KR20240003591A

KR20240003591A - Composition for preventing or treating atopic dermatitis comprising tacrolimus nanocapsule coated with chitosan

Info

Publication number: KR20240003591A
Application number: KR1020220081363A
Authority: KR
Inventors: 최원일; 김성현; 신용철; 이증훈
Original assignee: 주식회사 스킨메드
Priority date: 2022-07-01
Filing date: 2022-07-01
Publication date: 2024-01-09

Abstract

본 발명은 타크로리무스를 담지한 키토산이 코팅된 나노 캡슐의 제조방법 및 이의 제조방법으로 제조된 타크로리무스 나노 캡슐과 이를 포함하는 아토피 피부염 치료용 조성물에 관한 것으로, 타크로리무스 나노 캡슐을 100 ㎚ 이하의 직경으로 제조하는 방법을 확립함으로써 타크로리무스 나노 캡슐이 서방출 특성을 가져 고농도 타크로리무스 적용 시의 부작용을 저감시키고 아토피 피부염 치료효과를 개선할 수 있다.The present invention relates to a method for manufacturing chitosan-coated nanocapsules carrying tacrolimus, tacrolimus nanocapsules prepared by the same, and a composition for treating atopic dermatitis containing the same. Tacrolimus nanocapsules are manufactured with a diameter of 100 nm or less. By establishing a method, tacrolimus nanocapsules have sustained-release properties, which can reduce side effects when applying high concentrations of tacrolimus and improve the treatment effect of atopic dermatitis.

Description

Composition for preventing or treating atopic dermatitis comprising tacrolimus nanocapsule coated with chitosan}

본 발명은 키토산으로 코팅된 타크로리무스 나노 캡슐을 포함하는 아토피 피부염이 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for preventing or treating atopic dermatitis comprising tacrolimus nanocapsules coated with chitosan.

아토피 피부염(atopic dermatitis)은 호전과 악화를 반복하는 만성 재발성 염증성 피부질환으로, 환경적, 유전적인 유발 요인들에 의한 피부 과민 반응에 의해 나타난다. 전 세계적으로 볼 때도 유럽에서의 유병률은 20-35%로 매우 높고, 일본에서 실시한 역학조사의 경우 1980년에 9.5%이었으나 1989년 24%로 2배 이상 증가하는 경향을 보이고 있어, 아토피 피부염은 현대에 들어 중요한 난치질환 중 하나임을 알 수 있다.Atopic dermatitis is a chronic, recurrent inflammatory skin disease that repeatedly improves and worsens, and is caused by skin hypersensitivity caused by environmental and genetic triggers. Looking at the world, the prevalence in Europe is very high at 20-35%, and in the case of an epidemiological survey conducted in Japan, it was 9.5% in 1980, but showed a tendency to more than double to 24% in 1989, showing that atopic dermatitis is a modern disease. It can be seen that it is one of the important incurable diseases.

아토피 피부염은 심한 소양증과 피부건조증, 피부 병변이 주요 증상이며, 피부건조는 가려움증을 유발하고 악화시키는데, 낮 동안에는 간헐적으로 가렵다가 대개 초저녁이나 한밤중에 심해진다. 가려워서 긁게 되면 습진성 피부 병변이 생기고 이러한 병변이 진행되면서 다시 더 심한 가려움이 유발되는 악순환이 반복된다. 유아의 경우 병변이 주로 진물이나 딱지가 지는 급성 습진이 나타나며 주로 얼굴, 머리에 잘 생기고, 팔다리의 바깥쪽에 생기는 경우가 많다. 2세 이상 10세 이하의 소아기에는 얼굴보다는 오히려 팔다리의 접히는 부분, 목의 접히는 부위에 생기며 건조한 습진 형태로 나타나는 경우가 많다.The main symptoms of atopic dermatitis are severe itching, dry skin, and skin lesions. Dry skin causes and worsens itching. Itching occurs intermittently during the day, but usually gets worse in the early evening or middle of the night. When you scratch because of itchiness, eczematous skin lesions develop, and as these lesions progress, more severe itching occurs, repeating the vicious cycle. In infants, the lesions usually appear as acute eczema with oozing or scabs, and occur mainly on the face and head, and often on the outside of the limbs. In childhood, between the ages of 2 and 10, it often occurs in the folds of the limbs and neck rather than the face, and often appears in the form of dry eczema.

아토피 피부염을 치료하기 위해서는 건조한 피부의 보습, 피부염 치료를 위한 부신피질호르몬제, 면역조절제, 국소 면역조절제와 가려움증을 치료하기 위한 항히스타민제가 사용된다. 또한 피부 증상을 악화시키거나 유발하는 알레르겐, 자극 물질, 스트레스를 피하도록 하는 다각적이고 체계적인 치료가 필요하며, 환자의 특성에 따라 개별화된 치료를 시행한다.To treat atopic dermatitis, moisturizing dry skin, corticosteroids to treat dermatitis, immunomodulators, topical immunomodulators, and antihistamines to treat itching are used. In addition, multifaceted and systematic treatment is needed to avoid allergens, irritants, and stress that worsen or cause skin symptoms, and individualized treatment is performed depending on the patient's characteristics.

아토피 피부염 치료에 사용되는 방법으로 국소 스테로이드, 국소 면역조절제, 전신 스테로이드, 전신 면역억제제, 항히스타민제, 인터페론 감마 등이 있으며, 그 외에도 광선 치료나 감마 리놀산, 치모펜틴(thymopentin) 등이 치료에 이용되기도 한다. 전신 스테로이드 또는 전신 면역억제제는 중증 아토피 피부염 환자 치료에 사용되나 장기간 지속하는 경우 전신 부작용이 나타날 수 있으므로 제한적으로 사용된다.Methods used to treat atopic dermatitis include topical steroids, local immunomodulators, systemic steroids, systemic immunosuppressants, antihistamines, and interferon gamma. In addition, phototherapy, gamma linoleic acid, and thymopentin are also used for treatment. do. Systemic steroids or systemic immunosuppressants are used to treat patients with severe atopic dermatitis, but their use is limited because systemic side effects may occur if continued for a long time.

국소 스테로이드는 아토피 피부염 치료의 기본이 되며 가장 많이 사용되고 있는 치료약제이다. 스테로이드는 강력한 항염증 효과를 보이는 반면 피부위축, 혈관확장, 팽창선 등, 부작용이 큰 문제가 있어 반드시 의사와 상담하면서 사용해야 한다.Topical steroids are the basis for the treatment of atopic dermatitis and are the most commonly used treatment medication. While steroids have a strong anti-inflammatory effect, they have significant side effects such as skin atrophy, vasodilation, and swollen glands, so they must be used after consulting a doctor.

타크로리무스(tacrolimus), 피메크로리무스(pimecrolimus) 등의 국소 면역조절제는 스테로이드 연고를 대신할 수 있는 약제로서 개발되어 각광을 받고 있다. 면역억제제는 스테로이드처럼 강한 염증 억제 효과를 나타내는 반면에 스테로이드제가 갖고 있는 여러 심각한 부작용이 줄어들었다. 이 중 타크로리무스는 칼시뉴린이라고 하는 세포 내 신호물질을 차단한다. 칼시뉴린은 칼슘의 자극에 의해 흥분하는 물질로, 면역세포 특히 림프구의 활성에 결정적인 작용을 한다. 칼시뉴린은 주로 FK 결합단백(FKBP)에 결합하여 사이토카인을 전사해 염증을 일으키게 된다. 때문에 칼시뉴린을 억제하면 활성화된 T 세포를 비롯한 여러 염증세포에서 사이토카인의 분비를 차단할 수 있어 강력한 항염증 효과를 가져 올 수 있다.Topical immunomodulators such as tacrolimus and pimecrolimus have been developed as drugs that can replace steroid ointments and are receiving attention. While immunosuppressants have a strong anti-inflammatory effect like steroids, many of the serious side effects of steroids have been reduced. Among these, tacrolimus blocks an intracellular signaling substance called calcineurin. Calcineurin is a substance that is excited by calcium stimulation and plays a critical role in the activation of immune cells, especially lymphocytes. Calcineurin mainly binds to FK binding protein (FKBP) and transcribes cytokines, causing inflammation. Therefore, inhibiting calcineurin can block the secretion of cytokines from various inflammatory cells, including activated T cells, resulting in a strong anti-inflammatory effect.

그러나 타크로리무스제제는 고용량을 사용하는 경우, 피부 자극 부작용이 있어 전체 사용자의 34~58%가 화끈거림이나 가려움증 등의 피부증상을 느끼는 것으로 보고되고 있다. 특히 피부가 타는 듯 따끔거리고 빨개지며 아프고, 피부가 열이나 추위에 민감해진다. 또한 가려움 또는 여드름이 유발되기도 하며, 피부가 붓거나 모공 감염이 일어나기도 하고 심한 경우, 두통, 근육통, 허리통증 또는 독감과 비슷한 증상이나 구역감을 토로하기도 한다. 타크로리무스를 경구 복용하는 경우, 신장손상, 발진, 두통, 시야흐림, 당뇨병, 출혈 등의 심각한 부작용이 나타날 수 있다.However, when high doses of tacrolimus are used, it has skin irritation side effects, and it is reported that 34-58% of all users experience skin symptoms such as burning or itching. In particular, the skin becomes tingling, red, and painful as if it is burning, and the skin becomes sensitive to heat or cold. It may also cause itching or acne, swelling of the skin or infection of pores, and in severe cases, headache, muscle pain, back pain, flu-like symptoms or nausea. If tacrolimus is taken orally, serious side effects such as kidney damage, rash, headache, blurred vision, diabetes, and bleeding may occur.

타크로리무스 연고제인 프로토픽 연고(emc)의 알려진 흔한 부작용은 가벼운 작열감, 따끔거림 또는 가려움증, 피부 발적, 좌창, 감기 또는 독감 증상(코막힘, 재채기, 인후통), 두통, 그리고 뜨겁거나 차가운 온도에 더 민감한 느낌이며, 심각한 부작용은 두드러기, 호흡 곤란, 얼굴, 입술, 혀 또는 목의 붓기, 약을 바르는 심한 따끔거림, 작열감, 가려움증 또는 통증, 부은 땀샘, 모낭 주위의 발적 또는 딱지, 및 피부 감염의 징후(발적, 부기, 가려움증 또는 삼출물) 등이다.Common known side effects of tacrolimus ointment, Protopic ointment (emc), include mild burning, stinging or itching, redness of the skin, acne, cold or flu symptoms (stuffy nose, sneezing, sore throat), headache, and feeling more sensitive to hot or cold temperatures. Serious side effects include hives, difficulty breathing, swelling of the face, lips, tongue, or throat, severe stinging, burning, itching, or pain when applying the medication, swollen glands, redness or crusting around the hair follicles, and signs of skin infection (redness, , swelling, itching, or exudate).

이와 같은 타크로리무스의 고농도 적용 위험을 저감시키고, 보다 안전한 아토피 피부염 치료를 위하여 안정한 제형의 서방출 제제의 필요성이 대두되고 있다.To reduce the risk of applying high concentrations of tacrolimus and to treat atopic dermatitis more safely, there is a need for a stable, sustained-release preparation.

