KR20240037272A - 건조 예방, 개선 또는 치료를 위한 지질 혼합물을 함유하는 점안액 및 이의 제조방법 - Google Patents

건조 예방, 개선 또는 치료를 위한 지질 혼합물을 함유하는 점안액 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 건조를 방지하기 위해 사용될 수 있는 항균성 지질 혼합물을 함유하는 점안액용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항균성 지질 혼합물을 함유하는 점안액용 조성물을 사용하는 경우 안구의 지질 존재 및 수분을 증가시킬 뿐만 아니라 안구 건조증 환자의 증상을 감소시킬 수 있다.

Description

건조 예방, 개선 또는 치료를 위한 지질 혼합물을 함유하는 점안액 및 이의 제조방법
본 발명은 지질 안약 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 건조를 방지하기 위해 사용될 수 있는 항균성 지질 혼합물을 함유하는 점안액용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
안구건조증(Dry eye disease, DED)은 전 세계 컴퓨터 사용자의 약 50%에 영향을 미친다. 과도한 화면 사용과 인공 블루라이트에 장기간 노출되면 안구건조증, 자극감 및 시야흐림 등의 증상이 유발된다. DED는 안구 표면의 생리적 수화를 담당하는 지질과 단백질 성분으로 구성된 눈물막 지질층(TFLL)이라고 불리는 외층에서 수분 증발에 기인한다. 인공 수성 눈물은 건조한 눈에 일시적인 눈의 편안함만을 제공하는 DED의 조기 치료로 널리 사용된다. 결과적으로, 이러한 제한은 안구 건조 증상뿐만 아니라 손상된 지질 눈물막 구조를 개선하기 위한 대체 요법으로서 지질 함유 점안액에 대한 추가 탐구에 대한 요구가 있다.
본 발명자들은 안구 지질 대체 요법을 제공하기 위하여 예의 연구를 거듭하였다. 이 목표를 위해, 본 발명자들은 이산화규소 표면에서 DOPC/LA 지질 바이셀 매개 형성에 대한 다양한 점성 점안액 모방 용액의 효과를 조사하였다. 또한 본 발명자들은 QCM-D, 형광 현미경 검사법 및 광표백 후 형광 회복(FRAP) 측정을 기록하여 흡착 역학을 추적하고 측면 지질 이동성 및 SLB(Supported Lipid Bilayer) 형성 품질을 평가하였다. 지질 바이셀(bicelle)에 해당하는 확산 제한 흡착 역학의 이론적 분석은 실험 결과를 보완하며 본 발명자들의 발견은 바이셀이 다양한 점성 환경에서 성공적인 SLB 형성을 달성하기 위한 강력한 도구임을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 건조, 구체적으로는 안구건조증을 예방, 개선 또는 치료를 위한, 지질 혼합물을 함유하는 점안액 및 이를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양태로서 본 발명은 항균성 지질 혼합물을 함유하는 안구건조의 예방, 개선 또는 치료용 점안액용 조성물을 제공한다.
일 양태로서 본 발명은 상기 점안액용 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
일 양태로서, 본 발명은 항균성 지질 혼합물을 포함하는 점안액용 조성물을 이용하여 안구건조를 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 점안제는, 종래 알려진 점안제가 단지 염(salt) 성분을 포함하여 단지 수분 공급을 목적으로 하는 것에 반해, 종래의 점안액 조성물에 더하여 바이셀 혼합물(bicellar mixture)를 포함하여 지질 교체뿐 아니라 눈(망막 또는 각막)의 수분 공급이 동시에 이루어지는 바 안구건조증에 대해 탁월한 예방, 개시 또는 치료 효과를 나타낸다.
도 1은 수용액에서 DOPC/LA 바이셀 흡착과 실리카 코팅된 센서 표면에서 지지된 지질 이중층 형성을 추적하기 위한 수정 진동자 마이크로 밸런스 법(QCM-D) 모니터링 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 실리카 코팅된 센서 표면에서 2 mg/ml HA 및 단일층, 지지된 지질 이중층 형성을 포함하는 수용액에서 DOPC/LA 바이셀 흡착을 추적하기 위한 수정 진동자 마이크로 밸런스 법(QCM-D) 모니터링 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 실리카 코팅된 센서 표면에서 4 mg/ml HA 및 단일층, 지지된 지질 이중층 형성을 포함하는 수용액에서 DOPC/LA 바이셀 흡착을 추적하기 위한 수정 진동자 마이크로 밸런스 법(QCM-D) 모니터링 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 실리카 코팅된 센서 표면에서 5 mg/ml CMC와 단일층, 지지된 지질 이중층 형성을 포함하는 수용액에서 DOPC/LA 바이셀 흡착을 추적하기 위한 수정 진동자 마이크로 밸런스 법(QCM-D) 모니터링 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 실리카 코팅된 센서 표면에서 3 mg/ml HPMC 및 단일층, 지지된 지질 이중층 형성을 포함하는 수용액에서 DOPC/LA 바이셀 흡착을 추적하기 위한 수정 진동자 마이크로 밸런스 법(QCM-D) 모니터링 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 실리카 코팅된 센터 표면에서 3 mg/ml HPMC 및 1 mg/ml 덱스트란을 함유한 수용액에서 DOPC/LA 바이셀 흡착을 추적하기 위한 수정 진동자 마이크로 밸런스 법(QCM-D) 모니터링 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 0.4% PEG와 0.3% PG를 포함하는 수용액에서 DOPC/LA 바이셀 흡착을 추적하기 위한 수정 진동자 마이크로 밸런스 법(QCM-D) 모니터링 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 QCM-D 측정으로 모니터링되는 이산화규소에 대한 다양한 점성 환경에서의 DOPC/LA 바이셀 흡착 결과를 나타낸 그래프이다. (a) 시간 분해 공진 주파수 이동(ΔF) 및 (b) 에너지 소산 이동(ΔD)를 나타낸다. 기준선은 버퍼만(대조군 샘플의 경우) 또는 적절한 점도 향상제가 있는 버퍼(PEG/PG, CMC, HPMC 및 HA 샘플의 경우)에서 기록된 후 각각의 점성 환경에서 지질 바이셀을 추가했다. 도 8에서 (c) 이산화규소 표면의 바이셀 흡착에 대한 최종 ΔF 및 ΔD 값의 요약을 나타낸다. ΔF 및 ΔD 값은 적절한 완충액-점도 증강제 혼합물의 기준선에 관련하여 보고되었다. 데이터는 n = 3 반복에 대한 평균 ± 표준 편차(standard deviation)로 보고되었다. 운동 프로파일의 회색 음영 영역과 열 그래프의 점선은 SLB에 대한 일반적인 QCM-D 측정 값을 나타내었다.
