KR20240020363A - 하이브리드 프로모터 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 일실시예는 SV40 프로모터 염기서열 및 hPGK 프로모터 염기서열을 포함하는 하이브리드 프로모터를 제공한다. 상기 하이브리드 프로모터는 기존의 단일 프로모터의 단백질 발현량보다 더욱 높은 단백질 발현량을 보여줬다. 항체 의약품 생산에 있어 vector의 유전자 수용력은 중요하기 때문에 본 발명의 일실시예에 따른 하이브리드 프로모터는 기존의 단일 프로모터를 사용하였을 때보다 단백질 생산성이 증가하여 바이오 의약품 생산에 적용하면 큰 효과가 있을 것이다.
Description
본 발명은 하이브리드 프로모터에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 SV40 프로모터 염기서열 및 hPGK 프로모터 염기서열을 포함하는 하이브리드 프로모터에 관한 것이다.
숙주 세포에서 원하는 유전자를 발현시키기 위해서는 세포 내로 구조 유전자를 수송하여 이를 발현시키는 발현벡터 및 유전자를 전달하는 기술이 수반되어야 한다. 이 때, 사용되는 발현벡터는 삽입된 유전자를 구성하는 DNA를 발현시킬 수 있는 벡터로서, 일반적으로 숙주 내에서 유전자를 발현시킬 수 있는 프로모터 서열 등의 발현조절서열을 포함한다. 숙주 세포의 종류, 발현 시기, 발현량 등은 발현벡터를 선택함에 있어서 주요한 근거가 되며, 목적에 따라 이러한 점들을 충족시키기 위해 다양한 발현벡터가 개발되고 있다.
프로모터(promoter)는 구조유전자(gene)의 상부 쪽에 연결되어 있는 유전체(genome) 부위로서, 이에 연결된 구조유전자가 mRNA로 전사(transcription) 되도록 조절하는 역할을 한다. 프로모터에는 여러 일반전사인자(general transcription factor)들이 결합함으로써 활성화(activation)되는데, 보편적으로 유전자 발현을 조절하는 TATA box, CAT box 등의 염기서열을 가지고 있다.
목적 유전자를 단백질로 발현되도록 그 발현 수준을 결정하는 프로모터는 목적 단백질을 총 세포 단백질의 10~30%정도 이상으로 발현할 수 있을만큼 강력해야 하고, 발현이 유도되지 않은 상태에서는 최소한으로 억제되어야 하며 간편하고 경제적인 방법으로 유도될 수 있어야 한다. 현재 많이 사용되는 프로모터들, 예를 들어, lac, phoA, araBAD, nar, tac, T7들과 다양하게 융합(hybrid)된 프로모터들이 개발되어 왔다. T7프로모터를 이용한 발현 시스템은 대부분 목적 단백질을 총 단백질량의 40~50%수준으로 발현하며 Bacillus 유래의 cyclotdextrin glucanotransferase, phytic acid를 가수분해하는 phytase, human growth hormone 등 다양한 외부 단백질 생산연구에 이용되었다.
하지만, 융합 프로모터 시스템을 구축하기 위한 단일 프로모터의 선택은 헤아릴 수 없이 많은 조합을 가질 수 있기에 이에 대한 연구가 여전히 진행중이다. 또한 융합 프로모터를 위한 단일 프로모터 자체의 분석에 대한 연구가 많이 진행되지 않았다. 따라서, 높은 발현수준을 보여주는 융합 프로모터 시스템에 대한 연구가 필요한 상황이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 높은 발현수준을 보여주는 하이브리드 프로모터를 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일실시예는 SV40 프로모터 염기서열 및 hPGK 프로모터 염기서열을 포함하는 하이브리드 프로모터를 제공한다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 SV40프로모터 염기서열은 서열번호 1로 표시될 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 hPGK 프로모터 염기서열은 서열번호 2로 표시될 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 SV40 프로모터 염기서열은 hPGK 프로모터 염기서열의 3'방향에 위치할 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 SV40 프로모터 염기서열은 hPGK 프로모터 염기서열의 5'방향에 위치할 수 있다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 실시예는 본 발명에 따른 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 실시예는 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 제공한다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 실시예는 상기 재조합 벡터로 숙주 세포를 형질 전환시키는 단계를 포함하는 단백질 발현 방법을 제공한다.
