KR20240037595A - Antifreeze composition comprising nucleic acid nanostructures to which oligopeptides are bound - Google Patents
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Abstract
본 발명은 올리고펩티드가 결합된 핵산 나노구조체를 포함하는 항동결 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 핵산 나노구조체; 및 상기 핵산 나노구조체의 적어도 일부에 결합된 올리고펩티드;를 포함하는 표면이 개질된 나노구조체를 포함함으로써 높은 구조적 안정성을 나타내며 우수한 얼음의 재결정화 억제 효능을 나타낼 수 있다.The present invention relates to an anti-freezing composition comprising a nucleic acid nanostructure to which an oligopeptide is bound, and more specifically, to a nucleic acid nanostructure; and an oligopeptide bound to at least a portion of the nucleic acid nanostructure. By including a nanostructure with a modified surface, it can exhibit high structural stability and exhibit excellent efficacy in inhibiting recrystallization of ice.
Description
본 발명은 올리고펩티드가 결합된 핵산 나노구조체를 포함하는 항동결 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to an anti-freezing composition comprising a nucleic acid nanostructure to which an oligopeptide is bound.
항동결 단백질 (antifreeze protein, AFP) 및 항동결 당단백질 (antifreeze glycoprotein, AFGP) (이하 통칭하여 “AF(G)P”라 함)은 얼음 결정에 부착되고, 이로 인해 성장하는 얼음 결정에서 형성되는 마이크로 또는 나노 굴곡은 물 분자가 결정화되는 것을 열역학적으로 더 어렵게 만든다. AF(G)P의 작용 기전은 확립되어 있지 않으나, 양친매성 작용기 (Threonine (Thr)) 의 평면적 배열이 얼음 결정과 AF(G)P 사이의 상호작용을 촉진하는 것으로 보고되어 있다. 이는 실증적인 관찰뿐 아니라, 수치적 시뮬레이션을 통한 이론적 뒷받침도 함께 진행되고 있다.Antifreeze protein (AFP) and antifreeze glycoprotein (AFGP) (hereinafter collectively referred to as “AF(G)P”) attach to ice crystals, thereby forming a Micro- or nano-bending makes it thermodynamically more difficult for water molecules to crystallize. Although the mechanism of action of AF(G)P has not been established, it has been reported that the planar arrangement of the amphipathic functional group (Threonine (Thr)) promotes the interaction between ice crystals and AF(G)P. This is being done not only through empirical observation, but also through theoretical support through numerical simulation.
하지만, 현재까지 개발된 대부분의 소분자, 고분자 또는 거대분자 기반의 인공 동결방지제는 친양매성 작용기 및 이의 평면적 구조화 없이 사용되었다. 이는 기하학적으로 정의되기 어려운 고분자 및 거대분자의 특성에 기인하며, 이러한 특성은 동결방지제와 얼음 결정 사이의 상호작용을 저해하여 상대적으로 고농도의 동결방지제의 사용을 요구한다.However, most artificial cryoprotectants based on small molecules, polymers, or macromolecules developed to date have been used without amphipathic functional groups and their planar structures. This is due to the characteristics of polymers and macromolecules that are difficult to define geometrically, and these characteristics inhibit the interaction between the antifreeze agent and ice crystals, requiring the use of a relatively high concentration of the antifreeze agent.
한편, DNA를 이용한 나노구조체의 합성 및 활용은 지난 10여년간 현저하게 진전되어 왔으며, 다양한 기하학적 형태의 나노구조체를 고도로 균일하게 대량으로 만들어 낼 수 있는 기반이 마련되어 있다. 따라서, DNA 나노구조체의 모양 및 크기를 정확하게 제어할 수 있는 능력은 얼음과 동결방지제 사이의 상호작용 개선에도 이용될 수 있을 것이다. 그러나 DNA 나노구조체는 생체 내 환경에서의 낮은 구조적 안정성 및 동결제어활성의 부재로 인해 동결방지제로 사용되지 못하고 있으며, 이에 대한 개선이 필요하다.Meanwhile, the synthesis and use of nanostructures using DNA has progressed significantly over the past 10 years, and the foundation has been laid for producing nanostructures of various geometric shapes in a highly uniform manner in large quantities. Therefore, the ability to precisely control the shape and size of DNA nanostructures could also be used to improve the interaction between ice and antifreeze agents. However, DNA nanostructures cannot be used as anti-freeze agents due to low structural stability in the in vivo environment and lack of freeze-control activity, and improvements are needed.
본 발명은 항동결 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.The present invention aims to provide an anti-freezing composition.
본 발명은 세포의 생존율을 높이기 위한 세포 동결 보존용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.The purpose of the present invention is to provide a composition for cell cryopreservation to increase cell survival rate.
본 발명은 식품의 동결 시에도 식감을 유지할 수 있는 식품 동결 보존용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.The purpose of the present invention is to provide a composition for freeze-preserving food that can maintain the texture even when the food is frozen.
본 발명은 동결 방지 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.The purpose of the present invention is to provide a method for preventing freezing.
1. 핵산 나노구조체; 및 상기 핵산 나노구조체의 적어도 일부에 결합된 올리고펩티드;를 포함하는 표면이 개질된 나노구조체를 포함하는 항동결 조성물.1. Nucleic acid nanostructure; and an oligopeptide bound to at least a portion of the nucleic acid nanostructure.
2. 위 1에 있어서, 상기 핵산은 DNA 인, 항동결 조성물.2. The anti-freezing composition of 1 above, wherein the nucleic acid is DNA.
3. 위 1에 있어서, 상기 핵산 나노구조체는 스캐폴드 DNA의 소정 부분이 접혀 형성되는 DNA 오리가미 구조체인, 항동결 조성물.3. The anti-freezing composition of 1 above, wherein the nucleic acid nanostructure is a DNA origami structure formed by folding a predetermined portion of the scaffold DNA.
4. 위 1에 있어서, 상기 핵산 나노구조체는 얼음 결정의 하나 이상의 면과 접촉이 가능한 하나 이상의 면을 포함하는, 항동결 조성물.4. The anti-freezing composition of 1 above, wherein the nucleic acid nanostructure includes one or more surfaces capable of contacting one or more surfaces of the ice crystal.
5. 위 1에 있어서, 상기 핵산 나노구조체는 원통(barrel) 형태 또는 판(plate) 형태인, 항동결 조성물.5. The anti-freezing composition of 1 above, wherein the nucleic acid nanostructure is in the form of a cylinder or a plate.
6. 위 1에 있어서, 상기 올리고펩티드는 상기 핵산 나노구조체의 적어도 일부에 비공유결합할 수 있는 작용기를 갖는 제1아미노산을 적어도 하나 포함하는, 항동결 조성물.6. The anti-freezing composition of 1 above, wherein the oligopeptide includes at least one first amino acid having a functional group capable of non-covalently binding to at least a portion of the nucleic acid nanostructure.
7. 위 6에 있어서, 상기 제1아미노산은 라이신인, 항동결 조성물.7. The anti-freezing composition of 6 above, wherein the first amino acid is lysine.
8. 위 1에 있어서, 상기 올리고펩티드는 히스티딘(His), 글리신(Gly), 프롤린(Pro), 알라닌(Ala), 발린(Val), 이소류신(Ile), 류신(Leu), 메티오닌(Met) 및 트레오닌(Thr)으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는, 항동결 조성물.8. In 1 above, the oligopeptide is histidine (His), glycine (Gly), proline (Pro), alanine (Ala), valine (Val), isoleucine (Ile), leucine (Leu), and methionine (Met). and at least one amino acid selected from the group consisting of threonine (Thr).
9. 위 1에 있어서, 상기 올리고펩티드는 트레오닌 또는 알라닌 중 적어도 하나의 아미노산을 포함하는, 항동결 조성물.9. The anti-freezing composition according to 1 above, wherein the oligopeptide contains at least one amino acid of threonine or alanine.
10. 위 1에 있어서, 상기 올리고펩티드는 (Lys)k-(Thr)n 또는 (Lys)k-(Ala)n이고, 상기 n은 2 내지 10의 정수이고, 상기 k는 2 내지 15의 정수인, 항동결 조성물.10. The method of 1 above, wherein the oligopeptide is (Lys) k -(Thr) n or (Lys) k -(Ala) n , where n is an integer from 2 to 10, and k is an integer from 2 to 15. , anti-freezing composition.
11. 위 1 내지 10 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 세포 동결 보존용 조성물.11. A composition for cell cryopreservation comprising the composition of any one of items 1 to 10 above.
12. 위 1 내지 10 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 식품 동결 보존용 조성물.12. A composition for freezing and preserving food comprising the composition of any one of items 1 to 10 above.
13. 위 1 내지 10 중 어느 한 항의 조성물을 시료에 첨가하는 단계를 포함하는 동결 방지 방법.13. A method for preventing freezing, comprising adding the composition of any one of 1 to 10 above to a sample.
14. 위 13 에 있어서, 상기 시료는 식품, 약품, 색소, 농화학제 및 생물학적 재료 중 적어도 하나인, 동결 방지 방법.14. The method of preventing freezing according to item 13 above, wherein the sample is at least one of food, medicine, pigment, agricultural chemical, and biological material.
본 발명의 표면이 개질된 나노구조체는 올리고펩티드가 핵산 나노구조체에 결합함으로써 마그네슘과 같은 이온성 물질이 없는 환경에서도 높은 구조적 안정성을 가질 수 있다.The surface-modified nanostructure of the present invention can have high structural stability even in an environment without ionic substances such as magnesium by binding oligopeptides to the nucleic acid nanostructure.
본 발명의 표면이 개질된 나노구조체는 얼음의 재결정화를 억제하고 결빙을 제어할 수 있다.The surface-modified nanostructure of the present invention can suppress recrystallization of ice and control freezing.
본 발명의 표면이 개질된 나노구조체를 포함하는 조성물을 세포 동결 보존시 사용하는 경우 세포의 생존율을 높일 수 있다. 또한, 본 발명의 표면이 개질된 나노구조체를 포함하는 조성물을 식품 동결시 사용하는 경우 식품의 손상을 저해하고 식감을 유지할 수 있다.When a composition containing the surface-modified nanostructure of the present invention is used for cryopreservation of cells, the survival rate of cells can be increased. In addition, when the composition containing the surface-modified nanostructure of the present invention is used when freezing food, damage to the food can be prevented and texture can be maintained.
본 발명의 표면이 개질된 나노구조체를 포함하는 조성물은 세포 내 환경 및 식품의 통상적인 유통에 사용되는 환경 하에서 물리적, 화학적 안정성을 유지하면서 항동결 효능을 나타낼 수 있다.The composition containing the surface-modified nanostructure of the present invention can exhibit anti-freezing efficacy while maintaining physical and chemical stability in the intracellular environment and the environment used in normal distribution of food.
