KR20240035670A - 미토리보솜 단백질을 포함하는 노화 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
미토리보솜 단백질을 포함하는 노화 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 미토리보솜 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 노화 진단을 위한 바이오마커로 활용할 수 있는 노화 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도에 대한 것이다.
본 발명의 미토리보솜 단백질은 노화 초기단계에서 그 발현수준이 감소하므로, 노화 진단을 위한 바이오마커 조성물, 또는 이를 포함하는 노화 진단용 키트 내지 노화 진단을 위한 정보제공 방법에 효과적으로 활용될 수 있다.
본 발명의 미토리보솜 단백질은 노화 초기단계에서 그 발현수준이 감소하므로, 노화 진단을 위한 바이오마커 조성물, 또는 이를 포함하는 노화 진단용 키트 내지 노화 진단을 위한 정보제공 방법에 효과적으로 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 미토리보솜 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 노화 진단을 위한 바이오마커로 활용할 수 있는 노화 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도에 대한 것이다.
미토콘드리아 산화적 인산화(OXPHOS, oxidative phosphorylation) 매개 생체 에너지 탈조절은 세포 노화 및 유기체 노화 과정에 오랫동안 연루되어 미토콘드리아 자유 라디칼 노화 이론을 뒷받침한다. 미토콘드리아는 자체 DNA와 복제, 전사 및 번역 기계와 같은 독립적인 유전 정보 전달 시스템을 가지고 있으며, 이를 집합적으로 미토콘드리아 중앙 도그마(MCD, mitochondrial central dogma) 시스템이라고 한다. MCD 활동에 관여하는 핵 DNA(ncDNA)로 암호화된 핵심 작용 단백질은 ncDNA 기원의 중앙 도그마 시스템과 근본적으로 다르다. 약 16kb의 원형 이중나선 DNA의 길이를 갖는 포유류 미토콘드리아 DNA(mtDNA)는 염색질과 유사한 패킹이 없는 핵형 구조와 반응성 산소종(ROS) 생성 OXPHOS 위치에 근접하여 산화 스트레스에 매우 취약하다. mtDNA에서 체세포 돌연변이 및/또는 결실의 축적은 노화 및 노화 과정에 중요한 기여자로 간주되며, 이는 DNA 중합효소 결핍 마우스의 연구에 의해 추가로 입증되었다. 그럼에도 불구하고, mtDNA 손상이 노화 관련 미토콘드리아 기능 장애의 유일한 원인인지와 MCD 활성이 기능 장애에 어떻게 관련되는지는 아직 명확하지 않다. MCD 활성에 의해 합성되는 mtDNA로 암호화된 단백질은 13개에 불과하지만, 이러한 단백질 산물은 호기성 ATP 생산을 관장하는 OXPHOS 시스템의 필수 구성요소이다. MCD의 최종 실행자인 미토콘드리아 리보솜(미토리보솜, mitoribosome)은 13개 단백질의 번역을 실행하는 특수 거대 구조이다. 구조적으로 미토리보솜은 82개의 ncDNA로 인코딩된 미토리보솜 단백질(MRP)과 2개의 mtDNA로 인코딩된 리보솜 RNA(rRNA)에 의해 형성되며, 이는 82개의 MRPS와 2개의 rRNA의 잘 조직화된 발현이 미토콘드리아 활성을 조절하는데 중요함을 나타낸다. .
제한된 수의 인구 배가 후, 1차 인간 이배체 섬유아세포(HDF)는 복제 노화(RS, replicative senescence)라고 하는 상태에 들어가며, 이 상태에서 성장이 비가역적으로 정지된다. RS는 유기체 노화의 정상적인 과정을 조사하기 위해 잘 확립된 시험관 내 세포 노화 모델로 사용되었다. RS로 이어지는 가장 광범위하게 연구된 자극은 DNA 복제 중 "말단 복제 문제(end-replication problem)"로 인한 텔로미어 마모이다. 이는 p53, mTOR 또는 PARP 활성화를 통해 증식자 활성화 수용체 γ공활성화제(PGC, proliferatoractivated receptor γ coactivator)-1 및/또는 PGC-1을 통해 미토콘드리아 생합성을 억제하여 텔로미어-미토콘드리아 축을 생성하여 노화 과정을 가속화하였다. 반면에, 텔로미어 G 삼중항(telomeric G triplet)은 산화적 손상시 절단에 특히 민감하며, 이는 미토콘드리아 탈조절 유도 ROS가 텔로미어 마모에 기여함을 암시하였다. 인간 텔로미어는 텔로미어 관련 인자 1(TRF1), TRF2, 억제인자/활성화인자 단백질(RAP1), 텔로미어 단백질 1 보호(POT1), TRF1-상호작용 핵단백질 2(TIN2) 및 TIN2- 및 POT1-상호작용 단백질(TPP1)의 6개 단백질의 수많은 사본으로 구성된 쉘터린(shelterin)이라는 특징적인 다중 단백질 복합체로 조립된다. 쉘터린은 텔로미어 DNA 구조와 텔로미어라제 활성을 모두 조절하여 텔로미어 서열을 보호한다. p53 의존성 TRF2 분해 및 인간 항원 R(HuR) 손실 매개 TIN2 불안정화는 세포 노화의 유도 및 유지에 기여하는 것으로 보고되었다. 이러한 발견은 쉘테린 인자의 변경된 발현 또는 활성이 텔로미어 탈보호 매개 손상을 통해 세포 노화를 조절함을 시사한다.
노화 세포는 노화와 함께 포유동물 조직에 다양한 비율과 비동기 방식으로 축적된다. 본 발명자들은 이전에 RS 동안 HDF가 뚜렷한 유전자 발현 프로필을 갖는 노화의 4단계를 점진적으로 겪는다고 보고했으며, 이는 노화로의 점진적이고 급격한 진행이 아님을 시사한다.
Kim, Y.M.; Byun, H.O.; Jee, B.A.; Cho, H.; Seo, Y.H.; Kim, Y.S.; Park, M.H.; Chung, H.Y.; Woo, H.G.; Yoon, G. Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence. Aging Cell 2013, 12, 622-634.
Jung, H.J.; Byun, H.O.; Jee, B.A.; Min, S.; Jeoun, U.W.; Lee, Y.K.; Seo, Y.;Woo, H.G.; Yoon, G. The Ubiquitin-like with PHD and Ring Finger Domains 1 (UHRF1)/DNA Methyltransferase 1 (DNMT1) Axis Is a Primary Regulator of Cell Senescence. J. Biol. Chem. 2017, 292, 3729-3739.
본 발명자들은 강력한 노화 특이적 바이오마커를 제공하고자 예의 노력한 결과, 미토리보솜 탈조절(mitoribosomal deregulation)은 세포 노화의 주요 원인이며, 노화 초기에 그 발현수준이 감소하여 노화 관련 바이오마커로서 활용할 수 있는 미토리보솜 단백질을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 미토리보솜 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 노화 진단을 위한 바이오마커로 활용할 수 있는 노화 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 MRPL21, MRPL28, MRPS17, MRPL40, MRPL58, MRPS12, MRPS2 및 MRPS7 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 미토리보솜 단백질(mitoribosomal proteins) 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 검출하는 제제를 포함하는 노화 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 노화는 노화 초기(early stages of senescence)인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 노화 초기는 SA-β-gal(Senescence β-Galactosidase)활성화 이전인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 노화는 피부 노화인 것이다.
본 발명은 상기 조성물을 포함하는 노화 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 i) 개체에서 분리된 시료에서 MRPL21, MRPL28, MRPS17, MRPL40, MRPL58, MRPS12, MRPS2 및 MRPS7 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 미토리보솜 단백질(mitoribosomal proteins) 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현수준을 측정하는 단계;
ii) 상기 측정된 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계;
iii) 상기 측정된 발현 수준이 대조군 시료에 비하여 낮으면 노화로 분류하는 단계;
를 포함하는 노화 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
본 발명의 미토리보솜 단백질은 노화 초기단계에서 그 발현수준이 감소하므로, 노화 진단을 위한 바이오마커 조성물, 또는 이를 포함하는 노화 진단용 키트 내지 노화 진단을 위한 정보제공 방법에 효과적으로 활용될 수 있다.
도 1은 미토리보솜 단백질(MRP) 탈조절은 복제 노화의 초기(E-M) 전환 중에 발생하는 핵심 이벤트임을 나타낸다. (A) HDF의 RS에서 MitoCarta3.0의 유전자의 발현 히트맵 및 감독되지 않은 계층적 클러스터링(메트릭 = 1 - 피어슨 상관관계, 연결 방법 = 평균). DT와 PT는 각각 세포 조건에 도달하기 위한 배가 시간(day)과 인구 배가 횟수를 나타낸다. E, M, A 및 VA는 각각 초기, 중기, 고급 및 매우 진행된 노화 단계의 세포를 나타낸다. (B) 노화의 다른 단계에서 샘플 사이의 명확한 분리를 보여주는 RS의 주성분(PC) 플롯. (C) DT에 대한 퍼지 c-평균 클러스터링에 의해 확인된 M1 내지 M10 유전자 클러스터의 발현 패턴. 타원은 샘플에 피팅된 가우시안 평균에서 표준편차 1개를 나타낸다. n은 각 클러스터에 할당된 유전자의 수를 나타낸다. (D) RS-M1에서 M3 유전자 클러스터로의 발현 히트맵. MCD = mitochondrial central dogma; OXPHOS = oxidative phosphorylation; PISH = protein import, sorting and homeostasis; MDS = mitochondrial dynamics and surveillance; SMT = small molecule transport. (E) Mito-Carta3.0에 의해 정의된 각 범주에 할당된 유전자의 수와 비율을 보여주는 막대 차트 및 파이 차트. (F) 발현 히트맵 및 (G) 세포질 리보솜 단백질(RP, n = 83) 및 미토콘드리아 리보솜 단백질(MRP, n = 53)의 발현 패턴은 퍼지 c-평균 클러스터링에 의해 식별된 바와 같이 DT에 대한 점진적인 하향 조절을 나타낸다. 파이 차트(하단)는 각 유전자 클러스터에 존재하는 MRP 또는 RP 유전자의 비율을 나타낸다.
도 2은 MRP 및 세포질 RP를 사용한 RS 모델의 퍼지 c-평균 클러스터링은 10개의 유전자 클러스터를 식별했다. E에서 M으로 전환하는 동안 DT에서 하향 조절된 발현 패턴을 보여주는 클러스터는 빨간색으로 강조 표시되었다.
도 3는 세포 노화에서 일반적으로 하향 조절되는 SA-MPR을 나타낸다. (A) HDF의 OS에서 MitoCarta 3.0의 유전자의 발현 히트맵. (B) MitoCarta 3.0에서 나온 유전자의 퍼지 c-means 클러스터링은 M1에서 M4라고 하는 4개의 유전자 클러스터를 확인했다. (C) MitoCarta 3.0에서 정의한 각 범주에 할당된 유전자의 수와 비율을 보여주는 막대 차트 및 파이 차트. (D) 각 세포 노화 모델에서 시간이 지남에 따라 발현 패턴이 하향 조절된 확인된 MRP의 수를 보여주는 벤 다이어그램. 두 모델에서 일반적으로 하향 조절된 MRP의 유전자 기호는 노란색 상자에 표시된다. (E) 일반적으로 하향조절된 MRP의 평균 유전자 발현은 RS(왼쪽) 및 OS(오른쪽)에 대해 표시된다.
