KR20230175195A - 생물분석 감도 향상을 위한 마이크로유체 마이크로입자-표지 임피던스 센서 배열 - Google Patents

생물분석 감도 향상을 위한 마이크로유체 마이크로입자-표지 임피던스 센서 배열 Download PDF

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유니버시티 오브 유타 리써치 파운데이션
텍사스 테크 유니버시티 시스템
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Abstract

생체분자의 향상된 검출 및 정량을 위한 장치 및 방법이 본 출원에서 기술된다. 장치 및 방법은, 면역분석(immunoassays)의 감도를 향상시키기 위해 정현파 입력 전압으로부터 표적 분석물의 존재 하에서의 전기 임피던스 변화를 측정하기 위한 마이크로유체 바이오센싱 플랫폼을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 기술된 장치 및 방법은, 감도 및 검출 한계를 향상시키기 위해 신호 강화 마이크로입자를 사용하는 정량적 진단을 위한 현장 진단 면역분석 플랫폼을 제공할 수 있다.

Description

생물분석 감도 향상을 위한 마이크로유체 마이크로입자-표지 임피던스 센서 배열
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 3월 12일에 출원된 미국 임시 특허 출원 제63/160,594호에 대한 우선권을 주장하고, 이 미국 임시 특허 출원은 그 전체 내용이 인용에 의해 본 명세서에 통합된다.
연방정부가 후원하는 연구
본 발명은 미국 국립 과학 재단(National Science Foundation)이 부여한 승인 번호 NSF-EECS/1509746 하에서 미국 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
기술 분야
생체분자의 향상된 검출 및 정량을 위한 장치 및 방법이 본 명세서에 설명되어 있다. 장치 및 방법은, 면역분석의 감도를 향상시키기 위해, 정현파 입력 전압으로부터 표적 분석물의 존재 하에서의 전기 임피던스 변화를 측정하기 위한 마이크로유체 바이오센싱 플랫폼을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 설명된 장치 및 방법은, 감도 및 검출 한계를 개선하기 위해 신호 강화 마이크로입자를 사용하는, 정량적 진단을 위한 현장 진단 면역분석 플랫폼(point-of-care immunoassay platform)을 제공할 수 있다.
임피던스 바이오센서(impedimetric biosensor)는 정현파 전압을 적용함으로써 작동 전극 상에 생체분자, 세포 또는 표지된 생물재료(labeled biomaterials)의 존재로 인한 전기 임피던스 변화를 측정하는 일종의 전기화학적 바이오센서이다. 이러한 유형의 센서들은 저렴한 비용, 소형화의 용이성, 다중 기능(multiplexing ability), 및 무표지 작동(label-free operation)으로 인해 디지털화된 현장 의료 진단(POC)에 대한 가능성을 보여주었다. 지금까지, 복잡성을 줄이고 소형화된 플랫폼을 개발과 함께 많은 노력이 기울여졌다. 이전 연구에서는 마이크로유체 칩 및 소형 임피던스 회로 기판(impedance circuit board)으로 구성된 말라리아 진단을 위한 통합 세포 계수 분석 시스템을 개발하였다. 인쇄된 금 전극 칩 및 마이크로유체 플로우 셀(microfluidic flow cell)로 이루어진 형질전환 단백질 Cry1Ab를 검출하기 위해, 또다른 통합 진단 플랫폼이 제안되었다. 소형화 및 휴대용 임피던스 바이오센서 플랫폼을 위해, AD5933 칩을 기반으로 한 임피던스 판독기는 심부정맥 혈전증 및 폐색전증 진단을 위해 IDE 배열 상의 마이크로유체 채널을 사용하여 설계되었다. 소형화된 임피던스 바이오센서를 개발하기 위해 많은 노력이 이루어졌지만, 실제 면역분석을 수행하기에 충분한 감도를 갖춘, 사용하기 쉽고 통합된 플랫폼은 제대로 개발되지 않았다.
모세관 마이크로유체는 다양한 유형의 면역분석을 수행하기 위해 다양한 플랫폼에서 활용되었다. 초기 연구 중 하나에서, 모세관 충전 현상을 사용하여 온-칩(on-chip) 면역분석의 가능성이 조사되었다. 자율 유체 경로(autonomous fluidic pathway)를 갖기 위해, 모세관 유지 밸브가 도입되어 복수의 사이클들을 순차적으로 전달하고 가능하게 하였다. 채널 기하학 및 따라서 수압 저항(hydraulic resistance)을 제어함으로써, 반응 챔버의 배양 시간을 변경하기 위해 유량 조절을 가능하도록 하는 1단계 모세관-구동 마이크로유체(one-step capillary-driven microfluidic)가 개발되었다. 이 소형 장치는 10 pg mL-1의 C-반응성 단백질(CRP)에 대해 최소 검출 가능한 형광 신호를 사용하여 CRP에 대한 정량화된 면역분석을 시연하였다. 이들 플랫폼은 민감한 면역분석을 실행하기 위한 자율 마이크로유체 칩(autonomous microfluidic chip)을 향한 기반을 닦았으나, 낮은 감도, 및 출력 신호를 판독하기 위한 부피가 큰 다운스트림 센서들의 필요성이 결합되어, 상업적으로 실행 가능한 제품으로의 개발을 방해하였다.
따라서, 질병과 관련된 다양한 생물지표들의 향상된 검출 및 정량화를 위한 새로운 통합되고 사용자 친화적인 방법 및 장치가 필요하다. 이러한 방법과 장치는 다양한 POC 진단 적용분야에 유용할 것이다.
본 명세서에 기술된 일 구현예는 생체분자(biomolecules)의 검출 및 정량을 위한 마이크로유체 장치(microfluidic device)이며, 마이크로유체 장치는 다음을 포함한다: (a) 마이크로유체 칩(microfluidic chip)으로서, 마이크로유체 칩은: 마이크로유체 채널, 완충제 입구, 샘플 입구, 및 폐기물 출구를 포함하는 다층 마이크로유체 네트워크(multi-layer microfluidic network)로서, 완충제 입구, 샘플 입구, 및 폐기물 출구는 마이크로유체 채널을 통해 서로 유체연통하고, 다층 마이크로유체 네트워크는 완충제 용액 및 샘플을 수용하도록 구성된, 다층 마이크로유체 네트워크; 및 공유결합적으로 부착된 제1 항체를 갖는 표면을 포함하는 기재 층으로서, 제1 항체는 표적 분석물(target analyte)에 특이적으로 결합하도록 적합화되고, 제1 항체는 제1 전극과 제2 전극 사이에 부착되고, 기재 층은 마이크로유체 채널과 유체연통하고, 제1 항체는 마이크로유체 채널 내에 위치된, 기재 층;을 포함하는, 마이크로유체 칩; 및 (b) 전기 임피던스의 변화를 검출하기 위한 검출기.
일 양태에서, 다층 마이크로유체 네트워크는, 폴리카보네이트(PC), 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA), 고리형 올레핀 코폴리머(COC), 폴리이미드, 폴리디메틸실록산(PDMS), 또는 이들의 조합 중 어느 하나로부터 선택된 폴리머 재료로 구성된다. 다른 양태들에 있어서, 다층 마이크로유체 네트워크는 PDMS로 구성된다.
다른 양태에서, 다층 마이크로유체 네트워크는 완충제 용액 및 샘플의 자발적 모세관 작용 흐름(autonomous capillary action flow)을 위한 기하학적 치수를 갖는다(geometrically dimensioned). 다른 양태에서, 다층 마이크로유체 네트워크는 마이크로유체 채널 위에 위치된 챔버 층, 모세관 밸브, 및 가교 개구부(bridging hole)를 포함하고, 챔버 층 및 마이크로유체 채널은 모세관 밸브 및 가교 개구부를 통해 서로 유체연통하고, 샘플 입구는 챔버 층 내에 위치된다. 또 다른 양태에서, 챔버 층은 제2 항체를 포함하고, 제2 항체는 표적 분석물에 특이적으로 결합하도록 적합화되고, 제2 항체는 마이크로입자에 접합된다(conjugated). 다른 양태에서, 제2 항체는 비오틴 모이어티를 포함하고, 마이크로입자는 스트렙타비딘 코팅을 포함하고, 제2 항체는 스트렙타비딘 코팅에의 상기 비오틴 모이어티의 결합을 통해 마이크로입자에 접합된다(conjugated). 다른 양태에서, 마이크로입자는, 자성 비드(magnetic bead), 폴리스티렌 비드, 실리카 비드, 또는 이들의 조합을 포함한다. 다른 양태에서, 마이크로입자는 직경이 약 1 μm 내지 약 5 μm의 범위인 크기를 갖는다. 다른 양태에서, 마이크로입자는 직경이 약 2.8 μm의 크기를 갖는 자성 비드를 포함한다. 다른 양태에서, 챔버 층은 샘플 입구에 부착된 다공성 폴리카보네이트(PC) 멤브레인을 더 포함하고, 제2 항체에 접합된 마이크로입자는 다공성 PC 멤브레인에 고정화된다(immobilized).
다른 양태에서, 모세관 밸브는 직경이 약 100 μm 내지 약 300 μm의 범위인 크기를 갖는 오리피스를 포함한다. 다른 양태에서, 모세관 밸브는 직경이 약 250 μm인 크기를 갖는 오리피스를 포함한다. 다른 양태에서, 가교 개구부는 직경이 약 0.5 mm 내지 약 2.5 mm의 범위인 크기를 갖는 오리피스를 포함한다. 다른 양태에서, 가교 개구부는 직경이 약 1 mm인 크기를 갖는 오리피스를 포함한다.
다른 양태에서, 완충제 용액은 약 0.001 mM 내지 약 1 mM 범위의 농도로 포스페이트 완충 염수(phosphate buffered saline: PBS)를 포함한다. 다른 양태에서, 완충제 용액은 약 0.01 mM 농도의 PBS를 포함한다. 다른 양태에서, 완충제 용액은 약 1 wt%로 소 혈청 알부민(bovine serum albumin: BSA)을 더 포함한다.
다른 양태에서, 다층 마이크로유체 네트워크는 하나 이상의 흡수제 패드들(absorbent pads)을 더 포함한다.
다른 양태에서, 샘플 입구는 혈청 분리 멤브레인을 더 포함한다.
다른 양태에서, 기재 층은 유리 기재 또는 플라스틱 기재를 포함한다. 다른 양태에서, 제1 전극 및 제2 전극은 전기전도성 금속으로 코팅된다. 다른 양태에서, 전기전도성 금속은, 금(Au), 티타늄(Ti), 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 다른 양태에서, 제1 전극과 제2 전극 사이의 거리는 약 1 μm 내지 약 10 μm이다. 다른 양태에서, 제1 전극과 제2 전극 사이의 거리는 약 10 μm이다. 다른 양태에서, 제1 전극 및 제2 전극은 약 1kHz 내지 약 100kHz 범위의 주파수에서 작동한다. 다른 양태에서, 제1 전극 및 제2 전극은 약 10 kHz의 주파수에서 작동한다. 다른 양태에서, 제1 전극 및 제2 전극은 복수의 전극들의 일부이고, 복수의 전극들은 상호 맞물린다(interdigitated).
본 명세서에 기술된 다른 구현예는, 개시된 장치 구현예 또는 양태들 중 어느 하나를 사용하여, 샘플 내 표적 분석물의 존재를 검출 및 측정하기 위한 방법으로서, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 완충제 용액을 완충제 입구 내로 적재하는 단계; (b) 완충제 용액을 기재 층 위로 흐르게 하는 단계; (c) 샘플을 샘플 입구 내로 적재하는 단계; (d) 완충제 용액을 샘플과 혼합하는 단계; (e) 완충제 용액과 샘플의 혼합물을 기재 층 위로 순차적으로 흐르게 하는 단계로서, 표적 분석물은 제1 항체에 결합하는, 단계; (f) 완충제 용액을 기재 층 위로 연속적으로 흐르게 하여 미결합 표적 분석물을 제거하는 단계; 및 (g) 전기 임피던스의 변화를 검출하여 샘플 내 표적 분석물의 농도를 정량화하는 단계.
