KR20240041389A - Maleimide group-modified bead complex and thiol group-modifed nucleotide molecule for detection of nucleic acid molecules in biological samples and method of detecting nucleic acid using the same - Google Patents

Maleimide group-modified bead complex and thiol group-modifed nucleotide molecule for detection of nucleic acid molecules in biological samples and method of detecting nucleic acid using the same Download PDF

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KR20240041389A KR1020220119926A KR20220119926A KR20240041389A KR 20240041389 A KR20240041389 A KR 20240041389A KR 1020220119926 A KR1020220119926 A KR 1020220119926A KR 20220119926 A KR20220119926 A KR 20220119926A KR 20240041389 A KR20240041389 A KR 20240041389A
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Abstract

생물학적 샘플에서 하나 이상의 표적 핵산 분자를 검출하는 방법에 관한 것으로, 일 양상에 따른 생물학적 샘플에서 하나 이상의 표적 핵산 분자를 검출하는 방법에 의하면, 생물학적 샘플 내에서 효과적으로 복수의 표적 핵산 분자를 분리, 추출, 및 검출할 수 있고, 생물학적 샘플 내에 표적 핵산 분자가 존재하는지의 여부를 분석함으로써, 분석의 민감도를 향상시킬 수 있는 효과가 있다.Pertaining to a method for detecting one or more target nucleic acid molecules in a biological sample, the method for detecting one or more target nucleic acid molecules in a biological sample according to one aspect includes effectively separating and extracting a plurality of target nucleic acid molecules in the biological sample, And it has the effect of improving the sensitivity of the analysis by detecting and analyzing whether the target nucleic acid molecule exists in the biological sample.

Description

생물학적 샘플에서 핵산 분자를 검출하기 위한 말레이미드기가 수식된 비드복합체와 티올기가 수식된 NUCLEOTIDE 분자 및 이를 이용한 핵산을 검출하는 방법{MALEIMIDE GROUP-MODIFIED BEAD COMPLEX AND THIOL GROUP-MODIFED NUCLEOTIDE MOLECULE FOR DETECTION OF NUCLEIC ACID MOLECULES IN BIOLOGICAL SAMPLES AND METHOD OF DETECTING NUCLEIC ACID USING THE SAME}A bead complex modified with a maleimide group for detecting nucleic acid molecules in biological samples, a NUCLEOTIDE molecule modified with a thiol group, and a method for detecting nucleic acids using the same MOLECULES IN BIOLOGICAL SAMPLES AND METHOD OF DETECTING NUCLEIC ACID USING THE SAME}

생물학적 샘플에서 핵산 분자를 검출하기 위한 말레이미드기가 수식된 비드복합체와 티올기가 수식된 NUCLEOTIDE 분자 및 이를 이용한 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다. It relates to a maleimide group-modified bead complex for detecting nucleic acid molecules in biological samples, a thiol group-modified NUCLEOTIDE molecule, and a method for detecting nucleic acids using the same.

검체 내 핵산을 추출하는 방식은 크게 컬럼(Column) 방식과 자성 비드(Magnetic Bead)를 이용한 방식으로 나뉜다. 컬럼을 이용한 정제는 검체 내 존재하는 세포를 용해(Lysis) 한 이후 컬럼을 이용하여 포집한 후, 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통해 검사하는 방식이다. 자성 비드를 이용한 정제는 자성 비드의 표면전하를 이용하여 핵산과 전하-전하 상호작용(charge-charge interaction)을 통해 원하는 핵산을 포집 및 정제하는 방식이다. 하지만 이러한 방식들은 검체 내에 다양한 단백질이나 inhibitor 또는 genomic DNA, RNA 또한 비특이적으로 포집하기 때문에 추가적인 정제과정이 필요하다. 또한 다양한 inhibitor로 인하여 PCR 반응을 수행하여도 정확도가 낮은 편이다. Methods for extracting nucleic acids from samples are largely divided into column methods and methods using magnetic beads. Purification using a column is a method of lysing the cells present in the sample, collecting them using a column, and then testing them through polymerase chain reaction (PCR). Purification using magnetic beads is a method of capturing and purifying desired nucleic acids through charge-charge interaction with nucleic acids using the surface charge of magnetic beads. However, these methods require additional purification processes because they non-specifically capture various proteins, inhibitors, genomic DNA, and RNA within the sample. In addition, the accuracy of the PCR reaction is low due to various inhibitors.

이를 극복하기 위하여, DNA 특정서열이 원하는 target DNA와 hybridization하는 것을 응용하여, Solution-based hybridization 방법이 연구되었다. Solution-based hybridization 방법은 주로 avidin-biotin이 특이적인 결합을 하는 것을 응용한다. 검출하고자 하는 특정 유전자에 상보적인 nucleotide의 말단에 Biotin 작용기를 붙이고, 검체 내 특정 유전자와 혼성화시키고, strepavidin이 표면처리된 자성비드에 결합시켜 특정 DNA만 검출하는 방식이다. 이 방식은 기존 방식에 비해 더 많은 양의 DNA가 필요하고 반응에 소요되는 시간이 길다는 단점이 있다. 또한 streptavidin이 표면처리된 비드는 기존의 비드에 비해 가격이 10-20 배 이상 비싼 단점이 있다.To overcome this problem, solution-based hybridization methods have been studied by applying hybridization of specific DNA sequences to desired target DNA. Solution-based hybridization method mainly applies the specific binding of avidin-biotin. This method detects only specific DNA by attaching a Biotin functional group to the end of a nucleotide complementary to a specific gene to be detected, hybridizing it with a specific gene in the sample, and binding it to magnetic beads surface-treated with strepavidin. This method has the disadvantage of requiring a larger amount of DNA and requiring a longer reaction time compared to existing methods. Additionally, beads surface-treated with streptavidin have the disadvantage of being 10 to 20 times more expensive than conventional beads.

대한민국공개특허공보 제10-2009-0107927호Republic of Korea Patent Publication No. 10-2009-0107927

일 양상은 생물학적 샘플에서 핵산 분자를 특이적으로 포집 및 정제하는 방법으로서, 티올기가 수식된 올리고-뉴클레오타이드를 생물학적 샘플에 첨가하여 표적 핵산 분자와 혼성화시키는 단계; 및 말레이미드기가 수식된 비드복합체를 상기 티올기가 수식된 올리고뉴클레오타이드와 결합시키는 단계;를 포함하는 표적 핵산 분자를 추출 또는 검출하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.One aspect is a method for specifically capturing and purifying nucleic acid molecules from a biological sample, comprising adding an oligo-nucleotide modified with a thiol group to the biological sample and hybridizing it with a target nucleic acid molecule; The object is to provide a method for extracting or detecting a target nucleic acid molecule comprising a step of combining the maleimide group-modified bead complex with the thiol group-modified oligonucleotide.

다른 양상은 생물학적 샘플 내에 존재하는 핵산 분자를 특이적으로 포집 및 정제하여 효과적으로 검출할 수 있는 비드 복합체의 제조방법을 제공하고자 하는 것이다.Another aspect is to provide a method for producing a bead complex that can effectively detect nucleic acid molecules present in a biological sample by specifically capturing and purifying them.

다른 양상은 비드 복합체를 이용하여 타액 및 소변을 포함한 생물학적 샘플 내의 표적 핵산 분자를 검출하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.Another aspect seeks to provide a method for detecting target nucleic acid molecules in biological samples, including saliva and urine, using a bead complex.

다른 양상은 비드 복합체를 이용하여 NGS library에 필요한 capture probe 방식을 대체하는 방법을 제공하는 것이다.Another aspect is to provide a method to replace the capture probe method required for NGS libraries using bead complexes.

다른 양상은 Sandwich hybridization을 이용한 colorimetric 검사에 제공하는 것이다. Another aspect is to provide colorimetric testing using sandwich hybridization.

다른 양상은 말레이미드기가 수식된 비드복합체 및 티올기가 수식된 올리고-뉴클레오타이드를 포함하는 생물학적 샘플에서 하나 이상의 표적 핵산 분자를 추출 또는 검출하기 위한 핵산 추출 또는 검출용 키트를 제공하고자 하는 것이다.Another aspect is to provide a nucleic acid extraction or detection kit for extracting or detecting one or more target nucleic acid molecules from a biological sample containing a bead complex modified with a maleimide group and an oligo-nucleotide modified with a thiol group.

일 양상은 생물학적 샘플에서 하나 이상의 표적 핵산 분자를 추출 또는 검출하는 방법으로서,One aspect is a method for extracting or detecting one or more target nucleic acid molecules from a biological sample, comprising:

티올기가 수식된 올리고-뉴클레오타이드를 생물학적 샘플에 첨가하여 표적 핵산 분자와 혼성화시키는 단계; 및Adding an oligo-nucleotide modified with a thiol group to a biological sample and hybridizing it with a target nucleic acid molecule; and

말레이미드기가 수식된 비드복합체를 상기 티올기가 수식된 올리고뉴클레오타이드와 결합시키는 단계;combining the maleimide group-modified bead complex with the thiol group-modified oligonucleotide;

를 포함하는 표적 핵산 분자를 추출 또는 검출하는 방법을 제공한다.A method for extracting or detecting a target nucleic acid molecule comprising a is provided.

일 구체예에 있어서, 상기 말레이미드기가 수식된 비드복합체는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 것일 수 있다:In one embodiment, the maleimide group-modified bead complex may have the structure of Formula 1 below:

[화학식 1][Formula 1]

, ,

상기 식에서 X는 수소 또는 이고, 적어도 하나의 X는 이고,In the above formula, X is hydrogen or , and at least one ego,

상기 식에서 R1은 직접 결합 또는 C1-C20 지방족 탄화수소기이고,In the above formula, R 1 is a direct bond or a C 1 -C 20 aliphatic hydrocarbon group,

상기 식에서 R2는 C2-C20 지방족 탄화수소기이고,In the above formula, R 2 is a C 2 -C 20 aliphatic hydrocarbon group,

상기 식에서 n1은 적어도 1 이상의 정수, 예를 들면, 1 내지 100,000, 1 내지 10,000, 1 내지 1,000, 1 내지 100, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20 또는 1 내지 10의 정수이고,In the above formula, n 1 is an integer of at least 1, for example, 1 to 100,000, 1 to 10,000, 1 to 1,000, 1 to 100, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 30, 1 to 20, or 1 to 10. It is an integer,

R1 왼쪽의 별표는 비드 표면에 연결되는 부위를 나타낸다.The asterisk to the left of R 1 indicates the site connected to the bead surface.

일 구체예에 있어서, 상기 말레이미드기가 수식된 비드복합체는 하기 화학식 2의 구조를 갖는 것일 수 있다:In one embodiment, the maleimide group-modified bead complex may have the structure of Formula 2 below:

[화학식 2][Formula 2]

상기 식에서 R1은 직접 결합 또는 C1-C20 지방족 탄화수소기이고,In the above formula, R 1 is a direct bond or a C 1 -C 20 aliphatic hydrocarbon group,

상기 식에서 R2는 C2-C20 지방족 탄화수소기이고,In the above formula, R 2 is a C 2 -C 20 aliphatic hydrocarbon group,

R1 왼쪽의 별표는 비드 표면에 연결되는 부위를 나타낸다.The asterisk to the left of R 1 indicates the site connected to the bead surface.

화학식 1 및 2에서 R1은 직접 결합이거나, C1-C20 알킬기, C2-C20 알케닐기, C2-C20 알키닐기 및 C1-C20 알킬 에테르기로 구성되는 군에서 선택되는 지방족 탄화수소기일 수 있다. 일 실시예에 있어서, 화학식 1 및 2의 R1을 구성하는 지방족 탄화수소기는 C1-C10 알킬기, C2-C20 알케닐기, C2-C20 알키닐기 및 C1-C20 알킬 에테르기로 구성되는 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 화학식 1 및 2에서 R2는 C2-C20 알킬렌기(alkylene group), 예를 들어 C2-10 알킬렌기 또는 C5-10 알킬렌기 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In Formulas 1 and 2, R 1 is a direct bond or an aliphatic selected from the group consisting of C 1 -C 20 alkyl group, C 2 -C 20 alkenyl group, C 2 -C 20 alkynyl group, and C 1 -C 20 alkyl ether group. It may be a hydrocarbon group. In one embodiment, the aliphatic hydrocarbon group constituting R 1 of Formulas 1 and 2 is a C 1 -C 10 alkyl group, a C 2 -C 20 alkenyl group, a C 2 -C 20 alkynyl group, and a C 1 -C 20 alkyl ether group. It may be selected from the group consisting of, but is not limited to this. Additionally, in Formulas 1 and 2, R 2 may be a C 2 -C 20 alkylene group, for example, a C 2 - 10 alkylene group or a C 5 - 10 alkylene group, but is not limited thereto.