도 4은 초기 MRP 하향 조절은 미토콘드리아 기능 장애 및 조기 노화 표현형 획득과 관련이 있다. (A-F) RS는 기본 HDF를 사용하여 개발되었다. (A) HDF-RS의 시계열 웨스턴 블롯 분석. 대표적인 오점 이미지가 표시된다. (B) 부유 세포의 세포 크기 증가는 전방 산란(FSC)의 유세포 분석에 의해 추정되었다. 대표적인 FSC 패턴은 오른쪽 패널에 표시된다. (C) 세포 입도 증가는 측면 산란(SSC) 분석에 의해 추정되었다. 대표적인 SSC 패턴은 오른쪽 패널에 표시된다. (D) 기본 HDF의 시계열 RS의 웨스턴 블롯. (E) 세포의 미토콘드리아 ROS 수준은 MitoSox 염색 후 유세포 분석에 의해 모니터링되었다. 대표적인 형광 이동이 표시된다(오른쪽 패널). **, p < 0.01 vs. (B,C,E)에서 Student's t-test에 의한 DT2. (F) SA-β-gal 활성. 대표 이미지(위) 및 정량화(아래). (G, H) HDF-OS 모델은 재료 및 방법에 설명된 대로 H2O2 처리에 의해 개발되었다. 다른 복용량의 H2O2에 대한 세포 반응이 표시된다. (G) HDF-OS 모델의 웨스턴 블롯. 대표적인 오점 이미지가 표시된다. (H) SA-β-gal 활성. **, Student's t-test에 의한 p < 0.01 vs C.
도 5는 도 4A 의 HDF-RS 모델의 시계열 MRP 표현의 정량화 결과를 나타낸다. 면역 블롯에서 표적 단백질 수준의 정량화된 값은 Image J를 사용하여 농도계 분석에 의해 획득되었다. 각 블롯에 대한 액틴 값은 대조군으로 사용되었다. 히트맵은 MRP(상단 패널) 및 미토콘드리아 단백질 발현(하단)의 평균값을 사용하여 생성되었다. 값은 평균 표준 편차(SD)로 표시된다(n = 3). Student's t-test에 의한 *, p < 0.05; **, p < 0.01 vs E(두 DT2 값의 평균).
도 6은 도 4 G 의 HDF-OSIS 모델의 용량 반응에서 MRP 발현의 정량화 결과를 나타낸다. 면역 블롯에서 표적 단백질 수준의 정량화된 값은 Image J를 사용한 농도 분석에 의해 얻어졌다. 각 블롯에 대한 액틴 값은 대조군으로 사용되었다. 히트맵은 MRP(상단 패널) 및 미토콘드리아 단백질 발현(하단)의 평균값을 사용하여 생성되었다. 값은 평균 표준 편차(SD)로 표시된다(n = 3). Student's t-test에 의한 *, p < 0.05; **, p < 0.01 vs C.
도 7는 미토리보솜 교란은 미토콘드리아 ROS 생성 및 노화를 유도함을 나타낸다. (A-D) HDF(DT2)는 특정 미토리보솜 억제제인 클로람페니콜(CAP)의 표시된 용량으로 처리되었다. DMSO는 CAP용 비히클(V)로 사용되었다. (A) 웨스턴 블롯. 대표적인 오점 이미지와 정량화된 값이 표시된다. (B) 세포 성장. (C) SA-β-gal 활성. **, p < 0.01 vs. V(0.4%) (B,C)의 Student's t-test. (D) 웨스턴 블롯. 대표적인 오점 이미지와 정량화된 값이 표시된다. (E-K) HDF(DT2)는 표시된 MRP에 대해 4일 동안 siRNA로 개별적으로 형질감염되었다. 음성 대조군(NC)의 경우 무작위 서열을 갖는 siRNA를 사용하였다. (E) 웨스턴 블롯. 대표적인 오점 이미지와 정량화된 값이 표시된다. (F) SA-β-gal 활성. (G) 세포 성장. (H) 셀 크기(FSC). (I) 세포 세분성(SSC). (J) 미토콘드리아 ROS(MitoSOX 염색). **, Student's t-test에 의한 p < 0.01 vs. (F-J)에서 NC. (K) 미토콘드리아 번역 활동. 미토콘드리아 번역 활성을 선택적으로 모니터링하기 위해 에메틴(세포질 번역 억제제) 및 호모프로파길글리신(HPG - 초기 단백질 합성의 추적자)을 사용했다. 전체, 세포질(Cyto) 및 미토콘드리아(Mito)에 대한 단백질 번역 활성의 대표적인 이미지가 왼쪽 패널에 표시되고 세 가지 MRP의 개별 녹다운 후 선택적 미토콘드리아 번역 활성이 오른쪽 패널에 표시된다.
도 8는 TPP1 발현은 RS의 M 단계에서 감소하고 그 억제는 텔로미어 DNA 손상과 함께 노화를 유도함을 나타낸다. (A) HDF-RS의 초기(E) 및 중간(M) 단계에서 HDF의 상대 텔로미어 길이가 추정한 결과이다. **, Student's t-test에 의한 p < 0.01 vs DT2. (B) 쉘터린 복합체의 도식적 구조. (C) RS 및 OSIS에서 TERT(텔로미어라제) 및 쉘터린 복합 유전자의 발현 히트맵은 이전 시계열 전사체 데이터(GSE41714 및 GSE80322)에서 얻었다. (D) qPCR 분석에 의한 RS 모델의 표시된 DT에서 HDF의 메신저 RNA 수준. 두 가지 다른 세포 집단 배가(PD32 및 PD35)를 갖는 HDF를 DT2에 사용했다. Student's t-test에 의한 **, p < 0.01 및 *, p < 0.05 vs. DT2(PD32). (E) 시계열 HDF-RS의 웨스턴 블롯. 대표적인 오점 이미지와 정량화된 값이 표시된다. (F-J) HDF(DT2)를 4일 동안 표적 유전자에 대한 siRNA로 개별적으로 형질감염시켰다. (F) 웨스턴 블롯. 대표적인 오점 이미지와 정량화된 값이 표시된다. (G) SA-β-gal 활성. Student's t-test에 의한 **, p < 0.01 및 *, p < 0.05 vs. NC. (H) 텔로미어 길이 분석. (I) 웨스턴 블롯. 대표적인 오점 이미지와 정량화된 값이 표시된다. (J) 텔로미어 기능 장애 유도 초점(TIF), 텔로미어(녹색) 및 53BP1(빨간색)의 공동 국소 초점은 재료 및 방법에 설명된 대로 IF-FISH에 의해 시각화되었다. DAPI(파란색) 염색을 사용하여 핵을 시각화했다.
도 9는 표적 유전자의 녹다운 후 TIF의 정량화 결과를 나타낸다. 도 8 J(A) 및 도 10 F(B)의 IF-FISH 결과로부터 TIF 정량을 얻었다. TIF 양성(+) 세포는 핵에 3개 이상의 TIF가 있는 세포에 대해 선택되었다. TIF(+) 세포의 값은 3개의 독립적인 표지 전표의 5개 이미지에서 20개 이상의 세포를 계산하여 얻었다. Student's t-test에 의한 p < 0.01 vs. NC.
도 10은 SA-MRP 탈조절은 TPP1 억제의 업스트림 조절자 역할을 함을 나타낸다. (A,B) HDF(DT2)는 4일 동안 표적(TPP1 및 POT1)에 대한 siRNA로 형질감염되었다. (A) 웨스턴 블롯. 대표적인 오점 이미지와 정량화된 값이 표시된다. (B) TPP1 및 POT1의 개별 녹다운 4일 후 qPCR에 의한 메신저 RNA 수준. **, Student's t-test에 의한 p < 0.01 vs NC. (CG) HDF(DT2)를 4일 동안 표적 MRP에 대해 siRNA로 형질감염시켰다. (C) 웨스턴 블롯. 대표적인 오점 이미지와 정량화된 값이 표시된다. (D) MRPS9, MRPS15 및 MRPS31의 개별 녹다운 4일 후 메신저 RNA 수준(qPCR). Student's t-test에 의한 **, p < 0.01 및 *, p < 0.05 vs. NC. (E) 상대적인 텔로미어 길이. (F) 텔로미어(녹색) 및 53BP1(빨간색)의 공동 국소화 초점인 텔로미어 기능 장애 유도 초점(TIF)은 재료 및 방법에 설명된 대로 IF-FISH에 의해 시각화되었다. DAPI(파란색) 염색을 사용하여 핵을 시각화했다. (G) 웨스턴 블롯. 대표적인 오점 이미지와 정량화된 값이 표시된다. (H,I) HDF(DT2)는 표시된 기간 동안 CAP(200ug/mL)에 노출되었다. (H) 웨스턴 블롯. 대표적인 오점 이미지와 정량화된 값이 표시된다. (I) 정량적 RT-PCR. Student's t-test에 의한 **, p < 0.01 및 *, p < 0.05 vs. NC. (J) HDF(M 단계, PD63 및 DT3) 후 웨스턴 블롯 분석을 2일 동안 pCMV6-ACD-AC-GFP 플라스미드로 형질감염시켰다. 대표적인 오점 이미지와 정량화된 값이 표시된다. (A,C,H) 화살표는 POT1 밴드를 나타낸다.
도 11은 노화된 인간 세포 및 노화된 마우스/쥐 피부 조직에서 SA-MRP 탈조절의 검증결과를 나타낸다. (A-C) 인간 1차(A) 피부 섬유아세포 및 마우스(B) 진피 섬유아세포 및 (C) 피부 조직에서 SA-MRP 및 쉘터린 유전자의 발현 히트맵. 마우스 게놈에는 2개의 POT1 오르토로그인 Pot1a와 pot1b가 있다. Welch t-검정 p-값은 각 오른쪽 패널에 표시된다. (D) 분석된 각 데이터 세트의 노화된 샘플에서 하향 조절된 발현 패턴을 갖는 식별된 MRP의 수를 보여주는 벤 다이어그램. 사용된 모든 인간 및 마우스 세포 및 조직에서 15개의 공유 SA-MRP의 유전자 기호가 상자에 표시된다. (E) 노화 마우스 피부 조직을 사용한 표적 유전자의 메신저 RNA 수준(qPCR). Student's t-test에 의한 **, p < 0.01 및 *, p < 0.05 vs. 4m. (F) 노화 쥐 피부 조직을 사용한 표적 유전자의 메신저 RNA 수준(qPCR). Student's t-test에 의한 *, p < 0.05 vs. 6m.