일 양태에서, 흐르게 하는 것은 모세관 작용을 통해 자발적으로 이루어진다. 다른 양태에서, 샘플은, 완충제 용액과 혼합하기 전에, 제2 항체에 접합된 마이크로입자와 함께 배양되고, 표적 분석물은 마이크로입자에 접합된 제2 항체에 결합한다. 다른 양태에서, 제2 항체에 접합된 마이크로입자는 다공성 PC 멤브레인 상에 고정화되고, 샘플을 샘플 입구 내로 적재한 후, 샘플은 다공성 PC 멤브레인에 적가되고, 마이크로입자는 다공성 PC 멤브레인에서 방출되고, 샘플은 제2 항체에 접합된 방출된 마이크로입자와 함께 배양된다. 다른 양태에서, 샘플은, 완충제 용액이 모세관 밸브에 도달한 후에, 샘플 입구 내로 적재된다. 다른 양태에서, 모세관 밸브는, 샘플이 완충제 용액과 접촉할 때, 열린다.
다른 양태에서, 샘플은 대상체(subject)로부터의 혈액 샘플 또는 기타 생물학적 유체 샘플을 포함한다.
다른 양태에서, 이 방법은 약 5 분 내지 약 10 분 범위의 총 분석 시간을 포함한다.
본 특허 또는 출원 파일에는 적어도 하나의 컬러로 구현된 도면이 포함되어 있다. 컬러 도면(들)이 포함된 이 특허 또는 특허출원 간행물의 사본들은, 요청하고 필요한 수수료를 지불하면 특허상표청에 의해 제공된다.
도 1은 마이크로입자 표지된 면역분석을 위한 예시적인 마이크로유체 임피던스 센서 배열의 개략도를 보여준다. 맞춤형 임피던스 분석기들과 마이크로유체 채널이 통합된 8개의 상호 맞물린 전극(IDE: Interdigitated electrodes)이 표시된다(왼쪽). 음성(상단) 및 양성(하단) 대조군들에 대한 IDE들의 도시(illustration), 및 IDE 상의 전체 면역복합체의 형성이 제공된다(오른쪽).
도 2a는 금(Au) IDE 배열 칩, 2개의 임피던스 분석 회로, 및 LabVIEW 소프트웨어 프로그램과 관련된 신호 전송을 위한 데이터 수집(DAQ) 보드로 구성된 예시적인 시스템 설정을 보여준다. 마이크로유체 채널 네트워크를 IDE 배열의 상단에 배치하여, 분석물 및 완충 용액을 전달하고, 세척을 위한 수력학적 힘을 제어할 수 있다. 도 2b는 예시적인 IDE 칩 제작 공정에 대한 개략도를 보여준다. 도 2c는 IDE 및 등가 회로의 도시를 보여주고, 또한 인가된 정현파 전압과 측정된 교류 전류로부터 IDE가 임피던스 변화를 측정하는 방법에 대한 방정식을 보여준다.
도 3은 다양한 농도의 PBS 완충제에 대한 임피던스 분석기 및 LCR 측정기에 의한 측정에 기초하여 다양한 주파수에 대해 계산된 이득 계수(gain factor)를 보여준다.
도 4는 마이크로입자-표지 면역분석을 위한 임피던스 바이오센서의 등가 회로를 보여준다. 등가 회로는 전극의 정전용량 효과, 전극과 마이크로입자 표면의 이중층 정전용량, 및 용액의 저항으로 이루어진다.
도 5는, 전도계에 의해 측정된, 도 4에 도시된 회로를 사용하여 완충제의 다양한 농도에 대한 완충제 전도도의 플롯을 보여준다.
도 6은 Simulink, MATLAB을 이용하여 시뮬레이션한 등가 회로를 보여준다.
도 7a 내지 7f는 검출기 항체-접합 마이크로입자들(detector antibody-conjugated microparticles)에 의한 개선된 검출을 사용한 인간 종양 괴사 인자-알파(tumor necrosis factor-alpha: TNF-α) 면역분석에 대한 표면 작용화 공정을 보여준다. 도 7a는 유리 기재 상에 산소 플라즈마 세정에 의해 하이드록실 기가 형성되는 것을 보여준다. 도 7b는 제거 가능한 PDMS 마스킹 필름을 배치한 후 30분 동안 3% APTES 배양을 보여준다. 도 7c는 카르보디이미드 커플링 방법에 의한 활성화된 포획 항체의 공유결합 고정화(covalent immobilization)를 보여준다. 도 7d는 표적 분석물 TNF-α와의 배양 및 고정된 포획 항체와의 결합을 보여준다. 도 7e는 마스크의 제거, 및 PDMS 마이크로유체 채널의 통합을 보여준다. 1% w/v 소 혈청 알부민(BSA)(1% PBSB) 용액을 갖는 희석된 포스페이트 완충 염수(PBS)를 먼저 마이크로채널을 통해 주입하고 BSA 표면 부동태화를 위해 30분 동안 배양하였다. 도 7f는 자성 마이크로입자와 접합된 검출 항체(detection antibody)의 흐름 및 수력학적 세척을 보여준다. 도 7f에서는 고정된 포획 항체, 표적 분석물, 및 검출기 항체가 접합된 마이크로입자들 사이에 샌드위치 면역복합체(sandwich immunocomplex)가 형성된다.
도 8은 상업용 LCR 미터 및 임피던스 분석기를 사용하여 IDE 상에서 측정하고 시뮬레이션 모델로부터 계산한 탈이온수 내 PBS의 다양한 농도를 보여준다. 0.1 mM 이상의 완충제 농도는 포화를 나타내며, 생체분자의 고정화에 의한 임피던스 변화를 얻을 수 없게 한다. PBS 0.01 mM의 경우, 포화 효과가 덜한 것으로 나타났으며, pH 완충제 용량을 고려하여, 임피던스 신호 측정 동안 완충제 용액으로서 PBS 0.01 mM을 선택하였다.
도 9는, 자성, 폴리스티렌, 및 실리카 비드를 포함하는 세 가지 다른 마이크로입자 유형들이 선택되고 특성분석된다는 것을 보여준다. 모든 마이크로입자들은 2.8 μm의 동일한 크기였으며, 원래 마이크로입자들과 동일한 스트렙타비딘 표면 코팅을 가졌다. 마이크로입자들을 열 변성시키기 위해서, 핫플레이트 상에서 입자를 끓이는 과정을 거친 후, 이들 변성된 마이크로입자들을 임피던스 측정에 사용하였다. 모든 데이터는 5% IDE 표면 피복률(surface coverage)에 대해 수집되었다. 각각의 시험된 주파수의 왼쪽에서 오른쪽 샘플 순서는 자성 비드, 자기 변성, 폴리스티렌 비드, 변성 폴리스티렌, 실리카 비드, 실리카 변성이다.
도 10은 표면 작용화 동안 정규화된 임피던스 변화 백분율을 보여준다. 임피던스 신호의 백분율 변화는 각각의 APTES 및 IDE 센서의 항체 포획에 따라 증가한다. 이들 변화는 생성된 이중층 정전용량의 영향으로 인해 주파수가 11 kHz로부터 91 kHz까지 증가함에 따라 약간 감소한다.
도 11a 내지 11c는 자성 마이크로입자 접합된 검출기 항체가 있거나 없이, 다양한 표적 분석물 농도에 대한 임피던스 변화 및 IDE 표면 피복률을 보여준다. 도 11a는 다양한 표적 농도에 대한 IDE 상에서의 자성 마이크로입자 밀도를 보여준다. 도 11b는, 11k Hz에서 무표지(label-free)(자성 마이크로입자 없음) 및 샌드위치 마이크로입자-표지(sandwich microparticle-labeled)(자성 마이크로입자 있음) 둘 다에 대해, TNF-α의 다양한 표적 농도들과 포획 항체를 비교하는 정규화된 임피던스 변화들을 보여준다. 임피던스 센서를 마이크로입자 표지 면역분석 포맷과 결합함으로써, 83.46 pg/mL 정도로 낮은 TNF-α를 검출할 수 있었다. 이러한 조합 감지 기술은 한 자리수 규모의 감도 향상을 가능하게 한다. 도 11c는 11 kHz에서 무표지(cAb 대 TNF-α) 및 샌드위치 마이크로입자-표지(cAb 대 검출기) 둘 다에 대해 TNF-α의 다양한 표적 농도와 포획 항체(cAb)를 비교하는 임피던스 변화의 그래프를 보여주며, 오른쪽 축 상에 표면 피복률(%)을 포함한다.
도 12는 11 kHz에서 IDE 상의 다양한 표면 피복률에 대한 2.8 μm 자성 마이크로입자의 임피던스 차등 크기(impedance differential magnitude)를 보여준다.
도 13은 모세관 밸브 및 가교 개구부를 갖는 2단(two-stage) 마이크로유체 네트워크를 포함하는 예시적인 마이크로유체 칩의 개략도를 보여준다.
도 14는 서로 다른 색상의 염료를 사용하는 2단 마이크로유체 채널 네트워크에서 모세관 밸브의 작동 원리 흐름을 보여준다. 완충제 용액 - 청색 염료; 및 표적 분석물을 포함하는 샘플 용액 - 적색 염료.
도 15a는 마이크로유체 칩, 임피던스 분석 회로, 전력 공급 장치, 데이터 획득 보드, 및 처리 장치를 포함하는 통합형 휴대용 POC 장치의 예시적인 설계를 보여준다. 도 15b는 통합된 IDE 및 마이크로유체 칩을 갖춘 통합된 휴대용 POC 장치의 또 다른 예시적인 설계를 보여준다. 도 15b의 설계로, 모든 하우징 및 회로를 3D 프린터로 제작하였다.
도 16은 도 13에 도시된 마이크로유체 설계를 기반으로 하여 다양한 가교 개구부 직경에 대한 가교 개구부에서의 완충제 용액 상승 시간을 도시한다.
도 17은 모세관 구동 마이크로유체 칩을 갖춘 통합된 IDE 시스템에서 다양한 색상의 염료를 사용하는 예시적인 자발적이고 순차적인 흐름 공정을 보여준다. 완충제 용액 - 청색 염료; 표적 분석물을 포함하는 샘플 용액 - 적색 염료; 및 검출기 항체-접합된 마이크로입자 - 황색 염료.
도 18a 내지 18b는 모세관 구동 마이크로유체 네트워크를 갖는 통합된 IDE 감지 플랫폼의 샌드위치 면역분석으로부터 11kHz에서의 임피던스 변화를 보여준다. 포획 항체(cAb, 마우스 단일클론 항-심장 트로포닌 I 항체)를 IDE 배열 상에 고정화되었고, 다양한 인간 심장 트로포닌 I 표적 분석물(cTnI) 농도를 검출기 항체-접합된 마이크로입자(cTnI 대 검출기)를 사용하여 그리고 검출기 항체(detector antibody)-접합된 마이크로입자(cAb 대 cTnI)없이 시험하였다. 검출 항체는 또한, 마우스 단일클론 항-심장 트로포닌 I 항체였으며, 2.8μm M-270 자성 마이크로입자에 접합되었다. cTnI 분석물은 인간 심장 조직으로부터 추출되었으며 동결건조되었다.
