KR20240022041A - 자동 세포 분주 장치, 이를 포함하는 액체 핸들링 장치 및 자동 세포 분주 방법 - Google Patents
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Abstract
자동 액체 핸들링 장치로서, 하부에 배치되고, 하나 이상의 랙이 안착되기 위한 데크; 상기 데크의 상부에 배치되어 액츄에이터에 의해 3차원 이동 가능하고, 파이펫 팁을 프로브에 결합하여 시료를 흡입하고 분주하기 위한 파이펫 장치; 데크에 장착되어 시료 용기로부터 파이펫 팁에 흡입된 세포 혼합액을 카운팅 위치에서 촬상하는 팁 광학계; 세포 또는 세포 집합체를 포함하는 세포 혼합액을 수용하는 시료 용기를 보유하여 세포 혼합액을 쿨링 유지하기 위한 쿨링모듈; 및 파이펫 팁에 흡입된 세포 혼합액의 촬상 이미지에 기초하여 세포 개수를 산정하고 파이펫 장치를 미리 프로그램된 방법에 따라 작동하도록 제어하는 제어모듈;을 포함하고, 제어모듈은 파이펫 팁의 촬상 이미지에 기초하여 세포 개수를 산정한다.
Description
본 발명은 자동화된 세포 분주 장치 및 방법에 관한 것으로서, 특히 광학적 카운터를 이용한 자동 세포 분주 장치 및 방법과 자동 세포 분주 장치를 포함하는 액체 핸들링 장치에 관한 것이다.
제약 산업의 중심은 제네릭 의약품 중심에서 바이오 의약품으로 전환되고 있다. 동물 또는 인체에서 채취한 세포(Cell)를 실험실 내 조건(in vitro)으로 배지(media)에서 배양(culture)한 뒤 다양한 반응 실험을 하거나 원하는 조직으로 성장시키는 등 여러 목적에 맞게 사용한다. 최근에는 특히 체내 환경과 유사한 3차원 세포 배양이 각광받고 있다.
세포 현탁액, 예를 들어 세포와 Matrigel(Matrigelⓡ Matrix by Corning, natural ECM-based hydrogel)을 혼합한 세포 혼합액을 이용한 다양한 실험에서, 세포를 배양하거나 반응 실험을 위해 플레이트 상에 세포를 다수 분주할 필요가 있다. 실험결과의 신뢰성 및 반복 재현성을 위해 각각의 분주는 균일하게 이루어져야 한다. 단일 세포 또는 세포 집합체(이하, '세포'라 함)을 균일하게 분주함으로써, 다수의 분주된 세포/세포군을 배양, 약물을 가하거나 또는 단백질 과발현 등 각종 실험을 했을 때 균일하고 재현성 높은 실험 결과를 얻을 수 있다. 그러므로, 분주된 세포 혼합액 내에 각기 포함되는 세포 수가 균일하도록 분주하는 것은 이 분야에서 중요한 과제이다.
일반적으로 시료 용기(튜브)에 든 오가노이드, 스페로이드와 같은 세포 집합체 또는 세포는 파이펫 팁에 흡입된 후 플레이트 상에 분주되어 돔 어레이(dome array)을 형성하거나 웰 플레이트의 복수의 웰에 각기 분주된다. 종래에는 희석 기반의 세포 분주가 이루어졌다. 희석기반 분주는 시료 튜브에 든 세포 현탁액 속에 세포 집합체 또는 세포가 전체적으로 균일하게 분포되어 있다는 가정을 전제로 한 것이다. 즉, 동일한 부피의 세포 현탁액 속에는 동일한 갯수의 세포 또는 세포 집합체가 포함되어 있다는 가정하에, 수동 또는 자동으로 동일 부피의 세포 현탁액을 파이펫 팁 내에 흡인하여 플레이트 상에 복수의 돔 등으로 분주하는 방식이다.
그러나, 이 방식은 실험자의 스킬이나 여러 환경 조건 등에 따라 오차가 있을 수 있어 한계를 가진다. 예를 들어, 시간의 경과에 따라 세포가 시료 튜브의 하부에 더 많이 가라앉을 경우 시간이 지날수록 동일한 양(부피)의 현탁액 속에 더 많은 세포가 포함될 수 있고 그 반대로 시간 경과에 따라 세포 양이 줄어들 수도 있다. 그 밖에 온도 등 환경 조건 등에 따라서도 현탁액 속의 세포 분포가 달라지므로 동일량의 세포 현탁액이 동일량의 세포 갯수를 담보할 수 없다. 따라서 이러한 희석 기반 분주의 한계 극복이 요구되고, 보다 정확하고 균일한 세포 분주 자동화가 필요하다.
(특허문헌 1) KR 10-1858056 B
본 발명은 희석기반 분주의 문제점들을 해결하여 균일한 세포 분주가 가능한 자동 세포 분주 방법 및 장치를 제공하고자 한다.
본 발명은 또한 모듈화된 소형 컴팩트한 구성의 자동 액체 핸들링 장치로 균일한 세포 분주가 가능한 방법을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 일 측면에 의한 자동 세포 분주 장치는 세포 혼합액을 균일하게 자동 분주하기 위한 것으로서, 분주된 세포 혼합액 내에 포함된 세포 수가 균일하도록 자동 제어하여 세포 혼합액을 분주한다.
상기 자동 세포 분주 장치는 액츄에이터에 의해 3축 이동 가능하고, 파이펫 팁을 프로브에 결합하여 세포 혼합액을 흡입하고 분주하기 위한 파이펫 장치; 및 파이펫 장치에 의해 시료 용기로부터 세포 혼합액이 흡입된 파이펫 팁을 카운팅 위치에서 촬상하는 팁 비전모듈;를 포함한다. 파이펫 팁에 흡입된 세포 혼합액의 촬상 이미지에 기초하여 세포 개수가 산정되는 것이 바람직하다.
상기 팁 비전모듈은 촬상모듈과 조명모듈을 포함하고, 촬상모듈은 하나 이상의 렌즈를 포함하는 제1광학계와 제1카메라를 포함하고, 조명모듈는 환형의 제1조명부를 포함한다.
상기 제1조명부의 환 중심 상단의 카운팅 위치를 상기 제1카메라가 촬상하도록 상기 제1광학계 및 제1카메라가 배치되고, 상기 제1조명부의 환 중심축의 동축 하부에 위치하도록 시료 용기가 안착되고, 상기 파이펫 장치는 시료 용기로부터 세포 혼합액을 파이펫 팁에 흡입한 상태로 수직 상승하여 상기 카운팅 위치로 이동하도록 제어된다.
상기 카운팅 위치의 하부에는 시료 용기가 안착되는 쿨링모듈이 배치되고, 쿨링모듈은 열전소자, 상기 열전소자의 하부에 밀착 결합되는 히트싱크, 하나 이상의 팬, 상기 열전소자의 상부에 배치되는 홀더 및 쿨러케이스를 포함한다.
시료 용기가 상부로터 삽입 안착되도록 홀더의 상단은 개방되고, 홀더의 하단은 상기 열전소자의 상단에 직접 또는 열전달부를 통해 밀착 결합되고, 쿨러케이스는 상기 열전소자, 히트싱크 및 하나의 이상의 팬을 내부에 수용한다.
상기 파이펫 장치에 의해 시료 용기로부터 파이펫 팁에 소정량의 시료가 흡입된 후 상부로 이동하여 상기 카운팅 위치에 위치하면 팁 비전모듈에 의해 파이펫 팁의 하부 소정 영역이 측면에서 촬상된다.
상기 자동 세포 분주 장치의 일부이거나 또는 별도의 외부 장치인 정보처리장치를 더 포함하고, 이 정보처리장치는 프로세서, 메모리 및 통신모듈을 포함하고, 촬상된 이미지를 분석하여 파이펫 팁의 소정 영역 내 세포 개수를 산정하기 위한 것이다. 산정된 세포 개수가 소정 개수에 도달하기까지 1회 이상 촬상 및 촬상된 이미지 분석을 통한 세포 개수의 산정을 반복하고, 산정된 세포 개수가 소정 개수에 도달하면 파이펫 장치가 플레이트 상에 소정량의 세포 혼합액을 분주한다.
상기 자동 세포 분주 장치는 플레이트 비전모듈을 추가로 더 포함할 수 있다.