도 9는 DOPC/LA 바이셀 흡착 역학 및 이론적 비교 분석을 나타내는 그래프이다. (a) QCM-D 측정에 의해 추적된 지질 바이셀의 흡착으로터의 |ΔF|의 시간 미분계수. (b) 이론적으로 계산된 확산 제한 흡착 속도와 실험적으로 측정된 QCM-D 흡착 속도의 비교. 전자는 샘플의 점도 차이를 기반으로 하고 후자는 최대 |ΔF| 시간 미분계수 수치에 기반한다. 제시된 흡착 속도는 대조군 샘플에 대해 얻은 속도 값이 1로 정의되도록 정규화되었다. (b)의 데이터는 3회 반복에 대한 평균 ± sd로 보고된다.
도 10은 표면형광 현미경으로 모니터링되는 유리에 다양한 점도 향상제가 있는 형광 표지된 DOPC/LA 바이셀의 흡착 결과를 나타내는 사진이다. (a) 추가 점도 향상제 없이, (b) 0.4% PEG 및 0.3% PG 사용, (c) 5 mg/mL CMC 사용, (d) 3 mg/mL HPMC 사용, (e) 2 mg/mL HA를 사용한 지질 바이셀의 시간 경과 형광 현미경 사진을 나타낸다. 모든 스케일 바는 20μm이다.
도 11은 다양한 점도 향상제를 사용한 FRAP 실험 및 DOPC/LA 바이셀의 흡착으로 형성된 SLB 분석결과를 나타낸 도면이다. (a) 추가 점도 향상제 없이, (b) 0.4% PEG 및 0.3% PG, (c) 5 mg/mL CMC, (d) 3 mg/ mL HPMC 및 (e) 2 mg/mL HA 를 사용하여 형성된 SLB들의 광표백 전후에 SLB의 형광 현미경 사진을 나타낸다. 모든 스케일 바는 20μm이다. (f) 시간의 함수로서 광표백된 영역의 형광 강도(F.I.) 프로파일. F.I. 각 현미경 사진 세트에 대한 최대 및 최소 강도 값이 각각 1 및 0으로 설정되도록 값을 정규화했다. (g) n = 6 반복에 대한 FRAP 실험에서 계산된 확산 계수는 평균 ± sd로 표시되었다.
발명의 실시를 위한 최선의 형태
발명의 요약
본 발명은 항균성 지질 바이셀(bicelle) 함유 점안액용 조성물 및 상기 점안액용 조성물을 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 인간의 안구건조증 예방, 개선 또는 치료를 위한 신규한 방법을 개시한다. 특히, 본 발명은 인간의 안구 건조증을 치료하기 위한 신규한 방법을 개시한다. 일부 실시양태에서, 방법은 지질 바이셀-함유 점안액을 인간의 안구 표면에 국소적으로 투여하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 상기 점안액에 포함되는 지질 혼합물은 0.008 내지 0.91 mg/mL 농도 범위의 장쇄 지질 및 0.04 내지 0.9 mg/mL 농도 범위의 단쇄 지질을 포함할 수 있다. 상기 점안액에는 상기 지질 혼합물과 함께, 히알루론산(HA), 카르복시메틸셀룰로오스(CMC), 히드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC), HPMC + 덱스트란, PEG + 프로필렌 글리콜(PG), 또는 이들을 조합을 포함할 수 있고, 이들의 농도는 0.01 내지 5%(v/v)일 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
일 양태로서, 본 발명은 지질 혼합물을 포함하는, 안구건조증 예방, 개선 또는 치료용 점안액용 조성물에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은, 지질 혼합물을 포함하는 항균용 점안액용 조성물에 관한 것이다.
바람직한 일 양태에서 상기 점안액용 조성물은 약학적 조성물이다.
바람직한 일 양태에서, 상기 지질 혼합물은 “바이셀(bicelle)” 형태일 수 있다.
본 발명에서 바이셀(bicelle)이란, 장쇄 지질로 이루어진 2중층 평판막의 단부를, 단쇄 지질 등의 계면활성제로 커버한 디스크 모양의 분자집합체를 의미하며, 최소의 지질 2분자막 모델로서 생체막의 연구에 이용되고 있다.
이러한 바이셀 구조를 형성하기 위해, 본 발명의 점안액용 조성물 중의 지질 혼합물은 장쇄 지질 및 단쇄 지질을 포함한다.
상기 장쇄 지질은 일 예에 따른 지질 나노입자의 융합을 촉진할 수 있는 지질을 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 장쇄 인지질일 수 있다.