일 실시예에 있어서, 상기 R2는 C2-C10 알킬렌기일 수 있다.In one embodiment, R 2 may be a C 2 -C 10 alkylene group.

일 실시예에 있어서, 상기 비드는 무기 소재로 이루어질 수 있다.In one embodiment, the beads may be made of an inorganic material.

상기 무기 소재는 산화철, 실리카, 금, 은, 구리 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택될 수 있다.The inorganic material may be selected from the group consisting of iron oxide, silica, gold, silver, copper, and combinations thereof.

일 실시예에 있어서, 상기 비드는 유기 소재로 이루어질 수 있다.In one embodiment, the beads may be made of an organic material.

상기 유기 소재는 폴리스틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 플루란, 플루란 아세테이트, 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 키토산, 이들의 공중합체 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택될 수 있다.The organic material may be selected from the group consisting of polystyrene, polypropylene, polyethylene, pullulan, pullulan acetate, cellulose, hydroxypropylmethylcellulose, chitosan, copolymers thereof, and combinations thereof.

일 실시예에 있어서, 상기 비드는 자성화된 비드일 수 있다.In one embodiment, the bead may be a magnetized bead.

상기 비드는 직경 0.1 - 100 μm, 바람직하게는 0.2 - 10 μm, 더욱 바람직하게는 0.4 - 1 μm일 수 있다.The beads may have a diameter of 0.1 - 100 μm, preferably 0.2 - 10 μm, and more preferably 0.4 - 1 μm.

상기 자성화된 비드의 자성화 수치는 0.1 - 1,000 emu/g, 바람직하게는 1 - 100 emu/g, 더욱 바람직하게는 5 - 10 emu/g일 수 있다.The magnetization value of the magnetized beads may be 0.1 - 1,000 emu/g, preferably 1 - 100 emu/g, and more preferably 5 - 10 emu/g.

일 실시예에 있어서, 상기 비드는 그 형태에 있어서 제한이 없으며, 예를 들어, 구형, 로드형(막대형), 와이어형(선형), 평면형, 무정형 등 어떠한 형태라도 가능하다.In one embodiment, the bead is not limited in its shape, and may be of any shape, for example, spherical, rod-shaped (rod-shaped), wire-shaped (linear), flat, amorphous, etc.

일 실시예에 있어서, 상기 비드는 아미노기, 티올기, 알데하이드기, 카르복시기, 하이드록시기, 말레이미드기 또는 C2-C10 알케닐기로 개질된 것일 수 있다.In one embodiment, the beads may be modified with an amino group, a thiol group, an aldehyde group, a carboxyl group, a hydroxy group, a maleimide group, or a C 2 -C 10 alkenyl group.

일 실시예에 있어서, 상기 축합은 아마이드 결합, 포름아마이드 결합, 에스테르 결합, 티오에스테르 결합, 다이설파이드 결합, 에테르 결합 및 글리코사이드 결합 중에서 선택되는 어느 하나의 결합을 통해 축합 될 수 있다.In one embodiment, the condensation may be performed through any one bond selected from an amide bond, a formamide bond, an ester bond, a thioester bond, a disulfide bond, an ether bond, and a glycoside bond.

일 구체예에 있어서, 상기 티올기가 수식된 올리고-뉴클레오타이드는 하기 화학식 3의 구조를 갖는 것일 수 있다:In one embodiment, the oligo-nucleotide modified with the thiol group may have the structure of Formula 3 below:

[화학식 3][Formula 3]

또는 or

상기 식에서 n2은 적어도 1 이상의 정수, 예를 들면, 1 내지 100, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20 또는 1 내지 10의 정수이고,In the above formula, n 2 is an integer of at least 1, for example, 1 to 100, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 30, 1 to 20, or 1 to 10,

상기 식에서 는 올리고-뉴클레오타이드이다.In the above equation is an oligo-nucleotide.

상기 혼성화 및 결합은 하나의 수용액에서 수행되는 것일 수 있다.The hybridization and binding may be performed in one aqueous solution.

상기 수용액의 pH는 6.5 내지 7.5일 수 있다.The pH of the aqueous solution may be 6.5 to 7.5.

상기 수용액은 MES buffer, Bis-Tris, ADA, ACES, PIPES, MOPSO, TES, HEPES 및 TE buffer로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 버퍼를 포함할 수 있다.The aqueous solution may contain one or more buffers selected from the group consisting of MES buffer, Bis-Tris, ADA, ACES, PIPES, MOPSO, TES, HEPES, and TE buffer.

상기 표적 핵산 분자는 암세포 또는 병원체에서 유래할 수 있으며, DNA 또는 RNA 형태일 수 있다. The target nucleic acid molecule may be derived from a cancer cell or pathogen, and may be in the form of DNA or RNA.

예를 들어, 상기 병원체는 병원성 바이러스 및 병원성 박테리아를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.For example, the pathogens may include, but are not limited to, pathogenic viruses and pathogenic bacteria.

일 실시예에 있어서, 상기 병원성 바이러스는 EBV(Epstein-Barr virus), HAV(hepatitis A virus), HBV(hepatitis B virus), HCV(hepatitis C virus), HDV(hepatitis Dvirus), HEV(hepatitis E virus), 한탄바이러스(Hantaan virus), CMV(cytomegalovirus), HIV(human immunodeficiency virus), 독감 바이러스(influenza virus), HPV(human papilloma virus), 소아마비 바이러스(poliovirus), 에볼라 바이러스(ebola virus), 로타바이러스(rotavirus), 댕기열바이러스(dengue virus), 웨스트나일 바이러스(West Nile virus), 황열바이러스(yellow fever virus), 아데노바이러스(adenovirus), 일본 뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), BK 바이러스(BK virus), 천 연두 바이러스(smallpox virus), 지카 바이러스(Zika virus), 중증열성혈소판감소증후근 바이러스 (SFTS virus) 및 HSV(herpes simplex virus)로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.In one embodiment, the pathogenic virus is Epstein-Barr virus (EBV), hepatitis A virus (HAV), hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), hepatitis D virus (HDV), and hepatitis E virus (HEV). ), Hantaan virus, CMV (cytomegalovirus), HIV (human immunodeficiency virus), influenza virus, HPV (human papilloma virus), poliovirus, Ebola virus, rotavirus (rotavirus), dengue virus, West Nile virus, yellow fever virus, adenovirus, Japanese encephalitis virus, BK virus, It may be selected from the group consisting of smallpox virus, Zika virus, severe fever with thrombocytopenia syndrome virus (SFTS virus), and herpes simplex virus (HSV).

일 실시예에 있어서, 상기 병원성 박테리아는 폐렴막대균(Klebsiella penumoniae), 아시네토박터(Acinetobacter baumannii),　녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 엔테로박터(Enterobacter spp.), 살모넬라균(salmonella), 이질균(shigella), 리케차(R. rickettsii), 대장균(E. coli), 콜레라균(V. cholerae), 페스트균(Y. pestis), 임질구균(N. gonorrhoeae), 수막염균(N. meningitidis), 나선상균(spirochaeta), 포도상구균(staphylococcus), 연쇄상구균(streptococcus),　폐렴균(pneumococcus), 나병균(M. leprae), 디프테리아균(C. diphtheriae), 파상풍균(C. tetani), 탄저균(B. anthracis), 방선균(actinobacteria) 및 고초균(B. subtilis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.In one embodiment, the pathogenic bacteria include Klebsiella penumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp., salmonella, and shigella. , R. rickettsii, E. coli, V. cholerae, Y. pestis, N. gonorrhoeae, N. meningitidis, spirochaeta ), staphylococcus, streptococcus, pneumococcus, M. leprae, C. diphtheriae, C. tetani, B. anthracis, actinomycetes It may be selected from the group consisting of actinobacteria and B. subtilis.

예를 들어, 상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있다.For example, the cancer may be a solid tumor or a hematological cancer.

일 실시예에 있어서, 상기 고형암은 폐암, 간암, 식도암, 위암, 대장암, 소장암, 췌장암, 흑색종, 유방암, 구강암, 뇌종양, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 자궁경부암, 육종, 전립선암, 요도암, 방광암, 고환암, 피부암, 건선 및 섬유선종으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 암은 췌장암 또는 자궁경부암일 수 있다.In one embodiment, the solid cancer includes lung cancer, liver cancer, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, small intestine cancer, pancreatic cancer, melanoma, breast cancer, oral cancer, brain tumor, thyroid cancer, parathyroid cancer, kidney cancer, cervical cancer, sarcoma, prostate cancer, It may be selected from the group consisting of urethral cancer, bladder cancer, testicular cancer, skin cancer, psoriasis, and fibroadenoma. In one embodiment, the cancer may be pancreatic cancer or cervical cancer.

일 실시예에 있어서, 상기 혈액암은 급성골수구성백혈병(acute myeloid leukemia), 급성림프구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia), 급성단구성백혈병(acute monocytic leukemia), 호지킨림프종(Hodgkin's lymphoma), 또는 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. In one embodiment, the blood cancer is acute myeloid leukemia, acute lymphoblastic leukemia, acute monocytic leukemia, Hodgkin's lymphoma, or It may be selected from the group consisting of non-Hodgkin's lymphoma.

상기 표적 핵산 분자는 암의 발병 여부 또는 병원체 관련 질환의 감염 여부를 나타내는 마커로서의 핵산 분자일 수 있다. 일례로, 암 또는 종양은 위암, 폐암, 간암, 대장암, 소장암, 피부암, 췌장암, 전립선암을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 선택적인 측면에서, 암 또는 종양에서 유래하는 표적 핵산 분자는 종양 항원 또는 이의 단편, 이들의 변이체 또는 유도체인 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자일 수 있다.The target nucleic acid molecule may be a nucleic acid molecule that serves as a marker indicating the occurrence of cancer or infection with a pathogen-related disease. For example, cancer or tumor includes, but is not limited to, stomach cancer, lung cancer, liver cancer, colon cancer, small intestine cancer, skin cancer, pancreatic cancer, and prostate cancer. In an optional aspect, the target nucleic acid molecule derived from a cancer or tumor may be a nucleic acid molecule encoding a protein or peptide that is a tumor antigen or fragment thereof, variant or derivative thereof.

