자는 API 3200 시스템(SCIEX, Framingham, MA, USA)을 사용하여 검출하였다. 누적 방출(F; %) 대 시간(t)은 하기 방정식을 기반으로 Fmax, Hopfenberg, Korsmeyer-Peppas 및 Peppas-Sahlin 모델의 1차 모델을 사용하여 플롯하고 피팅되었다.
First-order model:
Hopfenberg model:
Korsmeyer-Peppas model:
Peppas-Sahlin model:
(단, Fmax 는 최대 누적 방출량, k, kHB, kKP, k1 및 k2 는 각 모델의 방출율 상수)
도 6B에서 보는 바와 같이, DOX-흡착 NC는 지속적이고 pH 의존적인 약물 방출 패턴을 나타냈다. 96시간에 DOX/HSA-TPP의 누적 약물 방출은 pH 7.4에서 43.5 ± 3.1%, pH 6.7에서 56.8 ± 5.1%이었다. 이러한 방출 패턴은 DOX 노출이 정상 조직보다 뼈의 골 종양 미세환경(bone tumor microenvironment, TME)에서 더 유의한 것임을 시사한다. 이와 유사하게, MTX-흡착 NC는 96시간 동안 지속된 약물 방출 패턴을 보였으며, DOX-흡착 NC의 방출보다 빨랐다.
방출 패턴을 추가로 조사하기 위해 각 방출 프로파일을 4개의 다른 방출 동역학 모델에 피팅하여 표 2에 나타내었다. 표 2에서 보는 바와 같이, DOX 방출 프로파일은 Peppas-Sahlin 모델에 피팅하였을 때 가장 높은 상관 계수(R2)를 나타내었으며, 이는 약물 방출이 NC로부터의 DOX 확산 및 NC에서의 DOX 제거에 수반되는 NC 구조가 분해를 각각 나타내는 Fickian 확산 및 사례 II 완화의 혼합 패턴을 따를 수 있음을 나타낸다.
| Groups | pH | First-order with F max | Hopfenberg | Korsmeyer - Peppas | Peppas - Sahlin | |||||||||
| R 2 | k | F max | R 2 | k HB | n | R 2 | k KP | n | R 2 | k 1 | k 2 | m | ||
| DOX/HSA | 6.7 | 0.9721 | 0.0467 | 56.30 | 0.8143 | 0.00001 | 2412 | 0.9737 | 7.967 | 0.4461 | 0.9905 | 5.789 | -0.1432 | 0.6354 |
| 7.4 | 0.9585 | 0.0531 | 37.97 | 0.6652 | 0.00001 | 774.1 | 0.9801 | 6.246 | 0.4161 | 0.9939 | 4.900 | -0.1456 | 0.5796 | |
| DOX/HSA-TPP | 6.7 | 0.9622 | 0.0486 | 54.79 | 0.7775 | 0.00001 | 1623 | 0.9855 | 8.421 | 0.4268 | 0.9965 | 6.607 | -0.1856 | 0.5857 |
| 7.4 | 0.9263 | 0.0540 | 40.51 | 0.6660 | 0.00001 | 1322 | 0.9925 | 6.703 | 0.4137 | 0.9956 | 6.110 | -0.1611 | 0.4989 | |
| MTX/HSA | 6.7 | 0.9979 | 0.2331 | 84.00 | 0.8114 | 0.0001 | 2302 | 0.8055 | 34.32 | 0.2243 | 0.9321 | 29.38 | -2.395 | 0.4522 |
| 7.4 | 0.9979 | 0.2227 | 85.24 | 0.8491 | 0.0001 | 1836 | 0.8111 | 33.84 | 0.2309 | 0.9374 | 28.56 | -2.227 | 0.4623 | |
| MTX/HSA-TPP | 6.7 | 0.9988 | 0.2308 | 95.09 | 0.9846 | 0.0001 | 2009 | 0.8127 | 38.78 | 0.2246 | 0.9395 | 33.12 | -2.686 | 0.4530 |
| 7.4 | 0.9986 | 0.2311 | 93.48 | 0.9729 | 0.0001 | 1623 | 0.8015 | 38.14 | 0.2243 | 0.9335 | 32.41 | -2.616 | 0.4560 | |
그러나 1차 모델에서 MTX 방출 프로파일의 가장 잘 맞는 것이 관찰되었으며, 이는 MTX 방출이 단순한 약물-단백질 해리 모델을 따를 수 있음을 나타낸다. 이러한 결과는 DLS 및 TEM 분석에서 본 바와 같이 DOX 흡착이 MTX 흡착보다 알부민 분자의 더 강한 클러스터링을 유도할 수 있음을 뒷받침하였다.