도 12은 단일 세포 RNA-seq 분석은 노화와 관련된 MRP 및 쉘터린 유전자의 고유한 발현 프로필을 가진 별개의 세포 클러스터를 식별함을 나타낸다. (A) 노화 마우스 진피 섬유아세포(GSE111136)에서 파생된 scRNA-seq 데이터에서 매우 가변적인 특징의 식별. (B) 유의미한 PC를 나타내는 균일 분포(점선)가 있는 각 PC에 대한 p-값 분포. (C) 다른 Seurat 정의 세포 클러스터(왼쪽) 및 연령(오른쪽)의 세포를 묘사하는 균일 매니폴드 근사 및 투영(UMAP) 플롯. (D) Seurat 정의 셀 클러스터에 할당된 셀의 수와 비율을 보여주는 누적 막대 차트. (E) C3(상단) 및 C4 세포(하단)에서만 각 샘플(젊은 및 고령)에 대한 상위 10개 유전자의 발현 히트맵. (F) 각 셀 그룹에서 풍부한 상위 GO 용어를 보여주는 도트 플롯. (G) 발현 히트맵 및 (H) 47개의 마우스 SA-MRP, 15개의 SA-MRP 유전자, 쉘터린 복합체, Acd 및 노화 마커(p21의 경우 Cdkn1a 및 p16의 경우 Cdkn2a)의 평균 발현(SD). Kruskal-Wallis 카이제곱 p-값(p)이 표시된다. N은 분석된 유전자의 수를 나타낸다. 51개의 SA-MRP 중 Mrps16, Mrps37, Mrps30 및 Mrps27이 필터링된 데이터 세트에 없다.
도 2은 MRP 및 세포질 RP를 사용한 RS 모델의 퍼지 c-평균 클러스터링은 10개의 유전자 클러스터를 식별했다. E에서 M으로 전환하는 동안 DT에서 하향 조절된 발현 패턴을 보여주는 클러스터는 빨간색으로 강조 표시되었다.
도 3는 세포 노화에서 일반적으로 하향 조절되는 SA-MPR을 나타낸다. (A) HDF의 OS에서 MitoCarta 3.0의 유전자의 발현 히트맵. (B) MitoCarta 3.0에서 나온 유전자의 퍼지 c-means 클러스터링은 M1에서 M4라고 하는 4개의 유전자 클러스터를 확인했다. (C) MitoCarta 3.0에서 정의한 각 범주에 할당된 유전자의 수와 비율을 보여주는 막대 차트 및 파이 차트. (D) 각 세포 노화 모델에서 시간이 지남에 따라 발현 패턴이 하향 조절된 확인된 MRP의 수를 보여주는 벤 다이어그램. 두 모델에서 일반적으로 하향 조절된 MRP의 유전자 기호는 노란색 상자에 표시된다. (E) 일반적으로 하향조절된 MRP의 평균 유전자 발현은 RS(왼쪽) 및 OS(오른쪽)에 대해 표시된다.
도 4은 초기 MRP 하향 조절은 미토콘드리아 기능 장애 및 조기 노화 표현형 획득과 관련이 있다. (A-F) RS는 기본 HDF를 사용하여 개발되었다. (A) HDF-RS의 시계열 웨스턴 블롯 분석. 대표적인 오점 이미지가 표시된다. (B) 부유 세포의 세포 크기 증가는 전방 산란(FSC)의 유세포 분석에 의해 추정되었다. 대표적인 FSC 패턴은 오른쪽 패널에 표시된다. (C) 세포 입도 증가는 측면 산란(SSC) 분석에 의해 추정되었다. 대표적인 SSC 패턴은 오른쪽 패널에 표시된다. (D) 기본 HDF의 시계열 RS의 웨스턴 블롯. (E) 세포의 미토콘드리아 ROS 수준은 MitoSox 염색 후 유세포 분석에 의해 모니터링되었다. 대표적인 형광 이동이 표시된다(오른쪽 패널). **, p < 0.01 vs. (B,C,E)에서 Student's t-test에 의한 DT2. (F) SA-β-gal 활성. 대표 이미지(위) 및 정량화(아래). (G, H) HDF-OS 모델은 재료 및 방법에 설명된 대로 H2O2 처리에 의해 개발되었다. 다른 복용량의 H2O2에 대한 세포 반응이 표시된다. (G) HDF-OS 모델의 웨스턴 블롯. 대표적인 오점 이미지가 표시된다. (H) SA-β-gal 활성. **, Student's t-test에 의한 p < 0.01 vs C.
도 5는 도 4A 의 HDF-RS 모델의 시계열 MRP 표현의 정량화 결과를 나타낸다. 면역 블롯에서 표적 단백질 수준의 정량화된 값은 Image J를 사용하여 농도계 분석에 의해 획득되었다. 각 블롯에 대한 액틴 값은 대조군으로 사용되었다. 히트맵은 MRP(상단 패널) 및 미토콘드리아 단백질 발현(하단)의 평균값을 사용하여 생성되었다. 값은 평균 표준 편차(SD)로 표시된다(n = 3). Student's t-test에 의한 *, p < 0.05; **, p < 0.01 vs E(두 DT2 값의 평균).
도 6은 도 4 G 의 HDF-OSIS 모델의 용량 반응에서 MRP 발현의 정량화 결과를 나타낸다. 면역 블롯에서 표적 단백질 수준의 정량화된 값은 Image J를 사용한 농도 분석에 의해 얻어졌다. 각 블롯에 대한 액틴 값은 대조군으로 사용되었다. 히트맵은 MRP(상단 패널) 및 미토콘드리아 단백질 발현(하단)의 평균값을 사용하여 생성되었다. 값은 평균 표준 편차(SD)로 표시된다(n = 3). Student's t-test에 의한 *, p < 0.05; **, p < 0.01 vs C.
도 7는 미토리보솜 교란은 미토콘드리아 ROS 생성 및 노화를 유도함을 나타낸다. (A-D) HDF(DT2)는 특정 미토리보솜 억제제인 클로람페니콜(CAP)의 표시된 용량으로 처리되었다. DMSO는 CAP용 비히클(V)로 사용되었다. (A) 웨스턴 블롯. 대표적인 오점 이미지와 정량화된 값이 표시된다. (B) 세포 성장. (C) SA-β-gal 활성. **, p < 0.01 vs. V(0.4%) (B,C)의 Student's t-test. (D) 웨스턴 블롯. 대표적인 오점 이미지와 정량화된 값이 표시된다. (E-K) HDF(DT2)는 표시된 MRP에 대해 4일 동안 siRNA로 개별적으로 형질감염되었다. 음성 대조군(NC)의 경우 무작위 서열을 갖는 siRNA를 사용하였다. (E) 웨스턴 블롯. 대표적인 오점 이미지와 정량화된 값이 표시된다. (F) SA-β-gal 활성. (G) 세포 성장. (H) 셀 크기(FSC). (I) 세포 세분성(SSC). (J) 미토콘드리아 ROS(MitoSOX 염색). **, Student's t-test에 의한 p < 0.01 vs. (F-J)에서 NC. (K) 미토콘드리아 번역 활동. 미토콘드리아 번역 활성을 선택적으로 모니터링하기 위해 에메틴(세포질 번역 억제제) 및 호모프로파길글리신(HPG - 초기 단백질 합성의 추적자)을 사용했다. 전체, 세포질(Cyto) 및 미토콘드리아(Mito)에 대한 단백질 번역 활성의 대표적인 이미지가 왼쪽 패널에 표시되고 세 가지 MRP의 개별 녹다운 후 선택적 미토콘드리아 번역 활성이 오른쪽 패널에 표시된다.
도 8는 TPP1 발현은 RS의 M 단계에서 감소하고 그 억제는 텔로미어 DNA 손상과 함께 노화를 유도함을 나타낸다. (A) HDF-RS의 초기(E) 및 중간(M) 단계에서 HDF의 상대 텔로미어 길이가 추정한 결과이다. **, Student's t-test에 의한 p < 0.01 vs DT2. (B) 쉘터린 복합체의 도식적 구조. (C) RS 및 OSIS에서 TERT(텔로미어라제) 및 쉘터린 복합 유전자의 발현 히트맵은 이전 시계열 전사체 데이터(GSE41714 및 GSE80322)에서 얻었다. (D) qPCR 분석에 의한 RS 모델의 표시된 DT에서 HDF의 메신저 RNA 수준. 두 가지 다른 세포 집단 배가(PD32 및 PD35)를 갖는 HDF를 DT2에 사용했다. Student's t-test에 의한 **, p < 0.01 및 *, p < 0.05 vs. DT2(PD32). (E) 시계열 HDF-RS의 웨스턴 블롯. 대표적인 오점 이미지와 정량화된 값이 표시된다. (F-J) HDF(DT2)를 4일 동안 표적 유전자에 대한 siRNA로 개별적으로 형질감염시켰다. (F) 웨스턴 블롯. 대표적인 오점 이미지와 정량화된 값이 표시된다. (G) SA-β-gal 활성. Student's t-test에 의한 **, p < 0.01 및 *, p < 0.05 vs. NC. (H) 텔로미어 길이 분석. (I) 웨스턴 블롯. 대표적인 오점 이미지와 정량화된 값이 표시된다. (J) 텔로미어 기능 장애 유도 초점(TIF), 텔로미어(녹색) 및 53BP1(빨간색)의 공동 국소 초점은 재료 및 방법에 설명된 대로 IF-FISH에 의해 시각화되었다. DAPI(파란색) 염색을 사용하여 핵을 시각화했다.
도 9는 표적 유전자의 녹다운 후 TIF의 정량화 결과를 나타낸다. 도 8 J(A) 및 도 10 F(B)의 IF-FISH 결과로부터 TIF 정량을 얻었다. TIF 양성(+) 세포는 핵에 3개 이상의 TIF가 있는 세포에 대해 선택되었다. TIF(+) 세포의 값은 3개의 독립적인 표지 전표의 5개 이미지에서 20개 이상의 세포를 계산하여 얻었다. Student's t-test에 의한 p < 0.01 vs. NC.
도 10은 SA-MRP 탈조절은 TPP1 억제의 업스트림 조절자 역할을 함을 나타낸다. (A,B) HDF(DT2)는 4일 동안 표적(TPP1 및 POT1)에 대한 siRNA로 형질감염되었다. (A) 웨스턴 블롯. 대표적인 오점 이미지와 정량화된 값이 표시된다. (B) TPP1 및 POT1의 개별 녹다운 4일 후 qPCR에 의한 메신저 RNA 수준. **, Student's t-test에 의한 p < 0.01 vs NC. (CG) HDF(DT2)를 4일 동안 표적 MRP에 대해 siRNA로 형질감염시켰다. (C) 웨스턴 블롯. 대표적인 오점 이미지와 정량화된 값이 표시된다. (D) MRPS9, MRPS15 및 MRPS31의 개별 녹다운 4일 후 메신저 RNA 수준(qPCR). Student's t-test에 의한 **, p < 0.01 및 *, p < 0.05 vs. NC. (E) 상대적인 텔로미어 길이. (F) 텔로미어(녹색) 및 53BP1(빨간색)의 공동 국소화 초점인 텔로미어 기능 장애 유도 초점(TIF)은 재료 및 방법에 설명된 대로 IF-FISH에 의해 시각화되었다. DAPI(파란색) 염색을 사용하여 핵을 시각화했다. (G) 웨스턴 블롯. 대표적인 오점 이미지와 정량화된 값이 표시된다. (H,I) HDF(DT2)는 표시된 기간 동안 CAP(200ug/mL)에 노출되었다. (H) 웨스턴 블롯. 대표적인 오점 이미지와 정량화된 값이 표시된다. (I) 정량적 RT-PCR. Student's t-test에 의한 **, p < 0.01 및 *, p < 0.05 vs. NC. (J) HDF(M 단계, PD63 및 DT3) 후 웨스턴 블롯 분석을 2일 동안 pCMV6-ACD-AC-GFP 플라스미드로 형질감염시켰다. 대표적인 오점 이미지와 정량화된 값이 표시된다. (A,C,H) 화살표는 POT1 밴드를 나타낸다.