이러한 장쇄 인지질의 예를 들면, 디올레일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine, DOPE), 디스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine, DSPC), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린 (palmitoyloleoylphosphatidylcholine, POPC), 에그 포스파티딜콜린(egg phosphatidylcholine, EPC), 디올레오 일포스파티딜콜린(dioleoylphosphatidylcholine, DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린 (dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(dioleoylphosphatidylglycerol, DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(dipalmitoylphosphatidylglycerol, DPPG), 디스테아로일포스파티딜에탄 올아민(distearoylphosphatidylethanolamine, DSPE), 포스파티딜에탄올아민(Phosphatidylethanolamine, PE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(dipalmitoylphosphatidylethanolamine), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린](DOPS)(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine]) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 바람직하게 상기 장쇄 지질은 DOPC일 수 있다.
상기 단쇄 지질은, 예를 들면, 라우르산, 미리스트산, 미리스톨레산, 팔미트산, 팔미톨레산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 카프르산(capric acid), 카프릴산(caprylic acid), 알파-리놀렌산, 에루스산, 파이타노산 (phytanoic acid), 아라키드산, 아라키돈산, 에이코사노산(eicosanoic acid), 에이코사펜타에노산, 베헨산, 도코사펜타에노산, 및 도코사헥사에노산으로 구성된 비-제한적 그룹에서 선택될 수 있다. 바람직하게, 상기 단쇄 지질은 라우르산일 수 있다.
바람직하게, 상기 점안액용 조성물은 0.008 mg/mL ~ 0.91 mg/mL 농도 범위의 장쇄 지질 및 0.04 mg/mL ~ 0.9 mg/mL 농도 범위의 단쇄 지질을 포함할 수 있다.
바람직하게, 상기 점안액용 조성물에는 상기 지질 혼합물과 함께, 히알루론산(HA), 카르복시메틸셀룰로오스(CMC), 히드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC), HPMC + 덱스트란, PEG + 프로필렌 글리콜(PG) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 점증제가 추가적으로 포함할 수 있다. 구체적인 일 양태로서, 상기 점안액 중의 이들의 농도는 점안액의 전체 부피에 대해 0.01 내지 5%(v/v)일 수 있다.
본 발명에 따른 점안액용 조성물은 바람직하게는 7.0 ∼ 8.0의 pH, 더욱 바람직하게는 7.3 ∼ 7.7 범위의 pH를 가질 수 있다.
또 다른 일 실시양태에서, 본 발명에 따른 점안액 조성물은 담체로서 수성 매질, 예를 들어 주사용수, pH 조절제(예를 들어, 수산화나트륨, 염산, 또는 이의 수용액) 등을 함유할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 점안액은 점안제 분야에서 통상적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 첨가제, 예를 들어 염화나트륨 등의 등장화제; 인산수소이나트륨(Na2HPO4) 등의 완충제; 및/또는 수산화나트륨, 염산 등의 pH 조절제를 포함할 수 있다. 상기 등장화제, 완충제, 및 pH 조절제는 점안제 분야에서 통상적으로 사용되는 양으로 사용될 수 있으며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, pH 조절제는 바람직하게는 7.0 ∼ 8.0의 pH, 더욱 바람직하게는 7.3 ∼ 7.7 범위의 pH로 조절하기에 충분한 양으로 사용될 수 있다.
일 양태로서, 본 발명은 지질 혼합물을 포함하는, 점안액을 투여하는 단계를 포함하는, 안구 건조증 예방, 개선 또는 치료방법에 관한 것이다.
발명의 실시를 위한 형태
[실시예]
이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다.
제조예 1. 본 발명에 따른 점안제용 조성물 중의 지질 바이셀 및 추가의 점도개선제와의 혼합물의 제조
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC) 및 라우르산(LA) 지질 바이셀을 2의 q-ratio 및 0.0031mM DOPC의 최종 지질 농도에서 동결-해동-와류 (freeze-thaw-vortex) 사이클링에 의해 제조하였다. 완충 용액은 10mM Tris 및 150mM NaCl이었고 용액 pH는 7.5였다. 지질 바이셀은 히알루론산(HA), 카르복시메틸셀룰로오스(CMC), 히드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC), HPMC + 덱스트란 또는 PEG + 프로필렌 글리콜(PG)을 포함한 다양한 점도개선제(증점제)의 존재하에 분산시켰다. 증점제에 대한 자세한 설명은 표 1에 기재되어 있다.
Hyaluronic acid (HA)
* cosmetic grade, obtained from Resurrection Beauty
* Molecular weight: 100+kDa
* Concentration: 2&4 mg/ml		 HPMC + Dextran
* Dextran obtained from Sigma (Cat no: 31390)
* Dextran molecular weight: ~70kDa
* Concentration: 3mg/ml HPMC, 1mg/mL Dextran
Carboxymethylcellulose (CMC)
* Obtained from Sigma (Cat no. C4888)
* Molecular weight: not provided
* Concentration: 5mg/mL		 PEG + Propylene glyco (PG)
* PEG & PG obtained from Sigma (Cat no. 202398 & w294004)
* PEG molecular weight: ~400Da
* Concentration: 0.4% (v/v) PEG, 0.3% (v/v) PG
Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC)
* Obtained from Sigma (Cat no. 423181)
* Molecular weight: ~90 kDa
* Concentration: 3mg/mL		 -
실시예 1. 본 발명에 따른 점안제용 조성물 중의 지질 바이셀 및 추가의 점도개선제와의 조합의 수정 진동자 마이크로 밸런스 법(QCM-D) 모니터링
제조예 1과 같이 제조된 점도개선제에 분산된 DOPC/LA 지질 바이셀의 수용액에서의 흡착과 실리카 코팅된 센서 표면에서의 지지된 지질 이중층 형성을 추적하기 위한 석영 크리스탈 미세 균형 소산(quartz crystal microbalance-dissipation, QCM-D) 모니터링 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 1 내지 도 7, 및 표 2에 나타내었다.