<
실시예
3. 뼈의 골 종양 미세환경
TME에
대한
HSA
-
TPP
NC의 친화도>
3.1
HOS
/
MNNG
단층 배양 모델
시험관 내에서 뼈 TME에 대한 NC의 친화성을 조사하기 위해 우리는 HAp 비드를 사용하여 골육종 배양 모델을 확립하였다. 인간 골육종 세포 HOS/MNMG(CRL-1547; ATCC, Manassas, VA, USA)는 L-글루타민(300 mgL- 1)을 함유하고 10% FBS(v/v) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(v/v)이 보충된 MEM에서 37℃에서 5% CO2 에서 배양했다.
HAp 비드를 DDW로 세척하고 사용하기 전에 밤새 동결 건조시켰다. HOS/MNNG 세포(5 × 105/웰)를 6웰 플레이트에 접종하고 12시간 동안 배양한 다음 HAp 비드(2.5mg)와 함께 1시간 배양했다. 그런 다음 세포를 PBS로 세척하여 흡착되지 않은 HAp 비드를 제거하고 5분 동안 알리자린 레드 S(alizarin red S, ARS) (50μg mL-1)로 염색하여 칼슘의 존재를 확인했다. 이후 세포를 트립신 처리하고 FSC, SSC 및 ARS 형광 강도를 유세포 분석기(NovoCyte; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)로 측정했다. 형성된 Ca-ARS 복합체의 양은 10% 세틸피리디늄 클로라이드 용액으로 세포를 추출하고 Multiskan GO 기기를 사용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하여 정량화하였다. 이러한 방법으로 HAp의 존재 및 부재에서 HOS/MNNG 세포의 크기와 복잡성을 각각 FSC 및 측면 산란(SSC) 신호를 모니터링하여 평가하여 도 7A에 나타내었다. 또한 HAp 비드 부재하의 HOS/MNNG 세포에 대하여 HAp 비드와 함께 배양 후 HOS/MNNG 세포의 전방 산란 영역(FSC-A)과 높이(FSC-H), 측방 산란(SSC-A)과 높이(SSC-H)를 측정하여 도 7B에 나타내었다.
도 7B에서 보는 바와 같이, HAp의 존재하에 배양된 HOS/MNNG 세포는 HAp의 부재하에 배양된 HOS/MNNG 세포보다 각각 1.42배 FSC-H 및 3.55배 더 높은 SSC-H를 나타내었다. 이는 HAp 비드와 HOS/MNNG 세포 간 세포 표면 흡착과 같은 물리적 상호작용이 있음을 암시한다.
이러한 변화가 HAp 흡착에 의한 것인지 확인하기 위해 alizarin red S(ARS)를 이용한 칼슘염색을 통하여, 세포에 형성된 Ca-ARS 복합체의 형광강
도를 유세포분석을 통해 SSC-낮음(G1) 및 SSC-높음(G2) 하위 집합의 평균 ARS 형광 강도로 정량한 결과, 도 7C에서 보는 바와 같이, HAp 존재하에 배양된 HOS/MNNG 세포의 총 ARS 강도는 36.9배 더 높은 반면, HAp 부재하에 배양된 HOS/MNNG 세포의 총 ARS 강도는 1.19배로 ARS 처리 없는 HAp와 빈 세포 샘플과 거의 동일하였다. 특히, SSC-높음(G2) 하위 집합은 SSC-낮음(G1)보다 ARS 강도가 더욱 컸다. 이에 따라 ARS 강도와 SSC-H 간의 상관관계 분석을 수행하여 도 7D에 나타내었다. 도 7D에 나타낸 바와 같이, HOS/MNNG + HAp + ARS 그룹의 Pearson 상관계수는 0.70 ± 0.04(p < 0.0001)로 높은 상관관계를 나타내었다.
3.2
스캐폴드
기반 배양 모델
상기 결과를 바탕으로 Matrigel 기반 반고체 세포 배양 배지에서 HAp 비드의 존재 하에 HOS/MNNG 세포를 배양함으로써 스캐폴드 기반 배양 모델을 구축하고, 뼈 TME에 대한 NC 친화도를 평가하였다.
HOS/MNNG 세포(1.5 × 106) 및 HAp 비드(7.5 mg)를 세포 배양 배지와 Matrigel®(1:1, v/v)의 혼합물에 현탁시켰다. 현탁액을 공초점 접시에 분산시키고 37℃에서 20분 동안 안정화시켜 골육종 모방 겔 매트릭스를 형성하였다. 그런 다음, 약물이 흡착된 NC(50 μg mL-1 DOX 또는 250 μg mL-1 MTX)를 젤에 적용하고, 12시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 겔을 PBS로 부드럽게 세척하고, 0.1 M Tris/HCl 완충액(pH 9.0) 및 글리세롤(10:90, v/v)로 구성된 마운팅 배지를 배양 슬라이드에 첨가하였다. 이후 DOX 및 MTX의 형광 강도는 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Airyscan이 있는 LSM 880; Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 측정하여 도 8A에 나타내고, ImageJ 소프트웨어(Leica Camera AG, Wetzlar, Germany)를 사용하여 각 색상 채널에서 최대 강도 투영 이미지를 정량화하고 그 결과를 도 8B에 나타내었다. 도 8A 및 도 8B에서 보는 바와 같이, DOX/HSA-TPP 및 MTX/HSA-TPP 그룹은 각각 DOX/HSA 및 MTX/HSA 그룹보다 1.85 배 및 1.49 배 더 높은 형광 강도를 나타냈다.
