KR20240009827A - The method for one-stop system isolating and culturing cancer organoid, stromal and immune cell from cancer tissue - Google Patents
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Abstract
동일 암 조직으로부터 암 오가노이드 및 암미세환경인자 중 섬유모세포와 면역세포를 한 번에 분리 및 배양하는 방법에 관한 것으로, 일 양상에 따른 분리 및 배양하는 방법에 의하면, 암세포, 섬유모세포, 및 면역세포 간의 상호작용을 유지하면서 암조직으로부터 암 오가노이드, 섬유모세포, 및 면역세포를 동시에 분리하여 배양할 수 있는 효과가 있다. 또한, 기존의 암 미세환경 속의 암세포를 정확하게 연구할 수 없는 한계를 극복할 수 있는 효과가 있으며, 이를 통해 분리 및 배양된 암 오가노이드는 암조직의 기능과 특성을 보다 효과적으로 재현할 수 있다. 면역세포 역시 암세포와의 상호작용을 통해 활성화된 상태로 분리되어 암 세포와의 면역 기작에 대한 연구에 활용될 수 있는 효과가 있다.It relates to a method of isolating and culturing fibroblasts and immune cells among cancer organoids and cancer microenvironment factors at the same time from the same cancer tissue. According to the method of separating and culturing cancer cells, fibroblasts, and immune cells, It has the effect of simultaneously separating and culturing cancer organoids, fibroblasts, and immune cells from cancer tissue while maintaining interactions between cells. In addition, it has the effect of overcoming the limitation of accurately studying cancer cells in the existing cancer microenvironment, and through this, isolated and cultured cancer organoids can more effectively reproduce the functions and characteristics of cancer tissue. Immune cells are also separated into an activated state through interaction with cancer cells and can be used for research on immune mechanisms with cancer cells.
Description
동일 암 조직으로부터 암 오가노이드 및 암미세환경인자 중 섬유모세포와 면역세포를 한 번에 분리 및 배양하는 방법에 관한 것이다.This relates to a method of isolating and culturing fibroblasts and immune cells among cancer organoids and cancer microenvironment factors from the same cancer tissue at the same time.
암 세포는 다양한 종류의 정상세포와 세포외 기질 및 혈관으로 구성된 암 미세환경(tumor microenvironment, TME)에서 다른 인자들과 함께 상호작용하며 성장한다. 이러한 암 미세환경은 혈관 내피세포(endothelial cells), 섬유모세포(stromal fibroblasts), 면역세포, 세포외기질 등으로 구성되어 있으며, 이러한 미세환경에서 암세포는 성장하고 진화(evolution) 하여 이질성을 유지한다(Curr Biol. 2020 Aug 17;30(16):R921-R925). Cancer cells grow by interacting with other factors in the tumor microenvironment (TME), which is composed of various types of normal cells, extracellular matrix, and blood vessels. This cancer microenvironment is composed of vascular endothelial cells, fibroblasts, immune cells, and extracellular matrix, and in this microenvironment, cancer cells grow, evolve, and maintain heterogeneity ( Curr Biol. 2020 Aug 17;30(16):R921-R925).
또한, 암 치료 연구에 있어서, 이러한 암 미세환경과 암 세포의 상호작용에 대한 이해 및 연구가 필수적이며, 면역세포 및 섬유모세포는 암세포에 대한 종양면역과 세포성장 조절에 중요한 역할을 하고 있다. In addition, in cancer treatment research, understanding and research on the interaction between the cancer microenvironment and cancer cells is essential, and immune cells and fibroblasts play an important role in tumor immunity and cell growth control against cancer cells.
암 미세환경 구성물 중에 섬유모세포는 다른 비종양성 조직의 섬유모세포와 달리 "암연관섬유모세포(Cancer associated Fibroblast, CAF)"로 분류되고, 이러한 암연관섬유모세포는 여러 종류의 세포들이 암세포와의 상호작용을 통해 생성될 수 있으며(Cancer Sci. 2020 Oct;111(10):3468-3477), 암 성장에 도움을 준다고 알려져 있다(Cancer Sci. 2020 Oct;111(10):3468-3477). 그러나, 암연관섬유세포는 암을 억제하는 역할을 하기도 하고(Cancer Sci. 2020 Apr;111(4):1047-1057), 주변 면역세포에게 여러 신호를 전달함으로써 면역세포의 작용에도 영향을 미칠 수 있다고 보고되고 있다(Elife. 2020 Dec 28;9:e57243). 때문에 암연관섬유모세포의 연구도 암세포와 암 미세환경과 함께 포괄적으로 진행되어야 한다. Among the components of the cancer microenvironment, fibroblasts, unlike fibroblasts in other non-neoplastic tissues, are classified as "Cancer associated Fibroblasts (CAF)", and these cancer-associated fibroblasts interact with cancer cells of various types. It can be produced through (Cancer Sci. 2020 Oct;111(10):3468-3477) and is known to help cancer growth (Cancer Sci. 2020 Oct;111(10):3468-3477). However, cancer-related fibrocytes also play a role in suppressing cancer (Cancer Sci. 2020 Apr;111(4):1047-1057) and can also affect the function of immune cells by transmitting various signals to surrounding immune cells. It is reported that there is (Elife. 2020 Dec 28;9:e57243). Therefore, research on cancer-related fibroblasts should be conducted comprehensively along with cancer cells and the cancer microenvironment.
암 미세환경에 존재하는 면역세포, 예를 들면, 종양 침윤 림프구(tumor infiltrating lymphocyte, TIL)의 경우, 차세대 항암 치료 전략으로 이미 항암제 개발의 주요 타겟으로 연구가 진행되고 있다. 그러나 면역항암제의 효과를 예측하기 위한 바이오마커가 부족한 실정이며, 따라서 환자별 면역항암제 반응성 예측에는 많은 어려움이 존재한다(Bric view 2019-T05). 일반적으로 면역 세포들은 자기와 비자기를 인식하는 기작을 통해 정상세포와 비정상세포를 구별하는 메커니즘을 통해 비정상세포를 죽이는데, 이러한 면역 세포들의 특성 때문에 면역세포와 암세포를 직접적으로 연구하는 일이 쉽지 않다. 따라서, 연구에 있어서 동일한 환자로부터 유래한 면역세포와 암세포가 필수적으로 요구되며, 면역세포는 암세포에 의해 활성화된 면역세포여야 한다. 하지만, 실험적으로 이 모든 환경을 재현한 상태에서 암세포 연구를 하기는 어려운 실정이다. Immune cells present in the cancer microenvironment, such as tumor infiltrating lymphocytes (TILs), are already being studied as major targets for the development of anticancer drugs as a next-generation anticancer treatment strategy. However, there is a lack of biomarkers to predict the effectiveness of cancer immunotherapy drugs, and therefore, there are many difficulties in predicting immunotherapy drug responsiveness for each patient (Bric view 2019-T05). In general, immune cells kill abnormal cells through a mechanism that distinguishes normal cells from abnormal cells through a mechanism that recognizes self and non-self. However, due to the characteristics of these immune cells, it is not easy to directly study immune cells and cancer cells. Therefore, in research, immune cells and cancer cells derived from the same patient are essentially required, and the immune cells must be immune cells activated by cancer cells. However, it is difficult to conduct cancer cell research while experimentally reproducing all of these environments.
일 양상은 분리된 암세포 혼합물을 제1 배지가 첨가된 상부 챔버에서 배양하는 단계; 상기 배양된 암세포 혼합물 중 암미세환경(tumor microenvironment, TME)인자가 상기 상부 챔버의 다공성 표면에 의해 제2 배지가 첨가된 하부 챔버로 이동하는 단계로서, 상기 다공성 표면은 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 또는 이의 유사체가 개질된 것인 단계; 및 상기 암미세환경인자로부터 섬유모세포 또는 면역세포를 분리하는 단계를 포함하는 암 조직으로부터 암 오가노이드 및 암미세환경인자를 분리 및 배양하는 방법을 제공하는 것이다.One aspect includes culturing the separated cancer cell mixture in an upper chamber to which a first medium is added; A step in which tumor microenvironment (TME) factors in the cultured cancer cell mixture move to the lower chamber to which a second medium is added by the porous surface of the upper chamber, wherein the porous surface is an extracellular matrix (extracellular matrix, ECM) or a modified analog thereof; And to provide a method of isolating and culturing cancer organoids and cancer microenvironment factors from cancer tissue, including the step of isolating fibroblasts or immune cells from the cancer microenvironment factors.
다른 양상은 상기 방법에 따라 분리 및 배양된 암 오가노이드를 제공하는 것이다.Another aspect is to provide cancer organoids isolated and cultured according to the above method.
또 다른 양상은 상기 암 오가노이드를 시험 물질과 접촉시키는 단계; 상기 접촉된 암 오가노이드의 세포 생존율, 크기, 암 영역, 및 저산소 영역 중에서 어느 하나 이상을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 결과를 상기 시험 물질과 접촉되지 않은 암오가노이드로부터 측정된 결과와 비교하는 단계를 포함하는 항암제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.Another aspect includes contacting the cancer organoid with a test agent; Measuring any one or more of cell viability, size, cancer area, and hypoxic area of the contacted cancer organoid; and comparing the measured results with results measured from cancer organoids not in contact with the test substance.