구체적으로, 이산화규소 표면에 지질 바이셀 샘플의 흡착은 Q-Sense E4 기기(Biolin Scientific AB, 스웨덴)를 사용한 수정 진동자 마이크로 밸런스 법 (QCM-D) 실험에 의해 모니터링되었다. 각 실험 전에 이산화규소로 코팅된 센서 칩을 1%(wt/vol) SDS 수용액, 물, 에탄올로 차례로 헹구고 부드러운 질소 가스 흐름 하에서 건조시킨 후 산소 플라즈마 처리(PDC-002, Harrick Plasma, Ithaca, NY, USA) 1분 동안 액체 샘플은 연동 펌프를 사용하여 100μL min-1의 유속으로 연속 흐름 조건에서 측정 챔버에 도입하였다. 측정 데이터는 1Hz의 시간 분해능으로 Q-Soft 소프트웨어 패키지(Biolin Scientific AB)에 의해 여러 홀수 배음(odd overtones)에서 수집되었으며 5번째 배음에서 배음 정규화 데이터가 보고되었다. 데이터 처리는 Q-Tools(Biolin Scientific AB) 및 OriginPro(OriginLab, USA) 소프트웨어 프로그램을 사용하여 수행되었다. 모든 측정은 25°C에서 수행되었다.
바이셀 형성 평균 Δf 평균 ΔD
DOPC/LA -25.2 ± 0.7 0.13 ± 0.06
DOPC/LA + 2 mg/mL HA -24.9 ± 0.4 0.33 ± 0.06
DOPC/LA + 4 mg/mL HA -26.7 ± 0.7 0.30 ± 0.17
DOPC/LA + 5 mg/mL CMC -26.2 ± 0.4 1.23 ± 0.11
DOPC/LA + 3 mg/mL HPMC -27.3 ± 0.6 1.57 ± 0.21
DOPC/LA + 3 mg/mL HPMC, 1 mg/mL Dextran -27.1 ± 0.9 1.10 ± 0.26
DOPC/LA + 0.4% PEG, 0.3% PG -25.8 ± 0.6 0.47 ± 0.21
도 1 내지 7 및 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 점안제에 포함되는 지질 혼합물의 경우 지질 이중층의 값인 Frequency 기준 -24Hz ~ -28Hz내에서 완벽한 지질 이중층이 형성된 것을 확인하였다. 여기에 기반이 되는 Energy Dissipation값 기준(-2 미만)도 충족하여 완벽한 지질 이중층이 형성된 것을 다시 한 번 보여주는 데이터이다.
실시예 2. 본 발명에 따른 점안제용 조성물 중의 지질 바이셀 및 추가의 점도개선제와의 조합의 점도 확인
점도가 향상된 4가지 완충용액과 일반 완충용액의 유변학적 특성은 CP 25-1 콘/플레이트 형상(0.982°각, 24.990mm, 47μm 간격)을 갖는 MCR 501 응력 제어 유변계(Anton Paar, Austria)를 사용하여 진동 측정을 수행하는 것을 특징으로 하였다. 각 시료 75 μL를 측정 단계에 로딩하였으며, 선형 점탄성 영역 내에서 측정이 이루어지도록 0.1 s-1에서 500 s-1로 전단율을 로그적으로 증가시켜 점도를 측정하였다. 모든 측정은 25°C에서 수행되었다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.
바이셀 형성 평균 Δf 평균 ΔD
DOPC/LA -25.2 ± 0.7 0.13 ± 0.06
DOPC/LA + 2 mg/mL HA -24.9 ± 0.4 0.33 ± 0.06
DOPC/LA + 4 mg/mL HA -26.7 ± 0.7 0.30 ± 0.17
DOPC/LA + 5 mg/mL CMC -26.2 ± 0.4 1.23 ± 0.11
DOPC/LA + 3 mg/mL HPMC -27.3 ± 0.6 1.57 ± 0.21
DOPC/LA + 3 mg/mL HPMC, 1 mg/mL Dextran -27.1 ± 0.9 1.10 ± 0.26
DOPC/LA + 0.4% PEG, 0.3% PG -25.8 ± 0.6 0.47 ± 0.21
실시예 3. 본 발명에 따른 점안제용 조성물 중의 지질 바이셀 및 추가의 점도개선제와의 혼합물의 제조 및 이들의 점도 측정, 흡착 및 SLB 형성 확인
3-1 재료 및 방법
시약.
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC) 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(리사민 로다민 B 설포닐)(암모늄 염)(Rh-PE)에 용해 클로로포름은 Avanti Polar Lipids(미국)에서 얻었다. 라우르산(L4250, LA), 폴리에틸렌 글리콜 400(202398, PEG), 프로필렌 글리콜(W294004, PG) 카르복시메틸셀룰로오스(C4888, CMC) 및 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스(423181, HPMC)는 Sigma-Aldrich에서 구입했다. RESURRECTIONbeauty에서 히알루론산을 얻었다. Tris(히드록시메틸)아미노메탄(Tris)은 Amresco(미국)에서 얻었고 에탄올(95%)은 Aik Moh(싱가포르)에서 얻었다. 완충액과 샘플 용액은 Milli-Q 처리수로 준비했다(25°C에서 저항률 >18.2 MΩ.cm).
샘플 준비.