3.3
HAp에
대한
HSA
-
TPP의
친화도 분석
TPP로 장식된 NC의 뼈 광물에 대한 결합 친화성을 확인하기 위해 HAp 비드를 NC와 함께 직접 배양하고 유세포 분석으로 분석하였다. DOX/HSA 또는 DOX/HSA-TPP(200 μg mL-1 DOX)를 HAp(10 mg)와 1분 동안 볼텍스 혼합하고, 이와 유사하게, MTX/HSA 또는 MTX/HSA-TPP(2 mg mL-1 MTX)를 HAp(0.5 mg)와 1분 동안 복텍스 혼합했다. 이후 상기 각 현탁액을 16,000 × g에서 1분 동안 원심분리하여 결합되지 않은 NC를 제거한 후, HAp 펠릿을 2% FBS(v/v) 함유 PBS(pH 7.4)에 재현탁하고 NovoCyte 및 FACSCanto™ II(BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 기기를 사용하여 DOX 및 MTX 형광 강도를 각각 측정하여 도 8C에 나타내었다. 도 8C에서 보는 바와 같이, DOX/HSA-TPP와 함께 배양된 HAp 비드는 DOX/HSA 및 유리 DOX와 함께 배양된 것보다 각각 1.64 배 및 2.41 배 더 높은 DOX 강도를 보여주었으며, MTX/HSA-TPP와 함께 배양된 HAp 비드는 MTX/HSA 및 유리 MTX와 함께 배양된 것보다 각각 20.8 배 및 14.9 배 더 높은 MTX 강도를 나타냈다. 이와 같이 HAp에 대하여 약물 흡착이 증가된 것은 TPP 부분과 HAp 사이의 이온 상호작용의 결과일 수 있으며, 이는 골 TME에 대한 향상된 표적화 능력을 의미한다.
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실시예
4.
HSA
-
TPP
NC를 통한 MAP의 in vitro 항종양 효능 확인>
본 발명에 따른 HSA-TPP NC를 통한 MAP 요법의 시험관 내 항종양 효능을 확인하였다. 단일 및 병용 요법의 세포독성을 측정하기 위해 HOS/MNMG 세포를 웰당 5000개 세포의 밀도로 96웰 플레이트에 시딩하고 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, DOX/HSA-TPP 및 CDDP 용액을 첨가하고 플레이트를 24시간 동안 인큐베이션한 다음, MTX/HSA-TPP를 첨가하고 플레이트를 추가로 24시간 동안 인큐베이션하였다. 각 약물의 단일 요법은 DOX의 경우 0.125, 0.25, 0.5, 1.25, 2.5, 5.0, 12.5, 25.0 및 50.0μg mL-1의 다양한 농도 범위에서 수행되었으며, MTX의 경우 0.0005, 0.002, 0.005, 0.02, 0.05, 0.1, 1, 10 및 100 μg mL-1; CDDP의 경우 0.30, 0.75, 1.5, 3.0, 7.5, 15, 30 및 75 μg mL-1였다. 이후, Cell Counting Kit-8(Dojindo, Tokyo, Japan)을 사용하여 세포 생존율을 평가하였고 그 결과를 도 8D에 나타내었다. 세포 생존율은 UV-vis 분광광도계(Multiskan GO)를 사용하여 파장 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 도 8D에서 보는 바와 같이, 단일 요법 조건에서 DOX 용액, DOX/HSA 및 DOX/HSA-TPP는 각각 0.829 ± 0.076 μg mL-1, 0.970 ± 0.090 μg mL-1 및 0.679 ± 0.082 μg mL-1의 유사한 반수 최대 억제 농도(IC50) 값을 나타냈다. 또한 MTX 용액과 MTX에 흡착된 NC는 0.5ng mL-1에서 100μg mL-1까지의 광범위한 MTX 농도에서 유사한 세포 독성을 나타냈다. CDDP 용액의 IC50 값은 1.825 ± 0.444μg mL-1이었다(미도시).