도 11은 노화된 인간 세포 및 노화된 마우스/쥐 피부 조직에서 SA-MRP 탈조절의 검증결과를 나타낸다. (A-C) 인간 1차(A) 피부 섬유아세포 및 마우스(B) 진피 섬유아세포 및 (C) 피부 조직에서 SA-MRP 및 쉘터린 유전자의 발현 히트맵. 마우스 게놈에는 2개의 POT1 오르토로그인 Pot1a와 pot1b가 있다. Welch t-검정 p-값은 각 오른쪽 패널에 표시된다. (D) 분석된 각 데이터 세트의 노화된 샘플에서 하향 조절된 발현 패턴을 갖는 식별된 MRP의 수를 보여주는 벤 다이어그램. 사용된 모든 인간 및 마우스 세포 및 조직에서 15개의 공유 SA-MRP의 유전자 기호가 상자에 표시된다. (E) 노화 마우스 피부 조직을 사용한 표적 유전자의 메신저 RNA 수준(qPCR). Student's t-test에 의한 **, p < 0.01 및 *, p < 0.05 vs. 4m. (F) 노화 쥐 피부 조직을 사용한 표적 유전자의 메신저 RNA 수준(qPCR). Student's t-test에 의한 *, p < 0.05 vs. 6m.
도 12은 단일 세포 RNA-seq 분석은 노화와 관련된 MRP 및 쉘터린 유전자의 고유한 발현 프로필을 가진 별개의 세포 클러스터를 식별함을 나타낸다. (A) 노화 마우스 진피 섬유아세포(GSE111136)에서 파생된 scRNA-seq 데이터에서 매우 가변적인 특징의 식별. (B) 유의미한 PC를 나타내는 균일 분포(점선)가 있는 각 PC에 대한 p-값 분포. (C) 다른 Seurat 정의 세포 클러스터(왼쪽) 및 연령(오른쪽)의 세포를 묘사하는 균일 매니폴드 근사 및 투영(UMAP) 플롯. (D) Seurat 정의 셀 클러스터에 할당된 셀의 수와 비율을 보여주는 누적 막대 차트. (E) C3(상단) 및 C4 세포(하단)에서만 각 샘플(젊은 및 고령)에 대한 상위 10개 유전자의 발현 히트맵. (F) 각 셀 그룹에서 풍부한 상위 GO 용어를 보여주는 도트 플롯. (G) 발현 히트맵 및 (H) 47개의 마우스 SA-MRP, 15개의 SA-MRP 유전자, 쉘터린 복합체, Acd 및 노화 마커(p21의 경우 Cdkn1a 및 p16의 경우 Cdkn2a)의 평균 발현(SD). Kruskal-Wallis 카이제곱 p-값(p)이 표시된다. N은 분석된 유전자의 수를 나타낸다. 51개의 SA-MRP 중 Mrps16, Mrps37, Mrps30 및 Mrps27이 필터링된 데이터 세트에 없다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 '복제 노화(RS, replicative senescence)' 는 인간 체세포 또는 인간 이배체 섬유아세포(human diploid fibroblasts)가 배양에서 분열하여 결국 도달하는 비가역적인 증식 정지 상태를 의미할 수 있다.
본 발명의 '산화적 스트레스 유발 노화(OS, oxidative stress-induced senescence 또는 hydrogen peroxide-induced senescence)' 는 인간 체세포 또는 인간 이배체 섬유아세포(human diploid fibroblasts)에 과산화수소(H2O2)를 처리하여 유도된 노화를 의미할 수 있다.
본 발명의 '노화 초기' 는 SA-β-gal 의 발현 수준이 증가하기 전 단계, 또는 [비특허문헌 1] 에 따라 인간 체세포 또는 인간 이배체 섬유아세포(human diploid fibroblasts)의 노화를 초기(E), 중기(M), 말기(A) 및 매우 말기(VA)의 4단계로 분류하는 경우 초기(E) 를 의미할 수 있다.
본 발명에서는 인간 이배체 섬유아세포의 두 가지 다른 세포 노화 모델에서 파생된 다양한 미토콘드리아 관련 유전자 발현 프로필을 활용함으로써, 미토리보솜 단백질(MRP, mitoribosomal proteins)의 발현이 눈에 띄는 SA-β-gal 활동이 나타나기 전에 초기에서 중간 전환 동안 일반적으로 감소한다는 것을 확인하였다. 확인된 노화 관련 MRP 특징(SA-MRP, senescence-associated MRP signatures)의 억제된 발현 패턴은 노화된 인간 세포, 쥐 및 마우스 피부 조직 및 노화된 마우스 섬유아세포에서 단일 세포 분해능에서 검증되었다. TIN2 및 POT1 상호작용 단백질(TPP1, TIN2- and POT1-interaction protein)이 동시에 억제되어 텔로미어 DNA 손상과 함께 노화를 유도했다. 마지막으로, 본 발명자들은 SA-MRP 탈조절이 TPP1 억제의 잠재적인 업스트림 조절자가 될 수 있음을 보여주었다. 본 발명은 미토리보솜 탈조절이 미토콘드리아 기능 장애를 시작하는 초기 사건을 나타낼 수 있고 세포 노화의 주요 동인(driver) 및 쉘터린(shelterin) 매개 텔로미어 탈보호의 상류 조절자 역할을 할 수 있음을 나타냈다.
현재, SA-β-gal 은 노화 세포에 대해 가장 널리 사용되는 바이오마커를 나타내지만, 노화의 후기 단계에서 발생하는 ROS, 세포 크기 및 세포 입도의 증가와 같은 다른 노화 표현형 이후에 나타난다. 더욱이, 이러한 초기 표현형은 초기 유전자 재프로그래밍을 동반하여, 노화 초기 단계의 특정 유전자 마커를 개발하기 위한 새로운 길을 열어준다. 본 발명에서는 두 가지 노화 모델(RS 및 OS)에 대한 전사체 데이터의 포괄적인 분석을 통해, 본 발명자들은 눈에 띄는 SA-β-gal 활동이 나타나기 전에 E-M 단계 전환 중에 발생하는 집단 MRP 탈조절을 확인하고 본 발명을 완성하였다. 51개의 SA-MRP는 HDF 노화의 초기 진입을 위한 핵심 특징으로 식별되었다. 노화된 인간 1차 섬유아세포, 마우스 진피 섬유아세포 및 고령 마우스 및 쥐 피부 조직에서 파생된 새로 생성된 검증 데이터의 공개적으로 이용 가능한 전사체 분석을 사용함으로써, 본 발명자들은 또한 집단적 MRP 탈조절이 세포 노화 및 노화 과정에서 일반적인 사건임을 발견했으며 15개의 탈조절된 SA-MRP 유전자(MRPL21, MRPL22, MRPL27, MRPL28, MRPL40, MRPL46, MRPL48, MRPL58, MRPS12, MRPS17, MRPS18B, MRPS2, MRPS26, MRPS33 및 MRPS7)를 다양한 종 및 세포 유형에 걸친 MRP 탈조절의 공유 특징으로 확인했다.
미토리보솜은 2개의 mtDNA로 암호화된 미토리보솜 RNA와 82개의 핵 DNA로 암호화된 MRP를 포함하는 이중 유전적 기원의 거대구조로, 미토콘드리아 에너지를 지배하는 OXPHOS의 핵심 13 mtDNA로 암호화된 단백질의 번역에 특화되어 있다. 본 발명자들은 또한 1차 젊은 HDF에서 여러 MRP(MRPS9, MRPS15 및 MRPS31)의 개별 녹다운이 미토콘드리아 번역 활성의 감소 및 미토콘드리아 ROS의 증가와 함께 노화를 유발한다는 것을 입증했다. 이러한 발견은 MRP 탈조절 매개 미토콘드리아 기능 장애가 세포의 노화 진입을 촉진하는 초기 사건을 나타낼 수 있음을 나타낸다.
광범위한 시험관 내 세포 배양에 의해 확립된 세포 노화는 1960년대 Hayflick에 의해 처음 기술된 후로 유한한 세포 복제 수명을 가진 HDF의 RS는 인간 노화의 세포 모델링에 널리 사용되었다. RS의 주요 기본 메커니즘은 반복적인 세포 분열 중 "말단 복제 문제(end-replication problem)"의 결과인 텔로미어 감소 또는 텔로미어 단축으로 설명되었다. 유사분열 세포에서 "말단 복제 문제"에 의해 유도되는 불가피한 텔로미어 마모에도 불구하고, 반복되는 텔로미어 DNA 서열은 6개의 단백질(TPP1, POT1, RAP1, TIN2, TRF1 및 TRF2) 로 구성된 쉘터린 복합체와 관련된 보호 메커니즘을 가지고 있다. 다수의 쉘터린 복합체는 텔로미어 DNA 서열에 결합하여 T-루프 형성을 통해 구조를 보호하고 텔로미어 연장이 필요할 때 텔로미어라제 효소를 모집한다. TPP1은 TIN2, TRF1 및 TRF2 사이의 상호작용을 촉진하고 텔로미어로의 POT1 모집을 매개하여 쉘터린 복합체를 구성하는 데 필수적인 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 결과적으로 TPP1은 텔로미어 보호를 위해 텔로미어라제 활성을 모집하고 조절한다. 조건부 녹아웃 실험은 POT1 모집을 통해 텔로미어를 보호하는 TPP1의 역할을 보여주었다. 본 발명에서 본 발명자들은 RS 진행의 E에서 M으로의 전환 동안 텔로미어 마모가 발생했음을 확인했으며, 이는 M 단계에서 최소한으로 점진적으로 증폭되었다. TPP1의 mRNA와 단백질 수준은 E에서 M으로의 전환에서 분명히 억제되었고 이후에 일관되었으며, 이는 텔로미어라제 수준이 변하지 않았음에도 불구하고 M 단계 쉘터린 복합체가 텔로미어라제 모집을 위한 제한된 능력을 가졌다는 것을 의미하였다. 본 발명자들은 또한 TPP1 억제가 텔로미어 길이의 유의미한 변화 없이 텔로미어 DNA 손상을 동반한 노화를 유도하고 MRP 탈조절이 TPP1 발현의 업스트림 억제인자로 기능한다는 것을 입증했다.
본 발명은 RS 모델에서 "말단 복제 문제(end-replication problem)"와 관련된 텔로미어 마모의 두 가지 사건과 TPP1 억제에 의한 텔로미어 DNA 손상이 인구 배가(PD, population doubling) 수가 60 이상인 M 단계에서 발생할 수 있음을 시사하였고(도 1A 및 4A), TPP1 매개 텔로미어 DNA 손상만으로도 텔로미어 마모 없이 노화를 유발할 수 있었다. 본 발명자들은 TPP1 억제로 인한 노화에서 텔로미어 마모가 없는 것이 "말단 복제 문제"를 만들기 위한 짧은 실험 기간(4일)에 기인할 수 있다고 가정하였다.