상기 플레이트 비전모듈은 제2조명부, 제2조명부와 대향 배치되는 제2광학계, 제2카메라, 상기 제2조명부와 제2광학계 사이에 배치되고 2차원 이동이 가능한 플레이트 스테이지를 포함한다. 상기 제2카메라는 플레이트 스테이지에 안착되는 투명한 플레이트 상의 세포 혼합액을 제2광학계를 통해 취득하여 촬상한다.
상기 제2카메라에 의해 촬상된 플레이트 상의 세포 혼합액 이미지에 기초하여 플레이트 상에 분주된 세포 혼합액에 포함된 세포 개수가 산정된다.
제2광학계를 수직 방향으로 미세 이동시켜 오토포커싱 위치를 조절하기 위한 z축 방향 이송부를 더 포함하고, 플레이트 상에 분주된 세포 혼합액 돔을 z축 방향으로 복수의 레이어 별로 오토포커싱 하여 레이어 별로 촬상 및 이미지 분석을 실행한다.
정보처리장치 또는 제어모듈에 의해 제어되어 상기 자동 세포 분주 장치에 의해 실행되는 자동 세포 분주 방법은 다음의 단계들을 포함한다.
파이펫 장치가 시료 용기의 상부로 이동한 후 하강하여 파이펫 팁에 세포 혼합액을 취하는 단계; 카운팅 위치에 파이펫 팁을 위치한 상태로 팁 비전모듈이 파이펫 팁의 소정 영역을 1회 이상 촬상하여 파이펫 팁 내 세포 개수를 카운팅하는 세포 측정 단계; 및 소정 부피의 혼합액을 플레이트 상에 분주하는 분주 단계;를 포함한다.
상기 세포 측정 단계는, 세포 혼합액이 흡인된 파이펫 팁을 카운팅 위치로 이송하는 단계; 카운팅 위치에 파이펫 팁을 정지한 상태로 카메라로 촬상하는 촬상 단계; 및 촬상된 이미지를 분석하여 파이펫 팁 내의 소정 영역 내의 세포 수를 산정하는 단계;를 포함하고, 상기 촬상 및 산정하는 단계를 반복하되, 세포 수가 소정 개수에 도달하면 상기 분주 단계를 실행한다.
상기 자동 세포 분주 장치는 플레이트 스테이지에 안착된 상기 플레이트를 검사하기 위한 플레이트 비전모듈을 더 포함하고, 플레이트 비전모듈이 상기 플레이트에 분주된 세포 혼합액을 촬상하여 분주된 세포의 개수를 검사하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의한 자동 액체 핸들링 장치는, 하부에 배치되고, 하나 이상의 랙이 안착되기 위한 데크; 상기 데크의 상부에 배치되어 액츄에이터에 의해 3차원 이동 가능하고, 파이펫 팁을 프로브에 결합하여 시료를 흡입하고 분주하기 위한 파이펫 장치; 데크에 장착되어 시료 용기로부터 흡입된 세포 혼합액을 보유하는 파이펫 팁을 카운팅 위치에서 촬상하는 팁 비전모듈; 세포 또는 세포 집합체를 포함하는 세포 혼합액을 수용하는 시료 용기를 보유하여 세포 혼합액을 쿨링 유지하기 위한 쿨링모듈; 및 세포 혼합액이 흡입된 파이펫 팁의 촬상 이미지에 기초하여 세포 개수를 산정하고 파이펫 장치를 미리 프로그램된 방법에 따라 작동하도록 제어하는 제어모듈;을 포함한다.
상기 자동 액체 핸들링 장치는 플레이트 스테이지에 안착된 플레이트를 검사하기 위한 플레이트 비전모듈을 더 포함한다.
상기 플레이트 비전모듈은 제2조명부, 제2조명부와 대향 배치되는 제2광학계, 제2카메라, 상기 제2조명부와 제2광학계 사이에 배치되고 수평(xy) 방향 2차원 이동이 가능한 플레이트 스테이지를 포함한다.
제2조명부로부터 플레이트 스테이지에 안착되는 투명한 상기 플레이트 상의 세포 혼합액을 투과하여 제2광학계를 통해 취득되는 이미지를 상기 제2카메라는 촬상하고, 상기 제2카메라에 의해 촬상된 플레이트 상의 세포 혼합액 이미지에 기초하여 플레이트 상에 분주된 세포 혼합액에 포함된 세포 개수가 산정된다.
상기 쿨링모듈의 시료 용기가 삽입 안착되기 위한 홀더의 중심축은 상기 카운팅 위치와 동축이되, 상기 카운팅 위치의 하부에 위치한다.
상기 자동 액체 핸들링 장치는 제2광학계를 수직 방향으로 미세 이동시켜 오토포커싱 위치를 조절하기 위한 z축 방향 이송부를 더 포함하고, 플레이트 상에 분주된 세포 혼합액 돔을 z축 방향으로 복수의 레이어 별로 오토포커싱 하여 레이어 별로 촬상 및 이미지 분석을 실행한다.
상기 자동 액체 핸들링 장치는 상기 데크의 상부에 배치되어 3차원 이동 가능한 그리퍼; 및 상기 데크 상의 일 영역에 안착되는 히터;를 더 포함한다.
상기 그리퍼는 히터 상에 플레이트를 이송하여 안착시키고, 상기 히터는 소정 온도로 플레이트를 히팅시켜 분주된 세포 혼합액을 굳힌다.
본 발명의 또 다른 측면에 의한 자동 세포 분주 장치는, 데크; 액츄에이터에 의해 3축 이동 가능하고, 투명 파이펫 팁을 프로브에 결합하여 시료를 흡입 및 분주하기 위한 파이펫 장치; 및 파이펫 팁을 카운팅 위치에서 촬상하는 팁 비전모듈;를 포함한다.
파이펫 장치에 의해 시료 용기로부터 세포 혼합액이 파이펫 팁에 취해진 후 상기 카운팅 위치로 상승하여 정지된 상태로 상기 팁 비전모듈에 의해 세포 혼합액이 취해진 파이펫 팁이 촬상되고, 촬상 이미지에 기초하여 파이펫 팁 하부의 소정 영역 내의 세포 개수가 산정된다. 상기 산정되는 세포 개수가 소정 개수에 도달하면 파이펫 장치가 이동하여 플레이트에 소정량의 세포 혼합액을 분주한다.
상기 데크는 하나 이상의 구성요소가 탈착가능하게 안착되고 이동가능한 이동데크부와 고정데크부를 포함한다. 상기 이동데크부의 일 구역에 피팅 안착되기 위한 쿨링모듈을 더 포함하고, 상기 쿨링모듈은 열전소자를 포함하는 쿨러블록과 상기 쿨러블록의 상부에 안착되고 상기 시료 용기를 상부로부터 삽입 안착하기 위한 쿨링블록을 포함한다.
파이펫 장치에 의해 시료 용기로부터 세포 혼합액이 파이펫 팁에 취해진 후 상기 카운팅 위치로 상승하여 정지된 상태로 상기 소정 영역 내의 세포 개수가 소정 개수에 도달할 때까지 촬상 및 산정이 반복된다.
본 발명의 일 측면에 의하면 희석기반 분주의 문제점들을 해결하여 균일한 세포 분주가 가능한 자동 세포 분주 방법 및 장치를 제공한다.
본 발명에 의하면, 균일한 세포 분주 및 검증이 가능한 모듈화된 소형 컴팩트한 구성의 자동 액체 핸들링 장치 및 처리 방법이 제공된다.
도 1은 본 발명에 의한 일 실시예에 따른 자동 액체 핸들링 장치의 사시도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 자동 액체 핸들링 장치의 데크에 팁 비전모듈, 플레이트 비전모듈 및 쿨링모듈만을 설치한 상태를 나타낸 사시도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 팁 비전모듈의 사시도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 자동 액체 핸들링 장치의 팁 비전모듈과 데크에 안착된 쿨러블록을 나타낸 사진이다.