도 1은 실시예에 따른 표면이 개질된 DNA 나노구조체의 구조 및 이의 얼음 결정과의 상호작용을 도식화한 것이다. 도 1에서 원통 구조 내의 파란색 나선은 스캐폴드 DNA, 회색 나선은 스테이플 DNA이다.
도 2는 DNA 나노구조체의 투과전자현미경 및 원자 힘 현미경 이미지를 나타낸다.
도 3은 투과전자현미경, 원자 힘 현미경 및 아가로오스 겔 분석을 통해 올리고펩티드의 결합 유무에 따른 원통형 DNA 나노구조체의 체내 안정성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 투과전자현미경, 원자 힘 현미경 및 아가로오스 겔 분석을 통해 올리고펩티드의 결합 유무에 따른 판형 DNA 나노구조체의 체내 안정성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 DNA 나노구조체의 얼음 재결정화 억제 효과를 나타낸다.
도 6은 트레오닌(Thr)을 포함하는 올리고펩티드로 표면이 개질된 DNA 나노구조체의 얼음 재결정화 억제 효과를 나타낸다.
도 7은 트레오닌(Thr) 및 알라닌(Ala)을 포함하는 올리고펩티드로 표면이 개질된 DNA 나노구조체의 얼음 재결정화 억제 효과를 나타낸다.
도 8은 트레오닌(Thr)을 포함하는 올리고펩티드로 표면이 개질된 DNA 나노구조체의 얼음 재결정화 억제 효과를 트레오닌 단량체 수에 따라 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 분자 동역학 시뮬레이션에 따른 원통형 DNA 나노구조체 및 판형 DNA 나노구조체의 형태 및 이의 구성을 나타낸다. 도 9에서 파란색 표시는 스캐폴드 DNA, 회색 표시는 스테이플 DNA이다.
도 10은 일 실시예에 따른 원통형 DNA 나노구조체의 설계 도면을 나타낸다. 도 10에서 파란색 표시는 스캐폴드 DNA, 회색 표시는 스테이플 DNA이다.
도 11은 일 실시예에 따른 판형 DNA 나노구조체의 설계 도면을 나타낸다. 도 11에서 파란색 표시는 스캐폴드 DNA, 회색 표시는 스테이플 DNA이다.Figure 1 schematically illustrates the structure of a surface-modified DNA nanostructure according to an example and its interaction with ice crystals. In Figure 1, the blue helix in the cylindrical structure is scaffold DNA, and the gray helix is staple DNA.
Figure 2 shows transmission electron microscopy and atomic force microscopy images of DNA nanostructures.
Figure 3 shows the results of confirming the in vivo stability of the cylindrical DNA nanostructure according to the presence or absence of oligopeptide binding through transmission electron microscopy, atomic force microscopy, and agarose gel analysis.
Figure 4 shows the results of confirming the in vivo stability of the plate-shaped DNA nanostructure according to the presence or absence of oligopeptide binding through transmission electron microscopy, atomic force microscopy, and agarose gel analysis.
Figure 5 shows the effect of suppressing ice recrystallization of DNA nanostructures.
Figure 6 shows the effect of inhibiting ice recrystallization of a DNA nanostructure whose surface was modified with an oligopeptide containing threonine (Thr).
Figure 7 shows the effect of inhibiting ice recrystallization of a DNA nanostructure whose surface was modified with oligopeptides containing threonine (Thr) and alanine (Ala).
Figure 8 shows the results of confirming the effect of suppressing ice recrystallization of a DNA nanostructure whose surface was modified with an oligopeptide containing threonine (Thr) according to the number of threonine monomers.
Figure 9 shows the shape and composition of a cylindrical DNA nanostructure and a plate-shaped DNA nanostructure according to molecular dynamics simulation. In Figure 9, blue markings are scaffold DNA and gray markings are staple DNA.
Figure 10 shows a design drawing of a cylindrical DNA nanostructure according to one embodiment. In Figure 10, blue markings are scaffold DNA and gray markings are staple DNA.
Figure 11 shows a design drawing of a plate-shaped DNA nanostructure according to one embodiment. In Figure 11, blue markings are scaffold DNA and gray markings are staple DNA.
본 발명은 표면이 개질된 핵산 나노구조체를 포함하는 항동결 조성물을 제공한다.The present invention provides an anti-freezing composition comprising a surface-modified nucleic acid nanostructure.
용어 “항동결”, “항-동결”, “동결 제어”, “결빙 제어”, “동결 억제” 및 “결빙 억제”는 상호 교환적으로 사용 가능하고, 어느점을 낮추거나, 얼음이 형성되지 않도록 하거나 얼음 형성 속도를 늦추거나, 얼음의 재결정화가 되지 않도록 하거나, 얼음 재결정화 속도를 늦추거나, 얼음 결정의 크기를 작게 유지하는 작용을 의미한다.The terms “anti-freeze,” “anti-freeze,” “freeze control,” “freeze control,” “freeze inhibition,” and “freeze inhibition” are used interchangeably to lower the point or prevent ice from forming. It refers to the action of preventing or slowing down the rate of ice formation, preventing recrystallization of ice, slowing down the rate of ice recrystallization, or keeping the size of ice crystals small.
용어 “얼음 재결정화” 는 작은 얼음 결정으로부터 더 큰 얼음 결정으로 성장하는 과정을 의미하고, 오스왈드 숙성 (Ostwald ripening)은 상온 및 결정 사이 표면 에너지 차이로 인한 압력에서 발생하는 이러한 재결정화를 의미한다.The term “ice recrystallization” refers to the process of growth from small ice crystals into larger ice crystals, and Ostwald ripening refers to this recrystallization occurring at room temperature and pressure due to the surface energy difference between the crystals.
본 발명의 항동결 조성물은 생체 조직, 세포 또는 유기체 및 식품을 동결 손상으로부터 보호하기 위해 사용되는 물질일 수 있다. 일 실시예에 따르면, 조성물은 얼음 결정의 형성 또는 성장을 억제할 수 있다.The anti-freezing composition of the present invention may be a substance used to protect biological tissues, cells or organisms, and food from freezing damage. According to one embodiment, the composition can inhibit the formation or growth of ice crystals.
본 발명의 표면이 개질된 나노구조체는 핵산 나노구조체; 및 상기 핵산 나노구조체의 적어도 일부에 결합된 올리고펩티드;를 포함한다.The surface-modified nanostructure of the present invention includes nucleic acid nanostructure; and an oligopeptide bound to at least a portion of the nucleic acid nanostructure.
용어 “핵산 나노구조체”는 핵산 사슬 사이의 결합으로 만들어진 구조체를 의미하며, 본 발명에서 제시한 표면이 개질된 나노구조체의 기본 골격을 이룬다. 통상의 핵산 나노구조체는 구조적 안정성을 유지하기 위해 마그네슘과 같은 양이온을 필요로 한다. 한편, 본 발명의 표면이 개질된 나노구조체는 올리고펩티드에 의해 핵산 나노구조체가 표면개질되고, 양이온이 적은 환경에서도 구조적 안정성을 유지하며 항동결능을 나타낼 수 있다.The term “nucleic acid nanostructure” refers to a structure made of bonds between nucleic acid chains, and forms the basic framework of the surface-modified nanostructure presented in the present invention. Typical nucleic acid nanostructures require cations such as magnesium to maintain structural stability. Meanwhile, the surface-modified nanostructure of the present invention is a nucleic acid nanostructure surface modified with an oligopeptide, and can maintain structural stability and exhibit anti-freezing ability even in an environment with few cations.
핵산 나노구조체는 핵산 오리가미 구조체일 수 있다.The nucleic acid nanostructure may be a nucleic acid origami structure.
본 명세서에서 핵산은 DNA, RNA 또는 PNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Nucleic acids herein may be, but are not limited to, DNA, RNA, or PNA.
핵산 나노구조체는 DNA 오리가미 구조체, DNA 타일(tile) 또는 DNA 브릭(brick)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The nucleic acid nanostructure may be a DNA origami structure, a DNA tile, or a DNA brick, but is not limited thereto.
핵산 오리가미 구조체는 스캐폴드 핵산의 소정 부분이 접혀 형성되는 구조체일 수 있다.A nucleic acid origami structure may be a structure formed by folding a predetermined portion of a scaffold nucleic acid.
예를 들어, 핵산 오리가미 구조체는 스캐폴드 핵산이 복수개의 스테이플 핵산과 상보적으로 결합하면서, 스캐폴드 핵산의 소정 부분이 접혀 특정한 형상을 나타내는 구조체일 수 있다. 핵산 오리가미 구조체는 스캐폴드 DNA에 복수개의 스테이플 DNA를 혼합하여 제조된 것일 수 있다. 일 실시예에 따르면, 핵산 오리가미 구조체는 M13mp18 벡터(Guild bioscience, 미국)가 특정 형상(원통형 또는 판형)을 나타낼 수 있도록 스테이플 DNA 가닥을 설계하고, 스캐폴드 가닥과 스테이플 가닥들을 혼합하여 제조된 것일 수 있다.For example, a nucleic acid origami structure may be a structure in which a scaffold nucleic acid is complementary to a plurality of staple nucleic acids and a certain portion of the scaffold nucleic acid is folded to form a specific shape. The nucleic acid origami structure may be prepared by mixing scaffold DNA with a plurality of staple DNAs. According to one embodiment, the nucleic acid origami structure may be manufactured by designing the staple DNA strand so that the M13mp18 vector (Guild bioscience, USA) can exhibit a specific shape (cylindrical or plate-shaped) and mixing the scaffold strand and the staple strand. there is.
다른 예를 들어, 핵산 오리가미 구조체는 스캐폴드 핵산이 그 내부적으로 상보적 결합을 하여 특정 위치에서 접혀 특정한 형상을 나타내는 구조체일 수 있다. 핵산 오리가미 구조체는 스테이플 DNA 가닥을 사용하지 않고 단일 가닥의 스캐폴드 DNA가 접혀 특정 형상을 나타내는 구조체일 수 있다.For another example, a nucleic acid origami structure may be a structure in which scaffold nucleic acids form complementary bonds internally and are folded at specific positions to form a specific shape. A nucleic acid origami structure may be a structure in which a single strand of scaffold DNA is folded to form a specific shape without using staple DNA strands.
