KR20240009564A - 수면지속시간 개선용 동물사료 조성물 및 동물사료 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 부작용이 문제될 가능성이 낮은 천연물 소재를 이용한 감탕나무(Ilex integra Thunb.) 잎 추출물을 포함하는 스트레스 예방 및 멜라토닌 분비촉진용 동물 사료 조성물 및 사료를 제공함으로써, 동물의 스트레스를 감소시키고 운동활성을 감소시켜 스트레스 시기의 동물 사육효율을 증가시킬 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 부작용이 문제될 가능성이 낮은 천연물 소재를 이용한 동물의 스트레스 예방 및 멜라토닌 분비촉진용 사료 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 감탕나무(Ilex integra Thunb.) 잎 추출물을 포함하는 스트레스 예방 및 멜라토닌 분비촉진용 동물사료 및 동물사료 조성물에 관한 것이다.
소득의 증가와 고급화된 식생활의 영향으로 사육 동물에 대한 소비는 계속 증가하고 있다. 소비자들은 사육된 동물을 대량으로 수요하고 있을 뿐만 아니라 건강한 먹거리를 위한 고품질의 사육 동물을 선호하고 있어 사육시스템도 대형화가 되고 있다.
통상적으로 소비자들에게 공급되는 사육 동물은 요구되는 수요량을 맞추기 위해 단시간에 따른 대량생산이 이루어져야 한다. 이에 사육 동물에 성장호르몬의 투여 및 고밀도 사육이 실시되는 공장형 사육시스템이 발달되었고, 항생제 잔류 및 내성문제, 사육동물의 질병, 환경문제 등에 의해 여러 문제가 발생하면서 안전한 먹거리를 위한 사육시스템이 필요하다.
그러나, 수요에 따른 생산량을 맞추는 경제적인 이슈도 무시할 수는 없다. 이와 같은 밀집사육으로 동물의 스트레스가 증가하고 심각한 질병에 노출되기 쉬워진다. 동물도 고통과 스트레스를 받으면 두려움, 불안, 좌절 및 기쁨 등을 느낀다라는 동물복지라는 개념으로부터 사육 동물의 스트레스 관리에 따라 고품질의 사육 동물 생산방법이 강구되고 있다.
스트레스란 항상성과 개체의 균을 무너뜨리는 육체적, 정신적 변화로서 스트레스를 유발하는 요인은 소음, 강력한 빛, 열, 한정된 공간과 같은 물리적 환경, 무례함, 명령, 타인과의 충돌과 같은 사회적 관계 등 매우 다양하나 동물에 있어 움직임과 호전성을 제한하는 구금 스트레스는 정신적 유체적 스트레스를 동시에 유발하는 것으로 알려져 있다.
스트레스 유발 자극은 제일 먼저 상위 뇌조직인 대뇌피질 변연계에서 접수하여 과거 경험과 기억력을 동원하여 해석하고 대뇌피질 변연계는 인지기능과 예측현상을 관장하는 대뇌전두엽피질, 기억을 관장하는 해마, 정서를 관장하는 편도 및 행동 반응을 조절하는 중격으로 구성된다.
인지된 자극이 이 부분들에서 스트레스로 인식되면 신경내부빈 적응계인 시상하부의 CRH세포, 뇌간에서 locus ceruleus의 norepinephrine 이외의 세로토닌, 도파민, 베타엔돌핀등 신경전달물질 또는 신경호르몬들과 사이토카인 분비세포들이 활성화된다.
시상하부에서 분비된 CRH는 뇌하수체 전엽을 자극하여 ACTH를 분비하고 이는 부신피질을 자극하여 코르티솔을 분비하게 되며 이러한 스트레스 반응에서 생성된 스트레스 호르몬들이 말초 기관인 심장혈관계, 면역계, 내분비계 등 기관에 여러 생리적 반응을 유발하게 되는 것이다.
동물 스트레스는 환경적인 스트레스를 유발하여 생산성 저하, 혈류량 감소로 인해 장관 내 소화물의 정체로 불규칙적인 섭취 혹은 사료 섭취량이 감소함으로써 영양 상태 불량이 발생하여 체중이 미달되며, 번식 관련 호르몬 분비 감소로 생산성 감소로 이어진다.