도 5은 본 발명의 일 실시예에 따른 자동 액체 핸들링 장치의 팁 비전모듈의 조명모듈과 데크에 안착된 쿨링모듈의 종 절단면을 타나낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 팁 비전모듈, 쿨링모듈 및 파이펫 장치의 상대적 위치를 나타낸 것으로, 세포 계수를 위해, 파이펫 장치가 쿨링모듈에 안착된 시료 용기로부터 세포 혼합액을 흡입한 후 카운팅 위치으로 이동한 상태를 나타낸 사시도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 자동 액체 핸들링 장치의 플레이트 비전모듈과 플레이트 스테이지를 사시도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 자동 액체 핸들링 장치의 플레이트 비전모듈을 나타낸 사시도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 자동 액체 핸들링 장치의 플레이트 스테이지의 작동을 나타낸 사시도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 자동 액체 핸들링 장치의 데크에 팁 비전모듈, 플레이트 비전모듈, 쿨링모듈, 플레이트 스테이지 및 모든 랙을 설치한 상태를 나타낸 내부 상면도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 자동 처리 방법의 준비 단계를 나타낸 사진이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 자동 처리 방법의 웰 플레이트 이송 단계를 나타낸 사진이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 자동 처리 방법의 세포 혼합액 흡입 단계 및 세포 측정 단계를 나타낸 사진이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 자동 처리 방법의 세포 측정 단계에서 촬상된 이미지이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 자동 처리 방법의 세포 혼합액 분주 단계 및 분주 세포 검사 단계를 나타낸 사진이다.
도 16은 분주 세포 검사 단계에서 촬상된 이미지이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 자동 처리 방법의 분주 플레이트 히팅 단계를 나타낸 사진이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 자동 처리 방법의 플레이트 이송 단계 및 배지 분주 단계를 나타낸 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 자동 액체 핸들링 장치의 데크에 팁 비전모듈, 플레이트 비전모듈 및 쿨링모듈만을 설치한 상태를 나타낸 사시도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 팁 비전모듈의 사시도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 자동 액체 핸들링 장치의 팁 비전모듈과 데크에 안착된 쿨러블록을 나타낸 사진이다.
도 5은 본 발명의 일 실시예에 따른 자동 액체 핸들링 장치의 팁 비전모듈의 조명모듈과 데크에 안착된 쿨링모듈의 종 절단면을 타나낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 팁 비전모듈, 쿨링모듈 및 파이펫 장치의 상대적 위치를 나타낸 것으로, 세포 계수를 위해, 파이펫 장치가 쿨링모듈에 안착된 시료 용기로부터 세포 혼합액을 흡입한 후 카운팅 위치으로 이동한 상태를 나타낸 사시도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 자동 액체 핸들링 장치의 플레이트 비전모듈과 플레이트 스테이지를 사시도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 자동 액체 핸들링 장치의 플레이트 비전모듈을 나타낸 사시도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 자동 액체 핸들링 장치의 플레이트 스테이지의 작동을 나타낸 사시도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 자동 액체 핸들링 장치의 데크에 팁 비전모듈, 플레이트 비전모듈, 쿨링모듈, 플레이트 스테이지 및 모든 랙을 설치한 상태를 나타낸 내부 상면도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 자동 처리 방법의 준비 단계를 나타낸 사진이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 자동 처리 방법의 웰 플레이트 이송 단계를 나타낸 사진이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 자동 처리 방법의 세포 혼합액 흡입 단계 및 세포 측정 단계를 나타낸 사진이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 자동 처리 방법의 세포 측정 단계에서 촬상된 이미지이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 자동 처리 방법의 세포 혼합액 분주 단계 및 분주 세포 검사 단계를 나타낸 사진이다.
도 16은 분주 세포 검사 단계에서 촬상된 이미지이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 자동 처리 방법의 분주 플레이트 히팅 단계를 나타낸 사진이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 자동 처리 방법의 플레이트 이송 단계 및 배지 분주 단계를 나타낸 사진이다.
이하에서는 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명에 따른 실시예를 상세히 설명한다.
자동 액체 핸들링 장치(Automated liquid handling system)는 신소재개발, 신약개발 및 연구 등에서 다량의 시료를 효율적으로 고속 처리할 수 있도록, 세척(washing), 희석(dilution), incubation, 분주(dispensing), labware 이동 등이 편리하도록 설계된 실험 자동화 장비이다.
생물공학실험 또는 제조 전반에 사용되는 마이크로 플레이트 충진부터 플레이트 리포멧팅, 스탬핑, 연속 희석 같이 복잡한 다단계 피펫팅 작업까지 정밀성이 요구되는 시험을 자동화함으로서 최소인력으로 반복 수행 가능하며 실험 결과의 오차를 최소화할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 자동 액체 핸들링 장치는 데크에 장착되는 다양한 모듈을 포함하여 실험 자동화 뿐 아니라 바이오의약품의 생산 자동화를 위해서도 이용될 수 있다.
이하, 도 1 내지 3을 자동화된 세포 분주 장치를 포함하는 액체 핸들링 시스템을 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 자동 액체 핸들링 장치의 사시도이고, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 자동 액체 핸들링 장치의 데크에 팁 비전모듈, 플레이트 비전모듈 및 쿨링모듈만을 장착한 상태를 나타낸 사시도이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 자동 액체 핸들링 장치는 하나 이상의 이송부, 상기 하나 이상의 이송부에 의해 3차원 이동하는 하나 이상의 파이펫 장치와 그리퍼, 하나 이상의 비전모듈, 내부에 상기한 각종 구성요소들을 수용하는 케이스(10), 케이스의 하부에 배치되어 상기 하나 이상의 비전모듈 및 하나 이상의 랙이 장착되는 데크(20, 21)를 포함한다. 추가로, 케이스(10) 전방에는 개폐가능한 도어(미도시)를 포함하고, 케이스(10) 상단 위에는 케이스(10) 내에서 일정 공기 청정 상태를 유지하기 위한 필터를 포함하는 공조 장치(30)가 설치된다.
도 1, 2에 의하면, 케이스(10) 내의 상부에 이송부가 배치되고, 상기 이송부에 결합된 제1파이펫장치, 제2파이펫장치, 그리퍼는 각기 이송부에 의해 케이스 내부에서 3차원 이동가능하다. 이송부는 3축 액츄에이터일 수 있고, 이송부와 파이펫장치 및 그리퍼의 구성은 일반적인 액체 핸들링 장치의 다양한 방식에 의할 수 있다. 예를 들어, 이송부는 xyz 3축 액츄에이터로서 동일한 x축 선형이송부에 각기 결합된 3개의 y축이송부 및 각 y축이송부에 결합된 z축 이송부를 가질 수 있고, 각각의 z축 이송부에 제1파이펫장치(50), 제2파이펫장치(60), 그리퍼가(40) 결합되어 독립적으로 케이스 내에서 3차원 이동이 가능할 수 있다.
각각의 파이펫 장치는 액체를 흡입/방출하기 위한 구동에너지를 공급하는 스텝모터, 스텝모터에 의해 작동하는 펌프, 시린지, 파이펫 팁의 장착을 위한 파이펫 프로브 등을 포함하는 일반적인 자동 파이펫 장치일 수 있다. 별도의 제어모듈에 의해 구동되는 스텝모터의 작동에 의해 펌프 및 시린지의 동작을 거쳐, 파이펫 프로브에 장착되는 파이펫팁으로 액체가 흡인되고 배출된다.
하나 이상의 파이펫 장치는 하나의 파이펫 팁이 프로브에 결합되는 단일 팁 과 결합되는 1채널 파이펫 장치 또는 다수의 파이펫 팁이 동시에 다수의 프로브에 결합되도록 멀티 파이펫 프로브를 가지는 멀티채널 파이펫 장치일 수 있다. 제1파이펫장치(50)는 1채널 파이펫 장치이고, 제2파이펫장치(60)는 멀티채널 파이펫 장치이다.
파이펫 장치 및 이송부의 구성은 종래에 잘 알려져 있으므로 자세한 설명을 생략한다.
케이스의 하부에는 하나 이상의 비전모듈과, 쿨링모듈, 파이펫 팁 어레이 용기, 시료 플레이트 등이 배치될 수 있도록 데크가 형성된다. 데크는 사각 케이스에 의해 양 측면, 후방 및 상방이 커버된어 액체 핸들러 내부 공간이 형성된다.