스캐폴드 핵산은 단일가닥의 핵산으로서 그 길이는 형성하고자 하는 구조체의 길이, 크기, 모양 등에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 통상적으로 7000 내지 8000 뉴클레오티드(nt) 정도의 길이를 가진 종류를 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 7,249nt 길이의 M13mp18 DNA를 사용하였으나, 이에 제한되지 않는다. M13mp18 스캐폴드 DNA를 사용하여 DNA 구조체를 제작한 경우, 만들어진 구조체 하나의 분자량은 약 5 메가달턴이며, 이는 약 10-20 kg에 상응하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 실시예에 따르면, 본 발명의 DNA 나노구조체는 M13mp18 벡터와 짧은 DNA 가닥(스테이플 DNA 가닥) 사이의 상보 결합으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Scaffold nucleic acids are single-stranded nucleic acids whose length can be appropriately selected depending on the length, size, and shape of the structure to be formed. Typically, types with a length of about 7000 to 8000 nucleotides (nt) can be used. In a specific example of the present invention, M13mp18 DNA with a length of 7,249 nt was used, but it is not limited thereto. When a DNA structure is produced using M13mp18 scaffold DNA, the molecular weight of one constructed structure is about 5 megadaltons, which corresponds to about 10-20 kg, but is not limited thereto. According to one embodiment, the DNA nanostructure of the present invention may be composed of complementary linkage between the M13mp18 vector and a short DNA strand (staple DNA strand), but is not limited thereto.
스테이플 핵산은 그 서열 중 적어도 일부가 상기 스캐폴드 핵산과 상보적인 서열을 가져, 스캐폴드 핵산이 특정 위치에서 접히거나 고정되도록 할 수 있다.The staple nucleic acid may have at least a portion of its sequence complementary to the scaffold nucleic acid, allowing the scaffold nucleic acid to be folded or fixed at a specific location.
예를 들어, 스테이플 핵산은 상기 스캐폴드 핵산의 가닥 중 적어도 하나에 결합되어 이중 가닥을 형성하는 복수개의 스테이플 핵산(이하 '제1 스테이플 핵산') 일 수 있다. 제1 스테이플 핵산은 스캐폴드 핵산과 상보적인 서열을 가져, 스캐폴드 핵산과 결합하여 이중 가닥을 형성할 수 있다. 다른 예를 들어, 스테이플 핵산은 그 서열 중 적어도 일부는 상기 스캐폴드 핵산과 상보적이고, 적어도 일단은 그렇지 않아, 상기 스캐폴드 핵산의 가닥 중 적어도 하나에 결합되어 이중 가닥 및 말단에 단일 가닥을 형성하는 복수개의 스테이플 핵산(이하 '제2 스테이플 핵산') 일 수 있다. 제2 스테이플 핵산은 스캐폴드 핵산과 상보적인 서열을 갖는 부분 및 적어도 한 쪽 말단(일단)이 스캐폴드 핵산과 상보적이지 않은 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일단이 스캐폴드 핵산과 상보적이지 않을 수 있고, 양단이 스캐폴드 핵산과 상보적이지 않을 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않는다.For example, the staple nucleic acid may be a plurality of staple nucleic acids (hereinafter referred to as 'first staple nucleic acids') that are bound to at least one of the strands of the scaffold nucleic acid to form a double strand. The first staple nucleic acid has a sequence complementary to the scaffold nucleic acid and can bind to the scaffold nucleic acid to form a double strand. In another example, a staple nucleic acid has at least part of its sequence complementary to the scaffold nucleic acid and at least one end is not, so that it is bound to at least one of the strands of the scaffold nucleic acid to form a double strand and a single strand at the end. It may be a plurality of staple nucleic acids (hereinafter referred to as ‘second staple nucleic acids’). The second staple nucleic acid may include a portion having a sequence complementary to the scaffold nucleic acid and a portion at least one end of which is not complementary to the scaffold nucleic acid. For example, one end may not be complementary to the scaffold nucleic acid, and both ends may not be complementary to the scaffold nucleic acid. However, it is not limited to this.
스테이플 핵산은 그 길이는 형성하고자 하는 구조체의 길이, 크기, 모양 등에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 예를 들면 20 내지 50nt일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The length of the staple nucleic acid may be appropriately selected depending on the length, size, shape, etc. of the structure to be formed, and may be, for example, 20 to 50 nt, but is not limited thereto.
스테이플 핵산은 스캐폴드 핵산의 특정 위치에 결합하여 스캐폴드 핵산이 특정 형상을 가질 수 있도록 설계될 수 있다.The staple nucleic acid can be designed to bind to a specific position of the scaffold nucleic acid so that the scaffold nucleic acid has a specific shape.
스테이플 핵산의 설계는 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있으며, 예를 들면 caDNAno 등의 디자인 프로그램을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Design of staple nucleic acids can be performed according to conventional methods, for example, using a design program such as caDNAno, but is not limited thereto.
핵산 나노구조체는 공지된 방법으로 제조된 것일 수 있으며, 방법이 제한되는 것은 아니다.Nucleic acid nanostructures may be manufactured by known methods, but the methods are not limited.
핵산 오리가미 구조체는 통상의 열풀림(thermal annealing) 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어 원재료인 스캐폴드 핵산과 스테이플 핵산을 고온(예를 들어 80~95℃)으로 가열하여 모든 핵산 가닥이 단일가닥 상태로 있도록 만들어 주는 것으로 시작할 수 있다. 핵산 가닥은 염기서열에 따라 녹는점(melting temperature)이 존재하며 이 온도 이상이면 주로 단일가닥, 이하일 경우 주로 이중가닥으로 존재하게 된다. 이후 반응 용액의 온도를 천천히 낮춰주게 되면, 핵산 가닥이 상보적으로 결합하면서 이중가닥으로 존재하기 시작하며, 핵산 오리가미에서는 200개 정도의 스테이플 핵산이 협력적으로 결합하면서 설계했던 위치에 결합되고, 원하는 형상의 구조체가 생성될 수 있다.Nucleic acid origami structures can be prepared using conventional thermal annealing techniques. For example, the raw materials, scaffold nucleic acid and staple nucleic acid, can be heated to a high temperature (e.g., 80-95°C) to ensure that all nucleic acid strands remain single-stranded. Nucleic acid strands have a melting temperature depending on their base sequence. If the temperature is above this temperature, they mainly exist as a single strand, and if it falls below this temperature, they mainly exist as a double strand. Afterwards, when the temperature of the reaction solution is slowly lowered, the nucleic acid strands begin to bind complementaryly and exist as a double strand. In nucleic acid origami, about 200 staple nucleic acids bind cooperatively to the designed position, and the desired A structure of a shape can be created.
스테이플 핵산마다 염기서열이 다르므로 결합 시점은 조금씩 다르지만 통상의 열풀림 기법은 충분한 시간(수 시간 이상)에 걸쳐 서서히 온도를 낮추기 때문에 모든 스테이플 핵산이 결합하기 충분한 조건이며, 따라서 구성하는 스테이플 핵산의 염기서열과 무관하게 원하는 형상을 갖도록 제작할 수 있다.Since the base sequence is different for each staple nucleic acid, the binding time is slightly different, but the conventional heat annealing technique gradually lowers the temperature over a sufficient period of time (several hours or more), which is a sufficient condition for all staple nucleic acids to bind, and thus the bases of the constituting staple nucleic acids It can be manufactured to have the desired shape regardless of sequence.
스캐폴드 핵산은 기결정된 위치에서 접혀 복수개의 가닥을 이루고, 스테이플 핵산은 스캐폴드 핵산이 기결정된 위치에서 접히도록 설계된 서열들을 갖는 것으로서, 상기 방법으로 스캐폴드 핵산에 결합하면서 스캐폴드 핵산이 소정의 구조를 형성하도록 할 수 있다.The scaffold nucleic acid is folded at a predetermined position to form a plurality of strands, and the staple nucleic acid has sequences designed to fold the scaffold nucleic acid at a predetermined position, and when bound to the scaffold nucleic acid in the above method, the scaffold nucleic acid has a predetermined structure. can be formed.
스캐폴드 핵산 가닥과 스테이플 핵산이 결합하여 이중 가닥(이중 나선)을 이룰 수 있는데, 핵산 오리가미 구조체는 예를 들면 2 내지 50, 2 내지 45, 2 내지 40, 2 내지 35, 2 내지 30, 2 내지 25 또는 2 내지 20, 2 내지 12, 4 내지 12 나선 다발(helix bundle)을 가질 수 있고, 구체적으로는 4 나선 다발 내지 12 나선 다발을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The scaffold nucleic acid strand and the staple nucleic acid can be combined to form a double strand (double helix), and the nucleic acid origami structure is, for example, 2 to 50, 2 to 45, 2 to 40, 2 to 35, 2 to 30, 2 to 30. It may have 25 or 2 to 20, 2 to 12, or 4 to 12 helix bundles, and specifically may have 4 to 12 helix bundles, but is not limited thereto.
핵산 나노 구조체는 기결정된 위치에서 접혀 복수개의 가닥을 이룬 스캐폴드 핵산, 및 적어도 일부가 상기 스캐폴드 핵산과 상보적인 서열을 가져, 상기 가닥 중 적어도 하나에 결합되어 이중 가닥을 형성하는 복수개의 스테이플 핵산을 포함하는 것일 수 있다.The nucleic acid nanostructure includes a scaffold nucleic acid folded at a predetermined position to form a plurality of strands, and a plurality of staple nucleic acids, at least a portion of which has a sequence complementary to the scaffold nucleic acid, and is bound to at least one of the strands to form a double strand. It may include.
핵산 나노 구조체는 기결정된 위치에서 접혀 복수개의 가닥을 이룬 스캐폴드 핵산을 포함하는 것일 수 있고, 스테이플 핵산은 포함하지 않을 수 있다.The nucleic acid nanostructure may include scaffold nucleic acid that is folded at a predetermined position to form a plurality of strands, and may not include staple nucleic acid.
핵산 나노구조체는 얼음결정과 접촉할 수 있는 면을 포함할 수 있다. 예를 들어 핵산 나노구조체는 얼음결정과 평면 또는 곡면 접촉할 수 있다.The nucleic acid nanostructure may include a surface that can contact ice crystals. For example, nucleic acid nanostructures can be in flat or curved contact with ice crystals.
용어 “평면 접촉”은 “면 접촉”과 상호 교환적으로 사용 가능하며 면과 면이 접촉할 때 그 경계에 실질적으로 평면이 형성되는 경우를 의미하고, “곡면 접촉”은 경계에 곡면이 형성되는 경우를 의미한다.The term “plane contact” can be used interchangeably with “surface contact” and refers to a case where a substantially flat surface is formed at the boundary when surfaces come into contact, and “curved surface contact” refers to a case where a curved surface is formed at the boundary. It means case.
핵산 나노구조체는 얼음결정과 접촉할 수 있으면 충분하고, 그 형태는 제한되지 않는다. 예를 들어, 핵산 나노구조체는 선형, 판형, 원통형 또는 구형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 실시예에 따르면 핵산 나노구조체는 원통형(Barrel) 또는 판형(plate)일 수 있다. 본 출원인은 실시예를 통해 실질적으로 동일한 질량을 가진 원통 형태의 나노구조체에 비해 판 형태의 나노구조체가 더 높은 얼음 재결정화 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다.It is sufficient for the nucleic acid nanostructure to be in contact with an ice crystal, and its shape is not limited. For example, nucleic acid nanostructures may be linear, plate-shaped, cylindrical, or spherical, but are not limited thereto. According to one embodiment, the nucleic acid nanostructure may be cylindrical (barrel) or plate-shaped. Through examples, the present applicant confirmed that the plate-shaped nanostructure exhibits a higher ice recrystallization inhibition effect than the cylindrical nanostructure with substantially the same mass.
