KR20240036037A - 히알루론산 그래프팅된 폴리(n-이소프로필아크릴아미드)(HA-g-pNIPAM)를 제조하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, a) 수-혼화성 용매 중, 히알루론산 화합물, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 및 카보디이미드 가교제를 포함하는 혼합물을 제조하는 단계; b) 상기 혼합물을, pH를 7.2 내지 7.8 범위로 조정하고, 20 내지 40℃에서 1 내지 3일 동안 교반함에 의해 반응시키는 단계; 및 c) 단계 b)의 혼합물을 건조시키는 단계를 포함하는 히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(HA-g-pNIPAM)를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 히알루론산, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 및 카보디이미드 가교제의 몰비가 0.1:0.0025:1 내지 0.2:0.0125:1 범위이다.
Description
본 발명은 화학 분야에 관한 것으로, 특히 히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(HA-g-pNIPAM)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
히알루론산 또는 HA는 D-글루쿠론산과 N-아세틸-D-글루코사민의 화학적 결합으로 이당류 하위 단위(subunit)를 형성하는 천연 글리코사미노글리칸(GAG)이다. 이러한 이당류 하위 단위는 2,4-글리코시드 결합을 통해 연결되어 긴 사슬과 큰 구조를 형성한다. 당연히, 인체 70kg에서, 피부, 관절, 눈 및 일부 기타 조직 내에 약 15g의 HA가 있는 것으로 밝혀졌다. 오늘날, HA는 예를 들어 수탉의 빗이나 분자량이 5,000-1,800,000 kDa인 황색 연쇄상구균(Streptococcus aureus)의 발효 등을 통해 자연적으로 생성될 수 있다.
히알루론산은 현저한 특성, 특히 수분 보유성을 갖고, 1 g의 HA가 6 리터의 물을 보유할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, HA는 흡습성이 있고, 겔을 형성하기에 적절한 점도를 가지며, 생분해성이고, 생체적합성 특성을 갖는다. 현재, HA는, 생체재료 및 화장품, 예컨대 항염증, 상처 치유 및 조직 재생을 위한 젤, 크림, 폼, 주사제 또는 하이드로겔에 널리 사용되고 있다.
폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 또는 pNlPAM은, N-이소프로필아크릴아미드 단량체의 중합 반응에서 나오는 열-반응성 중합체이다. pNIPAM의 하위(lower) 임계 용액 온도(LCST) 또는 중합체가 가요성 용매화된 상태에서 보다 강질(rigid)의 비용매화된 상태로 상 전이되는 온도는 32℃이다. pNIPAM은 LCST로 인해 가역적인 가용성-불용성 거동을 갖는다. 온도가 32℃ 미만이면, pNIPAM은 친수성이고 가용성이다. 반면에, 온도가 32℃ 초과(예: 체온)인 경우, pNIPAM은 소수성이고, 불용성이며 조직 접착 특성을 갖는 하이드로겔을 형성할 수 있다.
나노겔은 나노크기 범위의 3차원 나노크기 하이드로겔 유사 물질인 콜로이드의 한 유형이다. 나노겔의 주요 장점은, 수분 보유성, 도달하기 어려운 장기, 조직 및 세포에 전신적으로 전달될 수 있는 에멀젼을 형성하는 능력, 및 신속한 약동학에 대한 능력이다. 따라서, 최근, 약물 전달, 진단, 영상화, 포도당 감지 및 조직 공학 분야에서 나노겔에 대한 관심이 생기고 있다.
문헌 리뷰에서, 히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)가 하기 문서에 개시되어 있다:
특허 문헌 US 20130171197 A1에는, 특정한 벌집 구조를 갖는 히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 하이드로겔이 개시되어 있다. 상기 하이드로겔은 열-반응 특성을 가지게 형성되어 조직 공학의 효율성을 높이는 데 사용될 수 있다.
Chen 등(Journal of Pharmaceutical sciences, 2011, 100(2), 655-666.)은, 암 치료제인 시스플라틴의 약물 전달을 위한 히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 하이드로겔을 개시했다. 이러한 상기 하이드로겔은 40% 초과의 그래프팅도를 가지며 네트워크 하이드로겔을 형성한다.
Amenda(Wagner, A. 2019)는, 카보디이미드 가교제로서 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드(EDC), N-하이드록시 숙신이미드(NHS)를 사용하여 히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필 아크릴아미드) 나노겔을 개시했다. 이 나노겔은 약 25%의 그래프팅도를 가지며 또한 소수성 약물 전달 시스템에 사용된다.
그러나, 이전 개시내용의 히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)는, 높은 점도를 가지며, 그래프팅도가 높아 네트워킹 하이드로겔을 형성한다. 따라서, 본 발명의 목적은, 높은 안정성과 생체적합성을 유지하면서, 낮은 점도를 제공하는 낮은 그래프팅도를 갖는 히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(HA-g-pNIPAM)를 합성하는 것이다. 본 발명의 HA-g-pNIPAM은, 전달 시스템, 상처 치유, 세포 증식, 항염증, 항산화 및 광보호와 같은 많은 응용 분야에 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명은
a) 수-혼화성 용매 중, 히알루론산 화합물(hyaluronic compound), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 및 카보디이미드 가교제를 포함하는 혼합물을 제조하는 단계;
b) 상기 혼합물을, pH를 7.2 내지 7.8 범위로 조정하고, 20 내지 40℃에서 1 내지 3일 동안 교반함에 의해 반응시키는 단계; 및
c) 단계 b)의 혼합물을 건조시키는 단계
를 포함하는 히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(HA-g-pNIPAM)를 제조하는 방법에 관한 것으로서,
히알루론산, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 및 카보디이미드 가교제의 몰비가 0.1:0.0025:1 내지 0.2:0.0125:1 범위이다.
상기 방법으로 제조된 히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(HA-g-pNIPAM)가 추가로 제공된다.
도 1은 (a) 샘플 1, (b) 샘플 2, (c) 샘플 3, (d) 샘플 4 및 (e) 샘플 5의 핵자기 공명(NMR) 스펙트럼을 보여준다.
도 2는 히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필 아크릴아미드)(HA-g-pNIPAM)의 화학 구조를 보여준다.
도 3은 샘플 2의 적외선(IR) 분광 스펙트럼을 보여준다. HA와 pNIPAM 사이의 그래프팅의 확인은 1606.4, 1406.3 및 1373.2 cm-1의 파수에서 특징적 피크로서 나타난다.
도 4는 샘플 3의 열중량 분석(TGA) 스펙트럼을 보여준다.
도 5는 샘플 3의 열-반응 특성을 보여준다.
도 6은 (a) 샘플 1 0.25% w/v, (b) 샘플 2 0.25% w/v, (c) 샘플 4 0.25% w/v 및 (d) 샘플 5 0.25% w/v의 투과 전자 현미경(TEM) 이미지를 보여준다.
도 7은 (a) 각질형성세포(HaCaT 세포) 및 (b) 섬유아세포(BJ 세포)에서 샘플 2의 세포 증식 효능을 보여준다.