병용 요법에서 MAP 요법의 일반적인 투여 순서에 따라 DOX(용액 또는 NC)와 CDDP(용액)를 먼저 24시간 동안 투여한 다음, MTX(용액 또는 NC)를 추가 24시간 동안 추가했다. DOX/MTX/CDDP의 농도 비율은 MAP의 일반적인 투여 비율에 따라 5/10/3으로 표 3과 같이 고정하였다.
| DOX ( μg mL - 1 ) | MTX ( μg mL - 1 ) | CDDP ( μg mL - 1 ) | Total drug concentration ( μg mL - 1 ) |
| 5 | 10 | 3 | 18 |
| 1.25 | 2.5 | 0.75 | 4.5 |
| 0.5 | 1 | 0.3 | 1.8 |
| 0.125 | 0.25 | 0.075 | 0.45 |
| 0.05 | 0.1 | 0.03 | 0.18 |
| 0.0125 | 0.025 | 0.0075 | 0.045 |
| 0.005 | 0.01 | 0.003 | 0.018 |
| 0.00125 | 0.0025 | 0.00075 | 0.0045 |
용액, HSA NC 및 HSA-TPP NC를 이용한 MAP 병용요법에서의 IC50 및 50% 약물 효과 수준에서의 예상 CI값(CI50)을 표 4에 나타내었다.
| Treatment (incubation time) | IC 50 ( μg mL - 1 ) | CI 50 |
| DOX solution (48 h) + CDDP solution (48 h) + MTX solution (24 h) | 2.158 ± 0.523 | 1.570 |
| DOX/HSA NCs (48 h) + CDDP solution (48 h) + MTX/HSA NCs (24 h) | 0.371 ± 0.315 | 0.358 |
| DOX/HSA-TPP NCs (48 h) + CDDP solution (48 h) + MTX/HSA-TPP NCs (24 h) | 0.807 ± 0.541 | 0.806 |
표 4에서 보는 바와 같이, HSA NC와 HSA-TPP NC는 모두 0.018-4.5μg mL-1의 총 약물 농도 범위에서 암세포 생존율을 유의하게 낮추었으며, 용액군과 비교하여 IC50 값이 각각 0.17 배 및 0.37 배였다.
이러한 결과를 바탕으로 Chou-Talalay 방법을 사용하여 조합 지수(CI) 값을 계산하여 요법의 시너지 효과를 정량화하여 도 8E에 나타내었다. IC50 및 CI 값은 각각 선량-효과 곡선을 기반으로 하고 Chou-Talalay 방법을 사용하여 계산되었다. 도 8E에서 보는 바와 같이, 50% 약물 효과 수준(50% drug effect level, CI50)에서 예측된 CI 값은 HSA NC 및 HSA-TPP NC 그룹에서 각각 0.358 및 0.806으로 상승적인 항암 효과를 나타냈다.
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실시예
5.
동소성
골육종 모델의 생체 내 생체 분포 확인>
HSA-TPP NC의 생체내 생체 분포를 평가하기 위해 동소성 골육종 마우스 모델이 확립하였다. Balb/c 누드 마우스(암컷, 4주령)는 나라바이오텍(서울, 대한민국)에서 구입했다. 마우스는 22±2°C, 상대습도 40±5%의 빛이 조절되는 방에서 사육하였다(충남대학교 의약품연구소). 마우스는 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 하였다. 동물 연구 프로토콜은 충남대학교 실험동물 윤리위원회의 승인을 받았다(승인번호: 202103A-CNU-085). 동소 골 종양 이종이식 마우스 모델은 마우스의 오른쪽 뒷다리에 골육종 세포 현탁액의 경골 내 접종에 의해 구축하였다. 현탁액은 HOS/MNNG 세포(5 × 106 세포)를 배양 배지와 Matrigel®(1:1, v/v; 총 부피, 100μL)의 혼합물에 현탁시켜 제조하였다. HAp 비드(4 mg)는 에탄올로 세척하고 밤새 건조시킨 다음 동일한 배지에 분산시켜 HOS/MNNG 접종 후 10일에 종양 내 이식하여 뼈 TME를 시뮬레이션하였다. 도 9A에 동소성 골육종 마우스 모델 구축 개략도를 나타내었다. 골아세포성 골육종 조직의 인산칼슘 함량(2.4~3.9%)에 따라, 이식된 HAp 비드의 양은 종양당 4mg으로 설정되었다. 이 농도에서 HOS/MNNG 세포의 생존력은 영향을 받지 않았으며, HOS/MNNG 세포는 104개 세포당 50μg의 HAp 농도에서 103.7 ± 0.6% 생존율을 나타내었으며, 이는 생체 내 최대 농도(즉, 5 × 106 세포당 4000μg)보다 6.25배 더 높은 농도이다.
이후, 시아닌 5.5 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(Cy5.5)로 표지된 NC를 마우스에 정맥내 주사하고, 근적외선 형광(NIRF) 이미징을 사용하여 미리 결정된 시점에서 전신 스캐닝을 수행하여 그 결과를 도 9B에 나타내었으며, 형광 이미지를 정량화하여 도 9C에 나타내었다. 도 9B 및 도 9C에서 보는 바와 같이, HSA NC는 24시간 동안 골육종에 점진적으로 축적되어, 알부민 기반 나노운반체의 고유한 종양 귀소 특성을 확인하였다. 특히, TPP로 장식된 HSA-TPP NC는 24시간에 종양 축적이 TPP로 장식되지 않은 HSA NC와 비교하여 1.40배 증가했다.