이에 동물 스트레스를 저감할 수 있는 물질을 가축사양에 이용함으로서 다양한 스트레스 요인에 의한 사육 효율 저하에 대처할 수 있는 방안이 있다. 그러나 화학적 합성 물질은 여러 부작용을 야기할 수 있어 부작용이 문제될 가능성이 낮은 천연물 유래로 우울증에 대해 장기적이고 효과적으로 치료할 수 있는 스트레스 저감용 동물사료 제제의 개발이 요구된다.
한편, 감탕나무(Ilex integra Thunb.)는 감탕나무과의 상록 활엽 소교목으로우리나라 전라남도, 경상남도, 제주도 등지의 바닷가 산기슭에 자생하고 있다. 감탕나무는 껍질을 찧어 물에 담가 두면 아교나 송진처럼 끈끈한 감탕이 된다고 해서 붙여진 이름이다. 예전에는 감탕나무 껍질과 잎을 약재로 사용하였으나 요즘은 짙은 녹색의 잎사귀와 열매가 아름다워서 관상용으로 많이 재배되고 있다. 감탕나무의 효능은 항균작용, 화상치료, 요로감염 치료에 사용되어 왔다고 전해지고 있다.
이에 본 발명은 기존의 화학적인 물질 주입으로 인해 경제적인 동물 생산을 통해 발생하는 부작용을 방지할 수 있도록 천연물을 원료로 하고 경제성 있는 동물 생산이 가능한 스트레스 예방 및 멜라토닌 분비촉진용 동물 사료 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 우리나라의 천연 식물자원을 활용할 목적으로 천연원료인 감탕나무(Ilexintegra Thunb.)를 이용하여 독성 및 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있는 감탕나무(ILEX INTEGRA THUNB.) 잎 추출물을 포함하는 스트레스 예방 및 멜라토닌 분비촉진용 동물 사료 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 트레스 예방 및 멜라토닌 분비촉진용 동물 사료 조성물은 감탕나무(ILEX INTEGRA THUNB.) 잎 추출물을 포함하는 것일 수 있다.
상기 감탕나무(ILEX INTEGRA THUNB.) 잎 추출물은 물, 에탄올, 메탄올 이들의 혼합물로 추출된 것 중에서 선택되는 1종 이상을 추출용매로 가용한 추출물인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 스트레스 예방 및 멜라토닌 분비촉진용 동물 사료는 스트레스 예방 및 멜라토닌 분비촉진용 동물 사료 조성물이 0.01 내지 99.9 중량%의 양으로 포함되는 것일 수 있다.
감탕나무(Ilex integra Thunb.) 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 만성 구속스트레스로 유도된 생쥐의 해마 (HC)와 전전두피질 (PFC)에서 ERK 및 AKT에 대한 단백질 발현 수준이 control군에 비해 구속스트레스군 (CRS)에서 감소하였고, p-ERK 및 p-AKT 단백질 발현이 증가시킴으로서 스트레스성 질환의 예방 또는 멜라토닌 분비촉진 효과를 갖는다.