일 양상은 분리된 암세포 혼합물을 제1 배지가 첨가된 상부 챔버에서 배양하는 단계; 상기 배양된 암세포 혼합물 중 암미세환경(tumor microenvironment, TME)인자가 상기 상부 챔버의 다공성 표면에 의해 제2 배지가 첨가된 하부 챔버로 이동하는 단계로서, 상기 다공성 표면은 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 또는 이의 유사체가 개질된 것인 단계; 및 상기 암미세환경인자로부터 섬유모세포 또는 면역세포를 분리하는 단계를 포함하는 암 조직으로부터 암 오가노이드 및 암미세환경인자를 분리 및 배양하는 방법을 제공한다.One aspect includes culturing the separated cancer cell mixture in an upper chamber to which a first medium is added; A step in which tumor microenvironment (TME) factors in the cultured cancer cell mixture move to the lower chamber to which a second medium is added by the porous surface of the upper chamber, wherein the porous surface is an extracellular matrix (extracellular matrix, ECM) or a modified analog thereof; and isolating fibroblasts or immune cells from the cancer microenvironment factors. A method for isolating and culturing cancer organoids and cancer microenvironment factors from cancer tissue is provided.
본 명세서에서 용어, "세포 혼합물"은 2 종 이상의 세포를 포함하는 세포 집단을 의미한다. 상기 세포 혼합물은 2 종 이상의 세포 외에, 배지 성분 등을 포함할 수 있으며, 상기 세포 혼합물은 암세포, 및 암 미세환경인자를 포함할 수 있다. 상기 암세포 혼합물은 암조직으로부터 분리된 것일 수 있다.As used herein, the term “cell mixture” refers to a cell population comprising two or more types of cells. The cell mixture may include media components in addition to two or more types of cells, and the cell mixture may include cancer cells and cancer microenvironment factors. The cancer cell mixture may be separated from cancer tissue.
상기 상부 챔버의 다공성 표면은 미세구멍(micropore)이 형성된 표면일 수 있다. 상기 미세구멍의 직경은 0.1 ㎛ 내지 10.0 ㎛, 예를 들면, 1 ㎛ 내지 10 ㎛, 또는 5 ㎛ 내지 10 ㎛일 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 변경할 수 있다.The porous surface of the upper chamber may be a surface on which micropores are formed. The diameter of the micropores may be 0.1 ㎛ to 10.0 ㎛, for example, 1 ㎛ to 10 ㎛, or 5 ㎛ to 10 ㎛, and can be varied depending on the purpose.
본 명세서에서 용어, "세포외기질(extracellular matrix)"은 조직내 또는 세포외의 공간을 채우고 있는 생체고분자의 복잡한 집합체로서, 세포에 의해 합성되고 세포외에 분비, 축적된 분자로 구성된 것을 의미한다. "세포외기질의 유사체"는 세포 외 거대분자들의 3차원적 네트위크로 구성된 세포외 기질과 유사한 구성을 가지는 혼합물로서, 천연의 세포외기질과 동일하거나 유사한 생물학적 기능을 하는 인공 또는 천연의 단백질 혼합물을 의미한다.As used herein, the term “extracellular matrix” refers to a complex assembly of biopolymers that fill intratissue or extracellular space, and is composed of molecules synthesized by cells and secreted and accumulated outside the cells. “Extracellular matrix analog” refers to a mixture with a composition similar to the extracellular matrix consisting of a three-dimensional network of extracellular macromolecules, and is a mixture of artificial or natural proteins that perform the same or similar biological functions as the natural extracellular matrix. do.
일 구체예에 따르면, 상기 세포외기질 또는 그 유사체는 젤라틴성 단백질 혼합물일 수 있다. According to one embodiment, the extracellular matrix or its analogue may be a gelatinous protein mixture.
일 구체예에 따르면, 상기 젤라틴성 단백질 혼합물은 하이드로겔일 수 있다.According to one embodiment, the gelatinous protein mixture may be a hydrogel.
상기 하이드로겔(hydrogel)은 매트리겔(matrigel), 피브린겔(fibrin gel), 콜라겐(collagen), 아가로스겔(agarose), 알지네이트(alginate), HEMA겔 또는 이들의 혼합물일 수 있다. The hydrogel may be matrigel, fibrin gel, collagen, agarose gel, alginate, HEMA gel, or a mixture thereof.
본 명세서에서 용어, "매트리겔(matrigel)"은 EHS(Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스의 육종세포에서 추출된 단백질 복합체로서(BD Bioscience사의 제품명), 라미닌(lamonin), 콜라겐(collagen), 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan)과 같은 세포외 매트릭스(extracellular matrix, ECM)와 섬유모세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 상피세포 성장인자(epiderma growth factor, EFG), 인슐린 성장인자(insulin-like growth factor, IGF), 형질전환 성장인자-베타(transforming growth factor-beta, TGF-β), 혈소판 유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF)와 같은 성장인자를 함유할 수 있다. 따라서, 상기 매트리겔 층은 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 환경을 형성할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 용어, "매트리겔 층(matrigel layer)"은 매트리겔이 형성된 층(layer)을 의미할 수 있다. As used herein, the term "matrigel" is a protein complex extracted from sarcoma cells of EHS (Engelbreth-Holm-Swarm) mice (product name of BD Bioscience), containing laminin, collagen, and heparan. Extracellular matrix (ECM) such as heparan sulfate proteoglycan, fibroblast growth factor (FGF), epiderma growth factor (EFG), and insulin-like It may contain growth factors such as growth factor (IGF), transforming growth factor-beta (TGF-β), and platelet-derived growth factor (PDGF). Therefore, the Matrigel layer can form an extracellular matrix (ECM) environment. Therefore, as used herein, the term “matrigel layer” may refer to a layer in which matrigel is formed.
본 명세서에서 용어, "개질(coating)"은 대상표면 상에 특정 물질로 피막을 형성함으로써 일정한 두께의 새로운 층을 형성하는 것을 의미할 수 있다. 대상표면과 개질 물질은 이온결합, 공유결합, 수소결합 등의 다양한 화학적 결합을 통해 코팅될 수 있다. 세포외기질 등이 챔버의 표면을 개질하는 경우 세포외기질은 챔버 표면을 완전히 둘러싸면서 밀폐된 층을 형성할 수도 있고 부분적으로 밀폐된 층을 형성할 수도 있다.As used herein, the term “coating” may mean forming a new layer of a certain thickness by forming a film with a specific material on the target surface. The target surface and modified material can be coated through various chemical bonds such as ionic bonds, covalent bonds, and hydrogen bonds. When the surface of the chamber is modified by the extracellular matrix, the extracellular matrix may form a sealed layer that completely surrounds the surface of the chamber, or it may form a partially sealed layer.
상기 매트리겔은 2 ℃ 내지 10 ℃, 예를 들면, 4 ℃에서는 액체 상태로 존재할 수 있으며, 30 ℃ 내지 40 ℃의 온도, 예를 들면 37 ℃에서는 겔 형태로 존재할 수 있다. 따라서, 2 ℃ 내지 10 ℃에서 상부 챔버의 다공성 표면을 매트리겔로 도포하면 매트리겔은 상부 챔버의 미세구멍을 통해 상부 챔버의 다공성 표면의 내측 및 외측에 매트리겔 층을 형성할 수 있다. 그리고 30 ℃ 내지 40 ℃의 온도에서 매트리겔이 도포된 상기 상부 챔버를 보관하면 매트리겔이 겔화되어 매트리겔로 개질된 상부 챔버가 형성될 수 있다.The Matrigel may exist in a liquid state at a temperature of 2°C to 10°C, for example, 4°C, and may exist in a gel form at a temperature of 30°C to 40°C, for example, 37°C. Therefore, when Matrigel is applied to the porous surface of the upper chamber at 2°C to 10°C, Matrigel can form a Matrigel layer on the inside and outside of the porous surface of the upper chamber through the micropores of the upper chamber. And, if the upper chamber coated with Matrigel is stored at a temperature of 30°C to 40°C, the Matrigel may be gelled to form an upper chamber modified with Matrigel.
따라서, 일 구체예에 있어서, 상기 매트리겔이 개질된 상부 챔버의 다공성 표면은 2 ℃ 내지 10 ℃의 온도에서 매트리겔을 상부 챔버의 다공성 표면을 도포하고, 상기 매트리겔이 도포된 상부 챔버를 30 ℃ 내지 40 ℃의 온도에서 보관하는 단계를 통해 개질된 것일 수 있다.Therefore, in one embodiment, Matrigel is applied to the porous surface of the upper chamber at a temperature of 2° C. to 10° C., and the upper chamber to which the Matrigel is applied is incubated for 30 minutes. It may be modified through storage at a temperature of ℃ to 40 ℃.
일 구체예에 있어서, 트랜스웰(transwell) 배양 시스템은 상기 상부 챔버 및 하부 챔버를 포함할 수 있다.In one embodiment, a transwell culture system may include the upper chamber and the lower chamber.
본 명세서에서 용어, "트랜스웰(transwell)" 또는 "트랜스웰 플레이트"는 당 업계에서 널리 사용되는 것일 수 있으며, 본 명세서에서 용어, "트랜스웰 배양 시스템"은 상기 트랜스웰을 이용하여 배양하는 기구 또는 방법을 의미할 수 있다.As used herein, the term “transwell” or “transwell plate” may be widely used in the art, and as used herein, the term “transwell culture system” refers to a device for culturing using the transwell. Or it may mean a method.