종양이 있는 다리 및 다른 주요 기관에 대한 생체외(ex vivo) 영상화를 통해 TPP로 장식된 NC의 향상된 종양 분포를 확인하여 도 9D에 나타내었으며, 이를 정량화하여 도 9E에 나타내었다. 도 9D 및 도 9E에서 보는 바와 같이, 종양이 있는 다리의 복사 효율(RE)은 TPP로 장식된 HSA-TPP NC 처리군이 TPP로 장식되지 않은 HSA NC 처리군보다 1.53 배 더 높았다. 그러나 정상 다리에서는 평균 두 군 간에 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았다.
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실시예
6.
동소성
골육종
모델에서 HSA
-
TPP
NC를 이용한 MAP 요법>
HSA-TPP NC를 이용한 MAP 요법의 종양 억제 효과를 동소성 골육종 이종이식 마우스 모델에서 기존의 자유 약물 기반 MAP의 종양 억제 효과와 비교하였다.
종양이 있는 마우스를 무작위로 다음과 같이 4개의 그룹으로 나누었다: 미처리군, 용액 MAP(모든 약물은 유리 약물 용액으로 투여됨), HSA MAP(DOX/HSA, MTX/HSA 및 유리 CDDP) 및 HSA-TPP MAP (DOX/HSA-TPP, MTX/HSA-TPP 및 유리 CDDP). 도 10A에 동소성 골육종 모델 구축 및 MAP 치료 일정을 도시하였다. 종양 크기 및 체중을 매일 측정하였다. 종양 부피가 약 70 mm3(4일차)에 도달하면 약물 용액 또는 NC를 치료 일정에 따라 DOX(5mg kg-1) 및 CDDP 용액(3mg kg-1)은 4일, 8일, 및 13; 6, 10, 15일에 MTX(10 mg kg- 1)를 정맥 주사하였다. 17일에 마우스를 희생시키기 전에 후안와 신경총에서 혈액 샘플을 수집하였다. 마우스를 희생시킨 후, 양쪽 다리를 절단하고 무게를 달아 종양 무게를 계산했다. 또한 간, 비장, 신장, 심장 및 폐를 포함한 주요 장기를 절제하고 H&E 염색을 수행하였으며, H&E 염색과 함께 다리 샘플에 TUNEL 염색을 수행했다. 수집된 혈액 샘플에 대하여 CBC 검사를 Scil Vet abc Plus(HORIBA, Kyoto, Japan)를 사용하여 수행하였다.
도 10B 및 도 10C에 17일 간의 종양 성장 프로파일 및 체중의 프로파일을 나타내었다. 도 10B 및 도 10C에서 보는 바와 같이, 3주기의 MAP 후, 종양 성장은 용액 MAP 군에서 일정 억제되었으며, 17일째에는 처리되지 않은 그룹보다 1.40배 더 낮은 부피로 억제되었다. HSA MAP 군의 경우, 종양 부피를 1.84배 더 감소시켰는데, 이는 알부민의 종양 표적화 능력에 기인할 수 있다. 특히, HSA-TPP MAP은 17일째에 가장 낮은 종양 부피를 나타내어 종양 성장을 현저히 억제했으며, 이는 종래 용액 MAP 및 HSA MAP 그룹과 비교하여 각각 2.37배 및 1.80배 감소한 것이었다. 실험 전반에 걸쳐 유의미한 체중 변화가 관찰되지 않아 전신 독성이 무시할 수 있음을 시사한다.
도 10D 및 도 10E에 각 군의 17일 후 마우스 및 종양을 가진 절제된 다리에서의 종양 외관을 나타내었으며 도 10F에 각 군의 종양 무게를 나타내었다. 상기 결과는 종양 부피 데이터와 일치했으며 HSA-TPP MAP 처리군이 가장 높은 종양 억제 효과를 가짐을 확인했다.
종양 조직에서 세포 사멸의 정도를 조사하기 위해 17일째에 절제된 종양을 가진 다리를 튜널(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling, TUNEL) 염색하여 세포 사멸 영역을 시각화하였으며, 근육(M), 뼈(B) 및 종양(T) 조직의 형태학적 차이를 명확히 하기 위해 헤마톡실린과 에오신(hematoxylin and eosin, H&E)으로 염색하고 그 결과를 도 10G에 나타내었다.
도 10G에서 보는 바와 같이, 미처리군의 종양에서는 관찰 가능한 세포 사멸 영역이 발견되지 않았다. 모든 약물은 유리 약물 용액으로 투여한 용액 MAP군 및 HSA MAP군은 세포 사멸 영역 (apoptotic region, 갈색)을 나타내었지만, 이들 부위는 대부분 임상 상황에서 표적 부위가 될 수 있는 뼈 부위에서 멀리 떨어져 있었다. 그러나 HSA-TPP MAP 그룹은 특히 뼈-종양 경계 근처에서 상당히 더 큰 세포 사멸 영역을 보였으며, 이는 TPP 장식으로 인해 뼈 미네랄에 대한 NC의 친화도가 증가했기 때문으로 판단된다.