지질 바이셀은 종래 알려진 방법에 따라 준비하였다(1. Kolahdouzan, K.; Jackman, J. A.; Yoon, B. K.; Kim, M. C.; Johal, M. S.; Cho, N.-J., Langmuir 2017, 33 (20), 5052-5064. 및 2. Sut, T. N.; Park, S.; Yoon, B. K.; Jackman, J. A.; Cho, N.-J., Langmuir 2020, 36 (18), 5021-5029)
간단히, 클로로포름 중의 DOPC 지질을 유리병에 첨가한 후, 클로로포름은 질소가스의 완만한 흐름 아래에서 증발한 후 밤새 진공 건조기에서 배양되었다. 표면형광현미경(Epifluorescence microscopy) 실험의 경우 DOPC 지질에 Rh-PE 0.5 몰%를 도핑하였다. 건조된 지질막을 LA 함유 Tris 완충액(10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5)으로 수화하여 DOPC와 LA 농도가 각각 1 mM과 0.5 mM, 즉, DOPC: LA비율이 2:1가 되도록 하였다. 이 지질 혼합물은 5회의 freeze-thaw-vortex 사이클을 거쳤으며, 각 사이클은 액체 질소에 1분간 잠긴 다음, 60°C의 수조에서 5분간 해동한 다음 30초 소용돌이를 거쳤다. 생성된 지질 바이셀 표준원액(Lipid bicell stock solution)을 각각 다른 점도강화제를 사용하여 별도로 제조된 트리스 완충용액 4개에 희석하여 PEG 0.4%(vol/vol) 및 0.3%(vol/vol) PG, 5mg mL-1 CMC, 3mg MG MG MG-2MG에서 0.031 mM DOPC를 함유한 지질 바이셀 시료를 얻었다. 제어 바이셀 샘플도 Tris buffer 용액에서만 0.031 mM DOPC로 희석하여 제조하였다(추가적인 점도 강화제 없이).
점도 측정
점도가 향상된 4가지 완충용액과 일반 완충용액의 유변학적 특성은 CP 25-1 콘/플레이트 형상(0.982°각, 24.990mm, 47μm 간격)을 갖는 MCR 501 응력 제어 유변계(Anton Paar, Austria)를 사용하여 진동 측정을 수행하는 것을 특징으로 하였다. 각 시료 75 μL를 측정 단계에 로딩하였으며, 선형 점탄성 영역 내에서 측정이 이루어지도록 0.1 s-1에서 500 s-1로 전단율을 로그적으로 증가시켜 점도를 측정하였다. 모든 측정은 25°C에서 수행되었다.
수정 진동자 마이크로 밸런스
이산화규소 표면에 지질 바이셀 샘플의 흡착은 Q-Sense E4 기기(Biolin Scientific AB, 스웨덴)를 사용한 수정 진동자 마이크로 밸런스 법 (QCM-D) 실험에 의해 모니터링되었다. 각 실험 전에 이산화규소로 코팅된 센서 칩을 1%(wt/vol) SDS 수용액, 물, 에탄올로 차례로 헹구고 부드러운 질소 가스 흐름 하에서 건조시킨 후 산소 플라즈마 처리(PDC-002, Harrick Plasma, Ithaca, NY, USA) 1분 동안 액체 샘플은 연동 펌프를 사용하여 100μL min-1의 유속으로 연속 흐름 조건에서 측정 챔버에 도입하였다. 측정 데이터는 1Hz의 시간 분해능으로 Q-Soft 소프트웨어 패키지(Biolin Scientific AB)에 의해 여러 홀수 배음(odd overtones)에서 수집되었으며 5번째 배음에서 배음 정규화 데이터가 보고되었다. 데이터 처리는 Q-Tools(Biolin Scientific AB) 및 OriginPro(OriginLab, USA) 소프트웨어 프로그램을 사용하여 수행되었다. 모든 측정은 25℃에서 수행되었다.
형광현미경
바이셀 흡착 및 지지형 지질 이중층 형성(SLB)을 추적하기 위해, 60X oil-immersion 대물렌즈(Numerical Aperture of 1.49)를 갖춘 니콘 이클립스 Ti-E 도립현미경과 C-HGFIE Intensilight(일본 니콘) 수은-섬유 조명기를 사용하여 시간 경과 형광 현미경 사진(Time-lapsed fluorescence micrographs)을 얻었다. 광원은 TRITC 필터 세트를 통과했고 AndoriXon 3897 EMCCD 카메라를 사용하여 3초마다 1프레임의 비율로 이미지를 얻었다. 실험은 유리 커버 슬립에 장착된 바닥이 없는 슬라이드(Sticky-Slide VI 0.4, 독일)로 구성된 미세 유체 흐름 셀 내에서 수행되었다. 장착 전 유리 커버 슬립을 1% SDS 용액, 물, 에탄올로 연속 헹군 후 질소 가스의 완만한 흐름에서 건조시킨 후 1분간 산소 플라즈마 처리를 하여 세척하였다. 그런 다음 연동 펌프를 사용하여 50 μL min-1의 유량으로 액체 시료를 측정 챔버에 도입하였다. 모든 측정은 25°C에서 수행되었다.
광표백 후 형광 회복
흡착된 지질층 내의 측면 지질 확산 정도는 광표백(FRAP) 실험 후 형광 회복에 의해 측정되었다. 100mW 전력 강도의 단일 모드, 532nm 레이저(Coherent Inc., USA)를 사용하여 표면 흡착 지질 층 내의 직경 20μm 영역을 광표백했다. 그 후, 광표백 영역의 시간 경과 형광 현미경 사진을 3분 동안 2초마다 기록하여 시간 의존적 형광 신호 회복을 추적하고 측면 지질 운동의 해당 확산 계수를 Hankel 변환 방법으로 계산했다. 모든 측정이 25 °C에서 수행되었다.