일 구체예에 따르면, 상기 제1 배지는 암 조직 특성에 기반하여 선택되며, 암세포 및 암 오가노이드의 배양에 통상적으로 사용되는 배지면 어느 것이나 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면 상부 챔버에서 배양하는 분리된 암세포 혼합물이 폐암세포 혼합물인 경우, 폐암 오가노이드 배양을 위해 사용되는 LT-MBM(Lung tumor minimum basal medium)을 제1 배지로 사용할 수 있다.According to one embodiment, the first medium is selected based on cancer tissue characteristics, and any medium commonly used for culturing cancer cells and cancer organoids may be used without limitation. For example, if the mixture of separated cancer cells cultured in the upper chamber is a mixture of lung cancer cells, LT-MBM (Lung tumor minimum basal medium), which is used for culturing lung cancer organoids, can be used as the first medium.
일 구체예에 따르면, 상기 하부 챔버는 제2배지 또는 제3배지를 포함할 수 있다. 상기 제2 배지는 통상적으로 면역세포 배양에 사용되는 배지면 어느 것이나 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들면, RPMI 또는 AIMV일 수 있다. 상기 제3 배지는 통상적으로 섬유모세포 배양에 사용되는 배지면 어느 것이나 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들면, DMEM/F12일 수 있다.According to one embodiment, the lower chamber may include a second medium or a third medium. The second medium may be any medium commonly used for immune cell culture without limitation, for example, RPMI or AIMV. The third medium may be any medium commonly used for fibroblast culture without limitation, and may be, for example, DMEM/F12.
일 구체예에 있어서, 상기 제2 배지는 8 내지 12 %의 FBS, 및 1 내지 7 %의 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, P/S)을 포함하는 RPMI일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 제3 배지는 8 내지 12 %의 FBS, 및 1 내지 7 %의 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM/F12일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In one embodiment, the second medium may be RPMI containing 8 to 12% FBS and 1 to 7% penicillin/streptomycin (P/S), but is not limited thereto. The third medium may be DMEM/F12 containing 8 to 12% FBS and 1 to 7% penicillin/streptomycin, but is not limited thereto.
상기 배양은 34 ℃ 내지 39 ℃, 예를 들면, 35 내지 39 ℃, 36 내지 39 ℃, 37 내지 39 ℃, 38 내지 39 ℃, 34 내지 38 ℃, 35 내지 38 ℃, 36 내지 38 ℃, 37 내지 38 ℃, 34 내지 37 ℃, 35 내지 37 ℃, 36 내지 37 ℃, 34 내지 36 ℃, 35 내지 36 ℃, 또는 34 내지 35 ℃에서 수행될 수 있으나, 당 업자에 의해 배양에 적합한 온도로 변경 가능하다.The culture is performed at 34 to 39°C, for example, 35 to 39°C, 36 to 39°C, 37 to 39°C, 38 to 39°C, 34 to 38°C, 35 to 38°C, 36 to 38°C, 37 to 38°C. It can be carried out at 38 ℃, 34 to 37 ℃, 35 to 37 ℃, 36 to 37 ℃, 34 to 36 ℃, 35 to 36 ℃, or 34 to 35 ℃, but can be changed to a temperature suitable for culturing by those skilled in the art. do.
본 명세서에서 용어, "암"은 전형적으로 비정상적 또는 제어되지 않은 세포 성장의 특징을 가지는, 동물에서의 생리학적 상태를 의미한다. 암은 예를 들어, 전이, 정상적으로 기능하는 주변 세포에 대한 간섭, 비정상 레벨에서 사이토카인(cytokine) 또는 다른 분비 산물의 방출, 염증성 또는 면역학적 반응의 억제 또는 증대, 종양 형성(neoplasia), 전암(premalignant), 악성 종양(malignancy), 주위 또는 거리가 있는 조직 또는 기관, 예를 들어 림프절 침범(invasion) 등과 연관될 수 있다. 상기 암조직은 암으로부터 분리된 조직일 수 있다. 상기 암으로부터 암조직을 얻는 단계는 통상의 해부학적 방법, 예를 들어, 암에 존재하는 조직들을 멸균된 가위로 여러 부위로 잘라냄으로써 얻을 수 있다. 얻어진 암조직은 무혈청 배지, 또는 항생제, 예를 들면, 페니실린, 스트렙토마이신, 또는 겐타마이신이 포함된 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 세척함으로써, 조직에 존재하는 혈액 등의 오염물질들을 제거할 수 있다. 상기와 같이 분리된 암조직에 직접 효소 처리하거나, 멸균된 가위 등을 사용하여 더 잘게 세절한 후 효소 처리할 수 있다.As used herein, the term “cancer” refers to a physiological condition in animals, typically characterized by abnormal or uncontrolled cell growth. Cancer can cause, for example, metastasis, interference with normally functioning surrounding cells, release of cytokines or other secreted products at abnormal levels, inhibition or enhancement of inflammatory or immunological responses, tumor formation (neoplasia), or precanceration ( It may be associated with premalignant, malignancy, or invasion of surrounding or distant tissues or organs, such as lymph nodes. The cancer tissue may be a tissue separated from cancer. The step of obtaining cancer tissue from the cancer can be obtained using a common anatomical method, for example, by cutting the tissues present in the cancer into several parts with sterilized scissors. The obtained cancer tissue is washed with serum-free medium or phosphate buffered saline (PBS) containing antibiotics, such as penicillin, streptomycin, or gentamicin, to remove contaminants such as blood present in the tissue. It can be removed. As described above, the isolated cancer tissue can be treated directly with enzymes, or it can be cut into smaller pieces using sterilized scissors, etc. and then treated with enzymes.
일 구체예에서 상기 암은 고형암일 수 있으며, 상기 고형암은 폐암(lung cancer), 피부암(skin cancer), 위암(stomach cancer), 대장암(intestinal cancer), 결장암(colon cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 간암(liver cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 자궁암(uterine cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer), 고환암(testicular cancer), 전립선암(prostate cancer), 유방암(breast cancer), 및 구강암(oral cancer)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In one embodiment, the cancer may be a solid cancer, and the solid cancer includes lung cancer, skin cancer, stomach cancer, colon cancer, colon cancer, and pancreatic cancer. ), liver cancer, thyroid cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer, testicular cancer, prostate cancer, breast cancer cancer), and oral cancer, but is not limited thereto.
본 명세서에서 용어, "암조직"은 암이 발현한 조직을 의미하며, 상기 암조직은 폐암 조직, 피부암 조직, 위암 조직, 대장암 조직, 결장암 조직, 췌장암 조직, 간암 조직, 갑상선암 조직, 자궁암 조직, 자궁경부암 조직, 난소암 조직, 고환암 조직, 전립선암 조직, 유방암 조직, 및 구강암 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.As used herein, the term “cancer tissue” refers to a tissue expressing cancer, and the cancer tissue includes lung cancer tissue, skin cancer tissue, stomach cancer tissue, colon cancer tissue, colon cancer tissue, pancreatic cancer tissue, liver cancer tissue, thyroid cancer tissue, and uterine cancer tissue. , may be any one selected from the group consisting of cervical cancer tissue, ovarian cancer tissue, testicular cancer tissue, prostate cancer tissue, breast cancer tissue, and oral cancer tissue, but is not limited thereto.
본 명세서에서 용어, "암미세환경(tumor microenvironment, TME)" 또는 "암미세환경인자"는 암의 형성 및 진행에 직접 또는 간접적으로 영향을 미치는 주변 조직세포 등을 의미할 수 있다. 상기 암 미세환경인자는 면역세포, 섬유모세포, 혈관세포, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.As used herein, the term “tumor microenvironment (TME)” or “cancer microenvironment factor” may refer to surrounding tissue cells that directly or indirectly affect the formation and progression of cancer. The cancer microenvironmental factors may include immune cells, fibroblasts, vascular cells, or a combination thereof.
일 구체예에 따르면, 상기 섬유모세포는 암연관섬유모세포(cancer associated fibroblast, CAF)일 수 있다. 본 명세에서 용어, "암연관섬유모세포"는 암(cancer) 또는 악성종양(malignant tumor) 주변을 둘러싸고 있는 조직에 존재하는 섬유모세포를 의미하며, 대부분의 암에서 종양의 성장, 종양 혈관 생성, 종양세포의 침윤 및 전이에 관여하는 것으로 알려져 있다.According to one embodiment, the fibroblasts may be cancer associated fibroblasts (CAFs). In this specification, the term "cancer-related fibroblast" refers to fibroblasts present in the tissue surrounding a cancer or malignant tumor, and in most cancers, tumor growth, tumor angiogenesis, and tumor It is known to be involved in cell invasion and metastasis.
상기 암연관섬유모세포는 정상 섬유모세포에 비하여 암연관섬유모세포 마커, 예를 들면 α-SMA, FSP-1, VEGF, MMP2, Prrx1, 및/또는 Vimentin의 발현이 증가된 것일 수 있다.The cancer-related fibroblasts may have increased expression of cancer-related fibroblast markers, such as α-SMA, FSP-1, VEGF, MMP2, Prrx1, and/or Vimentin, compared to normal fibroblasts.
일 구체예에 따르면, 상기 면역세포는 종양 침윤 림프구(tumor infiltrating lymphocyte, TIL), T 세포, 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL), B 세포, NK 세포, 단핵 식세포, α/β 수용체 T-세포 및 γ/δ 수용체 T 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. According to one embodiment, the immune cells include tumor infiltrating lymphocytes (TIL), T cells, cytotoxic T lymphocytes (CTL), B cells, NK cells, mononuclear phagocytes, and α/β receptor T. It may be any one or more selected from the group consisting of -cells and γ/δ receptor T cells.