도 2에 의하면, 데크는 고정데크부(20)와 전방으로 슬라이드 가능한 이동데크부(21)를 포함한다. 케이스(10)의 하부 전방부에 배치된 이동데크부(21)는 쿨링모듈(600)을 포함한 각종 모듈이나 플레이트 랙, 파이펫 팁 랙과 같은 랙이 구역별로 안착될 수 있도록 구획된 복수의 안착부와, 이동데크부를 전후방으로 슬라이드 이송하기 위한 이동데크부 손잡이(22)를 가진다. 이동데크부가 전후방 슬라이드 가능하도록 이동데크부의 하부에는 레일 또는 선형 가이드가 형성된다.
고정데크부(20)는 이동데크부(21)의 양 측면과 후방에 고정배치되고, 2개의 비전모듈이 고정데크부의 좌측 및 후방 영역에 장착되고 우측 영역에는 하나 이상의 랙이 안착되기 위한 복수의 안착부가 형성된다.
도 2를 참조하면, 고정데크부의 전방 일 측에는 팁 비전모듈이 장착되고, 고정데크부의 후방 일측에는 플레이트 비전모듈(200)이 장착된다.
팁 비전모듈은 촬상모듈(100)과 조명모듈(150, 160)을 포함하고, 파이펫 장치가 시료 용기로부터 파이펫 팁에 흡입한 세포 혼합액을 촬상하여 제어모듈(80) 또는 외부 정보처리 장치로 전송한다. 제어모듈(80) 또는 외부 정보처리 장치는 CPU, AP 등의 프로세서, 메모리, 통신모듈을 포함하여, 메모리에 저장된 소프트웨어 프로그램을 프로세서에 의해 실행함으로써 액체 핸들링 장치의 구성요소들의 동작을 제어하고 비전모듈로부터 수신한 이미지 데이터를 처리하여 세포의 개수를 산정한다. 도 1에 의하면 제어모듈은 케이스(10) 외부에 배치되지만 이에 한정되지 않고 케이스 내에 배치될 수도 있다.
촬상모듈은 하나 이상의 렌즈를 포함하는 렌즈부와 카메라를 포함한다. 조명모듈은 중앙이 빈 환형 조명부(160)와 상기 환형 조명부를 지지하는 지지대(150, 152), 광원(미도시), 상기 광원으로부터의 광을 환형 조명부로 전달하는 광전달부(미도시)를 포함한다. 환형 조명부는 중심축을 향해 조명광을 조사하도록 구성된다.
도 2, 3를 참조하면, 환형 조명부를 지지하는 지지대(150)는 역ㄱ자 형태로 하단부는 고정데크부(20)의 전방 좌측 영역에 고정되고 상단부는 수평 연장되어 환형 조명부(160)를 이동데크부(21)의 쿨링모듈 안착부 상부에 이격 배치되도록 지지한다.
촬상모듈(100)은 ㄱ자 지지부(130), 상기 ㄱ자 지지부(130)의 상부 전단에 결합되는 카메라(110) 및 상기 카메라(110)의 전단에 배치되는 제1렌즈부(120)를 포함한다. 상기 카메라(110)와 제1렌즈부(120)는 상기 조명부 상부의 카운팅 위치에 초점이 맞도록 배치된다.
한편, 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 자동 액체 핸들링 장치의 팁 비전모듈과 데크에 안착된 쿨러블록(600)을 나타낸 사진으로, 쿨링블록(700)이 안착되지 않은 상태이다. 도 5은 본 발명의 일 실시예에 따른 자동 액체 핸들링 장치의 팁 비전모듈의 조명모듈과 데크에 안착된 쿨링모듈의 종 절단면을 타나낸 도면이다.
카운팅 위치은 환형 조명부의 중심축(A) 상의, 높이(z)방향으로는 환형 조명부(160)의 상단으로부터 소정 높이까지이다. 이 소정 높이는 카메라(110)의 field of view 일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 파이펫 팁이 카운팅 위치에 있을 때 카메라(110)는 파이펫 팁을 촬상한다. 즉, 파이펫 팁이 카운팅 위치에 있을 때, 파이펫 팁의 하단은 환형 조명부(160)의 상단과 같은 높이에 있고, 파이펫 팁의 중심축은 환형 조명부의 중심축(A)와 동일하다.
상기 환형 조명부(160)는 이동데크부(21)의 제1안착부의 상부에 이격 배치된다. 도 2 내지 5에 의하면, 제1안착부에는 시료 용기가 안착되는 쿨링모듈이 배치되고, 안착된 시료 용기의 z 방향 중심축은 환형 조명부의 중심축(A)과 동축으로 배치되도록 설계된다. 이동데크부를 전방으로 슬라이드하여 쿨링모듈(600, 700)의 홀더에 시료 용기를 안착시킨 후 이동데크부를 후방으로 슬라이드 이동하여 조명부 중심축 하부에 시료 용기가 동축 배치되게 할 수 있다.
도 4, 5를 참조하면, 쿨링모듈은 이동데크부(21) 제1안착부에 안착되는 쿨러블록(600)과 상기 쿨러블록 상단의 쿨링블록 안착부에 안착되는 쿨링블록(700)을 포함한다. 상기 쿨러블록(600)과 쿨링블록(700)은 각기 별개로 구성되어 이동데크부(21)에 안착되는 쿨러블록(600)에 쿨링블록(700)을 안착되게 하는 것이 바람직하다. 실험 등을 위해 이동데크부(21)를 전방으로 슬라이드하여 쿨링블록(600)을 안착시킨 후 작동시킨다. 한편, 별도로 냉장보관 한 쿨링블록(700)에 시료 용기를 안착한 상태로 쿨링블록(600)에 장착한 후 이동데크부(21)를 후방으로 슬라이드하여 상기 조명부의 하부에 이격되게 배치한다.
쿨러블록(600)은 열전소자(620), 상기 열전소자에 밀착 결합되는 히트싱크(640), 하나 이상의 팬(650), 상기 열전소자, 히트싱크 및 하나의 이상의 팬을 내부에 수용하는 사각 케이스 형태의 쿨러케이스(660)와, 상기 쿨러케이스를 커버하고 쿨링블록을 안착하기 위한 안착부(690)가 상면에 형성되는 쿨러커버(610)를 포함한다. 상기 안착부의 일 영역에는 관통공이 형성되고 상기 관통공에는 열전달부(630)가 삽입되어 고정된다. 상기 안착부의 일 영역에 관통 배치되는 상기 열전달부(630)는 바람직하게는 원형의 알루미늄 플레이트이나, 이에 한정되지 않고 구리, 은 등의 열전도율이 우수한 다른 금속으로 이루어 질수 있고, 원형이 아닌 사각 플레이트 형태일 수도 있다.
상기 열전소자(620)의 흡열부는 상기 열전달부(630)의 저부에 밀착 결합되어 열전달부로부터 열을 흡수하고, 발열부는 하부의 히트싱크(640)에 접하여 연결된다. 히트싱크의 저부 및 측면에 인접하여 배치된 하나 이상의 팬(650)이 쿨러블록으로부터 외부로 방열한다.
쿨러커버(610)는 단열성이 우수한 재료인 엔지니어링 플라스틱, 예를 들어 POM(Poly-Oxy-Methylene, 아세탈)으로 구성된다. 쿨러커버(610)의 상단 일 영역에는 쿨링블록이 안착되기 위한 쿨링블록 안착부가 오목하게 형성된다. 대안적으로, 안착부는 쿨링블록이 쿨러블록의 상면 특정 영역에 위치 고정되도록 쿨링블록의 저면 모서리 형태에 대응하도록 돌출 테두리의 형태로 구성될 수도 있다.
쿨링블록(700)은 시료 용기(800)를 보유하기 위한 홀더(710), 상기 홀더를 내부에 보유하고 하부가 상기 안착부에 안착됨으로써 상기 쿨링블록이 상기 쿨러블록에 안착되게 하는 쿨링케이스(720), 및 상기 홀더(710)를 쿨링케이스에 고정결합하는 체결부(730)를 포함한다.
쿨링케이스(720)는 단열성이 우수한 재료인 엔지니어링 플라스틱, 예를 들어 POM(Poly-Oxy-Methylene, 아세탈) 재료로 형성된 케이스이다. 쿨링케이스(720)는 쿨러블록의 안착부에 피팅 안착되기 위해 안착부와 대응되는 형태로 형성된 하부를 가지고, 내측에는 종단면이 U자인 홀더(710)를 고정 보유하기 위한 관통공이 형성된다. 예를 들어, 쿨러블록의 안착부는 일 모서리가 절개된 형상의 사각형 오목부로 형성되고, 쿨링블록(600)의 하부는 쿨러블록의 안착부에 피팅 안착 가능하도록 대응되는 형상(일 모서리가 절개된 형상의 사각형)으로 구성된다.