도 8은 (a) 각질형성세포(HaCaT 세포) 및 (b) 섬유아세포(BJ 세포)에서 샘플 2의 상처 치유 효능을 보여준다.
도 9는 각질형성세포(HaCaT 세포)에서 샘플 2의 항염증 효능을 보여준다.
도 10은 각질형성세포(HaCaT 세포)에서 샘플 2의 항산화 효능을 보여주며, 이는 (a) 과산화수소(H2O2)를 사용한 것과 사용하지 않은 것이고 (b) 용량 의존적 효과이다.
도 11은 (a) UVA 5 J/cm3로 처리 및 (b) UVA 7.5 J/cm3로 처리된 각질형성세포(HaCaT 세포)에서 샘플 2의 광보호 효능을 보여준다.
도 12는 각질형성세포(HaCaT)에서 샘플 2의 콜라게나제 분해 효능을 보여준다.
도 13은 (a) 샘플 1 0.25% w/v, (b) 샘플 4 0.25% w/v 및 (c) 샘플 5 0.25% w/v에 캡슐화된 커큐민의 투과 전자 현미경(TEM) 이미지를 보여준다.
도 14는 (a) 0.1% w/v, (b) 0.15% w/v 및 (c) 0.25% w/v의 샘플 2에 캡슐화된 아시아트산의 투과 전자 현미경(TEM) 이미지를 보여준다.
도 15는 (a) 0.1% w/v, (b) 0.25% w/v 및 (c) 0.5% w/v의 샘플 2에 캡슐화된 폴리(I:C)의 투과 전자 현미경(TEM) 이미지를 보여준다.
도 16은 (a) 0.1% w/v, (b) 0.25% w/v 및 (c) 0.5% w/v의 샘플 2에 캡슐화된 폴리(I:C)의 제타 전위 및 크기를 보여준다.
도 17은 샘플 1, 4, 및 5의 NIH-3T3 세포에 대한 커큐민 세포 흡수 효능 테스트의 공초점 현미경 이미지를 보여준다.
도 18은 샘플 3의 치주 인대(periodontal ligament) 줄기 세포에 대한 커큐민 세포 흡수 효능 테스트의 공초점 현미경 이미지를 보여준다.
도 19는 샘플 2의 섬유아세포 성장 인자(FGF) 안정성을 보여준다.
도 20은 (a) 샘플 2의 0.1% w/v 및 (b) 샘플 1, 4 및 5의 0.25% w/v의 커큐민 용해도 효능을 보여준다.
도 21은 (a) 담지량(mM), (b) 담지 효율(%), (c) 담지 용량(%) 및 (e) 포집 효율(%)에서의 샘플 2의 아시아트산 용해도 효율을 보여준다.
도 22는 (a) 에탄올 용액이 없는 경우와 (b) 에탄올 용액이 있는 경우 샘플 2의 레스베라트롤 용해도 효율을 보여준다.
도 23은 0, 0.06, 0.12, 0.25, 0.5, 1 및 2% w/v 농도의 샘플 2에서의 각막 상피 세포의 세포독성을 보여준다.
도 24는 7.5 J/cm2의 자외선-A(UVA)를 조사한 0, 0.05 및 0.5% w/v 농도의 샘플 2에서의 각질형성세포(HaCaT)의 세포 생존율을 보여준다.
도 25는 PrestoBlue™ 분석을 통해 0, 0.1, 0.15 및 0.25% w/v의 샘플 2에서의 세포 생존율을 보여준다.
도 2는 히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필 아크릴아미드)(HA-g-pNIPAM)의 화학 구조를 보여준다.
도 3은 샘플 2의 적외선(IR) 분광 스펙트럼을 보여준다. HA와 pNIPAM 사이의 그래프팅의 확인은 1606.4, 1406.3 및 1373.2 cm-1의 파수에서 특징적 피크로서 나타난다.
도 4는 샘플 3의 열중량 분석(TGA) 스펙트럼을 보여준다.
도 5는 샘플 3의 열-반응 특성을 보여준다.
도 6은 (a) 샘플 1 0.25% w/v, (b) 샘플 2 0.25% w/v, (c) 샘플 4 0.25% w/v 및 (d) 샘플 5 0.25% w/v의 투과 전자 현미경(TEM) 이미지를 보여준다.
도 7은 (a) 각질형성세포(HaCaT 세포) 및 (b) 섬유아세포(BJ 세포)에서 샘플 2의 세포 증식 효능을 보여준다.
도 8은 (a) 각질형성세포(HaCaT 세포) 및 (b) 섬유아세포(BJ 세포)에서 샘플 2의 상처 치유 효능을 보여준다.
도 9는 각질형성세포(HaCaT 세포)에서 샘플 2의 항염증 효능을 보여준다.
도 10은 각질형성세포(HaCaT 세포)에서 샘플 2의 항산화 효능을 보여주며, 이는 (a) 과산화수소(H2O2)를 사용한 것과 사용하지 않은 것이고 (b) 용량 의존적 효과이다.
도 11은 (a) UVA 5 J/cm3로 처리 및 (b) UVA 7.5 J/cm3로 처리된 각질형성세포(HaCaT 세포)에서 샘플 2의 광보호 효능을 보여준다.
도 12는 각질형성세포(HaCaT)에서 샘플 2의 콜라게나제 분해 효능을 보여준다.
도 13은 (a) 샘플 1 0.25% w/v, (b) 샘플 4 0.25% w/v 및 (c) 샘플 5 0.25% w/v에 캡슐화된 커큐민의 투과 전자 현미경(TEM) 이미지를 보여준다.
도 14는 (a) 0.1% w/v, (b) 0.15% w/v 및 (c) 0.25% w/v의 샘플 2에 캡슐화된 아시아트산의 투과 전자 현미경(TEM) 이미지를 보여준다.
도 15는 (a) 0.1% w/v, (b) 0.25% w/v 및 (c) 0.5% w/v의 샘플 2에 캡슐화된 폴리(I:C)의 투과 전자 현미경(TEM) 이미지를 보여준다.
도 16은 (a) 0.1% w/v, (b) 0.25% w/v 및 (c) 0.5% w/v의 샘플 2에 캡슐화된 폴리(I:C)의 제타 전위 및 크기를 보여준다.
도 17은 샘플 1, 4, 및 5의 NIH-3T3 세포에 대한 커큐민 세포 흡수 효능 테스트의 공초점 현미경 이미지를 보여준다.
도 18은 샘플 3의 치주 인대(periodontal ligament) 줄기 세포에 대한 커큐민 세포 흡수 효능 테스트의 공초점 현미경 이미지를 보여준다.
도 19는 샘플 2의 섬유아세포 성장 인자(FGF) 안정성을 보여준다.
도 20은 (a) 샘플 2의 0.1% w/v 및 (b) 샘플 1, 4 및 5의 0.25% w/v의 커큐민 용해도 효능을 보여준다.
도 21은 (a) 담지량(mM), (b) 담지 효율(%), (c) 담지 용량(%) 및 (e) 포집 효율(%)에서의 샘플 2의 아시아트산 용해도 효율을 보여준다.