3-2. 결과 및 논의
실험적 설계
본 발명자들은 다섯 가지 다른 점성이 있는 점안액 모방 용액, 즉 (i) Tris 버퍼 대조군(Control)과 Tris 버퍼와 함께, (ii) 0.4% PEG 및 0.3% PG(PEG/PG), (iii) 5mg mL-1 CMC(CMC), (iv) 3mg mL-1 HPMC(HPMC), 및 (v) 2 mg mL-1 HA(HA)를 사용하여 이러한 조건에서의 DOPC/LA 바이셀 매개 SLB 형성의 효과를 평가하였다. 점도 향상제의 종류와 각각의 농도는 시판되는 점안제 제형에 기초하여 선택되었다. 상기 대조군, PEG/PG, CMC, HPMC 및 HA 샘플의 평균 점도 값은 230 s-1 전단 속도로 레오미터로 측정한 결과, 각각 1.57, 2.38, 6.96, 12.53 및 15.07 cP였다.
DOPC/LA 바이셀은 먼저 표면에 흡착된 바이셀의 임계 농도에 도달할 때까지 표면에 흡착 및 축적함으로써 실리카 표면에 SLB를 형성하였다. 이후 바이셀이 자발적으로 융합하고 DOPC 지질들이 표면에 재결합하여 연속적인 이중층을 형성하는 동안 LA 분자들이 표면에서 제거되고 다시 벌크 용액으로 돌아가는 파열 메커니즘이 뒤따랐다. 본 실시예에서는 바이셀의 흡착 및 파열을 연구하고, 서로 다른 점성 환경에서 이산화규소 및 유리 표면에 형성된 SLB의 품질을 평가하기 위하여 QCM-D, 표면현미경 및 FRAP 실험을 수행하였으며, 이하에서 설명한다.
실시간 흡착거동(Real-Time Adsorption Behavior)
본 발명자들은 먼저 QCM-D 공진 주파수(ΔF)와 에너지 소산(ΔD)의 변화를 유체역학적으로 결합된 질량의 변화와 흡착기 점탄성 특성에 해당하는 시간의 함수로 기록하여 이산화규소 표면에 있는 5개의 DOPC/LA 바이셀 샘플의 흡착 프로파일을 측정하였다.
각 샘플에 대한 기준 신호는 바이셀 없이 해당 버퍼에서 먼저 설정되었고, 그 다음 측정 신호가 안정화될 때까지 바이셀 샘플을 연속 흐름 조건 하에 도입한 다음, 각각의 완충액에서 세척 단계를 수행하였다. 따라서 ΔF 및 ΔD 신호 반응 모두에서 보고된 변화는 단지 지질의 흡착 때문이다.
바이셀 매개 SLB 형성은 일반적으로 QCM-D 실험에서 특징적인 2단계 흡착 프로파일을 나타내는데, 처음에는 표면에 있는 바이셀의 흡착으로 인한 음의 ΔF 이동과 양의 ΔD 이동으로 구성되고, 이어서 흡착된 바이셀 임계 농도에 다다른 후 흡착된 바이셀이 파열된 양의 ΔF 이동과 음의 ΔD 이동을 나타내며, 결과적으로 안정적인ΔF 값인 약 -26 Hz, ΔD 값은 1 × 10-6 이하를 나타내고, 이는 성공적인 SLB 형성에 따른 전형적인 값이다.
도 8a 및 8b는 대조군, PEG/PG, CMC, HPMC 및 HA 샘플에 대해 실험적으로 얻은 ΔF 및 ΔD 이동을 보여준다. 예상대로 점도 향상제를 포함하지 않는 대조 샘플은 바이셀이 충분히 높은 표면 적용 범위에 도달할 때까지 흡착한 다음 SLB를 형성하기 위해 자발적인 파열이 뒤따를 때까지 흡착하는 특징적인 2단계 흡착 프로파일을 나타냈다. 놀랍게도, 완충 용액 점도를 대조군 샘플의 약 1.5-10배까지 증가시키는 다양한 점도 향상제를 추가했음에도 불구하고 PEG/PG, CMC, HPMC 및 HA 샘플도 유사한 2단계 흡착 프로파일을 나타냈다. 이러한 점성 환경에서 DOPC/LA 바이셀이 이산화규소 표면에 흡착 및 파열되어 SLB를 형성할 수 있음을 뒷받침한다. 참고로, HPMC 바이셀 샘플은 >-90Hz의 해당 ΔF 값을 갖는 다른 샘플과 비교하여 파열 전 약 -105Hz의 상당히 낮은 최소 ΔF 값을 나타냈으며, 이는 HPMC 환경에서 훨씬 더 큰 ΔF 값을 나타냈고, 자발적인 파열이 일어나기 전에 많은 양의 바이셀이 흡착되어야 함을 나타낸다. HPMC의 존재는 바이셀-바이셀 상호작용을 감소시켜 파열에 대한 임계 바이셀 농도를 증가시킬 수 있다. 도 1c는 3중 측정의 모든 샘플에 대한 최종 ΔF 및 ΔD 값을 요약한다. 대조군, PEG/PG, CMC, HPMC 및 HA 샘플은 각각 -25.2 ± 0.7Hz, -25.8 ± 0.6Hz, -26.2 ± 0.4Hz, -27.3 ± 0.6Hz 및 -24.9 ± 0.4Hz의 평균 ΔF 값을 생성했다. 각각 0.1 ± 0.1 × 10-6, 0.5 ± 0.2 × 10-6, 1.2 ± 0.1 × 10-6, 1.6 ± 0.2 × 10-6 및 0.3 ± 0.1 × 10-6의 평균 ΔD 값. 이러한 ΔF 및 ΔD 값은 일반적으로 SLB에 대한 예상 범위 내에 있는 반면 CMC 및 HPMC는 1 × 10-6보다 약간 높은 ΔD 값을 가지며, 이는 소량의 파열되지 않은 바이셀이 표면에 남아 있을 가능성이 있음을 시사한다. 종합하면 QCM-D 데이터는 DOPC/LA 바이셀이 다양한 점성 환경에서 SLB를 형성할 수 있음을 뒷받침한다.