이 관통공은 원통형 또는 다각 기둥 형상일 수 있으나, 이에 한정되지 않고 홀더의 외주와 피팅되는 형상이면 족하다.
도 5를 참조하면, 홀더 보유를 위한 관통공은 상하단이 개방되고, 관통공의 상단에는 원통형 관통공의 중심축(A)을 향해 쿨링케이스가 소정 두께로 돌출되는 단차부를 가진다. 이 단차부는, 홀더의 조립 시 상단의 한계를 만드는 동시에 홀더의 상단이 외부로 노출되지 않아 쿨링케이스에 의한 단열 작용이 이루어진다. 단차부에 의해 홀더 상단 테두리면은 외부와 차단되나, 홀더 및 관통공의 상부는 시료 용기(800)가 쿨링블록(700)의 상부로부터 삽입되어 안착 가능하도록 소정의 크기의 단면을 가지고 개방된다. 바람직하기로는 상부의 단차부의 내주면과 이에 접하는 하부의 홀더 상단의 주내면은 동축으로 그 둘레가 동일하여, 쿨링블록(700)이 조립된 상태에서 단차부의 내부 측면으로부터 홀더의 내측면으로 상하 일자로 매끄럽게 이어진다. 즉, 종단면이 U자인 홀더(710)의 상단 테두리에는 이에 면접하도록 쿨링케이스의 돌출된 단차부가 형성된다.
U자 홀더(710)는 열전도율이 우수한 재료로 형성되고 하단이 막힌 원통으로 내부에 시료 용기를 보유하기 위한 공간을 가지고, 하단면은 쿨러블록의 열전달체와 면접하도록 구성된다. 따라서, 쿨링블록(700)이 쿨러블록(600)에 안착된 상태에서, 홀더, 열전달체, 열전소자가 상하로 일직선상에 순차로 접하게 배치되어 홀더에 안착된 시료 용기 내의 시료가 지속적으로 냉각 상태를 유지한다.
한편, 하부가 막힌 원통형 홀더(710)의 하단 외측 가장자리에는 절개에 의한 단턱이 형성되고 이 단턱에 체결부가 결합되어 홀더가 쿨링케이스에 고정결합된다. 조립을 위해 홀더(710)가 저부로부터 쿨링케이스(720)에 삽입되어 체결 고정되도록 체결부를 위한 단턱이 홀더의 저부 가장자리에 형성된다. 도 5에 의하면, 홀더의 하부 외측 가장자리에 환형 절개부가 형성되고, 홀더의 상단 테두리는 쿨링케이스(720)의 단차부에 의해 한정되고, 하부는 환형 절개부에 피팅된 환형의 체결판(732)과 나사(731)에 의해 쿨링케이스에 고정된다.
도 4, 5를 참조하면, 환형 조명부(160)의 하부에는 데크에 피팅 안착되는 쿨러블록 및 쿨러블록의 안착부에 피팅 안착되는 쿨링블록이 배치되고, 환형 조명부(160)의 중심축(A)과 쿨러블록의 U자형 홀더에 피팅 안착된 시료 용기의 중심축(A)은 동축으로 배치되도록 구성된다. 상기 U자형 홀더의 하단면은 쿨러블록의 상단면의 열전달부와 면접하고, 하부에는 열전소자, 히트싱크가 순차로 배치된다.
카운팅 위치은 상기 시료 용기의 중심축 상에 위치하고, 상기 카메라(110)는 카운팅 위치을 촬상하도록 배치된다.
한편, 설계 변경에 의해 쿨러블록(600)과 쿨링블록(700)을 일체로 구성할 수도 있다. 이 경우 쿨러케이스와 쿨링케이스가 접착 등의 방법에 의해 고정결합되거나 설계 변경에 의해 두 케이스가 하나로 형성될 수 있다. 그 외의 주요 구성은 동일하므로 반복 설명을 생략한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 액체 핸들링 장치는 플레이트 비전모듈을 더 포함할 수 있다. 이하 도 1, 2, 7, 8, 9를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 자동 액체 핸들링 장치의 플레이트 비전모듈과 플레이트 스테이지를 설명한다.
플레이트 비전모듈은 플레이트 스테이지에 안착된 플레이트에 분주된 세포 혼합액을 촬상하여 세포 혼합액의 이미지를 획득한다. 플레이트에 분주된 세포 혼합액 돔(dome) 이미지 데이터는 제어모듈 또는 외부 정보처리장치로 전송되고 분석되어 돔 내의 세포 개수가 산출된다.
도 2에 의하면, 플레이트 비전모듈(200)과 플레이트 스테이지(300)는 쿨링모듈의 후방, 고정데크부(20) 상에 배치된다. 도 7 내지 9에 의하면, 플레이트 비전모듈(200)은 상부 조명, 상기 상부 조명의 하부에 대향 배치되는 제2렌즈부를 포함하는 광학계 및 플레이트 카메라를 포함한다.
도 7에 도시된 바와 같이, 플레이트 스테이지는 상부 조명(260)과 하부 광학계 사이에 배치된다. 플레이트 스테이지(300)는 플레이트 안착부(350)와 플레이트 안착부를 수평 방향 2차원(x, y축) 이송하는 2차원 이송부(320)를 포함한다.
플레이트 안착부(350)는 플레이트(1000)의 개별 웰을 조명의 광이 투과할 수 있도록 형성된 내부 관통구(310)와, 플레이트(1000)를 물리적으로 지지하기 위해 관통구(310)의 가장자리에 형성되는 거치부를 포함한다. 플레이트 안착부는 2차원 이송부에 의해 2차원 슬라이드 이동이 가능하고, 2차원 이송부(320)의 슬라이드 이송에 의해 상부 조명의 하부에 위치하거나 상부 조명을 벗어나도록 이동가능하다. 플레이트 안착부(350)는 검사를 위해 상부 조명의 하부로 슬라이드 이동가능하다. 상부 조명 하부에서 최대한 타측으로 이동한 경우 상부 조명을 벗어나 플레이트 안착부에 안착된 플레이트가 완전히 노출될 수 있다. 이는 플레이트 안착부에 플레이트를 안착한 상태에서 장애물 없이 파이펫 장치에 의해 분주가 이루어질 수 있도록 하기 위해서이다.
플레이트 스테이지는 모터, 상기 모터의 회동축에 결합되는 벨트, 리니어모션 가이드, 케이블 체인, 플레이트 안착부를 포함한다. 하며, 이는 통상의 기술자라면 쉽게 실시가능한 다양한 방법이 있으므로 상세한 설명은 생략한다.
쿨링모듈(600, 700)에 안착된 시료 용기(800)로부터 파이펫 팁(51)에 흡인된 세포 혼합액이 플레이트 스테이지(300)에 안착된 플레이트(1000)에 분주될 수 있도록, 플레이트 스테이지의 2차원 이송부는 플레이트 안착부(350)를 우측으로 이송하여 상부 조명이 파이펫 장치의 이동을 방해하지 않도록 한다.
한편, 오토 포커싱을 위해 제2렌즈부(220)의 상하 방향(z축) 이송을 위한 zc축 이송부(240)가 상기 제2렌즈부에 연결된다.
공간의 효율적 이용을 위해 제2렌즈부의 하부에는 경사진 각도로 거울(220-1)이 배치되고 제2카메라(210)는 제2렌즈부에 의해 집속되고 거울에 의해 반사된 이미지 광을 캡춰할 수 있도록 수평방향으로 배치된다.
도 7, 9에 의하면, 플레이트에 분주된 세포 혼합액 돔은 각기 플레이트의 웰에 각기 위치한다. 플레이트 비전모듈(200)은 팁 비전 모듈에 의해 측정된 세포 개수가 맞는지 확인 및 검사를 하기 위해 플레이트에 분주된 세포 혼합액을 촬상하여 돔 내의 세포 개수를 측정한다.
이하, 도 10 내지 18을 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 자동 액체 핸들링 장치에 의해 오가노이드 혼합액을 정량 분주 및 처리하는 방법을 상세히 설명한다.