도 22는 (a) 에탄올 용액이 없는 경우와 (b) 에탄올 용액이 있는 경우 샘플 2의 레스베라트롤 용해도 효율을 보여준다.
도 23은 0, 0.06, 0.12, 0.25, 0.5, 1 및 2% w/v 농도의 샘플 2에서의 각막 상피 세포의 세포독성을 보여준다.
도 24는 7.5 J/cm2의 자외선-A(UVA)를 조사한 0, 0.05 및 0.5% w/v 농도의 샘플 2에서의 각질형성세포(HaCaT)의 세포 생존율을 보여준다.
도 25는 PrestoBlue™ 분석을 통해 0, 0.1, 0.15 및 0.25% w/v의 샘플 2에서의 세포 생존율을 보여준다.
본 발명은, 높은 안정성과 생체적합성을 유지하면서 낮은 점도를 제공하는 낮은 그래프팅도를 갖는 히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(HA-g-pNIPAM)를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 HA-g-pNIPAM은 전달 시스템, 상처 치유, 세포 증식, 항염증, 항산화 및 광보호와 같은 다양한 응용 분야에 사용될 수 있다.
본원에 기술된 임의의 측면은, 달리 언급되지 않는 한, 본 발명의 다른 측면에 대한 적용을 포함하는 것으로 의도된다.
정의
본원에 사용된 기술 용어 또는 과학 용어는 달리 명시되지 않는 한 당업자가 이해하는 정의를 갖는다.
본원에 명명된 모든 도구, 장비, 방법 또는 화학 물질은, 본 발명에만 특정한 도구, 장비, 방법 또는 화학 물질이라고 달리 명시하지 않는 한 당업자가 일반적으로 사용하는 도구, 장비, 방법 또는 화학 물질을 의미한다.
청구항 또는 명세서에서 "포함하는"과 함께 단수 명사 또는 단수 대명사의 사용은 "하나"를 의미하며, "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 초과"를 포함한다.
본 출원에 개시되고 청구된 모든 조성물 및/또는 방법은, 본 발명과 크게 다른 어떠한 실험도 없이 임의의 작용, 수행, 수정 또는 조정으로부터의 실시양태를 포괄하고, 유용성을 가지고 목적을 달성하며, 청구범위에 구체적으로 언급되지는 않았지만 당업자에 따른 본 실시양태와 동일한 결과를 얻는 것을 목표로 한다. 그러므로, 당업자가 명백히 알 수 있는 사소한 수정이나 조정을 포함하는 본 실시양태에 대한 대체 또는 유사한 목적은 첨부된 청구범위에 나타난 발명의 사상, 범위 및 개념에 속하는 것으로 해석되어야 한다.
본 출원 전체에서, "약"이라는 용어는, 장비, 방법 또는 상기 장비 또는 방법을 사용하는 개인의 오차로 인해 달라지거나 벗어날 수 있는 본원에 나타나거나 표시되는 모든 숫자를 의미한다.
이하, 본 발명의 실시양태는 본 발명의 범위를 제한하려는 의도 없이 기술된다.
예시적인 실시양태에서, 본 발명은
a) 수-혼화성 용매 중, 히알루론산 화합물(hyaluronic compound), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 및 카보디이미드 가교제를 포함하는 혼합물을 제조하는 단계;
b) 상기 혼합물을, pH를 7.2 내지 7.8 범위로 조정하고, 20 내지 40℃에서 1 내지 3일 동안 교반함에 의해 반응시키는 단계; 및
c) 단계 b)의 혼합물을 건조시키는 단계
를 포함하는 히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(HA-g-pNIPAM)를 제조하는 방법에 관한 것으로서,
히알루론산, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 및 카보디이미드 가교제의 몰비가 0.1:0.0025:1 내지 0.2:0.0125:1 범위이다.
바람직한 예시적 실시양태에서, 상기 카보디이미드 가교제가 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드(EDC), N-하이드록시 숙신이미드(NHS), N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(DCC), N,N'-디이소프로필카보디이미드(DIC) 또는 이들의 혼합물로부터 선택된다.
바람직한 예시적 실시양태에서, 상기 카보디이미드 가교제가 1:0.5 내지 1:1.5 몰비의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드(EDC)와 N-하이드록시 숙신이미드(NHS)의 혼합물이다.
바람직한 예시적 실시양태에서, 히알루론산 화합물의 중량 평균 분자량이 30,000 내지 60,000 달톤 범위이다.
바람직한 예시적 실시양태에서, 히알루론산 화합물이 히알루론산, 히알루로네이트 염, 또는 이들의 혼합물로부터 선택된다.
바람직한 예시적 실시양태에서, 상기 히알루로네이트 염이 나트륨 히알루로네이트, 칼륨 히알루로네이트 또는 이들의 혼합물로부터 선택된다.
바람직한 예시적 실시양태에서, 상기 히알루로네이트 염이 나트륨 히알루로네이트이다.
바람직한 예시적 실시양태에서, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)의 중량 평균 분자량이 4,000 내지 6,000 달톤 범위이다.
바람직한 예시적 실시양태에서, 단계 a)에서 사용되는 수-혼화성 용매가 물, 포스페이트 완충 식염수(PBS), 시트레이트 완충액, 트리스(Tris) 완충액, 칼륨 포스페이트 완충액, 하이드로알코올 용액 또는 이들의 혼합물로부터 선택된다.
바람직한 예시적 실시양태에서, 단계 a)에서 사용되는 수-혼화성 용매가 물이다.
바람직한 예시적 실시양태에서, 상기 방법이, 상기 단계 b)를 수행하기 전에, 단계 a)에서 수득된 혼합물의 pH를 4.8 내지 5.8 범위로 조정하고, 상기 혼합물을 0.5 내지 2시간 동안 교반하는 단계를 추가로 포함한다.
바람직한 예시적 실시양태에서, pH가, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 중탄산나트륨, 수산화칼슘 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 pH 조정제에 의해 조정된다.
바람직한 예시적 실시양태에서, pH가, 염산, 황산 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 pH 조정제에 의해 조정된다.
바람직한 예시적 실시양태에서, 단계 c)가, 동결-건조, 진공 건조 또는 공기 건조, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 공정에 의해 수행된다.
바람직한 예시적 실시양태에서, 상기 방법이, 단계 c)를 수행하기 전에, 단계 b)에서 수득된 생성물을 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
바람직한 예시적 실시양태에서, 상기 정제하는 단계가, 단계 c)를 수행하기 전에 투석, 직교류 여과, 액체-액체 추출 또는 이들의 조합에 의해 수행된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은, 본 발명에 따른 히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(HA-g-pNIPAM)에 관한 것이다.
바람직한 예시적 실시양태에서, 상기 히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)가 4 내지 8%의 그래프팅도(degree of grafting)를 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 물, 포스페이트 완충 식염수(PBS), 시트레이트 완충액 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 수-혼화성 용매 중의 본 발명에 따른 히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)의 콜로이드는 0.0001 내지 2% w/v 농도로 존재한다.