본 발명의 실시예에 따른 하이브리드 프로모터는 종래의 프로모터보다 단백질 발현을 높일 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 루시퍼라제 유전자 앞에 각각, 프로모터가 없는 대조군(A), CMV 프로모터(B), RSV 프로모터(C), SV40 프로모터(D), Ubb 프로모터(E) 및 hPGK 프로모터가 삽입된 벡터들을 나타낸 그림이다.
도 2는 Chinese hamster ovary(CHO)에 각각의 단일 프로모터를 도입하여 transient 및 stable level을 보여주는 그림이다. 결과값을 보면, transient level에서는 hPGK 프로모터가, stable level에서는 SV40 프로모터가 단백질 발현양이 가장 높게 나온 것을 확인하였다.
도 3은 루시퍼라제 유전자 앞에 각각, 프로모터가 없는 대조군(A), SV40 프로모터(B), hPGK 프로모터(C), SV40 프로모터 및 hPGK 프로모터(D), hPGK프로모터 및 SV40 프로모터(E)가 삽입된 벡터들을 나타낸 그림이다.
도 4는 Chinese hamster ovary(CHO)에 SV40 프로모터와 hPGK 프로모터로 구축한 하이브리드 프로모터를 도입하여 transient level을 보여주는 그림이다.
도 5는 Chinese hamster ovary(CHO)에 SV40 프로모터와 hPGK 프로모터로 구축한 하이브리드 프로모터를 도입하여 stable level(A 내지 C) 및 안정성(D)을 보여주는 그림이다.
도 2는 Chinese hamster ovary(CHO)에 각각의 단일 프로모터를 도입하여 transient 및 stable level을 보여주는 그림이다. 결과값을 보면, transient level에서는 hPGK 프로모터가, stable level에서는 SV40 프로모터가 단백질 발현양이 가장 높게 나온 것을 확인하였다.
도 3은 루시퍼라제 유전자 앞에 각각, 프로모터가 없는 대조군(A), SV40 프로모터(B), hPGK 프로모터(C), SV40 프로모터 및 hPGK 프로모터(D), hPGK프로모터 및 SV40 프로모터(E)가 삽입된 벡터들을 나타낸 그림이다.
도 4는 Chinese hamster ovary(CHO)에 SV40 프로모터와 hPGK 프로모터로 구축한 하이브리드 프로모터를 도입하여 transient level을 보여주는 그림이다.
도 5는 Chinese hamster ovary(CHO)에 SV40 프로모터와 hPGK 프로모터로 구축한 하이브리드 프로모터를 도입하여 stable level(A 내지 C) 및 안정성(D)을 보여주는 그림이다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결(접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우 뿐만 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 일측면에 따른 하이브리드 프로모터는 SV40 프로모터 염기서열 및 hPGK(human phosphoglycerate kinase) 프로모터 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 SV40 프로모터 염기서열은 서열번호 1로 표시될 수 있고, 상기 hPGK 프로모터 염기서열은 서열번호 2로 표시될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 SV40 프로모터 염기서열은 hPGK 프로모터 염기서열의 3'방향에 위치하거나 5'방향에 위치할 수 있다. 바람직하게, 상기 SV40프로모터 염기서열은 hPGK 프로모터 염기서열의 3'방향에 위치할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 SV40 프로모터 염기서열이 hPGK 프로모터 염기서열의 3'방향에 위치하는 경우의 서열은 서열번호 3일 수 있고, SV40 프로모터 염기서열이 hPGK 프로모터 염기서열의 5'방향에 위치하는 경우의 서열은 서열번호 4일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 하이브리드 프로모터는 SV40 프로모터 염기서열 및 hPGK 프로모터 염기서열을 포함하도록 표시되는 것을 특징으로 하며, 상기 SV40 프로모터 염기서열 및 hPGK 프로모터 염기서열 뿐만 아니라 상기 SV40 프로모터 염기서열 및 hPGK 프로모터 염기서열의 일부 염기가 치환, 결실 또는 부가된 변형서열로서 간 또는 간 유래 세포에 특이적으로 프로모터 활성을 나타내는 염기서열을 포함한다.