종래선행기술인 한국공개특허 제1020170032801호에는 아토피 피부염 치료제를 함침하고, 피부 내로 전달할 수 있는 아토피 피부염 치료제의 피부 투여 시스템으로 타크로리무스를 포함하는 용해성 미세바늘이 기재되어 있다. 그러나 용해성 미세바늘은 물리적으로 인체 피부를 뚫고 들어가 약물을 전달하는 점에서 사용편의성이 떨어지는 문제가 있다.Korean Patent Publication No. 1020170032801, which is a prior art, describes a soluble microneedle containing tacrolimus as a skin administration system for an atopic dermatitis treatment that can be impregnated with the atopic dermatitis treatment and delivered into the skin. However, soluble microneedles have the problem of poor usability in that they physically penetrate the human skin and deliver drugs.

종래선행기술인 한국등록특허 제102384808호는 본 출원인의 선행기술로, 키토산으로 코팅된 나노 캡슐 및 이의 용도에 관한 것이다. 상기 발명에서는 약물 및 플루로닉을 포함하는 나노입자를 제조하고 여기에 키토산을 코팅하여 제조한 나노캡슐을 피부외용제로 사용할 수 있다. 또한 사이클로스포린 A를 담지한 나노캡슐을 피부에 적용함으로써 피부 자극이나 손상없이 피부내로 약물을 침투시켜 발모를 유도할 수 있었다. 그러나 상기의 방법에 타크로리무스를 적용한 나노캡슐을 제조하는 경우, 타크로리무스의 분자구조에 의해 나노캡슐의 직경을 작게 조절하기 어려우며, 이에 따른 피부투과율이 낮고 이에 따라 방출특성을 제어하기 어려운 문제가 있었다.Korean Patent No. 102384808, a prior art of the present applicant, relates to chitosan-coated nanocapsules and their uses. In the above invention, nanocapsules prepared by manufacturing nanoparticles containing a drug and pluronic and coating them with chitosan can be used as an external skin agent. Additionally, by applying nanocapsules containing cyclosporine A to the skin, the drug was able to penetrate into the skin without causing skin irritation or damage, thereby inducing hair growth. However, when manufacturing nanocapsules using tacrolimus using the above method, it is difficult to adjust the diameter of the nanocapsules to a small size due to the molecular structure of tacrolimus, and the skin permeability is low, making it difficult to control the release characteristics.

한국공개특허 제1020170032801호, 아토피 피부염 치료제 전달을 위한 용해성 미세바늘 패치, 2017년03월23일. 공개.Korean Patent Publication No. 1020170032801, Dissolvable microneedle patch for delivering atopic dermatitis treatment, March 23, 2017. open. 한국등록특허 제102384808호, 키토산으로 코팅된 나노 캡슐 및 이의 용도, 2022년04월05일. 등록.Korean Patent No. 102384808, Nanocapsules coated with chitosan and uses thereof, April 5, 2022. registration.

본 발명의 목적은 일에 타크로리무스 누적방출량 60~70%(w/w)의 서방출 특성을 갖는 타크로리무스를 담지한 키토산 나노 캡슐의 제조방법을 제공하는 데 있다.The purpose of the present invention is to provide a method for producing chitosan nanocapsules containing tacrolimus with sustained release characteristics of 60-70% (w/w) of tacrolimus cumulative release per day.

본 발명은 직경 50~100 nm의 크기를 갖는 타크로리무스를 담지한 키토산 나노 캡슐의 제조방법을 제공하는 데 있다.The present invention aims to provide a method for producing chitosan nanocapsules containing tacrolimus having a diameter of 50 to 100 nm.

또한, 본 발명의 목적은 상기 방법으로 제조된 타크로리무스를 담지한 키토산 나노 캡슐을 포함하는 아토피 피부염 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.Additionally, an object of the present invention is to provide a composition for treating atopic dermatitis containing chitosan nanocapsules containing tacrolimus prepared by the above method.

상기 과제를 달성하기 위하여 본 발명은 타크로리무스를 담지한 키토산 나노 캡슐의 제조방법 및 상기 제조방법에 의하여 제조된 타크로리무스를 담지한 키토산 나노 캡슐을 포함하는 아토피 피부염 치료용 조성물을 제공한다. 상기 나노 캡슐은 직경 50~100 nm의 크기를 갖는 타크로리무스를 담지한 키토산 나노 캡슐로, 7일에 타크로리무스 누적방출량 60~70%(w/w)의 서방출특성을 갖는 것을 특징으로 한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a method for producing chitosan nanocapsules loaded with tacrolimus and a composition for treating atopic dermatitis comprising the chitosan nanocapsules loaded with tacrolimus produced by the manufacturing method. The nanocapsules are chitosan nanocapsules containing tacrolimus with a diameter of 50 to 100 nm, and are characterized by a sustained release of 60 to 70% (w/w) of tacrolimus cumulative release in 7 days.

상기 아토피 피부염 치료용 조성물은 피부외용제, 경구용 제제 및 주사제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 제형을 가지는 것을 특징으로 한다. 상기 제형이 피부외용제 조성물인 경우, 상기 나노 캡슐은 타크로리무스 수용액과 비교하여 피부흡수율이 24시간 기준 9배 증가한 것일 수 있다.The composition for treating atopic dermatitis is characterized by having a formulation selected from the group consisting of external skin preparations, oral preparations, and injections. When the formulation is a composition for external application to the skin, the nanocapsule may have a skin absorption rate 9 times higher in 24 hours compared to the tacrolimus aqueous solution.

본 발명은 타크로리무스를 담지한 키토산 나노 캡슐의 제조방법을 제공한다.The present invention provides a method for producing chitosan nanocapsules containing tacrolimus.

상기 나노 캡슐은, 타크로리무스를 유기용매에 용해시켜 타크로리무스 용액을 제조하는 1단계; 상기 1단계의 타크로리무스가 용해된 용액에 플루로닉을 첨가하여 반응시키는 2단계; 상기 2단계의 반응용액을 교반하고 있는 물에 적가하여 1시간 상온에서 반응시키는 3단계; 상기 3단계의 반응용액을 3일 이상 동결건조로 유기용매를 완전히 제거하여 나노입자를 제조하는 4단계; 상기 4단계의 동결건조된 나노입자를 물에 재분산시킨 후 한외여과(ultrafiltration)하는 5단계; 및 상기 5단계의 한외여과된 나노입자에 키토산을 첨가하여 반응시켜 키토산 코팅 나노캡슐을 제조하는 6단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 타크로리무스를 담지한 키토산 나노 캡슐의 제조방법으로 제조될 수 있다.The nanocapsule includes the first step of preparing a tacrolimus solution by dissolving tacrolimus in an organic solvent; Step 2 of adding pluronic to the solution in which tacrolimus is dissolved in step 1 and reacting it; Step 3 of adding the reaction solution of step 2 dropwise to stirred water and reacting at room temperature for 1 hour; Step 4 of producing nanoparticles by completely removing the organic solvent by freeze-drying the reaction solution of step 3 above for more than 3 days; Step 5 of redispersing the freeze-dried nanoparticles of step 4 in water and then performing ultrafiltration; And step 6 of producing chitosan-coated nanocapsules by adding chitosan to the ultrafiltered nanoparticles in step 5 and reacting them to produce chitosan-coated nanocapsules.

상기 4단계의 타크로리무스가 용해된 용액은 타크로리무스가 유기용매에 1~3 중량% 농도로 용해된 것일 수 있다. 타크로리무스가 1 중량% 보다 낮은 경우 타크로리무스의 농도가 낮아 피부 등에 유효한 효과를 나타내는 데에 효과적이지 않거나, 상기 타크로리무스를 포함하는 조성물을 과도한 양으로 환자에 적용해야하는 문제가 있다. 타크로리무스가 3 중량% 보다 높은 경우, 나노캡슐의 직경이 급격히 커져 제형이 불안정하고 피부흡수율, 세포투과율이 급격히 떨어지며, 타크로리무스 방출특성이 나빠진다.The solution in which tacrolimus is dissolved in step 4 may be one in which tacrolimus is dissolved in an organic solvent at a concentration of 1 to 3% by weight. If tacrolimus is lower than 1% by weight, the concentration of tacrolimus is low and it is not effective in showing effective effects on the skin, etc., or there is a problem that the composition containing tacrolimus must be applied to the patient in an excessive amount. When tacrolimus is higher than 3% by weight, the diameter of the nanocapsule rapidly increases, making the formulation unstable, skin absorption rate and cell permeability rate rapidly decreasing, and tacrolimus release characteristics deteriorating.

상기 타크로리무스는 플루로닉 100중량부를 기준으로 0중량부 초과~20중량부일 수 일 수 있으며, 바람직하게는 0중량부 초과~3중량부이다.The tacrolimus may be in the amount of more than 0 parts by weight to 20 parts by weight based on 100 parts by weight of Pluronic, and is preferably in the amount of more than 0 parts by weight to 3 parts by weight.

상기 플루로닉은 플루로닉 L35, 플루로닉 L43, 플루로닉 L44, 플루로닉 L64, 플루로닉 F68, 플루로닉 P84, 플루로닉 P85, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88, 플루로닉 F98, 플루로닉 P103, 플루로닉 P104, 플루로닉 P105, 플루로닉 F108, 플루로닉 P123 및 플루로닉 F127로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.The pluronics include Pluronic L35, Pluronic L43, Pluronic L44, Pluronic L64, Pluronic F68, Pluronic P84, Pluronic P85, Pluronic F87, Pluronic F88, It may be one or more types selected from the group consisting of Pluronic F98, Pluronic P103, Pluronic P104, Pluronic P105, Pluronic F108, Pluronic P123, and Pluronic F127.

상기 키토산은 분자량이 3~100kDa인 키토산일 수 있다.The chitosan may be chitosan with a molecular weight of 3 to 100 kDa.

상기 키토산은 플루로닉 100중량부를 기준으로 0.001~200중량부를 포함할 수 있다.The chitosan may contain 0.001 to 200 parts by weight based on 100 parts by weight of Pluronic.

상기 나노 캡슐은 32.5~37℃에서 입자 크기가 100 ㎚ 이하일 수 있다. 바람직하게는 32.5~37℃에서 입자 크기가 30~100 ㎚일 수 있다. 더욱 바람직하게는 50~100 ㎚이다.The nanocapsules may have a particle size of 100 nm or less at 32.5 to 37°C. Preferably, the particle size may be 30-100 nm at 32.5-37°C. More preferably, it is 50 to 100 nm.

본 발명은 타크로리무스 누적방출량 60~70%(w/w)의 서방출 특성을 갖는 타The present invention provides tacrolimus with a sustained-release characteristic of 60 to 70% (w/w) of cumulative release amount.

상기 1단계의 유기용매는 아세톤, DMSO(dimethyl sulfoxide), 에탄올, 아세토니트릴(acetonitrile), 테트라히드로푸란(tetrahydrofuran), 클로로포름(chloroform) 및 다이클로로메테인(dichloromethane) 으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.The organic solvent in step 1 is one selected from the group consisting of acetone, DMSO (dimethyl sulfoxide), ethanol, acetonitrile, tetrahydrofuran, chloroform, and dichloromethane. It could be more than that.