본 발명의 더 나은 이해를 위해, 본 발명에 따른 히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)의 실시예를 기술할 것이며, 하기 실시예는 본 발명의 실시양태를 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
본 출원 전반에 걸쳐, 수-혼화성 용매는 탈이온수, 증류수, 수돗물, 포스페이트 완충 식염수(PBS), 시트레이트 완충액, 세포 배양 배지, Dulbecco's Modified Eagle 배지(DMEM), 최소 필수 배지(MEM), HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-l-피페라진에탄설폰산) 완충액, 트리스 완충액, 인산칼륨 완충액, 하이드로알코올 용액 또는 생체적합성(biocompatible) 유기 용매, 또는 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있지만 이에 제한되지는 않는다는 점에 유의한다. 생체적합성 유기 용매는 희석된 메탄올, 희석된 에탄올, 또는 희석된 아세트산, 또는 이들의 혼합물의 군으로부터 선택된다.
히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필아크릴아미드(HA-g-pNIPAM)(샘플 1 내지 5)의 제조
히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(HA-g-pNIPAM)의 샘플 1 내지 5는 다음 절차에 의해 제조되었다:
(1) 약 47,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는 히알루론산 나트륨(NaHA)을 물에 용해시키는 단계;
(2) 약 5,500 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(pNIPAM)를 단계 (1)의 나트륨 히알루로네이트 용액에 첨가한 후, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)를 후속적으로 상기 용액에 각각 첨가하는 단계;
(3) 수산화나트륨을 사용하여 단계 (2)의 용액의 pH를 약 5.5로 조정하고, 실온에서 교반하면서 반응을 약 1시간 동안 유지하는 단계;
(4) 염산을 사용하여 단계 (3)의 용액의 pH를 약 7.5로 일단 조정하고, 교반하면서 약 3일 동안 실온에서 반응을 유지하는 단계; 및
(5) 단계 (4)에서 수득된 HA-g-pNIPAM을 투석으로 정제하고, 각각 동결-건조 기술로 건조했다.
샘플 1 내지 5에 사용된 나트륨 히알루로네이트(NaHA), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(pNIPAM), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)의 양은 표 1에 기술되어 있다.
표 1은 샘플 1 내지 5의 조성을 나타낸다.
조성 | 샘플 1 | 샘플 2 | 샘플 3 | 샘플 4 | 샘플 5 |
NaHA (mmol) | 1.26 | 1.26 | 1.26 | 1.26 | 1.26 |
EDC (mmol) | 5.03 | 5.03 | 5.03 | 5.03 | 5.03 |
NHS (mmol) | 5.03 | 5.03 | 5.03 | 5.03 | 5.03 |
pNIPAM (mol) | 5.03 x 10-5 | 5.66 x 10-5 | 6.29 x 10-5 | 7.55 x 10-5 | 10.07 x 10-5 |
본 발명의 HA-g-pNIPAM의 특성
(1) 핵자기공명(NMR1)
샘플 1 내지 5의 핵자기공명(NMR) 스펙트럼은 도 1에 도시된다. 결과는, 샘플 1 내지 5는 히알루론산과 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)의 특정 특성 피크를 가짐을 보였고, 1.10 내지 1.65 ppm에서 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)의 지방족 양성자를 확인했고, 1.65 내지 2.01 ppm에서 히알루론산의 D-글루코사민 고리 상의 N-아세틸 기의 양성자와 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)의 양성자의 중첩을 확인했다. 또한, 샘플 1 내지 5의 그래프팅도는 NMR 스펙트럼에서 2개의 표시된 피크에 의해 계산되었다. 히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(HA-g-pNIPAM)의 화학 구조는 도 2에 도시되어 있다. 그래프팅도, 평균 분자량, 및 pNIPAM과 HA의 중량비는 표 2에 기술되어 있다.
표 2는 히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(HA-g-pNIPAM) 샘플 1 내지 5의 특성을 나타낸다.
(2) 적외선 분광법(IR) 스펙트럼
도 3에 도시된 샘플 2의 적외선(IR) 스펙트럼은 HA-g-pNIPAM의 특징적 피크를 보여준다. 1,606 cm-1의 피크는 아미드 밴드(C=0의 신장 진동)에 기인한다. 1,406.3 및 1,373 cm-1의 피크는 N-이소프로필아크릴아미드의 메틸기의 C-H 결합의 특징적 변형 진동 피크였다. IR 결과는, pNIPAM 코어 구조 상에 그래프팅된 HA의 존재를 확인했다.
(3) 열중량 분석(TGA)
샘플 3의 열분해는 열중량 분석(TGA)으로 조사되었으며, 그 결과는 도 4에 도시되어 있다. 결과는, 이 샘플 3이 약 200℃와 약 400℃에서 두 부분으로 분해되는 것으로 나타났다. 히알루론산 화합물의 분해 온도를 비교하면, 샘플 2의 분해는 약 200℃에서 일어났다.
(4) 입자 크기
샘플 2를 물에 분산시켜 농도 범위 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 0.15 및 0.25% w/v의 콜로이드를 수득하였다. 샘플 2의 수득된 콜로이드를 동적 광산란법(DLS)으로 조사하였다. 콜로이드 형태의 샘플 2의 각 농도의 입자 크기 및 평균 입자 크기를 표 3에 나타내었다. 그 결과는, 콜로이드의 농도가 증가 시에 평균 입자 크기가 증가하는 것으로 나타났다.
표 3은 다양한 농도에서 콜로이드 형태의 샘플 2의 입자 크기를 보여준다.
농도 | 입자 크기 (nm) | 평균 입자 크기 (nm) |
0.0001% w/v (25℃) | 11-444 | 135.5 ± 81.6 |
0.001% w/v (25℃) | 116-298 | 127.6 ± 47.8 |
0.01% w/v (25℃) | 124-456 | 258.9 ± 20.8 |
0.1% w/v (25℃) | 192-710 | 449.3 ± 4.3 |
0.15% w/v (25℃) | 218-710 | 458.7 ± 8.2 |
0.25% w/v (25℃) | 153-811 | 585.5 ± 6.7 |
(5) 열-반응 특성
샘플 3 콜로이드의 열-반응 특성은 동적 광산란(DLS) 기술을 통해 연구되었다.
샘플 3의 열 반응 특성은 도 5에 도시되어 있다. 결과는, 약 25 내지 32℃의 온도에서 약 30 내지 80 nm 범위의 입자 크기를 갖는 0.5% w/v의 샘플 3 콜로이드 구형 입자를 나타냈고, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)의 하위 임계 용액 온도(LCST) 특성 때문에 온도가 32℃ 초과일 때 입자 크기가 증가했다.
(6) 입자 형태
샘플 1, 2, 4 및 5를 물에 분산시켜 0.25% w/v 농도의 콜로이드를 수득하였다. 수득된 콜로이드를 투과 전자 현미경(TEM)으로 조사하였다.