또한 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다. 본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열 및 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 서열번호 1 및 서열번호 2의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열 및 이를 구성하는 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다.
상기 하이브리드 프로모터는, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 포함할 수 있으나 상기 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열, 바람직하게는 90% 이상의 상동성, 더 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 보다 더 바람직하게는 98% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열로서, 실질적으로 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 염기를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열을 갖는 프로모터도 본 발명의 범위에 포함됨은 자명하다.
본 발명에 있어 "상동성"이란 야생형(wild type) 염기서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 일실시예에 따른 염기서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.
본 발명에 다른 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명의 일실시예에 따른 하이브리드 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공할 수 있다. 상기 재조합 벡터의 염기서열은 서열번호 5 또는 서열번호 6일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 함유하는 유전자 적재물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일실시예에 따른 재조합 발현 벡터는 본 발명의 일실시예에 따른 하이브리드 프로모터 및 상기 하이브리드 프로모터와 작동가능하게 연결(operably linked)되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 유전자 염기 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는, 이 기술 분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다.
상기 본 발명의 일실시예에 따른 재조합 발현 벡터로는 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 본 발명의 프로모터를 삽입하고 상기 프로모터의 하류(downstream)쪽으로 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 삽입함으로써 제조할 수 있다. 따라서 본 발명에 사용될 수 있는 벡터로는 다양한 클로닝 부위를 가지고 있는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸러스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 및 Ti 플라스미드 등의 플라스미드일 수 있고, 식물 바이러스 벡터일 수 있으며, pCHF3, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리 벡터를 사용할 수도 있다. 그러나 이 기술 분야의 통상의 기술자라면 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 숙주 세포 내로 도입할 수 있는 벡터라면 어떠한 벡터라도 모두 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 일실시예에 따른 재조합 발현 벡터는 목적 유전자에 작동가능하게 연결된 조절 핵산서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 조절 핵산서열은 그것에 작동가능하게 연결된 유전자의 전사/번역에 영향을 줄 수 있는, 전사 개시 부위의 상류 또는 하류에 존재하는 임의의 핵산서열을 말한다. 예컨대 인핸서, 전사를 조절하기 위한 오퍼레이터 서열, 폴리아데닐화 시그널, 리보솜 결합 부위, 복제 개시점, 전사 종결 서열 등을 의미할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 재조합 발현 벡터는 형질전환된 숙주 유기체의 선별을 가능 또는 용이하게 하기 위하여 선택마커 유전자를 하나 이상 포함하거나, 발현시키고자 하는 목적 유전자의 발현 여부를 정성적·정량적으로 분석하기 위하여 리포터 유전자를 하나 이상 포함할 수 있다. 이러한 선택 마커 유전자나 리포터 유전자는 당업계에 공지된 것을 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일실시예에 따른 재조합 벡터는 암피실린(ampicilin), 테트라사이클린(tetracyclin), [0049] 카나마이신(kanamycin), 클로람페니콜(chloroamphenicol), 스트렙토마이신 (streptomycin) 및 네오마이신(neomycin)으로 이루어진 군에 서 선택되는 하나 이상의 항생제 저항성 유전자를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "항생제 저항성 유전자"는 항생제에 대하여 저항성을 가지는 유전자로서, 이것을 가지고 있는 세포는 해당 항생제를 처리한 환경에서도 생존하므로, 대장균에서 대량으로 플라스미드를 얻는 과정에 선별 마커로서 유용하게 사용된다. 본 발명에서 항생제 저항성 유전자는 본 발명의 핵심적 기술인 벡터의 최적의 조합에 따른 발현 효율에 크게 영향을 미치는 요소가 아니므로, 선별 마커로서 일반적으로 사용되는 항생제 저항성 유전자를 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명의 일실시예에 따른 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 제공할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "형질 전환"은 DNA의 세포내로의 도입을 말한다. 도입된 DNA는 일반적으로 DNA가 삽입된 조각을 함유하는 벡터의 형태이다. 도입된 DNA 서열은 숙주 세포와 동일한 종, 또는 숙주 세포와는 상이한 종으로부터 기원할 수 있거나, 또는 이는 숙주 종으로부터 기원한 일부 DNA 및 일부 외부 DNA를 함유하는 하이브리드 DNA 서열일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 하이브리드 프로모터 또는 상기 하이브리드 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 유전자의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터는 당분야에 공지된 방법을 이용하여 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따른 재조합 벡터를 숙주세포내로 도입하는 방법으로는, 이에 한정되지는 않으나, 염화칼슘(CaCl2) 및 열 쇼크(heat shock) 방법, 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(polyethylenglycol)에 의한 침전법 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명의 일실시예에 따른 재조합 벡터로 숙주 세로를 형질 전환시키는 단계를 포함하는 단백질 발현 방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 일실시예에 따른 형질 전환된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 상기 배양된 숙주 세포 또는 숙주세포 배양 배지로부터 발현된 목적 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 목적 단백질 제조방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "배양"은 세포를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 상기 세포는 통상의 배지에서 생육 가능하다. 배지는 특정 세포를 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 세포가 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다.