상기 암세포는 암미세환경인자보다 크기가 크고 이동속도가 느리며, 세포외기질 환경에서는 서로 뭉쳐 구의 형태인 암 오가노이드를 형성하는 특성이 있다. 따라서, 하부 챔버로 이동하지 않고 상기 제1 배지가 첨가된 상부 챔버의 내측에 남아있는 세포는 암세포 또는 암 오가노이드일 수 있다.The cancer cells are larger in size and move slower than cancer microenvironment factors, and in the extracellular matrix environment, they have the characteristic of clustering together to form spherical cancer organoids. Accordingly, cells that do not move to the lower chamber but remain inside the upper chamber to which the first medium is added may be cancer cells or cancer organoids.
상기 면역세포는 상부 챔버의 표면에 형성된 미세구멍보다 크기가 작아 배양액 속에서의 이동 속도가 암세포보다 빠른 특성이 있다. 따라서, 상부 챔버에 형성된 미세구멍을 통해 상부 챔버에서 제2 배지가 첨가된 하부 챔버로 이동할 수 있다. 따라서, 상기 제2 배지가 첨가된 하부 챔버로 이동한 세포는 면역세포일 수 있다.The immune cells are smaller than the micropores formed on the surface of the upper chamber and have the characteristic of moving faster in the culture medium than cancer cells. Therefore, it can move from the upper chamber to the lower chamber where the second medium is added through the microhole formed in the upper chamber. Therefore, the cells that migrated to the lower chamber to which the second medium was added may be immune cells.
상기 섬유모세포는 상부 챔버의 표면에 형성된 미세구멍보다 크기가 작아 배양액 속에서의 이동 속도가 암세포보다 빠른 특성이 있다. 또한, 섬유모세포는 세포외기질을 선호하여 접착되는 성질이 있다. 따라서, 상부 챔버에 형성된 미세구멍을 통해 상부 챔버에서 제2 배지가 첨가된 하부 챔버로 이동하는 과정에서 상기 상부 챔버의 외측에 개질된 세포외기질에서 존재할 수 있다. 그리고 상기 제2 배지를 제거하고 제3 배지를 하부 챔버에 첨가하는 단계를 통해 상부 챔버의 외측에 개질된 세포외기질에 존재하는 섬유모세포가 제3 배지가 첨가된 하부 챔버로 이동할 수 있다. 따라서, 상기 제3 배지가 첨가된 하부 챔버로 이동한 세포는 섬유모세포일 수 있다.The fibroblasts are smaller than the micropores formed on the surface of the upper chamber and have a faster moving speed in the culture medium than cancer cells. In addition, fibroblasts have a tendency to prefer extracellular matrix and adhere to it. Therefore, in the process of moving from the upper chamber to the lower chamber where the second medium is added through the micropores formed in the upper chamber, the modified extracellular matrix may exist on the outside of the upper chamber. And through the step of removing the second medium and adding the third medium to the lower chamber, the fibroblasts present in the modified extracellular matrix on the outside of the upper chamber can move to the lower chamber to which the third medium is added. Therefore, the cells that migrated to the lower chamber to which the third medium was added may be fibroblasts.
상기 상부 챔버의 내측은 매트리겔로 개질된 상부 챔버의 표면을 기준으로 제1 배지와 접촉하고 있는 부분을 의미하며, 상기 상부 챔버의 외측은 매트리겔로 개질된 상부 챔버의 표면을 기준으로 제2 배지 또는 제3 배지와 접촉하고 있는 부분을 의미할 수 있다.The inside of the upper chamber refers to a portion in contact with the first medium based on the surface of the upper chamber modified with Matrigel, and the outside of the upper chamber refers to the portion in contact with the first medium based on the surface of the upper chamber modified with Matrigel. It may refer to a part in contact with a medium or a third medium.
일 구체예에 따르면, 상기 방법은 상기 제1 배지가 첨가된 상부 챔버의 내측에 남아있는 암 오가노이드를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.According to one embodiment, the method may include separating the cancer organoids remaining inside the upper chamber to which the first medium was added.
일 구체예에 따르면, 상기 방법은 상기 제1 배지가 첨가된 상부 챔버의 내측에 남아있는 암 오가노이드를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.According to one embodiment, the method may include culturing the cancer organoids remaining inside the upper chamber to which the first medium has been added.
일 구체예에 있어서, 상기 방법은 상기 제2 배지가 첨가된 하부 챔버로 이동한 면역세포를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.In one embodiment, the method may include the step of isolating immune cells that have migrated to the lower chamber to which the second medium is added.
일 구체예에 있어서, 상기 방법은 상기 제2 배지가 첨가된 하부 챔버로 이동한 면역세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.In one embodiment, the method may include culturing immune cells that have migrated to the lower chamber to which the second medium has been added.
일 구체예에 있어서, 상기 방법은 상기 하부 챔버 상의 제2배지를 제거하는 단계; 상기 제2배지가 제거된 하부 챔버에 제3배지를 첨가하는 단계; 및 상기 상부 챔버의 외측에 개질된 세포외기질에서 상기 제3배지가 첨가된 하부 챔버로 이동한 섬유모세포를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.In one embodiment, the method includes removing the second medium on the lower chamber; adding a third medium to the lower chamber from which the second medium was removed; And it may include the step of separating fibroblasts that have moved to the lower chamber to which the third medium is added from the extracellular matrix modified on the outside of the upper chamber.
일 구체예에 있어서, 상기 방법은 상기 하부 챔버 상의 제2배지를 제거하는 단계; 상기 제2배지가 제거된 하부 챔버에 제3배지를 첨가하는 단계; 및 상기 상부 챔버의 외측에 개질된 세포외기질에서 상기 제3배지가 첨가된 하부 챔버로 이동한 섬유모세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.In one embodiment, the method includes removing the second medium on the lower chamber; adding a third medium to the lower chamber from which the second medium was removed; And it may include culturing fibroblasts that have migrated from the extracellular matrix modified to the outside of the upper chamber to the lower chamber to which the third medium is added.
일 구체예에 따르면, 상기 방법은 암조직으로부터 세포 혼합물을 분리하는 단계를 포함할 수 있다.According to one embodiment, the method may include separating the cell mixture from cancer tissue.
일 구체예에 있어서, 상기 암세포 혼합물로부터 암 오가노이드 및 암 미세환경인자를 분리하는 단계는 세포의 크기 및 이동속도의 차이를 이용하여 분리하는 것일 수 있다.In one embodiment, the step of separating cancer organoids and cancer microenvironmental factors from the cancer cell mixture may be performed using differences in cell size and migration speed.
상기 세포의 크기 및 이동속도의 차이는 세포외기질의 성분, %농도 등을 조절함으로써 명확하게 구별되게 할 수 있으며, 이를 통해, 암세포, 섬유모세포, 및 면역세포를 더욱 효과적으로 분리할 수 있다. 따라서, 암세포, 섬유모세포, 및 면역세포를 효과적으로 분리하기 위해, 매트리겔의 %농도 등을 임의로 조절할 수 있다.Differences in the size and movement speed of the cells can be clearly distinguished by adjusting the components and % concentration of the extracellular matrix, and through this, cancer cells, fibroblasts, and immune cells can be more effectively separated. Therefore, in order to effectively separate cancer cells, fibroblasts, and immune cells, the % concentration of Matrigel can be arbitrarily adjusted.
다른 양상은 암 조직으로부터 암 오가노이드 및 암미세환경 인자를 분리 및 배양하는 방법을 통해 분리 및 배양된 암 오가노이드를 제공한다.Another aspect provides isolated and cultured cancer organoids through a method of isolating and culturing cancer organoids and cancer microenvironment factors from cancer tissue.
일 구체예에 따르면, 상기 암 오가노이드는 암조직으로 분리된 세포 혼합물을 트랜스웰의 상부 챔버에서 배양한 후 3 내지 7일 후에 상부 챔버에서 수득한 암세포 또는 암 오가노이드를 배양하여 제조한 것일 수 있다.According to one embodiment, the cancer organoid may be prepared by culturing a cell mixture separated from cancer tissue in the upper chamber of a transwell and then culturing cancer cells or cancer organoids obtained in the upper chamber 3 to 7 days later. there is.
본 명세서에서 용어, "오가노이드(organoid)"는 3차원의 입체구조를 가지는 세포를 의미하며, 동물 등에서 수집, 취득하지 않은 인공적인 배양 과정을 통해 제조한 신체 장기와 유사한 모델을 의미할 수 있다. 이를 구성하는 세포의 유래는 제한되지 않는다. 2차원 배양과는 달리, 3차원 세포 배양은 체외에서 세포가 모든 방향으로 성장할 수 있는 바, 상기 오가노이드는 생체 내에서 상호작용하고 있는 장기를 유사하게 모사하여 질병의 치료제 개발 등에 이용될 수 있다. 상기 오가노이드의 크기는 직경 300 내지 500 um일 수 있다.As used herein, the term “organoid” refers to a cell having a three-dimensional structure, and may refer to a model similar to a body organ produced through an artificial culture process that is not collected or acquired from animals, etc. . The origin of the cells constituting it is not limited. Unlike two-dimensional culture, three-dimensional cell culture allows cells to grow in all directions in vitro, and the organoids can be used to develop treatments for diseases by closely replicating organs interacting in vivo. . The size of the organoid may be 300 to 500 um in diameter.