또한, 감탕나무 잎 열수 추출물 (IIW)을 투여한 마우스 실험군에서 대조군(Control)과 비교하여 입면시간이 유의적으로 감소하였고 수면 지속시간이 유의적으로 증가되었으며, 혈액 내의 멜라토닌 분비촉진으로 운동활성(locomotor activity)을 감소, 제어시키는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 사용된 감탕나무 잎 원물 및 열수 추출물을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 감탕나무 잎 추출물이 만성 구속스트레스로 유도된 생쥐에서 forced swimming test (FST)에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 감탕나무 잎 열수추출물이 만성 구속스트레스로 유도된 생쥐에서 open field test (OFT) 에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 감탕나무 잎 추출물이 만성 구속스트레스로 유도된 생쥐에서 스트레스 호르몬 수준에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 감탕나무 잎 추출물이 만성 구속스트레스로 유도된 생쥐의 해마(hippocampus, HC)와 전전두피질 (prefrontal cortex, PFC) 부위에서 신경전달물질인 세로토닌 (serotonin), 노르에피네프린 (norepinephrine), 도파민 (dopamine) 수준에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 감탕나무 잎 추출물이 만성 구속스트레스로 유도된 생쥐의 해마 (HC)와 전전두피질 (PFC)에서 ERK 및 AKT에 대한 단백질 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 감탕나무 잎 추출물이 만성 구속스트레스로 유도된 생쥐의 해마 (HC)와 전전두피질 (PFC)에서 ERK 및 AKT에 대한 단백질 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 마우스를 이용하여 감탕나무 잎 열수 추출물을 투여 시 입면시간을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 마우스를 이용하여 감탕나무 잎 열수 추출물을 투여 시 수면 지속시간을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 마우스를 이용하여 감탕나무 잎 열수 추출물을 투여 시 운동 활동을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 마우스를 이용하여 감탕나무 잎 열수 추출물을 투여 시 혈청 멜라토닌 함량 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 감탕나무 잎 추출물이 만성 구속스트레스로 유도된 생쥐에서 forced swimming test (FST)에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 감탕나무 잎 열수추출물이 만성 구속스트레스로 유도된 생쥐에서 open field test (OFT) 에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 감탕나무 잎 추출물이 만성 구속스트레스로 유도된 생쥐에서 스트레스 호르몬 수준에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 감탕나무 잎 추출물이 만성 구속스트레스로 유도된 생쥐의 해마(hippocampus, HC)와 전전두피질 (prefrontal cortex, PFC) 부위에서 신경전달물질인 세로토닌 (serotonin), 노르에피네프린 (norepinephrine), 도파민 (dopamine) 수준에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 감탕나무 잎 추출물이 만성 구속스트레스로 유도된 생쥐의 해마 (HC)와 전전두피질 (PFC)에서 ERK 및 AKT에 대한 단백질 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 감탕나무 잎 추출물이 만성 구속스트레스로 유도된 생쥐의 해마 (HC)와 전전두피질 (PFC)에서 ERK 및 AKT에 대한 단백질 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 마우스를 이용하여 감탕나무 잎 열수 추출물을 투여 시 입면시간을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 마우스를 이용하여 감탕나무 잎 열수 추출물을 투여 시 수면 지속시간을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 마우스를 이용하여 감탕나무 잎 열수 추출물을 투여 시 운동 활동을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 마우스를 이용하여 감탕나무 잎 열수 추출물을 투여 시 혈청 멜라토닌 함량 변화를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 감탕나무(ILEX INTEGRA THUNB.) 잎 추출물을 포함하는 스트레스 예방 및 멜라토닌 분비촉진용 동물 사료 조성물을 제공하고자 한다. 상기 감탕나무(ILEX INTEGRA THUNB.) 잎 추출물은 물, 에탄올, 메탄올 이들의 혼합물로 추출된 것 중에서 선택되는 1종 이상을 추출용매로 가용한 추출물인 것일 수 있다.
본 발명의 감탕나무(ILEX INTEGRA THUNB.) 잎 추출물을 포함하는 스트레스 예방 및 멜라토닌 분비촉진용 동물 사료 조성물은 감탕나무(Ilex integra Thunb.) 잎 추출물을 포함하는 조성물이 0.01 내지 99.9 중량%의 양으로 포함되는 것일 수 있다.
본 발명에서 지칭하는 스트레스는 사육 동물에게서 발생하는 이동 스트레스, 고립스트레스, 사육환경 스트레스, 질병 스트레스, 사료 스트레스, 사양스트레스 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
이하, 본 발명의 감탕나무(ILEX INTEGRA THUNB.) 잎 추출물을 포함하는 스트레스 예방 및 멜라토닌 분비촉진용 동물 사료 조성물과 관련한 실험예를 들어 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 실험예는 감탕나무 잎 추출물을 만성 구속스트레스로 유도된 생쥐의 해마 (HC)와 전전두피질 (PFC)에서 ERK 및 AKT에 대한 단백질 발현을 확인하고자 하였고, 그 결과 해마(HC)와 전전두피질 (PFC)부위에서 인산화된 ERK 및 AKT 단백질 발현 수준이 control군에 비해 구속스트레스군 (CRS)에서 감소하는 경향을 확인하였고, p-ERK 및 p-AKT 단백질 발현이 증가하는 경향을 확인함으로서 감탕나무(Ilexintegra Thunb.) 추출물이 스트레스 예방 효과가 있음을 확인하였다.