이하 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
실시예1. 플라스미드 디자인 및 구축
재조합 플라스미드를 구축하기 위해서 인퓨젼 클로닝 기술이 사용되었다. 포로모터가 없는 백본(backbone) 벡터는 pcDNA3 벡터 (V22020; Invitrogen) 에서 루시퍼라제 유전자로부터 CMV 프로모터를 제거함으로써 구축되었다(도 1A). 단일 프로모터로 구성된 벡터가 구축되었고, 5가지 종류의 프로모터, CMV, hPGK, RSV, Ubb, 및 SV40가 루시퍼라제 유전자 앞에 위치하였다(도 1B 내지 1F). hPGK 프로모터 및 SV40 프로모터로 구성된 하이브리드 프로모터가 루시퍼라제 유전자에 인접하여 구축되었다. SKYI는 SV40 프로모터를 포함하는 벡터에서 hPGK 프로모터를 SV40 프로모터 뒤에 삽입함으로써 구축되었다(도 3D). SKYII는 hPGK 프로모터를 SV 프로모터 앞에 삽입함으로써 구축되었다(도 3E).
실시예2. 세포 배양
CHO DG44 세포들은 종래기술대로 배양되었다. 회분 배양을 위해서, 세포들은 30 mL 용양으로 125 mL Erlenmeyer 플라스크(CLS431143 ; Corning, NY, USA)에서 배양되었고, 150 rpm 교반하에서 인큐베이션되었으며, 3일마다 계대배양되었다. 세포 밀도 및 생존능(viability)는 Cedex HiRes Analyzer (05650216001; Roche, Basel, Switzerland)에서 측정되었다. 본 발명에서, 유전자 증폭을 위한 DHFR/MTX 시스템이 사용되지 않았기 때문에, CHO DG44 세포들은 무혈청 조건에서 적응되지 않았다.
실시예3. 형질 감염 및 세포주 구축
CHO DG44 세포들은 Lipofector-EZ Reagent (AB-LF0EZ150; APTABIO, Suwon, Korea)를 사용해서 제조사의 지시서에 따라 형질 감염되었다. 세포들은 대조군으로서 프로모터가 없는 2 μg의 백본 벡터를 사용해서 형질 감염되었다. 단일 프로모터를 가진 각각 2 μg의 5개 벡터들은 형질 감염되었다. 형질 감염된 세포들은 2주동안 500 μg/mL G418 (ant-gn-1; Invitrogen)을 사용해서 선택되었다. 선택 과정동안, 배지는 2일마다 교체되었다. 선택 후, 단일 세포들은 96-웰 플레이트 (353072; Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA)에 150 μL 배지에서 각 웰에 씨딩(seeding)되었고, 15일동안 인큐베이션되었다.