본 명세서에서 용어, "3차원(three-dimensional)"은 2차원이 아닌 기하학적인 3개의 파라미터(예를 들어, 깊이, 넓이, 높이 또는 X, Y, Z 축) 모델을 갖는 입체를 의미할 수 있다. 따라서 일 구체예에 따른 오가노이드는 3차원 배양, 즉 배양 용기에서 탈착되어 부유상태로 배양되어 세포가 증식함에 따라 입체적으로 구형, 시트(sheet) 또는 그와 유사한 3차원의 형태(예를 들어, 유사조직체)를 갖는 오가노이드를 의미할 수 있다. 또한, 일 구체예에 따른 오가노이드는 조직공학기술로 인공적인 3차원 다공성 세포외기질, 예를 들어, 시트, 하이드로겔, 막, 스캐폴드 등과 같은 합성 고분자 또는 천연 고분자 지지체를 사용할 필요 없이, 그 자체로서 3차원 오가노이드가 형성되는 것을 의미할 수 있다. As used herein, the term “three-dimensional” may mean a three-dimensional model with three geometric parameters (e.g., depth, width, height, or X, Y, Z axes) rather than two-dimensional. there is. Therefore, organoids according to one embodiment are three-dimensionally cultured, that is, detached from a culture vessel and cultured in a suspended state, and as the cells proliferate, they form three-dimensionally into a sphere, sheet, or similar three-dimensional shape (e.g., It may refer to an organoid having a similar tissue. In addition, the organoid according to one embodiment is an artificial three-dimensional porous extracellular matrix using tissue engineering technology, for example, without the need to use synthetic polymers or natural polymer scaffolds such as sheets, hydrogels, membranes, scaffolds, etc. This in itself can mean the formation of a 3D organoid.
상기 오가노이드는 간 오가노이드, 심장 오가노이드, 위 오가노이드, 뇌 오가노이드, 장관 오가노이드, 혀 오가노이드, 폐 오가노이드, 갑상선 오가노이드, 흉선 오가노이드, 췌장 오가노이드, 상피 오가노이드, 신장 오가노이드, 전립선 오가노이드, 고환 오가노이드, 배아 오가노이드, 배반포 유사 오가노이드, 또는 망막 오가노이드일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. The organoids include liver organoids, heart organoids, stomach organoids, brain organoids, intestinal organoids, tongue organoids, lung organoids, thyroid organoids, thymus organoids, pancreas organoids, epithelial organoids, and kidney organoids. It may be, but is not limited to, an organoid, a prostate organoid, a testicular organoid, an embryonic organoid, a blastocyst-like organoid, or a retinal organoid.
일 구체예에 있어서, 상기 오가노이드는 매트리겔 드랍(matrigel drop) 배양(Nat Commun. 2019 Sep 5;10(1):3991) 또는 부유배양을 통해 배양하는 것일 수 있다. In one embodiment, the organoids may be cultured through matrigel drop culture (Nat Commun. 2019 Sep 5;10(1):3991) or suspension culture.
본 명세서에서 용어, "부유배양(suspension culture)"은 세포가 어떠한 표면에 부착되지 않고 배지 중에 떠 있는 상태로 배양되는 것을 의미한다. 이때, 일정 수의 세포가 서로 응집되면서 증식할 수 있다.As used herein, the term “suspension culture” means that cells are cultured while floating in the medium without attaching to any surface. At this time, a certain number of cells can aggregate and proliferate.
또 다른 양상은 상기 암 오가노이드를 시험 물질과 접촉시키는 단계; 상기 접촉된 암 오가노이드의 세포 생존율, 크기, 암 영역, 및 저산소 영역 중에서 어느 하나 이상을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 결과를 상기 시험 물질과 접촉되지 않은 암오가노이드로부터 측정된 결과와 비교하는 단계를 포함하는 항암제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.Another aspect includes contacting the cancer organoid with a test agent; Measuring any one or more of cell viability, size, cancer area, and hypoxic area of the contacted cancer organoid; and comparing the measured results with results measured from cancer organoids not in contact with the test substance.
상기 스크리닝하는 방법은 상기 시험 물질과 접촉시킨 후의 암 오가노이드의 세포 생존율, 크기, 암 영역, 및 저산소 영역 중 어느 하나가 상기 시험 물질과 접촉시키기 전과 비교하여 감소한 경우, 상기 시험 물질의 효과가 있는 것으로 판단하는 단계를 포함할 수 있다.The screening method determines the effect of the test substance when any one of the cell viability, size, cancer area, and hypoxic area of the cancer organoid after contact with the test substance is reduced compared to before contact with the test substance. It may include a step of determining that
상기 항암제는 세포독성항암제, 면역항암제, 표적치료 항암제, 대사항암제 및 항암신약 치료제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.The anticancer agent may be one or more selected from the group consisting of cytotoxic anticancer agents, immunological anticancer agents, targeted anticancer agents, anticancer agents, and new anticancer drugs.
일 양상에 따른 분리 및 배양하는 방법에 의하면, 암세포, 섬유모세포, 및 면역세포 간의 상호작용을 유지하면서 암조직으로부터 암 오가노이드, 섬유모세포, 및 면역세포를 동시에 분리하여 배양할 수 있는 효과가 있다. 또한, 기존의 암 미세환경 속의 암세포를 정확하게 연구할 수 없는 한계를 극복할 수 있는 효과가 있으며, 이를 통해 분리 및 배양된 암 오가노이드는 암조직의 기능과 특성을 보다 효과적으로 재현할 수 있다. 면역세포 역시 암세포와의 상호작용을 통해 활성화된 상태로 분리되어 암 세포와의 면역 기작에 대한 연구에 활용될 수 있는 효과가 있다.According to the separation and culture method according to one aspect, it is possible to simultaneously separate and culture cancer organoids, fibroblasts, and immune cells from cancer tissue while maintaining the interaction between cancer cells, fibroblasts, and immune cells. . In addition, it has the effect of overcoming the limitation of accurately studying cancer cells in the existing cancer microenvironment, and through this, isolated and cultured cancer organoids can more effectively reproduce the functions and characteristics of cancer tissue. Immune cells are also separated into an activated state through interaction with cancer cells and can be used for research on immune mechanisms with cancer cells.
도 1은 트랜스웰 배양 시스템을 이용한 암조직으로부터 암 오가노이드, 섬유모세포, 및 면역세포를 분리 및 배양하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 트랜스웰 배양 시스템을 나타낸 모식도이다.
도 3은 1차로 하부 챔버에 모아진 세포가 종양침윤성림프구임을 확인한 이미지 및 그래프이다:
도 3a는 1차로 하부 챔버에 모아진 세포를 관찰한 이미지이고, 도 3b는 하부 챔버에 모아진 세포를 수득하고 상기 수득한 세포에서 종양침윤성림프구의 바이오마커인 CD4+ 및 CD8+의 발현 여부를 확인한 그래프이다.
도 4는 2차로 하부 챔버에 모아진 세포가 암 연관 섬유모세포임을 확인한 이미지이다:
도 4a는 2차로 하부 챔버에 모아진 세포를 관찰한 이미지이고, 도 4b는 하부 챔버에 모아진 세포에를 수득하고 상기 수득한 세포에서 암 연관 섬유모세포의 바이오마커인 Prrx1, 및 Vimentin의 발현 여부를 확인한 이미지이다.
도 5는 상부 챔버에 존재하는 세포가 암 오가노이드임을 확인한 이미지이다:
도 5a는 상부 챔버에 배양된 암 오가노이드를 관찰한 이미지 및 상기 오가노이드들을 수득하여 마트리겔 드랍 배양 방식으로 지속 배양한 이미지이고, 도 5b는 상기 배양된 오가노이드가 고형 암 세포임을 확인하기 위해 상피 세포 바이오마커인 PanCK의 발현 여부를 확인한 이미지이다.
도 6은 트랜스웰 배양 시스템을 이용한 암 오가노이드 배양 효율을 매트리겔 드랍 배양 방식만을 이용한 암 오가노이드 배양 효율과 비교하여 나타낸 이미지이다:
도 6a는 조직으로부터 매트리겔 드랍 방식을 이용하여 암 오가노이드를 배양하는 경우 시간의 경과에 따른 암 오가노이드 형성 여부를 나타낸 이미지이고, 도 6b는 트랜스웰 배양 시스템을 이용하여 암 오가노이드를 형성시킨 후 마트리겔 드롭 방식으로 지속 배양했을 시, 시간의 경과에 따른 암 오가노이드 형성 여부를 나타낸 이미지이다.Figure 1 is a schematic diagram showing a method for isolating and culturing cancer organoids, fibroblasts, and immune cells from cancer tissue using a transwell culture system.
Figure 2 is a schematic diagram showing the transwell culture system.
Figure 3 is an image and graph confirming that the cells initially collected in the lower chamber were tumor infiltrating lymphocytes:
Figure 3a is an image of cells first collected in the lower chamber, and Figure 3b is a graph showing the cells collected in the lower chamber and the expression of CD4+ and CD8+, biomarkers of tumor infiltrating lymphocytes, in the obtained cells.
Figure 4 is an image confirming that the cells collected in the second lower chamber are cancer-related fibroblasts:
Figure 4a is an image of observing the cells collected in the lower chamber in the second stage, and Figure 4b shows the cells collected in the lower chamber were obtained and the expression of Prrx1 and Vimentin, which are biomarkers of cancer-related fibroblasts, was confirmed in the obtained cells. It is an image.