통상적으로 DNA 나노구조체는 구조적 안정성을 유지하기 위해 높은 농도의 마그네슘 이온을 필요로 한다. 본 발명의 표면이 개질된 나노구조체는 DNA 나노구조체에 올리고펩티드를 결합시킴으로써 DNA 나노구조체의 표면을 부동화 (passivation)시킬 수 있고, 마그네슘 이온이 낮은 농도로 포함된 환경에서도 구조적 안정성이 유지될 수 있다.Typically, DNA nanostructures require a high concentration of magnesium ions to maintain structural stability. The surface-modified nanostructure of the present invention can passivate the surface of the DNA nanostructure by binding oligopeptides to the DNA nanostructure, and structural stability can be maintained even in an environment containing low concentrations of magnesium ions. .
용어 “올리고펩티드”는 “폴리펩티드”, “펩티드” 또는 “단백질”과 상호교환적으로 사용될 수 있고, 펩티드 결합을 통해 공유결합된 아미노산 잔기로 구성된 중합체 화합물을 의미한다. 본 발명에서는 공지의 기술을 통해 합성된 펩티드를 이용할 수 있다. 본 발명에서 올리고펩티드의 서열은 N 말단에서 C 말단 순서로 기재한다.The term “oligopeptide” may be used interchangeably with “polypeptide”, “peptide” or “protein” and refers to a polymeric compound composed of amino acid residues covalently linked through peptide bonds. In the present invention, peptides synthesized through known techniques can be used. In the present invention, the oligopeptide sequence is described in order from N-terminus to C-terminus.
올리고펩티드는 화학적 방법 또는 생물학적 방법으로 제조된 것일 수 있다. 화학적 방법은 예컨대 용액상 방법; tertbutyloxycarbonyl (Boc)/benzyl (Bzl) 전략 및 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)/tert-butyl (t-Bu) 전략을 포함하는 고체상 방법; 레진에 첫번째 아미노산을 고정화시키고 서열 순서대로 펩티드 사슬을 연장시키는 방법; 또는 마이크로파를 이용한 방법일 수 있고, 생물학적 방법은 미생물을 이용한 방법일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Oligopeptides may be produced by chemical or biological methods. Chemical methods include, for example, solution phase methods; solid-phase methods including the tertbutyloxycarbonyl (Boc)/benzyl (Bzl) strategy and the 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)/tert-butyl (t-Bu) strategy; A method of immobilizing the first amino acid on resin and extending the peptide chain in sequence order; Alternatively, it may be a method using microwaves, and the biological method may be a method using microorganisms, but is not limited thereto.
본 발명의 표면이 개질된 나노구조체는 핵산 나노구조체에 결합된 올리고펩티드를 포함할 수 있다. 상기 결합은 공유결합 및/또는 비공유결합일 수 있다. The surface-modified nanostructure of the present invention may include an oligopeptide bound to a nucleic acid nanostructure. The bond may be a covalent bond and/or a non-covalent bond.
예를 들어, 올리고펩티드는 핵산 나노구조체의 적어도 일부에 비공유결합될 수 있다. 예컨대 상기 비공유결합은 정전기적 결합일 수 있다.For example, the oligopeptide may be non-covalently bound to at least a portion of the nucleic acid nanostructure. For example, the non-covalent bond may be an electrostatic bond.
다른 예를 들어, 올리고펩티드의 N 말단이 핵산 나노구조체에 공유결합되고, 상기 올리고펩티드의 일부 아미노산이 상기 핵산 나노구조체에 비공유결합될 수 있다. For another example, the N-terminus of the oligopeptide may be covalently bound to the nucleic acid nanostructure, and some amino acids of the oligopeptide may be non-covalently bound to the nucleic acid nanostructure.
용어 “비공유결합(noncovalent interaction)”은 공유결합이 아닌 결합을 의미하며, DNA와 단백질의 상호 작용, 효소와 기질의 상호작용, 호르몬과 수용체의 상호작용등 고분자 사이의 상호 작용을 가능하게 해 생명 유지에 중요한 역할을 할 수 있다.The term “noncovalent interaction” refers to a bond other than a covalent bond, and enables interactions between macromolecules, such as interactions between DNA and proteins, interactions between enzymes and substrates, and interactions between hormones and receptors, thereby contributing to life. It can play an important role in maintenance.
공유결합이 아닌 결합을 이용해 올리고펩티드를 핵산 나노구조체에 결합시키는 경우 보다 효율적으로 표면이 개질된 나노구조체를 제조할 수 있다. 한편, 공유결합을 이용해 올리고펩티드를 핵산 나노구조체에 결합시키는 경우, 핵산 나노구조체 및/또는 올리고펩티드에 공유결합을 할 수 있는 작용기를 도입하거나 링커(Linker)가 필요한바 공유결합이 아닌 결합을 이용하는 경우에 비해 상대적으로 표면이 개질된 나노구조체의 제조효율이 낮을 수 있다.When oligopeptides are bound to nucleic acid nanostructures using bonds rather than covalent bonds, nanostructures with modified surfaces can be manufactured more efficiently. On the other hand, when binding an oligopeptide to a nucleic acid nanostructure using a covalent bond, a functional group capable of covalently bonding to the nucleic acid nanostructure and/or the oligopeptide is introduced or a linker is required, using a bond other than a covalent bond. Compared to other cases, the manufacturing efficiency of nanostructures with modified surfaces may be relatively low.
올리고펩티드에 포함된 적어도 일부 아미노산에 의해 올리고펩티드가 핵산 나노구조체의 적어도 일부에 비공유결합될 수 있다.The oligopeptide may be non-covalently bound to at least a portion of the nucleic acid nanostructure by at least some amino acids included in the oligopeptide.
올리고펩티드는 상기 핵산 나노구조체의 적어도 일부에 비공유결합할 수 있는 작용기(functional group)를 갖는 제1아미노산을 적어도 하나 포함할 수 있다. 즉, 상기 올리고펩티드와 상기 핵산 나노구조체의 결합은 상기 제1아미노산과 상기 핵산 나노구조체 사이의 상호작용에 의한 것일 수 있다. 상기 비공유결합은 상기 제1아미노산의 물리화학적 특성에 의한 것일 수 있다.The oligopeptide may include at least one first amino acid having a functional group that can non-covalently bind to at least a portion of the nucleic acid nanostructure. That is, the binding between the oligopeptide and the nucleic acid nanostructure may be due to the interaction between the first amino acid and the nucleic acid nanostructure. The non-covalent bond may be due to the physicochemical properties of the first amino acid.
제1아미노산은 핵산 나노구조체의 적어도 일부에 결합할 수 있는 작용기를 가지는 것이면 그 종류가 제한되지 않으며, 예를 들어 제1아미노산은 라이신일 수 있다.The type of the first amino acid is not limited as long as it has a functional group capable of binding to at least a portion of the nucleic acid nanostructure. For example, the first amino acid may be lysine.
올리고펩티드는 상기 제1아미노산을 복수개 포함할 수 있다. 올리고펩티드는 복수개의 연속된 제1아미노산을 포함할 수 있다.The oligopeptide may contain a plurality of the first amino acids. An oligopeptide may contain a plurality of consecutive first amino acids.
올리고펩티드는 N 말단 또는 C말단에 상기 제1아미노산이 위치하는 것일 수 있다. 예컨대 올리고펩티드는 N 말단 또는 C말단에 (Lys)k-(k는 1 이상의 정수)를 포함할 수 있다. 올리고펩티드는 N 말단 또는 C말단에 (Lys)k-(k는 2 내지 15, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 4 내지 6, 또는 5의 정수일 수 있으나, 이에 제한되지 않음)를 포함할 수 있다.The oligopeptide may have the first amino acid located at the N-terminus or C-terminus. For example, the oligopeptide may include (Lys) k - (k is an integer of 1 or more) at the N-terminus or C-terminus. The oligopeptide has (Lys) k -(k may be an integer of 2 to 15, 2 to 10, 2 to 8, 2 to 6, 4 to 6, or 5, but is not limited to) at the N-terminus or C-terminus. It can be included.
올리고펩티드는 핵산 나노구조체와의 결합 및 경화를 위해 N-말단에 적어도 하나 이상의 Lys을 포함할 수 있다.The oligopeptide may contain at least one Lys at the N-terminus for binding to and curing the nucleic acid nanostructure.
올리고펩티드는 제1아미노산 외에도, 핵산 나노구조체에 결합할 수 있는 구성을 더 포함할 수 있다.In addition to the first amino acid, the oligopeptide may further include a component that can bind to the nucleic acid nanostructure.
올리고펩티드는 항동결 기능을 갖는 아미노산 성분을 포함할 수 있다. 본 올리고펩티드는 공지의 항동결 펩티드에 포함된 적어도 하나의 아미노산을 포함할 수 있다.The oligopeptide may contain an amino acid component that has anti-freezing function. The present oligopeptide may contain at least one amino acid included in known anti-freezing peptides.
상기 항동결 기능을 갖는 아미노산 성분은 핵산 나노구조체와 상호작용하지 않는 것일 수 있다. 즉, 항동결 기능을 갖는 아미노산 성분은 올리고펩티드에서 핵산 나노구조체와 직접적으로 결합하는 영역이 아닐 수 있다.The amino acid component having the anti-freezing function may not interact with the nucleic acid nanostructure. In other words, the amino acid component with anti-freezing function may not be a region of the oligopeptide that directly binds to the nucleic acid nanostructure.
올리고펩티드는 핵산 나노구조체에 올리고펩티드를 결합시키는 역할을 할 수 있는 상기 제1아미노산; 및 항동결 기능을 갖는 아미노산;을 포함할 수 있다.The oligopeptide includes the first amino acid that can serve to bind the oligopeptide to the nucleic acid nanostructure; and an amino acid having an anti-freezing function.
예를 들어, 올리고펩티드는 복수개의 연속된 라이신을 포함할 수 있다. 상기 라이신은 핵산 나노구조체의 표면에 결합할 수 있다.For example, an oligopeptide may contain multiple consecutive lysines. The lysine can bind to the surface of the nucleic acid nanostructure.
예를 들어, 올리고펩티드는 복수개의 연속된 라이신 및 항동결능을 갖는 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 항동결능을 갖는 아미노산은 트레오닌 또는 알라닌일 수 있다.For example, the oligopeptide may include a plurality of consecutive lysines and an amino acid with anti-freezing ability. The amino acid having the anti-freezing ability may be threonine or alanine.