1차 HDF의 시험관 내 데이터는 MRP 탈조절이 조기 노화를 유도할 수 있음을 보여주지만, 이 세포 특징이 노화 단계의 세포 이질성으로 인해 유기체 조직에서 단세포 유형이라도 조직 및 유기체 노화 진행에 어떻게 관련될 수 있는지 설명하기에는 충분하지 않았다. 이 문제를 해결하기 위해 본 발명자들은 노화된 마우스 진피 섬유아세포에서 파생된 공개적으로 사용 가능한 scRNA-seq 데이터 세트를 분석하고 연령, 세포 하위 집단의 이질적인 연령 정의 특성을 암시하는 5개의 서로 다른 세포 하위 집단(C1, C2, C3, C4 및 C5)의 존재와 다양한 구성의 마우스에서 이러한 하위 집단의 다양한 구성을 관찰했다. 중요하게도, 본 발명자들은 MRP와 쉘터틴 유전자의 발현 수준이 C1에서 C5로 점진적으로 감소한다는 것을 발견했다. 여기서 C1 및 C2 세포는 대부분 신생 마우스(1.5/2.5일령)에서 파생된 반면 젊은(2개월) 및 고령(18개월) 마우스에서 비슷한 수의 C3 및 C4 세포가 얻어졌다. 본 발명자들은 Acd를 포함한 MRP와 쉘터틴 유전자가 신생과 어린 나이 사이에 억제된다고 추측하였다. 그러나 분석된 데이터 세트가 3개의 다른 연령 마우스(신생(P1.5-2.5일), 젊은(2개월) 및 늙은(18개월))에서만 파생되었기 때문에 MRP와 쉘터틴 유전자가 억제되는 정확한 노화 시점을 정확히 지적할 수는 없었다. 종합적으로, 본 발명자들은 TPP1 억제를 유도하는 MRP 탈조절이 인간 세포 노화의 초기 진입이며, SA-β-gal 활성으로 특징지을 수 없는 초기 노화의 새로운 마커로서 15개의 SA-MRP 및 TPP1을 제공한다고 보고한다. 마지막으로, 본 발명자들은 노화 유도에서 TPP1 매개 텔로미어 탈보호의 기능적 중요성을 밝혔다.
따라서, 본 발명은 MRPL21, MRPL28, MRPS17, MRPL40, MRPL58, MRPS12, MRPS2 및 MRPS7 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 미토리보솜 단백질(mitoribosomal proteins) 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 검출하는 제제를 포함하는 노화 진단용 바이오마커 조성물을 제공할 수 있다.
상기 '단백질을 검출하는 제제'는 상기 미토리보솜 단백질을 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 항체, 항체단편, 항체모방체, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 페티도모방체(peptidomimerics)일 수 있다. 미토리보솜 단백질을 이용하여 항체를 생성하는 방법은 통상의 기술자가 당업계에서 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
상기 '유전자를 검출하는 제제'는 상기 미토리보솜 단백질을 암호화하는 유전자, 예를 들어 MRPL21, MRPL28, MRPS17, MRPL40, MRPL58, MRPS12, MRPS2 및 MRPS7 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 특이적으로 확인하거나 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 상기 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 노화는 노화 초기(early stages of senescence)인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 노화 초기는 SA-β-gal(Senescence β-Galactosidase) 활성화 이전인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 노화는 피부 노화인 것일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 노화 진단용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 노화는 노화 초기(early stages of senescence)인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 노화 초기는 SA-β-gal(Senescence β-Galactosidase) 활성화 이전인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 노화는 피부 노화인 것일 수 있다.
본 발명의 키트는 통상적으로 사용되는 검출방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성될 수 있다. 예를 들어, 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 평가 대상체로부터 샘플을 수득하기 위한 샘플 추출 수단을 포함할 수 있다. 샘플 추출 수단은 바늘 또는 시린지 등을 포함할 수 있다. 키트는 액체, 기체 또는 반고체일 수 있는, 추출된 샘플을 수용하기 위한 샘플 수집 용기를 포함할 수 있다. 키트는 사용 지침을 추가로 포함할 수 있다. 상기 샘플은 미토리보솜 단백질이 존재하거나 분비될 수 있는 임의의 신체 샘플일 수 있다. 신체 샘플에서 미토리보솜 단백질의 측정은 전체 샘플 또는 가공된 샘플 상에서 수행될 수 있다.
본 발명은 또한, i) 개체에서 분리된 시료에서 MRPL21, MRPL28, MRPS17, MRPL40, MRPL58, MRPS12, MRPS2 및 MRPS7 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 미토리보솜 단백질(mitoribosomal proteins) 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현수준을 측정하는 단계;
ii) 상기 측정된 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계;
iii) 상기 측정된 발현 수준이 대조군 시료에 비하여 낮으면 노화로 분류하는 단계;
를 포함하는 노화 진단을 위한 정보제공 방법을 제공할 수 있다.
상기 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 소변, 대변, 땀 또는 뇌척수액일 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 시료는 조직 또는 세포일 수 있다.
상기 대조군은 노화가 진행되지 않은 시료를 의미할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 노화는 노화 초기(early stages of senescence)인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 노화 초기는 SA-β-gal(Senescence β-Galactosidase) 활성화 이전인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 노화는 피부 노화인 것일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석하지 않는 것은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.
<실험 방법>
1. 세포 노화 모델의 전사체 분석
[비특허문헌 1] 및 [비특허문헌 2] 에 의해 생성된 인간 1차 섬유아세포의 복제 노화(RS) 모델 및 과산화수소 처리를 통해 유도한 산화적 스트레스 유발 노화(OS) 모델에서 파생된 처리된 전사체 데이터는 각각 GSE41714 및 GSE80322 수탁 코드로 NCBI 유전자 발현 옴니버스(GEO)에서 다운로드되었다. 프로브 ID는 R AnnotationDbi 패키지(v1.52.0)의 mapIds 기능을 사용하여 유전자 기호에 매핑되었다. 샘플 전체에 걸쳐 최대 평균 발현 수준을 갖는 프로브는 후속 분석을 위해 유전자로 축소되었다. 주성분 분석(PCA)은 R stats 패키지(v4.0.3)의 prcomp 함수를 사용하여 수행되었다. 퍼지 c-means 클러스터링은 R Mfuzz 패키지(v2.50.0)의 mfuzz 기능을 사용하여 미리 결정된 클러스터 수(RS의 경우 n = 10, OS의 경우 n = 4)로 스케일링된 데이터에 적용되었다.
2. MitoCarta3.0 및 MRP 및 RP를 인코딩하는 유전자
하위 미토콘드리아 구획 및 경로를 포함한 미토콘드리아 프로테옴에 대한 인간 유전자 주석은 MitoCarta3.0(https://www.broadinstitute.org/mitocarta/mitocarta30-inventory-mammalian-mitochondrial-proteinsand-pathways, 마지막 액세스 2021년 4월 5일)에서 직접 구하였다. MitoCarta3.0에 나열된 1136개 유전자 중 1113개 유전자에 대한 전사체 데이터는 두 데이터 세트를 생성하는데 사용되는 프로파일링 플랫폼인 Illumina HumanHT-12 v4.0 발현 비드칩(GPL10558)에서 사용할 수 있다. MRP를 인코딩하는 유전자를 사용하여 RS 모델의 퍼지 c-평균 클러스터링(도 1F,G 및 도 2), 작은(n = 30) 및 큰(n = 52) 리보솜 소단위의 단백질을 인코딩하는 유전자 목록은 Ban Lab(https://bangroup.ethz.ch/research/nomenclature-of-ribosomal-proteins.html, 마지막 액세스 2021년 4월 5일)에서 얻었다. 세포질 리보솜 단백질(RP)을 암호화하는 유전자 목록은 HUGO Gene Nomenclature Committee(HGNC) 리소스(https://www.genenames.org/data/genegroup/#!/group/646, 마지막 액세스 2021년 4월 5일)에서 직접 얻었다.
3. 쥐와 인간의 노화 피부에 대한 전사체 분석
5개의 다른 연령에서 마우스 피부에서 파생된 RPKM(백만 매핑된 리드당 전사체의 킬로베이스당 리드) 값은 액세스 코드 GSE75192로 NCBI GEO에서 직접 다운로드하였다. R geneExpressionFrom-GEO 패키지(v0.6)의 getGeneExpressionFromGEO 함수를 사용하여 젊은(n = 4, 2개월) 및 늙은(n = 4, 18개월) 마우스에서 분리된 진피 섬유아세포의 처리된 발현 매트릭스를 얻었다. 인간 전사체 데이터의 경우, 백인 남성(n = 5, 중간 연령 = 24) 및 노인(n = 5, 중간 연령 = 70.4)의 1차 진피 섬유아세포에 대한 4분위 정규화된 발현 데이터가 NCBI GEO에서 수탁 코드 GSE131938로 직접 다운로드하였다. Morpheus(https://software.broadinstitute.org/morpheus/, 마지막 액세스 2022년 4월 5일)를 사용하여 MRP의 표현 히트맵을 생성하고 1-Pearson 상관 거리와 평균 연결을 사용하여 계층적으로 클러스터링하여 하향 조절된 MRP를 결정했다. 3개의 분석된 데이터 세트에 대한 노화(도 5). 인간 유전자 기호는 R biomaRt 패키지(v2.46.3)를 사용하여 마우스 기호로 변환되었다.
4. 쥐 노화 피부 섬유아세포의 단일 세포 RNA-Seq 분석
3가지 연령(1.5/2.5일령(신생), 2개월령(젊은) 및 18개월령(고령))의 마우스에서 얻은 진피 섬유아세포의 세포 인덱스당 원시 판독 카운트가 있는 처리된 발현 매트릭스를 액세스 코드 GSE111136 에 따라 NCBI GEO에서 다운로드했다. R Seurat 패키지(v4.0.1)는 정규화, 기능 선택, 데이터 크기 조정, PCA, 셀 클러스터링, 비선형 차원 축소(예: UMAP(Uniform Manifold approximation and projection) 플로팅) 및 히트맵 생성을 수행하는데 사용되었다. 간단히 말해서, 가장 가변적인 유전자(n = 3000)는 스케일링된 데이터에서 PCA를 수행하는 데 사용되었으며, 여기서 처음 10개의 PC는 세포 클러스터링을 위한 입력으로 사용되었다. 미토콘드리아 유전자를 주로 발현하는 세포 클러스터는 추가 분석을 위해 제외되었다(도 6). C3 및 C4 클러스터의 세포를 추출하여 독립적인 Seurat 개체를 생성했으며, FindAllMarkers 기능을 사용하여 젊은 및 고령 마우스의 섬유아세포에서 차별적으로 발현된(DE) 기능을 식별하는 데 사용되었다. 상위 100개 DE 유전자(도 9)를 사용하여 R clusterProfiler 패키지(v3.18.1)의 richGO 기능을 사용하여 유전자 온톨로지(GO) 농축 분석을 수행했다.
5. 세포 배양, 세포 성장 및 세포 노화 발달
5세 남아의 포피에서 분리된 일차 HDF는 Dr. Lim IK(아주대학교)에 의해 제공되었으며 이전에 설명한 대로 5% CO2가 포함된 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 10% FBS(Gibco, Grand Island, NY, USA) 및 항생제가 보충된 DMEM(Antibiotic-Antimycotic™Gibco, Grand Island, NY, USA)에서 배양되었다. 세포 성장 및 생존력은 트리판 블루 염색으로 모니터링했다. 각 실험의 종료 시점에서 트립신 처리에 의해 세포를 수확하고 죽은 세포를 배제하기 위해 0.4%(w/v) 트립판 블루(Invitrogen)로 염색한 후 Countess™자동 세포 계수기(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 계수했다.