일례로, 암 또는 종양에서 유래하는 표적 핵산 분자는 5T4, 707-AP, 9D7, AFP, AlbZIP HPG1, 알파-5-베타-1-인테그린, 알파-5-베타-6-인테그린, 알파-액티닌-4/m, 알파-메틸아실-코엔자임 A 라세메이즈, ART-4, ARTC1/m, B7H4, BAGE-1, BCL-2, bcr/abl, 베타-카테닌/m, BING-4, BRCA1/m, BRCA2/m, CA 15-3/CA 27-29, CA 19-9, CA72-4, CA125, 칼레티쿨린(calreticulin), CAMEL, CASP-8/m, 카뎁신 B(cathepsin B), 카뎁신 L, CD19, CD20, CD22, CD25, CDE30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CEA, CLCA2, CML28, CML66, COA-1/m, 코액토신-유사 단백질, 콜라주(collage) XXIII, COX-2, CT-9/BRD6, Cten, 사이클린 B1, 사이클린 D1, cyp-B, CYPB1, DAM-10, DAM-6, DEKCAN, EFTUD2/m, EGFR, ELF2/m, EMMPRIN, EpCam, EphA2, EphA3, ErbB3, ETV6-AML1, EZH2, FGF-5, FN, Frau-1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE7b, GAGE-8, GDEP, GnT-V, gp100, GPC3, GPNMB/m, HAGE, HAST-2, 헵신, Her2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A*0201-R17I, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HNE, 호메오박스 NKX3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-L1, HPV-E6, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT, iCE, IGF-1R, IL-13Ra2, IL-2R, IL-5, 미숙 라미닌 수용체, 칼리크레인(kallikrein)-2, 크레인-4, Ki67, KIAA0205, KIAA0205/m, KK-LC-1, K-Ras/m, LAGE-A1, LDLR-FUT, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2, 맘마글로빈(mammaglobin) A, MART-1/멜란-A, MART-2, MART-2/m, 기질 단백질(matrix protein) 22, MC1R, M-CSF, ME1/m, 메소텔린(mesothelin), MG50/PXDN, MMP11, MN/CA IX-항원, MRP-3, MUC-1, MUC-2, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, 미오신 클래스 I/m, NA88-A, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제-V, 네오-PAP, 네오-PAP/m, NFYC/m, NGEP, NMP22, NPM/ALK, N-Ras/m, NSE, NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1, OFA-iLRP, OGT, OGT/m, OS-9, OS-9/m, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, p15, p190 마이너 bcr-abl, p53, p53/m, PAGE-4, PAI-1, PAI-2, PAP, PART-1, PATE, PDEF, Pim-1-키나제, Pin-1, Pml/PAR알파, POTE, PRAME, PRDX5/m, 프로스테인, 프로테이나제-3, PSA, PSCA, PSGR, PSM, PSMA, PTPRK/m, RAGE-1, RBAF600/m, RHAMM/CD168, RU1, RU2, S-100, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SCC, SIRT2/m, Sp17, SSX-1, SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1, STEAP-1, 서바이빈, 서바이빈-2B, SYT-SSX-1, SYT-SSX-2, TA-90, TAG-72, TARP, TEL-AML1, TGF베타, TGF베타RII, TGM-4, TPI/m, TRAG-3, TRG, TRP-1, TRP-2/6b, TRP/INT2, TRP-p8, 티로시나제, UPA, VEGFR1, VEGFR-2/FLK-1, WT1 및 림프성 혈구의 면역글로불린 유전자형 또는 림프구 혈구의 T 세포 수용체 유전자형, 이들의 단편, 이들의 변이체 또는 이들의 유도체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 전사체(transcript) 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.For example, target nucleic acid molecules derived from cancer or tumors include 5T4, 707-AP, 9D7, AFP, AlbZIP HPG1, alpha-5-beta-1-integrin, alpha-5-beta-6-integrin, and alpha-actinin. -4/m, alpha-methylacyl-coenzyme A racemase, ART-4, ARTC1/m, B7H4, BAGE-1, BCL-2, bcr/abl, beta-catenin/m, BING-4, BRCA1/m , BRCA2/m, CA 15-3/CA 27-29, CA 19-9, CA72-4, CA125, calreticulin, CAMEL, CASP-8/m, cathepsin B, CA Debsin L, CD19, CD20, CD22, CD25, CDE30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CEA, CLCA2, CML28, CML66, COA-1/m , coactosin-like protein, collage XXIII, COX-2, CT-9/BRD6, Cten, cyclin B1, cyclin D1, cyp-B, CYPB1, DAM-10, DAM-6, DEKCAN, EFTUD2/ m, EGFR, ELF2/m, EMMPRIN, EpCam, EphA2, EphA3, ErbB3, ETV6-AML1, EZH2, FGF-5, FN, Frau-1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE- 4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE7b, GAGE-8, GDEP, GnT-V, gp100, GPC3, GPNMB/m, HAGE, HAST-2, hepsin, Her2/neu, HERV-K-MEL, HLA- A*0201-R17I, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HNE, homeobox NKX3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-L1, HPV-E6 , HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT, iCE, IGF-1R, IL-13Ra2, IL-2R, IL-5, immature laminin receptor, kallikrein-2, crane-4, Ki67 , KIAA0205, KIAA0205/m, KK-LC-1, K-Ras/m, LAGE-A1, LDLR-FUT, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9 , MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-C1, MAGE -C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2, mammaglobin A, MART-1/Melan- A, MART-2, MART-2/m, matrix protein 22, MC1R, M-CSF, ME1/m, mesothelin, MG50/PXDN, MMP11, MN/CA IX-antigen, MRP -3, MUC-1, MUC-2, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, myosin class I/m, NA88-A, N-acetylglucosaminyltransferase-V, Neo-PAP, Neo-PAP/m, NFYC/m, NGEP, NMP22, NPM/ALK, N-Ras/m, NSE, NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1, OFA-iLRP, OGT, OGT/m, OS-9, OS-9/m, osteocalcin, osteopontin, p15, p190 minor bcr-abl, p53, p53/m, PAGE-4, PAI-1, PAI-2, PAP, PART- 1, PATE, PDEF, Pim-1-kinase, Pin-1, Pml/PARalpha, POTE, PRAME, PRDX5/m, Prostein, Proteinase-3, PSA, PSCA, PSGR, PSM, PSMA, PTPRK /m, RAGE-1, RBAF600/m, RHAMM/CD168, RU1, RU2, S-100, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SCC, SIRT2/m, Sp17, SSX-1, SSX -2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1, STEAP-1, Survivin, Survivin-2B, SYT-SSX-1, SYT-SSX-2, TA-90, TAG-72 , TARP, TEL-AML1, TGFbeta, TGFbetaRII, TGM-4, TPI/m, TRAG-3, TRG, TRP-1, TRP-2/6b, TRP/INT2, TRP-p8, tyrosinase, UPA, Nucleotide sequences encoding VEGFR1, VEGFR-2/FLK-1, WT1 and immunoglobulin genotypes of lymphoid blood cells or T cell receptor genotypes of lymphoid blood cells, fragments thereof, variants or derivatives thereof, or transcripts thereof ( transcript) sequence, but is not limited to this.

상기 표적 핵산 분자는 무세포 핵산(Cell free DNA, cfDNA)일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "cfDNA"는 세포핵 안에 존재하지 않고 혈액에 떠돌아다니는 DNA의 조각을 의미한다. 상기 cfDNA는 암세포 또는 병원체에서 유래된 것일 수 있다. 또한, 혈액, 혈장 또는 소변 등과 같은 체액에서는 종양 세포 또는 병원체에서 유래된 cfDNA를 발견할 수 있다.The target nucleic acid molecule may be cell free DNA (cfDNA). The term “cfDNA” used in the present invention refers to a piece of DNA that is not present in the cell nucleus but is floating around in the blood. The cfDNA may be derived from cancer cells or pathogens. Additionally, cfDNA derived from tumor cells or pathogens can be found in body fluids such as blood, plasma, or urine.

상기 올리고-뉴클레오타이드는 20 내지 100개의 뉴클레오타이드로 이루어질 수 있다.The oligo-nucleotide may consist of 20 to 100 nucleotides.

상기 올리고-뉴클레오타이드는 프라이머일 수 있다.The oligo-nucleotide may be a primer.

본 발명에서 사용되는 용어 "프라이머"는 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에서 발생하는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오타이드로부터 폴리뉴클레오타이드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 상기 프라이머는 무세포 핵산과 상보적으로 결합하는 것일 수 있다.As used herein, the term "primer" refers to a starting point for the stepwise synthesis of a polynucleotide from a mononucleotide by hybridizing to a complementary RNA or DNA target polynucleotide and, for example, by the action of a nucleotidyltransferase that occurs in a polymerase chain reaction. refers to an oligonucleotide that functions as a Primers used in the present invention may include naturally occurring dNMP (i.e., dAMP, dGMP, dCMP, and dTMP), modified nucleotides, or non-natural nucleotides. Additionally, primers may also contain ribonucleotides. The primer may bind complementary to cell-free nucleic acid.

상기 생물학적 샘플은 소변, 타액, 객담, 혈액 및 비인두 도말물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 생물학적 샘플 내에 존재하는 핵산 분자가 DNA 형태인 경우, 티올기가 수식된 올리고-뉴클레오타이드와 혼성화시키기 전에 생물학적 샘플 내의 핵산 분자를 단일 사슬 핵산 분자로 변형시킬 수 있다.The biological samples may include, but are not limited to, urine, saliva, sputum, blood, and nasopharyngeal swab. If the nucleic acid molecules present in the biological sample are in the form of DNA, the nucleic acid molecules in the biological sample may be transformed into single-stranded nucleic acid molecules prior to hybridization with oligo-nucleotides modified with thiol groups.

예를 들어, 단일 사슬 핵산 분자로의 변형은 생물학적 샘플에 열을 가하여 수행될 수 있고, 이 경우 열처리는 70 내지 100℃에서 2 내지 10분간 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.For example, transformation into a single-chain nucleic acid molecule may be performed by applying heat to a biological sample, in which case the heat treatment may be performed at 70 to 100° C. for 2 to 10 minutes, but is not limited thereto.

생물학적 샘플 내에는 표적 핵산 분자 이외에도, 다양한 비표적 핵산 분자가 존재할 수 있다. 본 발명에 따른 비드 복합체의 외측에는 티올기와 반응할 수 있는 말레이미드기가 존재하고 있다. 따라서, 표적 핵산 분자가 존재하는 생물학적 샘플에 본 발명에 따른 티올기가 수식된 올리고-뉴클레오타이드 분자를 혼성화시킨 후, 비드복합체와 반응시키면, 티올기와 말레이미드기의 결합으로 인해 올리고-뉴클레오타이드와 혼성화된 표적 핵산 분자만이 비드 복합체에 결합한다. 반면, 생물학적 샘플 내에 존재하는 비표적 핵산 분자들은 본 발명에 따른 비드 복합체에 결합하지 못하고, 생물학적 샘플 내에 자유 핵산 분자(free nucleic acid molecule)로 잔존한다.In addition to target nucleic acid molecules, various non-target nucleic acid molecules may exist in a biological sample. On the outside of the bead complex according to the present invention, there is a maleimide group that can react with a thiol group. Therefore, when an oligo-nucleotide molecule modified with a thiol group according to the present invention is hybridized to a biological sample containing a target nucleic acid molecule and then reacted with a bead complex, the target hybridized with the oligo-nucleotide is formed due to the bond between the thiol group and the maleimide group. Only nucleic acid molecules bind to the bead complex. On the other hand, non-target nucleic acid molecules present in the biological sample fail to bind to the bead complex according to the present invention and remain as free nucleic acid molecules in the biological sample.

일 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 비드가 자성화된 비드로 이루어진 경우, 자석을 이용하여 표적 핵산과 올리고-뉴클레오타이드가 결합된 비드 복합체를 생물학적 샘플 내에 잔존하는 비표적 핵산 분자와 분리할 수 있다.In one embodiment, when the bead according to the present invention is made of a magnetized bead, a bead complex combining a target nucleic acid and an oligonucleotide can be separated from non-target nucleic acid molecules remaining in the biological sample using a magnet. .

일 실시예에 있어서, 상기 표적 핵산 분자를 검출하는 것은, 상기 올리고-뉴클레오타이드와 혼성화된 표적 핵산 분자를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 것일 수 있다.In one embodiment, detecting the target nucleic acid molecule may involve performing polymerase chain reaction (PCR) using the target nucleic acid molecule hybridized with the oligonucleotide as a template.

상기 중합효소연쇄반응은 실시간 중합효소연쇄반응일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 중합효소연쇄반응과 관련하여, 표적 핵산 분자와 올리고-뉴클레오타이드 이중 사슬 분리를 위한 열변성(denaturation), 결합(annealing) 및 중합 반응(polymerization)은 올리고-뉴클레오타이드 및 이에 특이적으로 결합하는 표적 핵산 분자의 조성 및 길이에 따라 적절하게 조정, 제어될 수 있다.The polymerase chain reaction may be a real-time polymerase chain reaction, but is not limited thereto. In relation to the polymerase chain reaction, heat denaturation, annealing, and polymerization for separating the target nucleic acid molecule and the oligo-nucleotide double chain are performed on the oligo-nucleotide and the target nucleic acid that specifically binds thereto. It can be appropriately adjusted and controlled depending on the composition and length of the molecule.