용어 “항동결 펩티드”는 얼음과 결합하여 얼음 결정의 성장을 막는 특징을 가진 단백질로, 결빙방지 폴리펩티드 (anti-freezing peptides, AFPs), 결빙방지 당단백질, 결빙방지 글리코펩티드 (anti-freezing glycopeptides, AFGP), 열 이력 폴리펩타이드 등일 수 있다. 예컨대, 항동결 펩티드는 북극 및 남극환 내의 지방을 포함해서 지구의 극지 지방의 물에서 사는 냉혈 수생 극지 어류 종에서 생산되는 결빙 방지 펩티드; 극지 규조, 당근 및 민들레를 비롯한 다양한 고등 식물에서 생산되는 결빙 방지 펩티드; 곤충, 세균, 어류 등 다양한 종에서 생산되는 결빙 방지 펩티드일 수 있고, 구체적으로 FfIBP, NglIBP 또는 Type III AFP일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The term “anti-freeze peptide” refers to proteins that have the property of binding to ice and preventing the growth of ice crystals, including anti-freezing polypeptides (AFPs), anti-freezing glycoproteins, and anti-freezing glycopeptides (anti-freezing glycopeptides). AFGP), heat history polypeptide, etc. For example, anti-freeze peptides include those produced by cold-blooded aquatic polar fish species that live in the waters of the Earth's polar regions, including those within the Arctic and Antarctic rings; Anti-freeze peptides produced by a variety of higher plants, including polar diatoms, carrots, and dandelions; It may be an anti-freezing peptide produced in various species such as insects, bacteria, and fish, and may specifically be FfIBP, NglIBP, or Type III AFP, but is not limited thereto.
올리고펩티드는 소수성 작용기를 갖는 아미노산; 또는 소수성 및 친수성 작용기를 갖는 아미노산;을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 올리고펩티드는 히스티딘(His), 글리신(Gly), 프롤린(Pro), 알라닌(Ala), 발린(Val), 이소류신(Ile), 류신(Leu), 메티오닌(Met), 티로신(Tyr) 및 트레오닌(Thr)으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 아미노산은 핵산 나노구조체와 직접적으로 결합하는 영역이 아닐 수 있다.Oligopeptides include amino acids having a hydrophobic functional group; or amino acids having hydrophobic and hydrophilic functional groups; For example, the oligopeptide of the present invention includes histidine (His), glycine (Gly), proline (Pro), alanine (Ala), valine (Val), isoleucine (Ile), leucine (Leu), methionine (Met), It may contain at least one amino acid selected from the group consisting of tyrosine (Tyr) and threonine (Thr). The amino acid may not be in a region that directly binds to the nucleic acid nanostructure.
올리고펩티드는 히스티딘(His), 글리신(Gly), 프롤린(Pro), 알라닌(Ala), 발린(Val), 이소류신(Ile), 류신(Leu), 메티오닌(Met), 티로신(Tyr) 및 트레오닌(Thr)으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 연속으로 또는 이격적으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Oligopeptides include histidine (His), glycine (Gly), proline (Pro), alanine (Ala), valine (Val), isoleucine (Ile), leucine (Leu), methionine (Met), tyrosine (Tyr), and threonine ( Thr) may contain at least one selected from the group consisting of (Thr) consecutively or spaced apart, but is not limited thereto.
올리고펩티드는 히스티딘(His), 글리신(Gly), 프롤린(Pro), 알라닌(Ala), 발린(Val), 이소류신(Ile), 류신(Leu), 메티오닌(Met), 티로신(Tyr) 및 트레오닌(Thr)으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 단수 또는 복수개 포함할 수 있다.Oligopeptides include histidine (His), glycine (Gly), proline (Pro), alanine (Ala), valine (Val), isoleucine (Ile), leucine (Leu), methionine (Met), tyrosine (Tyr), and threonine ( It may include singular or plural numbers of at least one selected from the group consisting of Thr).
트레오닌, 알라닌, 발린, 티로신 및 글리신 등은 항동결 펩티드의 주요한 아미노산 성분으로 알려져 있고, 이들 아미노산은 다른 아미노산에 비해 얼음과의 상호작용이 우수하고, 얼음 결정이 성장하는 것을 효과적으로 조절(특히, 방지)할 수 있다.Threonine, alanine, valine, tyrosine, and glycine are known as major amino acid components of anti-freeze peptides, and these amino acids have better interaction with ice than other amino acids, and effectively control (in particular, prevent) the growth of ice crystals. )can do.
올리고펩티드는 트레오닌 또는 알라닌 중 적어도 하나의 아미노산을 포함할 수 있다. 올리고펩티드는 트레오닌 또는 알라닌 중 적어도 하나의 아미노산을 단수 또는 복수개 포함할 수 있다.The oligopeptide may contain at least one amino acid of threonine or alanine. The oligopeptide may contain a single or plural amino acid of at least one of threonine or alanine.
올리고펩티드는 (Thr)n 및 (Ala)n 로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 포함할 수 있다(이 때 n은 1 이상의 정수임). 상기 n은 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 4 내지 6, 또는 5의 정수일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The oligopeptide may include at least one selected from the group consisting of (Thr) n and (Ala) n (where n is an integer of 1 or more). The n may be an integer of 2 to 10, 2 to 8, 2 to 6, 4 to 6, or 5, but is not limited thereto.
올리고펩티드는 (Lys)k-(Thr)n 또는 (Lys)k-(Ala)n이고, 상기 n은 2 내지 10의 정수이고, 상기 k는 2 내지 15의 정수일 수 있다. 상기 n은 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 4 내지 6, 또는 5의 정수; 또는 2, 5, 7 또는 10;일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 k는 2 내지 15, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 4 내지 6, 또는 5의 정수일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The oligopeptide is (Lys) k -(Thr) n or (Lys) k -(Ala) n , where n is an integer from 2 to 10, and k may be an integer from 2 to 15. where n is an integer of 2 to 10, 2 to 8, 2 to 6, 4 to 6, or 5; or 2, 5, 7 or 10; but is not limited thereto. The k may be an integer of 2 to 15, 2 to 10, 2 to 8, 2 to 6, 4 to 6, or 5, but is not limited thereto.
일 실시예에 따르면, 본 발명의 올리고펩티드는 라이신; 및 트레오닌 또는 알라닌 중 적어도 하나의 아미노산;을 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 올리고펩티드는 N 말단 또는 C말단에 단수 또는 복수개의 라이신이 존재하고, 트레오닌 또는 알라닌 중 적어도 하나의 아미노산을 단수 또는 복수개 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 올리고펩티드는 (Lys)5-(Thr)2, (Lys)5-(Thr)5, (Lys)5-(Thr)7, (Lys)5-(Thr)10, (Lys)5-(Ala)2, (Lys)5-(Ala)5, (Lys)5-(Ala)7, 또는 (Lys)5-(Ala)10일 수 있다.According to one embodiment, the oligopeptide of the present invention includes lysine; and at least one amino acid of threonine or alanine. Specifically, the oligopeptide of the present invention may have a single or plural lysine at the N-terminus or C-terminus, and may contain a single or plural amino acid of at least one of threonine or alanine. For example, oligopeptides include (Lys) 5 -(Thr) 2 , (Lys) 5 -(Thr) 5 , (Lys) 5 -(Thr) 7 , (Lys) 5 -(Thr) 10 , (Lys) 5 -(Ala) 2 , (Lys) 5 -(Ala) 5 , It may be (Lys) 5 -(Ala) 7, or (Lys) 5 -(Ala) 10 .
통상의 핵산 나노구조체는 구조적 안정성을 유지하기 위해 높은 농도의 마그네슘 이온을 필요로 한다. 그러나, 높은 농도의 마그네슘 이온은 역삼투 현상을 통해 세포 및 조직의 생존율을 저해하므로 핵산 나노구조체를 세포의 동결보존에 사용하기 어려운 문제가 있다. 한편, 본 발명에 따른 나노구조체는 올리고펩티드의 N-말단에 존재하는 라이신(Lys)에 의해 표면이 부동화(passivation)될 수 있는바, 세포 및 조직의 생장에 적합한 환경(낮은 농도의 마그네슘 이온이 포함된 환경)에서도 구조적 안정성이 유지될 수 있다(도 1 참조). 이에, 본 발명에 따른 나노구조체는 세포의 동결 보존 시 사용하기 적합하다.Typical nucleic acid nanostructures require high concentrations of magnesium ions to maintain structural stability. However, high concentrations of magnesium ions impair the survival rate of cells and tissues through reverse osmosis, making it difficult to use nucleic acid nanostructures for cryopreservation of cells. Meanwhile, the surface of the nanostructure according to the present invention can be passivated by lysine (Lys) present at the N-terminus of the oligopeptide, providing an environment suitable for the growth of cells and tissues (low concentration of magnesium ions). Structural stability can be maintained even in contained environments (see Figure 1). Therefore, the nanostructure according to the present invention is suitable for use in cryopreservation of cells.
또한, 세포를 동결하여 저장할 때 얼음 결정이 톱니 형상 또는 바늘 형상을 나타내는 경우 세포막 및/또는 세포벽이 파괴되어 세포의 생존율이 낮아지게 된다. 마찬가지로 식품을 동결하여 저장할 때 얼음 결정이 톱니 형상 또는 바늘 형상을 나타내는 경우 식품의 식감이 낮아지는 문제가 발생한다. 한편, 실시예를 통해 확인 한 것처럼 본 발명의 나노구조체를 첨가하면 얼음 결정이 톱니 형상 또는 바늘 형상이 아닌 끝이 뭉뚝한 형상으로 형성될 수 있고, 방향성 없이 성장할 수 있다. 이에, 본 발명의 나노구조체를 첨가하여 세포 동결 보존 시 세포의 생존율을 높일 수 있고 식품의 동결 보존 시 식감을 유지할 수 있는 장점이 있다. 이러한 점을 고려할 때 본 발명의 나노 구조체는 통상의 결빙 제어를 위한 원료로서 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 세포 및 식품의 동결 보존 시 사용하기 적합하다.Additionally, when freezing and storing cells, if the ice crystals have a sawtooth or needle shape, the cell membrane and/or cell wall is destroyed, lowering the survival rate of the cells. Likewise, when freezing and storing food, if the ice crystals have a sawtooth or needle shape, the texture of the food is reduced. Meanwhile, as confirmed through examples, when the nanostructure of the present invention is added, ice crystals can be formed in a blunt-ended shape rather than a sawtooth or needle-shaped shape, and can grow without direction. Accordingly, by adding the nanostructure of the present invention, the survival rate of cells can be increased when frozen and preserved, and the texture of food can be maintained when frozen. Considering this, the nanostructure of the present invention can not only be used as a raw material for general freezing control, but is also suitable for use in freeze-preservation of cells and food.