다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당해 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 및 단백질과 핵산 화학 및 혼성화(hybridization)와 관련하여 사용된 임의의 명명법, 및 기술은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있고 통상적으로 사용된다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 본 개시가 통제될 것이다. 예시적인 방법 및 재료가 아래에 설명되어 있지만, 본 명세서에 설명된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 재료가 본 명세서에 설명된 구현예들 및 양태들의 실제 또는 시험에 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "아미노산", "뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드", "벡터", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 당해 기술분야의 통상의 기술자가 이해하는 바와 같은 통상적인 의미를 갖는다. 표준 단일 문자 뉴클레오티드(A, C, G, T, U) 및 표준 단일 문자 아미노산(A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y)가 본 명세서에서 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "포함한다(include)", "포함하는(including)", "포함하는(including)", "함유하는(containing)", "갖는(having)" 등의 용어는 "포함하는(comprising)"을 의미한다. 본 개시는 또한, 명시적으로 기재되었는지 여부에 관계없이, 본 명세서에 제시된 구현예들 또는 요소들을 "포함하는(comprising)", 이들로 "이루어지는(consisting of)" 및 이들로 "본질적으로 이루어지는(consisting essentially of)" 다른 구현예들을 고려한다.
본 명세서에 사용되는 단수 용어 및 본 개시의 맥락에서(특히 청구범위의 맥락에서) 사용된 유사한 용어는, 달리 명시되지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 단수 및 복수를 모두 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 또한, 단수 용어는 달리 명시되지 않는 한 "하나 이상"을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "또는(or)"은 연언적(連言的, conjunctive)이거나 또는 선언적(選言的, disjunctive)일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "실질적으로(substantially)"는 상당하거나 현저한 정도를 의미하지만, 완전히는 아님을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 하나 이상의 관심 값들에 적용되는 용어 "약" 또는 "대략"은, 언급된 기준 값에 유사한 값, 또는 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 특정 값에 대해 허용가능한 오류 범위 내에 있는 값을 의미하며, 이는 부분적으로, 측정 시스템의 한계와 같은, 값이 측정되거나 결정되는 방법에 따라 달라질 것이다. 일 양태에서, 용어 "약"은, 용어 "약"에 의해 수정된 값의 최대 ±10%의 변동 범위 내에 있는 정수 및 분수 성분 모두를 포함하는, 임의의 값을 지칭한다. 대안적으로, "약"은 당해 기술분야의 실시에 의해, 3개 이상의 표준 편차들 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, 생물학적 시스템 또는 공정과 관련하여, 용어 "약"은 값의 한 자리수 규모 이내, 일부 구현예들에서는 5배 이내, 및 일부 구현예들에서는 2배 이내를 의미할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 기호 "~"는 "약" 또는 "대략"을 의미한다.
본 명세서에 개시된 모든 범위는 이산 값(discrete values)으로서의 두 종점뿐만 아니라 범위 내에 지정된 모든 정수 및 분수를 포함한다. 예를 들어, 0.1 내지 2.0 범위에는 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 ... 2.0가 포함된다. 종점들이 "약"이라는 용어로 수정되는 경우, 지정된 범위는, 종점들을 포함하여, 범위 내 또는 3개 이상의 표준 편차 내의 임의의 값의 최대 ±10%의 변동까지 확장된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "대조군" 또는 "참조"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. "참조" 또는 "대조군" 수준은 미리 결정된 값 또는 범위일 수 있으며, 이는 측정 결과를 평가하기 위한 기준선(baseline) 또는 벤치마크로서 사용된다. "대조군"은 또한, 대조 실험 또는 대조 세포들을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "투여량(dose)"은, 적어도 1회 이상의 투여로 치료 효과를 개시하거나 생성하기에 충분한 양을 함유하는, 세포들을 포함하는, 활성 성분 제형 또는 조성물의 임의의 형태를 의미한다. "제형" 및 "조성물"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "예방(prophylaxis)"은 질환의 진행을, 통계적으로 유의미한 정도로 또는 당해 기술분야의 통상의 기술자가 검출할 수 있는 정도로, 예방하거나 감소시키는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "유효량(effective amount)" 또는 "치료 유효량(therapeutically effective amount)"이라는 용어는, 대상체가 겪고 있거나 대상체가 감염되기 쉬운 질병 또는 상태의 하나 이상의 증상들을 예방, 치료, 또는 어느 정도까지 개선하는, 대상체에게 투여되는 작용(action), 작용제(agent), 조성물(composition), 또는 세포(들)의 실질적으로 무독성이지만 충분한 양을 지칭한다. 그 결과는 질병의 징후, 증상, 또는 원인이 감소 또는 완화되거나, 또는 생물학적 시스템의 임의의 다른 목적하는 변경이 될 수 있다. 유효량은, 대상체의 연령, 크기, 질병의 유형 또는 정도, 질병의 단계, 투여 경로, 사용된 보충 요법의 유형 또는 정도, 진행 중인 질병 과정, 및 목적하는 치료 유형을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 각각의 대상체의 개별적인 요인에 따라 달라질 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "대상체(subject)"는 동물을 지칭한다. 전형적으로, 대상체는 포유동물이다. 대상체는 또한, 영장류(예를 들어, 인간, 남성 또는 여성; 유아, 청소년, 또는 성인), 비인간 영장류, 쥐(rats), 생쥐(mice), 토끼, 돼지, 소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 물고기, 새 등을 지칭한다. 일 구현예에서, 대상체는 영장류이다. 일 구현예에서, 대상체는 인간이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 대상체가 그러한 치료로부터 생물학적으로, 의학적으로, 또는 삶의 질에 있어서 이익을 얻을 경우, 대상체는 "치료가 필요한" 것이다. 치료가 필요한 대상체는, 특히 예방적(preventative) 또는 예방적(prophylaxis) 치료의 경우, 반드시 증상을 나타내는 것은 아니다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "억제하다(inhibit)" 또는 "억제(inhibition)", 또는 "억제하는(inhibiting)"은 주어진 생물학적 과정, 상태, 증상, 장애, 또는 질병의 감소 또는 억제, 또는 생물학적 활동이나 과정의 기준선 활동(baseline activity)의 상당한 감소를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "치료(treatment)" 또는 "치료하는(treating)"은, 장애 또는 질병을 포함하는 생물학적 과정의 예방, 방지, 억제, 진압, 반전, 완화, 개선, 또는 억제, 또는 질병을 완전히 제거하는 것을 지칭한다. 치료는 급성 또는 만성 방식으로 수행될 수 있다. "치료"라는 용어는 또한, 질병을 앓기 전에 질병의 중증도 또는 그러한 질병과 관련된 증상을 감소시키는 것을 지칭한다. 질병, 장애, 또는 이의 증상을 "억제" 또는 "개선"하는 것은, 그러한 질병, 장애, 또는 이의 증상이 임상적으로 나타난 후 대상체에게 본 명세서에 기술된 세포, 조성물, 또는 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 질병, 장애, 또는 이의 증상의 "예방(prophylaxis of)" 또는 "예방(preventing)"은, 질병, 장애, 또는 이의 증상이 발병하기 전에 대상체에게 본 명세서에 기술된 세포, 조성물 또는 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 질병 또는 장애를 "억제(suppressing)"하는 것은 질병 또는 장애가 유도된 후 그러나 임상적 외관 또는 증상이 나타나기 전에, 대상체에게 본 명세서에 기술된 세포, 조성물 또는 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "샘플(sample)" 또는 "표적 샘플(target sample)"은 표적 분석물 또는 표적 바이오마커의 존재 및/또는 수준이 검출되거나 측정되는 임의의 샘플을 의미한다. 샘플에는 액체, 용액, 에멀젼, 또는 현탁액이 포함될 수 있다. 샘플에는 의료 샘플(medical sample)이 포함될 수 있다. 샘플에는 혈액, 전혈, 혈장 및 혈청과 같은 혈액 분획, 근육, 간질액, 땀, 타액, 소변, 눈물, 윤활액, 골수, 뇌척수액, 콧물, 가래, 양수, 기관지폐포 세척액, 위세척액, 구토, 대변, 폐조직, 말초혈액 단핵 셀, 총 백혈구, 림프절 세포, 비장 세포, 편도선 세포, 암 세포, 종양 세포, 담즙, 소화액, 피부, 또는 이들의 조합과 같은 임의의 생물학적 체액이나 조직이 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 분취량(aliquot)을 포함한다. 다른 구현예들에서, 샘플은 생물학적 유체 또는 체액을 포함한다. 샘플은 당해 기술분야에 알려진 임의의 수단에 의해 얻어질 수 있다. 샘플은 환자로부터 얻은 그대로 사용되거나, 여과, 증류, 추출, 농축, 원심분리, 방해 성분의 불활성화, 시약 첨가, 등의 전처리를 거쳐 사용되어, 본 명세서에 기술된 방식으로 또는 당해 기술분야에 알려진 방식으로 샘플의 성질을 수정할 수 있다. 일 구현에서, 샘플은 대상체로부터의 혈액 샘플 또는 다른 생물학적 체액 샘플을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "표적 분석물(target analyte)" 또는 "표적 바이오마커(target biomarker)"는, 질병 상태 또는 질병 또는 장애의 진단 또는 예후 지표(예를 들어, 질병이나 장애의 존재 또는 향후 발병 가능성을 식별하는 지표)와 같은, 생물학적 상태 또는 생물학적 과정과 연관된 물질을 의미한다. 바이오마커의 존재 또는 부재, 또는 바이오마커 농도의 증가 또는 감소는, 특정 상태 또는 과정과 연관되거나 및/또는 이를 나타낼 수 있다. 바이오마커에는, 세포 또는 세포 성분(예를 들어, 바이러스 세포, 박테리아 세포, 진균 세포, 암세포, 등), 소형 분자, 지질, 탄수화물, 핵산, 펩티드, 단백질, 효소, 항원, 및 항체가 포함될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 바이오마커는, 박테리아, 곰팡이 또는 바이러스와 같은, 감염인자(infectious agent)로부터 유래될 수 있거나, 또는 건강한 개체와 비교하여 질병 또는 장애를 앓고 있는 대상체에서 더 큰 또는 더 작은 풍부함(예를 들어, 유전자 또는 유전자 산물의 발현의 증가 또는 감소)으로 발견되는 내인성 분자일 수 있다. 일 구현예에서, 표적 분석물은 대상체로부터의 혈액 샘플 또는 혈청 샘플에서 유래한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "마이크로유체(microfluidic)"는 표면 장력이 부피 기반 힘(volumetric forces)을 지배하는 작은 규모(통상적으로 밀리미터 미만)로 기하학적으로 그리고 치수적으로 제한된 유체의 거동, 정밀한 제어, 및 조작을 의미한다. "마이크로유체 장치"는 단면 치수가 1 mm 미만인 적어도 하나의 마이크로채널을 포함하는 장치 또는 회로를 의미한다. 개시된 발명의 일부 구현예들에서, 마이크로유체 장치는 다층 마이크로유체 칩을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "임피던스"는 전기 임피던스 또는 전자 임피던스이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "전기 임피던스의 변동을 검출하는 것" 또는 "임피던스 변화를 검출하는 것"은, 하나 이상의 전극들 사이에 분자 결합 반응이 일어날 때, 상기 전극들 사이의 임피던스가, 임피던스 분석기 또는 임피던스 측정 회로에 의해 검출될 수 있는 상당한 변화를 가질 것이라는 것을 의미한다. 임피던스 변동(impedance change) 또는 임피던스 변화(impedance variation)는, 장치의 하나 이상의 전극들 사이에 분자 결합 반응이 발생할 때와 분자 결합 반응이 발생하지 않을 때의 임피던스 값들의 차이를 의미한다. 전극들 사이의 임피던스는 전형적으로 검출 및 측정을 위해 인가된 전기장의 주파수 또는 정현파 입력 전압의 함수이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "검출 한계" 또는 "LOD"는, 충분한 신뢰도 또는 통계적 유의성으로 관찰될 수 있는, 가장 낮은 신호, 또는 신호로부터 결정되는 가장 낮은 해당 양을 의미한다. 개시된 발명의 특정 구현예들에서, 신뢰성 있게 검출될 수 있는 표적 분석물의 최저 농도는: [LOD = [평균블랭크 + 1.645 x (SD블랭크)] + 1.645 x (SD저농도 샘플)]로 보고된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "상호 맞물린(interdigitated)"은 깍지끼워진 손들(folded hands)의 손가락들과 같은 방식으로 한 방향으로 오는 돌출부가 다른 방향에서 나오는 돌출부와 얽혀 있는(interlace) 구조를 의미한다. 개시된 발명의 일 양태에 있어서, 제1 전극 및 제2 전극은 복수의 전극들의 일부이고, 복수의 전극들은 상호 맞물려 있다. 본 출원의 상호 맞물린 전극(IDE) 요소들은 바람직하게는 서로 접촉하지 않는다. 개시된 발명의 일 양태에서, 제1 전극과 제2 전극 사이의 거리는 약 1 μm 내지 약 10 μm이다. 다른 양태에서, 제1 전극과 제2 전극 사이의 거리는 약 10 μm이다. 일 구현예에서, 개시된 장치들은 IDE 배열을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "전기전도성 금속"은 전류를 전도하는 능력을 갖는 임의의 금속을 의미한다. 일 구현예에서, 전기전도성 금속은 금(Au), 티타늄(Ti), 알루미늄(Al), 구리(Cu), 은(Ag), 아연(Zn), 철(Fe), 니켈(Ni), 코발트(Co), 또는 이들의 조합 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예들에서, 전기전도성 금속은 개시된 장치들의 하나 이상의 전극 들 상에 침착 및 코팅될 수 있다. 일 구현예에서, 제1 전극과 제2 전극은 전기전도성 금속으로 코팅된다. 다른 구현예에서, 전기전도성 금속은 금(Au), 티타늄(Ti), 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "생물분석(bioassay)"은, 예를 들어, 항체 또는 단일 가닥 DNA(ssDNA)를 포함하는, 하나 이상의 생체분자들을 사용하여 용액 내 표적 분석물 또는 표적 생체분자의 존재를 검출 및/또는 농도를 측정하기 위한 생화학적 시험을 의미한다. 일 구현예에서, 생물분석은 용액 중의 표적 분석물에 결합하고 포획하기 위해 기재 층 상에 공유결합적으로 부착되거나 고정화되는 제1의 "포획 항체" 또는 "cAb"를 포함하는 면역분석을 포함한다. 이 구현예의 일 양태에서, 면역분석은 제1 포획 항체에 의해 포획되는 표적 분석물에 결합함으로써 샌드위치 면역분석을 생성하는 데 사용되는 제2 "검출기 항체" 또는 "dAb"를 더 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "특이적으로 결합하다(specifically bind)"는 통상적으로, 항체가 무작위, 관련되지 않은 생체분자 또는 분석물에 결합하는 것보다 더 쉽게 표적 분석물에 결합하도록 적합화되는 경우를 의미한다.