또 다른 실험예에 따르면, 감탕나무 잎 열수 추출물 (IIW)을 투여한 마우스 실험군에서 대조군(Control)과 비교하여 입면시간이 유의적으로 감소하였고 수면지속시간이 유의적으로 증가되었으며, 운동 활동 (locomotor activity)이 감소와 더불어 혈액 내의 멜라토닌 함량을 증가시킴으로써 멜라토닌 분비촉진 효과가 있음을 확인함으로써 감탕나무(Ilex integra Thunb.) 추출물이 멜라토닌 분비촉진 효과가 있음을 확인하였다.
<실험예 1> 감탕나무 잎 열수 추출물의 제조
감탕나무 잎 100 g을 증류수 2 L를 가하고, 환류추출기를 이용하여 100℃에서 3시간 동안 가열하여 추출하였다. 상기 추출된 열수 추출물을 감압 농축 및 동결 건조하여 16.3 g을 얻었다. 도 1은 본 발명의 사용된 감탕나무 잎 원물 및 열수 추출물을 나타낸 것이다.
동일한 과정을 통해 클로로포름 (chloroform), 에틸아세테이트 (ethyl acetate), 부탄올(butanol)을 순차적으로 가하여 각 분획물을 얻었고, 얻어진 각각의 분획물을 감압여과 장치로 여과하여 농축한 후 동결건조하여 용매를 완전히 제거한 뒤 본 실험에 사용할 수 있다.
1-1. 핵산 가용성 분획 분리
감탕나무 잎 열수 추출물 40g을 lL의 증류수에 완전히 용해시킨 후에 분획 여두 깔대기에 넣고 헥산 1L를 첨가하여 헥산 불용성층(수층)과 헥산가용성층을 분리하였다. 다시 헥산 불용성층(수층)을 대상으로 동일한 공정을 3번 반복하여 헥산 불용성 분획 및 가용성 분획을 수집하였다.
1-2. 클로로포름 가용성 분획분리
핵산불용성 분획(수층)에 클로로포름 5L를 가하여 섞은 후에 클로로포름가용성 분획 및 불용성 분획을 분리하였고, 클로로포름 불용성층(수층)을 대상으로 동일한 공정을 3번 반복하여 클로로포름 불용성 분획 및 가용성 분획을 수집하였다.
1-3. 에틸아세테이트 가용성 분획분리
클로로포름 불용성 분획(수층)에 에틸아세테이트 5L를 가하여 섞은 후에 에틸아세테이트 가용성 분획 및 불용성 분획을 분리하였고, 에틸아세테이트 불용성층(수층)을 대상으로 동일한 공정을 3번 반복하여 에틸아세테이트 불용성 분획 및 가용성 분획를 수집하였다.
1-4. 부탄올 가용성 분획분리
에틸아세테이트 불용선 분획(수층)에 부탄올 5L를 가하여 섞은 후에 부탄올 가용성 분획 및 불용성 분획을 분리하였고, 부탄올 불용성층을 대상으로 동일한 공정을 3번 반복하여 부탄올 불용성 분획 및 가용성 분획을 수집하였다.
<실험예 2> 실험동물 및 사육
본 발명의 실험예 2에 따른 실험동물 및 사육은 실험동물로서 생후 6주령된 수컷 C57BL/6 마우스를 ㈜샘타코 (SAMTACO, Korea)부터 구입하여 동물 사육실에서 일정한 조건 (온도: 22±2℃, 습도:50±5%, 명암: 12시간 light/dark cycle)으로 일주일간 적응시킨 후 사용하였다.