본 발명은 표면이 개질된 나노구조체를 포함하는 조성물을 포함하는 세포 동결 보존용 조성물을 제공한다.The present invention provides a composition for cell cryopreservation, including a composition containing a surface-modified nanostructure.
표면이 개질된 나노구조체를 포함하는 조성물에 대해서는 전술한 바 있어 구체적인 설명은 생략한다.Since the composition containing the surface-modified nanostructure has been described above, detailed description will be omitted.
동결 보존할 수 있는 세포는 원핵 세포; 진핵 세포; 미생물; 동물 세포; 암 세포, 정자; 난자; 성체 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 역분화 줄기 세포를 포함하는 줄기 세포; 제대혈, 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 포함하는 혈액 세포; 신장 세포, 간 세포, 및 근육 세포를 포함하는 조직 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Cells that can be cryopreserved include prokaryotic cells; eukaryotic cell; microbe; zooblast; cancer cells, sperm; egg cell; Stem cells, including adult stem cells, embryonic stem cells, and pluripotent stem cells; blood cells, including cord blood, white blood cells, red blood cells, and platelets; It may be, but is not limited to, tissue cells including kidney cells, liver cells, and muscle cells.
본 발명은 전술한 조성물을 포함하는 식품 동결 보존용 조성물을 제공한다.The present invention provides a composition for freeze-preserving food comprising the above-described composition.
표면이 개질된 나노구조체를 포함하는 조성물에 대해서는 전술한 바 있어 구체적인 설명은 생략한다.Since the composition containing the surface-modified nanostructure has been described above, detailed description will be omitted.
통상적으로 동결 보존시 사용되는 에틸렌글리콜, 글리세롤과 같은 화학보존제는 독성으로 인해 매우 제한적인 용도로만 사용되고 있다. 본 발명은 동결 보존시 생물자원의 손상을 최소화할 수 있다.Chemical preservatives such as ethylene glycol and glycerol, which are commonly used for cryopreservation, are used for very limited purposes due to their toxicity. The present invention can minimize damage to biological resources during cryopreservation.
또한, 본 발명은 표면이 개질된 나노구조체를 포함하는 조성물을 시료에 첨가하는 단계를 포함하는 동결 방지 방법을 제공한다.Additionally, the present invention provides a method for preventing freezing, including adding a composition containing a surface-modified nanostructure to a sample.
표면이 개질된 나노구조체를 포함하는 조성물에 대해서는 전술한 바 있어 구체적인 설명은 생략한다.Since the composition containing the surface-modified nanostructure has been described above, detailed description will be omitted.
상기 시료는 식품, 약품, 색소, 농화학제 및 생물학적 재료 중 적어도 하나일 수 있다.The sample may be at least one of food, medicine, pigment, agricultural chemical, and biological material.
이하, 실시예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the configuration and effects of the present invention will be described in more detail through examples. However, the examples below are provided only for illustrative purposes to aid understanding of the present invention, and the scope and scope of the present invention are not limited thereto.
1. 표면이 개질된 DNA 나노구조체의 제조1. Preparation of surface-modified DNA nanostructure
(1) DNA 나노구조체의 제조(1) Preparation of DNA nanostructures
M13mp18 벡터 (Guild bioscience, 미국)에 상보적으로 결합하는 staple DNA 가닥들을 혼합하여 DNA 나노구조체를 합성하였다. 해당 staple DNA 가닥의 염기서열은 caDNAno 프로그램(Douglas, S. M.; Marblestone, A. H.; Teerapittayanon, S.; Vazquez, A.; Church, G. M.; Shih, W. M. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic acids research, 2009, 37 (15), 5001-5006.)을 이용하여 진행된 DNA 나노구조체의 설계로부터 얻어내었다(도 10 및 11 참조). 나노구조체의 합성을 위해 10 mM의 염화마그네슘, 20 nM의 M13mp18 벡터, 200 nM의 staple DNA 가닥을 함유하는 수용액을 열풀림 기법으로 처리하여 자기조립을 유도하였다. 판형의 DNA 나노구조체의 자기조립을 위해서, 상기 수용액을 90℃로 승온시킨 후, 1℃/min의 속도로 냉각시킴으로써 DNA 가닥 사이의 자기조립을 유도하였다. 원통형의 DNA 나노구조체의 자기조립을 위해서는, 상기 수용액을 80℃로 승온시킨 후, 60℃에서 1℃/hour 의 속도로 냉각시킴으로써 DNA 가닥 사이의 자기조립을 유도하였다.A DNA nanostructure was synthesized by mixing staple DNA strands complementary to the M13mp18 vector (Guild bioscience, USA). The base sequence of the corresponding staple DNA strand was determined using the caDNAno program (Douglas, S. M.; Marblestone, A. H.; Teerapittayanon, S.; Vazquez, A.; Church, G. M.; Shih, W. M. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic acids research , 2009, 37 (15), 5001-5006.) was obtained from the design of the DNA nanostructure (see Figures 10 and 11). To synthesize the nanostructure, an aqueous solution containing 10 mM magnesium chloride, 20 nM of the M13mp18 vector, and 200 nM of the staple DNA strand was treated with a thermal annealing technique to induce self-assembly. For self-assembly of plate-shaped DNA nanostructures, the aqueous solution was heated to 90°C and then cooled at a rate of 1°C/min to induce self-assembly between DNA strands. For self-assembly of cylindrical DNA nanostructures, the aqueous solution was heated to 80°C and then cooled at 60°C at a rate of 1°C/hour to induce self-assembly between DNA strands.
합성된 DNA 나노구조체는 아가로스 젤 전기영동 (agarose gel electrophoresis)을 이용해 정제하였다. 아가로스 젤의 전기영동에는 10 mM의 염화마그네슘, 44.5 mM의 트리스(히드록시메틸)아미노메테인 , 44.5 mM의 붕산, 1 mM의 에틸렌다이아민테트라아세트산이 함유된 수용액이 사용되었으며, 1 wt%의 아가로스 젤에 90분 동안 60V의 전압을 가해 전기영동을 진행하였다. 전기영동을 통해 분리된 DNA 나노구조체는 Freeze ‘N Squeeze DNA gel extraction spin column (Biorad, 미국)을 이용하여 최종 정제하였다.The synthesized DNA nanostructure was purified using agarose gel electrophoresis. For electrophoresis of agarose gel, an aqueous solution containing 10mM magnesium chloride, 44.5mM tris(hydroxymethyl)aminomethane, 44.5mM boric acid, and 1mM ethylenediaminetetraacetic acid was used, 1 wt% Electrophoresis was performed by applying a voltage of 60V to the agarose gel for 90 minutes. The DNA nanostructures separated through electrophoresis were finally purified using Freeze ‘N Squeeze DNA gel extraction spin column (Biorad, USA).
DNA 나노구조체를 높은 수득율 및 확장성을 가지고 합성하였다. 도 2는 본 발명에서 사용된 DNA 나노구조체의 투과전자현미경 및 원자 힘 현미경 이미지를 나타낸다. 얼음 결정의 성장 및 재결정화 억제에 두 계면 간 접촉의 효과를 조사하기 위하여, 동일한 질량을 가지면서 원통형 및 판형의 형태를 갖도록 DNA 나노구조체를 합성하였다.DNA nanostructures were synthesized with high yield and scalability. Figure 2 shows transmission electron microscopy and atomic force microscopy images of the DNA nanostructure used in the present invention. To investigate the effect of contact between two interfaces on inhibiting ice crystal growth and recrystallization, DNA nanostructures with the same mass and cylindrical and plate-shaped shapes were synthesized.
(2) 표면이 개질된 DNA 나노구조체 제조(2) Manufacturing of surface-modified DNA nanostructures
Lys과 DNA 사이의 정전기적 인력이 존재하는 특징을 이용하여, 위 1.(1)에서 제조된 DNA 나노구조체를 항동결 올리고펩티드로 개질하였다. 구체적으로, N-말단에 적어도 하나의 라이신 (Lys)이 포함된 올리고펩티드를 DNA 나노구조체에 결합시켜 표면이 개질된 DNA 나노구조체를 제조하였다(도 1 참조). Using the characteristic of electrostatic attraction between Lys and DNA, the DNA nanostructure prepared in 1.(1) above was modified with an anti-freezing oligopeptide. Specifically, a surface-modified DNA nanostructure was prepared by binding an oligopeptide containing at least one lysine (Lys) at the N-terminus to the DNA nanostructure (see Figure 1).
보다 구체적으로, 10 mM의 염화마그네슘, 44.5 mM의 트리스(히드록시메틸)아미노메테인, 44.5 mM의 붕산, 1 mM의 에틸렌다이아민테트라아세트산에 분산된 DNA 나노구조체를 과량의 올리고펩티드와 혼합하고, 상온에서 30분간, 37℃에서 1시간동안 배양하여 DNA 나노구조체의 표면이 완전히 개질되도록 하였다. 배양 후, Amicon ultra centrifugal filter (Merk, 미국)를 이용해 과량의 올리고펩티드를 제거하고 phosphate buffered saline 용액에 재분산하였다. 상기 방법에서 N-말단에 (Lys)10-이 포함되고 항동결 아미노산 서열이 포함된 다양한 올리고펩티드(예컨대 N 말단-C 말단 순서로 (Lys)10-(Thr)n, (Lys)10-(Ala)n (n=1 이상의 정수))를 사용하여, 다양한 모이어티들의 얼음 성장에의 영향을 조사하였다. 먼저, (Lys)10-(Thr)5 및 (Lys)10-(Ala)5-가 결합된 나노구조체의 항동결 효능을 확인하여, (Lys)10-을 제외한 서열이 상이한 올리고펩타이드가 항동결 효과에 미치는 영향을 확인하였다. 또한, (Lys)10-(Thr)n에서 n이 2, 5, 7, 10인 올리고펩티드가 결합된 나노구조체의 항동결 효과를 확인하여, 올리고펩타이드의 길이가 항동결 효과에 미치는 영향을 확인하였다.More specifically, DNA nanostructures dispersed in 10mM magnesium chloride, 44.5mM tris(hydroxymethyl)aminomethane, 44.5mM boric acid, and 1mM ethylenediaminetetraacetic acid were mixed with an excess of oligopeptides. , the surface of the DNA nanostructure was completely modified by incubating at room temperature for 30 minutes and at 37°C for 1 hour. After incubation, excess oligopeptides were removed using an Amicon ultra centrifugal filter (Merk, USA) and redispersed in phosphate buffered saline solution. In the above method, various oligopeptides containing (Lys) 10 - at the N-terminus and containing an anti-freezing amino acid sequence (e.g., (Lys) 10 -(Thr) n , (Lys) 10 -( Ala) n (n=1 or greater integer)) was used to investigate the effect of various moieties on ice growth. First, the anti-freezing efficacy of the nanostructure combined with (Lys) 10 -(Thr) 5 and (Lys) 10 -(Ala) 5- was confirmed, and oligopeptides with different sequences except (Lys) 10 - were found to have anti-freezing properties. The impact on effectiveness was confirmed. In addition, the anti-freezing effect of a nanostructure containing oligopeptides with n of 2, 5, 7, and 10 in (Lys) 10 -(Thr) n was confirmed to determine the effect of the length of the oligopeptide on the anti-freezing effect. did.