[실시예]
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 자동 액체 핸들링 장치의 데크에 팁 비전모듈, 플레이트 비전모듈, 쿨링모듈, 플레이트 스테이지 및 모든 랙을 설치한 상태를 나타낸 내부 상면도이다.
도 10에 의하면, 자동 액체 핸들링 장치의 데크에는 팁 비전모듈, 플레이트 비전모듈이 고정데크부(20) 좌측 전방에서 후방 영역에 걸쳐 장착된다. 또한, 고정데크부(20) 우측 후방으로부터 전방을 향해 히터(400), 뚜껑을 거치하기 위한 뚜껑 랙(950), 제1 플레이트 랙(980) 및 폐기물 용기(920)이 순차로 안착된다.
이동데크부(21) 상에는 좌측 후방으로부터 시계방향으로 쿨러블록(600), 제1팁 랙(970), 제2 팁 랙(910), 배지(medial)를 수용하는 리저버(reservoir, 900)가 안착된다.
도 10과 같은 액체 핸들링 장치를 이용하여 오가노이드 혼합액을 정량 분주 및 처리하는 방법은 다음과 단계들을 전부 또는 일부 포함한다. 이 방법은 제어모듈 또는 정보처리장치의 메모리에 저장되고 프로세서에 의해 실행되는 소프트웨어 프로그램에 의해 전체 또는 하기 2 내지 10단계가 자동화 진행이 가능하다.
1. 시료 준비 단계(도 11 참조)
1.5ml 시료가 든 시료 용기(1.8ml), 배지가 든 reservoir, 제1 및 제2 팁,및 플레이트를 준비한다.
시료는 오가노이드와 매트리젤(matrigel)이 혼합된 세포 혼합액을 시료 용기에 준비한다. 세포와 Matrigel 혼합액은 상온에 쉽게 굳기 때문에 분주 동안 쿨링 상태 유지를 위해 쿨링모듈에 시료 용기를 안착시킨다.
쿨링블록(700)은 별도로 냉장보관을 하고, 이동데크부(21)를 전방으로 슬라이드하여 쿨링블록(600)을 안착시킨 후 작동시킨다. 이후 시료 용기를 차가운 쿨링블록(700)의 홀더(710)에 삽입 안착한 상태로 쿨링블록(600)에 장착한 후 이동데크부(21)를 후방으로 슬라이드하면 상기 조명부의 하부에 이격되게 쿨링모듈이 위치한다. 이 때 냉각 온도는 4℃ 정도가 바람직하고, 쿨링블록(700)을 쿨러블록(600)에 안착시킨 상태에서 후방으로 이동데크부(21)를 슬라이드하면 시료 용기의 중심축이 조명부의 중심축(A)과 일치하도록 배치된다.
안착된 시료 용기의 z 방향 중심축은 환형 조명부의 중심축(A)과 동축으로 배치되도록 설계된다. 이동데크부를 전방으로 슬라이드하여 쿨링모듈(600, 700)의 홀더에 시료 용기를 안착시킨 후 이동데크부를 후방으로 슬라이드 이동하여 조명부 중심축 하부에 시료 용기가 동축 배치되게 할 수 있다.
쿨러블록(600)을 작동시켜 4℃로 냉각시키고, 미리 4℃로 냉각된 쿨링블록(700)에 시료 용기가 보유되므로, 쿨링블록(700)의 홀더에 면접하는 쿨러블록(600)의 열전달체, 열전소자에 의해 분주 작업 중에 시료 용기 내의 세포 혼합액은 냉각 상태를 유지하여 응고되지 않는다.
한편, 배지를 reservoir에 넣고, 제1 팁(50ul 파이펫 팁) 어레이를 제1팁 랙(970),에, 제2 팁(200-1000ul 파이펫 팁) 어레이를 제2 팁 랙(910)에 안착시키고, 커버를 덮은 플레이트를 제1 플레이트 랙(980)에 안착시킨다.
이 시료 준비 단계는 자동으로도 가능하나 수동으로 진행될 수 있다.
2. 그리퍼가 플레이트 랙(980) 상의 플레이트를 플레이트 스테이지(300)로 이송한 후 플레이트 뚜껑을 제거하여 뚜껑 랙(950)에 이동시키는 플레이트 이동 단계(도 12).
그리퍼(40)는 뚜껑이 덮힌 플레이트(1000)를 플레이트 스테이지(300)로 이송하여 플레이트 안착부(350)에 안착시키고, 뚜껑을 이송하여 뚜껑 랙(950)에 거치한다. 이 때 플레이트 스테이지(300)의 안착부에 안착된 플레이트는 파이펫 장치에 의한 시료 분주가 가능하도록 플레이트 비전모듈(200)의 하부 영역에서 벗어난 우측 영역에 위치한다.
사용자의 필요에 따라 그리퍼에 의한 플레이트 스테이지로의 플레이트 이동 단계는 생략되거나 플레이트 상의 분주 이후에 이루어질 수도 있다. 예를 들어 플레이트 랙(980) 상에 플레이트를 거치한 상태로 뚜껑만 제거하고 분주 단계 진행 후 후술하는 플레이트 비전모듈에 의한 검사 단계를 생략하거나, 분주 완료 후에 플레이트 스테이지로 분주된 플레이트를 이송하여 검사하는 것도 가능하다. 그 외 다양한 변형이 가능하다.
3. 시료(세포와 Matrigel 혼합액) 흡입 단계(도 13)
1채널 파이펫 장치가 시료 용기(800) 및 환형 조명부(160)의 상부로 이동한 후 환형 조명부의 중심축(A)을 따라 하강하여 파이펫 팁에 세포 혼합액을 50ul 흡입한다. 이 때, 1채널 파이펫 장치는 쿨링모듈에 안착된 시료 용기에서 세포 혼합액을 흡입한다.
4. 세포 측정 단계(도 13, 14)
흡입한 세포 혼합액을 팁 비전모듈이 촬상하여 파이펫 팁 내 세포 개수를 카운팅하는 세포 측정 단계는 다음의 3 단계를 포함한다.
(4-1) 파이펫 장치에 의해 시료 혼합액이 흡입된 파이펫 팁을 상부로 이송하여 조명부 바로 위의 카운팅 위치로 이동하는 단계
1채널 파이펫 장치(50)는 환형 조명부의 중심축(A)을 따라 환형 조명부(160) 상단의 카운팅 위치로 파이펫 팁을 이동한다. 여기에서 카운팅 위치는 조명부의 중심축(A) 상에 위치하되 파이펫 팁의 하단이 환형 조명부(160)를 막 벗어난 위치이다.
(4-2) 카운팅 위치에 파이펫 팁이 위치하면 정지시킨 후 카메라로 촬상하는 촬상 단계
파이펫 팁이 카운팅 위치에 위치한 상태로 1채널 파이펫 장치(50)이 정지되면, 촬상모듈(100)이 세포 혼합액이 든 투명한 파이펫 팁을 촬상하여 팁에 든 세포 혼합액 이미지를 획득한다. 다만, 카운팅 위치에 대응하도록 카메라(110) 및 렌즈부(120)는 배치되어 있고, 팁의 촬상 대상이 되는 소정 높이도 미리 정해져 있다.
도 14는 세포 측정 단계에서 촬상된 이미지의 일 예로서, 파이펫 팁의 하단부터 소정 높이 아래를 촬상한 것이고, 현탁액 내에 다수의 오가노이드를 확인할 수 있다.
(4-3) 상기 촬상 이미지의 분석을 통해 세포 혼합액 내 소정 영역에 포함된 세포 개수를 산정하는 단계
팁의 하단으로부터 소정의 높이(부피)를 기준으로 그 높이(부피) 내의 세포의 개수를 산정하되, 미리 정한 세포 개수가 카운팅될 때까지 촬상 및 산정 단계를 반복한다. 세포 개수를 산정하는 구체적인 방법은 제어모듈 또는 외부의 별도 정보처리장치에서 이미지 분석을 통해 이미지에서 세포에 해당하는 영역을 추출하고 해당 영역의 갯수를 산출함으로써 가능하다. 이러한 이미지 분석은 일반적인 방법을 사용하여 가능하다.