실시예4. 루시퍼라제 활성 측정
루시퍼라제 활성은 Luciferase Assay System (E1500; Promega, Madison, Wisconsin, USA)를 사용해서 검사되었다. transient levels을 측정할 때, 1 × 106 개의 세포들은 2분동안 200 ×g로 원심분리되었고 PBS (10010023; Thermo Fisher Scientific)로 2번 세척되었다. 그리고 나서, 3번 반복을 위해, 200 μL의 용해된 샘플은 3개의 60 μL짜리 흰 96-웰 플레이트(30396; SPL, Pocheon-si, Gyeonggi-do) 로 나눴고, 각 웰에 옮긴 다음 60 μL의 루시퍼라제 검사 시약II가 각 웰에 추가되었다. stable levels을 측정할 때, 1 × 106 개의 세포들은 2분동안 200 ×g로 원심분리되었고 PBS (10010023; Thermo Fisher Scientific)로 2번 세척되었다. 세포들은 100 μL의 1× 세포 배양 용해 시약(cell culture lysis reagent) 및 100 μL의 PBS (10010023; Thermo Fisher Scientific)에서 잘 섞어주었다. 그리고 나서, 용해된 샘플은 흰 96-웰 플레이트(30396; SPL, Pocheon-si, Gyeonggi-do)의 웰에 옮겨졌고, 100 μL의 루시퍼라제 검사 시약II가 각 웰에 추가되었다. 루시퍼라제 활성은 VICTOR multi-label plate reader (2030-0050; PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 사용해서 발광 세기(luminescence intensity)를 측정함으로써 조사되었다.
실시예5. cDNA 구축
총 RNA는 RNase Mini Kit (74104; QIAGEN, Hilden, Germany)를 사용해서 제조사의 지시서에 따라 2 × 106 세포들에서 분리되었다. 총 RNA는 Phusion RT-PCR Kit (F-546S; Thermo Fisher Scientific)를 사용해서 제조사의 지시서에 따라 역전사되었다. cDNA의 순도 및 농도는 DS-11 Spectrophotometer (DS-11; DeNovix, Wilmington, DE, USA)를 사용해서 결정되었다.
실시예6. qPCR(Quantitative polymerase chain reaction)
qPCR이 종래기술과 같이 수행되었다. qPCR은 4분동안 95 °C, 그 다음 30초동안 94 °C, 30초동안 57 °C, 및 10초동안 70 °C에서 40 사이클로 denaturation해서 수행되었다. qPCR은 다음 프라이머 5'-GCACCACCAACTGCTTAGC-3' (GAPDH-forward)(서열번호 7), 5'- AGTCTTCTGGGTGGCAGTGA-3' (GAPDH-reverse) (서열번호 8), 5'-AAGAGATACGCCCTGG-3' (루시퍼라제-forward) (서열번호 9), 5'-AATAACGCGCCCAACA-3' (루시퍼라제-reverse) (서열번호 10)를 사용해서 수행되었다.
실시예7. Western Blot 분석
웨스턴 블랏은 종래기술과 같이 수행되었다. 단백질들은 Chemidoc XRS+ system (1708265; BIO-RAD; Hercules, CA, USA)을 사용하는 SuperSignal™West Pico chemiluminescence solution (34577; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)으로 탐지되었다. 본 발명에서 사용된 1차 항체는 HRP-conjugated 항 루시퍼라제 항체 (sc74548; 1:1000 dilution; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), 및 HRP-conjugated β(sc47778; 1:1000 dilution; Santa Cruz Biotechnology)을 포함했다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (8)
- SV40 프로모터 염기서열 및 hPGK 프로모터 염기서열을 포함하는 하이브리드 프로모터.
- 제1항에 있어서,
상기 SV40프로모터 염기서열은 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 하이브리드 프로모터.
- 제1항에 있어서,
상기 hPGK 프로모터 염기서열은 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 하이브리드 프로모터.
- 제1항에 있어서,
상기 SV40 프로모터 염기서열은 hPGK 프로모터 염기서열의 3'방향에 위치하는 것을 특징으로 하는 하이브리드 프로모터.
- 제1항에 있어서,
상기 SV40 프로모터 염기서열은 hPGK 프로모터 염기서열의 5'방향에 위치하는 것을 특징으로 하는 하이브리드 프로모터.
- 제1항에 따른 프로모터를 포함하는 재조합 벡터.
- 제6항에 따른 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
- 제6항에 따른 재조합 벡터로 숙주 세포를 형질 전환시키는 것을 포함하는 단백질 발현 방법.
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