Figure 5 is an image confirming that the cells present in the upper chamber are cancer organoids:
Figure 5a is an image observing cancer organoids cultured in the upper chamber and the organoids were obtained and continuously cultured using Matrigel drop culture, and Figure 5b is an image showing the cultured organoids to confirm that they are solid cancer cells. This image confirms the expression of PanCK, an epithelial cell biomarker.
Figure 6 is an image showing the cancer organoid culture efficiency using the transwell culture system compared to the cancer organoid culture efficiency using only the Matrigel drop culture method:
Figure 6a is an image showing the formation of cancer organoids over time when culturing cancer organoids from tissue using the Matrigel drop method, and Figure 6b is an image showing the formation of cancer organoids using a transwell culture system. This image shows the formation of cancer organoids over time when continuously cultured using the Matrigel drop method.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.This will be described in more detail through examples below. However, these examples are for illustrative purposes only and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예 1. 트랜스웰 배양 시스템 제조Example 1. Preparation of transwell culture system
1.1 매트리겔 층이 형성된 트랜스웰 배양 시스템 제조1.1 Preparation of transwell culture system with Matrigel layer formed
약 30분 내지 1시간 동안 트랜스웰(6 well SPLInsert™ Hanging)의 상부 챔버(upper chamber)를 얼음(ice) 위에 두어 저온 상태로 유지시킨 후, 상기 상부 챔버에 250 ul의 매트리겔(matrigel)을 골고루 분주하여 매트리겔을 상부 챔버 상에 평평하게 코팅하였다. 상기 매트리겔이 코팅된 상부 챔버를 37 ℃의 조건으로 30 분 동안 인큐베이터에 보관하여 매트리겔을 굳힘으로써, 매트리겔 층을 형성시켰다.After maintaining the upper chamber of the Transwell (6 well SPLInsert™ Hanging) at a low temperature by placing it on ice for about 30 minutes to 1 hour, 250 ul of Matrigel was added to the upper chamber. Matrigel was evenly coated on the upper chamber by dispensing evenly. The Matrigel-coated upper chamber was stored in an incubator at 37°C for 30 minutes to harden the Matrigel, thereby forming a Matrigel layer.
1.2 트랜스웰 배양 시스템을 통한 배양1.2 Cultivation via transwell culture system
수술로 채취된 폐암 조직 (약 1 ~ 4 cm3)을 튜브에 담아, 1시간 이내로 온도를 4 ℃로 유지시키며 실험실로 이동시켰다. 운반된 암조직을 작게 조각을 낸 후 37 ℃인큐베이터에서 collagenase IV를 넣고 약 30분 내지 1시간 동안 반응시켜 단일 세포로 분리하였다. 상기 단일 세포(5 x 105 개의 세포)를 매트리겔이 코팅된 상부 챔버에 420 μl의 LT-MBM에 혼합하여 로딩하였다. 그리고 하부 챔버에 2.4 ml의 10 % FBS 및 1 %의 Penicillin/Streptomycin(P/S)이 함유된 RPMI 배양액을 넣어주어, 면역 세포를 배양하기 위한 조건으로 맞춰주었다. 그 후, 상기 상부 챔버와 하부 챔버를 조합한 뒤, 조합된 상부 챔버와 하부 챔버를 37 ℃의 조건 하에 인큐베이터에 넣어 세포를 배양하였다.Lung cancer tissue (approximately 1 to 4 cm 3 ) collected through surgery was placed in a tube and transported to the laboratory while maintaining the temperature at 4°C within 1 hour. The transported cancer tissue was cut into small pieces, collagenase IV was added in an incubator at 37°C, and reacted for about 30 minutes to 1 hour to separate into single cells. The single cells (5 x 10 5 cells) were mixed with 420 μl of LT-MBM and loaded into the Matrigel-coated upper chamber. Then, 2.4 ml of RPMI culture medium containing 10% FBS and 1% Penicillin/Streptomycin (P/S) was added to the lower chamber to adjust the conditions for culturing immune cells. Afterwards, the upper chamber and the lower chamber were combined, and the combined upper and lower chambers were placed in an incubator at 37° C. to culture the cells.
도 1은 트랜스웰 배양 시스템을 이용한 암조직으로부터 암 오가노이드, 섬유모세포, 및 면역세포를 분리 및 배양하는 방법을 나타낸 모식도이다.Figure 1 is a schematic diagram showing a method for isolating and culturing cancer organoids, fibroblasts, and immune cells from cancer tissue using a transwell culture system.
도 2는 트랜스웰 배양 시스템을 나타낸 모식도이다.Figure 2 is a schematic diagram showing the transwell culture system.
1.3 트랜스웰 배양 시스템을 통한 배양 및 분리1.3 Culture and isolation through transwell culture system
배양 시작 후 약 3 내지 5일이 경과하자, 빈 하부 챔버에서 세포들이 관찰됨을 확인하였다. 상기 관찰된 세포를 수득하여, 종양침윤성림프구(tumor-infiltrating lymphocyte, TIL)를 확인 후 분리하였다. 하부 챔버를 DPBS로 세척해주고 상기 하부 챔버에 10 % FBS, 및 5 %의 P/S가 포함된 DMEM/F12 배양액(2.4 ml)을 넣어주었다.Approximately 3 to 5 days after the start of culture, it was confirmed that cells were observed in the empty lower chamber. The observed cells were obtained, tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) were identified, and then isolated. The lower chamber was washed with DPBS, and DMEM/F12 culture medium (2.4 ml) containing 10% FBS and 5% P/S was added to the lower chamber.
상기 DMEM/F12 배양액을 넣고 배양을 시작한 후 약 3 내지 7일이 경과하자, 상부 챔버에 구 형상의 세포들이 관찰됨을 확인하였다. 상기 관찰된 구 형상의 세포를 수득하여 암 오가노이드를 분리하였다.About 3 to 7 days after adding the DMEM/F12 culture medium and starting the culture, it was confirmed that spherical cells were observed in the upper chamber. The observed spherical cells were obtained and cancer organoids were isolated.
상기 DMEM/F12 배양액을 넣고 배양을 시작한 후 약 7일이 경과하자, 하부 챔버에 세포들이 관찰됨을 확인하였다. 상기 관찰된 세포를 수득하여 암연관섬유모세포(cancer associated fibroblast, CAF)인지 확인 및 분리하였다. About 7 days after adding the DMEM/F12 culture medium and starting the culture, it was confirmed that cells were observed in the lower chamber. The observed cells were obtained, confirmed to be cancer associated fibroblasts (CAF), and isolated.
1.4 암 오가노이드 배양1.4 Cancer organoid culture
상기 실시예 1.2에서 1차적으로 수득한 암 오가노이드를 일반적인 매트리겔 드랍(Matrigel drop) 배양 방식(Nat Commun. 2019 Sep 5;10(1):3991)을 이용하여 지속 배양하였다.The cancer organoids initially obtained in Example 1.2 were continuously cultured using the general Matrigel drop culture method (Nat Commun. 2019 Sep 5;10(1):3991).
실험예 1. 종양침윤성림프구 분리 확인Experimental Example 1. Confirmation of tumor infiltrating lymphocyte isolation
상기 실시예 1.3에서 분리된 세포가 종양침윤성림프구에 해당하는지 여부를 확인하기 위해, 상기 분리된 세포에서도 종양침윤성림프구의 바이오마커인 CD4+ 및 CD8+의 발현 여부를 확인하고 그 결과를 도 3에 나타내었다.In order to confirm whether the cells isolated in Example 1.3 correspond to tumor-infiltrating lymphocytes, the expression of CD4+ and CD8+, which are biomarkers of tumor-infiltrating lymphocytes, was also checked in the isolated cells, and the results are shown in Figure 3. .
구체적으로, 하부 챔버에서 1차로 수득된 세포들을 DPBS를 이용하여 세척한 후, EpCAM, CD45, CD19, CD3, 및 CD8 항체로 염색하였다. 염색 후, 유세포분석기를 통해 상기 세포들의 염색 정도를 분석하고 Leucocyte 마커인 CD45 항체로 염색이 되지 못한 세포들을 분리하였다. 상기 CD45로 염색되지 못한 세포들 중 상피세포 마커인 EpCAM로 염색된 세포가 있는지 여부를 확인하고, 이를 통해, 하부 챔버에서 1차적으로 수득된 세포들이 Leucocyte임을 확인하였다. 그 후, Leucocyte로 확인된 세포들이 구체적으로 어떤 Leucocyte인지 확인하기 위해 CD3 항체 (T-cell 마커)와 CD19 항체 (B-cell 마커)의 염색 정도를 확인하였다. T-cell의 종류를 더 구체적으로 확인하기 위해 CD3 항체에 염색되면서 CD19에는 염색이 안되는 세포들을 구분하여 CD8 항체 (CD8 T-cell 마커)의 염색 정도를 확인하였다. 그 결과, CD8 항체로 염색되는 부분은 세포독성 T-cell이고, 염색되지 않는 부분은 헬퍼 T-cell임을 확인하였다.Specifically, the cells initially obtained from the lower chamber were washed using DPBS and then stained with EpCAM, CD45, CD19, CD3, and CD8 antibodies. After staining, the degree of staining of the cells was analyzed using a flow cytometer, and cells that were not stained with CD45 antibody, a leucocyte marker, were separated. Among the cells that were not stained with CD45, it was confirmed whether there were cells stained with EpCAM, an epithelial cell marker, and through this, it was confirmed that the cells primarily obtained from the lower chamber were leucocytes. Afterwards, the staining levels of CD3 antibody (T-cell marker) and CD19 antibody (B-cell marker) were checked to confirm specifically what type of leucocyte the cells identified as leucocytes were. To confirm the type of T-cell more specifically, cells stained with CD3 antibody but not CD19 were identified and the degree of staining with CD8 antibody (CD8 T-cell marker) was checked. As a result, it was confirmed that the area stained with CD8 antibody was cytotoxic T-cell, and the area not stained was helper T-cell.