상기에서 본 HSA-TPP MAP 세포사멸 유도는 종양에서 항-세포사멸 단백질의 발현 감소를 통해 확인하였다. HSA-TPP NC를 이용한 MAP 요법의 3주기 후 종양에서 항-세포자멸사 단백질(anti-apoptotic protein)의 미처리군에 대한 상대적 발현을 도 11에 나타내었다. 도 11에서 보는 바와 같이, 항 세포자멸사 단백질로 알려진 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 6(Insulin-like growth factor-binding protein 6, IGFBP-6), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5(Insulin-like growth factor-binding protein 5, IGFBP-5), X-링크 세포사멸 단백질(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP) 등이 미처리 종양과 비교하여 HSA-TPP NC를 이용한 MAP 요법을 받은 종양에서 발현이 현저히 감소하였다. 이를 통해 HSA-TPP NC를 이용한 MAP 요법이 종래의 MAP 요법과 비교하여 종양 조직에서 세포사멸을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
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실시예
7.
HSA
-
TPP
NC를 이용한 MAP 요법의 독성 프로파일>
7.1 표적 외 장기 독성을 평가
본 발명에 따른 HSA-TPP NC를 이용한 MAP 요법의 독성 프로파일을 동소성 골육종 이종이식된 마우스에서 평가하였다. 표적 외 장기 독성을 평가하기 위해 상기 실시예 6에서 수득한 장기 심장, 폐, 간, 신장 및 비장을 H&E로 염색하여 조직학적 변화를 조사하고 그 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12에서 보는 바와 같이, HSA MAP 및 HSA-TPP MAP 군에서 DOX에 민감한 것으로 알려진 심장근육 조직은 치료되지 않은 그룹과 비교하여 3주기의 MAP 요법 후, 관찰 가능한 병리학적 변화를 나타내지 않았다. 그러나, 용액 MAP 그룹의 마우스는 줄무늬의 손실과 함께 근원섬유 밀도의 감소를 나타내어 심각한 심장독성을 나타내었다. NC를 이용한 MAP 요법 처리군에서 감소된 DOX 관련 심장독성은 도 9E에서 보듯이, 심장에 대한 상대적으로 낮은 NC 분포에 의한 것으로 판단된다. 폐, 간, 신장 및 비장의 다른 장기의 독성은 모든 그룹에서 무시할 수 있는 수준이었다.
7.2 혈구 수 및 혈청
바이오마커
평가
본 발명에 따른 HSA-TPP NC를 이용한 MAP 요법의 안전성 강화를 위하여 전신독성 평가를 통해 안정성을 확인하였다. 상기 실시예 6에서 수득한 MAP의 3주기 후에 각 군별 혈액 샘플의, 완전한 혈구 수(CBC) 및 혈청 바이오마커를 평가하여 하기 표 5에 나타내었다.
| Parameters [unit] a) | Untreated | Solution MAP | HSA MAP | HSA - TPP MAP |
| Complete blood counts | ||||
| WBC [103 μL-1] | 6.4 ± 2.1 | 4.9 ± 2.8 | 6.7 ± 4.2 | 5.8 ± 2.8 |
| RBC [106 μL-1] | 10.5 ± 1.0 | 11.0 ± 3.1 | 10.2 ± 3.1 | 11.3 ± 2.5 |
| HGB [g dL-1] | 16.5 ± 1.2 | 17.9 ± 4.7 | 14.6 ± 3.3 | 17.3 ± 3.9 |
| HCT [%] | 51.7 ± 3.6 | 54.1 ± 15.4 | 46.1 ± 11.8 | 55.7 ± 13.4 |
| MCV [μm³] | 48.3 ± 1.2 | 49.5 ± 0.5 | 49.0 ± 1.4 | 49.0 ± 1.5 |
| MCH [pg] | 15.5 ± 0.8 | 15.5 ± 0.3 | 15.7 ± 0.6 | 15.3 ± 0.5 |
| MCHC [g dL-1] | 32.0 ± 1.0 | 31.6 ± 0.8 | 32.0 ± 1.8 | 31.2 ± 0.7 |
| PLT [10³ μL-1] | 129 ± 59 | 133 ± 75 | 118 ± 59 | 168 ± 83 |
| Serum biochemistry | ||||
| AST [U L-1] | 107.3 ± 19.4 | 106.7 ± 26.0 | 107.7 ± 20.8 | 106.3 ± 19.2 |
| ALT [U L-1] | 17.5 ± 6.4 | 20.5 ± 4.4 | 17.7 ± 1.5 | 18.3 ± 5.2 |
| SCr [mg dL-1] | 0.48 ± 0.16 | 0.26 ± 0.11 | 0.17 ± 0.07 | 0.21 ± 0.09 |
| BUN [mg dL-1] | 29.6 ± 6.7 | 38.5 ± 7.6 | 28.1 ± 4.1 | 25.3 ± 4.3 |
데이터는 평균 ± 표준 편차(n = 6)로 표시됨. a) 약어: WBC, 백혈구 수; RBC, 적혈구 수; HGB, 헤모글로빈; HCT, 헤마토크릿; MCV, 평균 미립자 부피; MCH, 평균 미립자 헤모글로빈; MCHC, 평균 미립자 헤모글로빈 농도; PLT, 혈소판 수; AST, 아스파르테이트 트랜스아미나제; ALT, 알라닌 트랜스아미나제; SCr, 혈청 크레아티닌; 및 BUN, 혈액 요소 질소.