다른 양상은 말레이미드기가 수식된 비드복합체 및 티올기가 수식된 올리고-뉴클레오타이드를 포함하는 생물학적 샘플에서 하나 이상의 표적 핵산 분자를 추출 또는 검출하기 위한 핵산 추출 또는 검출용 키트를 제공한다.Another aspect provides a nucleic acid extraction or detection kit for extracting or detecting one or more target nucleic acid molecules from a biological sample comprising a bead complex modified with a maleimide group and an oligo-nucleotide modified with a thiol group.

상기 생물학적 샘플은 소변(urine), 타액, 객담, 혈액 및 비인두 도말물을 포함할 수 있다. The biological samples may include urine, saliva, sputum, blood, and nasopharyngeal swabs.

일 실시예에 있어서, 상기 키트는 상기 비드 복합체를 구성하는 상기 올리고-뉴클레오타이드에 특이적으로 결합한 표적 핵산 분자와, 핵산 중합 효소 및 핵산 중합 반응용 완충 용액을 포함하는 핵산 증폭 키트, 전기영동 키트 또는 차세대 염기서열분석(next generation sequencing) 키트일 수 있다. In one embodiment, the kit is a nucleic acid amplification kit, electrophoresis kit or It may be a next generation sequencing kit.

상기 키트는 비드 복합체를 구성하는 올리고-뉴클레오타이드에 특이적으로 결합한 표적 핵산 분자와, 핵산 중합 효소 및 핵산 증폭 반응용 완충액을 포함하는 핵산 증폭 키트일 수 있다. The kit may be a nucleic acid amplification kit containing a target nucleic acid molecule specifically bound to an oligonucleotide constituting a bead complex, a nucleic acid polymerase, and a buffer for a nucleic acid amplification reaction.

상기 핵산 증폭 반응용 완충액은 비드 복합체 및 핵산 중합 효소 이외에도, 디옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트(dNTP) 및/또는 뉴클레오타이드 트리포스페이트(NTP), 핵산 증폭 반응에 따른 증폭 산물의 존재 여부를 검출할 수 있도록 형광 물질 및/또는 방사선 동위원소 등으로 표지된(labeled) 탐침(probe) 및 중합 효소 안정화제 등과 같은 기능성 첨가제를 더욱 포함할 수 있다. In addition to the bead complex and nucleic acid polymerase, the buffer for the nucleic acid amplification reaction contains deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) and/or nucleotide triphosphate (NTP), a fluorescent substance to detect the presence of an amplification product according to the nucleic acid amplification reaction, and /Or it may further include functional additives such as a probe labeled with a radioisotope or the like and a polymerase stabilizer.

상기 중합 효소 안정화제는 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)이나, 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 글리코사미노글리칸, 풀루란, 알긴산, 카라기난, 아리비노갈락탄, 헤미셀룰로오스, 덱스트란, 키토산, 글리콜 키토산, 전분 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 다당류를 포함할 수 있다. 핵산 증폭 반응용 완충액 중에 중합 효소 안정화제의 함량은 0.01 내지 10%(w/v), 예를 들어 0.5 내지 5%(w/v) 또는 0.5 내지 3%(w/v)의 농도로 포함될 수 있다. 중합 효소 안정화제의 함량이 전술한 범위를 충족할 때, 핵산 증폭 반응이 효율적으로 이루어질 수 있다.The polymerase stabilizer is bovine serum albumin (BSA), cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methylcellulose, glycosaminoglycan, pullulan, alginic acid, carrageenan, arabinogalactan, and hemicellulose. , dextran, chitosan, glycol chitosan, starch, and combinations thereof. The content of the polymerase stabilizer in the buffer for nucleic acid amplification reaction may be included at a concentration of 0.01 to 10% (w/v), for example, 0.5 to 5% (w/v) or 0.5 to 3% (w/v). there is. When the content of the polymerase stabilizer satisfies the above-mentioned range, the nucleic acid amplification reaction can be carried out efficiently.

본 발명에서 사용되는 용어 "중합 효소(polymerase)"는 일반적으로 중합 반응을 촉매하는 물질을 의미한다. 중합 효소는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 도입에 의해 주형 가닥과 쌍-형성된 핵산 프라이머를 연장시키는데 사용될 수 있다. 중합 효소는 포스포디에스테르 결합의 생성을 통해서 한 번에 하나씩 주형 가닥에 부응하는 새로운 뉴클레오타이드를 첨가하여, 존재하는 뉴클레오타이드 사슬의 3' 말단을 연장시킴으로써 DNA의 새로운 가닥을 첨가할 수 있다. The term “polymerase” used in the present invention generally refers to a substance that catalyzes a polymerization reaction. Polymerases can be used to extend nucleic acid primers paired with a template strand by introduction of nucleotides or nucleotide analogs. Polymerases can add new strands of DNA by extending the 3' end of the existing nucleotide chain, adding new nucleotides corresponding to the template strand one at a time through the creation of phosphodiester bonds.

이러한 핵산 중합 효소는 해당 중합 효소를 이용하여 표적 핵산 분자의 증폭 반응이 수행될 수 있다면, 특별히 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 중합 효소는 DNA 중합 효소, RNA 중합 효소, 열안정성 중합 효소, 야생형 중합 효소 및 변형 중합 효소를 포함한다. 보다 구체적으로, 중합 효소는 E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우(Klenow) 단편", 박테리오파아지 T7 DNA 중합 효소, 박테리오파지 T4 DNA 중합 효소, 029 (phi29) DNA 중합 효소제, Taq 중합 효소, Tth 중합 효소, Tli 중합 효소, Pfu 중합 효소, Pwo 중합 효소, VENT 중합 효소, DEEPVENT 중합 효소, EXTaq 중합 효소, LA-Taq 중합 효소, Sso 중합 효소, Poc 중합 효소, Pab 중합 효소, Mth 중합 효소, ES4 중합 효소, Tru 중합 효소, Tac 중합 효소, Tne 중합 효소, Tma 중합 효소, Tea 중합 효소, Tih 중합 효소, Tfi 중합 효소, 플래티늄 Taq 중합 효소, Tbr 중합 효소, Tfl 중합 효소, Pfutubo 중합 효소, Pyrobest 중합 효소, Pwo 중합 효소, KOD 중합 효소, Bst 중합 효소, Sac 중합 효소, 3'에서 5'으로의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 중합 효소, 및 이의 변이체 및 유도체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일례로, 중합 효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소로써, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 및/또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.This nucleic acid polymerase is not particularly limited as long as the amplification reaction of the target nucleic acid molecule can be performed using the polymerase. More specifically, polymerases include DNA polymerase, RNA polymerase, thermostable polymerase, wild-type polymerase, and modified polymerase. More specifically, the polymerase is the "Klenow fragment" of E. coli DNA polymerase I, bacteriophage T7 DNA polymerase, bacteriophage T4 DNA polymerase, 029 (phi29) DNA polymerase, Taq polymerase, Tth. Polymerase, Tli polymerase, Pfu polymerase, Pwo polymerase, VENT polymerase, DEEPVENT polymerase, EXTaq polymerase, LA-Taq polymerase, Sso polymerase, Poc polymerase, Pab polymerase, Mth polymerase, ES4 Polymerase, Tru polymerase, Tac polymerase, Tne polymerase, Tma polymerase, Tea polymerase, Tih polymerase, Tfi polymerase, Platinum Taq polymerase, Tbr polymerase, Tfl polymerase, Pfutubo polymerase, Pyrobest polymerase Enzymes, including, but not limited to, Pwo polymerase, KOD polymerase, Bst polymerase, Sac polymerase, polymerases with 3' to 5' exonuclease activity, and variants and derivatives thereof. For example, polymerases are thermostable DNA polymerases that can be obtained from various bacterial species, including Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis , Thermis flavus , Thermococcus literalis and/or Pyrococcus furiosus (Pfu). However, it is not limited to this.

일 실시예에 있어서, 핵산 증폭 반응용 완충액에 중합 효소와, dNTP 및/또는 NTP는 프리믹스(premix) 형태로 상용화된 것을 사용할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 핵산 중합 효소와 dNTP (및/또는 NTP)는 핵산 증폭 반응용 완충액 중에 5 내지 40%(w/v), 예를 들어 10 내지 33%(w/v) 또는 15 내지 25%(w/v)의 함량으로 포함될 수 있다. In one embodiment, the polymerase, dNTP and/or NTP can be used in a buffer solution for nucleic acid amplification reaction in the form of a premix. In one embodiment, nucleic acid polymerase and dNTPs (and/or NTPs) are present at 5 to 40% (w/v), for example, 10 to 33% (w/v) or 15 to 25% (w/v) in the buffer for nucleic acid amplification reaction. It may be included in an amount of % (w/v).

핵산 증폭 반응용 완충액에는 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 및/또는 NTP 혼합물(ATP, CTP, GTP, TTP), 기타 핵산 증폭 반응 첨가제 및 핵산 중합효소 조인자를 포함할 수 있다. 핵산 증폭 반응을 수행할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 공급하는 것이 바람직할 수 있다. 핵산 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭 반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dNTP를 원하는 증폭 반응이 달성될 수 있을 정도로 반응액에 공급될 수 있다. The buffer for nucleic acid amplification reaction may include dNTP mixture (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) and/or NTP mixture (ATP, CTP, GTP, TTP), other nucleic acid amplification reaction additives, and nucleic acid polymerase cofactor. When performing a nucleic acid amplification reaction, it may be desirable to supply an excess amount of components necessary for the reaction to the reaction vessel. The excess amount of components required for a nucleic acid amplification reaction refers to an amount such that the amplification reaction is not substantially limited by the concentration of the components. Cofactors such as Mg 2+ and dNTPs can be supplied to the reaction solution to a degree that the desired amplification reaction can be achieved.

예를 들어, 핵산 증폭 반응에서 어닐링(annealing)은 표적 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 서열 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격한 조건 하에서 수행된다. 용어 어닐링 또는 프라이밍(priming)은 주형 핵산 분자에 올리고 뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 이에 따라 중합 효소가 뉴클레오타이드를 중합하여 주형 핵산 분자 또는 그 단편에서 상보적인 핵산 분자가 형성된다. 어닐링을 위한 엄격한 조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다. 예시적인 측면에서 핵산 증폭 반응용 완충액 중에 본 발명에 따른 비드 복합체(100)는 5 내지 40%(w/v), 예를 들어 5 내지 30%(w/v) 또는 5 내지 20%(w/v)의 농도로 포함될 수 있다. For example, in nucleic acid amplification reactions, annealing is performed under stringent conditions that enable specific binding between the nucleotide sequence of the target nucleic acid molecule and the primer sequence. The term annealing or priming refers to the apposition of an oligonucleotide or nucleic acid to a template nucleic acid molecule, whereby a polymerase polymerizes the nucleotides to form a complementary nucleic acid molecule in the template nucleic acid molecule or fragment thereof. The stringent conditions for annealing are sequence-dependent and vary depending on environmental variables. In an exemplary aspect, the bead complex 100 according to the present invention in the buffer for nucleic acid amplification reaction is 5 to 40% (w/v), for example, 5 to 30% (w/v) or 5 to 20% (w/). It may be included at a concentration of v).

필요한 경우, 핵산 증폭 반응용 완충액은 핵산 증폭 반응용 첨가제를 더욱 포함할 수 있다. 일례로, 핵산 증폭 반응용 첨가제는 만니톨(mannitol), 폴리에틸렌글리콜(예를 들어, PEG 10,000), 트레할로오스, 베타인 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택될 수 있다. 이때, 핵산 증폭 반응용 완충액 중에 상기 핵산 증폭 반응용 첨가제는 0.5 내지 30%(w/v), 예를 들어 0.5 내지 20%(w/v) 또는 1 내지 15%(w/v)의 농도로 첨가될 수 있다. If necessary, the buffer solution for the nucleic acid amplification reaction may further include additives for the nucleic acid amplification reaction. For example, the additive for nucleic acid amplification reaction may be selected from the group consisting of mannitol, polyethylene glycol (eg, PEG 10,000), trehalose, betaine, and combinations thereof. At this time, the additive for the nucleic acid amplification reaction in the buffer for the nucleic acid amplification reaction is at a concentration of 0.5 to 30% (w/v), for example, 0.5 to 20% (w/v) or 1 to 15% (w/v). may be added.