도 3은 1차로 하부 챔버에 모아진 세포가 종양침윤성림프구임을 확인한 이미지 및 그래프이다:Figure 3 is an image and graph confirming that the cells initially collected in the lower chamber were tumor infiltrating lymphocytes:
도 3a는 1차로 하부 챔버에 모아진 세포를 관찰한 이미지이고, 도 3b는 하부 챔버에 모아진 세포를 수득하고 상기 수득한 세포에서 종양침윤성림프구의 바이오마커인 CD4+ 및 CD8+의 발현 여부를 확인한 그래프이다.Figure 3a is an image of cells first collected in the lower chamber, and Figure 3b is a graph showing the cells collected in the lower chamber and the expression of CD4+ and CD8+, biomarkers of tumor infiltrating lymphocytes, in the obtained cells.
실험예 2. 암연관섬유모세포 분리 확인Experimental Example 2. Confirmation of isolation of cancer-related fibroblasts
상기 실시예 1.3에서 분리된 세포가 암연관섬유모세포에 해당하는지 여부를 확인하기 위해, 상기 분리된 세포에서 암연관섬유모세포의 바이오마커인 Prrx1, 및 Vimentin의 발현 여부를 확인하고 그 결과를 도 4에 나타내었다.In order to confirm whether the cells isolated in Example 1.3 correspond to cancer-related fibroblasts, the expression of Prrx1 and Vimentin, which are biomarkers of cancer-related fibroblasts, were checked in the isolated cells, and the results are shown in Figure 4 shown in
구체적으로, 하부 챔버에서 1차적으로 수득된 세포를 모두 제거한 후, 하부 챔버의 배양액을 10 % FBS가 포함된 DMEM/F12로 교체하였다. 교체 후 약 7일이 경과하자 하부 챔버에서 세포가 관찰됨을 확인하였다. 상기 관찰된 세포들이 하부 챔버의 80 % 이상을 채울 때, 2차적으로 하부 챔버에서 세포를 수득하였다. 상기 2차적으로 수득된 세포 중 일부는 동정을 위해 사용하고 나머지는 냉동 상태로 보관하였다. 2차적으로 수득된 세포를 슬라이드 글라스재질의 Leb-tek 챔버에서 재배양하고, 상기 Leb-tek 챔버에 세포가 안정적으로 안착되고 PanCK 항체 (상피세포 마커), Pxxr1 항체 (CAF 마커) 및 Vimentin 항체 (fibroblast 마커)로 세포를 염색하였다. 그 후, 면역형광현미경으로 염색 정도를 분석하였다. Specifically, after removing all cells primarily obtained from the lower chamber, the culture medium in the lower chamber was replaced with DMEM/F12 containing 10% FBS. About 7 days after replacement, cells were confirmed to be observed in the lower chamber. When the observed cells filled more than 80% of the lower chamber, cells were secondarily obtained from the lower chamber. Some of the secondary obtained cells were used for identification and the rest were stored in a frozen state. The secondary obtained cells were re-cultured in a Leb-tek chamber made of glass slide, and the cells were stably settled in the Leb-tek chamber, and PanCK antibody (epithelial cell marker), Pxxr1 antibody (CAF marker), and Vimentin antibody ( Cells were stained with fibroblast marker). Afterwards, the degree of staining was analyzed using an immunofluorescence microscope.
도 4는 2차로 하부 챔버에 모아진 세포가 암 연관 섬유모세포임을 확인한 이미지이다:Figure 4 is an image confirming that the cells collected in the second lower chamber are cancer-related fibroblasts:
도 4a는 2차로 하부 챔버에 모아진 세포를 관찰한 이미지이고, 도 4b는 하부 챔버에 모아진 세포를 수득하고 상기 수득한 세포에서 암 연관 섬유모세포의 바이오마커인 Prrx1, 및 Vimentin의 발현 여부를 확인한 이미지이다.Figure 4a is an image of observing cells secondarily collected in the lower chamber, and Figure 4b is an image of obtaining cells collected in the lower chamber and confirming the expression of Prrx1 and Vimentin, biomarkers of cancer-related fibroblasts, in the obtained cells. am.
도 4에 나타낸 바와 같이, 2차로 하부 챔버에 모아진 세포는 PanCK의 염색정도가 약하면서 Prrx1, 및 Vimentin가 강하게 발현되는 것을 확인하였다. 이를 통해, 상기 2차로 하부 챔버에 모아진 세포는 암연관섬유모세포임을 확인하였다. As shown in Figure 4, it was confirmed that the cells collected secondarily in the lower chamber showed weak staining of PanCK and strong expression of Prrx1 and Vimentin. Through this, it was confirmed that the cells collected in the secondary lower chamber were cancer-related fibroblasts.
실험예 3. 암 세포 분리 및 배양Experimental Example 3. Cancer cell isolation and culture
상기 실시예 1.2를 통해 1차적으로 배양된 암 오가노이드를 차가운 DPBS를 이용하여 수득하였다. 이후 원심분리기를 이용하여 암 오가노이드를 수득할 때 섞인 마트리겔을 오가노이드와 분리한 후, 새로운 마트리겔과 혼합하여 세포배양플레이트에 드롭 형식으로 분주하였다. 이 후, 일반적인 매트리겔 드랍(Matrigel drop) 배양 방식(Nat Commun. 2019 Sep 5;10(1):3991)을 이용하여 암 오가노이드를 지속 배양하였다. 상기 배양한 암 오가노이드가 상피세포 기원 고형 암세포가 맞는지 확인하기 위해 상피세포 마커인 PanCK의 발현 여부 및 함께 공배양될 가능성이 있는 섬유아세포의 마커인 Vimentin의 발현 여부를 함께 분석하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.Cancer organoids primarily cultured through Example 1.2 were obtained using cold DPBS. Afterwards, when cancer organoids were obtained using a centrifuge, the mixed Matrigel was separated from the organoids, then mixed with new Matrigel and dispensed in a drop format on a cell culture plate. Afterwards, cancer organoids were continuously cultured using the general Matrigel drop culture method (Nat Commun. 2019 Sep 5;10(1):3991). In order to confirm whether the cultured cancer organoids were solid cancer cells of epithelial cell origin, the expression of PanCK, an epithelial cell marker, and Vimentin, a marker of fibroblasts that may be co-cultured, were analyzed together, and the results were reported. It is shown in Figure 5.
도 5는 상부 챔버에 존재하는 세포가 암 오가노이드임을 확인한 이미지이다:Figure 5 is an image confirming that the cells present in the upper chamber are cancer organoids:
도 5a는 상부 챔버에 배양된 암 오가노이드를 관찰한 이미지 및 상기 오가노이드들을 수득하여 마트리겔 드랍 배양 방식으로 지속 배양한 이미지이고, 도 5b는 상기 배양된 오가노이드가 고형 암 세포임을 확인하기 위해 상피 세포 바이오마커인 PanCK의 발현 여부를 확인한 이미지이다.Figure 5a is an image observing cancer organoids cultured in the upper chamber and the organoids were obtained and continuously cultured using Matrigel drop culture, and Figure 5b is an image showing the cultured organoids to confirm that they are solid cancer cells. This image confirms the expression of PanCK, an epithelial cell biomarker.
도 5에 나타낸 바와 같이, 상부 챔버에 존재하는 세포에서 상피세포 마커인 PanCK의 발현이 섬유아세포의 마커인 Vimentin 발현보다 월등히 높음을 확인하였다. 이는 상부 챔버에는 암 오가노이드가 배양되고 있음을 의미한다.As shown in Figure 5, it was confirmed that the expression of PanCK, an epithelial cell marker, in cells present in the upper chamber was significantly higher than the expression of Vimentin, a fibroblast marker. This means that cancer organoids are being cultured in the upper chamber.
실험예 4. 트랜스웰 배양 시스템을 이용한 암 오가노이드 배양 효과 확인Experimental Example 4. Confirmation of cancer organoid culture effect using transwell culture system
트랜스웰 배양 시스템을 이용함에 따른 암 오가노이드 배양 효과를 확인하였다. 이에 대한 대조군으로 일반적으로 암 오가노이드 제작에 사용되는 매트리겔 드랍 배양 방식을 사용하여 조직으로부터 암 오가노이드를 배양하였다. The effect of cancer organoid culture using the transwell culture system was confirmed. As a control, cancer organoids were cultured from tissues using the Matrigel drop culture method, which is generally used to produce cancer organoids.
그 결과 트랜스웰 배양 시스템을 통해 암 세포를 상부 챔버에서 암 오가노이드로 형성시킨 후, 다시 마트리겔 드랍 배양 방식을 사용하여 지속 배양하는 경우, 암 오가노이드 배양 성공률이 대조군 대비 현저히 상승함을 확인하였다. 그리고 그 결과를 도 6에 나타내었다.As a result, it was confirmed that when cancer cells were formed into cancer organoids in the upper chamber through the transwell culture system and then continuously cultured using the Matrigel drop culture method, the success rate of cancer organoid culture increased significantly compared to the control group. . And the results are shown in Figure 6.