<실험예 3> 감탕나무 잎 추출물을 이용한 만성 구속 스트레스 (Chronic restraint stress, CRS) 실험
3-1. 감탕나무 잎 추출물을 이용한 만성 구속 스트레스 (Chronic restraint stress, CRS)에서의 항우울 동물행동실험
만성 구속 스트레스 (CRS)는 3주간 하루 6시간 동안 (a.m 11시 ~ p.m 5시) 높이 20 cm, 직경 7 cm 의 아크릴 상자에 마우스를 넣어서 지속적인 구속 스트레스를부여하였다. 감탕나무 잎 추출물은 각 농도별로 매일 동일시간에 구속 스트레스를 주기 30분 전에 경구 투여하였으며, 대조군 (control)은 동일 부피의 saline을 투여하였고, 비교군으로는 항우울제로 사용되는 에스시탈로프람 옥살산염을 경구 투여하였다.
3주간의 구속 스트레스에 의한 자극이 끝난 다음 날에 동물 행동평가는 진행하였으며, Forced swimming test (FST)를 평가하기 전에 Open field test(OFT)를 먼저 측정하였다. FST 평가가 끝난 다음에 부검하여 전혈채취 및 적출한 뇌 조직은 해마 (hippocampus)와 전전두피질 (prefrontal cortex)로 바로 분리하여 -80℃에 보관하여 실험에 사용하였다.
Forced swimming test (FST)는 본 시험 (post-swim) 전날에 예비실험(pre-swim)으로 원통모양의 수조 (직경 20 cm, 높이 40 cm)에 25℃ 내외의 수돗물을 실린더 바닥에서부터 15 cm까지 부은 후, 생쥐를 집어넣고 15분간 강제로 수영을 시키고, 물에서 건져 올려 마른 수건으로 닦고 사육상자로 돌려보냈다.
본 시험 (post-swim)날 실린더에 생쥐를 넣고 6분 동안 강제 수영을 시행하면서 비디오 촬영을 하였다. 기록된 영상에서 최초 1분간을 제외하고, 나머지 5분 동안 동물의 행동을 3가지로 분류하여 분석하였는데, 동물이 얼굴을 포함한 상체의 일부분만 수면 위로 드러낸 채 약간의 움직임만 나타낼 뿐 물 위에 떠있는 행동 (부동자세, immobility behavior), 실린더 주위를 수평 방향으로 움직이면서 앞발과 뒷발을 물장구를 치는 행동 (수영, swimming behavior), 벽을 향해 앞발을 물 밖으로 차올리는 다소 격렬하게 움직이면서 벽을 긁는 행동(기어오르기, climbing behavior)으로 구분하여 각각의 시간을 측정하였다.
도 2는 본 발명의 감탕나무 잎 추출물이 만성 구속스트레스로 유도된 생쥐에서 forced swimming test (FST)에 대한 효과를 나타낸 그래프이다. 도 2에 도시된 바와 같이, 3주간 CRS 부여와 각각의 약물을 처치가 끝난 다음날에 FST를 시행한 결과, 부동시간은 control군 (198.17±2.34 초)과 비교하여 볼 때 구속스트레스군 (CRS)은 252.21±2.37 초, 양성대조군 에스시탈로프람 옥살산염 (EO 10mg/kg p.o)은 203.53±4.70 초, 감탕나무 잎 추출물 (I.I-100 및 200 mg/kg p.o)은 각각 230.85±4.71 초, 184.49±6.78 초로 감탕나무 잎 추출물 200 mg/kg 투여군에서 유의성 있는 감소를 확인하였다 (P < 0.01).
그리고 수영 시간은 control군 (96.66±2.70 초)과 비교하여 볼 때 구속 스트레스군은 45.86±4.29 초, 양성대조군 에스시탈로프람 옥살산염은 91.82±3.89 초, 감탕나무 잎 추출물 200 mg/kg에서 109.19±7.32 초로 유의성 있는 수영시간이 증가함을 확인하였다 (P < 0.01). 또한, 기어오르기 시간은 control군 (11.95±1.11 초)과 비교하여 볼 때 구속스트레스군은 6.60±0.48 초, 양성대고군 에스시탈로람 옥살산염은 15.14±1.66 초, 감탕나무 잎 추출물 (I.I-100 및 200 mg/kg p.o)은 각각 25.42±3.44 초, 14.81±2.15 초로 증가적인 경향을 확인하였다.