개시된 발명의 일부 구현예들에서, 정현파 입력 전압으로부터 생체분자의 존재 하에 전기 임피던스 변화를 측정하기 위한 임피던스 면역분석 바이오센서 장치가 설명된다. 임피던스 바이오센서의 감도를 향상시키기 위해, 몇 가지 설계 파라미터가 고려되었다. 전형적으로, 신호-대-잡음 비율이 높고, 저항 강하가 낮으며, 정상 상태에 빠르게 도달한다는 장점이 있기 때문에, IDE가 임피던스 바이오센서에 사용된다. IDE 설계의 중요한 파라미터는 감지 영역, 전극 갭, 및 주파수 범위이다. IDE 배열 설계 자체는, 전체 감지 영역을 고려하여 IDE의 전체 감도를 높일 수 있다. 전극 갭은, 두 전극들 사이의 전기장이 생체분자 결합 이벤트 동안 효과적으로 변경될 수 있기 때문에, IDE 바이오센서의 감도에 대한 가장 중요한 파라미터이다. 두 전극들 사이의 거리가 마이크로 갭에서 나노 갭으로 줄어들면, 감도는 더욱 높아진다. 전극들 사이의 거리가 좁아질수록, 샘플뿐만 아니라 표지에 의해 전극들이 단락될 가능성이 높아지며, 이는 측정 실패로 이어질 수 있다. 또한 주목되어야 하는 바와 같이, 나노 갭은, 적합한 기준선을 유지하기 위해 이온 강도가 매우 낮은 완충제 용액이 필요할 것이며, 이는 항원-항체 상호작용에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 나노 갭 IDE는 복잡한 제조 절차가 필요하므로, 제조 비용이 더 높아지고, 수율은 더 낮아지며, 실용성이 더 낮아진다. 따라서, 바이오센싱 플랫폼의 전극 핑거들 사이의 전형적인 갭은 1 내지 10 μm로 제안된다.
적합한 주파수의 선택은 분석 민감도와 관련된 또 다른 주요 파라미터이다. 더 낮은 주파수(< 1kHz)에서, 임피던스는 IDE의 누설 저항에 의해 지배되며, 이는 전극 재료에 매우 민감하다. 100 kHz 초과의 고주파수에서, 용액 저항이 순 임피던스에 영향을 미치고, 기생 정전용량 및 유도용량(inductances)으로 인해 측정 오차가 증가한다. 중간 주파수(1 kHz 내지 100 kHz)에서, 측정 신호는 전극 표면 정전용량에 의존하여, IDE의 친화력 결합을 감지할 수 있도록 한다. 따라서, 대부분의 임피던스 바이오센서는 1 kHz 내지 100 kHz 사이, 통상적으로 약 10 kHz의 주파수를 채택하며, 이 주파수에서 신호가 상대적으로 안정적이고, 임피던스 응답은 계면 변화에 의해 지배된다. 일 구현예에서, 제1 전극 및 제2 전극은 약 1 kHz 내지 약 100 kHz 범위의 주파수에서 작동한다. 다른 구현예에서, 제1 전극 및 제2 전극은 약 10 kHz의 주파수에서 작동한다.
생체분자를 검출하는 것을 목표로 하는 모든 바이오센서에는, 반응 챔버의 계면 이벤트를 인식하는 신호 해석 요소가 포함되어야 한다. 이 요소는 전형적으로 POC 장치의 마이크로유체 바이오칩과 통합되며, 실제 휴대 가능하고 실용적인 장치로 소형화될 수 있다. 임피던스 바이오센서는 높은 감도, 개선된 신호-대-잡음 비율, 및 편리한 통합, 디지털화된 신호 제공 및 통신 촉진으로 인해 이상적인 후보이다. 잘 확립된 생물전기 센서(bioelectrical sensors)에 사용되는 IDE는, 미세전극의 범주에 속하며, 실시간 인식, 낮은 저항 강하, 및 빠른 정상 상태 설정이라는 고유한 장점으로 인해 POC 플랫폼에서 널리 활용되었다. IDE는, 통상적으로 마이크로미터 크기 범위의, 일련의 전극 핑거들(electrode fingers)로 구성되며, 이들은 정현파 전류를 가함으로써 계면 생물반응을 검출한다.
이들 유형의 임피던스 기반 바이오센서를 사용하여 전체 면역분석 성능(overall immunoassay performance)을 향상시키는 두 가지 별개의 접근 방식이 있다. IDE 상에 금 나노입자를 전기화학적으로 코팅함으로써, 전극들의 전체 표면적이 크게 증가하며, 그 결과 신호-대-잡음 비율이 향상되어 표적 분석물을 검출할 수 있다. 이 접근 방식은 감도에 대한 적합한 개선을 보여주지만, IDE 및 생체작용화 및 추가 제조 단계들을 위한 광범위한 표면 준비로 인해 더욱 강력한 POC 플랫폼의 잠재력이 제한된다. 또 다른 접근 방식은 마이크로/나노입자를 사용하여 전체 감도를 향상시키는 것이다. 임피던스 바이오센서의 전체 감도는, 계면 변화를 유도함으로써 임피던스 신호를 증폭시키는 표지로서 마이크로입자 또는 나노입자를 사용하여, 향상될 수 있다. 전기화학적 바이오센서에서 입자들로 표지하는 것이 널리 사용되었지만, 주목되어야 하는 바와 같이, 패러데이 측정에 사용되는 전기화학적 완충제는 통상적으로 일부 단백질을 변성시킬 수 있는 약한 산화제 역할을 하기 때문에, 완충제 용액 PBS 하에서의 데이터 기록이 더 낫다. 또한, 비패러데이성(non-faradaic)(또는, 정전용량성) 바이오 센서의 마이크로입자-표지화는 본질적으로 POC 시험에 사용하기에 더 간단하고 더 적합하고, 또한 친화력 결합 동안 계면 정전용량의 변화와 관련된 측정을 수행할 수 있는 능력을 갖지만, 패러데이성 바이오센서에서 요구되는 것과 같은 산화환원 반응이 완료될 필요가 없다.
여러 연구에서 입자 크기와 재료가 검출 감도에 미치는 영향이 입증되었다. 이론적 분석에 따르면, 표지 입자는 전기 프린징 필드(electric fringing fields)를 효과적으로 차단하여, IDE의 폭과 갭에 따라 임피던스가 증가할 수 있다. 이러한 원리로, 금 나노입자(GNP)를 이용하여 암배아 항원(carcinoembryonic antigen)을 정량하기 위한 샌드위치 면역분석을 실시하였고, 1 ng/mL의 검출 한계를 달성하였다. 마찬가지로, 갈렉틴-1 항체를 알루미나 나노입자에 접합시키는 실시간 임피던스-기반 면역센서를 사용하여, 갈렉틴-1 단백질의 정량화를 위한 감도 및 고정화 효율을 향상시켰다. 이들 입자를 사용한 표지는 감도를 향상시키기 위해 다양한 분석에 활용되었지만, 이들 입자의 효과에 대한 이해, 표지와의 신호 강화의 비교, 및 적합한 면역분석 절차의 구현의 부족으로 인해, 전반적인 성과는 미미하다.
전형적인 마이크로입자-기반 분석에서는 제어가능한 수력학적 힘을 유도하기 위해 마이크로유체 채널이 필요하다. 0.1 내지 10 pN 사이의 수력학적 힘은 비특이적 결합을 깰 수 있으며 6 내지 250 pN 사이의 힘은 특이적 결합을 보존하는 것으로 나타났다. 따라서, 마이크로유체 채널의 유량에 의해 부과되는 제어된 수력학적 세척력을 활용하는 것은, IDE 배열로부터 비특이적으로 결합되거나 또는 결합되지 않은 표적 분석물 또는 미세 입자들을 무너뜨리고, 전체 신호-대-잡음 비율을 개선하는 데 중요하다.
마이크로입자-기반 신호 강화 및 마이크로유체 시스템을 사용하는 이러한 개념을 통해, 단일 플랫폼 내에서 면역분석에 필요한 모든 구성요소를 포함하는 소형화된 임피던스 바이오센서를 개발할 수 있다. 일 구현예에서, 이 장치 플랫폼은 다중 분석(multiplexed assays)을 위한 금 IDE 배열 칩, 반-실시간 데이터 수집 소프트웨어에 연결된 소형 맞춤형 8-채널 임피던스 분석기, 및 샘플 전달과 수력학적 세척 목적을 위한 마이크로유체 채널 네트워크를 포함한다.