2. 표면이 개질된 DNA 나노구조체의 안정성 분석2. Stability analysis of surface-modified DNA nanostructures
위1.(2)에서 제조된 표면이 개질된 DNA 나노구조체의 구조적, 물리적 및 화학적 안정성을 생체 내 환경과 유사한 조건에서 확인하였다. 이를 위해 표면이 개질된 DNA 나노구조체를 아가로스 젤 전기영동, 투과전자현미경 (transmission electron microscope) 및 원자 힘 현미경 (atmoic force microscope)을 이용하여 분석하였다(도 3 및 4 참조). Phosphate buffered saline 용액에 분산된 시료는 37℃에서 1시간동안 배양한 후, 상기 방법을 통한 분석에 사용되었다. 아가로스 젤의 전기영동에는 10 mM의 염화마그네슘, 44.5 mM의 트리스(히드록시메틸)아미노메테인, 44.5 mM의 붕산, 1 mM의 에틸렌다이아민테트라아세트산이 함유된 수용액이 사용되었으며, 1 wt%의 아가로스 젤에 90분 동안 60V의 전압을 가해 전기영동을 진행하였다. 투과전자현미경을 이용한 분석에는 포름산우라닐을 이용한 음성 염색(negative staining)을 동반하여 진행하였으며, 가속전압 100 kV하에서 분석을 진행하였다. 원자 힘 현미경을 이용한 분석에는 10 mM의 염화마그네슘, 44.5 mM의 트리스(히드록시메틸)아미노메테인, 44.5 mM의 붕산, 1 mM의 에틸렌다이아민테트라아세트산이 함유된 수용액상에 재분산된 시료를 사용하였다. 해당 수용액 상에서 시료를 운모(mica) 기판에 흡착시킨 후, 시료의 기하학적 형태를 분석하였다.The structural, physical, and chemical stability of the surface-modified DNA nanostructure prepared in 1.(2) above was confirmed under conditions similar to the in vivo environment. For this purpose, the surface-modified DNA nanostructure was analyzed using agarose gel electrophoresis, transmission electron microscope, and atomic force microscope (see FIGS. 3 and 4). The sample dispersed in phosphate buffered saline solution was incubated at 37°C for 1 hour and then used for analysis using the above method. For electrophoresis of agarose gel, an aqueous solution containing 10mM magnesium chloride, 44.5mM tris(hydroxymethyl)aminomethane, 44.5mM boric acid, and 1mM ethylenediaminetetraacetic acid was used, 1 wt% Electrophoresis was performed by applying a voltage of 60V to the agarose gel for 90 minutes. Analysis using a transmission electron microscope was accompanied by negative staining using uranyl formate, and analysis was conducted under an acceleration voltage of 100 kV. For analysis using atomic force microscopy, samples were redispersed in an aqueous solution containing 10 mM magnesium chloride, 44.5 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane, 44.5 mM boric acid, and 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid. used. After the sample was adsorbed onto a mica substrate in the aqueous solution, the geometric shape of the sample was analyzed.
먼저, 올리고펩티드가 결합된 표면이 개질된 DNA 나노구조체는 높은 농도의 마그네슘 이온이 포함된 수용액뿐 아니라 phasphate buffered saline이 포함된 수용액상에서도 구조적 안정성이 유지되는 것을 투과전자현미경 또는 원자 힘 현미경 이미지 분석 결과를 통해 확인하였다. 이는 아가로스 젤 전기영동 상에서 DNA 나노구조체에 해당하는 신호가 상기한 수용액의 조성 차이에도 불구하고 같은 위치에서 나타나는 것으로 뒷받침 될 수 있다. 한편, DNA 나노구조체는 높은 농도의 마그네슘 이온이 포함된 수용액에 분산된 경우 원통형 또는 판형의 구조가 유지되는 것을 투과전자현미경 또는 원자 힘 현미경 이미지 분석 결과를 통해 확인하였다. 하지만 생체 내 환경과 유사한 phosphate buffered saline이 포함된 수용액에 분산된 경우 구조적 안정성을 잃고 비정형적 형태를 나타내었다. 이러한 현상은 아가로스 젤 전기영동 상에서 DNA 나노구조체에 해당하는 신호가 상기한 수용액의 조성에 따라 상이한 위치에서 나타나는 것으로 뒷받침될 수 있다.First, the results of transmission electron microscopy or atomic force microscopy image analysis showed that DNA nanostructures with surface-modified oligopeptide-bound surfaces maintain structural stability not only in aqueous solutions containing high concentrations of magnesium ions but also in aqueous solutions containing phasphate buffered saline. It was confirmed through . This can be supported by the fact that in agarose gel electrophoresis, the signal corresponding to the DNA nanostructure appears at the same location despite the difference in composition of the aqueous solution. Meanwhile, it was confirmed through transmission electron microscopy or atomic force microscope image analysis results that the DNA nanostructure maintained its cylindrical or plate-shaped structure when dispersed in an aqueous solution containing a high concentration of magnesium ions. However, when dispersed in an aqueous solution containing phosphate buffered saline, similar to the in vivo environment, it lost structural stability and exhibited an atypical shape. This phenomenon can be supported by the fact that signals corresponding to DNA nanostructures appear at different positions in agarose gel electrophoresis depending on the composition of the aqueous solution.
3. 표면이 개질된 DNA 나노구조체의 얼음 재결정화 억제 효능 확인3. Confirmation of the effectiveness of surface-modified DNA nanostructures in suppressing ice recrystallization
위1.(2)에서 제조된 표면이 개질된 DNA 나노구조체의 얼음 재결정화 억제(ice recrystallization inhibition, IRI) 효능을 확인하였다 (도 5 내지 도 8 참조). 효능 확인을 위해 얼음 재결정화 억제 활성의 정량 측정에 대한 표준인 수크로오스 샌드위치 분석법을 수행하였다(Budke, C.; Heggemann, C.; Koch, M.; Sewald, N.; Koop, T. Ice recrystallization kinetics in the presence of synthetic antifreeze glycoprotein analogues using the framework of LSW theory. J. Phys. Chem. B 2009, 113 (9), 2865-2873.). 재결정화는 수크로오스 용액에 분산된 얼음 결정들 사이에 일어나며, 30분 간의 어닐링 시간동안 평균 얼음 결정 반경의 세제곱이 지속적으로 증가되도록 한다. 이때, 수용액상에 포함된 시료와 얼음 결정 사이의 상호작용이 거의 없는 경우, 재결정화 속도는 확산 지배 (diffusion limited) 반응에 의해 결정된다. 반면, 시료와 얼음 결정 사이의 상호작용으로 인해 얼음 결정의 재결정화가 억제되는 경우, 재결정화 속도는 상전이 지배 (phase transition limited) 반응에 의해 결정된다. 이에 따른 차이는 Lifshitz-Solyozov-Wagner (LSW) 이론을 이용한 재결정화 속도 (recrystallization rate)의 변화로 파악할 수 있다 (도 5의 위쪽 그림 참조).The ice recrystallization inhibition (IRI) efficacy of the surface-modified DNA nanostructure prepared in step 1. (2) above was confirmed (see FIGS. 5 to 8). To confirm efficacy, the sucrose sandwich assay, a standard for quantitative measurement of ice recrystallization inhibitory activity, was performed (Budke, C.; Heggemann, C.; Koch, M.; Sewald, N.; Koop, T. Ice recrystallization kinetics in the presence of synthetic antifreeze glycoprotein analogues using the framework of LSW theory. J. Phys. Chem. B 2009, 113 (9), 2865-2873.). Recrystallization occurs between ice crystals dispersed in the sucrose solution, causing the average cube of the ice crystal radius to continuously increase during the 30 min annealing time. At this time, when there is little interaction between the sample contained in the aqueous solution and the ice crystals, the recrystallization rate is determined by a diffusion limited reaction. On the other hand, when recrystallization of ice crystals is suppressed due to interaction between the sample and ice crystals, the recrystallization rate is determined by a phase transition limited reaction. The resulting difference can be identified as a change in recrystallization rate using the Lifshitz-Solyozov-Wagner (LSW) theory (see the upper figure of FIG. 5).
분석에 앞서 올리고펩티드로 표면이 개질된 DNA 나노구조체를 amicon ultra centrifugal filter를 이용해 정제하여 잔여 유기물에 의한 작용을 제거하였다. 수크로오스 샌드위치 검정으로 IRI 활성을 특성짓기 위하여, 40wt%의 수크로오스 존재 하에 시료를 2개의 커버글라스 사이에 주입하고 펠티에 냉각기에 위치하였다. -40℃까지 시료를 냉각시킨 후에, 펠티에 냉각기의 온도를 10℃/min의 속도로 -6℃까지 승온시켰다. 그 후, 시료를 해당 온도에서 30분간 배양하였다. 얼음 재결정화 억제 활성을 분석하기 위해 수크로스 용액상에 분산된 얼음 결정을 2분마다 촬영하고 이의 반경을 측정하였다. 시간에 따른 평균 얼음 결정 반경의 세제곱을 계산하고, 오스왈드 숙성에 따른 재결정화 속도를 계산해 재결정화 억제 활성을 정량하였다. 3회의 독립된 실험을 진행하였으며, 그 결과로부터 평균값을 도출하였다.Prior to analysis, the DNA nanostructure whose surface was modified with oligopeptides was purified using an amicon ultra centrifugal filter to remove the action of residual organic substances. To characterize IRI activity by sucrose sandwich assay, samples were injected between two coverglasses in the presence of 40 wt% sucrose and placed in a Peltier cooler. After cooling the sample to -40°C, the temperature of the Peltier cooler was raised to -6°C at a rate of 10°C/min. Afterwards, the samples were incubated at the corresponding temperature for 30 minutes. To analyze ice recrystallization inhibition activity, ice crystals dispersed in a sucrose solution were photographed every 2 minutes and their radii were measured. Recrystallization inhibition activity was quantified by calculating the cube of the average ice crystal radius over time and calculating the recrystallization rate according to Oswald ripening. Three independent experiments were conducted, and the average value was derived from the results.