Open field test (OFT) 는 실험동물의 활동성을 측정하는 평가법으로 동물의 활동성이 약물의 항불안 및 항우울 작용에 미치는 효과를 확인하는 실험방법이다. OFT 박스는 바닥면에 25분획되어 있는 직경 60 cm x 높이 20 cm의 네모난 상자에 실험동물을 한 마리씩 넣어서 5분간 자발적으로 이동한 칸의 횟수를 측정하여 각 군마다 평균값을 이용하여 활동성을 비교하였다.
도 3은 본 발명의 감탕나무 잎 열수추출물이 만성 구속스트레스로 유도된 생쥐에서 open field test (OFT) 에 대한 효과를 나타낸 그래프이다. 도 3에 도시된 바와 같이, control군 (152.00±2.93 칸)에 비해 구속스트레스군 (CRS, 122.00±3.14 칸)에서 이동한 칸 횟수가 감소하였다.
이에 반해 양성대조군 에스시탈로프람과 감탕나무 잎 추출물 (I.I-100 및 200 mg/kg p.o)은 각각 166.00±3.51 칸, 153.50±3.11 칸, 144.20±2.54 칸으로 구속스트레스군보다 활동성이 증가함을 확인할 수 있었다. 상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 감탕나무 잎 추출물은 사지를 전혀움직이지 않는 부동시간을 감소시키므로 항우울 효과가 뛰어나게 관찰되었다.
3-2. 감탕나무 잎 추출물을 이용한 만성 구속 스트레스 (Chronic restraint stress, CRS)에서 혈청 내 스트레스 호르몬 측정
3주간 구속스트레스 자극과 약물 투여한 다음날, 생쥐로부터 혈청 (serum)을 분리하여 시상하부-뇌하수체-부신 축 (HPA axis) 조절과 연관되는 코르티코트로핀 방출호르몬 (corticotrophin releasing hormone, 이하 CRH), 부신피질자극호르몬 ( adrenocorticotropic hormone, 이하 ACTH) 및 스트레스호르몬인 코르티코스테론 (corticosterone, 이하 CORT)를 Abnova ELISA kit를 사용하여 제조사의 지시에 따라 측정하였다.
도 4는 본 발명의 감탕나무 잎 추출물이 만성 구속스트레스로 유도된 생쥐에서 스트레스 호르몬 수준에 대한 효과를 나타낸 그래프이다. 스트레스 호르몬인 코르티코스테론 수치를 확인한 결과, control군 (129.52±29.82 pg/ml)과 비교하여 구속스트레스군(CRS)에서 488.54±48.59 pg/ml로 유의적으로 증가하였으며, 그에 반해 양성대조군 에스시탈로프람 옥살산염은 156.77±27.00 pg/ml, 감탕나무 잎 추출물 (I.I-100 및 200 mg/kg p.o)은 각각 219.51±32.53 pg/ml, 101.63±28.73pg/ml으로 감탕나무 잎 200 mg/kg 투여군에서 유의적으로 감소됨을 확인하였다 (도 4A).
HPA axis 조절과 연관되는 CRH 및 ACTH 수준을 확인한 결과, 각 control군 (16.97±0.78 pg/ml 및 429.43±14.86 pg/ml)에 비하여 구속스트레스군에서 36.10±3.89 pg/ml 및 673.31±4.15 pg/ml으로 유의적으로 증가하였으며 (P < 0.01 and P < 0.001), 감탕나무 잎 추출물 200 mg/kg 투여군에서 19.99±0.72 pg/ml 및 514.90±15.06 pg/ml 으로 유의적으로 CRH 및 ACTH 수준을 감소시켰다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 감탕나무 잎 추출물은 만성 구속 스트레스에 의해 유발되는 HPA축 기능장애로 증가되는 CRH, ACTH 및 스트레스 호르몬인 corticosterone level을 유의적으로 감소시킴을 확인하였다.
3-3. 감탕나무 잎 추출물을 이용한 만성 구속 스트레스 (Chronic restraint stress, CRS) 에서의 해마 (hippocampus)와 전전두피질 (prefrontal cortex) 내 신경전달물질 측정
3주간 구속스트레스 자극과 약물 투여한 다음날, 적출한 뇌의 해마 (HC)와 전전두피질 (PFC)에서 신경전달물질 (serotonin, dopamine, norepinephrine)에 미치는 영향을 확인하였다.