도 6은 트랜스웰 배양 시스템을 이용한 암 오가노이드 배양 효율을 매트리겔 드랍 배양 방식만을 이용한 암 오가노이드 배양 효율과 비교하여 나타낸 이미지이다:Figure 6 is an image showing the cancer organoid culture efficiency using the transwell culture system compared to the cancer organoid culture efficiency using only the Matrigel drop culture method:
도 6a는 조직으로부터 매트리겔 드랍 방식을 이용하여 암 오가노이드를 배양하는 경우 시간의 경과에 따른 암 오가노이드 형성 여부를 나타낸 이미지이고, 도 6b는 트랜스웰 배양 시스템을 이용하여 암 오가노이드를 형성시킨 후 마트리겔 드롭 방식으로 지속 배양했을 시, 시간의 경과에 따른 암 오가노이드 형성 여부를 나타낸 이미지이다.Figure 6a is an image showing the formation of cancer organoids over time when culturing cancer organoids from tissue using the Matrigel drop method, and Figure 6b is an image showing the formation of cancer organoids using a transwell culture system. This image shows the formation of cancer organoids over time when continuously cultured using the Matrigel drop method.
Claims (17)
상기 배양된 암세포 혼합물 중 암미세환경(tumor microenvironment, TME)인자가 상기 상부 챔버의 다공성 표면에 의해 제2 배지가 첨가된 하부 챔버로 이동하는 단계로서, 상기 다공성 표면은 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 또는 이의 유사체가 개질된 것인 단계; 및
상기 암미세환경인자로부터 섬유모세포 또는 면역세포를 분리하는 단계를 포함하는 암 조직으로부터 암 오가노이드 및 암미세환경인자를 분리 및 배양하는 방법. Culturing the separated cancer cell mixture in an upper chamber to which a first medium is added;
A step in which tumor microenvironment (TME) factors in the cultured cancer cell mixture move to the lower chamber to which a second medium is added by the porous surface of the upper chamber, wherein the porous surface is an extracellular matrix (extracellular matrix, ECM) or a modified analog thereof; and
A method of isolating and culturing cancer organoids and cancer microenvironment factors from cancer tissue, comprising the step of isolating fibroblasts or immune cells from the cancer microenvironment factors.
상기 암 조직으로부터 암 오가노이드 및 암미세환경인자를 분리하는 단계는 세포의 크기 및 이동속도의 차이를 이용하여 분리하는 것인, 분리 및 배양하는 방법.In claim 1,
The separation and culture method of separating cancer organoids and cancer microenvironment factors from the cancer tissue using differences in cell size and migration speed.
상기 세포외기질 또는 그 유사체는 젤라틴성 단백질 혼합물인 것인, 분리 및 배양하는 방법.In claim 1,
A method of separating and culturing the extracellular matrix or its analogue, wherein the extracellular matrix is a gelatinous protein mixture.
상기 젤라틴성 단백질 혼합물은 하이드로겔인 것인, 분리 및 배양하는 방법.In claim 3,
A method of separating and culturing the gelatinous protein mixture, wherein the gelatinous protein mixture is a hydrogel.
상기 하이드로겔은 매트리겔(matrigel), 피브린겔(fibrin gel), 콜라겐(collagen), 아가로스겔(agarose), 알지네이트(alginate), HEMA겔 또는 이들의 혼합물인 것인, 분리 및 배양하는 방법.In claim 4,
The hydrogel is matrigel, fibrin gel, collagen, agarose gel, alginate, HEMA gel, or a mixture thereof.
상기 매트리겔이 개질된 상부 챔버의 다공성 표면은 2 ℃ 내지 10 ℃의 온도에서 매트리겔을 상부 챔버의 다공성 표면을 도포하는 단계; 및
상기 매트리겔이 도포된 상부 챔버를 30 ℃ 내지 40 ℃의 온도에서 보관하는 단계를 포함하는 방법으로 개질되는 것인, 분리 및 배양하는 방법.In claim 5,
The step of applying Matrigel to the porous surface of the upper chamber where the Matrigel has been modified at a temperature of 2° C. to 10° C.; and
A method of separation and culture, which is modified by a method comprising the step of storing the upper chamber to which the Matrigel is applied at a temperature of 30 ℃ to 40 ℃.
상기 방법은 상기 제1 배지가 첨가된 상부 챔버의 내측에 남아있는 암 오가노이드를 분리하는 단계를 포함하는 것인, 분리 및 배양하는 방법.In claim 1,
The method includes the step of isolating cancer organoids remaining inside the upper chamber to which the first medium was added.
상기 방법은 상기 제1 배지가 첨가된 상부 챔버의 내측에 남아있는 암 오가노이드를 배양하는 단계를 포함하는 것인, 분리 및 배양하는 방법.In claim 1,
The method includes culturing the cancer organoids remaining inside the upper chamber to which the first medium was added.
상기 방법은 상기 제2 배지가 첨가된 하부 챔버로 이동한 면역세포를 분리하는 단계를 포함하는 것인, 분리 및 배양하는 방법.In claim 1,
The method includes the step of isolating immune cells that have migrated to the lower chamber to which the second medium is added.
상기 방법은 상기 제2 배지가 첨가된 하부 챔버로 이동한 면역세포를 배양하는 단계를 포함하는 것인, 분리 및 배양하는 방법.In claim 1,
The method includes the step of culturing the immune cells that have migrated to the lower chamber to which the second medium is added.
상기 방법은 상기 하부 챔버 상의 제2배지를 제거하는 단계; 상기 제2배지가 제거된 하부 챔버에 제3배지를 첨가하는 단계; 및 상기 상부 챔버의 외측에 개질된 세포외기질에서 상기 제3배지가 첨가된 하부 챔버로 이동한 섬유모세포를 분리하는 단계를 포함하는 것인, 분리 및 배양하는 방법.In claim 1,
The method includes removing the second medium on the lower chamber; adding a third medium to the lower chamber from which the second medium was removed; And separating fibroblasts that have migrated to the lower chamber to which the third medium is added from the extracellular matrix modified on the outside of the upper chamber.
상기 방법은 상기 하부 챔버 상의 제2배지를 제거하는 단계; 상기 제2배지가 제거된 하부 챔버에 제3배지를 첨가하는 단계; 및 상기 상부 챔버의 외측에 개질된 세포외기질에서 상기 제3배지가 첨가된 하부 챔버로 이동한 섬유모세포를 배양하는 단계를 포함하는 것인, 분리 및 배양하는 방법.In claim 1,
The method includes removing the second medium on the lower chamber; adding a third medium to the lower chamber from which the second medium was removed; And culturing the fibroblasts that have migrated from the extracellular matrix modified to the outside of the upper chamber to the lower chamber to which the third medium is added.
상기 제2 배지는 8 내지 12 %의 FBS 및 1 내지 7 %의 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, P/S)을 포함하는 RPMI인 것인, 분리 및 배양하는 방법.In claim 1,
Wherein the second medium is RPMI containing 8 to 12% FBS and 1 to 7% penicillin/streptomycin (P/S).
상기 제3 배지는 8 내지 12 %의 FBS, 및 1 내지 7 %의 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, P/S)을 포함하는 DMEM/F12인 것인, 분리 및 배양하는 방법.In claim 12,
The third medium is DMEM/F12 containing 8 to 12% FBS and 1 to 7% penicillin/streptomycin (P/S).
상기 암조직은 간암조직, 유방암조직, 대장암조직, 두경부암조직, 폐암조직, 위암조직, 피부암조직, 결장암조직, 전립선암조직, 방광암조직, 신장암조직, 직장암조직, 갑상선암조직, 자궁경부암조직, 피부암조직, 직장암조직, 항문암조직, 요도암조직, 난소암조직, 식도암조직 및 췌장암조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 분리 및 배양하는 방법.In claim 1,
The cancer tissues include liver cancer tissue, breast cancer tissue, colon cancer tissue, head and neck cancer tissue, lung cancer tissue, stomach cancer tissue, skin cancer tissue, colon cancer tissue, prostate cancer tissue, bladder cancer tissue, kidney cancer tissue, rectal cancer tissue, thyroid cancer tissue, and cervical cancer tissue. , a method of separating and culturing any one selected from the group consisting of skin cancer tissue, rectal cancer tissue, anal cancer tissue, urethral cancer tissue, ovarian cancer tissue, esophageal cancer tissue, and pancreatic cancer tissue.
상기 섬유모세포는 암연관섬유모세포(cancer associated fibroblast, CAF)이고,
상기 면역세포는 종양 침윤 림프구(tumor infiltrating lymphocyte, TIL), T 세포, 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL), B 세포, NK 세포, 단핵 식세포, α/β 수용체 T-세포 및 γ/δ 수용체 T 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 분리 및 배양하는 방법.In claim 1,
The fibroblasts are cancer associated fibroblasts (CAF),
The immune cells include tumor infiltrating lymphocytes (TIL), T cells, cytotoxic T lymphocytes (CTL), B cells, NK cells, mononuclear phagocytes, α/β receptor T-cells, and γ/δ A method of isolating and culturing at least one selected from the group consisting of receptor T cells.
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2022
- 2022-07-14 KR KR1020220087236A patent/KR20240009827A/en unknown
Non-Patent Citations (3)
| Title |
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| Bric view 2019-T05 |
| Cancer Sci. 2020 Apr;111(4):1047-1057 |
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