일부 구현예들에서, 마이크로유체 네트워크는, 레이저 절단, 사출 성형, 다이 절단, 밀링, 프레스 절단, 층별(layer-by-layer) 제작, 3D 프린팅, 포토리소그래피, 또는 이들의 조합 중 하나 이상에 의해, 마이크로유체 채널, 모세관 밸브, 가교 개구부, 저장소, 반응 영역, 입구, 및 출구를 생성하도록 제작된다. 일 구현예에서, 마이크로유체 네트워크는 완충제 용액 및 샘플과 같은 면역분석 시약의 자발적 모세관 작용 흐름을 위한 기하학적 치수를 가질 수 있다.
모세관 구동 마이크로유체는, 표면 장력을 활용하여 채널에서 액체를 구동하고, 채널 기하학을 조정함으로써 제어될 수 있다. 이 기술은 시약 흐름을 위해 모세관 구동 마이크로유체의 수동적 방법(passive method)을 사용한다. 이 수동적 흐름 처리 방법은 임의의 외부 주변 기기와 독립적이므로, 소형화 POC 플랫폼을 위한 진화하는 능력(evolving capabilities)을 실증한다. 진정한 모세관-구동 마이크로유체 플랫폼은, 통상적으로 모세관-펌프, 모세관-정지-밸브(CSV), 및 트리거-밸브와 같은 다양한 모세관 요소들과 결합되는 자율 유체 회로(autonomous fluidic circuits)로 설명된다.
일부 구현예들에서, 급격한 기하학적 변화가 있는 표면 특성(surface characteristics)을 기반으로 하여 마이크로채널 내의 액체를 정지시키도록 설계된 CSV가 설명된다. 마이크로채널 단면의 급격한 확대는, 모세관 효과에 의해 부과되는 구동력을 감소시키고, 액체 이마(liquid forehead)가 이 지점에 도달하면 액체를 정지시킨다. 이들 CSV는 제작이 쉽고, 모세관 구동 마이크로유체의 신뢰할 수 있는 수동적 요소이다. 그러나, 모서리 흐름, 버블 트래핑, 및 기능 중지를 방지하려면, 활성 지속시간, 표면 접촉각, 및 기하학을 주의깊게 조사해야 한다. 소수성 PDMS로 덮인 친수성 실리콘 마이크로채널을 갖춘 정지 밸브의 신뢰성을 향상시키기 위해 2-레벨 정지 밸브가 개발되었다. 이들 정지 밸브의 파열 압력(burst pressure)은 마이크로 채널 크기와 액체 접촉각을 고려하여 수치적으로, 그리고 실험적으로 연구되었다. 정지 밸브는 2개의 수직 채널들이 교차하는 지점에서 모세관 트리거 밸브로 쉽게 변형될 수 있다. 이 구성에서, 한 채널로부터의 액체는, 다른 액체가 직교 채널로부터 교차점에 도달할 때까지, 그 교차점에서 정지된다. 일단 직선 채널 내의 액체가 교차점을 적시면, 모세관 힘이 흐름을 채널로 유도하고, 두 유체가 공통 하류 채널에서 혼합된다. 정지 밸브의 기능을 강화하고 제조 제한을 줄이기 위해, 더 높은 신뢰성과 견고성을 위해 이전에 2층 트리거 밸브가 도입되었으며, 최대 30분 동안 유체를 중지하도록 시험되었다. 자율 모세관 구동 마이크로유체의 설계에 있어서의 이러한 이전 발전들은 황금같은 성과였지만, 영향을 받는 파라미터들을 더 잘 제어하려면 추가 조사가 필요하다. 또한, POC를 신뢰성있게 적용하는 실제 면역분석에서 이들 흐름 제어 요소들을 시험하기 위한 소수의 연구만이 구현되었다.
일 구현예에서, 휴대용 임피던스 분석기와 통합된 마이크로입자 표지화된 면역분석을 위한 모세관 구동 마이크로유체 플랫폼이 설명된다. 효과적인 유체 조작을 위해, 마이크로유체의 두 단계 또는 층들을 연결하는 수직 CSV가 도입될 수 있다. 이 CSV를 사용하면, 유체가 상부 마이크로유체 단계 또는 챔버에서 준비된 후, 해당 지점에 도달할 때, 시약들이 제1 단(first stage) 내로 주입될 수 있다. 2단(two stage) 마이크로유체의 개념은, 소형화된 마이크로유체 장치의 설계를 허용할 뿐만 아니라, 편리한 전처리 배양 단계(pre-treatment incubation steps)를 추가할 수도 있다. 유체 파라미터들을 특성분석함으로써, 이 통합된 플랫폼을 사용하여 검출 분석(예를 들어, 인간 트로포닌 I)을 위한 전체 시간을 6분 미만에 완료할 수 있다.
본 명세서에 기술된 일 구현예는 생체분자의 검출 및 정량을 위한 마이크로유체 장치로서, 마이크로유체 장치는: (a) 마이크로유체 칩으로서, 마이크로유체 칩은: 마이크로유체 채널, 완충제 입구, 샘플 입구, 및 폐기물 출구를 포함하는 다층 마이크로유체 네트워크로서, 완충제 입구, 샘플 입구, 및 폐기물 출구는 마이크로유체 채널을 통해 서로 유체연통하고, 다층 마이크로유체 네트워크는 완충제 용액 및 샘플을 수용하도록 구성된, 다층 마이크로유체 네트워크; 및 공유결합적으로 부착된 제1 항체 또는 포획 항체를 갖는 표면을 포함하는 기재 층으로서, 제1 항체는 표적 분석물에 특이적으로 결합하도록 적합화되고, 제1 항체는 제1 전극과 제2 전극 사이에 부착되고, 기재 층은 마이크로유체 채널과 유체연통하고, 제1 항체는 마이크로유체 채널 내에 위치된, 기재 층;을 포함하는, 마이크로유체 칩; 및 (b) 전기 임피던스의 변화를 검출하기 위한 검출기;를 포함한다.
일부 구현예들에서, 폴리아크릴산, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리카보네이트(PC), 고리형 올레핀 코폴리머(COC), 폴리이미드, 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리에스테르, 나일론, 폴리비닐 클로라이드, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트 글리콜, 폴리부틸렌 아디페이트 테레프탈레이트, 에틸렌 테트라플루오로에틸렌, 불화 에틸렌 프로필렌, 퍼플루오로 알콕시 알칸, 폴리락트 산, 폴리카프로락톤, 폴리옥시메틸렌, 셀룰로오스, 이들의 코폴리머, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함하는 친수성 폴리머 재료를 포함하는 마이크로유체 네트워크가 기술된다. 일 구현예에서, 마이크로유체 네트워크는, PC, PMMA, COC, 폴리이미드, PDMS, 또는 이들의 조합 중 어느 하나로부터 선택된 폴리머 재료로 이루어진다. 다른 구현예에서, 마이크로유체 네트워크는 PDMS로 이루어진다.
PDMS와 같은 폴리머 재료는 전형적으로 소수성이다. 개시된 발명의 특정 구현예들에서, 층별(LBL) 침착, 산소 플라즈마 처리 후 폴리비닐 알코올(PVA)의 침착, 또는 폴리(에틸렌 글리콜) 코팅 생성을 포함하는 표면 개질 기술이 폴리머 재료 표면 상에서 수행되어, 폴리머 재료의 친수성을 미세하게 제어하고 마이크로유체 네트워크의 전체 유량을 조절할 수 있다. 일 구현예에서, 개질(modification)은 PDMS 또는 기재 표면 상의 BSA 침착을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 개질은 PDMS 또는 기재 표면의 산소 플라즈마 처리를 포함할 수 있다. 플라즈마 산화 처리는, 표면에 실라놀(SiOH) 기를 첨가함으로써 PDMS 또는 기재 표면 화학을 변경하는 데 사용될 수 있다. 대기압 플라즈마(atmospheric air plasma)와 아르곤 플라즈마는 이 플라즈마 처리 적용 분야에 사용된다. 플라즈마 처리는 PDMS 표면을 더욱 친수성으로 만들어, 수용액이 표면 젖음을 유지할 수 있도록 한다. 산화된 표면은 트리클로로실란과의 반응을 통해 더욱 작용화될 수 있다. 대안적으로, 장기적인 친수성이 요구되는 적용 분야의 경우, 친수성 폴리머 그래프팅, 표면 나노 구조화, 및 내장된 계면활성제를 사용한 동적 표면 개질과 같은 기술이 또한 사용될 수도 있다.
일 구현예에서, 마이크로유체 네트워크는 마이크로유체 채널 위에 배치되는 챔버 층, 모세관 밸브, 및 가교 개구부를 포함할 수 있으며, 챔버 층과 마이크로유체 채널은 모세관 밸브 및 가교 개구부를 통해 서로 유체연통하고, 샘플 입구는 챔버 층 내에 위치된다. 일 양태에서, 모세관 밸브는 직경이 약 100 μm 내지 약 300 μm 범위인 크기를 갖는 오리피스를 포함한다. 다른 양태에서, 모세관 밸브는 직경이 약 250 μm인 크기를 갖는 오리피스를 포함한다. 다른 양태에서, 가교 개구부는 직경이 약 0.5 mm 내지 약 2.5 mm 범위의 크기를 갖는 오리피스를 포함한다. 다른 양태에서, 가교 개구부는 직경이 약 1 mm인 크기를 갖는 오리피스를 포함한다.
다른 구현예에서, 챔버 층은 제2 항체 또는 검출 항체를 포함하며, 제2 항체는 표적 분석물에 특이적으로 결합하도록 구성되고, 제2 항체는 마이크로입자에 접합된다. 일 양태에서, 제2 항체는 비오틴 모이어티를 포함하고, 마이크로입자는 스트렙타비딘 코팅을 포함하고, 제2 항체는 스트렙타비딘 코팅에의 비오틴 모이어티의 결합을 통해 마이크로입자에 접합된다. 다른 양태에서, 마이크로입자는 자성 비드(magnetic bead), 폴리스티렌 비드, 실리카 비드, 또는 이들의 조합을 포함한다. 다른 양태에서, 마이크로입자는 직경이 약 1 μm 내지 약 5 μm 범위인 크기를 갖는다. 다른 양태에서, 마이크로입자는 직경이 약 2.8 μm인 크기를 갖는 자성 비드를 포함한다. 다른 양태에서, 챔버 층은 샘플 입구에 부착된 다공성 폴리카보네이트(PC) 멤브레인을 더 포함하고, 제2 항체에 접합된 마이크로입자는 다공성 PC 멤브레인에 고정화된다.