도 5는 본 발명의 감탕나무 잎 추출물이 만성 구속스트레스로 유도된 생쥐의 해마(hippocampus, HC)와 전전두피질 (prefrontal cortex, PFC) 부위에서 신경전달물질인 세로토닌 (serotonin), 노르에피네프린 (norepinephrine), 도파민 (dopamine) 수준에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5에 도시된 바와 같이, 해마 (HC) 및 전전두피질 (PFC) 부위에서 신경전달물질 (serotonin, norepinephrine, dopamine) 수준은 control군에 비해 구속스트레스군 (CRS)에서 유의적으로 감소하는 경향을 확인할 수 있었다.
특히, 전전두피질 (PFC) 부위에서 감탕나무 잎 추출물 200 mg/kg 투여군이 CRS군과 비교하여 세로토닌, 노르에피네프린, 도파민 수준이 유의적으로 증가함을 확인하였다 (P < 0.05).
3-4. 감탕나무 잎 추출물을 이용한 만성 구속 스트레스 (Chronic restraint stress, CRS) 에서의 해마 (hippocampus)와 전전두피질 (prefrontal cortex)부위에서 ERK 및 AKT 단백질 발현 확인
3주간 구속스트레스 자극과 약물 투여한 다음날, 적출한 뇌의 해마 (HC)와 전전두피질 (PFC)에서 ERK 및 AKT에 대한 단백질 발현 수준에 미치는 영향을 확인하기 위하여 western blot 시험법을 실시하였다.
도 6과 7은 본 발명의 감탕나무 잎 추출물이 만성 구속스트레스로 유도된 생쥐의 해마 (HC)와 전전두피질 (PFC)에서 ERK 및 AKT에 대한 단백질 발현을 확인한 결과로 해마 (HC)와 전전두피질 (PFC)부위에서 인산화된 ERK 및 AKT 단백질 발현 수준이 control군에 비해 구속스트레스군 (CRS)에서 감소하는 경향을 확인할 수 있었으며, 감탕나무 잎 추출물 100 및 200 mg/kg 투여군 (I.I-100 및 200 mg/kg p.o)에서는 구속스트레스군과 비교하여 해마와 전전두피질 부위에서 p-ERK 및 p-AKT 단백질 발현이 증가하는 경향을 확인하였다.
<실험예 4> 감탕나무 잎 열수 추출물을 이용한 멜라토닌 분비촉진 확인 실험
4-1. ICR 마우스에서 감탕나무 잎 열수 추출물의 입면시간 및 수면 지속시간에 미치는 효과 확인
실험예 1에 따른 감탕나무 잎 열수 추출물은 50, 100, 200 mg/kg으로 실험예 2에 따른 동물에 7일 동안 경구 투여하였으며, 대조군 (control)은 동일 부피의 saline을 투여하였고, 양성대조군으로는 디아제팜(diazepam, Dia)을 2mg/kg b.w.으로 1회 투여하였다. 7일째에 감탕나무 잎 물 추출물을 경구투여 45분 후에 pentobaribital 45mg/kg을 복강주사한 다음 입면시간 및 수면 지속시간을 측정하였다.
입면시간은 상기 pentobaribital 투여 후 정향반사(Righting reflex)를 1분 이상 소실될 때까지의 시간을 말하며, 수면 지속시간은 정향반사가 소실될 때부터 정향반사가 회복될 때까지의 시간을 측정한 것이다.
도 8은 마우스를 이용하여 감탕나무 잎 열수 추출물을 투여 시 입면시간을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 감탕나무 잎 열수 추출물 (IIW)을 50, 100, 200mg/kg b.w.로 투여한 실험군에서 대조군(Control)과 비교하여 입면시간이 유의적으로 감소된 것을 확인하였다.
도 9는 마우스를 이용하여 감탕나무 잎 열수 추출물을 투여 시 수면 지속시간을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 감탕나무 잎 열수 추출물(IIW)을 50, 100, 200mg/kg b.w.로 투여한 실험군이 대조군(Control)과 비교하여 수면 지속시간이 유의적으로 증가되는 것을 확인하였다.