먼저, 표면이 개질되지 않은 DNA 나노구조체 자체의 얼음 재결정화 억제 효과를 확인한 결과는 아래와 같다(도 5 참조). DNA 나노구조체가 포함되지 않은 완충용액의 경우 평균 얼음 결정 반경의 세제곱이 모든 구간에서 시간에 따라 선형적으로 증가하는 경향이 나타났다(도 5의 초록색 점). 이는 얼음 결정과 완충용액 사이의 상호작용이 없음을 보여준다. 원통형 및 판형 DNA 나노구조체 (100 μg/mL)가 포함된 완충용액은 평균 얼음 결정 반경의 세제곱이 시간에 따라 선형적으로 증가하는 구간이 15분을 기점으로 나뉘는 경향을 보인다. 이에 따른 15분간의 어닐링 이전 재결정화 속도는 완충 용액과 유사하게 나타났다 (k d,origami / k d,buffer ~ 1.0). 반면, 15분간의 어닐링 이후 완충용액 대비 재결정화 속도(k d,origami / k d,buffer)는 원통형과 판형 나노구조체에서 각각 0.81 및 0.61로 나타났다. 이는 얼음 결정의 재결정화 현상이 시간이 지남에 따라 확산 지배 반응에서 상전이 지배 반응으로 전환됨을 나타내며, DNA 나노구조체와 얼음 결정 사이에 약한 결합력이 있음을 의미한다.First, the results confirming the ice recrystallization inhibition effect of the DNA nanostructure itself without surface modification are as follows (see Figure 5). In the case of the buffer solution that did not contain DNA nanostructures, the cube of the average ice crystal radius tended to increase linearly with time in all sections (green dots in Figure 5). This shows that there is no interaction between the ice crystals and the buffer solution. Buffer solutions containing cylindrical and plate-shaped DNA nanostructures (100 μg/mL) tend to have a period starting at 15 minutes in which the cube of the average ice crystal radius increases linearly with time. Accordingly, the recrystallization rate before annealing for 15 minutes was similar to the buffer solution ( k d,origami / k d,buffer ~ 1.0). On the other hand, after 15 minutes of annealing, the recrystallization rate ( k d,origami / k d,buffer ) compared to the buffer solution was 0.81 and 0.61 for the cylindrical and plate-shaped nanostructures, respectively. This indicates that the recrystallization phenomenon of ice crystals switches from a diffusion-dominated reaction to a phase transition-dominated reaction over time, and that there is a weak binding force between the DNA nanostructure and the ice crystal.
표면이 개질된 DNA 나노구조체의 얼음 재결정화 억제 효과를 확인한 결과는 아래와 같다(도 6 내지 도 8 참조). 트레오닌을 포함한 올리고펩티드 ((Lys)10-(Thr)5)가 결합된 DNA 나노구조체를 첨가한 경우 보다 높은 농도(100 μg/mL)의 표면이 개질되지 않은 DNA 나노구조체에 대하여 얼음 결정의 재결정화가 현저하게 억제됨을 확인하였다 (도 6).The results confirming the ice recrystallization inhibition effect of the surface-modified DNA nanostructure are as follows (see FIGS. 6 to 8). Recrystallization of ice crystals for a DNA nanostructure with an unmodified surface at a higher concentration (100 μg/mL) when a DNA nanostructure containing threonine-containing oligopeptide ((Lys) 10 -(Thr) 5 ) was added. It was confirmed that anger was significantly suppressed (Figure 6).
표면이 개질된 DNA 나노구조체는 평균 얼음 결정 반경의 세제곱이 시간에 따라 선형적으로 증가하는 구간이 나뉘는 경향을 보이나, 나노구조체의 형태에 따라 상전이 지배 반응으로의 전환에 있어 상이한 경향이 나타났다. 원통형 나노구조체에서는 완충용액 대비 재결정화 속도가 0.97에서 0.68로 전환되어 확산 지배 반응에서 상전이 지배 반응으로의 전환이 명확하게 나타났다. 반면, 판형 나노구조체에서는 완충용액 대비 재결정화 속도가 상전이 지배 반응에 가까운 0.65에서 0.52로 전환되었다. 이는 재결정화 초기 단계에서 상전이 지배 반응으로의 전환이 신속하게 이루어지고 있으며, 나노구조체와 얼음 결정 사이에 강한 결합력이 존재함을 의미한다. 이를 통해 올리고펩티드로 DNA 나노구조체의 표면을 개질함으로써 얼음의 재결정화를 보다 더 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다. 또한 이러한 실험 결과는 표면이 개질되지 않은 DNA 나노구조체의 재결정화 억제 효과에서 확인한 바와 같이 곡면 접촉에 비하여 평면 접촉 시 성장하는 얼음과 결빙제어 소재 사이의 상호작용이 극대화됨을 보여준다.Surface-modified DNA nanostructures tend to be divided into sections where the cube of the average ice crystal radius increases linearly with time, but different trends in the transition to a phase transition-dominated reaction appear depending on the shape of the nanostructure. In the cylindrical nanostructure, the recrystallization rate compared to the buffer solution switched from 0.97 to 0.68, clearly showing the transition from a diffusion-dominated reaction to a phase transition-dominated reaction. On the other hand, in the plate-shaped nanostructure, the recrystallization rate compared to the buffer solution changed from 0.65 to 0.52, which is close to the phase transition dominant reaction. This means that the transition from the initial stage of recrystallization to a phase transition-dominated reaction is occurring quickly and that a strong bond exists between the nanostructure and the ice crystal. Through this, it was confirmed that recrystallization of ice could be more effectively suppressed by modifying the surface of the DNA nanostructure with oligopeptides. Additionally, these experimental results show that the interaction between the growing ice and the freezing control material is maximized during flat contact compared to curved contact, as confirmed by the recrystallization inhibition effect of DNA nanostructures with unmodified surfaces.
(Lys)10-을 제외한 서열이 상이한 올리고펩타이드를 사용하는 경우 항동결 효과에의 영향을 확인하기 위해 (Lys)10-(Ala)5이 결합된 DNA 나노구조체의 효과를 (Lys)10-(Thr)5이 결합된 DNA 나노구조체와 비교하였다 (도 7). 알라닌을 포함하는 올리고펩티드로 표면 개질된 DNA 나노구조체 포함하는 경우, 재결정화 초기 단계에서 완충용액 대비 재결정화 속도가 낮게 유지되다 상전이 지배 반응으로 완전히 전환되는 경향을 나타낸다. 이는 트레오닌을 포함하는 올리고펩티드로 표면 개질된 DNA 나노구조체에서와 같이 나노구조체와 얼음 결정 사이에 강한 결합력이 있으며, 이로부터 얼음의 재결정화를 효과적으로 억제할 수 있음을 의미한다. In order to check the effect on the anti-freezing effect when using oligopeptides with different sequences except for (Lys) 10 -, the effect of a DNA nanostructure to which (Lys) 10 -(Ala) 5 is bound was tested (Lys) 10 -( Thr) 5 was compared with the combined DNA nanostructure (FIG. 7). When a DNA nanostructure surface-modified with an oligopeptide containing alanine is included, the recrystallization rate remains low compared to the buffer solution in the initial stage of recrystallization and then tends to completely convert to a phase transition-dominated reaction. This means that, as in the case of a DNA nanostructure surface-modified with an oligopeptide containing threonine, there is a strong binding force between the nanostructure and the ice crystal, and this can effectively inhibit the recrystallization of ice.
또한, (Lys)10-(Thr)n에서 n이 2, 5, 7, 10인 올리고펩티드가 결합된 DNA 나노구조체의 효과를 비교하여 n 수가 항동결 효과에 미치는 영향을 확인하고, 이로부터 결빙제어 펩티드의 길이가 상이한 경우에도 항동결 효과를 나타냄을 검증하고자 하였다 (도 8). 올리고펩티드의 트레오닌 단량체 수에 따라 완충용액 대비 재결정화 속도는 상이하게 나타나나, 모든 경우에서 상전이 지배 반응으로의 전환이 재결정화 현상 초기에 일어남을 확인하였다. 이는 n 수에 상관없이 올리고펩티드로 표면 개질된 DNA 나노구조체가 얼음 결정과 강하게 상호작용 하며, 얼음 재결정화를 효과적으로 억제할 수 있음을 의미한다.In addition, the effect of the number of n on the anti-freezing effect was confirmed by comparing the effect of DNA nanostructures in which oligopeptides with n of 2, 5, 7, and 10 in (Lys) 10 -(Thr) n were bound, and from this, the effect of the number of n on the anti-freezing effect was confirmed. We sought to verify that the anti-freezing effect was observed even when the length of the control peptide was different (FIG. 8). The recrystallization rate compared to the buffer solution appears different depending on the number of threonine monomers in the oligopeptide, but in all cases, it was confirmed that the conversion to the phase transition dominant reaction occurred early in the recrystallization phenomenon. This means that regardless of the n number, DNA nanostructures surface-modified with oligopeptides interact strongly with ice crystals and can effectively suppress ice recrystallization.
Claims (14)
Nucleic acid nanostructure; and an oligopeptide bound to at least a portion of the nucleic acid nanostructure.
The anti-freezing composition of claim 1, wherein the nucleic acid is DNA.
The anti-freezing composition according to claim 1, wherein the nucleic acid nanostructure is a DNA origami structure formed by folding a predetermined portion of scaffold DNA.
The anti-freeze composition of claim 1, wherein the nucleic acid nanostructure includes at least one surface capable of contacting at least one surface of an ice crystal.
The anti-freezing composition according to claim 1, wherein the nucleic acid nanostructure is in the form of a cylinder or a plate.
The anti-freezing composition according to claim 1, wherein the oligopeptide includes at least one first amino acid having a functional group capable of non-covalently binding to at least a portion of the nucleic acid nanostructure.
The anti-freezing composition of claim 6, wherein the first amino acid is lysine.
The method of claim 1, wherein the oligopeptide is histidine (His), glycine (Gly), proline (Pro), alanine (Ala), valine (Val), isoleucine (Ile), leucine (Leu), methionine (Met), and threonine. An anti-freezing composition comprising at least one amino acid selected from the group consisting of (Thr).
The anti-freezing composition of claim 1, wherein the oligopeptide comprises at least one amino acid of threonine or alanine.
The method of claim 1, wherein the oligopeptide is (Lys) k -(Thr) n or (Lys) k -(Ala) n , where n is an integer from 2 to 10, and k is an integer from 2 to 15. Freezing composition.
A composition for cell cryopreservation comprising the composition of any one of claims 1 to 10.
A composition for freeze-preserving food comprising the composition of any one of claims 1 to 10.
A method for preventing freezing, comprising adding the composition of any one of claims 1 to 10 to a sample.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| EP2565200A1 (en) | 2010-04-30 | 2013-03-06 | Kaneka Corporation | Antifreeze protein |
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2022
- 2022-09-15 KR KR1020220116294A patent/KR20240037595A/en unknown
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