입자의 형태는 도 6에 도시되어 있다. 결과는, 콜로이드가 샘플 1 0.25% w/v(도 6a), 샘플 2 0.25% w/v(도 6b), 샘플 4 0.25% w/v(도 6c), 및 샘플 5 0.25% w/v(도 6d)에 기술된 바와 같이 잘 정의된 구형 형상을 가짐을 보여주었다.
HA-g-pNIPAM의 효능 연구
이하에서는 0.0001-2% w/v 범위 농도를 갖는 콜로이드 형태의 샘플 1, 2, 4, 및 5를 사용하여 HA-g-pNIPAM의 효능을 연구하였다.
(1) 세포 증식
콜로이드 형태의 샘플 2의 세포 증식 테스트는 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석을 사용하여 연구하였다. MTT 분석은 세포의 생존율과 증식을 측정하는 최적의 표준 방법이다. 실험은 다음 절차에 따라 수행되었다: HaCaT 각질형성세포 및 BJ 섬유아세포를 0, 0.06, 0.12, 0.25, 0.5, 1 및 2% w/v 농도의 샘플 2로 24시간 동안 처리했다. 처리 후, MTT 분석을 통해 세포 증식을 평가하였다.
세포 증식 효율 테스트는 도 7에 나타내었다. 그 결과, 샘플 2는 비처리된 세포에 비해 HaCaT 각질형성세포(도 7a)와 BJ 섬유아세포(도 7b)의 세포 생존율 증가로 결정되는 피부 세포의 증식을 촉진할 수 있는 것으로 나타났다.
(2) 상처 치유
콜로이드 형태의 샘플 2의 상처 치유 테스트는 다음 절차에 의해 연구되었다: BJ 섬유아세포를 면도날로 긁은 후, 세포를 0.0001, 0.0005, 0.001, 0.005, 0.01 및 0.05% w/v 농도의 샘플 2로 24시간 동안 처리했다. 화합물의 치유 활성을 현미경으로 관찰하였다.
상처 치유 효능 테스트는 도 8에 도시되어 있다. 그 결과는, 샘플 2-처리된 섬유아세포가 히알루론산으로 처리한 세포와 비처리된 세포에 비해 상처를 더 빠르게 치유할 수 있는 것으로 나타났다(도 8a). 샘플 2의 상처 치유 활성은 용량 의존적 방식이다(도 8b). 이러한 결과는, 샘플 2가 유망한 상처 치유 활성을 가지고 있음을 시사한다.
(3) 항염증성
0.1% w/v 농도의 콜로이드 형태의 샘플 2의 항염증 테스트는 다음 절차에 의해 연구되었다: HaCaT 각질형성세포를 종양-괴사-인자 알파(TNF-α) 및 인터페론-감마(IFN-γ)의 존재 하에 샘플 2로 24시간 동안 처리했다. 치료 후, 방출된 TARC의 수준은 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)을 통해 측정되었다. TNF-α와 IFN-γ는 염증 유발물질인 반면, 티무스(thymus) 및 활성화-조절 케모카인(TARC)은 염증 표지자이다.
항염증 효능 테스트는 도 9에 도시되어 있다. 결과는, 샘플 2에 대한 노출은 티무스 및 활성화-조절 케모카인(TARC) 수준을 감소시키고, 이는 샘플 2가 항염증 활성을 가짐을 시사한다.
(4) 항산화
콜로이드 형태의 샘플 2의 항산화 테스트는 다음 절차에 따라 연구되었다: HaCaT 각질형성세포를 0, 0.0005, 0.0001, 0.005, 0.01, 0.05 및 0.1% w/v 농도의 샘플 2로 24시간 동안 처리했다. 처리 후, 세포를 과산화수소와 함께 1시간 동안 배양한 후, 2'-7'-디클로로플루오레신 디아세테이트(DCFH-DA) 분석을 통해 산화 스트레스 상태를 평가했다. 과산화수소는 산화 스트레스 유발제로 사용되었다.
항산화 효능 테스트를 도 10에 나타내었다. 그 결과는, 샘플 2가 과산화수소 처리 후 산화 스트레스를 감소시킬 수 있고, 이는 샘플 2가 항산화 활성을 가짐을 보여준다.
(5) 광-보호
콜로이드 형태의 샘플 2의 광-보호 테스트는 다음 절차에 의해 연구되었다: HaCaT 각질형성세포를 0, 0.0001, 0.0005, 0.001, 0.01 및 0.05% w/v 농도의 샘플 2로 24시간 동안 처리했다. 처리 후, 세포에 5 J/cm2(도 11a) 및 7.5 J/cm2(도 1b)의 자외선-A(UVA)를 조사한 후, 세포 생존율을 MTT 분석으로 측정하였다.
광-보호 효능 테스트는 도 11에 도시되어 있다. 결과는, 샘플 2가 각질형성세포를 UVA 조사의 독성으로부터 예방할 수 있고, 이는 샘플 2가 광-보호 활성을 가지고 있음을 시사한다.
(6) 콜라게나제 분해
콜로이드 형태의 샘플 2의 콜라게나제 분해 테스트는 다음 절차에 의해 연구되었다: HaCaT 세포를 샘플 2로 24시간 동안 처리했다. 처리 후, 세포에 7.5 J/cm2의 자외선-A(UVA)를 조사하였다. 매트릭스 메탈로프로테이나제-1(MMP-1)과 매트릭스 메탈로프로테이나제-9(MMP-9)의 수준은 조사 후 24시간 후에 웨스턴 블롯 분석으로 측정되었다.
콜라게나제 분해 효율 테스트는 도 12에 도시되어 있다. 그 결과는, 샘플 2가 UVA 조사에 반응하여 MMP-1 및 MMP-9의 발현을 억제할 수 있는 것으로 나타났다. 이 결과는, 샘플 2가 콜라게나제의 분해를 향상시킬 수 있음을 시사했다.
(7) 전달 시스템
커큐민, 아시아트산 및 폴리이노신산:폴리시티딜산(폴리(I:C))을 포함한 화합물의 캡슐화는 다음 절차에 의해 연구되었다: 화합물을 단순 인큐베이션 방법을 사용하여 나노입자에 캡슐화시켰다.
커큐민의 경우, 커큐민의 에탄올 스톡 용액을 약 1:10의 부피비로 콜로이드 형태로 샘플 1, 4 및 5에 적가하고, 4℃에서 24시간 동안 계속 교반하면서 배양한 후, 원심분리하여 용해되지 않은 화합물을 제거했다.
아시아트산의 경우, 아시아트산의 에탄올 스톡 용액을 약 1:10의 부피비로 콜로이드 형태로 샘플 2에 적가하고, 25℃에서 6시간 동안 계속 교반하면서 배양한 후, 원심분리하여 용해되지 않은 화합물을 제거했다.
폴리이노신산:폴리시티딜산(폴리(I:C))의 경우, 폴리(I:C)의 수성 스톡 용액을 약 1:10의 부피비로 콜로이드 형태로 실온에서 30분 동안 지속적 교반 하에 샘플 2에 적가하였다. 화합물 캡슐화된 나노입자의 형태학적 형태 및 외관을 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 관찰하였고, 동적 광산란법(DLS)을 사용하여 폴리이노신산:폴리시티딜산(폴리(I:C)) 캡슐화된 나노입자의 크기 및 제타 전위의 측정을 수행했다.