RS를 개발하기 위해 합류 HDF를 두 개의 새로운 접시에 고르게 옮겨 연속적으로 계대 배양하고 이전에 설명한 대로 PD(population doubling) 수와 DT(doubling time)를 지속적으로 모니터링했다. 얻은 DT 값에는 HDF를 새 플레이트에 뿌린 후 적응 시간이 포함되었다. HDF의 OS를 생성하기 위해 이전에 설명한 대로 기본 HDF(DT2)가 H2O2에 노출되었다.
6. 노화 동물의 피부 조직
젊은(4개월, n=3) 및 고령(12-18개월, n=3) 수컷 C57BL/6 마우스를 KBSI(Korea Basic Science Institute, Deajeon, Korea)에서 구입했다. 희생 후 피부 조직을 채취하여 80 ℃에 보관하였다. 모든 동물 실험은 아주대학교의료원 동물연구윤리위원회(승인번호: 2020-0051)의 승인을 받았다. 젊은(6개월령, n = 3) 및 고령(15개월 및 24개월령, n = 3) Sprague Dawley(SD) 쥐의 피부 조직은 한국 부산의 노화 조직 은행에서 제공했다.
7. 미토콘드리아 ROS 수준 측정 및 세포 크기 및 세포 세분성 모니터링
미토콘드리아 ROS 수준을 결정하기 위해, 세포를 37℃에서 15분 동안 10μM Mitosox 형광 프로브(Invitrogen)를 함유하는 배지에서 인큐베이션하였다. 염색된 세포를 세척하고 PBS에 재현탁하고 유세포 분석법(FACS Vantage, Becton Dickinson Corp., San Antonio, TX, USA)으로 분석했다. 10,000개 세포의 임의의 형광 단위의 평균값을 얻었다.
8. SA-β-Gal 활성 염색
12-웰 플레이트에 접종된 세포를 SA-β-gal 활성 염색에 적용하였다. SA-β-gal 활성의 증가는 제공된 지침에 따라 SA-β-gal 염색 키트(CST, #9860S, Danvers, MA, USA)를 사용하여 모니터링했다. 각 웰의 대표적인 이미지는 Leica DMi1 도립 현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 사용하여 촬영했다. Image J 소프트웨어(National Institutes of Health, https://imagej.nih.gov/ij/, 마지막 액세스 2022년 5월 20일)를 사용하여 파란색으로 염색된 전체 세포의 수를 계산하여 SA-β-gal 의 백분율 양성(+) 세포를 얻었다. 각 실험 조건에 대해 3개의 웰을 사용하고 2개의 독립적인 실험을 수행했다(총 n = 6).
9. siRNA 및 발현 플라스미드를 세포로 형질감염
HDF는 제공된 지침에 따라 Lipofectamine RNAiMAX™시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 표적 유전자에 대한 siRNA 이중가닥으로 형질감염되었다. Target siRNA duplexes는 Bioneer(Daejeon, Korea)에 의해 생성되었으며, 염기서열은 하기와 같다.
| 대상 | 서열 | 서열번호 |
| MRPS9 | #1: 5'-GAGGUUUCGAAGAAGUGUA #2: 5'-GAAAACUUACACAGAGGAUU |
1 2 |
| MRPS15 | #1: 5'-CACUUGGAGAAACAUCGAA #2: 5'-GUCUGUCAAGAUCCGCAGU |
3 4 |
| MRPS31 | #1: 5'-CUCGGCGAUGUUUCCUAGA #2: 5'-GAUUCUCUCCCUUUUGAUA |
5 6 |
| ACD | #1: 5'-GACCUAUCUCUGACCCUCA #2: 5'-CCUACCGGUACCACAGGAA |
7 8 |
| POT1 | #1: 5'-CUGAUGUGGAUCAACUGAA #2: 5'-CUGAUCAAGCUACAGUGUA |
9 10 |
| 음성 대조군 | 5'-CCUACGCCACCAAUUUGGU | 11 |
TPP1 과발현 플라스미드(pCMV6-ACD-AC-GFP)는 OriGene Technologies(Rockville, MD, USA)에서 구입하고 Fugene®HD Reagent(Promega, Fitchburg, WI, USA)를 사용하여 HDF에 도입했다.
10. 웨스턴 블롯 분석
세포를 PBS로 두 번 세척하고 RIPA 용해 완충액(150mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 50mM Tris(pH 8.0), 1mM NaF, 1mM Na3VO4, 1mMPMSF, 1.5ug/mL 펩스타틴 A, 1.5ug/mL 류펩틴)에 용해시켰다. MRPS9(GTX87450), MRPS18C(GTX87389), MRPS22(GTX45001), MRPS30(GTX54320), MRPL9(GTX116779), MRPL46(GTX87311), MT에서 MRPL46(GTX0) 및 텔로미어레이즈(GTX30410)는 GeneTex Inc. (Irvine, CA, USA) 에서 구입하였다. MRPS15(ab137070), MRPS31(ab167406), MRPL30(ab179819) 및 POT1(ab124784)에 대한 항체는 Abcam(Cambridge, MA, USA) 에서 구입하였다. MRPL11(2199S) 및 TPP1(14667S)에 대한 항체는 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA)에서 얻었고 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)에서 NDUFA9(A21344), ATP5A1(A21350), SDHA(A11142) 및 MT-ND6(A3185)에 대한 항체를 얻었다. p21(sc-6246) 및 β-Actin 에 대한 항체는 Santa Cruz(Dallas, TX, USA)에서 구입했다. β-Actin 은 동일한 세포 용해물을 사용하여 다양한 표적 단백질에 대한 면역 블롯을 얻기 위한 로딩 대조군으로 사용되었다. 여러 블롯을 서로 다른 표적 항체와의 혼성화를 위해 2개 또는 3개의 조각으로 절단하고 필요한 경우 재확인을 위해 재탐색했다. 결과에 표시된 대표적인 블롯은 액틴 수준이 서로 비교 가능한 결과에서 선택되었다. 각 표적 단백질에 대해 적어도 4개의 독립적인 실험을 수행했다. 면역 블롯 상의 표적 단백질 수준의 정량적 값은 Image J(National Institutes of Health, https://imagej.nih.gov/ij/, 마지막 엑세스 2022년 5월 20일)를 사용한 밀도계 분석에 의해 얻었다.
11. mRNA 발현을 위한 정량적 실시간 PCR(qPCR)
총 세포 RNA는 RNAisolation plus kit(MN,Dueren, Germany)를 사용하여 분리하고, cDNA는 ReverTra Ace™qPCR RT Master Mix(Toyobo Co. Ltd., Osaka, Japan)를 사용하여 준비했다. PCR은 제공된 프로토콜에 따라 GoTaq®qPCR Master Mix(Promega, Fitchburg, WI, USA)를 사용하여 수행되었다. 표적용 프라이머 세트는 마크로젠(Seoul, Korea)에서 제작하였다.
동물 피부 조직에서 total RNA를 분리하기 위해 제조업체의 프로토콜에 따라 Maxwell RSC Simply RNA Tissue kit(Promega, Fitchburg, WI, USA)를 사용했다. 사용된 프라이머 세트의 서열은 하기에 나열되어 있다.
| 대상 | 종 | 프라이머 서열 | 서열번호 | |
| MRPS9 | Human | Forward | 5'-ATCACACAGGACAGAGAACAG | 12 |
| Reverse | 5'-ATTGCCAGTCGTATTGCTCC | 13 | ||
| MRPS15 | Forward | 5'-AGCGCCAAGTTTCCTTTCAAC | 14 | |
| Reverse | 5'-CTTTGAGCAGCGTAGAGGGA | 15 | ||
| MRPS31 | Forward | 5'-GACGTTCCTACCTCTTCGCC | 16 | |
| Reverse | 5'-CTGCGGTACCTGACTGTTCC | 17 | ||
| ACD | Forward | 5'-TTGAGGTACTACAGGACGCCG | 18 | |
| Reverse | 5'-CGAACTCCTTCTCCTCCCAGT | 19 | ||
| POT1 | Forward | 5'-GCCTTACGTGTTTGGGCATC | 20 | |
| Reverse | 5'-TGGTGCCATCCCATACCTTT | 21 | ||
| TERF1 | Forward | 5'-CAGCGCAGAGGCTATTATTC | 22 | |
| Reverse | 5'-TCAAACTGTGCATCAAGGG | 23 | ||
| TINF2 | Forward | 5'-CAGGGGGAAGGAAAGGAATC | 24 | |
| Reverse | 5'-GAGGCAGGAGACTAGAGTAC | 25 | ||
| TERF2 | Forward | 5'-TCGAGAAAAGAACTTGGCCC | 26 | |
| Reverse | 5'-CCTTTTTGGCCATCGTGAGG | 27 | ||
| TERF2IP | Forward | 5'-GACGTTCCTACCTCTTCGCC | 28 | |
| Reverse | 5'-CTGCGGTACCTGACTGTTCC | 29 | ||
| TBP | Forward | 5'-CGGATAGCGGGGAACCAC | 30 | |
| Reverse | 5'-CACAAGCATCTTTTTGACTGC | 31 | ||
| Mrps7 | Mouse | Forward | 5'-AACCTTCCAGGGCTCACAC | 32 |
| Reverse | 5'-GCTCCTGGTCATACTTCTCC | 33 | ||
| Mrps18b | Forward | 5'-CGCTTCTAAAGCTGGTTCC | 34 | |
| Reverse | 5'-AGCGGTTGTGGTATTCTTC | 35 | ||
| Mrps26 | Forward | 5'-CCTGCCAAATCCAAGGTCG | 36 | |
| Reverse | 5'-CCAACGTGAACTCTAGCCTG | 37 | ||
| Mrps33 | Forward | 5'-CGAGGTCAGGAGCAGGAATC | 38 | |
| Reverse | 5'-AAACAGGCTCACCACTTTC | 39 | ||
| Acd | Forward | 5'-TCCAAACTGCCAGGCTC | 40 | |
| Reverse | 5'-TCAGCCCATGTGTCCTC | 41 | ||
| Tbp | Forward | 5'-GTGGATCGAGTCCGGTAGC | 42 | |
| Reverse | 5'-TGAAATAGTGATGCTGGGC | 43 | ||
| Mrps7 | Rat | Forward | 5'-GAACTCACCGAAGAGGAGAAG | 44 |
| Reverse | 5'-ATGTTGGTGAATTTGCTGATGAC | 45 | ||
| Mrps18b | Forward | 5'-CGAAAGACATGCATTCGTAAGG | 46 | |
| Reverse | 5'-GGCATGGAAGATGATACCCG | 47 | ||
| Mrps26 | Forward | 5'-ACTGCAGGAACTACGGATAG | 48 | |
| Reverse | 5'-TCTTTCAGTTGCACCCAAGC | 49 | ||
| Mrps33 | Forward | 5'-GAGTGCCCGTATCTTTGGTG | 50 | |
| Reverse | 5'-GTCCTGATGCTCATCTCTGTAA | 51 | ||
| Acd | Forward | 5'-CCCACTCTGTCTGGGAACC | 52 | |
| Reverse | 5'-GTTTGGACCTGGGTATGGAG | 53 | ||
| Tbp | Forward | 5'-AATATAATCCCAAGCGGTTTG | 54 | |
| Reverse | 5'-GCTGCTAGTCTGGATTGTTC | 55 |
12. 텔로미어 길이 추정
텔로미어 길이는 게놈 DNA에 대한 qPCR에 의해 약간의 변형을 통해 추정되었다. 총 세포 게놈 DNA는 통상적인 방법을 사용하여 분리하였다. 텔로미어 길이를 추정하기 위해 GoTaq®qPCR Master Mix(Promega, Fitchburg, WI, USA)를 사용하여 qPCR을 수행했다. 프라이머 세트는 마크로젠(Seoul, Korea)에서 제작했다. 알려진 단일 카피 유전자인 산성 리보솜 인단백질 P0(36B4) 유전자를 내부 대조군으로 사용하였다. 사용된 프라이머 세트의 서열은 하기와 같다.