본 명세서에 기술된 다른 구현예는, 개시된 장치 구현예들 또는 양태들 중 어느 하나를 사용하여 샘플 내 표적 분석물의 존재를 검출하고 측정하는 방법으로서, 본 방법은: (a) 완충제 용액을 완충제 입구 내로 적재하는 단계; (b) 완충제 용액을 기재 층 위로 흐르게 하는 단계; (c) 샘플을 샘플 입구 내로 적재하는 단계; (d) 완충제 용액을 샘플과 혼합하는 단계; (e) 완충제 용액과 샘플의 혼합물을 기재 층 위로 순차적으로 흐르게 하는 단계로서, 표적 분석물은 상기 제1 항체 또는 포획 항체에 결합하는, 단계; (f) 완충제 용액을 기재 층 위로 연속적으로 흐르게 하여 미결합 표적 분석물을 제거하는 단계; 및 (g) 전기 임피던스의 변화를 검출하여 샘플 내 표적 분석물의 농도를 정량화하는 단계;를 포함한다. 일 양태에서, 흐르게 하는 것은 모세관 작용을 통해 자발적으로 이루어진다. 다른 양태에서, 샘플은, 완충제 용액과 혼합하기 전에, 제2 항체 또는 검출기 항체에 접합된 마이크로입자와 함께 배양되고, 표적 분석물은 마이크로입자에 접합된 제2 항체에 결합한다. 다른 양태에서, 제2 항체에 접합된 마이크로입자는 다공성 PC 멤브레인 상에 고정화되고, 샘플을 샘플 입구 내로 적재한 후 샘플은 다공성 PC 멤브레인에 적가되고, 마이크로입자는 다공성 PC 멤브레인으로부터 방출되고, 샘플은 제2 항체에 접합된 방출된 마이크로입자와 함께 배양된다. 다른 양태에서, 샘플은, 완충제 용액이 모세관 밸브에 도달한 후 샘플 입구 내로 적재된다. 다른 양태에서, 모세관 밸브는, 샘플이 완충제 용액과 접촉할 때 열린다. 다른 양태에서, 본 방법은 약 5 분 내지 약 10 분 범위의 총 분석 시간을 포함한다.
일 구현예에서, 정현파 입력 전압으로부터 생체분자의 존재 시에 전기 임피던스 변화를 측정하는 데 사용되는, 휴대용 임피던스 바이오센서 장치가 설명된다. 휴대용 임피던스-기반 바이오센서 플랫폼은 마이크로입자를 표지로 사용하는 면역분석의 감도 및 LOD를 향상시킬 수 있다. 일 구현예에서, 10/10 μm 전극/갭 및 소형화된 임피던스 분석기를 갖는 2 x 4 IDE 배열이 설명된다. 마이크로입자를 이용한 면역분석은 마이크로유체 채널을 통합하여 신호 강화를 평가함으로써 수행될 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 판독 감도에 대한 재료 성질 및 표면 전하의 영향을 측정하기 위해 세 가지 다른 유형의 마이크로입자들을 고정된 크기에서 시험하였다. 센서 배열에서 마이크로입자들의 재료 의존성을 이해하기 위해, 자성, 실리카, 및 폴리스티렌 마이크로입자들을 시험하였다. 이들 마이크로입자 중에서, 자성 마이크로입자는 센서 배열의 관련 안정성과 함께 높은 신호 강화를 나타냈다. 자성 마이크로입자들을 사용하여, 일련의 면역분석을 통해 인간 TNF-α를 검출하고, LOD를 측정함으로써 신호 강화의 수준을 비교하였다. 예비 시험을 기반으로, 자성 마이크로입자들은 TNF-α 면역분석을 위한 표지화(labeling)에서 최적의 성능을 보여준다. 항-인간(Anti-human) TNF-α 항체는 EDC/s-NHS 매개 생체접합을 통해 IDE 표면 상에 공유결합될 수 있다. 다양한 농도의 표적 분석물, 및 자성 마이크로입자들과 접합된 항-TNF-α 항체가 검출기로서 도입된다. IDE들 상에 정착(settling)하는 마이크로입자들의 표면 피복률로부터 면역센서 응답(정규화된 임피던스 변화)을 얻음으로써, 검출 한계(LOD)는, 이 면역분석에서, 무표지 검출의 경우 0.99 ng/mL로부터 마이크로입자-표지 검출의 경우 83 pg/mL까지 10배 향상될 수 있다.
관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 명백할 바와 같이, 본 명세서에 기술된 조성물, 제형, 방법, 공정, 및 적용분야에 대한 적합한 변형 및 적합화는, 임의의 구현예들 또는 이의 양태들의 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 제공된 조성물 및 방법은 예시적이며 특정 구현예들 중 어느 것의 범위를 제한하려는 의도가 아니다. 본 명세서에 개시된 다양한 구현예들, 양태들, 및 옵션 모두는 임의의 변형 또는 반복으로 결합될 수 있다. 본 명세서에 기술된 조성물, 제형, 방법, 및 공정의 범위는, 본 명세서에 기술된 구현예들, 양태들, 옵션, 실시예, 및 선호 사항의 모든 실제적 또는 잠재적인 조합들을 포함한다. 본 명세서에 기술된 예시적인 조성물 및 제형은, 임의의 성분을 생략하거나, 본 명세서에 개시된 임의의 성분을 대체하거나, 또는 본 명세서의 다른 곳에 개시된 임의의 성분을 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 조성물들 또는 제형들 중 임의의 것의 임의의 성분의 질량 대 제형 내의 임의의 다른 성분의 질량 또는 제형 내의 다른 성분들의 전체 질량의 비율은, 마치 그것들이 명시적으로 개시된 것처럼 본 명세서에 개시된다. 인용에 의해 통합된 특허 또는 간행물 중 임의의 것에서의 임의의 용어의 의미가 본 개시에서 사용되는 용어의 의미와 충돌하는 경우, 본 개시의 용어 또는 문구의 의미가 우선한다. 또한, 앞선 논의는 단지 예시적인 구현예들을 개시하고 설명한다. 본 명세서에 인용된 모든 특허 및 간행물은, 그것의 특정 가르침을 위해 본 명세서에 인용에 의해 통합된다.
본 명세서에 기술된 본 발명의 다양한 구현예들 및 측면들은 다음 항목들에 의해 요약된다:
항목 1. 생체분자의 검출 및 정량을 위한 마이크로유체 장치로서, 다음을 포함하는 마이크로유체 장치:
(a) 마이크로유체 칩으로서, 상기 마이크로유체 칩은:
마이크로유체 채널, 완충제 입구, 샘플 입구, 및 폐기물 출구를 포함하는 다층 마이크로유체 네트워크로서, 상기 완충제 입구, 상기 샘플 입구, 및 상기 폐기물 출구는 상기 마이크로유체 채널을 통해 서로 유체연통하고, 상기 다층 마이크로유체 네트워크는 완충제 용액 및 샘플을 수용하도록 구성된, 다층 마이크로유체 네트워크; 및
공유결합적으로 부착된 제1 항체를 갖는 표면을 포함하는 기재 층으로서, 상기 제1 항체는 표적 분석물에 특이적으로 결합하도록 적합화되고, 상기 제1 항체는 제1 전극과 제2 전극 사이에 부착되고, 상기 기재 층은 상기 마이크로유체 채널과 유체연통하고, 상기 제1 항체는 상기 마이크로유체 채널 내에 위치된, 기재 층;을 포함하는,
마이크로유체 칩; 및
(b) 전기 임피던스의 변화를 검출하기 위한 검출기.
항목 2. 항목 1에 있어서, 상기 마이크로유체 네트워크는, 폴리카보네이트(PC), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 고리형 올레핀 코폴리머(COC), 폴리이미드, 폴리디메틸실록산(PDMS), 또는 이들의 조합 중 어느 하나로부터 선택된 폴리머 재료로 구성된, 마이크로유체 장치.
항목 3. 항목 2에 있어서, 상기 다층 마이크로유체 네트워크는 PDMS로 구성된, 마이크로유체 장치.
항목 4. 항목 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 다층 마이크로유체 네트워크는, 상기 완충제 용액 및 상기 샘플의 자발적 모세관 작용 흐름을 위한 기하학적 치수를 갖는, 마이크로유체 장치.
항목 5. 항목 4에 있어서, 상기 다층 마이크로유체 네트워크는 상기 마이크로유체 채널 위에 위치된 챔버 층, 모세관 밸브, 및 가교 개구부를 포함하고, 상기 챔버 층 및 상기 마이크로유체 채널은 상기 모세관 밸브 및 상기 가교 개구부를 통해서 서로 유체연통하고, 상기 샘플 입구는 상기 챔버 층 내에 위치하는, 마이크로유체 장치.
항목 6. 항목 5에 있어서, 상기 챔버 층은 제2 항체를 포함하고, 상기 제2 항체는 표적 분석물에 특이적으로 결합하도록 적합화되고, 상기 제2 항체는 마이크로입자에 접합된, 마이크로유체 장치.
항목 7. 항목 6에 있어서, 상기 제2 항체는 비오틴 모이어티를 포함하고, 상기 마이크로입자는 스트렙타비딘 코팅을 포함하고, 상기 제2 항체는 상기 스트렙타비딘 코팅에의 상기 비오틴 모이어티의 결합을 통해 상기 마이크로입자에 접합된, 마이크로유체 장치.
항목 8. 항목 6 또는 7에 있어서, 상기 마이크로입자는 자성 비드, 폴리스티렌 비드, 실리카 비드, 또는 이들의 조합을 포함하는, 마이크로유체 장치.
항목 9. 항목 8에 있어서, 상기 마이크로입자는 직경이 약 1 μm 내지 약 5 μm의 범위인 크기를 갖는, 마이크로유체 장치.
항목 10. 항목 9에 있어서, 상기 마이크로입자는 직경이 약 2.8 μm인 크기를 갖는 자성 비드를 포함하는, 마이크로유체 장치.
항목 11. 항목 6 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 챔버 층은 상기 샘플 입구에 부착된 다공성 폴리카보네이트(PC) 멤브레인을 더 포함하고, 상기 제2 항체에 접합된 상기 마이크로입자는 상기 다공성 PC 멤브레인 상에 고정화된, 마이크로유체 장치.
항목 12. 항목 5 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 모세관 밸브는 직경이 약 100 μm 내지 약 300 μm의 범위인 크기를 갖는 오리피스를 포함하는, 마이크로유체 장치.
항목 13. 항목 12에 있어서, 상기 모세관 밸브는 직경이 약 250 μm인 크기를 갖는 오리피스를 포함하는, 마이크로유체 장치.
항목 14. 항목 5 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 가교 개구부는 직경이 약 0.5 mm 내지 약 2.5 mm의 범위인 크기를 갖는 오리피스를 포함하는, 마이크로유체 장치.
항목 15. 항목 14에 있어서, 상기 가교 개구부는 직경이 약 1 mm인 크기를 갖는 오리피스를 포함하는, 마이크로유체 장치.
항목 16. 항목 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 완충제 용액은 약 0.001 mM 내지 약 1 mM 범위의 농도로 포스페이트 완충 염수(PBS)를 포함하는, 마이크로유체 장치.
항목 17. 항목 16에 있어서, 상기 완충제 용액은 약 0.01 mM 농도로 PBS를 포함하는, 마이크로유체 장치.
항목 18. 항목 16 또는 17에 있어서, 상기 완충제 용액은 약 1 wt%로 소 혈청 알부민(BSA)을 더 포함하는, 마이크로유체 장치.
항목 19. 항목 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 다층 마이크로유체 네트워크는 하나 이상의 흡수제 패드들을 더 포함하는, 마이크로유체 장치.
항목 20. 항목 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플 입구는 혈청 분리 멤브레인을 더 포함하는, 마이크로유체 장치.
항목 21. 항목 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 기재 층은 유리 기재 또는 플라스틱 기재를 포함하는, 마이크로유체 장치.
항목 22. 항목 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 전극 및 상기 제2 전극은 전기전도성 금속으로 코팅된, 마이크로유체 장치.
항목 23. 항목 22에 있어서, 상기 전기전도성 금속은, 금(Au), 티타늄(Ti), 또는 이들의 조합으로부터 선택되는, 마이크로유체 장치.
항목 24. 항목 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 전극과 상기 제2 전극 사이의 거리는 약 1 μm 내지 약 10 μm인, 마이크로유체 장치.
항목 25. 항목 24에 있어서, 상기 제1 전극과 상기 제2 전극 사이의 거리는 약 10 μm인, 마이크로유체 장치.