상기 표 5에서 보는 바와 같이, HSA-TPP NC를 이용한 MAP 요법 군은 어떠한 바이오마커에서도 임상적으로 유의한 변화를 나타내지 않았으며, 이는 항암제의 골 표적 전달에 의해 야기될 수 있는 골수 억제를 포함하여 무시할 수 있는 독성을 나타내는 것을 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명자들은 골육종에 대한 MAP 요법의 치료 효능을 향상시키기 위해 DOX 및 MTX 이 흡착된 TPP-장식 HSA NC를 개발하였다. HSA-TPP에 대한 DOX 또는 MTX 흡착은 혈청에서 콜로이드 안정성이 높은 NC 구조의 자가 조립을 유도하여 소수성 약물을 치료적으로 의미 있는 농도까지 가용화할 수 있다. 본 발명에 따른 NC는 다양한 시험관 내 및 생체 내 골육종 모델에서 뼈 TME에 대해 상당히 증가된 친화도를 나타냈다.
HSA-TPP/DOX와 유리 CDDP 및 HSA-TPP/MTX 치료의 조합으로 구성된 HSA-TPP NC를 이용한 MAP 요법은 골육종 세포 억제에 향상된 상승 효과를 나타낸 반면, 기존의 용액 MAP 요법은 CI 값에서 길항작용을 나타냈다. 이러한 모든 결과는 동소성 골육종-이종이식된 마우스 모델에서 개선된 항종양 효능으로 확인되었다. 본 발명에 따른 HSA-TPP NC를 이용한 MAP 요법을 사용한 마우스는 용액 MAP 및 HSA MAP 군의 마우스와 비교할 때 눈에 띄는 전신 독성을 나타내지 않고도 골육종 부피의 상당한 감소를 나타냈다. 따라서 HSA-TPP NC 기반 MAP 요법은 골육종 치료를 위한 유망한 전략이 될 수 있음을 확인하였다.
Claims (14)
- 피로인산티아민-알부민 나노클러스터(HSA-TPP NC)를 포함하는 항암치료용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 피로인산티아민-알부민 나노클러스터는,
DMSO에 용해된 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate, SMCC)를 pH 7.0의 포스페이트 완충액에 용해된 피로인산티아민(thiamine pyrophosphate, TPP)에 첨가하여 반응시켜 말레이미드 활성화 TPP 용액(maleimide-activated TPP solution)을 제조하는 단계 (1);
상기 (1) 단계에서 제조된 말레이미드 활성화 TPP 용액을 인간 혈청 알부민(Human serum albumin, HSA) 용액에 적가하여 HSA-TPP 접합체를 형성시키는 단계 (2);
상기 (2) 단계의 HSA-TPP 접합체를 포함하는 용액을 투석하여 비접합 TPP를 제거하는 단계 (3);를 포함하는 제조방법에 의하여 제조되는 것을 특징으로 하는 항암치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 피로인산티아민-알부민 나노클러스터는, 골종양 미세환경(bone tumor microenvironment, TME)에 표적화하는 것을 특징으로 하는 항암치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 피로인산티아민-알부민 나노클러스터는, 항암제 약물을 흡착시킨 것을 특징으로 하는 항암치료용 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 약물은 파클리탁셀 (paclitaxel), 독소루비신(doxorubicin), 메소트렉세이트(methotrexate), 시스플라틴(cis-platin), 이포스파마이드(Isoffamide), 도데탁셀(docetaxel), 타목시펜(tamoxifen), 캄토세신(camtothecin), 아나스테로졸(anasterozole), 카보플라틴(carboplatin), 토포테칸(topotecan), 베로테칸(belotecan), 이리노테칸(irinotecan), 글리벡(gleevec) 및 빈크리스틴(vincristine)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것윽 특징으로 하는 항암치료용 조성물. - 제5항에 있어서,
상기 독소루비신을 흡착시킨 피로인산티아민-알부민 나노클러스터는
이중 탈이온수(DDW)에 용해된 독소루비신 염산(DOX HCl)을 클로로포름 및 트리에틸아민과 혼합하고, 클로로포름 상을 수집, 증발시켜 DOX 베이스를 제조하는 단계(a);
상기 (a) 단계에서 제조된 DOX 베이스를 DMSO에 용해시켜 DDW에 용해된 HSA-TPP와 혼합하여 혼합물을 만드는 단계 (b);
상기 (b) 단계의 혼합물에 초음파를 가하여 나노클러스터(nanocluster, NC)를 형성시키는 단계 (c);