| 대상 | 서열 | 서열번호 |
| 텔로미어 | 5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT 5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACTTACCCTTACCCT |
56 57 |
| 36B4 | 5'-CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC 5'-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA |
58 59 |
13. 미토콘드리아 번역 활동 모니터링
미토콘드리아 번역 활성은 Click-iTTM HPG Alexa FluorTM 488 Protein synthesis Assay Kit(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 모니터링했다. 미토리보솜에서 새로 합성된 단백질을 표지하기 위해 세포를 25 ug/mL 에메틴(Merck Millipore, Burlington, MA, USA)과 함께 2시간 동안 사전 배양하여 세포질 번역 활성을 억제했다. 그런 다음, 세포를 50 uM L-호모프로파길글리신(Click-iTTM HPG, Invitrogen)이 보충된 메티오닌이 없는 RPMI 배지(Invitrogen)에서 1시간 동안 인큐베이션했다. PBS로 2회 세척한 후 세포를 용해 완충액(1% SDS, 50mM Tris, pH 8.0, 1mM NaF, 1mM Na3VO4, 1mM PMSF, 1.5ug/mL 펩스타틴 A, 1.5ug/mL 류펩틴)에 용해시켰다. 전체 세포 용해물(50 ug)을 제조업체의 프로토콜에 따라 Click-iTTM 반응 칵테일에서 30분 동안 Alexa Fluor 488과 추가로 접합하고 Alexa Fluor 488 항체(A-11094, Invitrogen)를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 실시했다. 미토콘드리아 번역 활성의 특이성은 클로람페니콜(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 사용하여 확인하였다.
14. 텔로미어 DNA 손상에 대한 면역형광-형광 제자리 혼성화(IF-FISH) 분석
텔로미어 DNA 손상을 시각화하기 위해 커버슬립에서 성장한 세포는 먼저 4% 파라포름알데히드(고정용), 1차 53BP1 항체(4937S, Cell signaling Technology, Danvers, MA, USA) 및 TRITCconjugated anti-rabbit 이차 항체를 사용하여 기존의 면역형광 염색을 받았다. (A16101, Invitrogen). 염색 후 FITC 표지된 텔로미어 특이적(TTAGGG) PNA 프로브(PANAGENE, Daejeon, Korea)와 함께 제공된 프로토콜에 따라 세포를 다시 FISH 염색하였다. 핵은 1ug/mL DAPI(D3571, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 대조 염색되었다. 형광 염색된 세포는 Nikon A1R Spectral Confocal Laser Dual Scanning Microscope(Nikon Instruments Inc., Melville, NY, USA)로 시각화되었다.
15. 통계 분석
전사체의 통계 분석은 위에서 설명한 대로 R(v4.0.3)을 사용하여 수행되었으며 다른 실험 데이터는 GraphPad Prism 소프트웨어(La Jolla, CA, USA)를 사용하여 짝을 이루지 않은 2-표본 Student's t-test으로 평가되었다.
복제 노화의 초기 사건인 미토리보솜 유전자의 탈조절
미토콘드리아 결함이 복제 노화(RS) 과정에 어떻게 관련될 수 있는지 조사하기 위해 본 발명자들은 이전에 본 발명자들이 생성한 인간 이배체 섬유아세포(HDF, human diploid fibroblasts)의 RS의 시계열 전사체를 사용하여 MitoCarta 3.0에 나열된 미토콘드리아 단백질을 암호화하는 미토콘드리아 관련 유전자(MAG, mitochondria-associated genes)의 발현 프로필을 분석했다. [비특허문헌 1] 에서 별개의 유전자 발현 패턴인, 초기(E), 중기(M), 말기(A) 및 매우 말기(VA)으로 정의된 4단계의 노화를 겪는 HDF는 A 및 VA 단계의 세포가 함께 클러스터된 발현 프로파일로서 MAG를 기반으로 3개의 그룹으로 클러스터링되었다(도 1A,B). 이 데이터는 MAG의 주요 탈조절이 A 단계에 진입하기 전에 완료되었음을 의미하였다.
1113 MAG를 사용한 RS 모델의 퍼지 c-평균 클러스터링은 뚜렷한 시간 의존적 발현 패턴을 가진 10개의 유전자 클러스터(RS-M1에서 M10)를 식별했다(도 1C). 노화 진행과 관련된 미토콘드리아 결함과 관련된 원인 MAG를 확인하기 위해 RS-M1에서 M3으로 표시된 RS의 E에서 VA 단계로의 점진적인 하향조절을 보여주는 3개의 클러스터를 분석했다(1113개 유전자의 38.0%, 도 1D). RS-M1에서 M3 클러스터는 주로 MitoCarta3.0에 따라 미토콘드리아 중앙 도그마(MCD) 및 대사로 분류된 유전자로 구성되었으며, 여기서 57개의 유전자가 MRP를 인코딩하는 것으로 밝혀졌다(도 1E).
MRP 및 세포질 리보솜 단백질(RP)을 사용하는 RS 모델의 퍼지 c-평균 클러스터링은 10개의 유전자 클러스터를 추가로 확인했으며, 그 중 6개 클러스터는 배가 시간(DT)에 걸쳐 하향 조절된 발현 패턴을 나타냈다(도 2). 특히, MRP의 하향 조절은 대부분 E에서 M으로의 전환(88.7%, 47 대 53 MRP) 동안 발생했지만 대부분의 RP의 하향 조절은 후기 시점(89.4%, 74 대 83 RP)에서 관찰되었다(도 1F,G). 이러한 결과는 HDF의 RS 과정에서 세포질 리보솜 결함 이전의 초기 E-M 전환에서 미토리보솜 결함의 발생을 나타낸다.
노화 관련 미토리보솜 유전자 특징의 식별
MRP 탈조절이 세포 노화의 일반적인 사건을 나타낼 수 있는지 여부를 평가하기 위해 이전에 본 발명자들이 생성한 HDF의 산화 스트레스 유발 노화(OS) 모델에 대한 시계열 전사체 데이터에서 파생된 MAG의 발현 프로필을 추가로 분석했다. RS 모델에서 관찰된 바와 같이, MAG의 퍼지 c-평균 클러스터링은 4개의 별개의 유전자 클러스터를 식별했다.
그 중 2개의 클러스터(OS-M1 및 M2, 1113개 유전자의 62.5%)는 시간이 지남에 따라 점진적인 하향 조절을 보여주었다(도 3A,B). 이러한 하향 조절된 유전자 중 70개 유전자는 MitoCarta3.0(도 3C)에 따라 미토리보솜 단백질을 인코딩하였다.
2개의 분석된 세포 노화 모델(RS 및 OS)에서 51개의 MRP(총 82개의 MRP 중 67.1%)가 초기 시점에서 일반적으로 하향 조절되었으며(도 3D,E), OXPHOS 기능 장애 및 결과적인 미토콘드리아 생체 에너지의 탈조절에서 노화 관련(SA)-MRP 유전자 특징의 잠재적인 관여를 강조하였다.
초기 노화 표현형 및 미토콘드리아 ROS 생성과 관련이 있는 MRP의 하향 조절된 단백질 발현
SA-MRP 특징의 기능적 발현을 추정하기 위해 다음으로 HDF의 RS 모델을 사용하여 여러 SA-MRP의 단백질 발현을 조사했다. 특히, ncDNA로 인코딩된 OXPHOS 단백질(NDUFA9, ATP5A1 및 SDHA)의 변경 없이 mtDNA로 인코딩된 OXPHOS 단백질(ND6 및 CYB)의 억제와 함께 10개의 선택된 SA-MRP의 단백질 수준이 M 단계에서 감소했다(도 4A 및 도 5). 이러한 결과는 하향 조절된 SA-MRP 특징이 미토리보솜 번역 활동과 밀접하게 연관될 수 있음을 나타낸다.
동시에, 본 발명자들은 p21의 유도뿐만 아니라 세포 크기와 세포 입도의 증가를 관찰했는데(도 4B-D), 이는 일반적으로 잘 확립된 노화 마커인 노화 관련-갈락토시다아제(SA-β-gal)의 증가된 활성 이전에 획득된 초기 노화 표현형을 나타낸다(도 4F). 또한, 미토콘드리아 반응성 종(ROS)의 수준이 M 단계에서 증가하여(도 4E), 미토콘드리아 OXPHOS의 기능 장애를 시사하였다. RS 모델에서 관찰된 결과에 따라 OS 모델에서 SA-MRP 단백질과 메디나 인코딩 단백질(CYB)의 발현 수준이 감소했다(도 4G, H 및 도 6).
세포 노화를 유발하는 미토리보솜 변화(perturbation)
본 발명자들은 미토리보솜 번역 활성의 기능적 결함이 세포 노화를 유발할 수 있는지 여부를 조사하고자 하였다.
미토콘드리아 번역의 선택적 약리학적 억제제인 클로람페니콜(CAP)에 노출된 어린 HDF(DT2)는 ND6 및 CYB의 단백질 수준에서 현저한 감소를 나타내었지만 MRP의 수준에서는 그렇지 않은 것으로 나타났다(도 7A). 또한, 더 높은 농도(>100ug/mL)의 CAP는 감소된 세포 성장, 증가된 SA-β-gal 활성 및 p21 유도와 함께 노화 표현형을 유의하게 유도했다(도 7A-C). 또한, mtDNA로 인코딩된 단백질(COX2, ND 및 CYB)의 단백질 발현의 CAP 유도 감소와 p21의 유도가 시간 경과에 따라 관찰되었다(도 7D).
SA-MRP의 유전적 억제 효과를 조사하기 위해, 본 발명자들은 미토콘드리아 번역의 개시 단계를 효과적으로 차단할 수 있는 3개의 작은 미토리보솜 소단위 단백질, MRPS9, MRPS15 및 MRPS31을 표적으로 삼았다. 3가지 MRP의 siRNA 매개 녹다운은 ND6 및 CYB의 단백질 발현을 효과적으로 억제하고(도 7E), SA-β-gal-양성 세포, 세포 크기 및 입도의 증가 및 세포 성장의 감소에 의해 입증되는 바와 같이 노화를 유의하게 유도했다(도 7F-I). 중요하게는, 미토콘드리아 ROS가 증가하고(도 7J) 미토콘드리아 번역 활성이 감소했다(도 7K). 이러한 데이터는 미토리보솜의 탈조절이 미토콘드리아 기능 장애를 유발하고 세포를 노화로 유도한다는 것을 나타낸다.