상기 2단계의 증류수는 상기 1단계의 유기용매 부피를 기준으로 하여 2~10배를 이용할 수 있다. 바람직하게는 2~5배를 이용하며, 더 바람직하게는 4배를 이용한다. 상기 증류수가 유기용매 부피를 기준으로 2배 미만을 사용할 경우에는 부분적으로 침전이 발생할 수 있고, 10배 초과일 경우에는 키토산 코팅이 불안정하거나 나노 캡슐의 농도가 희석되어 농축 공정이 추가될 수 있어 바람직하지 못하다.Distilled water in step 2 can be used in an amount 2 to 10 times greater than the volume of the organic solvent in step 1. Preferably, 2 to 5 times is used, and more preferably, 4 times is used. If the distilled water is used in less than 2 times the volume of the organic solvent, partial precipitation may occur, and if it is more than 10 times, the chitosan coating may be unstable or the concentration of the nanocapsules may be diluted, so a concentration process may be added, which is preferable. can't do it

상기 타크로리무스 나노 캡슐을 피부외용제로 사용하는 경우, 피부 투과율은 타크로리무스 단독 처리와 대비하여 5~9배 증가될 수 있다.When the tacrolimus nanocapsule is used as an external skin agent, the skin permeability can be increased by 5 to 9 times compared to tacrolimus treatment alone.

본 발명에 있어서 “플루로닉(pluronic, poloxamer)”은 친수성 고분자로 온도 감응성 성질을 나타내며, 다양한 HLB(hydrophile-lipophile balance)를 가진 유도체가 존재한다. 상기 플루로닉은 HLB가 8~29인 플루로닉, 예컨대, 플루로닉 L35, 플루로닉 L43, 플루로닉 L44, 플루로닉 L64, 플루로닉 F68, 플루로닉 P84, 플루로닉 P85, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88, 플루로닉 F98, 플루로닉 P103, 플루로닉 P104, 플루로닉 P105, 플루로닉 F108, 플루로닉 P123 및 플루로닉 F127로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 HLB가 15~29인 플루로닉, 예컨대, 플루로닉 L35, 플루로닉 L44, 플루로닉 L64, 플루로닉 F68, 플루로닉 P85, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88, 플루로닉 F98, 플루로닉 P105, 플루로닉 F108 및 플루로닉 F127로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, “pluronic (poloxamer)” is a hydrophilic polymer that exhibits temperature-sensitive properties, and derivatives with various HLB (hydrophile-lipophile balance) exist. The pluronic is a pluronic having an HLB of 8 to 29, such as pluronic L35, pluronic L43, pluronic L44, pluronic L64, pluronic F68, pluronic P84, pluronic In the group consisting of P85, Pluronic F87, Pluronic F88, Pluronic F98, Pluronic P103, Pluronic P104, Pluronic P105, Pluronic F108, Pluronic P123 and Pluronic F127 There may be one or more types selected, preferably Pluronic with an HLB of 15 to 29, such as Pluronic L35, Pluronic L44, Pluronic L64, Pluronic F68, Pluronic P85, Pluronic It is one or more selected from the group consisting of Nick F87, Pluronic F88, Pluronic F98, Pluronic P105, Pluronic F108, and Pluronic F127. However, it is not limited to this.

상기 나노 입자는 활성제 및 플루로닉으로 이루어진 나노 입자로, 온도 민감성 성질로 인해 측정 온도에 따라 나노 입자의 크기가 달라질 수 있다. 구체적으로, 온도가 낮을수록 입자 크기가 커질 수 있다.The nanoparticles are nanoparticles composed of an activator and a pluronic agent, and due to their temperature-sensitive nature, the size of the nanoparticles may vary depending on the measurement temperature. Specifically, the lower the temperature, the larger the particle size may be.

본 발명에 있어서, “키토산(chitosan)"은 키틴의 부분적인 탈아세틸화에 의해 형성되는 다당류로서 독성이 없는 생체적합성, 생분해성이 높은 고분자 물질로 친수성이 높고 점막부착성이 높은 성질을 가지고 있다. 키토산은 산성 환경에서 용해도가 높고 양전하를 띠는 경향이 있어 점막질 같은 곳에 쉽게 부착하는 성질이 있고, 항세균성과 지혈효과가 있다. 상기 키토산은 일반적으로 아세트산, 락트산 등과 같은 산성 용액에 높은 용해도를 보인다. 상기 산성 용액에 용해된 키토산의 경우, 인체에 적용시 피부 자극이나 인체 내 pH의 변화로 인한 장애 등을 유발할 수 있다.In the present invention, “chitosan” is a polysaccharide formed by partial deacetylation of chitin. It is a non-toxic, biocompatible, highly biodegradable polymer material with high hydrophilicity and high mucosal adhesion. Chitosan has high solubility in an acidic environment and tends to have a positive charge, so it easily adheres to areas such as mucous membranes and has antibacterial and hemostatic effects. Chitosan generally has high solubility in acidic solutions such as acetic acid, lactic acid, etc. In the case of chitosan dissolved in the acidic solution, when applied to the human body, it may cause skin irritation or disorders due to changes in pH within the human body.

반면에, 본 발명의 상기 키토산은 물에 쉽게 용해되는 것으로, 산성 용액에 용해되는 키토산을 이용하는 경우에 나타나는 문제점들을 극복할 수 있다. 상기 키토산은 분자량이 3~100kDa인 것일 수 있다. 바람직하게는 3~20kDa, 더욱 바람직하게는 3~10kDa이다. 상기 키토산의 분자량이 100kDa 초과일 경우에는 물에 대한 용해도가 낮아 바람직하지 못하다.On the other hand, the chitosan of the present invention is easily soluble in water, so it can overcome the problems that appear when using chitosan soluble in acidic solutions. The chitosan may have a molecular weight of 3 to 100 kDa. Preferably it is 3 to 20 kDa, more preferably 3 to 10 kDa. If the molecular weight of chitosan is more than 100 kDa, it is undesirable due to low solubility in water.

상기 키토산은 플로로닉 100중량부를 기준으로 200중량부 이하를 포함할 수 있다. 바람직하게는 0.001~200중량부이고, 더 바람직하게는 0.001~100중량부이다. 키토산이 0.001중량부 미만이면 나노 입자의 표면이 키토산에 의해 충분히 코팅되지 않아 양전하의 표면 전하를 나타내기 어려울 수 있으며, 키토산이 200중량부 초과이면 나노 캡슐의 크기가 너무 커지거나 부분적으로 침전이 발생할 수 있어 바람직하지 못하다.The chitosan may contain 200 parts by weight or less based on 100 parts by weight of Floronic. Preferably it is 0.001 to 200 parts by weight, and more preferably 0.001 to 100 parts by weight. If the chitosan is less than 0.001 parts by weight, the surface of the nanoparticle is not sufficiently coated with chitosan, which may make it difficult to display a positive surface charge. If the chitosan is more than 200 parts by weight, the size of the nanocapsule may become too large or partial precipitation may occur. This is undesirable.

상기 타크로리무스 나노 캡슐은 온도 민감성 성질을 나타내는 것으로, 온도가 낮을수록 입자 크기가 커질 수 있다. 상기 나노 캡슐은 바람직하게는 32.5~37℃에서 입자 크기가 100 ㎚이고 이하이고, 더 바람직하게는 32.5~37℃에서 입자 크기가 50~700 ㎚이고, 더욱 바람직하게는 입자 크기가 50~60 ㎚이다. 상기 나노 캡슐의 입자 크기가 100 ㎚를 초과하면 피부에 적용 시 피부 투과 효율이 낮으며, 방출특성이 달라져 바람직하지 못하다.The tacrolimus nanocapsules exhibit temperature-sensitive properties, and the lower the temperature, the larger the particle size may be. The nanocapsules preferably have a particle size of 100 nm or less at 32.5 to 37°C, more preferably have a particle size of 50 to 700 nm at 32.5 to 37°C, and even more preferably have a particle size of 50 to 60 nm. am. If the particle size of the nanocapsule exceeds 100 nm, skin penetration efficiency is low when applied to the skin, and release characteristics are changed, which is not desirable.

상기 타크로리무스 나노 캡슐은 서방출 특성을 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 타크로리무스 나노 캡슐은 1일에 20~40%, 2일에 40~60%, 5일에 50~65%, 7일에 60~70%의 누적방출량을 가질 수 있다. 상기 타크로리무스 나노 캡슐의 서방출 특성은 고농도의 타크로리무스 적용에 의한 부작용을 저감시킬 수 있다. 상기 타크로리무스 나노 캡슐을 피부 외용제로 사용하는 경우, 피부 작열감, 발적 등의 부작용을 저감시키고, 타크로리무스 투여 빈도수와 투여량을 줄요 환자의 순응도 및 편의성을 증가시킬 수 있다. 상기 타크로리무스 나노캡슐을 피부 외용제 이외의 제제, 예를 들면, 경구제 또는 주사제로 사용하는 경우, 고농도의 타크로리무스 적용에 의한 신장손상, 발진, 두통, 시야흐림, 당뇨병, 출형 등의 심각한 부작용을 저감시킬 수 있다.The tacrolimus nanocapsules are characterized by sustained release properties. The tacrolimus nanocapsules may have a cumulative release amount of 20-40% on day 1, 40-60% on day 2, 50-65% on day 5, and 60-70% on day 7. The sustained-release properties of the tacrolimus nanocapsules can reduce side effects caused by application of high concentrations of tacrolimus. When the tacrolimus nanocapsule is used as an external skin agent, side effects such as skin burning and redness can be reduced, and the patient's compliance and convenience can be increased by reducing the frequency and dosage of tacrolimus administration. When the tacrolimus nanocapsule is used in preparations other than skin external preparations, such as oral preparations or injections, serious side effects such as kidney damage, rash, headache, blurred vision, diabetes, and discharge caused by application of high concentrations of tacrolimus can be reduced. You can.

상기 나노 캡슐은 나노 입자를 구성하는 플루로닉과 나노 입자의 표면에 코팅되는 키토산 간의 물리학적 결합에 의해 이루어지는 것으로, 플루로닉과 키토산의 화학적 결합을 통해 제조된 플루로닉-키토산 중합체를 이용하여 제조하는 나노 입자와 달리, 중합체 제조 공정이 별도로 필요가 없으며, 중합체 제조를 위해 사용되는 결합제에 의한 독성을 고려하지 않아도 된다.The nanocapsule is made by a physical bond between the pluronic constituting the nanoparticle and chitosan coated on the surface of the nanoparticle, using a pluronic-chitosan polymer produced through a chemical bond between pluronic and chitosan. Unlike nanoparticles manufactured using a separate polymer manufacturing process, there is no need to consider the toxicity of the binder used to manufacture the polymer.

상기 타크로리무스를 담지한 키토산 나노 캡슐을 포함하는 아토피 피부염 치료용 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다.The composition for treating atopic dermatitis containing the chitosan nanocapsules containing tacrolimus may include pharmaceutically acceptable excipients.