커큐민 캡슐화된 나노입자의 투과 전자 현미경(TEM) 이미지는 도 13에 도시되어 있다. 결과는, 나노입자의 크기, 형상 및 외관의 변화에 의해 결정되는 바와 같이 0.25% w/v의 콜로이드 형태의 샘플 1, 샘플 4 및 샘플 5에 커큐민이 성공적으로 캡슐화되었음을 보여준다.
아시아트산 캡슐화된 나노입자의 투과 전자 현미경(TEM) 이미지는 도 14에 도시되어 있다. 결과는, 나노입자의 크기, 형상 및 외관의 변화에 의해 결정되는 바와 같이 0.1% w/v, 0.15% w/v 및 0.25% w/v의 콜로이드 형태의 샘플 2에 아시아트산이 성공적으로 캡슐화되었음을 보여준다.
폴리이노신산:폴리시티딜산(폴리(I:C)) 캡슐화된 나노입자의 투과 전자 현미경(TEM) 이미지는 도 15에 도시되어 있다. 결과는, 나노입자의 크기, 형상 및 외관의 변화에 의해 결정되는 바와 같이 0.1% w/v, 0.25% w/v 및 0.5% w/v의 콜로이드 형태의 샘플 2에 커큐민이 성공적으로 캡슐화되었음을 보여준다.
폴리이노신산:폴리시티딜산(폴리(I:C))의 캡슐화는 도 16에 도시되어 있다. 결과는, 활성 성분 캡슐화된 샘플과 비교 시에 0.1% w/v(도 16a) 및 0.5% w/v(도 16b)에서 샘플 2의 입자 크기 감소에 의해 결정되는 바와 같이 콜로이드 형태의 샘플 2에 서로 다른 농도(0.2 및 1 μg/ml)의 폴리이노신산:폴리시티딜산(폴리(I:C))이 캡슐화되었음을 보여준다.
(8) 세포 흡수
콜로이드 형태의 커큐민 캡슐화된 샘플 1, 4 및 5의 세포 흡수 테스트를 다음 절차에 의해 연구했다: NIH-3T3 세포를 샘플 1, 4 및 5로 24시간 동안 처리했다. 처리 후, 세포를 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 디하이드로클로라이드(DAPI)(핵 염색) 및 로다민-팔로이딘(액틴 염색)으로 15 내지 30분 동안 염색하였다. 24시간 처리 후 형광 현미경을 이용하여 세포 흡수 수준을 측정하였다.
NIH-3T3 세포에 대한 커큐민 세포 흡수 효율 테스트의 공초점 현미경 이미지가 도 17에 도시되어 있다. 결과는, 커큐민 콜로이드의 세포 흡수가 녹색 형광 강도로 표시되고 커큐민 콜로이드가 NIH-3T3 세포에 의해 흡수된 것으로 나타났다.
샘플 3 캡슐화된 커큐민의 세포 흡수 테스트는 다음 절차에 의해 연구되었다: 치주 인대 줄기 세포를 샘플 3으로 24시간 동안 처리했다. 처리 후, 세포를 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 디하이드로클로라이드(DAPI)(핵 염색) 및 로다민-팔로이딘(액틴 염색)으로 15 내지 30분 동안 염색하였다. 24시간 처리 후 형광 현미경을 이용하여 세포 흡수 수준을 측정하였다.
치주 인대 줄기 세포로의 커큐민 세포 흡수 효율 테스트의 공초점 현미경 이미지가 도 18에 도시되어 있다. 결과는, 녹색 형광 강도로 표시된 커큐민 콜로이드의 세포 흡수가 물 중 커큐민의 경우보다 높았음을 보여준다.
(9) 투과성
나트륨 아스코빌 포스페이트(SAP), 및 콜로이드 형태의 샘플 2 0.1% w/v로 캡슐화된 SAP의 투과성을 프란츠 확산 세포를 통해 돼지피부에서 테스트했다. 결과는, 콜로이드 형태의 샘플 2 0.1% w/v로 캡슐화된 SAP 6 μg/cm2 및 SAP 68.78 μg/cm2가 돼지피부에 각각 투과되었음을 보여주었다. 따라서, HA-g-pNIPAM이 표피로의 투과성을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
(10) 활성 약학 성분의 안정성
콜로이드 형태의 샘플 2의 물리적 안정성 인자(즉, 색상, 침전물)와 화학적 안정성 인자(즉, pH, L-929 세포의 세포 증식 유도)를 포함하는 섬유아세포 성장 인자(FGF) 안정성을 FGF, 및 샘플 2에 캡슐화된 FGF와 비교하여 조사하였다. 실험은 FGF를 콜로이드 형태로 샘플 2에 포함시킨 후 0, 2, 4, 8 및 18주에 수행되었다.
L-929 세포의 세포 증식 유도는 PrestoBlue™ 분석을 이용한 L-929 세포의 대사율 분석이다. L-929를, 5% v/v 태아 소 혈청 및 150 μL의 2 mM L-글루타민을 함유하는 Dulbecco's Modified Eagle 배지/영양 혼합물 F-12(DMEM-F-12)("배지")와 함께 24시간 동안 배양하여 96웰 플레이트 상에 세포의 부착을 증진시킨다. 그런 다음, 배지를 제거하고, 각 웰에서 테스트 물질: FGF(대조군), 및 샘플 2 50μL에 캡슐화된 FGF로 교체했다. 또한, 세포를 5% CO2, 37℃의 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 테스트 물질도 제거하고, pH 7.4의 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 헹구고, 10% PrestoBlue™ 함유 배지로 교체한 후, 5% CO2, 37℃에서 1시간 동안 추가로 배양했다. 마지막으로, 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 560/590 nm(여기/방출)에서 형광 강도를 측정했다.
세포 생존율 테스트는 도 19에 도시되어 있다. 결과는, FGF-유도 세포 성장이 콜로이드-FGF 제형에서 유지되는 반면, FGF의 생물학적 활성은 18주 보관 기간에 걸쳐 떨어지는 것으로 나타났다.
(11) 용해도
커큐민, 아시아트산 및 레스베라트롤이 담지된 콜로이드 형태의 샘플 2와 커큐민이 담지된 콜로이드 형태의 샘플 1, 4 및 5의 용해도는 다음 절차에 따라 테스트되었다: 레스베라트롤 및 커큐민에 대한 자외선-가시광(UV-Vis) 분광 분석, 및 아시아트산에 대한 고성능 액체 크로마토그래피 분석.
0.1% w/v 농도의 콜로이드 형태의 커큐민-담지된 샘플 2와 0.25% w/v 농도의 콜로이드 형태의 샘플 1, 4 및 5의 용해도가 도 20에 도시되어 있다. 결과는, 0.1%의 농도의 샘플 2(도 20a)의 경우, 콜로이드는 커큐민의 용해도를 26배 증가시킬 수 있음을 보여준다. 샘플 1, 4 및 5는, 대조군으로서의 물에 비해 커큐민의 용해도를 각각 약 2배, 3배 및 2배 증가시킬 수 있었다.