항목 26. 항목 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 전극과 상기 제2 전극은 약 1 kHz 내지 약 100 kHz 범위의 주파수에서 작동하는, 마이크로유체 장치.
항목 27. 항목 26에 있어서, 상기 제1 전극 및 상기 제2 전극은 약 10 kHz의 주파수에서 작동하는, 마이크로유체 장치.
항목 28. 항목 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 전극 및 상기 제2 전극은 복수의 전극들의 일부이고, 상기 복수의 전극들은 깍지끼워진, 마이크로유체 장치.
항목 29. 항목 1 내지 28 중 어느 하나의 장치를 사용하여 샘플 내 표적 분석물의 존재를 검출 및 측정하기 위한 방법으로서, 다음 단계들을 포함하는 방법:
(a) 완충제 용액을 완충제 입구 내로 적재하는 단계;
(b) 상기 완충제 용액을 상기 기재 층 위로 흐르게 하는 단계;
(c) 샘플을 상기 샘플 입구 내로 적재하는 단계;
(d) 상기 완충제 용액을 상기 샘플과 혼합하는 단계;
(e) 상기 완충제 용액과 상기 샘플의 혼합물을 상기 기재 층 위로 순차적으로 흐르게 하는 단계로서, 상기 표적 분석물은 상기 제1 항체에 결합하는, 단계;
(f) 상기 완충제 용액을 상기 기재 층 위로 연속적으로 흐르게 하여 임의의 미결합 표적 분석물을 제거하는 단계; 및
(g) 전기 임피던스의 변화를 검출하여 상기 샘플 내 표적 분석물의 농도를 정량화하는 단계.
항목 30. 항목 29에 있어서, 흐르게 하는 것은 모세관 작용을 통해 자발적으로 이루어지는, 방법.
항목 31. 항목 29 또는 30에 있어서, 상기 샘플은, 상기 완충제 용액과 혼합되기 전에, 제2 항체에 접합된 마이크로입자와 함께 배양되고, 상기 표적 분석물은 상기 마이크로입자에 접합된 상기 제2 항체에 결합하는, 방법.
항목 32. 항목 31에 있어서, 상기 제2 항체에 접합된 상기 마이크로입자는 다공성 PC 멤브레인 상에 고정화되고, 상기 샘플을 상기 샘플 입구 내로 적재한 후 상기 샘플은 상기 다공성 PC 멤브레인에 적가되고, 상기 마이크로입자는 상기 다공성 PC 멤브레인으로부터 방출되고, 상기 샘플은 상기 제2 항체에 접합된 상기 방출된 마이크로입자와 함께 배양되는, 방법.
항목 33. 항목 29 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플은, 상기 완충제 용액이 모세관 밸브에 도달한 후에 상기 샘플 입구 내로 적재되는, 방법.
항목 34. 항목 33에 있어서, 상기 모세관 밸브는, 상기 샘플이 상기 완충제 용액과 접촉할 때 열리는, 방법.
항목 35. 항목 29 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플은 대상체로부터의 혈액 샘플 또는 기타 생물학적 체액 샘플을 포함하는, 방법.
항목 36. 항목 29 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 약 5 분 내지 약 10 분 범위의 총 분석 시간을 포함하는, 방법.
<실시예>
실시예 1
임피던스 감지 플랫폼(Impedance Sensing Platform)의 설계
임피던스 기반 면역센서는, 전극 표면 상의 박막 필름 구성에서 면역복합체(immunocomplex)(예를 들어, 바이오리셉터(bioreceptor)로서의 항체 및 그것의 상응하는 분석물로서의 특이적 항원)의 형성을 활용한다. 이러한 복합체 형성은 전극/전해질 계면에서 계면 정전용량 및 저항을 변경한다. 전기 임피던스 신호는 전압 페이저(phasor)와 전류 페이저의 비율로서 표현된다. 이 두 페이저들 사이의 불일치는, 감지 전극 상의 전기장이 전극 계면에 있는 생체분자의 존재로 인해 교란 및/또는 변경될 때 발생한다. 여기서는, 도 1에 도시된 바와 같이, 맞춤형 마이크로유체 임피던스 측정 시스템이 설계되었으며, 이는, 금(Au) IDE 배열 칩, 임피던스 분석 회로, LabVIEW 소프트웨어와 결부된 데이터 획득(DAQ) 보드, 및 마이크로유체 채널로 이루어졌다.
약 30 x 30 mm 크기의 정사각형 유리 칩 상에 8 세트의 IDE들을 발생시키기 위해, 종래의 포토리소그래피 공정 및 Ti/Au 침착에 기초하여, 유리 웨이퍼 상에, 대략 전극들 사이의 10 μm의 핑거(finger) 폭 및 간격을 갖는 Au IDE 배열 칩을 제작하였다. 분석기 회로의 전기 임피던스는 12 비트 임피던스 변환기 칩인 AD 5933(Analog Devices Inc.)에 의해 측정된다. 장치구성의 상세한 스케치가 도 2a에 도시되어 있다. 예시적인 IDE 칩 제작 공정에 대한 개략도가 도 2b에 도시되어 있다. 먼저, 유리 기재가 포토레지스트(PR) 재료로 코팅된다. 그 다음, PR 코팅된 유리 기재가 UV 광선에 노출되어 PR을 완전히 현상한다. 그 다음, E-빔 증발을 수행하여, 티타늄 또는 금(3/50 nm)과 같은 전기전도성 금속으로 코팅한다. 그 다음, PR의 리프트-오프(lift-off)를 수행하여 IDE 칩을 발생시킨다. 도 2c는, IDE, 등가 회로, 및 IDE가 인가된 정현파 전압 및 측정된 교류 전류로부터 임피던스 변화를 어떻게 측정하는지에 대한 방정식을 보여준다. 정현파 여기 신호(VPP = 200 mV)가 각각의 쌍의 IDE들에 인가되고, 회로 기판은 그 결과로 발생하는 전류를 읽고 이산 푸리에 변환(Discrete Fourier Transform: DFT)을 계산한다. DFT는 신호의 주파수 의존성 에너지를 측정하므로, 해당 주파수에서 임피던스 Z의 크기 및 위상은 다음 방정식에 의해 얻어질 수 있다:
,
여기서, vi, io, Vi, Io, φi, φo, Rfb, RA, Vo는, 각각, 정현파 입력 전압, 출력 전류, 입력 전압 크기, 출력 전류 크기, 입력 신호의 위상, 출력 신호의 위상, 피드백 저항, 내부 증폭기 이득, 출력 전압 크기이다. AD5933은 두 개의 16비트 레지스터들(registers)에서 DFT의 실수부(R) 및 허수부(I) 값들을 저장한다. 두 개의 데이터 레지스터들은 I2C 프로토콜을 사용하여 DAQ 보드에 의해 접근되며, 데이터 처리 후 맞춤형 LabVIEW 소프트웨어에서 저장된다. LCR-Meter(VSP/VMP3, Bio-Logic Science Instruments)를 사용하여 알려진 임피던스의 저항기(resistor)를 측정하고 11 kHz 내지 91 kHz의 선호 범위에서 주파수를 스와이핑함(swiping)으로써, 이득 계수 및 시스템 위상 오프셋을 먼저 캘리브레이션했다(도 3).
실시예 2
마이크로입자-증폭 임피던스 센서(Microparticle-Amplified Impedance Sensor)의 등가 회로
IDE 바이오센서는 마이크로입자 증폭을 갖는 비패러데이성(non-faradic)인 것으로 간주되므로, 그것의 작동 원리를 더 잘 이해하기 위해, 2전극 시스템의 등가 회로 모델이 조사될 수 있다. 이 등가 회로의 스케치를 도 4에 나타냈다. Cg는 전극들의 치수(두께, 갭, 등) 및 주변 용액의 유전성(dielectric)에 의해 결정되는 전극들의 기하학적 정전용량(geometrical capacitance)이다. Cdl은 두 전극들의 이중층 정전용량들을 나타내며, 전도성 전극과 인접한 완충제 용액 사이의 계면에 나타난다. 두 전극들 사이의 용액의 저항은 다음에 의해 주어진다:
,
.
위의 방정식들에서, n, l, , wsp, 및 L은, 각각, 전극들의 개수, 프린지들(fringes)의 길이, 용액 전도도, 두 전극들 사이의 간격, 인접한 두 전극들의 중심간 거리이다. K(m)은 제1 종류의 모듈러스의 완전한 타원 적분이며 다음과 같이 정의된다:
.
완충제 전도도()는, 다양한 농도의 PBS 완충제에 대해 도 5에 플롯된 바와 같이, 휴대용 전도도 측정기(Oakton CON 6+, Cole-Parmer, USA)에 의해 측정된다.
이 경계에서는, 전압이 인가될 때, 전극 표면 및 완충제 상에 반대 극성을 갖는 두 개의 이온층들이 형성된다. 두 이온층들은 용매 분자의 단일층에 의해 분리되어 전극 표면에 부착되며, 종래의 축전기에서 유전체 역할을 한다. Rs는, 완충제 용액에 따라 변하며 계면 친화력에 의해 영향을 받지 않는, 두 전극들 사이의 완충제 용액의 저항이다. Rs는 완충제에 의해 채워진 공간에 따라 달라지며, 따라서 전극들의 길이 및 전극들 사이의 갭의 크기에 따라 달라진다. 이러한 성분들 각각을 검증하기 위해, Simulink, MATLAB을 사용하여, 단순화된 Randles 등가 회로를 시뮬레이션했다(도 6). 도 6에 도시된 바와 같이, C(DL1) 및 C(DL2)의 두 이중층 정전용량은, 전극들의 대칭성으로 인해, 유사한 것으로 간주되고 30 nF로 고정된다. R(유전체) 및 Cg(유전체)에 대한 값들은 각각 20 kΩ 및 0.6 nF인 것으로 추산된다. 이러한 용액들의 임피던스 크기들 또한 맞춤형 임피던스 분석기로 측정되며, 동일한 경향이 관찰된다. 임피던스 분석기로부터의 값은 LCR 미터에 의해 측정된 절대값의 역수라는 점에 유의해야 한다. 이러한 측정들로부터, 맞춤형 임피던스 분석기는 방정식(G(f)=1/(ZLCR(f) Х ZAnalyzer(f)))에 의해 캘리브레이션되고, 목적하는 주파수 범위에 대해 플롯된다.
포획 항체의 고정화 과정을 고려하면, 산소 플라즈마 처리는 유리 표면 상에 하이드록실 기를 발생시키기 때문에, 항체가 전극들 사이에서 고정화될 가능성이 가장 높다. 따라서, 마이크로입자-증폭 IDE 면역분석(microparticle-amplified IDE immunoassays)을 수행함으로써, 마이크로입자들은 대부분 전극들 사이에 위치된다. 이 경우, 마이크로입자들은 전극들 사이의 임피던스에 영향을 주어, 그것들의 저항률, 및 이중층 정전용량을 갭들에 도입한다. 도 4에서 "입자 효과(particle effects)"로서 강조표시된 부분은 단일 마이크로입자에 의해 유도되는 등가 성분이다. 높은 목표 농도들의 경우, 여러 개의 마이크로입자들이 전극들 사이에 위치할 것이고, 해당 등가 성분이 직렬로 반복되어 임피던스 측정에 변화를 발생시킬 것이다.
실시예 3
마이크로유체 통합(Microfluidic Integration)
간단한 마이크로유체 통합을 위해, 소프트 리소그래피에 의해 PDMS 기반 마이크로유체 채널이 제작되었다. 채널의 높이 및 폭은 각각 110 μm 및 2.5 mm이었고, 이는 IDE들의 전체 영역을 덮기에 충분하다. 마이크로유체 채널의 입구 내로 피펫을 사용하여 샘플 용액들을 가하였고, 면역분석을 위한 모든 용액들을 밀어넣기 위해, 뿐만 아니라 수력학적 세척을 수행하여 미결합 또는 비특이적 마이크로입자들을 제거하기 위해, 출구에 미니 진공 펌프(12/02EB, Thomas Pump)가 배치되었다.