상기 (c) 단계의 나노클러스터를 포함하는 용액으로부터 투석으로 잉여의 독소루비신을 제거하는 단계(d); 를 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 항암치료용 조성물. - 제5항에 있어서,
상기 독소루비신 흡착 피로인산티아민-알부민 나노클러스터(DOX/HSA-TPP NC)는 50 내지 500 nm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 항암치료용 조성물. - 제5항에 있어서,
상기 메토트렉세이트를 흡착시킨 피로인산티아민-알부민 나노클러스터는
메토트렉세이트를 DMSO에 용해시켜 DDW에 용해된 HSA-TPP와 혼합하여 혼합물을 만드는 단계 (a);
상기 (a) 단계의 혼합물에 초음파를 가하여 나노클러스터(nanocluster, NC)를 형성시키는 단계 (b);
상기 (b) 단계의 나노클러스터를 포함하는 용액으로부터 투석으로 잉여의 메토트렉세이트를 제거하는 단계(c); 를 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 항암치료용 조성물. - 제5항에 있어서,
상기 메토트렉세이트 흡착 피로인산티아민-알부민 나노클러스터(MTX/HSA-TPP NC)는 10 내지 100 nm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 항암치료용 조성물. - 동시에 또는 순차적으로 투여되는 독소루비신 흡착 피로인산티아민-알부민 나노클러스터(DOX/HSA-TPP NC), 메토트렉세이트 흡착 피로인산티아민-알부민 나노클러스터(MTX/HSA-TPP NC) 및 시스플라틴 용액의 조합을 포함하는 항암치료용 조성물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항암치료는 유잉육종(Ewing's sarcoma), 연골육종 (Chondrosarcoma) 또는 골육종(osteosarcoma)에 대한 항암치료인 것을 특징으로 하는 항암치료용 조성물. - DMSO에 용해된 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate, SMCC)를 pH 7.0의 포스페이트 완충액에 용해된 피로인산티아민(thiamine pyrophosphate, TPP)에 첨가하여 반응시켜 말레이미드 활성화 TPP 용액(maleimide-activated TPP solution)을 제조하는 단계 (1);
상기 (1) 단계에서 제조된 말레이미드 활성화 TPP 용액을 인간 혈청 알부민(Human serum albumin, HSA) 용액에 적가하여 HSA-TPP 접합체를 형성시키는 단계 (2);
상기 (2) 단계의 HSA-TPP 접합체를 포함하는 용액을 투석하여 비접합 TPP를 제거하는 단계 (3);를 포함하는 피로인산티아민-알부민 나노클러스터(HSA-TPP NC)의 제조방법. - 이중 탈이온수(DDW)에 용해된 독소루비신 염산(DOX HCl)을 클로로포름 및 트리에틸아민과 혼합하고, 클로로포름 상을 수집, 증발시켜 DOX 베이스를 제조하는 단계(a);
상기 (a) 단계에서 제조된 DOX 베이스를 DMSO에 용해시켜 DDW에 용해된 HSA-TPP와 혼합하여 혼합물을 만드는 단계 (b);
상기 (b) 단계의 혼합물에 초음파를 가하여 나노클러스터(nanocluster, NC)를 형성시키는 단계 (c);
상기 (c) 단계의 나노클러스터를 포함하는 용액으로부터 투석으로 잉여의 독소루비신을 제거하는 단계(d); 를 포함하는 독소루비신 흡착 피로인산티아민-알부민 나노클러스터(DOX/HSA-TPP NC)의 제조방법. - 메토트렉세이트를 DMSO에 용해시켜 DDW에 용해된 HSA-TPP와 혼합하여 혼합물을 만드는 단계 (a);
상기 (a) 단계의 혼합물에 초음파를 가하여 나노클러스터(nanocluster, NC)를 형성시키는 단계 (b);
상기 (b) 단계의 나노클러스터를 포함하는 용액으로부터 투석으로 잉여의 메토트렉세이트를 제거하는 단계(c); 를 포함하는 메토트렉세이트 흡착 피로인산티아민-알부민 나노클러스터(MTX/HSA-TPP NC)의 제조방법.
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| KR102154459B1 (ko) | 2007-03-07 | 2020-09-09 | 아브락시스 바이오사이언스, 엘엘씨 | 항암제로서 라파마이신 및 알부민을 포함하는 나노입자 |
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2022
- 2022-09-28 KR KR1020220123698A patent/KR20240044603A/ko unknown
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