상기 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 나노 캡슐에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.The composition can be formulated and used in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories, and sterile injection solutions according to conventional methods. Carriers, excipients, and diluents that may be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, and cellulose. , methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil. When formulated, it is prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc. These solid preparations contain at least one excipient in the nanocapsule, such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, and gelatin. It is prepared by mixing etc. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used. Liquid preparations for oral use include suspensions, oral solutions, emulsions, syrups, etc. In addition to the commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included. . Preparations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Non-aqueous solvents and suspensions include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate. As a base for suppositories, witepsol, macrogol, tween 61, cacao, laurel, glycerogelatin, etc. can be used.

또한, 제형에 특별한 제한을 두지는 않으나, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 겔제 및 젤 중에서 선택되는 1종의 제형을 갖는 피부 외용제로 사용될 수 있다. 경피 흡수를 증가시키는 제제, 예를 들면 비한정적인 의미로 특히 디메틸설폭사이드, 디메틸아세트아마이드, 디메틸포름아마이드, 계면활성제, 알코올, 아세톤, 프로필렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜을 포함할 수 있다. 도포 빈도는 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 상당히 변할 수 있으며, 도포 빈도는 매달 내지 1일 10회, 바람직하게는 매주 내지 1일 4회, 더 바람직하게는 1주당 3회 내지 1일 3회, 보다 더 바람직하게 는 1일 1회 또는 2회가 제안된다.In addition, there are no particular restrictions on the formulation, but it can be used as an external skin agent having one type of formulation selected from ointments, lotions, sprays, patches, creams, gels, and gels. Agents that increase transdermal absorption may include, but are not limited to, dimethyl sulfoxide, dimethyl acetamide, dimethyl formamide, surfactants, alcohol, acetone, propylene glycol or polyethylene glycol, among others. The frequency of application may vary significantly depending on the age, gender, and weight of the subject to be treated, the specific disease or pathological state to be treated, the severity of the disease or pathological state, the route of administration, and the judgment of the prescriber. The frequency of application is from monthly to 10 times a day, Preferably weekly to 4 times a day, more preferably 3 times a week to 3 times a day, even more preferably once or twice a day.

본 발명의 타크로리무스를 담지한 키토산 나노 캡슐을 포함하는 아토피 피부염 치료용 조성물은 쥐, 가축, 인간, 반려동물 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 피부, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 바람직하게는 피부 투여이다.The composition for treating atopic dermatitis containing chitosan nanocapsules containing tacrolimus of the present invention can be administered to mammals such as rats, livestock, humans, and companion animals through various routes. All modes of administration are contemplated, for example, oral, rectal or by intravenous, intramuscular, subcutaneous, cutaneous, intrauterine intrathecal or intracerebrovascular injection. Preferably it is dermal administration.

본 발명은 타크로리무스를 담지한 키토산이 코팅된 나노 캡슐의 제조방법 및 이의 제조방법으로 제조된 타크로리무스 나노 캡슐을 포함하는 아토피 피부염 치료용 조성물에 관한 것으로, 타크로리무스 나노 캡슐을 100 ㎚ 이하의 직경으로 제조하는 방법을 확립함으로써 타크로리무스 나노 캡슐이 서방출 특성을 가져 타크로리무스 독성을 감소시키고 아토피 피부염 치료효과를 개선할 수 있다.The present invention relates to a method for producing chitosan-coated nanocapsules carrying tacrolimus and a composition for treating atopic dermatitis containing tacrolimus nanocapsules prepared by the same method, wherein tacrolimus nanocapsules are manufactured with a diameter of 100 nm or less. By establishing the method, tacrolimus nanocapsules can have sustained-release properties, thereby reducing tacrolimus toxicity and improving the treatment effect of atopic dermatitis.

도 1은 키토산 나노캡슐(ChiNC) 및 다양한 양의 타크로리무스가 로딩된 나노캡슐(TAC@ChiNC)의 직경을 나타낸 그래프이다.
도 2는 키토산 나노캡슐(ChiNC) 및 다양한 양의 타크로리무스가 로딩된 나노캡슐(TAC@ChiNC)의 다분산지수(PDI)를 나타낸 그래프이다.
도 3은 키토산 나노캡슐(ChiNC) 및 다양한 양의 타크로리무스가 로딩된 나노캡슐(TAC@ChiNC)의 제타전위를 나타낸 그래프이다.
도 4는 키토산 나노캡슐(ChiNC)(A)과 타크로리무스가 최적의 양으로 로딩된 나노캡슐(TAC@ChiNC)(B)의 투과전자현미경(TEM) 사진이다.
도 5는 TAC@ChiNC의 시간에 따른 직경 및 다분산지수를 나타낸 그래프이다.
도 6은 ChiNC로부터 방출되는 타크로리무스 약물의 7일간 타크로리무스 누적방출량 60~70%(w/w)의 서방출 거동을 나타내는 그래프이다.
도 7은 타크로리무스 및 TAC@ChiNC의 시간에 다른 누적투과량을 나타낸 그래프이다.
도 8은 인간 각질 세포에서의 (a) 키토산 나노캡슐(ChiNC)의 시간, 농도별 세포독성 및 (b) TAC가 담지된 키토산 나노 캡슐 (TAC@ChiNC)의 세포 항증식 효과를 보여주는 그래프이다.
도 9는 인간 각질 세포에서의 키토산 나노캡슐(ChiNC)(CTL), 로다민 b(RD) 및 로다민 b가 담지된 나노캡슐(RD@ChiNC)의 8시간 및 24시간에서의 형광현미경 사진(a) 및 8시간 및 24시간에서의 평균 형광 강도를 나타낸 그래프(b)이다.
도 10은 아토피 유발 물질 도포 후, 프로토픽(Protopic) 처리군, TAC가 담지된 키토산 나노 캡슐 (TAC@ChiNC) 처리군, 아토피 유발 대조군(AD) 및 정상 대조군(Normal)의 귀 사진 및 귀 조직의 H&E 염색 사진이다.
도 11은 아토피 유발 마우스 귀 조직의 시간별 귀 두께(Ear thickness) 및 각 처리군의 표피 두께(Epidermal thickness) 및 진피 두께(Dermal thickness)를 나타낸 그래프이다.
도 12는 아토피 유발 마우스의 각 처리군에 따른 귀 조직 내 TNF-α 및 IL-17 발현 수준 및 혈청 내 IgE의 농도를 나타낸 그래프이다.Figure 1 is a graph showing the diameters of chitosan nanocapsules (ChiNC) and nanocapsules loaded with various amounts of tacrolimus (TAC@ChiNC).
Figure 2 is a graph showing the polydispersity index (PDI) of chitosan nanocapsules (ChiNC) and nanocapsules loaded with various amounts of tacrolimus (TAC@ChiNC).
Figure 3 is a graph showing the zeta potential of chitosan nanocapsules (ChiNC) and nanocapsules loaded with various amounts of tacrolimus (TAC@ChiNC).
Figure 4 is a transmission electron microscope (TEM) photograph of chitosan nanocapsules (ChiNC) (A) and nanocapsules loaded with an optimal amount of tacrolimus (TAC@ChiNC) (B).
Figure 5 is a graph showing the diameter and polydispersity index of TAC@ChiNC over time.
Figure 6 is a graph showing the sustained release behavior of 60-70% (w/w) of tacrolimus cumulative release over 7 days of tacrolimus drug released from ChiNC.
Figure 7 is a graph showing the cumulative permeation amount of tacrolimus and TAC@ChiNC over time.
Figure 8 is a graph showing (a) cytotoxicity of chitosan nanocapsules (ChiNC) by time and concentration and (b) cell anti-proliferation effect of TAC-loaded chitosan nanocapsules (TAC@ChiNC) in human keratinocytes.
Figure 9 shows fluorescence micrographs of chitosan nanocapsules (ChiNC) (CTL), rhodamine b (RD), and rhodamine b-loaded nanocapsules (RD@ChiNC) in human keratinocytes at 8 hours and 24 hours ( a) and a graph (b) showing the average fluorescence intensity at 8 hours and 24 hours.
Figure 10 shows photographs and ear tissues of the ears of the Protopic-treated group, the TAC-loaded chitosan nanocapsule (TAC@ChiNC)-treated group, the atopy-induced control group (AD), and the normal control group (Normal) after application of the atopy-causing substance. This is a photo of H&E staining.
Figure 11 is a graph showing the ear thickness of atopy-induced mouse ear tissue over time and the epidermal thickness and dermal thickness of each treatment group.
Figure 12 is a graph showing the expression levels of TNF-α and IL-17 in ear tissue and the concentration of IgE in serum according to each treatment group of atopy-induced mice.

본 발명자는 아토피 피부염 치료에서 강력한 항염증 효과를 갖고 있으나 피부위축, 혈관확장, 팽창선 등, 부작용이 문제를 동반하는 스테로이드를 대체하는 국소 면역조절제의 서방 특성을 키토산 코팅 나노캡슐 제형 기반으로 연구를 수행하였다. 그러나 기존의 방법으로 타크로리무스(tacrolimus)의 키토산 코팅 나노캡슐 제조 시, 100 nm 이하 직경으로 형성시키기 어려운 점, 100 nm보다 큰 직경의 타크로리무스 나노캡슐의 경우, 제형이 불안정하며, 충분한 서방 특성을 나타내기 어려운 점이 있었으며, 이를 극복하는 과정에서 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventor conducted a study based on a chitosan-coated nanocapsule formulation on the sustained-release properties of a topical immunomodulator that replaces steroids, which have a strong anti-inflammatory effect in the treatment of atopic dermatitis but are accompanied by side effects such as skin atrophy, vasodilation, and swelling glands. did. However, when manufacturing chitosan-coated nanocapsules of tacrolimus using conventional methods, it is difficult to form them with a diameter of less than 100 nm, and in the case of tacrolimus nanocapsules with a diameter larger than 100 nm, the formulation is unstable and does not exhibit sufficient sustained-release properties. There were difficulties, and the present invention was completed in the process of overcoming them.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to the embodiments described herein and may be embodied in other forms. Rather, the content introduced herein is provided to be thorough and complete, and to fully convey the spirit of the present invention to those skilled in the art.

<< 실시예Example 1. One. 타크로리무스tacrolimus 로딩된loaded 키토산 나노 캡슐 ( Chitosan nanocapsules ( ChiNCCHINC ) 제조>) Manufacturing>

본 발명자의 선행기술인 종래 키토산으로 코팅된 나노 캡슐의 제조 공정(한국등록특허 제10-2384808호)을 기반으로 타크로리무스 담지 키토산 나노캡슐을 제조할 경우, 100 nm 이하 직경의 작은 나노캡슐로 제조하기 어려움이 있었다. 특히, 선행실험에서 직경이 100 nm 보다 큰 나노캡슐의 경우, 제형이 불안정하여 나노캡슐 자체가 신속히 붕괴되어 침전을 형성함으로써 실험 진행이 어려웠으며, 이때 담지된 타크로리무스의 전량이 대부분 빠른 시간 내에 방출되었다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 본 발명자는 나노 캡슐 제조 공정의 각 단계를 최적화하면서, 특히 반응 용액의 유기용매를 제거하고 나노입자를 제조하는 2단계에서 에탄올 제거 시 온도, 압력 조건이 불규칙하여 캡슐 형성 시 직경이 과도하게 증가하는 것을 확인하였다.When manufacturing tacrolimus-loaded chitosan nanocapsules based on the present inventor's prior art manufacturing process of conventional chitosan-coated nanocapsules (Korean Patent No. 10-2384808), it is difficult to manufacture small nanocapsules with a diameter of 100 nm or less. There was this. In particular, in the case of nanocapsules with a diameter larger than 100 nm in previous experiments, the formulation was unstable and the nanocapsules themselves quickly collapsed and formed a precipitate, making it difficult to proceed with the experiment. At this time, most of the entire amount of loaded tacrolimus was released within a short period of time. . In order to solve this problem, the present inventor optimized each step of the nanocapsule manufacturing process, especially in the second step of removing the organic solvent of the reaction solution and manufacturing nanoparticles, when temperature and pressure conditions were irregular when removing ethanol, so when forming capsules, It was confirmed that the diameter increased excessively.