바이셀 흡착 역학
다음으로 QCM-D 측정 데이터에서 ΔF(|dΔF/dt|)의 시간 도함수의 절대값을 계산하여 다양한 점성 환경에서 DOPC/LA 바이셀 흡착 동역학을 분석했다. |dΔF/dt| 바이셀 흡착의 초기 단계 동안의 값은 도 2a에 나와 있다. 바이셀들은 확산 제한 영역에서 흡착한다는 것이 이전에 확립되었으며 확산에 영향을 미치는 매개변수는 Stokes-Einstein 방정식(수학식 1)으로 설명할 수 있다.
[수학식 1]
Figure pct00001
여기서 D 는 확산계수, kB 는 볼츠만 상수, T 는 온도, η 는 용액 점도, 그리고, r 바이셀의 유효 유체역학적 반경이다. 모든 실험은 일정한 실온에서 수행되었으며 샘플 간에 용액 점도만 다르기 때문에 이론적인 확산 제한 흡착 체제에 의해 예측된 QCM-D ΔF 측정 응답은 다음 수학식 2에 따라 용액 점도의 영향을 받는다.
[수학식 2]
Figure pct00002
이 이론적으로 계산된 확산-제한 흡착 속도는 실험적으로 측정된 각 샘플에 대한 최대 초기 |dΔF/dt| 값과 비교되었다. 속도 값은 대조군 샘플의 값을 1로 설정하여 정규화되었고 도 2b에서 용액 점도가 증가하는 순서로 각 바이셀 샘플에 대해 플롯되었다. 예상대로 이론적으로 계산된 확산 제한 흡착 속도는 용액 점도에서 해당 증가 경향을 갖는 대조군, PEG/PG, CMC, HPMC 및 HA의 순서로 감소하는 경향을 예측했다.
대조군, PEG/PG, CMC 및 HPMC 샘플에 대해 실험적으로 측정된 QCM-D 흡착 속도는 초기 바이셀 흡착이 이러한 점도 향상제의 존재에 크게 영향을 받지 않음을 나타내는 이러한 경향에 대체로 동의한다. 대조적으로, HA 샘플의 실험적으로 측정된 흡착 속도는 확산 제한 흡착 역학에 의해 예측된 것보다 현저히 높고 상대적으로 점도가 낮은 CMC 및 HPMC 샘플보다 높으며, 이는 HA의 존재가 바이셀 기질 및/또는 또는 바이셀-바이셀 상호 작용을 증가시킴을 나타낸다. 문헌의 이전 연구에 따르면 HA는 이러한 실험 조건에서 실리카 표면에 흡착되지 않지만 HA는 포스포콜린(PC) 지질 소포 및 SLB에 결합하는 것으로 나타났으며 PC 이중층 표면 사이의 가교 분자 역할도 할 수 있다.
따라서, 본 발명에서, 이러한 PC-HA 상호작용은 아마도 개별 바이셀 사이의 거리를 줄여 바이셀 농도의 국소적 증가를 야기함으로써 증가된 바이셀 흡착 속도에 대한 책임이 있을 가능성이 있다. 종합하면, 이러한 결과는 점도 향상제의 존재가 용액 점도의 차이로 인해 바이셀 흡착 속도에 영향을 미칠 수 있을 뿐만 아니라 HA와 같은 특정 점도 향상제가 바이셀-바이셀 상호작용을 변화시켜 흡착 속도에 추가 영향을 미칠 수 있음을 보여준다.
HPMC 흡착 속도가 확산 제한 역학에 의해 예측된 것과 크게 다르지 않지만 파열을 유발하기 위해 더 많은 양의 HPMC 바이셀이 흡착되어야 한다는 사실은 HPMC가 바이셀-기질 상호작용보다 바이셀-바이셀 상호작용에 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
다른 한편으로, HA에 대한 흡착 역학은 확산 제한 역학에 의해 예측된 것보다 빠르기 때문에 HA의 존재는 바이셀-기질 상호작용을 증가시킬 가능성이 있다.
시간 경과 형광 현미경 이미징(Time-lapsed Fluorescence Microscopy Imaging)
점안액을 모방하는 점성 환경에서 형성된 이중층의 이동성을 확인하기 위해(유리 표면에 지질 바이셀 및 소포 흡착을 직접 관찰), 본 발명자들은 시간 경과 형광 현미경 이미징을 수행했다. DOPC 지질은 이미징 목적을 위해 0.5 mol%의 Rh-PE로 도핑되었다. 위에 제시된 각 시리즈의 첫 번째 현미경 사진은 임계 바이셀 농도에 도달한 시간에 해당한다(도 10a-e).
대조군: 도 10a에서 볼 수 있듯이 추가 점도 향상제가 없는 바이셀은 빠르게 흡착되고 약 10.4분 후에 임계 바이셀 농도에 도달하여 작고 밝은 반점이 형성되기 시작하여 바이셀 파열을 나타냈다. 이중층 확대는 2분 이내에 빠르게 발생하여 완전한 SLB 형성을 생성했다.
PEG/PG: 추가 점도 향상제가 없는 바이셀과 비교하여 PEG 및 PG가 있는 바이셀은 더 빠르게 흡착되서 약 8.8분 후에 임계 바이셀 농도에 도달했고, 이중층 확대는 그로부터 1분 이내에 발생했다(도 10b).
CMC: 앞서 언급한 경우와 달리 CMC가 있는 바이셀은 더 천천히 흡착되어 16.8분 후에 임계 표면 커버리지에 도달하고 그로부터 4분 이내에 SLB 형성과 함께 파열이 발생하였다. 그럼에도 불구하고, 더 많은 수의 반점이 남아 있었는데, 이는 파열되지 않은 바이셀에 기인하며, 이는 표면에 소량의 파열되지 않은 바이셀이 남아 있음을 시사하는 높은 ΔD 값의 QCM-D 기록과 일치하는 것이다.