4-2. ICR 마우스에서 감탕나무 잎 열수 추출물의 Open field test 방법을 통한 운동활성(locomotor activity)에 미치는 효과 확인
Open field test (OFT) 는 실험동물의 활동성을 측정하는 평가법으로 OFT 박스는 바닥면에 25분획되어 있는 직경 60 cm x 높이 20 cm 의 네모난 상자에 실험동물을 한 마리씩 넣어서 5분간 자발적으로 이동한 칸의 횟수를 측정하여 각 군마다 평균값을 이용하여 활동성을 비교하였다.
도 10은 마우스를 이용하여 감탕나무 잎 열수 추출물을 투여 시 운동 활동을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 감탕나무 잎 열수 추출물 (IIW) 50, 100, 200mg/kg b.w.에서 대조군 (control)에 비해 운동 활동 (locomotor activity)이 감소됨을 확인할 수 있었다.
4-3. ICR 마우스에서 감탕나무 잎 열수 추출물의 멜라토닌 (Melatonin) 함량에 미치는 효과 확인
감탕나무 잎 물 추출물을 투여 후 7일째 날에, 마우스로부터 혈청 (serum)를 분리하여 멜라토닌 생성량에 미치는 효과를 확인하였다. 멜라토닌 함량은 LSBio ELISA kit를 사용하여 제조사의 지시에 따라 측정하였다.
도 11은 마우스를 이용하여 감탕나무 잎 열수 추출물을 투여 시 혈청 멜라토닌 함량 변화를 나타낸 그래프이다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 감탕나무 잎 열수 추출물(IIW)를 50, 100, 200 mg/kg b.w.으로 투여한 결과, 대조군(Control)과 비교하여 혈액 내의 멜라토닌 함량을 증가시킴으로써 수면유도 효과가 있음을 확인하였다.
<실험예 5> 스트레스 예방 및 멜라토닌 분비촉진용 동물 사료제조
본 발명의 조성물을 첨가하여 제조한 스트레스 예방 및 멜라토닌 분비촉진용 동물 사료를 도 12에 나타낸다. 본 발명의 압출성형공정으로 생산되는 사료펠렛(pellet)의 물리적인 특성의 조절은 다른 공정과 비교하여 품질의 제어가 용이하므로 압출성형공정이 동물 사료의 생산에 널리 이용되는 점을 고려하여, 사료원료의 입자크기 및 익스트루전 가공조건에 따라 사료의 물성을 조절하여 제조하였다.
본 발명의 사료는 부작용이 문제될 가능성이 낮은 천연물 소재를 이용한 감탕나무(Ilex integra Thunb.) 잎 추출물을 포함하는 스트레스 예방 및 멜라토닌 분비촉진용 동물 사료 조성물 및 사료를 제공함으로써, 동물의 스트레스 감소 및 운동활성을 낮추어 사육 효율을 증가시킬 수 있다.
본 발명은 감탕나무를 이용하여 독성 및 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있는 스트레스 예방 및 멜라토닌 분비촉진용 동물 사료 조성물을 제공함으로써 독성 및 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있는 사료 조성물 및 이를 이용한 사료 생산이 가능함으로 산업상 이용가능성이 있다.
Claims (3)
- 감탕나무(ILEX INTEGRA THUNB.) 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 스트레스 예방 및 멜라토닌 분비촉진용 동물사료 조성물
- 제1항에 있어서, 상기 감탕나무(ILEX INTEGRA THUNB.) 잎 추출물은 물, 에탄올, 메탄올 이들의 혼합물로 추출된 것 중에서 선택되는 1종 이상을 추출용매로 가용한 추출물인 것을 특징으로 하는 스트레스 예방 및 멜라토닌 분비촉진용 동물사료 조성물
- 제1항 또는 제2항으로 이루어진 스트레스 예방 및 멜라토닌 분비촉진용 동물 사료 조성물이 0.01 내지 99.9 중량%의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 스트레스 예방 및 멜라토닌 분비촉진용 동물사료
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| KR100218977B1 (ko) | 1994-11-22 | 1999-10-01 | 에르버 에리히 | 동물의 스트레스 저항성 및 면역성을 개선시키기 위한 사료 및 음용수용 첨가제 |
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