이에 따라 활성제인 타크로리무스와 플루로닉을 유기용매에 용해시킨 반응용액을 증류수에 적가하면서 유기용매를 제거하는 과정을, 반응용액을 증류수에 적가하여 반응시키는 과정과 유기용매를 일정 조건에서 동결건조과정을 통하여 제거하는 과정으로 구분하고, 유기용매를 동결건조를 통해 제거 시, 온도 및 압력 조건을 일정하게 유지하면서 3~5일간 동결건조함으로써 일정 직경 이하의 타크로리무스가 담지된 나노입자를 제조하였다. 또한, 상기 최적화 과정에도 불구하고 담지되는 타크로리무스의 양이 일정 농도를 벗어나는 경우, 나노캡슐의 직경이 급격하게 증가하는 문제가 있어, 타크로리무스의 담지 농도를 3wt%(중량%) 이하로 최적화함으로써 100 nm이하의 작은 나노캡슐 제조를 완료할 수 있었다.Accordingly, the reaction solution in which the active agents tacrolimus and pluronic are dissolved in an organic solvent is added dropwise to distilled water to remove the organic solvent, the reaction solution is added dropwise to distilled water to react, and the organic solvent is freeze-dried under certain conditions. When the organic solvent was removed through freeze-drying, nanoparticles loaded with tacrolimus of a certain diameter or less were prepared by freeze-drying for 3 to 5 days while maintaining constant temperature and pressure conditions. In addition, despite the above optimization process, if the amount of tacrolimus loaded exceeds a certain concentration, there is a problem that the diameter of the nanocapsule increases rapidly. Therefore, by optimizing the loaded concentration of tacrolimus to 3 wt% (wt%) or less, We were able to complete the production of the following small nanocapsules.

타크로리무스 0, 0.4, 0.6, 0.8, 1mg을 95~99% 에탄올(sigma) 1mL에 녹여준 뒤, 플루로닉 F127 20mg을 첨가하여 상온에서 2시간 동안 반응시켜 주었다. 그 후 반응용액을 4000 rpm으로 교반하고 있는 4 mL의 증류수에 천천히 용액 방울을 천천히 적가한 뒤 1시간 상온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 용액들을 유기용매 아래 동결건조기를 이용하여 -40℃에서 20℃까지 순차적으로 온도를 상승시켜, 총 3일 이상의 공정시간으로 에탄올을 제거하였다. 온도 및 압력의 변화를 완화시킨 이러한 에탄올 제거 과정을 통하여 종래기술보다 작고 균일한 타크로리무스가 담지된 나노입자를 생성할 수 있었다.Tacrolimus 0, 0.4, 0.6, 0.8, and 1 mg were dissolved in 1 mL of 95-99% ethanol (Sigma), then 20 mg of Pluronic F127 was added and reacted at room temperature for 2 hours. Afterwards, droplets of the reaction solution were slowly added dropwise to 4 mL of distilled water being stirred at 4000 rpm and reacted at room temperature for 1 hour. The temperature of the reacted solutions was sequentially raised from -40°C to 20°C using a freeze dryer under an organic solvent to remove ethanol over a total process time of more than 3 days. Through this ethanol removal process that alleviated changes in temperature and pressure, it was possible to produce tacrolimus-loaded nanoparticles that were smaller and more uniform than those of the prior art.

건조가 완료된 파우더를 4mL의 증류슈에 재분산 시켜준 후, 로딩되지 않은 약물을 제거하기 위하여 최종적으로 한외여과(ultrafiltration, Amicon Ultra-15 filter)를 진행하였다. 그 후, 키토산 20mg를 첨가하여 2시간 동안 상온에서 회전 혼합을 통해 반응시켜주어 키토산으로 코팅된 나노캡슐을 제조하였다.The dried powder was redispersed in 4 mL of distilled sugar, and then ultrafiltration (Amicon Ultra-15 filter) was finally performed to remove unloaded drugs. Afterwards, 20 mg of chitosan was added and reacted by rotating mixing at room temperature for 2 hours to prepare nanocapsules coated with chitosan.

제조한 나노 캡슐의 크기를 입도분석기(Zetasizer, Nono-Zs, Malvern)와 투과전자현미경(transmission electron microscopy)을 이용하여 분석하였고, 그 결과로 나노캡슐의 직경(diameter), 다분산지수(Poly Dispersity Index, PDI), 제타전위(zeta potential)를 도 1 내지 도 3에 나타내었다.The size of the manufactured nanocapsules was analyzed using a particle size analyzer (Zetasizer, Nono-Zs, Malvern) and a transmission electron microscope. As a result, the diameter and polydispersity of the nanocapsules were analyzed. Index, PDI) and zeta potential are shown in Figures 1 to 3.

도 1에서 보듯이, 나노침전법으로 제조된 약물을 담지하지 않은 ChiNC는 37℃에서 70nm 정도의 크기를 보여주었다. 한편, 타크로리무스가 담지된 나노캡슐 (TAC@ChiNC) 크기는 3wt% 까지 100 nm 이하를 보여주어 타크로리무스가 담지되지 않은 ChiNC와 큰 차이를 보이지 않았다. 그러나 4wt% 로딩부터 나노캡슐의 크기가 급격히 커져 지며 차이를 보였다. 타크로리무스를 4wt% 로딩한 경우, 타크로리무스 담지 나노캡슐의 직경은 타크로리무스를 3wt% 로딩한 타크로리무스 담지 나노캡슐 직경의 10배가 넘었으며, 타크로리무스를 4wt% 로딩한 경우, 타크로리무스 담지 나노캡슐의 직경은 1000 nm를 넘었다. 타크로리무스 로딩양에 따른 나노캡슐 크기의 차이는 마크로라이드 기반의 타크로리무스 구조 특성에 의한 것으로 추측된다. 타크로리무스 과용량시 키토산 나노캡슐의 불안정성 특성에 의하여 로딩량이 4wt% 이상일 경우 나노캡슐의 안정성이 떨어서 부분 침전 또는 마이크로 크기를 나타내었다. 그러나 타크로리무스 3wt% 이하에서 안정한 100nm이하의 나노캡슐을 제조할 수 있었다.As shown in Figure 1, the drug-free ChiNC prepared by nanoprecipitation showed a size of about 70 nm at 37°C. Meanwhile, the size of the tacrolimus-loaded nanocapsules (TAC@ChiNC) was less than 100 nm up to 3wt%, showing no significant difference from the ChiNC without tacrolimus. However, starting from 4wt% loading, the size of the nanocapsules increased rapidly, showing a difference. When 4 wt% of tacrolimus was loaded, the diameter of the tacrolimus-loaded nanocapsule was over 10 times the diameter of the tacrolimus-loaded nanocapsule loaded with 3 wt% of tacrolimus, and when 4 wt% of tacrolimus was loaded, the diameter of the tacrolimus-loaded nanocapsule was 1000 nm. It passed. It is assumed that the difference in nanocapsule size depending on the tacrolimus loading amount is due to the structural characteristics of macrolide-based tacrolimus. Due to the instability characteristics of chitosan nanocapsules when tacrolimus is overdosed, when the loading amount is more than 4wt%, the stability of the nanocapsules is low, resulting in partial precipitation or micro size. However, it was possible to manufacture stable nanocapsules of 100 nm or less at less than 3 wt% of tacrolimus.

또한 도 2에서 보는 바와 같이, ChiNC 자체 및 타크로리무스 3wt%이하 로딩된 나노캡슐의 경우 다분산지수가 0.2 이하로 안정된 반면, 4wt%로 로딩된 TAC@ChiNC에서 분산값의 편차가 커지며, 재현성이 불안정하여 제형의 안정성을 확인하기 어려웠다. 또한 5wt 로딩부터 다분산지수가 0.3 이상을 보여주며 제형 불안정성을 나타내었다.Additionally, as shown in Figure 2, in the case of ChiNC itself and nanocapsules loaded with 3 wt% or less of tacrolimus, the polydispersity index was stable at 0.2 or less, whereas in TAC@ChiNC loaded with 4 wt%, the deviation of the dispersion value increased and reproducibility was unstable. Therefore, it was difficult to confirm the stability of the formulation. In addition, starting from 5wt loading, the polydispersity index was above 0.3, indicating formulation instability.

표면전하를 측정한 결과 도 3에서 보는 바와 같이, ChiNC와 타크로리무스가 2~5wt 로딩된 ChiNC가 모두에서 약 20~25mV로 큰 차이를 보이지 않았다. As a result of measuring the surface charge, as shown in Figure 3, there was no significant difference at about 20 to 25 mV for both ChiNC and ChiNC loaded with 2 to 5 wt of tacrolimus.

도 4는 약물이 담지되지 않은 키토산 나노 캡슐(ChiNC)(A)과 타크로리무스가 3wt로 로딩된 ChiNC의 구조 및 형태를 보여주는 투과전자현미경(transmission electron microscopy, TEM) 사진이다.Figure 4 is a transmission electron microscopy (TEM) photograph showing the structure and morphology of chitosan nanocapsules (ChiNC) (A) without drug and ChiNC loaded with 3wt tacrolimus.

도 4에서 보듯이, 키토산 나노캡슐(ChiNC)과 타크로리무스가 3wt%로 로딩된 ChiNC (TAC@ChiNC) 모두 구형구조이면서 둘의 크기가 차이가 없어, 약물 로딩에 따른 나노입자의 물리화학적 특성에 큰 영향을 주지 않는다는 것을 암시하였다. 또한, 타크로리무스의 액체응축/액체팽창(LC/LE)을 HPLC를 통해 평가한 결과, 99% 이상의 높은 효율을 보여주었다. As shown in Figure 4, both chitosan nanocapsules (ChiNC) and ChiNC loaded with 3 wt% of tacrolimus (TAC@ChiNC) have spherical structures and there is no difference in size between the two, which has a significant impact on the physicochemical properties of nanoparticles according to drug loading. It was implied that it had no effect. In addition, the liquid condensation/liquid expansion (LC/LE) of tacrolimus was evaluated through HPLC, showing a high efficiency of over 99%.