0, 0.1, 0.15 및 0.25% w/v 농도의 콜로이드 형태의 아시아트산-담지된 샘플 2의 용해도는 담지량(도 21a), 담지 효율(도 21b), 담지 용량(도 21c) 및 포집 효율(도 21d)의 면에서 도 21에 도시되어 있다. 결과는, 물 중 0.1%, 0.15% 및 0.25% 농도의 샘플 2의 경우, 콜로이드가, 대조군인 물에 비해 각각 약 400, 370 및 250배로 아시아트산 담지량을 증가시킬 수 있음을 보여주었다.
0, 0.1 및 0.2% w/v 농도의 콜로이드 형태의 레스베라트롤-담지된 샘플 2의 용해도는 도 22에 도시되어 있다. 결과는, 물 또는 하이드로알코올 용액 중 0.2% 농도의 샘플 2의 경우, 콜로이드는 대조군인 물에 비해 레스베라트롤의 용해도를 4.5 내지 5배 증가시킬 수 있음을 보여주었다.
(12) 보습(moisturizing) 테스트
0.1 및 2% w/v 농도의 콜로이드 형태 샘플 2의 보습 테스트를 건강한 지원자 5명을 대상으로 다음 절차에 의해 연구했다: 처리 전에, 참가자는 테스트 부위에서 1주일 동안 화장품을 금해야 했다. 샘플을 온도 25±2℃, 습도 50±5%에서 14일 동안 하루 2회 팔뚝에 고르게 적용했다. 샘플 2의 적용, 및 일정한 압력을 사용하여 피부에 가압되는 측정 커패시터를 사용한 이의 제어 전과 후에 피부의 수분 함량을 체크하고, 판독은 Corneometer로 평가했다. 대안적으로, 샘플 2의 적용 전과 후를 비교하는 TEWL 측정 프로브를 사용하여 경피 수분 손실량(TEWL) 테스트를 수행하였다.
0.1 및 2% w/v 농도의 콜로이드 형태의 샘플 2의 보습 테스트를 표 4에 나타내었다. 결과는, 샘플 2가, 물 중 2% 및 0.1% 농도의 샘플 2로 적용 후 피부 수분 함량을 각각 124% 및 11.91% 증가시키는 반면, 비개질된 HA는 대조군 중합체의 0.1% 농도에서 피부 수분 함량을 변화시킬 수 없는 것으로 나타났다. 또한, 물 중 0.1% 샘플 2를 팔뚝 피부에 적용한 후 경피 수분 손실량(TEWL)이 12.1% 감소될 수 있었다.
표 4는 샘플 2의 수분 함량 및 경피 수분 손실량(TEWL)을 나타낸다.
그래프팅된 중합체의 적용 전 표피에서의 수분 함량 | 그래프팅된 중합체의 적용 후 표피에서의 수분 함량 | 변화율 (%) | |
히알루론산 | 37.2 | 36.1 | -2.96% |
0.1% w/v HA-g-pNIPAM | 33.3 | 37.2 | 11.91% |
2.0% w/v HA-g-pNIPAM | 50 | 112 | 124% |
그래프팅된 중합체의 적용 전 경피 수분 손실량 (TEWL) | 그래프팅된 중합체의 적용 후 경피 수분 손실량 (TEWL) | 변화율 (%) | |
0.1 % w/v HA-g-pNIPAM | 12.4 | 10.9 | - 12.1% |
(13) 히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(HA-g-pNIPAM)의 독성
각질형성세포(HaCaT 세포), 섬유아세포(BJ 세포) 및 각막 상피 세포에서의 콜로이드 형태의 샘플 2의 시험관내 독성 테스트를 다음 절차에 의해 연구하였다: 세포를 0, 0.06, 0.12, 0.25, 0.5, 1 및 2% w/v 농도의 샘플 2로 24시간 동안 처리한 후 MTT 분석으로 독성을 평가했다.
각질형성세포(HaCaT 세포)와 섬유아세포(BJ 세포)에서의 세포독성 테스트는 도 7에 도시되어 있다. 이러한 결과는, 샘플 2가 두 피부 세포 모두의 세포 생존율을 감소시키지 않았음을 보여주며, 이는 샘플 2가 두 세포주 모두에 독성을 유발하지 않았음을 시사한다.
또한, 각막 상피 세포에서의 세포독성 테스트는 도 23에 도시되어 있다. 이러한 결과는, 샘플 2 처리된 세포에서는 독성이 관찰되지 않음을 보여주었다. 이러한 결과는, 샘플 2의 안전성 프로파일을 지지한다.
(14) HA-g-pNIPAM의 광독성
콜로이드 형태의 샘플 2의 시험관내 광독성 테스트는 다음 절차에 따라 연구되었다: HaCaT 각질형성세포를 0, 0.05 및 0.5% w/v 농도의 샘플 2로 24시간 동안 처리했다. 처리 후, 세포에 7.5 J/cm2의 자외선-A(UVA)를 조사한 후, MTT 분석을 통해 세포 생존율을 측정하였다.
광독성 테스트는 도 24에 도시되어 있다. 그 결과는, 샘플 2가 UVA 조사에 의한 독성을 예방할 수 있는 것으로 나타났다.
(15) 부작용 테스트
콜로이드 형태의 샘플 2의 부작용 테스트는 PrestoBlue™ 분석을 통해 섬유아세포 L929 세포에서 아시아트산의 독성 감소를 고려하여 연구되었다.
0, 0.1, 0.15 및 0.25 % w/v 농도의 콜로이드 형태의 샘플 2의 부작용 테스트가 도 25에 도시되어 있다. 결과는, 세포 배양 배지에서 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해된 12.5 μM의 아시아트산을 사용했을 때, 세포 생존율 퍼센트가 5%로 감소했다. 그러나, 콜로이드를 만들기 위해 샘플의 테스트 농도 0.1, 0.15 및 0.25% w/v로 12.5 μM 아시아트산을 포함하는 데 콜로이드가 사용된 경우 세포 생존율은 100%로 증가했다. 따라서, 본 발명의 히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(HA-g-pNIPAM)가 아시아트산의 독성을 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
(16) 피부 자극 테스트
2.0% w/v 농도의 콜로이드 형태의 샘플 2의 자극 테스트를 24시간 폐쇄형(occlusive) 인간용 패치 테스트로 연구했다. 사전 동의를 얻고 포함/제외 기준, 즉 모든 대상은 20 내지 59세의 건강한 성인이어야 하며 어떠한 제외 기준도 없어야 함을 확인한 후, 기술자는 선택한 각 대상의 등(척추 주위 영역)을 연구했다. 또한 기술자는, 선택된 각 대상의 등 위쪽(척추 주위 영역)의 테스트 부위를 관찰하고 촬영했다. 그런 다음, 적절한 용량의 패치 테스트 유닛을 사용하여 대상에게 테스트 샘플을 적용했다. 적용 24시간 후, 대상 스스로 패치를 제거했다. 패치 제거 후 1시간(총 24시간)과 24시간(총 48시간) 후 기술자가 테스트 영역을 촬영했다. 추가 판단, 예컨대 피부 반응성 판단, 및 피부 자극 점수 결정은 피부과 전문의가 평가했다.