세포 노화를 유발하는 초기 사건인 TPP1의 감소된 단백질 발현
미토리보솜 탈조절과 텔로미어 손상 사이의 연관성을 설명하기 위해 RS의 E 및 M 단계에서 세포의 텔로미어 길이를 모니터링했다.
E 단계(DT2)의 세포와 비교하여, M 단계의 세포는 더 짧은 텔로미어 길이를 제시했다(도 8A). 텔로미어 말단은 TRF1, TRF2, RAP1, POT1, TIN2 및 TPP1(도 8B)을 포함한 6개의 단백질로 구성된 쉘터린 복합체에 의해 보호되며, 그 길이는 세포 유형에 따라 복합체에 의해 조절되는 텔로미어라제 활성에 의해 유지된다(암 세포 및 정상 세포). RS 전사체에서 파생된 6개의 쉘터린 유전자의 발현 프로파일은 M 단계 이후에 POT1의 발현이 약간 감소하면서 ACD(단백질에 대해 TPP1로 명명됨)의 발현에서 현저한 감소를 보여주었다(도 8C, 왼쪽 및 5D). OS 모델에서 ACD 발현은 1일째부터 H2O2 처리 HDF에서 감소했다(도 8C, 오른쪽). 그러나 단백질 수준에서는 RS 모델의 M 단계에서 POT1이 아닌 TPP1만 감소했으며(도 8E), 이는 RS로의 초기 진입에서 TPP1의 기능적 관여를 나타낸다. TPP1의 녹다운은 SA-β-gal 활성의 증가 및 p21의 유도를 포함하는 노화 표현형을 유의하게 유도한 반면, POT1 녹다운은 더 적은 정도로 노화를 유도하였다(도 8F, G). 그러나, 쉘터린 단백질의 유전적 억제는 텔로미어 길이에 실질적으로 영향을 미치지 않았다(도 8H). 이러한 결과는 쉘터린 복합체의 기능적 결함이 유전적 기원과 상관없이 텔로미어 마모 없이 노화를 유도할 수 있음을 시사하였다.
다음으로, 본 발명자들은 TPP1 억제가 텔로미어 마모 없이 어떻게 노화를 유도하는지 추가로 조사했다. 최근에 세포 노화에서 텔로미어 DNA 손상의 관련이 입증되었다. 텔로미어 영역의 DNA 손상을 모니터링하기 위해 본 발명자들은 DNA 손상 반응의 핵심 역할을 하는 53BP1의 발현과 텔로미어 기능 장애 유도 초점(TIF)으로 알려진 텔로미어 DNA에 대한 국소화를 조사했다. TPP1의 억제는 핵 내에서 반점 병소를 형성함으로써 증가된 세포 53BP1 발현을 유도하고(도 8I,J) TIF를 증가시켰으며, 그 중 53BP1 병소는 텔로미어 영역에 밀접하게 국한되었으며(도 8J 및 도 9A), 이는 텔로미어 말단의 DNA 손상을 나타냈다.
텔로미어 기능 장애 유발 초점(TIF), 텔로미어(녹색) 및 53BP1(빨간색)의 공동 국소 초점은 재료 및 방법에 설명된 대로 IF-FISH에 의해 시각화되었다. DAPI(파란색) 염색을 사용하여 핵을 시각화했다. TIF의 정량화는 도 9A에 나와 있다.
전사 TPP1 억제의 업스트림 미토리보솜 탈조절 기능
본 발명자들은 미토리보솜 탈조절과 TPP1 억제 사이의 상호 관계를 조사했다.
TPP1 또는 POT1의 녹다운은 3가지 MRP(MRPS9, MRPS31 및 MRPS15)의 mRNA 및 단백질 발현에 영향을 미치지 않았다(도 10A,B). 그러나, 3개의 MRP의 개별 녹다운은 POT1 발현을 감소시키고 텔로미어 길이를 변경하지 않고 TPP1의 mRNA 및 단백질 발현을 선택적으로 감소시켰다(도 10C-E). 증가된 53BP1 발현 및 TIF는 또한 3개의 MRP의 녹다운에 의해 관찰되었다(도 10F,G 및 도 9B). 또한, 미토리보솜 활성의 CAP 매개 억제는 TPP1의 발현 수준을 감소시켰지만 POT1 및 텔로미어라아제는 감소시키지 않았다(도 10H,I). TPP1이 M 단계의 HDF에서 과발현되었을 때(PD63, DT3), p21 유도가 감소하여 노화 과정이 지연되었음을 의미하였다(도 10J). 이러한 발견은 미토리보솜의 탈조절이 TPP1 억제 매개 노화의 상류 조절자로서 역할을 한다는 것을 나타낸다.
피부 조직에서 하향 조절되는 MRP와 쉘터린 복합체의 유전자 발현
노화된 세포와 조직에서 MRP 및 쉼터 복합 유전자의 탈조절을 검증하기 위해 다음으로 피부 조직과 분리된 1차 세포의 공개적으로 사용 가능한 전사체를 분석했다.
젊은 기증자의 인간 1차 피부 섬유아세포와 비교하여 고령 기증자의 피부 섬유아세포는 51개 SA-MRP의 발현 수준이 감소했지만 통계적 유의성에 도달하지는 않았다(p = 0.062, 도 11A). 마우스 1차 진피 섬유아세포 및 피부 조직에서 유사한 결과가 얻어졌다(도 11B, C). 51개의 SA-MRP의 발현 프로필을 사용하여 분석된 두 데이터 세트의 감독되지 않은 계층적 클러스터링을 통해 노화된 세포와 피부 조직에서 유의하게 하향조절된 특정 SA-MRP를 확인했으며(도 5), 노화된 인간 및 마우스 섬유아세포 중 15개 SA-MRP는 일반적으로 하향 조절되었다(도 11D). 그러나, ACD의 약간 감소된 발현은 노화된 인간 세포에서만 관찰되었지만(도 11A-C), 쉘터린 유전자의 발현은 통계적 유의성에 도달하지 못했다. TERT는 노화된 인간 세포에서 약간 증가했지만 노화된 마우스 섬유아세포 및 조직에서는 감소하여(도 11A-C), 두 종에서 텔로미어라제의 차별적 관여를 나타낸다. 특히, 마우스 피부 조직에서 SA-MRP 및 쉘터틴 유전자의 발현 수준은 연령이 증가함에 따라 점진적으로 감소하였다(도 11C).
상기 결과를 검증하기 위해 본 발명자들은 세 가지 다른 연령(4, 12, 18개월)에서 얻은 마우스 피부 조직을 사용하여 qRT-PCR을 수행했으며 세 표본에서 Mrps7, Mrps33, Mrps26 및 Acd를 포함한 특정 SA-MRP의 mRNA 발현 수준이 감소했음을 발견했다(도 11E). 유사하게, 고령 마우스 피부 조직(6, 15 및 24개월)을 사용하여 MRPS33 및 Acd의 감소된 발현 수준이 추가로 확인되었다(도 11F).
SA-MRP 및 쉘터린 유전자의 초기 억제된 발현을 나타내는 인간 피부의 단일 세포 전사체
SA-MRP의 세포 이질성과 보호소 복합 발현 및 이들의 연관성을 평가하기 위해 노화 피부 섬유아세포에서 파생된 scRNA-seq 데이터 세트를 처리하고 분석했다. 주성분 분석(PCA)은 1044개의 QC 통과 셀과 3000개의 매우 가변적인 기능으로 구성된 확장된 데이터에서 수행되어 셀 클러스터링을 위한 주성분(PC)의 수를 결정했다(도 12A,B). 처음 10개의 PC를 사용하여 3개의 다른 연령(신생(P1.5-2.5일), 젊은(2개월) 및 노인(18개월))에서 얻은 쥐의 노화 피부 섬유아세포를 6개의 세포 하위 집단으로 묶었다. 미토콘드리아 유전자를 주로 발현하는 하나의 세포 클러스터(C6)는 추가 분석에서 제외되었다(도 6). 나머지 5개 세포 클러스터(C1~C5로 표시) 중 UMAP 플롯에서 C1과 C2의 세포는 대부분 갓 태어난 마우스의 섬유아세포에서 유래했으며, C3~C5의 세포는 젊은 및 고령 마우스에서 유래한 것으로 명확하게 구분되어 있다(도 12C).
확인된 세포 하위 집단은 다양한 연령의 세포 비율을 포함하여 세포 클러스터의 이질적인 연령 정의 특성을 시사하였다(도 12D). 본 발명자들은 또한 젊은 마우스의 섬유아세포의 구성 세포 하위 집단이 고령 마우스의 구성 세포 하위 집단과 비슷하다는 것을 발견하였다. C3 및 C4 세포의 최고 농축 기능에 대한 유전자 온톨로지(GO) 분석은 젊은 기증자의 인간 피부에 대한 최근 scRNA-seq 발견과 일치하게 세포외 기질(ECM) 조직 및 세포외 구조 조직을 젊은 마우스에서 최고 농축 GO 용어로 식별했다(도 12E,F 및 도 9). PCA 데이터는 젊은 마우스와 고령 마우스의 피부 조직이 세포 하위 집단 측면에서 비슷한 구성을 가지고 있음을 시사하지만, 다운스트림 분석은 다른 세포 하위 집단이 연령 정의 기능을 고유하게 표현한다는 것을 분명히 나타내며, 젊은 마우스와 고령 마우스에 존재하는 클러스터 결정 기능의 중요성을 강조하다 노화 피부의 섬유아세포 이질성을 해독하였다. 중요하게도, 본 발명자들은 p21 및 p16의 발현이 증가함에 따라 C1 및 C2에 비해 C3에서 C5까지의 세포에서 Acd를 포함한 MRP 및 쉘터린 복합 성분의 발현이 점진적으로 감소하는 것을 발견하였다(도 12G,H). 이러한 결과는 SA-MRP와 Acd의 탈조절이 생쥐가 2개월에 도달하기 전에 발생함을 시사하며, 노화 초기 단계의 조절자로서 SA-MRP와 TPP1의 잠재적 역할에 대한 본 발명자들의 주장을 뒷받침하였다.
Claims (6)
- MRPL21, MRPL28, MRPS17, MRPL40, MRPL58, MRPS12, MRPS2 및 MRPS7 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 미토리보솜 단백질(mitoribosomal proteins) 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 검출하는 제제를 포함하는 노화 진단용 바이오마커 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 노화는 노화 초기(early stages of senescence)인 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 노화 초기는 SA-β-gal(Senescence β-Galactosidase) 활성화 이전인 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 노화는 피부 노화인 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.
- 제1항의 조성물을 포함하는 노화 진단용 키트.
- i) 개체에서 분리된 시료에서 MRPL21, MRPL28, MRPS17, MRPL40, MRPL58, MRPS12, MRPS2 및 MRPS7 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 미토리보솜 단백질(mitoribosomal proteins) 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현수준을 측정하는 단계;
ii) 상기 측정된 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계;
iii) 상기 측정된 발현 수준이 대조군 시료에 비하여 낮으면 노화로 분류하는 단계;
를 포함하는 노화 진단을 위한 정보제공 방법.
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