이러한 결과를 바탕으로 타크로리무스는 3wt%로 약물을 로딩하여 나노캡슐을 제조함으로써 나노입자의 물리화학적 특성에 큰 영향을 주지 않으면서도 안정적으로 나노캡슐을 제조할 수 있으며, 많은 양의 타크로리무스를 로딩할 수 있음을 확인하였다. 이하 실험은 타크로리무스는 3wt%로 로딩된 나노캡슐을 사용하여 진행하였다.Based on these results, by manufacturing nanocapsules by loading the drug at 3wt%, nanocapsules can be manufactured stably without significantly affecting the physicochemical properties of the nanoparticles, and large amounts of tacrolimus can be loaded. It was confirmed that it exists. The following experiment was conducted using nanocapsules loaded with 3 wt% of tacrolimus.

<< 실시예Example 2. 2. 타크로리무스tacrolimus 나노 캡슐의 안정성 평가> Stability evaluation of nanocapsules>

상기 실시예 1에서 제조한 타크로리무스 나노 캡슐(TAC@ChiNC)의 안정성을 평가하였다. 구체적으로, TAC@ChiNC를 상기와 같이 나노침전법을 통해 제조 후, 유기용매용 동결건조기를 이용하여 모든 용매를 제거하였다. 이 후, 생체 환경과 유사한 PBS에 재분산하여 37℃ 환경에서 4주 동안의 방치하면서 1, 2, 3 및 4주째에 나노캡슐(Diameter)의 직경 및 다분산지수(PDI)를 측정하여 도 5에 나타내었다.The stability of tacrolimus nanocapsules (TAC@ChiNC) prepared in Example 1 was evaluated. Specifically, after TAC@ChiNC was prepared through the nanoprecipitation method as above, all solvents were removed using a freeze dryer for organic solvents. Afterwards, the diameter and polydispersity index (PDI) of the nanocapsules (Diameter) were measured at 1, 2, 3, and 4 weeks while re-dispersed in PBS similar to the living environment and left in an environment at 37°C for 4 weeks, as shown in Figure 5 . shown in

도 5에서 보는 바와 같이, TAC@ChiNC은 PBS에서 4주에 걸쳐 나노캡슐의 직경에 큰 차이를 보이지 않았다. 또한, PDI값도 0.3 이하로 단분산성을 보였다. 이러한 결과를 통해 TAC@ChiNC는 4주 동안 생체 내에서의 안정성을 유지하는 것을 확인하였으며, 이로써 추후 TAC@ChiNC가 안정적으로 생체 내에서 아토피 치료 효과를 낼 수 있음을 확인하였다.As shown in Figure 5, TAC@ChiNC showed no significant difference in the diameter of nanocapsules over 4 weeks in PBS. In addition, the PDI value was less than 0.3, showing monodispersity. Through these results, it was confirmed that TAC@ChiNC maintained its stability in vivo for 4 weeks, thereby confirming that TAC@ChiNC can stably produce an atopy treatment effect in vivo in the future.

<< 실시예Example 3. 3. 타크로리무스tacrolimus 나노 캡슐의 of nano capsules 서방출sustained release 평가> Evaluation>

타크로리무스를 외용제로 사용하는 경우, 고용량 투여로 인한 부작용 문제를 극복하기 위하여 본 발명에 따른 타크로리무스 나노 캡슐의 방출 특성을 평가하였다.When tacrolimus is used as an external agent, the release characteristics of the tacrolimus nanocapsule according to the present invention were evaluated to overcome the problem of side effects due to high dose administration.

상기에서 제조한 타크로리무스가 담지된 키토산 나노캡슐(TAC@ChiNC) 10 mg을 투석용 튜브(dialysis tube, Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device, 100kD)에 넣은 다음, 지용성 약물의 방출 거동을 촉진시키는 계면활성제(surfactant) tween 80 0.5%를 첨가한 PBS(pH 7.4) 10ml에 넣고 37℃로 예열시킨 후 100rpm, 37℃에서 방출 실험을 수행하였다. 타크로리무스의 방출 거동을 확인하기 위하여 20분, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 1일, 2일, 3일, 5일 및 7일에 방출 버퍼 10ml를 각각 수집하고, 고성능 액체 크로마토그래피(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC)를 통하여 버퍼에 방출된 타크로리무스의 농도를 확인하였다 (HPLC의 조건은 C18 column, Acetonitrile : DIW = 7 : 3의 eluent, 20μl injection volume, 1ml/min flow rate, 205nm UV detection wavelength). 방출실험이 끝난 이후의 시점에서 Dialysis tube에 남아 있는 TAC@ChiNC를 동결건조하여 남아 있는 약물의 양을 HPLC로 정량 분석하였다. 실험은 3번 반복하고(n = 3) 도 6에 그 결과를 나타내었다.10 mg of the tacrolimus-loaded chitosan nanocapsules (TAC@ChiNC) prepared above were placed in a dialysis tube (Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device, 100kD), and then placed at an interface that promotes the release of fat-soluble drugs. It was placed in 10 ml of PBS (pH 7.4) containing 0.5% of surfactant Tween 80, preheated to 37°C, and a release experiment was performed at 100 rpm and 37°C. To confirm the release behavior of tacrolimus, 10 ml of release buffer was collected at 20 minutes, 2 hours, 4 hours, 6 hours, 8 hours, 1 day, 2 days, 3 days, 5 days, and 7 days, respectively, and subjected to high-performance liquid chromatography. The concentration of tacrolimus released in the buffer was confirmed through High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) (HPLC conditions were C18 column, Acetonitrile: DIW = 7:3 eluent, 20μl injection volume, 1ml/min flow rate, 205nm. UV detection wavelength). After the release experiment was completed, the TAC@ChiNC remaining in the dialysis tube was freeze-dried and the amount of remaining drug was quantitatively analyzed by HPLC. The experiment was repeated three times (n = 3) and the results are shown in Figure 6.

도 6에서 보는 바와 같이, 타크로리무스는 시간에 따라 지속적으로 방출되었으며, 1일에 20~40%, 2일에 40~60%, 5일에 50~65%, 7일에 60~70%의 누적방출량 특히 7일에 걸쳐 60~70%가 순차적으로 방출됨을 알 수 있었다. 이러한 TAC@ChiNC의 서방출 특성은 생체 내에서 약물의 지속적 방출을 통해 고용량의 독성에 대한 위험을 감소시키고, 한 번에 투여할 투여빈도와 투여량을 줄여 환자의 순응도 및 편의성을 증가시키고 치료 효과를 개선할 수 있다.As shown in Figure 6, tacrolimus was released continuously over time, with an accumulation of 20-40% on day 1, 40-60% on day 2, 50-65% on day 5, and 60-70% on day 7. It was found that 60-70% of the emissions were released sequentially, especially over 7 days. This sustained-release characteristic of TAC@ChiNC reduces the risk of high-dose toxicity through continuous release of the drug in vivo, increases patient compliance and convenience by reducing the administration frequency and dose to be administered at one time, and improves therapeutic effect. can be improved.

<< 실시예Example 4. 4. 타크로리무스tacrolimus 나노 캡슐의 피부투과 실험> Skin penetration experiment of nanocapsules>

타크로리무스 150 μg을 4mL의 DIW에 녹인 샘플 (TAC)을 준비 후, 같은 양의 타크로리무스가 담지된 키토산 나노 캡슐(TAC@ChiNC)을 실시예 1의 방법으로 준비하였다. 0.636 cm² 로 자른 전두께(full-thickness)의 인간 피부 샘플 (58 years old/male, back, the certified intact skin)을 프란츠 경피 흡수 모델(Franz-type diffusion cell, FDC-6T, Logan Instruments, Somerset, NJ, USA)에 올린 후, 수용챔버에 0.05%의 polysorbate 80이 포함된 PBS 버퍼를 주입하였다. 그리고 준비된 두 샘플 (TAC, TAC@ChiNC)를 피부에 각각 처리한 후, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 18시간 및 24시간이 되는 시점에 수용챔버의 PBS 버퍼를 각각 수득하고, TAC 및 HPLC를 이용하여 정량 분석을 수행하였다. 실험은 3번 반복하고(n = 3) 그 결과를 도 7에 나타내었다. (타크로리무스의 정량분석을 위해 HPLC 조건은 C18 column, Acetonitrile : DIW = 7:3의 eluent, 20μl injection volume, 1ml/min flow rate, 205nm UV detection wavelength).After preparing a sample (TAC) in which 150 μg of tacrolimus was dissolved in 4 mL of DIW, chitosan nanocapsules (TAC@ChiNC) containing the same amount of tacrolimus were prepared by the method of Example 1. A full-thickness human skin sample (58 years old/male, back, the certified intact skin) cut into 0.636 cm ² was subjected to a Franz transdermal absorption model (Franz-type diffusion cell, FDC-6T, Logan Instruments, Somerset). , NJ, USA), and then PBS buffer containing 0.05% polysorbate 80 was injected into the receiving chamber. After treating the two prepared samples (TAC, TAC@ChiNC) on the skin, the PBS in the receiving chamber was treated at 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 4 hours, 8 hours, 12 hours, 18 hours, and 24 hours. Each buffer was obtained, and quantitative analysis was performed using TAC and HPLC. The experiment was repeated three times (n = 3) and the results are shown in Figure 7. (For quantitative analysis of tacrolimus, HPLC conditions are C18 column, Acetonitrile: DIW = 7:3 eluent, 20μl injection volume, 1ml/min flow rate, 205nm UV detection wavelength).

도 7에서 보는 바와 같이, TAC@ChiNC은 TAC와 비교하여 월등한 피부투과율을 나타내었으며, 피부적용 24시간 째에는 TAC@ChiNC의 피부투과율은 TAC에 비해 약 9배 증가하였다. 타크로리무스(TAC)자체가 물(증류수)에 잘 용해되지 않는 특성을 갖고 있다. 본 실험을 통하여 이러한 TAC를 ChiNC에 담지하는 경우 수용액에서 피부투과가 현저히 증가함을 확인할 수 있었다.As shown in Figure 7, TAC@ChiNC showed superior skin permeability compared to TAC, and at 24 hours after skin application, the skin permeability of TAC@ChiNC increased about 9 times compared to TAC. Tacrolimus (TAC) itself has the property of not dissolving well in water (distilled water). Through this experiment, it was confirmed that when TAC was loaded on ChiNC, skin permeation was significantly increased in aqueous solution.