그 결과는, 성인 대상 24명 모두가 샘플에 아무런 반응이 없는 것으로 나타났다. 결과로서, 스가이(Sugai)의 분류(cosmetic sciences, 1995, 19:49-56.)에 따르면, 피부 자극 점수는 5 미만인 0으로 계산되었다. 따라서, 이는, 샘플 2가 안전하고 비-자극성 제품임을 확인하였다.
표 5는 샘플 2의 24시간 폐쇄형 인간용 패치 테스트에 따른 피부 반응을 나타낸 것이다.
(17) 감작(sensitization) 테스트
2.0% w/v 농도의 콜로이드 형태의 샘플 2의 감작 테스트는 인간 반복 인절트(insult) 패치 테스트(HRIPT)에 의해 연구되었으며, 이는 (1) 스크리닝 기, (2) 유도 기, (3) 휴식 기간, (4) 챌린지(challenge) 기를 비롯한 4개의 주요 기로 나뉜다. 스크리닝 기에서, 사전 동의 및 포함 기준, 즉 모든 대상은 20 내지 59세의 건강한 성인이어야 하며 어떠한 제외 기준도 없어야 함을 수득 및 확인하였다. 그 후, 기술자는, 선택된 각 대상의 등 위쪽(척추 주위 영역)의 테스트 부위를 관찰하고 촬영했다. 유도 기에서, 대상에게 적절한 용량의 패치 테스트 유닛을 사용하여 테스트 샘플을 적용했다. 적용 24시간 후, 대상 스스로 패치를 제거했다. 숙련된 기술자가 다음 패치 테스트 유닛를 적용하기 전 24시간 또는 48시간 후에 피부 반응을 평가하고 촬영했다. 그런 다음, 기술자가 각 대상의 등의 동일한 위치에 동일한 샘플을 적용했다. 이 절차를 3주 연속으로 주당 3회 반복했다(적용 및 제거 총 9세트). 유도 기 후, 모든 대상에게 10 내지 14일간 휴식 기간을 제공했다. 마지막으로 챌린지 기에서, 패치 테스트 유닛을 사용하여 유도 기 동안 원래 적용 부위 근처의 정상 피부에 동일한 테스트 샘플을 적용했다. 각 패치 테스트 유닛은 적용 후 24시간 후에 각 대상에게서 제거되었다. 각 대상의 테스트 부위를 기술자가 촬영하였고, 피부과 전문의가 패치 테스트 유닛 제거 후 1시간 및 24시간(각각 "24h 후" 및 "48h 후")에 피부 반응을 판단했다.
56명 전원의 결과는, 거의 모든 대상이 아무런 반응을 보이지 않았으며, 표 6에 기술된 바와 같이 단지 1 내지 2명의 대상에서만 테스트 부위에 약간의 홍반이 나타났음을 보여주었다. 이는, 샘플 2가 감작의 원인이 아니며, 연구 조건 하에 저알러지성(hypoallergenic) 제품으로 간주될 수 있는 것으로 해석되었다.
표 6은 샘플 2의 인간 반복 인절트 패치 테스트(HRIPT)에 의한 피부 반응을 나타낸 것이다.
본 발명의 최선 모드
본 발명의 최선 모드 또는 바람직한 실시양태는 본 발명의 설명에 제공된 바와 같다.
Claims (19)
- a) 수-혼화성 용매 중, 히알루론산 화합물(hyaluronic compound), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 및 카보디이미드 가교제를 포함하는 혼합물을 제조하는 단계;
b) 상기 혼합물을, pH를 7.2 내지 7.8 범위로 조정하고, 20 내지 40℃에서 1 내지 3일 동안 교반함에 의해 반응시키는 단계; 및
c) 단계 b)의 혼합물을 건조시키는 단계
를 포함하는 히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(HA-g-pNIPAM)를 제조하는 방법으로서,
히알루론산, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 및 카보디이미드 가교제의 몰비가 0.1:0.0025:1 내지 0.2:0.0125:1 범위인, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 카보디이미드 가교제가 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드(EDC), N-하이드록시 숙신이미드(NHS), N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(DCC), N,N'-디이소프로필카보디이미드(DIC) 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는, 방법. - 제2항에 있어서,
상기 카보디이미드 가교제가 1:0.5 내지 1:1.5 몰비의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드(EDC)와 N-하이드록시 숙신이미드(NHS)의 혼합물인, 방법. - 제1항에 있어서,
히알루론산 화합물의 중량 평균 분자량이 30,000 내지 60,000 달톤 범위인, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 히알루론산 화합물이 히알루론산, 히알루로네이트 염, 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는, 방법. - 제5항에 있어서,
상기 히알루로네이트 염이 나트륨 히알루로네이트, 칼륨 히알루로네이트 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는, 방법. - 제6항에 있어서,
상기 히알루로네이트 염이 나트륨 히알루로네이트인, 방법. - 제1항에 있어서,
폴리(N-이소프로필아크릴아미드)의 중량 평균 분자량이 4,000 내지 6,000 달톤 범위인, 방법. - 제1항에 있어서,
단계 a)에서 사용되는 수-혼화성 용매가 물, 포스페이트 완충 식염수(PBS), 시트레이트 완충액, 트리스(Tris) 완충액, 칼륨 포스페이트 완충액, 하이드로알코올 용액 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는, 방법. - 제9항에 있어서,
단계 a)에서 사용되는 수-혼화성 용매가 물인, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 방법이, 상기 단계 b)를 수행하기 전에, 단계 a)에서 수득된 혼합물의 pH를 4.8 내지 5.8 범위로 조정하고, 상기 혼합물을 0.5 내지 2시간 동안 교반하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서,
pH가, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 중탄산나트륨, 수산화칼슘 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 pH 조정제에 의해 조정되는, 방법. - 제11항에 있어서,
pH가, 염산, 황산 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 pH 조정제에 의해 조정되는, 방법. - 제1항에 있어서,
단계 c)가, 동결-건조, 진공 건조 또는 공기 건조, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 공정에 의해 수행되는, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 방법이, 단계 c)를 수행하기 전에, 단계 b)에서 수득된 생성물을 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제15항에 있어서,
상기 정제하는 단계가, 단계 c)를 수행하기 전에 투석, 직교류(cross flow) 여과, 액체-액체 추출 또는 이들의 조합에 의해 수행되는, 방법. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 방법으로부터 수득된 히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(HA-g-pNIPAM).
- 제17항에 있어서,
상기 히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)가 4 내지 8% 범위의 그래프팅도(degree of grafting)를 갖는, 히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필아크릴아미드). - 0.0001 내지 2% w/v 농도의, 물, 포스페이트 완충 식염수(PBS), 시트레이트 완충액 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 수-혼화성 용매 중의 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 히알루론산 그래프팅된 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)의 콜로이드.
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