HPMC: 흡착된 bicellar 혼합물의 임계 바이셀 농도는 약 15분에 도달했으며 SLB 프로세스의 후속 완료는 30분 이내에 발생했다(도 10d). HPMC 바이셀을 사용한 SLB 형성은 연구에서 달리 기술된 경우와 다른 경향을 따랐다. 임계 바이셀 농도에 도달하면 SLB 단편의 형성이 관찰되지 않아 작은 바이셀 파열이 발생했음을 나타낸다. HPMC 바이셀이 임계 바이셀 농도에 도달하기 위한 장기간 프레임은 낮은 ΔF 값의 QCM-D 기록과 일치하며, 이는 파열이 발생하기 전에 많은 양의 바이셀이 흡착되어야 함을 나타낸다.
히알루론산: 도 10e와 같이 임계 바이셀 농도는 약 8.6분에 도달했으며 SLB 프로세스는 10분 이내에 완료되었다. QCD-M 측정 데이터의 결과에 따르면 임계 표면 커버리지까지의 경과 시간이 가장 컸다. 그럼에도 불구하고, 본 발명자들은 보이지 않는 바이셀 파열과 함께 균일한 형광을 관찰했는데, 이는 제작된 SLB에서 파열되지 않은 바이셀의 작은 존재가 있음을 나타낸다.
요약하면, 형광 현미경 실험은 바이셀 흡착 및 파열 시 성공적인 SLB 형성이 발생함을 확인함으로써 QCM-D 실험을 뒷받침한다.
FRAP 특성화
FRAP 측정은 또한 생체모방 특성을 평가하고 다양한 점성 환경에서 제작된 SLB의 측면 지질 이동성을 결정하기 위해 수행되었다. 시간 경과 FRAP 현미경 사진, 시간 종속 형광 강도 프로필 및 계산된 확산 계수는 도 11에 나와있다.
시간 경과 FRAP 현미경 사진은 거의 완전한 형광 회복이 2분 이내에 관찰되고 확산 계수 값이 약 2.6 ± 0.06 μm2/s, 2.5 ± 0.04 μm2/s, 2.4 ± 0.01 μm2/s, 2.1 ± 0.07 μm2/s 및 2.2 ± 0.01μm2/s를 나타냄을 확인하였고, 각각 SLB의 일반적인 범위 내에 있음을 확인하였다(도 11a-e). 그럼에도 불구하고 HPMC와 bicellar 혼합물의 경우 QCM-D 측정 결과와 달리 온전한 바이셀들이 많이 존재함을 나타내는 많은 bright spot을 관찰할 수 있었을 뿐만 아니라 다른 점안제 모방 용액 대비 이동 분율 및 확산 계수에서의 감소를 관찰했다. (도 11d, f, g).
결론
본 발명자들은 DOPC/LA bicellar 혼합물을 사용하여 눈 지질 대체 요법에 대한 유망한 대체물로서 추가 탐구가 필요한 다양한 점안액 모방 솔루션에서 SLB를 준비했다. 종합하면, QCM-D, 형광 현미경 및 FRAP 측정 결과의 조합은 DOPC/LA SLB가 PEG/PG, CMC, HPMC 및 HA와 같은 다양한 점성 환경에서 형성될 수 있음을 뒷받침하였다. 전반적으로, 본 발명자들의 연구 결과는 DOPC/LA가 바이셀 매개 SLB 형성을 수행하기 위해 기존의 점안액을 대체하는 데 유용하며 이 작업에서 표면 민감성 측정 기술의 조합이 SLB의 고품질 형성을 보장하는 데 유용하고, 나아가, 다양한 계면 과학 및 엔지니어링 응용에 유용할 수 있을 것임을 확인하였다.
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Claims (7)

  1. 장쇄 지질 및 단쇄 지질을 포함하는, 안구건조증 예방, 개선 또는 치료용 점안액용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 장쇄 지질은 디올레일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine, DOPE), 디스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine, DSPC), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린 (palmitoyloleoylphosphatidylcholine, POPC), 에그 포스파티딜콜린(egg phosphatidylcholine, EPC), 디올레오 일포스파티딜콜린(dioleoylphosphatidylcholine, DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린 (dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(dioleoylphosphatidylglycerol, DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(dipalmitoylphosphatidylglycerol, DPPG), 디스테아로일포스파티딜에탄 올아민(distearoylphosphatidylethanolamine, DSPE), 포스파티딜에탄올아민(Phosphatidylethanolamine, PE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(dipalmitoylphosphatidylethanolamine), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린](DOPS)(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine]) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 장쇄 인지질인 것인, 점안액용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단쇄 지질은 라우르산, 미리스트산, 미리스톨레산, 팔미트산, 팔미톨레산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 카프르산(capric acid), 카프릴산(caprylic acid), 알파-리놀렌산, 에루스산, 파이타노산 (phytanoic acid), 아라키드산, 아라키돈산, 에이코사노산(eicosanoic acid), 에이코사펜타에노산, 베헨산, 도코사펜타에노산, 및 도코사헥사에노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 단쇄 지질인 것인, 점안액용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 히알루론산(HA), 카르복시메틸셀룰로오스(CMC), 히드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC), HPMC 및 덱스트란, PEG 및 프로필렌 글리콜(PG), 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 점도 개선제를 더 포함하는 것인, 점안액용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 수성 매질, pH 조절제 및 약학적으로 허용가능한 첨가제를 더 포함하는 것인, 점안액용 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 첨가제는 등장화제, 완충제 또는 pH 조절제인 것인, 점안액용 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 점안액용 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 안구 건조증 예방, 개선 또는 치료방법.
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