소정 샘플링 시간 간격으로 촬상 및 산정을 하고, 소정 개수의 오가노이드가 소정 영역 내에 들어오면 그만큼의 부피를 분주한다. 예를 들어, 팁 30개의 오가노이드가 팁의 5ul 영역 내에서 카운팅되면 5ul 를 분주한다. 분주 과정은 아래에서 상술한다.
5. 소정 부피의 혼합액을 플레이트 상에 분주하는 분주 단계(도 15)
세포 측정 단계에서 미리 정한 세포 개수가 카운팅되면 파이펫 장치는 플레이트 상에 이동하여 플레이트 웰에 소정 부피의 세포 혼합액을 분주한다. 이때, 소정 부피는 4-3 단계에서 카운팅의 기준으로 정한 상기 팁의 높이에 상응한다. 구체적으로 카운팅의 기준으로 정한 상기 팁의 높이에 대응하는 혼합액의 부피일 수 있으나, 이보다 일정량 더 작은 부피일 수도 있다. 즉, 미리 설정된 개수의 오가노이드가 측정되면 플레이트에 예를 들어 5-50ul 의 혼합액을 분주한다. 플레이트의 복수의 웰에 흡입, 측정, 분주 과정을 되풀이하여 웰들에 균일하게 혼합액을 분주한다.
6. 분주 세포 검사 단계(도 15, 16)
플레이트에 분주된 오가노이드 혼합액 균일하게 잘 분주 되었는지 검사하기 위해 플레이트 비전모듈(Plate vision module)로 각 웰에 형성된 돔을 검사한다.
플레이트가 플레이트 안착부(350)에 안착된 상태에서 파이펫 장치에 의한 시료 분주가 이루어진 경우, 2차원 이송부(320)의 슬라이드 이송에 의해 조명(260) 하부에 플레이트가 위치하도록 한 후 플레이트 비전모듈(200)에 의해 개별 돔 별로 순차 검사를 진행한다. 2차원 이송부(320)는 조명(260)의 하부에 분주된 세포 혼합액 돔이 각기 순차 위치하도록 플레이트 안착부를 이동시켜가면서 조명(260) 광이 플레이트 및 돔을 투과하여 하부의 제2광학계에 전달되게 한다.
도 16은 제2카메라(210)에 의해 촬상된 플레이트 상에 분주된 돔 이미지의 일예이다.
2차원 이송부(320)에 의해 안착부(350)에 안착된 플레이트를 수평 이동시켜 순차로 플레이트 비전모듈의 카메라로 플레이트 상의 개별 돔을 촬상하고 돔 이미지 분석을 실행한다. 이때 돔(dome)은 두께를 가지므로 개별 돔에 포함된 정확한 세포 수를 확인하기 위해, 하나의 돔 내의 레이어 별로 제2렌즈부 이송부(240)에 의해 제2렌즈부(220)를 자동으로 미세 이동하여 오토 포커싱을 하면서 레이어 별로 촬상 및 이미지 분석을 실행할 수 있다. 정보처리장치에 의한 이미지 분석을 통해 개별 돔별로 레이어별 세포(오가노이드) 수를 합하여 돔 내의 총 세포수가 산정된다.
설정된 소정의 세포수 이상 또는 이하의 세포수가 감지되는 돔(웰) 정보를 제어모듈 또는 정보처리장치에서 확인할 수 있도록 한다.
7. 플레이트 커버링 단계
플레이트의 뚜껑을 그리퍼로 집어 다시 플레이트에 뚜껑을 닫아 오염을 방지한다.
8. 히팅 단계(도 17)
그리퍼로 플레이트를 들어 히터(400) 상에 이송하여 안착시키고 37도에서 15분간 히팅 시켜 분주 된 용액을 굳힌다. 히터는 전열방식이 바람직하다.
9. 배지 공급 단계(도 18)
그리퍼로 플레이트를 히터(400)로부터 플레이트 랙에 이송한 후, 플레이트의 뚜껑을 열어 뚜껑을 랙에 이동 시키고, 8채널 파이펫을 이용하여 배지를 만들어진 돔 위에 200ul 분주한다.
10. 플레이트의 뚜껑을 그리퍼로 집어 다시 플레이트에 뚜껑을 닫아준다.
상기 장치 및 방법에 의해, 파이펫 장치의 이동을 최소하하면서 효과적이고 정밀도가 향상된 균일한 세포 분주 및 인큐베이팅이 단시간 내에 자동으로 이루어질 수 있다.
[비교예]
비교예로서 종래의 희석 기반의 수동 분주과정을 설명한다.
1. 4℃ 온도에서 세포(오가노이드)와 Matrigel 혼합액이 담긴 시료 용기를 준비한다.
세포와 Matrigel 혼합액은 상온에서 굳기 시작하므로 혼합액이 담긴 시료 용기(vial tube)를 냉각된 블록에 넣거나, 얼음에 튜브를 꽂은 상태로 준비한다.
2. 세포와 Matrigel 혼합액 5~10ul을 파이펫 팁에 흡입하여 플레이트에 분주하여 돔(dome)을 형성한다. 이 때 분주는 희석기반 분주로서 세포 개수를 카운팅하지 않고 동일 혼합액 속에는 동일 개수의 세포가 포함되어 있다고 가정하여 분주하므로 플레이트에 형성된 돔 내에 포함된 세포 개수는 돔마다 균일하지 않다.
3. 37℃로 10분간 혼합액 돔을 인큐베이팅한다.
4. 배지(media)를 200ul 돔에 더한다.
10: 케이스
20, 21: 데크
100: 팁 비전모듈
150: 지지대
200: 플레이트 비전모듈
600: 쿨러블록
630: 열전달부
690: 안착부
20, 21: 데크
100: 팁 비전모듈
150: 지지대
200: 플레이트 비전모듈
600: 쿨러블록
630: 열전달부
690: 안착부
Claims (15)
- 세포 혼합액을 균일하게 자동 분주하기 위한 자동 세포 분주 장치로서,
액츄에이터에 의해 3축 이동 가능하고, 파이펫 팁을 프로브에 결합하여 세포 혼합액을 흡입하고 분주하기 위한 파이펫 장치; 및
파이펫 장치에 의해 시료 용기로부터 세포 혼합액이 흡입된 파이펫 팁을 카운팅 위치에서 촬상하는 팁 비전모듈;를 포함하고,
파이펫 팁에 흡입된 세포 혼합액의 촬상 이미지에 기초하여 세포 개수가 산정되는 것을 특징으로 하는 자동 세포 분주 장치.
- 제1항에 있어서,
상기 팁 비전모듈은 촬상모듈과 조명모듈을 포함하고,
촬상모듈은 하나 이상의 렌즈를 포함하는 제1광학계와 제1카메라를 포함하고,
조명모듈는 환형의 제1조명부를 포함하며,
상기 제1조명부의 환 중심 상단의 카운팅 위치를 상기 제1카메라가 촬상하도록 상기 제1광학계 및 제1카메라가 배치되고,
상기 제1조명부의 환 중심축의 동축 하부에 위치하도록 시료 용기가 안착되고,
상기 파이펫 장치는 시료 용기로부터 세포 혼합액을 파이펫 팁에 흡입한 상태로 수직 상승하여 상기 카운팅 위치로 이동하는 것을 특징으로 하는 자동 세포 분주 장치. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 카운팅 위치의 하부에는 시료 용기가 안착되는 쿨링모듈이 배치되고,
쿨링모듈은 열전소자, 상기 열전소자의 하부에 밀착 결합되는 히트싱크, 하나 이상의 팬, 상기 열전소자의 상부에 배치되는 홀더 및 쿨러케이스를 포함하고,
시료 용기가 상부로터 삽입 안착되도록 홀더의 상단은 개방되고, 홀더의 하단은 상기 열전소자의 상단에 직접 또는 열전달부를 통해 밀착 결합되고,
쿨러케이스는 상기 열전소자, 히트싱크 및 하나의 이상의 팬을 내부에 수용하는 것을 특징으로 하는 자동 세포 분주 장치. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 카운팅 위치의 하부에는 시료 용기가 안착되는 쿨링모듈이 배치되고,
상기 파이펫 장치에 의해 시료 용기로부터 파이펫 팁에 소정량의 시료가 흡입된 후 상부로 이동하여 상기 카운팅 위치에 위치하면 팁 비전모듈에 의해 파이펫 팁의 하부 소정 영역이 측면에서 촬상되고,
촬상된 이미지를 분석하여 파이펫 팁의 소정 영역 내 세포 개수를 산정하기 위한 정보처리장치를 더 포함하고,
산정된 세포 개수가 소정 개수에 도달하기까지 1회 이상 촬상 및 촬상된 이미지 분석을 통한 세포 개수의 산정을 반복하고,
산정된 세포 개수가 소정 개수에 도달하면 파이펫 장치가 플레이트 상에 소정량의 세포 혼합액을 분주하고,
상기 정보처리장치는 프로세서, 메모리 및 통신모듈을 포함하고,
상기 정보처리장치는 상기 자동 세포 분주 장치의 일부이거나 또는 별도의 외부 장치인 것을 특징으로 하는 자동 세포 분주 장치.