핵산 증폭 반응용 완충액은 핵산 증폭 반응을 위한 적절한 완충제를 포함할 수 있다. 완충제의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 유기산, 글리신, 히스티딘, 글루타메이트, 숙시네이트, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 트리스(예를 들어, 트리스-EDTA), HEPES(Hydroxyethyl Piperazine Ethane Sulfonic acid), 아미노산 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택될 수 있다. The buffer solution for the nucleic acid amplification reaction may contain an appropriate buffer for the nucleic acid amplification reaction. The type of buffer is not particularly limited, but includes organic acids, glycine, histidine, glutamate, succinate, phosphate, acetate, citrate, Tris (e.g., Tris-EDTA), HEPES (Hydroxyethyl Piperazine Ethane Sulfonic acid), amino acids and these. It may be selected from the group consisting of a combination of.

증폭된 표적 핵산 분자는 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 하나의 예시적인 측면에서, 표지 물질은 형광, 인광, 화학발광단 또는 방사성을 방출하는 물질일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일례로, 표지 물질은 풀루오레세인(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민(rhodamine), 리사민(lissamine) Cy-5 또는 Cy-3일 수 있다. The amplified target nucleic acid molecule can be labeled with a detectable label. In one exemplary aspect, the labeling material may be, but is not limited to, a fluorescent, phosphorescent, chemiluminescent, or radioactive material. For example, the labeling substance may be fluorescein, phycoerythrin, rhodamine, lissamine Cy-5 or Cy-3.

표적 핵산 분자를 증폭할 때, 올리고-뉴클레오타이드의 5'-말단 및/또는 3' 말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하고, 핵산 증폭 반응(예를 들어, 실시간 중합효소연쇄반응)을 수행하면, 표적 핵산이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 핵산 증폭 반응(예를 들어, 실시간 중합효소연쇄반응)을 수행할 때, P32 및/또는 S35 등과 같은 방사성 동위원소를 본 발명에 따른 핵산 증폭 반응용 완충액에 첨가하여, 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. When amplifying a target nucleic acid molecule, the 5'-end and/or 3' end of the oligo-nucleotide is labeled with Cy-5 or Cy-3, and a nucleic acid amplification reaction (e.g., real-time polymerase chain reaction) is performed. Then, the target nucleic acid can be labeled with a detectable fluorescent labeling substance. In addition, when performing a nucleic acid amplification reaction (for example, real-time polymerase chain reaction), radioactive isotopes such as P 32 and/or S 35 are added to the buffer solution for nucleic acid amplification reaction according to the present invention. Additionally, as the amplification product is synthesized, radioactivity may be incorporated into the amplification product and the amplification product may be radioactively labeled.

표지는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 수행될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 인광, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노-크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 신호(signal)을 제공한다The label can use various methods commonly practiced in the technical field to which the present invention pertains. For example, the nick translation method, the random priming method (Multiprime DNA labeling systems booklet, "Amersham" (1989)) and the kination method (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499 (1986)). It can be performed through . Labels are signals that can be detected by fluorescence, radioactivity, phosphorescence, color development, gravimetry, X-ray diffraction or absorption, magnetism, enzymatic activity, mass analysis, binding affinity, hybridization, high frequency, and nano-crystals. provides

핵산 증폭 반응, 예를 들어 중합효소연쇄반응(PCR)과 관련하여, 표적 핵산 분자와 올리고-뉴클레오타이드 이중 사슬 분리를 위한 열변성(denaturation), 결합(annealing) 및 중합 반응(polymerization)은 올리고-뉴클레오타이드(122) 및 이에 특이적으로 결합하는 표적 핵산 분자의 조성 및 길이에 따라 적절하게 조정, 제어될 수 있다.In relation to nucleic acid amplification reactions, such as polymerase chain reaction (PCR), heat denaturation, annealing, and polymerization for separation of the target nucleic acid molecule and the oligonucleotide duplex are performed on the oligonucleotide. (122) and can be appropriately adjusted and controlled depending on the composition and length of the target nucleic acid molecule that specifically binds to it.

생물학적 샘플 내에 존재할 수 있는 표적 핵산 분자를 증폭시킬 수 있다면, 핵산 증폭 반응은 특별히 한정되지 않는다. 일례로, 핵산 증폭 반응은, 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR), 역전사 반응(Reverse Transcription), 상보적 DNA 합성(Complementary DNA Synthesis), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction), 멀티플렉스 PCR, 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self-sustained sequence replication)), 타깃 폴리뉴클레오타이드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR, 루프-매개 등온 증폭(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP), 실시간 염기순서기반 증폭(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification, NASBA), 가닥 변위 증폭(Strand Displacement Amplification, SDA), 다중 변위 증폭(Multiple Displacement Amplification, MDA), 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification, RCA), 리가아제 연쇄반응(Ligase Chain Reaction, LCR), 헬리카제 의존형 증폭(Helicase Dependent Amplification, HDA), 분지-연장 증폭법(Ramification-extension Amplification Method, RAM), 전사 기반 증폭 시스템(in vitro transcription-based amplification system, TAS) 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 방법을 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.The nucleic acid amplification reaction is not particularly limited as long as it can amplify target nucleic acid molecules that may be present in the biological sample. For example, nucleic acid amplification reactions include Polymerase Chain Reaction (PCR), Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), and Real-Time PCR. , Reverse Transcription, Complementary DNA Synthesis, repair chain reaction, multiplex PCR, transcription-mediated amplification (TMA), self-sustaining sequence replication ( self-sustained sequence replication), selective amplification of target polynucleotide sequences, consensus sequence primed polymerase chain reaction (CP-PCR), random priming polymerase chain reaction Reaction (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR, Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP), Real-time Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA), Strand Displacement Amplification , SDA), Multiple Displacement Amplification (MDA), Rolling Circle Amplification (RCA), Ligase Chain Reaction (LCR), Helicase Dependent Amplification (HDA), A method selected from the group consisting of Ramification-extension Amplification Method (RAM), in vitro transcription-based amplification system (TAS), and combinations thereof may be used, but is not limited thereto. No.

일 실시예에 있어서, 표적 핵산 분자를 검출하기 위한 분석 키트는 전기영동 키트 또는 차세대 염기서열분석(next generation sequencing, NGS) 키트일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In one embodiment, the analysis kit for detecting target nucleic acid molecules may be an electrophoresis kit or a next generation sequencing (NGS) kit, but is not limited thereto.

일 구체예에 있어서, 상기 키트는 상기 말레이미드기가 수식된 비드복합체가 하기 화학식 1의 구조를 갖는 것인 키트일 수 있다:In one embodiment, the kit may be a kit in which the maleimide group-modified bead complex has the structure of Formula 1 below:

[화학식 1][Formula 1]

, ,

상기 식에서 X는 수소 또는 이고, 적어도 하나의 X는 이고,In the above formula, X is hydrogen or , and at least one ego,

상기 식에서 R1은 직접 결합 또는 C1-C20 지방족 탄화수소기이고,In the above formula, R 1 is a direct bond or a C 1 -C 20 aliphatic hydrocarbon group,

상기 식에서 R2는 C2-C20 지방족 탄화수소기이고,In the above formula, R 2 is a C 2 -C 20 aliphatic hydrocarbon group,

상기 식에서 n1은 1 내지 100,000의 정수이고,In the above formula, n 1 is an integer from 1 to 100,000,

R1 왼쪽의 별표는 비드 표면에 연결되는 부위를 나타낸다.The asterisk to the left of R 1 indicates the site connected to the bead surface.

일 구체예에 있어서, 상기 키트는 상기 말레이미드기가 수식된 비드복합체가 하기 화학식 2의 구조를 갖는 것인 키트일 수 있다:In one embodiment, the kit may be a kit in which the maleimide group-modified bead complex has the structure of Formula 2 below:

[화학식 2][Formula 2]

상기 식에서 R1은 직접 결합 또는 C1-C20 지방족 탄화수소기이고,In the above formula, R 1 is a direct bond or a C 1 -C 20 aliphatic hydrocarbon group,

상기 식에서 R2는 C2-C20 지방족 탄화수소기이고,In the above formula, R 2 is a C 2 -C 20 aliphatic hydrocarbon group,

R1 왼쪽의 별표는 비드 표면에 연결되는 부위를 나타낸다.The asterisk to the left of R 1 indicates the site connected to the bead surface.

일 구체예에 있어서, 상기 키트는 상기 티올기가 수식된 올리고-뉴클레오타이드는 하기 화학식 3의 구조를 갖는 것인 키트일 수 있다:In one embodiment, the kit may be a kit in which the thiol group-modified oligo-nucleotide has the structure of Formula 3 below:

[화학식 3][Formula 3]

또는 or

상기 식에서 n2은 1 내지 100의 정수이고,In the above formula, n 2 is an integer from 1 to 100,

상기 식에서 는 올리고-뉴클레오타이드이다.In the above equation is an oligo-nucleotide.

본 발명에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산 분자"는 교환가능하게 사용되며, 임의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체(polymer)를 지칭하고 DNA (예컨대 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함한다. 핵산 분자의 구성 단위인 "뉴클레오타이드"는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 그 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소(polymerase)에 의해, 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 당 또는 염기가 변형된 유사체 (analogue), 예컨대 메틸화 뉴클레오타이드 및 그 유사체를 포함할 수 있다.As used herein, the terms “polynucleotide” or “nucleic acid molecule” are used interchangeably, refer to a polymer of nucleotides of any length, and generically include DNA (e.g., cDNA) and RNA molecules. “Nucleotide,” a structural unit of a nucleic acid molecule, refers to deoxyribonucleotides, ribonucleotides, modified nucleotides or bases, and/or analogs thereof, or incorporated into polymers by DNA or RNA polymerase or by synthetic reactions. It can be any substrate that can be used. Polynucleotides may include modified nucleotides, analogues with modified sugars or bases, such as methylated nucleotides and analogs thereof.

본 발명에서 사용되는 용어 "엄격한 조건(stringent condition)에서 혼성화(hybridization)"은 2개의 단일 가닥 핵산 분자가 적어도 70%, 예를 들어 80% 이상 또는 90% 이상의 뉴클레오타이드가 상보적(complementary) 뉴클레오타이드로 이루어진 것을 지칭한다.As used herein, the term "hybridization under stringent conditions" means that two single-stranded nucleic acid molecules have at least 70%, for example, 80% or more or 90% or more of the nucleotides being complementary nucleotides. It refers to something that has been accomplished.

예시적인 측면에서, 올리고-뉴클레오타이드는 20 내지 100개의 뉴클레오타이드로 이루어질 수 있다. 올리고-뉴클레오타이드를 구성하는 뉴클레오타이드가 20 내지 100개의 뉴클레오타이드로 이루어진 경우, 올리고-뉴클레오타이드는 생물학적 샘플 내에 존재하는 표적 핵산 분자와 엄격한 조건에서 혼성화할 수 있다. 이에 따라, 올리고-뉴클레오타이드에 특이적인 표적 핵산 분자를 높은 민감도로 분리, 정제할 수 있다.In exemplary aspects, oligo-nucleotides may consist of 20 to 100 nucleotides. When the nucleotides constituting the oligo-nucleotide consist of 20 to 100 nucleotides, the oligo-nucleotide can hybridize under stringent conditions with the target nucleic acid molecule present in the biological sample. Accordingly, target nucleic acid molecules specific for oligo-nucleotides can be separated and purified with high sensitivity.