<< 실시예Example 5. 5. 타크로리무스Tacrolimus 나노 캡슐의 세포독성 및 각질세포 Cytotoxicity and keratinocytes of nanocapsules 항증식antiproliferative 효과 확인> Check the effect>

먼저, 나노캡슐의 세포독성을 확인하였다. 먼저 인간 표피 각질세포 (HaCaT, ATCC)를 96-well plate에 한 well당 세포 수 1×10⁴씩 분주하고 37℃, 5% CO₂환경에서 12시간 이상 배양시켰다. 이후, 10%의 태아 소 혈청(FBS)과 1%의 페니실린/스트렙토마이신(PS)이 포함된 DMEM-1640 배지에 약물이 담지되지 않은 ChiNC를 0.5-5mg/ml의 농도로 24시간 또는 48시간 처리하고 세포계수키트-8(Cell Counting Kit-8, CCK-8, Sigma-Aldrich)를 사용하여 세포독성을 측정하여 그 결과를 도 8(a)에 나타내었다. 세포계수키트-8를 이용한 검출은 제조사의 매뉴얼에 따라 CCK-8:배지를 1:9의 비율로 혼합한 용액을 각 세포에 100μl씩 처리하고 30분 동안 빛을 차단한 상태에서 배양한 후, 450nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존률을 결정하였다. 도 8(a)에서 보는 바와 같이, ChiNC 자체는 24시간 뿐 아니라 48시간 처리에서 5mg/mL의 고농도를 처리하여도 90% 이상의 cell viability 보여주며 HaCaT cell에서 세포독성을 나타내지 않았다.First, the cytotoxicity of nanocapsules was confirmed. First, human epidermal keratinocytes (HaCaT, ATCC) were dispensed into a 96-well plate at a number of 1 × 10 ⁴ cells per well and cultured at 37°C in a 5% CO ₂ environment for more than 12 hours. Afterwards, drug-free ChiNC was incubated at a concentration of 0.5-5 mg/ml in DMEM-1640 medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin (PS) for 24 or 48 hours. After treatment, cytotoxicity was measured using Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Sigma-Aldrich), and the results are shown in Figure 8(a). For detection using Cell Counting Kit-8, according to the manufacturer's manual, each cell was treated with 100 μl of a solution of CCK-8:medium mixed at a ratio of 1:9 and cultured for 30 minutes while blocking light. Cell viability was determined by measuring absorbance at 450 nm. As shown in Figure 8(a), ChiNC itself showed cell viability of more than 90% even when treated at a high concentration of 5 mg/mL for not only 24 hours but also 48 hours and did not show cytotoxicity in HaCaT cells.

또한, 인간 표피 각질세포에서 타크로리무스 나노캡슐의 항증식 효과를 확인하였다. 세포배지(CTL), 증류수에 용해시킨 TAC, DMSO에 용해시킨 TAC 및 TAC@ChiNC를 TAC 기준 20 또는 40 μg/mL의 농도로 24 시간동안 처리하고, 상기와 같은 방법으로 세포계수키트-8(Cell Counting Kit-8, CCK-8, Sigma-Aldrich)를 사용하여 세포 생존률을 측정하여 도 8(b)에 나타내었다. 도 8(b)에서 보는 바와 같이, 세포배지만을 처리한 CTL과 비교하였을 때 증류수에 용해시킨 TAC는 HaCaT cell에서의 항증식 효과가 미미하였다. 그러나, DMSO에 용해시킨 TAC는 20 μg/mL에서 약 14% 의 각질세포의 항증식 효과를 나타내었으며, 40 μg/mL 에서는 43%의 항증식 효과를 나타내었다. 이와 비교하여 TAC@ChiNC는 20 μg/mL에서 28%, 40μg/mL에서는 42%의 항증식 효과를 나타내어 DMSO에 용해시킨 TAC와 유사하거나 더 높은 항증식 효과를 나타내었다. 즉, TAC@ChiNC는 수용액에서 타크로리무스의 높은 항증식효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다. 이를 통해 타크로리무스를 나노캡슐에 담지시키는 경우, 피부에 독성을 나타내는 용매를 이용하지 않으면서도 아토피 피부염 또는 건선치료에서 더 나은 치료 효과를 얻을 수 있음을 확인하였으며, 특히 TAC@ChiNC는 TAC의 최적 용매로 알려져 있으나 피부독성이 있는 DMSO를 사용하지 않고도, 그에 상응하는 각질세포의 증식억제 효과를 수용액 상에서 나타낼 수 있음을 확인하였다.Additionally, the antiproliferative effect of tacrolimus nanocapsules was confirmed in human epidermal keratinocytes. Cell medium (CTL), TAC dissolved in distilled water, TAC dissolved in DMSO, and TAC@ChiNC were treated for 24 hours at a concentration of 20 or 40 μg/mL based on TAC, and used as the cell counting kit-8 ( Cell survival rate was measured using Cell Counting Kit-8, CCK-8, Sigma-Aldrich) and is shown in Figure 8(b). As shown in Figure 8(b), compared to CTL treated with only cell medium, TAC dissolved in distilled water had a minimal anti-proliferative effect on HaCaT cells. However, TAC dissolved in DMSO showed an anti-proliferative effect of about 14% on keratinocytes at 20 μg/mL, and an anti-proliferative effect of 43% at 40 μg/mL. In comparison, TAC@ChiNC showed an anti-proliferative effect of 28% at 20 μg/mL and 42% at 40 μg/mL, showing a similar or higher anti-proliferative effect than TAC dissolved in DMSO. In other words, it was confirmed that TAC@ChiNC can exhibit a high antiproliferative effect of tacrolimus in aqueous solution. Through this, it was confirmed that when tacrolimus is loaded into nanocapsules, better therapeutic effects can be obtained in the treatment of atopic dermatitis or psoriasis without using solvents that are toxic to the skin. In particular, TAC@ChiNC is the optimal solvent for TAC. It was confirmed that the corresponding anti-proliferation effect of keratinocytes can be achieved in an aqueous solution without using DMSO, which is known to be toxic to the skin.

<< 실시예Example 6. 6. 타크로리무스tacrolimus 나노 캡슐의 세포 흡수율 확인> Check the cellular absorption rate of nanocapsules>

ChiNC가 세포내로 지용성 약물을 효과적으로 전달할 수 있는지 확인하였다. 이를 위해서, 모델 지용성 약물인 로다민 b(Rhodamine b, RD)를 선택하여 ChiNC에 담지하고 세포내 전달을 확인하였다.It was confirmed whether ChiNC can effectively deliver fat-soluble drugs into cells. For this purpose, Rhodamine b (RD), a model fat-soluble drug, was selected, loaded on ChiNC, and intracellular delivery was confirmed.

200μg/mL의 농도로 RD를 DMSO에 희석시켜준 후, 20mg의 PF127에 첨가하여 상온에서 2시간 반응시켜 주었다. 그 후, 반응용액을 400rpm 으로 교반하고 있는 4 mL의 3차 증류수에 천천히 적가해준 뒤 유기용매용 동결건조기를 이용하여 DMSO를 3일 동안 제거하였다. 그 후, 증류수 4mL에 재분산하고 로딩되지 않은 약물을 제거하기 위해 최종적으로 한외여과(ultrafiltration, Amicon Ultra-15 filter)를 수행하였다. 이후, 20mg의 키토산을 넣고 2시간 동안 반응시켜 RD@ChiNC를 제조하였다.RD was diluted in DMSO to a concentration of 200 μg/mL, then added to 20 mg of PF127 and reacted at room temperature for 2 hours. Afterwards, the reaction solution was slowly added dropwise to 4 mL of triple distilled water being stirred at 400 rpm, and DMSO was removed using a freeze dryer for organic solvents for 3 days. Afterwards, it was redispersed in 4 mL of distilled water and finally ultrafiltration (Amicon Ultra-15 filter) was performed to remove unloaded drugs. Afterwards, 20 mg of chitosan was added and reacted for 2 hours to prepare RD@ChiNC.

RD 자체와 RD@ChiNC의 세포흡수율의 차이를 확인하기 위해, HaCaT cell을 12-well plate에 1×10⁶씩 분주하고 37℃, 5% CO₂환경에서 12시간 이상 배양시켰다. 그 후, 배지(CTL), RD 및 RD@ChiNC를 RD 기준 0.05μg/mL의 농도로 각 세포에 처리한 다음, 8시간 및 24시간 후에 형광현미경으로 세포흡수율을 확인하고, Image J로 정량 분석을 수행하여 도 9(a) 및 9(b)에 나타내었다. To confirm the difference in the cellular uptake rate of RD itself and RD@ChiNC, HaCaT cells were distributed 1 × 10 ⁶ into a 12-well plate and cultured at 37°C in a 5% CO ₂ environment for more than 12 hours. Afterwards, medium (CTL), RD, and RD@ChiNC were treated with each cell at a concentration of 0.05 μg/mL based on RD, and cell uptake was confirmed using a fluorescence microscope after 8 and 24 hours, and quantitative analysis was performed using Image J. was performed and shown in Figures 9(a) and 9(b).

도 9(a)에서 보는 바와 같이, 세포 배지만 처리한 CTL 그룹에서는 형광물질이 없으므로 형광이 감지되지 않았다. 또한 지용성 형광물질인 RD를 그대로 처리한 군도 세포 내에서 형광이 나타나지 않았다. 이는 RD이 가용화 문제로 세포 안에 전달되지 않음을 알 수 있다. 그러나 RD를 나노캡슐에 담지시킨 RD@ChiNC는 8시간 배양시간에서 세포 내에서 형광이 감지되었으며, 24시간 배양 시 형광이 더욱 증가하였다. 이를 정량분석하면 도 9(b)에서 보는 바와 같이, 8시간에 비해 24시간 후 형광 강도가 약 5배 증가하여, ChiNC는 지용성 약물을 매우 효율적으로 세포 내로 흡수시킬 수 있음을 확인하였다.As shown in Figure 9(a), fluorescence was not detected in the CTL group treated with only cell medium because there was no fluorescent material. In addition, the group treated with RD, a lipid-soluble fluorescent substance, did not show fluorescence within the cells. This shows that RD is not delivered into cells due to solubilization issues. However, in RD@ChiNC containing RD in nanocapsules, fluorescence was detected within the cells at 8 hours of incubation, and the fluorescence further increased after 24 hours of incubation. When quantitatively analyzing this, as shown in Figure 9(b), the fluorescence intensity increased about 5 times after 24 hours compared to 8 hours, confirming that ChiNC can absorb fat-soluble drugs into cells very efficiently.

<< 실시예Example 7. 7. 타크로리무스Tacrolimus 나노 캡슐의 아토피 완화 평가> Evaluation of nanocapsules to alleviate atopic dermatitis>

상기에서 제작한 타크로리무스 키토산 나노 캡슐(TAC@ChiNC)의 아토피 피부염에 대한 효과를 확인하였다. 8주령 수컷 Balb/c 마우스의 귀를 제모크림을 이용하여 제모 후, 집먼지 진드기 알레르겐 포함 연고(house dust mite, HDM, Biostir AD)를 100mg을 면봉을 이용하여 귀에 도포하였다. 두 번째 유발부터는 4% SDS 수용액 100μL을 귀에 도포하고 3~4시간 자연건조 시켜 피부장벽을 파괴한 후 같은 방법으로 HDM을 도포하여 아토피 피부염을 유도하였다.The effect of the tacrolimus chitosan nanocapsules (TAC@ChiNC) produced above on atopic dermatitis was confirmed. After the ears of an 8-week-old male Balb/c mouse were removed using a hair removal cream, 100 mg of ointment containing house dust mite allergen (HDM, Biostir AD) was applied to the ears using a cotton swab. From the second induction, 100 μL of 4% SDS aqueous solution was applied to the ears, dried naturally for 3 to 4 hours to destroy the skin barrier, and then HDM was applied in the same manner to induce atopic dermatitis.