- 제1항에 있어서,
플레이트 비전모듈을 추가로 더 포함하고,
상기 플레이트 비전모듈은 제2조명부, 제2조명부와 대향 배치되는 제2광학계, 제2카메라, 상기 제2조명부와 제2광학계 사이에 배치되고 2차원 이동이 가능한 플레이트 스테이지를 포함하고,
상기 제2카메라는 플레이트 스테이지에 안착되는 투명한 플레이트 상의 세포 혼합액을 제2광학계를 통해 취득하여 촬상하고,
상기 제2카메라에 의해 촬상된 플레이트 상의 세포 혼합액 이미지에 기초하여 플레이트 상에 분주된 세포 혼합액에 포함된 세포 개수가 산정되는 것을 특징으로 하는 자동 세포 분주 장치.
- 제5항에 있어서,
제2광학계를 수직 방향으로 미세 이동시켜 오토포커싱 위치를 조절하기 위한 z축 방향 이송부를 더 포함하고,
플레이트 상에 분주된 세포 혼합액 돔을 z축 방향으로 복수의 레이어 별로 오토포커싱 하여 레이어 별로 촬상 및 이미지 분석을 실행하는 자동 세포 분주 장치.
- 제1항의 자동 세포 분주 장치에 의해 실행되는 자동 세포 분주 방법으로서,
파이펫 장치가 시료 용기의 상부로 이동한 후 하강하여 파이펫 팁에 세포 혼합액을 취하는 단계;
카운팅 위치에 파이펫 팁을 위치한 상태로 팁 비전모듈이 파이펫 팁의 소정 영역을 1회 이상 촬상하여 파이펫 팁 내 세포 개수를 카운팅하는 세포 측정 단계; 및
소정 부피의 혼합액을 플레이트 상에 분주하는 분주 단계;를 포함하는 자동 세포 분주 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 세포 측정 단계는,
세포 혼합액이 흡인된 파이펫 팁을 카운팅 위치로 이송하는 단계;
카운팅 위치에 파이펫 팁을 정지한 상태로 카메라로 촬상하는 촬상 단계; 및
촬상된 이미지를 분석하여 파이펫 팁 내의 소정 영역 내의 세포 수를 산정하는 단계;를 포함하고,
상기 촬상 및 산정하는 단계를 반복하되, 세포 수가 소정 개수에 도달하면 상기 분주 단계를 실행하는 것을 특징으로 하는 자동 세포 분주 방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서,
상기 자동 세포 분주 장치는 플레이트 스테이지에 안착된 상기 플레이트를 검사하기 위한 플레이트 비전모듈을 더 포함하고,
플레이트 비전모듈이 상기 플레이트에 분주된 세포 혼합액을 촬상하여 분주된 세포의 개수를 검사하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 자동 세포 분주 방법.
- 자동 액체 핸들링 장치로서,
하부에 배치되고, 하나 이상의 랙이 안착되기 위한 데크;
상기 데크의 상부에 배치되어 액츄에이터에 의해 3차원 이동 가능하고, 파이펫 팁을 프로브에 결합하여 시료를 흡입하고 분주하기 위한 파이펫 장치;
데크에 장착되어 시료 용기로부터 흡입된 세포 혼합액을 보유하는 파이펫 팁을 카운팅 위치에서 촬상하는 팁 비전모듈;
세포 또는 세포 집합체를 포함하는 세포 혼합액을 수용하는 시료 용기를 보유하여 세포 혼합액을 쿨링 유지하기 위한 쿨링모듈; 및
세포 혼합액이 흡입된 파이펫 팁의 촬상 이미지에 기초하여 세포 개수를 산정하고 파이펫 장치를 미리 프로그램된 방법에 따라 작동하도록 제어하는 제어모듈;을 포함하는 것을 특징으로 하는 자동 액체 핸들링 장치.
- 제10항에 있어서,
플레이트 스테이지에 안착된 플레이트를 검사하기 위한 플레이트 비전모듈을 더 포함하고,
상기 플레이트 비전모듈은 제2조명부, 제2조명부와 대향 배치되는 제2광학계, 제2카메라, 상기 제2조명부와 제2광학계 사이에 배치되고 수평(xy) 방향 2차원 이동이 가능한 플레이트 스테이지를 포함하고,
제2조명부로부터 플레이트 스테이지에 안착되는 투명한 상기 플레이트 상의 세포 혼합액을 투과하여 제2광학계를 통해 취득되는 이미지를 상기 제2카메라는 촬상하고,
상기 제2카메라에 의해 촬상된 플레이트 상의 세포 혼합액 이미지에 기초하여 플레이트 상에 분주된 세포 혼합액에 포함된 세포 개수가 산정되며,
상기 쿨링모듈의 시료 용기가 삽입 안착되기 위한 홀더의 중심축은 상기 카운팅 위치와 동축이되, 상기 카운팅 위치의 하부에 위치하는 것을 특징으로 하는 자동 액체 핸들링 장치.
- 제11항에 있어서
제2광학계를 수직 방향으로 미세 이동시켜 오토포커싱 위치를 조절하기 위한 z축 방향 이송부를 더 포함하고,
플레이트 상에 분주된 세포 혼합액 돔을 z축 방향으로 복수의 레이어 별로 오토포커싱 하여 레이어 별로 촬상 및 이미지 분석을 실행하는 것을 특징으로 하는 자동 액체 핸들링 장치.
- 제10항 또는 제11항에 있어서,
상기 데크의 상부에 배치되어 3차원 이동 가능한 그리퍼; 및
상기 데크 상의 일 영역에 안착되는 히터;를 더 포함하고,
상기 그리퍼는 히터 상에 플레이트를 이송하여 안착시키고, 상기 히터는 소정 온도로 플레이트를 히팅시켜 분주된 세포 혼합액을 굳히는 것을 특징으로 하는 자동 액체 핸들링 장치.
- 데크;
액츄에이터에 의해 3축 이동 가능하고, 투명 파이펫 팁을 프로브에 결합하여 시료를 흡입 및 분주하기 위한 파이펫 장치; 및
파이펫 팁을 카운팅 위치에서 촬상하는 팁 비전모듈;를 포함하고,
파이펫 장치에 의해 시료 용기로부터 세포 혼합액이 파이펫 팁에 취해진 후 상기 카운팅 위치로 상승하여 정지된 상태로 상기 팁 비전모듈에 의해 세포 혼합액이 취해진 파이펫 팁이 촬상되고, 촬상 이미지에 기초하여 파이펫 팁 하부의 소정 영역 내의 세포 개수가 산정되고,
상기 산정되는 세포 개수가 소정 개수에 도달하면 파이펫 장치가 이동하여 플레이트에 소정량의 세포 혼합액을 분주하는 것을 특징으로 하는 자동 세포 분주 장치.
- 제14항에 있어서,
상기 데크는 하나 이상의 구성요소가 탈착가능하게 안착되고 이동가능한 이동데크부와 고정데크부를 포함하고,
상기 이동데크부의 일 구역에 피팅 안착되기 위한 쿨링모듈을 더 포함하고,
상기 쿨링모듈은 열전소자를 포함하는 쿨러블록과 상기 쿨러블록의 상부에 안착되고 상기 시료 용기를 상부로부터 삽입 안착하기 위한 쿨링블록을 포함하고,
파이펫 장치에 의해 시료 용기로부터 세포 혼합액이 파이펫 팁에 취해진 후 상기 카운팅 위치로 상승하여 정지된 상태로 세포 개수가 소정 개수에 도달할 때까지 촬상 및 산정이 반복되는 것을 특징으로 하는 자동 세포 분주 장치.
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