일 양상에 따른 생물학적 샘플에서 하나 이상의 표적 핵산 분자를 검출하는 방법에 의하면, 생물학적 샘플 내에서 효과적으로 복수의 표적 핵산 분자를 분리, 추출, 및 검출할 수 있고, 생물학적 샘플 내에 표적 핵산 분자가 존재하는 지의 여부를 분석함으로써, 분석의 민감도를 향상시킬 수 있는 효과가 있다.According to a method for detecting one or more target nucleic acid molecules in a biological sample according to one aspect, it is possible to effectively separate, extract, and detect a plurality of target nucleic acid molecules in a biological sample, and determine whether the target nucleic acid molecule is present in the biological sample. By analyzing whether or not there is an effect of improving the sensitivity of the analysis.

도 1a 내지 도 1b은 일 구체예에 따른 비드 복합체의 제조과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 일 구체예에 따른 비드 복합체를 이용하여 생물학적 샘플 내 표적 핵산 분자를 포집하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3a 내지 도 3c는 일 구체예에 따른 비드 복합체의 평균 입자 크기를 측정한 결과이다.
도 4는 일 구체예에 따른 비드의 표면전하 측정결과이다.
도 5는 일 구체예에 따른 비드 복합체를 이용하여 cfDNA를 추출한 결과를 PCR을 통해 확인한 결과이다.
도 6은 일 구체예에 따른 비드 복합체를 이용하여 cfDNA를 추출한 결과를 전기영동을 통해 확인한 결과이다.1A to 1B are schematic diagrams showing the manufacturing process of a bead composite according to one embodiment.
Figure 2 is a schematic diagram showing a process for capturing target nucleic acid molecules in a biological sample using a bead complex according to one embodiment.
Figures 3a to 3c show the results of measuring the average particle size of the bead composite according to one embodiment.
Figure 4 shows the surface charge measurement results of a bead according to one embodiment.
Figure 5 shows the results of cfDNA extraction using a bead complex according to one embodiment confirmed through PCR.
Figure 6 shows the results of cfDNA extraction using a bead complex according to one embodiment confirmed through electrophoresis.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Below, preferred embodiments are presented to aid understanding of the present invention. However, the following examples are provided only to make the present invention easier to understand, and the content of the present invention is not limited by the following examples.

본 발명의 명세서 및 청구범위에 사용된 용어 또는 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정 해석되지 아니하며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.The terms or words used in the specification and claims of the present invention are not to be construed as limited to their ordinary or dictionary meanings, and the inventor may appropriately define the concept of terms to explain his or her invention in the best way. It must be interpreted as meaning and concept consistent with the technical idea of the present invention based on principles.

본 발명의 명세서 전체에 있어서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.Throughout the specification of the present invention, when a part is said to "include" a certain component, this means that it does not exclude other components but may further include other components, unless specifically stated to the contrary. .

본 발명의 명세서 전체에 있어서, "A 및/또는 B"는, A 또는 B, 또는 A 및 B를 의미한다.Throughout the specification of the present invention, “A and/or B” means A or B, or A and B.

본 발명에서 사용되는 용어 "Amine Bead"는 아민 작용기가 있는 비드를 의미하고, 본 발명에서 사용되는 용어 "Amine-Maleimide Bead"는 Amine Bead에 말레이미드기가 개질된 비드를 의미한다.The term "Amine Bead" used in the present invention refers to a bead with an amine functional group, and the term "Amine-Maleimide Bead" used in the present invention refers to a bead in which an amine bead is modified with a maleimide group.

본 발명에서 사용되는 용어 "Epoxy Bead"는 에폭시 작용기가 있는 비드를 의미하고, 본 발명에서 사용되는 용어 "Epoxy-PEI Bead"는 Epoxy Bead에 폴리에틸렌이민(PEI)이 결합한 비드를 의미하고, 본 발명에서 사용되는 용어 "Epoxy-PEI-Maleimide Bead"는 Epoxy-PEI Bead의 표면에 말레이미드기가 개질된 비드를 의미한다.The term "Epoxy Bead" used in the present invention refers to a bead with an epoxy functional group, and the term "Epoxy-PEI Bead" used in the present invention refers to a bead in which polyethyleneimine (PEI) is bonded to an epoxy bead, and the present invention The term "Epoxy-PEI-Maleimide Bead" used in refers to a bead with a maleimide group modified on the surface of the Epoxy-PEI Bead.

본 발명에서 사용되는 용어 "Streptavidin Bead"는 비드의 표면에 Streptavidin 작용기가 개질된 비드를 의미한다.The term “Streptavidin Bead” used in the present invention refers to a bead whose surface is modified with a Streptavidin functional group.

실시예 1. 아민-말레이미드 비드 복합체의 제조Example 1. Preparation of amine-maleimide bead complex

도 1a는 본 발명의 실시예에 따른 비드 합성과정을 나타내는 모식도를 나타낸다.Figure 1a shows a schematic diagram showing the bead synthesis process according to an embodiment of the present invention.

구체적으로, 아민 작용기가 표면에 연결된 비드(AccuNanoBead™ Amine Magnetic Nanobeads, size 400 nm, Catalogue number (TA-1011-1), 바이오니아)를 10mg/ml 농도로 100mM MES buffer (pH 5.5) 1ml에 분산시켰다. Specifically, beads with amine functional groups connected to the surface (AccuNanoBead™ Amine Magnetic Nanobeads, size 400 nm, catalog number (TA-1011-1), Bioneer) were dispersed in 1 ml of 100mM MES buffer (pH 5.5) at a concentration of 10 mg/ml. .

비드 표면의 아민기와 6-maleimidohexanic acid의 carboxyl기의 carbodiimide 반응을 이용하여 결합시키기 위해 1-에틸-3-(3-디메틸아미노　프로필)카보디이미드(EDC),　N-하이드록시　숙신이미드(NHS)를 아민 비드의 아미노기 100배의 몰당량만큼 4 ml의 pH 5.5 MES buffer에서 용해시켰다. 그 후 용액을 비드가 분산된 용액에 점적하여 12-24시간 실온에서 반응시켰다. 반응이 완료된 후, MES buffer로 비드를 3번 세척 후, pH 7.4 100 mM tris buffer에 보관하였다.To bind the amine group on the bead surface to the carboxyl group of 6-maleimidohexanic acid using the carbodiimide reaction, 1-ethyl-3-(3-dimethylamino propyl)carbodiimide (EDC), N- hydroxy succinimide (NHS) ) was dissolved in 4 ml of pH 5.5 MES buffer in an amount equivalent to 100 times the molar equivalent of the amino group of the amine bead. Afterwards, the solution was dropped into the solution in which the beads were dispersed and reacted at room temperature for 12-24 hours. After the reaction was completed, the beads were washed three times with MES buffer and stored in 100 mM tris buffer, pH 7.4.

실시예 2. 에폭시-PEI-말레이미드 비드 복합체의 제조Example 2. Preparation of epoxy-PEI-maleimide bead composite

도 1b는 본 발명의 실시예에 따른 비드 합성과정을 나타내는 모식도를 나타낸다.Figure 1b shows a schematic diagram showing the bead synthesis process according to an embodiment of the present invention.

구체적으로, 에폭시 작용기가 표면에 연결된 비드(AccuNanoBead™ Epoxy Magnetic Nanobeads, size 400 nm, Catalogue number (TA-1013-1), 바이오니아)를 10 mg/ml 농도로 증류수 3 ml에 분산시켰다. 분자량 25,000의 분지화 폴리에틸렌이민(PEI)을 10 mg/ml 농도로 증류수 2 ml에 용해시켰다. 에폭시기와 아미노기를 결합시키기 위해 PEI를 녹인 용액을 에폭시 비드에 점적한 후 12-24시간 상온에서 반응시켰다. 반응이 완료된 비드(에폭시-PEI 비드)는 pH 5.5 MES buffer로 3번 세척 후 10 mg/ml 농도로 보관하였다.Specifically, beads with an epoxy functional group connected to the surface (AccuNanoBead™ Epoxy Magnetic Nanobeads, size 400 nm, catalog number (TA-1013-1), Bioneer) were dispersed in 3 ml of distilled water at a concentration of 10 mg/ml. Branched polyethyleneimine (PEI) with a molecular weight of 25,000 was dissolved in 2 ml of distilled water at a concentration of 10 mg/ml. To combine the epoxy group and the amino group, a solution of PEI was dropped onto the epoxy beads and allowed to react at room temperature for 12-24 hours. The beads on which the reaction was completed (epoxy-PEI beads) were washed three times with pH 5.5 MES buffer and stored at a concentration of 10 mg/ml.

비드 표면의 아민기와 6-maleimidohexanic acid의 carboxyl기의 carbodiimide 반응을 이용하여 결합시키기 위해 1-에틸-3-(3-디메틸아미노　프로필　)카보디이미드(EDC),　N-하이드록시　숙신이미드(NHS)를 PEI의 1차 아미노기 100배의 몰당량만큼 4 ml의 pH 5.5 MES buffer에서 용해시켰다. 그 후 용액을 비드가 분산된 용액에 점적하여 12-24시간 실온에서 반응시켰다. 반응이 완료된 후, MES buffer로 비드를 3번 세척 후, pH 7.4 100 mM tris buffer에 보관하였다.To bind the amine group on the bead surface to the carboxyl group of 6-maleimidohexanic acid using the carbodiimide reaction, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC), N- hydroxy succinimide (NHS) ) was dissolved in 4 ml of pH 5.5 MES buffer at a molar equivalent of 100 times the primary amino group of PEI. Afterwards, the solution was dropped into the solution in which the beads were dispersed and reacted at room temperature for 12-24 hours. After the reaction was completed, the beads were washed three times with MES buffer and stored in 100 mM tris buffer, pH 7.4.

실시예 3. 티올기가 수식된 올리고-뉴클레오타이드Example 3. Oligo-nucleotides modified with thiol groups

생물학적 검체 내에 있는 표적 핵산을 검출하기 위해 5' 말단이 티올기로 치환된 올리고-뉴클레오타이드를 이용하였다. 구체적으로, 뉴클레오타이드는 HPV L1 부위에 특이적인 프라이머를 제작 후, 5' 말단에 티올기를 부여한 것을 사용하였다. 프라이머는 IDT korea에서 구입하여 사용하였고, 사용한 프라이머의 서열을 아래 표 1에 나타내었다. To detect target nucleic acids in biological samples, an oligo-nucleotide whose 5' end was substituted with a thiol group was used. Specifically, a nucleotide specific to the HPV L1 region was prepared and a thiol group was added to the 5' end. Primers were purchased and used from IDT Korea, and the sequences of the primers used are shown in Table 1 below.

프라이머 이름primer name 뉴클레오티드 서열nucleotide sequence 서열번호sequence number GP6-SHGP6-SH 5ThioMC6-D/GAAAA ATAAA CTGTA AATCA TATTC5ThioMC6-D/GAAAA ATAAA CTGTA AATCA TATTC 서열번호 1SEQ ID NO: 1

비교예 1. Streptavidin 비드Comparative Example 1. Streptavidin beads

시판되어 사용중인 Streptavidin 작용기가 표면에 연결된 비드(AccuNanoBead™ Streptavidin Magnetic Nanobeads, size 400 nm, Catalogue number (TA-1015-1), 바이오니아)를 구매하여 사용하였다. Commercially available beads with a Streptavidin functional group connected to the surface (AccuNanoBead™ Streptavidin Magnetic Nanobeads, size 400 nm, catalog number (TA-1015-1), Bioneer) were purchased and used.

비교예 2. biotinylated 뉴클레오타이드Comparative Example 2. biotinylated nucleotides

생물학적 검체 내에 있는 표적 핵산을 검출하기 위해 5' 말단이 biotin으로 치환된 올리고-뉴클레오타이드를 이용하였다. 구체적으로, 뉴클레오타이드는 HPV L1 부위에 특이적인 프라이머를 제작 후, 5' 말단에 biotin을 부여한 것을 사용하였다. 프라이머는 IDT korea에서 구입하여 사용하였고, 사용한 프라이머의 서열을 아래 표 2에 나타내었다. To detect target nucleic acids in biological samples, an oligo-nucleotide whose 5' end was substituted with biotin was used. Specifically, a nucleotide specific to the HPV L1 region was prepared and biotin was added to the 5' end. Primers were purchased and used from IDT Korea, and the sequences of the primers used are shown in Table 2 below.