아토피 피부염이 유도된 후 13일째 되는 날부터 2주간 TAC@ChiNC 처리군은 0.001, 0.01, 0.05 및 0.1%(w/v)의 TAC@ChiNC 수용액 100 μL씩을 아토피 피부염이 유도된 마우스의 귀에 매일 1회 도포하였다. 대조군(무처리군)(control group)은 증류수 100 μL 및 타크로리무스 연고제인 프로토픽(Protopic 0.1%, tacrolimus ointment, Leo Pharma, USA) 100mg을 귀에 역시 매일 1회 도포하였다. 아토피 피부염이 유도 후 26일째 되는 날 마우스를 희생시키고 혈액과 귀 조직을 수득하였다.For 2 weeks starting from the 13th day after the induction of atopic dermatitis, the TAC@ChiNC treatment group injected 100 μL of 0.001, 0.01, 0.05, and 0.1% (w/v) TAC@ChiNC aqueous solution into the ears of mice with atopic dermatitis induced daily. It was applied twice. In the control group (untreated group), 100 μL of distilled water and 100 mg of tacrolimus ointment Protopic (Protopic 0.1%, tacrolimus ointment, Leo Pharma, USA) were applied to the ears once daily. On the 26th day after induction of atopic dermatitis, mice were sacrificed and blood and ear tissues were obtained.

조직병리학적 분석을 위해 귀 조직을 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 이용하여 고정시키고 파라핀 엠베딩하여 파라핀 블록을 만든 다음, 5 μm의 두께로 섹션하였다. 그 후, 이를 자일렌 및 농도를 달리하는 xylene과 농도를 달리한 에탄올을 이용하여 파라핀을 제거한 다음, 헤마톡실린 및 에오신으로 조직을 염색(H&E staining)을 수행하였다. 마우스 아토피 염증 모델에서의 TAC@ChiNC 효과 및 이의 헤마톡실린 및 에오신 조직염색 결과를 도 10에 나타내었다. 또한 이때 파라핀이 제거된 조직 샘플의 진피(dermis)와 표피(epidermis)의 두께를 측정하고 이를 도 11에 나타내었다. 도 10 및 도 11에서 보는 바와 같이, H&E staining을 통한 조직학 분석 결과 및 귀 조직 샘플의 두께 측정결과, HDM에 의한 아토피 피부염 유발 모델(AD)의 귀 조직의 진피 및 표피는 그 두께가 모두 증가하였으며, 상기 증가된 귀 조직의 진피 및 표피의 두께는 TAC@ChiNC 농도 의존적으로 감소하였다. 특히 TAC@ChiNC는 타크로리무스 0.1% 연고제인 프로토픽 처리군보다 더 낮은 농도에서 아토피염이 유발된 마우스 귀조직의 진피 및 표피의 두께를 효과적으로 감소시켰다.For histopathological analysis, ear tissue was fixed using 4% paraformaldehyde, embedded in paraffin to create a paraffin block, and then sectioned at a thickness of 5 μm. Afterwards, the paraffin was removed using xylene and different concentrations of ethanol, and then the tissue was stained with hematoxylin and eosin (H&E staining). The effect of TAC@ChiNC in the mouse atopic inflammation model and the results of its hematoxylin and eosin tissue staining are shown in Figure 10. Also, at this time, the thickness of the dermis and epidermis of the tissue sample from which paraffin was removed was measured and shown in Figure 11. As shown in Figures 10 and 11, the results of histological analysis through H&E staining and the thickness measurement of ear tissue samples showed that the thickness of both the dermis and epidermis of the ear tissue of the atopic dermatitis-induced model (AD) increased by HDM. , the thickness of the dermis and epidermis of the increased ear tissue decreased in a TAC@ChiNC concentration-dependent manner. In particular, TAC@ChiNC effectively reduced the thickness of the dermis and epidermis of atopic dermatitis-induced mouse ear tissue at a lower concentration than the group treated with Protopic, a 0.1% tacrolimus ointment.

상기 아토피 피부염이 유발된 마우스 귀 조직에서 TAC@ChiNC의 아토피 유발 인자 억제 기전을 검증하기 위해, 염증성 사이토카인의 발현을 확인하였다. 상기 수득한 귀 조직을 트리졸 시약을 이용하여 총 RNA를 수득한 후, qRT-PCR를 통하여 TNF-α 및 IL-17의 발현 수준을 확인하고 이를 도 12에 나타내었다. 또한 마우스 IgE ELISA kit(Pink-ONE, KomaBiotech)를 이용하여 정상대조군(Normal), 아토피 유발군(AD), 아토피 유발군+농도별 TAC@ChiNC 처리군(TAC@ChiNC), 아토피 유발군+프로토픽 0.1% 처리군(Protopic)의 마우스 혈청 내 IgE 의 수준을 측정하여 역시 도 12에 나타내었다.In order to verify the mechanism of TAC@ChiNC suppressing atopy-inducing factors in the atopic dermatitis-induced mouse ear tissue, the expression of inflammatory cytokines was confirmed. After obtaining total RNA from the obtained ear tissue using Trizol reagent, the expression levels of TNF-α and IL-17 were confirmed through qRT-PCR and are shown in Figure 12. In addition, using the mouse IgE ELISA kit (Pink-ONE, KomaBiotech), normal control group (Normal), atopy-induced group (AD), atopy-induced group + TAC@ChiNC treatment group by concentration (TAC@ChiNC), atopy-induced group + Protopic The level of IgE in the mouse serum of the 0.1% treatment group (Protopic) was measured and is also shown in Figure 12.

아토피 피부염은 Th2 세포 매개 면역 반응이 우세한 것으로 알려져 있다. 활성화된 Th2 세포는 IL-17을 분비하며, 이는 B 세포가 면역글로불린 E(IgE)를 생산하는 플라즈마 세포로 분화되는 것을 촉진시킨다. 이렇게 생성된 IgE는 호염구(basophil)와 비만세포(mast cell)를 활성화시켜 비만세포에서 전염증성 사이토카인인 TNF-α가 분비된다. 도 12에서 보는 바와 같이, 아토피를 유도한 마우스 모델의 귀 조직 샘플은 아토피 유발 인자인 TNF-α 및 IL-17의 발현 수준은 대조군과 비교하여 급격히 증가하였으며, 증가한 TNF-α 및 IL-17은 TAC@ChiNC에 의하여 농도 의존적으로 감소하였다. 아토피 유발 마우스모델의 혈청에서 증가한 IgE 수준 또한 TAC@ChiNC에 의하여 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 특히 TAC@ChiNC는 타크로리무스 0.1% 프로토픽 처리군보다 더 낮은 농도에서 TNF-α, IL-17 및 IgE 분비를 억제하여 아토피 완화 효과를 나타내는 것을 확인하였다.Atopic dermatitis is known to have a predominant Th2 cell-mediated immune response. Activated Th2 cells secrete IL-17, which promotes the differentiation of B cells into plasma cells that produce immunoglobulin E (IgE). The IgE produced in this way activates basophils and mast cells, and the mast cells secrete TNF-α, a pro-inflammatory cytokine. As shown in Figure 12, the expression levels of TNF-α and IL-17, which are atopy-inducing factors, in ear tissue samples from the mouse model that induced atopy were rapidly increased compared to the control group, and the increased TNF-α and IL-17 were It decreased in a concentration-dependent manner by TAC@ChiNC. The level of IgE increased in the serum of an atopy-induced mouse model was also confirmed to be decreased in a concentration-dependent manner by TAC@ChiNC. In particular, TAC@ChiNC was confirmed to have an atopic dermatitis alleviation effect by inhibiting the secretion of TNF-α, IL-17, and IgE at a lower concentration than the tacrolimus 0.1% Protopic treatment group.

Claims

A composition for treating atopic dermatitis comprising chitosan nanocapsules carrying tacrolimus and having a diameter of 50 to 100 nm.

According to paragraph 1,
The nanocapsule is a composition for treating atopic dermatitis, characterized in that it has a sustained-release characteristic of 60 to 70% (w/w) of tacrolimus cumulative release in 7 days.

According to claim 1 or 2,
The composition for treating atopic dermatitis is characterized in that it has a formulation selected from the group consisting of external skin preparations, oral preparations, and injections.

According to paragraph 3,
The skin external agent is a composition for treating atopic dermatitis, characterized in that the skin absorption rate is 9 times higher in 24 hours compared to the tacrolimus aqueous solution.

According to claim 1 or 2,
The composition for treating atopic dermatitis is characterized in that it reduces the expression levels of TNF-α and IL-17 in the blood.

According to claim 1 or 2,
The chitosan nanocapsules containing the tacrolimus,
Step 1: preparing a tacrolimus solution by dissolving tacrolimus in an organic solvent;
Step 2 of preparing a first reaction solution by adding pluronic to the tacrolimus solution prepared in step 1 and reacting at room temperature;
Step 3 of preparing a secondary reaction solution by adding the first reaction solution prepared in step 2 dropwise to stirred distilled water and reacting at room temperature for 1 hour;
Step 4 of producing nanoparticle powder by freeze-drying the secondary reaction solution prepared in step 3 above for 3 to 5 days while raising the temperature to -40°C to 20°C using a freeze dryer;
Step 5 of redispersing the nanoparticle powder prepared in step 4 in distilled water and performing ultrafiltration to produce nanoparticles from which unloaded drugs have been removed; and
A composition for treating atopic dermatitis, characterized in that it is manufactured by a manufacturing method comprising step 6 of preparing chitosan-coated tacrolimus nanocapsules by adding chitosan to the nanoparticles prepared in step 5 and coating them with chitosan.

According to clause 6,
The tacrolimus solution of step 1 is a composition for treating atopic dermatitis, characterized in that the tacrolimus solution is dissolved in an organic solvent at a concentration of 1 to 3% by weight.

According to clause 6,
A composition for treating atopic dermatitis, wherein the organic solvent in step 1 is ethanol.

Step 1: preparing a tacrolimus solution by dissolving tacrolimus in an organic solvent;
Step 2 of preparing a first reaction solution by adding pluronic to the tacrolimus solution prepared in step 1 and reacting at room temperature;
Step 3 of preparing a secondary reaction solution by adding the first reaction solution prepared in step 2 dropwise to stirred distilled water and reacting at room temperature for 1 hour;
Step 4 of producing nanoparticle powder by freeze-drying the secondary reaction solution prepared in step 3 above for 3 to 5 days while raising the temperature to -40°C to 20°C using a freeze dryer;
Step 5 of redispersing the nanoparticle powder prepared in step 4 in distilled water and performing ultrafiltration to produce nanoparticles from which unloaded drugs have been removed; and
Step 6 of producing chitosan-coated tacrolimus nanocapsules by adding chitosan to the nanoparticles prepared in step 5 and coating them with chitosan.

According to clause 9,
The tacrolimus solution in step 1 is a method for producing chitosan nanocapsules carrying tacrolimus, characterized in that tacrolimus is dissolved in an organic solvent at a concentration of 1 to 3% by weight.

According to clause 9,
A method for producing chitosan nanocapsules containing tacrolimus, wherein the organic solvent in step 1 is ethanol.

Chitosan nanocapsules containing tacrolimus produced by the method for producing chitosan nanocapsules containing tacrolimus according to any one of claims 9 to 11.