프라이머 이름primer name 뉴클레오티드 서열nucleotide sequence 서열번호sequence number GP6-BIOTINGP6-BIOTIN 5BIOMC6-D/GAAAA ATAAA CTGTA AATCA TATTC5BIOMC6-D/GAAAA ATAAA CTGTA AATCA TATTC 서열번호 2SEQ ID NO: 2

실험예 1. 비드 복합체의 형태학적 특성Experimental Example 1. Morphological characteristics of bead complex

1.1. 비드 복합체의 평균 입자 크기 측정1.1. Measurement of average particle size of bead composites

상기 실시예 1 및 2와 비교예 1의 비드 입자 크기를 알아보기 위해 dynamic light scattering(DLS)를 이용하여 평균 입자 크기를 측정하였고, 그 결과를 도 3a, 3b 및 3c에 나타냈다. To determine the bead particle size of Examples 1 and 2 and Comparative Example 1, the average particle size was measured using dynamic light scattering (DLS), and the results are shown in Figures 3a, 3b, and 3c.

DLS는 SEM, TEM과 같은 microscopy method와 다르게, 물리적인 diameter만 측정을 하는 것이 아닌 입자 표면에 흡착된 분자층(polymer, surfactant)을 포함한 두께 및 solvation layer를 측정한다. 따라서 입자 크기를 측정하면 입자 표면에 변화가 생겼는지 간접적으로 판단할 수 있는 지표가 된다. Unlike microscopy methods such as SEM and TEM, DLS measures not only the physical diameter but also the thickness and solvation layer, including the molecular layer (polymer, surfactant) adsorbed on the particle surface. Therefore, measuring particle size serves as an indicator that can indirectly determine whether a change has occurred on the particle surface.

도 3a에 나타낸 바와 같이, Amine 비드, Amine-Maleimide 비드의 평균 입자크기는 각각 427.4 nm, 439.4 nm임을 알 수 있다.As shown in Figure 3a, it can be seen that the average particle sizes of amine beads and amine-maleimide beads are 427.4 nm and 439.4 nm, respectively.

도 3b에 나타낸 바와 같이, Epoxy 비드, Epoxy-PEI 비드, Epoxy-PEI-Maleimide 비드의 평균 입자크기는 각각 392.2nm, 542.4nm, 614.7nm임을 알 수 있다.As shown in Figure 3b, it can be seen that the average particle sizes of Epoxy beads, Epoxy-PEI beads, and Epoxy-PEI-Maleimide beads are 392.2 nm, 542.4 nm, and 614.7 nm, respectively.

도 3c에 나타낸 바와 같이, Streptavidin bead의 평균 입자크기는 717.8nm임을 알 수 있다.As shown in Figure 3c, it can be seen that the average particle size of Streptavidin beads is 717.8 nm.

1.2. 제타전위측정기(Zetasizer)를 이용한 비드의 평균 표면전하 측정1.2. Measurement of the average surface charge of beads using a zeta potential meter (Zetasizer)

상기 실시예 1 및 2와 비교예 1의 제조 과정 중의 비드의 평균 표면전하와 작용기 결합 여부를 알아보기 위해 제타전위측정기를 이용하여 표면전하를 측정하였고, 그 결과를 도 4에 나타냈다. In order to determine the average surface charge of beads and functional group bonding during the manufacturing process of Examples 1 and 2 and Comparative Example 1, the surface charge was measured using a zeta potential meter, and the results are shown in FIG. 4.

Zeta potential(제타전위)은 입자 주위에 존재하는 액상층의 전하를 측정하여 확인한다. 입자 주위에는 2가지의 액상층이 존재하게 되는데, 이온이 강한 경계를 이루는 내부층과 약하게 결합되어 있는 외부영역으로 구성된다. 외부영역은 확산층(diffuse layer)라고 하며, 이 확산층의 전위를 제타전위라고 명명한다. 이러한 제타전위는 분산액 내에서 하전된 입자들 간의 반발력의 정도를 나타내므로 입자의 안정성을 평가하는 척도로 사용된다. 또한 안정성 외에도 표면의 전하를 측정할 수 있기 때문에 새로운 작용기가 붙었는지 확인할 수 있는 지표로도 사용된다. 위의 실험에서는 새로운 작용기가 개질되었는지 확인하는 보조적인 지표로 사용하였다.Zeta potential is confirmed by measuring the charge of the liquid layer that exists around the particle. Two liquid layers exist around the particle, consisting of an inner layer where ions form a strong boundary and an outer region where ions are weakly bonded. The outer area is called the diffusion layer, and the potential of this diffusion layer is called zeta potential. This zeta potential represents the degree of repulsion between charged particles in the dispersion and is therefore used as a measure to evaluate the stability of the particles. In addition to stability, the surface charge can be measured, so it is also used as an indicator to check whether a new functional group has been attached. In the above experiment, it was used as an auxiliary indicator to confirm whether a new functional group was modified.

도 4에 나타낸 바와 같이, Amine 비드, Amine-Maleimide 비드의 평균 표면전하는 각각 26.52mV, -67.02mV으로 측정되었다. Epoxy 비드, Epoxy-PEI 비드, Epoxy-PEI-Maleimide 비드의 평균 표면전하는 각각 2.26mV, 32.49mV, -30.23mV로 측정되었다. Streptavidin 비드의 평균 표면전하는 -59.71mV로 측정되었다.As shown in Figure 4, the average surface charges of amine beads and amine-maleimide beads were measured to be 26.52mV and -67.02mV, respectively. The average surface charges of epoxy beads, epoxy-PEI beads, and epoxy-PEI-Maleimide beads were measured as 2.26mV, 32.49mV, and -30.23mV, respectively. The average surface charge of streptavidin beads was measured at -59.71mV.

상기 결과로부터 실시예 1 및 2의 제조 과정 중에 있어서, 비드 표면에 작용기가 개질된 것을 확인할 수 있었다.From the above results, it was confirmed that the functional group on the bead surface was modified during the manufacturing process of Examples 1 and 2.

실험예 2. 표준물질을 이용한 핵산 분자의 추출 효율 평가Experimental Example 2. Evaluation of extraction efficiency of nucleic acid molecules using standard substances

2.1. 핵산의 검출2.1. Detection of nucleic acids

상기 실시예 1 및 2에서 제조된 말레이미드 비드와 비교예 1의 비드의 DNA 분리 가능성을 확인하기 위해, 세포 유리 DNA(cell free DNA, cfDNA)의 포집 및 회수 효율을 평가하였다. To confirm the DNA separation potential of the maleimide beads prepared in Examples 1 and 2 and the beads of Comparative Example 1, the capture and recovery efficiency of cell free DNA (cfDNA) was evaluated.

상기 실시예 1,2 및 비교예 1에서 각각 제조된 비드 복합체가 특정 cfDNA에 특이적으로 결합하는 것을 확인하기 위하여 HPV 16 type cfDNA를 인공소변에 10pg/ml 농도로 분주한 액상검체를 준비하였다.To confirm that the bead complexes prepared in Examples 1 and 2 and Comparative Example 1 specifically bind to specific cfDNA, a liquid sample was prepared by dispensing HPV 16 type cfDNA into artificial urine at a concentration of 10 pg/ml.

실시예 3의 티올기로 치환된 뉴클레오타이드(SH-뉴클레오티드)는 1 um 농도의 Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride(TCEP)가 녹아 있는 pH 7.4 Tris buffer에서 2시간 환원시켰다. 실시예 3의 SH-뉴클레오티드와 비교예 2의 Biotin-뉴클레오티드를 HPV 16 type cfDNA가 10pg/ml로 분주된 인공소변 10ml에 0.4nmole 또는 0.8nmole 농도로 분주하고, 7.5분 동안 상온에서 혼성화하였다. 그 후, 검체에 아민-말레이미드 비드와 에폭시-PEI-말레이미드 비드, Streptavidin 비드를 각각 넣고 15분 동안 반응시켰다. Kingfisher 장비를 이용하여 자사의 키트와 버퍼 protocol을 이용하여 추출을 진행하였다.The thiol-substituted nucleotide (SH-nucleotide) of Example 3 was reduced for 2 hours in Tris buffer at pH 7.4 in which 1 um concentration of Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) was dissolved. The SH-nucleotide of Example 3 and the Biotin-nucleotide of Comparative Example 2 were dispensed at a concentration of 0.4 nmole or 0.8 nmole into 10 ml of artificial urine in which HPV 16 type cfDNA was dispensed at 10 pg/ml, and hybridized at room temperature for 7.5 minutes. Afterwards, amine-maleimide beads, epoxy-PEI-maleimide beads, and streptavidin beads were each added to the sample and reacted for 15 minutes. Extraction was performed using Kingfisher equipment using the company's kit and buffer protocol.

2.2. PCR을 이용한 핵산 추출 효율 평가2.2. Evaluation of nucleic acid extraction efficiency using PCR

상기 실험예 2.1.에서 추출한 cfDNA 중 HPV cfDNA의 증폭여부를 확인하기 위하여 추출 용액에 Taq polymerase, primer, probe, dNTP, Evargreen을 넣고 실시간 PCR(real time PCR, RT-PCR)을 진행하였다. To check whether HPV cfDNA was amplified among the cfDNA extracted in Experimental Example 2.1, Taq polymerase, primer, probe, dNTP, and Evargreen were added to the extraction solution, and real-time PCR (RT-PCR) was performed.

HPV PCR의 경우, Invitrogen사의 platinum Ⅱ Hot start DNA Taq polymerase, dNTP, MgCl2 가 혼합된 mixture 12 μl, 자사의 GP5 & GP6 타겟팅 서열이 들어간 primer 5 μl, TE buffer 0.8 μl, EvaGreen 1.2μl, 추출 용액 5 μl를 사용하여 PCR을 진행하였다. In the case of HPV PCR, 12 μl of a mixture of Invitrogen's platinum Ⅱ Hot start DNA Taq polymerase, dNTP, and MgCl 2 , 5 μl of primer containing the company's GP5 & GP6 targeting sequences, 0.8 μl of TE buffer, 1.2 μl of EvaGreen, extraction solution. PCR was performed using 5 μl.

핵산 증폭 반응을 수행하기 위하여, 각각의 샘플을 95℃에서 10분 동안 처리하고, 95℃에서 20초, 45℃에서 30초, 72℃에서 40초의 핵산 증폭 사이클을 40회 수행하고, 마지막으로 60~95℃에서 5초 처리하였다. 그 결과를 도 5에 나타냈다. To perform the nucleic acid amplification reaction, each sample was treated at 95°C for 10 min, followed by 40 nucleic acid amplification cycles of 20 s at 95°C, 30 s at 45°C, and 40 s at 72°C, and finally at 60°C. Treatment was performed at ~95°C for 5 seconds. The results are shown in Figure 5.

도 5에서 나타낸 바와 같이, Amine-Maleimide 비드와 Epoxy-PEI-Maleimide 비드는 Primer 0.4nmole 첨가 시 Cq값이 각각 28.00, 28.63으로 비교예 1의 Streptavidin 비드의 Cq값인 33.35보다 5.35, 5.02 앞서 있고, Primer 0.8 mol 첨가 시 Cq값이 각각 28.64, 28.76으로 비교예 1의 Streptavidin 비드의 Cq값인 34.49보다 5.85, 5.73 앞서 있음을 알 수 있었다. As shown in Figure 5, the Cq values of Amine-Maleimide beads and Epoxy-PEI-Maleimide beads are 28.00 and 28.63, respectively, when 0.4 nmole of primer is added, which is 5.35 and 5.02 ahead of the Cq value of 33.35 of the Streptavidin beads of Comparative Example 1, and When 0.8 mol was added, the Cq values were 28.64 and 28.76, respectively, which were 5.85 and 5.73 ahead of the Cq values of 34.49 for the Streptavidin beads in Comparative Example 1.

상기 결과로부터 실시예 1 및 2에서 제조된 비드 복합체가 비교예 1의 비드에 비해 훨씬 특이적으로 결합함을 알 수 있다. 이러한 결과는 실시예 1 및 2에서 제조된 비드 복합체가 샘플 내에서 cfDNA를 효율적으로 추출할 수 있음을 의미한다.From the above results, it can be seen that the bead complexes prepared in Examples 1 and 2 bind much more specifically than the beads of Comparative Example 1. These results mean that the bead complexes prepared in Examples 1 and 2 can efficiently extract cfDNA from the sample.

2.3. 전기영동을 이용한 cfDNA 추출 효율 평가2.3. Evaluation of cfDNA extraction efficiency using electrophoresis

상기 실험예 2.1.에서 추출한 cfDNA 중 HPV cfDNA를 확인하기 위해 전기영동을 수행하였다.Electrophoresis was performed to confirm HPV cfDNA among the cfDNA extracted in Experimental Example 2.1.

구체적으로, 실시예 2.2.와 같이 PCR을 수행하고, PCR 반응결과물을 4 μl씩 로딩하여 150 V로 15분간 아가로스 겔 상에서 전기영동하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다. Specifically, PCR was performed as in Example 2.2, and 4 μl of each PCR reaction product was loaded and electrophoresed on an agarose gel at 150 V for 15 minutes. The results are shown in Figure 6.

도 6에서 나타낸 바와 같이, Amine-Maleimide 비드와 Epoxy-PEI-Maleimide 비드는 비교예 1의 Streptavidin 비드보다 HPV cfDNA와 잘 결합하여 밴드를 형성하는 것을 알 수 있다.As shown in Figure 6, it can be seen that the Amine-Maleimide beads and the Epoxy-PEI-Maleimide beads bind to HPV cfDNA better than the Streptavidin beads of Comparative Example 1 to form a band.

이러한 결과들은 실시예 1 및 2에서 제조된 비드 복합체가 샘플 내에서 cfDNA를 효율적으로 추출할 수 있음을 의미한다. These results mean that the bead complexes prepared in Examples 1 and 2 can efficiently extract cfDNA from the sample.

Claims (24)

생물학적 샘플에서 하나 이상의 표적 핵산 분자를 추출 또는 검출하는 방법으로서,
티올기가 수식된 올리고-뉴클레오타이드를 생물학적 샘플에 첨가하여 표적 핵산 분자와 혼성화시키는 단계; 및
말레이미드기가 수식된 비드복합체를 상기 티올기가 수식된 올리고뉴클레오타이드와 결합시키는 단계;
를 포함하는 표적 핵산 분자를 추출 또는 검출하는 방법.A method for extracting or detecting one or more target nucleic acid molecules from a biological sample, comprising:
Adding an oligo-nucleotide modified with a thiol group to a biological sample and hybridizing it with a target nucleic acid molecule; and
combining the maleimide group-modified bead complex with the thiol group-modified oligonucleotide;
A method for extracting or detecting a target nucleic acid molecule comprising. 제1항에 있어서,
상기 말레이미드기가 수식된 비드복합체는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 것인 방법:
[화학식 1]
,
상기 식에서 X는 수소 또는 이고, 적어도 하나의 X는 이고,
상기 식에서 R1은 직접 결합 또는 C1-C20 지방족 탄화수소기이고,
상기 식에서 R2는 C2-C20 지방족 탄화수소기이고,
상기 식에서 n1은 1 내지 100,000의 정수이고,
R1 왼쪽의 별표는 비드 표면에 연결되는 부위를 나타낸다.According to paragraph 1,
The method wherein the bead complex modified with the maleimide group has the structure of the following formula (1):
[Formula 1]
,
In the above formula, X is hydrogen or , and at least one ego,
In the above formula, R 1 is a direct bond or a C 1 -C 20 aliphatic hydrocarbon group,
In the above formula, R 2 is a C 2 -C 20 aliphatic hydrocarbon group,
In the above formula, n 1 is an integer from 1 to 100,000,
The asterisk to the left of R 1 indicates the site connected to the bead surface. 제1항에 있어서,
상기 말레이미드기가 수식된 비드복합체는 하기 화학식 2의 구조를 갖는 것인 방법:
[화학식 2]

상기 식에서 R1은 직접 결합 또는 C1-C20 지방족 탄화수소기이고,
상기 식에서 R2는 C2-C20 지방족 탄화수소기이고,
R1 왼쪽의 별표는 비드 표면에 연결되는 부위를 나타낸다.According to paragraph 1,
The method wherein the bead complex modified with the maleimide group has the structure of the following formula (2):
[Formula 2]

In the above formula, R 1 is a direct bond or a C 1 -C 20 aliphatic hydrocarbon group,
In the above formula, R 2 is a C 2 -C 20 aliphatic hydrocarbon group,
The asterisk to the left of R 1 indicates the site connected to the bead surface. 제1항에 있어서,
상기 티올기가 수식된 올리고-뉴클레오타이드는 하기 화학식 3의 구조를 갖는 것인 방법:
[화학식 3]
또는
상기 식에서 n2은 1 내지 100의 정수이고,
상기 식에서 는 올리고-뉴클레오타이드이다.According to paragraph 1,
The method wherein the oligo-nucleotide modified with the thiol group has the structure of the following formula (3):
[Formula 3]
or
In the above formula, n 2 is an integer from 1 to 100,
In the above equation is an oligo-nucleotide. 제1항에 있어서,
상기 혼성화 및 결합은 하나의 수용액에서 수행되는 것인 방법.According to paragraph 1,
A method wherein the hybridization and binding are performed in one aqueous solution. 제5항에 있어서,
상기 수용액의 pH는 6.5 내지 7.5인 것인 방법.According to clause 5,
The method wherein the pH of the aqueous solution is 6.5 to 7.5. 제5항에 있어서,
상기 수용액은 MES buffer. Bis-Tris, ADA, ACES, PIPES, MOPSO, TES, HEPES 및 TE buffer로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 버퍼를 포함하는 것인 방법.According to clause 5,
The aqueous solution is MES buffer. A method comprising one or more buffers selected from the group consisting of Bis-Tris, ADA, ACES, PIPES, MOPSO, TES, HEPES and TE buffer. 제2항 또는 제3항에 있어서,
상기 R2는 C2-C10 알킬렌기인 것인 방법.According to paragraph 2 or 3,
The method wherein R 2 is a C 2 -C 10 alkylene group. 제2항 또는 제3항에 있어서,
상기 R2는 C5 알킬렌기인 것인 방법.According to paragraph 2 or 3,
The method wherein R 2 is a C 5 alkylene group. 제1항에 있어서,
상기 비드는 무기 또는 유기 소재로 이루어진 것인 방법.According to paragraph 1,
A method wherein the beads are made of an inorganic or organic material. 제1항에 있어서,
상기 비드는 자성화된 비드인 것인 방법.According to paragraph 1,
A method wherein the bead is a magnetized bead. 제1항에 있어서,
상기 표적 핵산 분자는 암세포 또는 병원체에서 유래하는 것인 방법.According to paragraph 1,
A method wherein the target nucleic acid molecule is derived from a cancer cell or pathogen. 제12항에 있어서,
상기 병원체는 병원성 바이러스 및 병원성 박테리아를 포함하는 것인 방법.According to clause 12,
A method wherein the pathogens include pathogenic viruses and pathogenic bacteria. 제1항에 있어서,
상기 표적 핵산 분자는 암의 발병 여부 또는 병원체 관련 질환의 감염 여부를 나타내는 마커로서의 핵산 분자인 방법.According to paragraph 1,
The method wherein the target nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule that serves as a marker indicating the occurrence of cancer or infection with a pathogen-related disease. 제1항에 있어서,
상기 표적 핵산 분자는 무세포 핵산(cell free nucleic acid)인 것인 방법.According to paragraph 1,
A method wherein the target nucleic acid molecule is a cell free nucleic acid. 제1항에 있어서,
상기 올리고-뉴클레오타이드는 20 내지 100개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 것인 방법.According to paragraph 1,
The method wherein the oligo-nucleotide consists of 20 to 100 nucleotides. 제1항에 있어서,
상기 올리고-뉴클레오타이드는 프라이머인 것인 방법.According to paragraph 1,
A method wherein the oligo-nucleotide is a primer. 제17항에 있어서,
상기 프라이머는 무세포 핵산(cell free nucleic acid)과 상보적으로 결합하는 것인 방법.According to clause 17,
A method wherein the primer binds complementary to cell free nucleic acid. 제1항에 있어서,
상기 생물학적 샘플은 소변, 타액, 객담, 혈액 및 비인두 도말물을 포함하는 것인 방법.According to paragraph 1,
The method of claim 1, wherein the biological samples include urine, saliva, sputum, blood, and nasopharyngeal swab. 제1항에 있어서,
상기 표적 핵산 분자를 검출하는 것은, 상기 올리고-뉴클레오타이드와 혼성화된 표적 핵산 분자를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 것인 방법.According to paragraph 1,
A method of detecting the target nucleic acid molecule by performing polymerase chain reaction (PCR) using the target nucleic acid molecule hybridized with the oligo-nucleotide as a template. 말레이미드기가 수식된 비드복합체 및 티올기가 수식된 올리고-뉴클레오타이드를 포함하는 생물학적 샘플에서 하나 이상의 표적 핵산 분자를 추출 또는 검출하기 위한 핵산 추출 또는 검출용 키트.A nucleic acid extraction or detection kit for extracting or detecting one or more target nucleic acid molecules from a biological sample comprising a bead complex modified with a maleimide group and an oligo-nucleotide modified with a thiol group. 제21항에 있어서,
상기 말레이미드기가 수식된 비드복합체는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 것인 키트:
[화학식 1]
,
상기 식에서 X는 수소 또는 이고, 적어도 하나의 X는 이고,
상기 식에서 R1은 직접 결합 또는 C1-C20 지방족 탄화수소기이고,
상기 식에서 R2는 C2-C20 지방족 탄화수소기이고,
상기 식에서 n1은 1 내지 100,000의 정수이고,
R1 왼쪽의 별표는 비드 표면에 연결되는 부위를 나타낸다.According to clause 21,
A kit in which the bead complex modified with the maleimide group has the structure of the following formula (1):
[Formula 1]
,
In the above formula, X is hydrogen or , and at least one ego,
In the above formula, R 1 is a direct bond or a C 1 -C 20 aliphatic hydrocarbon group,
In the above formula, R 2 is a C 2 -C 20 aliphatic hydrocarbon group,
In the above formula, n 1 is an integer from 1 to 100,000,
The asterisk to the left of R 1 indicates the site connected to the bead surface. 제21항에 있어서,
상기 말레이미드기가 수식된 비드복합체는 하기 화학식 2의 구조를 갖는 것인 키트:
[화학식 2]

상기 식에서 R1은 직접 결합 또는 C1-C20 지방족 탄화수소기이고,
상기 식에서 R2는 C2-C20 지방족 탄화수소기이고,
R1 왼쪽의 별표는 비드 표면에 연결되는 부위를 나타낸다.According to clause 21,
A kit in which the bead complex modified with the maleimide group has the structure of the following formula (2):
[Formula 2]

In the above formula, R 1 is a direct bond or a C 1 -C 20 aliphatic hydrocarbon group,
In the above formula, R 2 is a C 2 -C 20 aliphatic hydrocarbon group,
The asterisk to the left of R 1 indicates the site connected to the bead surface. 제21항에 있어서,
상기 티올기가 수식된 올리고-뉴클레오타이드는 하기 화학식 3의 구조를 갖는 것인 키트:
[화학식 3]
또는
상기 식에서 n2은 1 내지 100의 정수이고,
상기 식에서 는 올리고-뉴클레오타이드이다.According to clause 21,
A kit in which the oligo-nucleotide modified with the thiol group has the structure of Formula 3 below:
[Formula 3]
or
In the above formula, n 2 is an integer from 1 to 100,
In the above equation is an oligo-nucleotide.
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