실시예 4
마이크로입자들의 특성분석
다양한 재료의 마이크로입자들이 임피던스 신호에 미치는 증폭 효과를 평가하기 위해, 스트렙타비딘으로 코팅된 자성(Dynabeads M-280, Thermofisher Scientific, USA), 폴리스티렌(08-19-303, Micromod, Germany), 및 실리카(43-19-303, Micromod, 독일) 마이크로입자들이 선택되었다. 초기에, 임피던스 신호에 대한 재료의 영향을 평가하기 위해, 직경 크기가 2.8 μm인 세 가지 서로 다른 마이크로입자들이 5% IDE 표면 피복률에서 임피던스 분광법을 사용하여 조사되었다. 마이크로입자들에 의한 표면 피복의 백분율을 제어하기 위해, 마이크로입자 현탁액을 희석하였고, 마이크로입자들이 표면 상에 침전된 후(약 30초) 현미경으로 표면 피복률을 측정하였다. 그 다음, 이 마이크로입자들을 120 ℃에서 120 분 동안 끓여서, 표면 상의 모든 단백질을 변성시킴으로써, 표면 전하의 효과를 재료 변화로부터 분리(decouple)하였다. 이러한 측정들로부터, 일련의 면역분석들을 위한 최적의 마이크로입자가 결정되었다. 또한, 자성 마이크로입자들의 표면 피복률 대비 임피던스를 측정함으로써, IDE 감지 플랫폼의 분해능을 검증하였다. IDE 배열 상의 다양한 마이크로입자 피복률(0.01~10%)을 준비한 후, 임피던스 크기 변화를 측정하여 이 플랫폼의 전체 LOD를 추산하였다.
실시예 5
표면 작용화 및 온칩 인간 TNF-α 면역분석(On-chip Human TNF-α Immunoassay)
임피던스 센서를 사용한 면역분석을 실증하기 위해, TNF-α 표적 분석물을 검출하는 수용체로서의 포획 항체(capture antibody)(Anti-TNF-α, Abcam, UK)로 IDE 표면을 작용화하였다. 이 연구에서, Au 전극들 사이의 유리 표면 간격들 상에 포획 항체를 고정화하기 위해 카르보디이미드-유도 가교(carbodiimide-induced cross-linking)를 활용하였다. 도 7a 내지 도 7f는 표면 작용화 및 면역접합(immunoconjugation)의 전체 과정을 묘사한다. 먼저, 신선하게 제조된 피라냐 용액(H2SO4/H2O2 3:1 V/V)으로 30 초 동안 IDE 칩을 처리함으로써 세정한 후, 탈이온수(DI)로 철저히 헹구고 질소로 건조하였다. 그 다음, IDE 배열들 상에 열린 창들을 갖는 패터닝된 PDMS 필름(HT 6240 Rogers Corp., USA)을 세정된 IDE 칩 상에 배치하여, 감지 영역 상에만 생화학 반응을 가하였다. 산소 플라즈마로 처리한 후, 하이드록실화 센서 표면을, 3% (3-아미노프로필) 트리에톡시 실란(APTES)으로 작용화하여, 아민-작용화된 표면을 얻었다. 카르보디이미드 결합(coupling) 방법을 적합화하기 위해, 포획 항체들을, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC) 및 술포 N-하이드록시숙신이미드(Sulfo-NHS)(Thermo Scientific, USA)에 의해 활성화시킨 다음, APTES-개질된 표면과 결합하였다. 포획 항체들을 가교 작용제와 함께 40 분 동안 배양한 후, IDE 칩을 탈이온수로 헹구었다. 그 다음, 인간 TNF-α(ab9642, Abcam, USA) 표적 분석물의 7가지 다양한 농도들(10배 희석으로 10 μg/mL ~ 100 pg/mL)을 패터닝된 영역들에서 30 분 동안 추가적으로 배양하였다. 그 다음, PDMS 마이크로유체 장치를, 산소 플라즈마 처리를 통해, 유리 슬라이드에 부착하였다. 1% w/v 소 혈청 알부민(BSA)(1% PBSB) 용액을 갖는 희석된 포스페이트 완충제 염수(PBS)를 먼저 마이크로채널을 통해 주입하였고, 표면 부동태화를 위해 30 분 동안 배양하였다. 그 다음, 비오티닐화된 항-인간 TNF-α 항체들(R&D Systems, USA)을, 스트렙타비딘으로 코팅된 마이크로입자들과 접합(conjugated)시키고, 외부 미니 펌프를 사용하여 마이크로입자들을 마이크로채널 내로 도입하였다. 면역복합체 층들을 형성하는 모든 단일 단계에서 임피던스 신호를 측정하였고, 각각의 측정 전에 적절한 완충제 용액으로 조심스럽게 세척을 수행하여, 미결합 분자 및 이온 잔류물을 철저히 제거하였다. 기준선 값의 변화로 인한 영향을 제거하기 위해, 임피던스 응답을, 측정들(ΔZ) 동안 각각의 쌍의 IDE들에 대한 초기 임피던스(Z0)로 정규화하였으며, 이를 정규화된 임피던스 변화(ΔZ/Z0)라고 지칭한다.
실시예 6
임피던스 센서 성능에 대한 완충제 농도의 영향
임피던스 센서는 특정 완충제 용액에 매우 민감하므로, 최적의 마이크로입자-표지화된 임피던스 감지를 위해 적절한 완충제가 선택되어야 한다. 먼저, 임피던스 분석기, 시뮬레이션된 Randles 모델로부터 임피던스 값들을 측정하였고, 다양한 PBS 농도들에 대해 LCR 미터로 검증하였다. 도 8은 1 mM 내지 0.001 mM의 PBS 농도에 대해 11 kHz 내지 91 kHz의 검사된 주파수들에 걸친 모든 측정들 및 시뮬레이션 결과들을 보여주며, 이는 모든 얻어진 값들에 대해 유사한 경향들 및 일관된 결과들을 실증한다. 11 kHz에서 0.001 mM PBS에 대한 시뮬레이션 결과와의 상세한 비교 연구를 통해, LCR 미터 및 휴대용 임피던스 분석기로부터, 각각, 11 % 및 13.5%의 차이들이 관찰되었다. 임피던스 신호는 더 낮은 주파수에서 전극에 더 민감하기 때문에, 낮은 완충제 농도 하에서 이러한 차이들은 IDE 전극의 제조 상의 변화로부터 비롯될 수 있다. 이 작업에서는, 정규화된 임피던스 변화가 주로 면역반응에 대해 사용되었으며, 그에 따라 그러한 차이들은 측정들에 대해 최소한의 영향을 미칠 수 있다. 도 8에 도시된 바와 같이, 0.1 mM 이상의 농도를 갖는 PBS 완충제들은, 신호가 완충제 용액에 의해 지배되는 < 5 kΩ 범위에서, 유사한 임피던스 크기를 나타낸다. PBS를 0.01 mM까지 추가적으로 희석함으로써, 임피던스 크기들은 > 10 kΩ의 범위로 증가한다. 면역반응으로 인한 임피던스 변화는 전도성이 높고 포화된 완충제 용액들 하에서는 구별될 수 없기 때문에, 0.01 mM PBS 또는 더 낮은 PBS 농도들이 임피던스 기반 면역분석법에 적합하다. 그러나, PBS 농도가 너무 낮으면, 완충 용량이 감소된다. 배경 신호 및 완충 용량을 고려함으로써, 0.01 mM PBS가 모든 후속 실험들을 위한 샘플 완충제 용액으로서 선택되었다. 아래 표 1에는, 다음 방정식을 사용하여 IDE 상에서의 계산된 용액 저항을 나타냈다:
.
표 1. IDE 상에서의 계산된 용액 저항.
PBS
10 mM		 PBS
1 mM		 PBS
0.1 mM		 PBS
0.01 mM		 PBS
0.001 mM
R(용액)/Ohm 3.88
x 101 		3.69
x 102 		2.99
x 103 		2.5
x 104 		1.53
x 105
실시예 7
임피던스 센서 성능에 대한 마이크로입자 재료 조성
마이크로입자들의 재료 및 표면 특성은 임피던스 신호에 큰 영향을 미치기 때문에, 다양한 마이크로입자들이 임피던스 측정에 미치는 영향을 조사하였다. 통상적으로, 마이크로입자들은 유전성 층을 형성함으로써 정전용량에 영향을 미칠 뿐만 아니라 전기장 프린지를 차단함으로써 저항에 영향을 미치며, 이는 등가 회로로부터 예측될 수 있는 바와 같다(도 4). 도 9는, 11 kHz 내지 91 kHz의 주파수 범위에 걸쳐 다양한 마이크로입자들에 의해 유도된 정규화된 임피던스 변화를 보여주며, 이는 저항 및 정전용량의 값들을 둘 다 나타낸다(. 임피던스 값들은 각각의 IDE에 대한 완충제 용액으로부터의 기준선 신호에 대해 정규화되었다. 마이크로입자들의 재료 및 표면의 효과들을 분리하기 위해, 이러한 특성분석 실험들을 위한 스트렙타비딘-코팅된 마이크로입자들 및 변성된 마이크로입자들을 제조하였다. 스트렙타비딘을 갖는 폴리스티렌 및 실리카 마이크로입자들의 경우, 임피던스 변화 백분율은 주파수에 따라, 각각, 1.10% 내지 3.04% 및 1.11% 내지 2.02%로 변한다. 이러한 마이크로입자들을 변성시킨 후, 임피던스 변화는 폴리스티렌의 경우 3.98~4.53%, 실리카의 경우 4.08~4.85%로 증가한다. 그러나, 자성 입자의 경우에는, 변성된 마이크로입자의 경우 임피던스 변화가 2.16~3.36%로 감소하는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과는, 마이크로입자들 상에 스트렙타비딘이 존재하는 경우의 계면 상호작용 및 마이크로입자 표면 전하의 촉진에 의해 설명될 수 있다. 실리카 및 폴리스티렌 마이크로입자들의 경우, 표면 전하는 전기장을 연결(bridge)하고, 변성 조건에 비해 더 낮은 임피던스 변화에 기여한다. 반면, 전기 투과성 초상자성 마이크로입자들에 표면 전하가 없기 때문에, 유전율(permittivity)이 증가하고 전체 임피던스 변화가 약간 떨어진다. 또한, 관찰된 바에 따르면, 전기적으로 불침투성인 재료에 대한 정규화된 임피던스 변화는 측정 주파수가 상승함에 따라 감소하며, 이는 스트렙타비딘으로 코팅된 조건 및 변성된 조건 둘 다에 대해 정전용량 효과가 저항보다 더 지배적이라는 것을 보여준다. 그러나, 자성 마이크로입자의 임피던스 변화는 인가된 주파수에 덜 의존하고, 이는 자성 마이크로입자에 의해 형성된 저항이 비전도성 입자에 의해 부과된 이중층 정전용량보다 더 지배적임을 실증한다(도 4). 자성 마이크로입자의 경우, 분극 효과 또한 전체 임피던스 크기에 기여한다. 자성 마이크로입자가 IDE들 사이에 배치되는 경우, 외부 전기장이 자성 마이크로입자를 분극화시켜, 마이크로입자 주변에서 균일하게 분포된 전기장을 변경함으로써, 더 높은 저항이 발생한다. 또한, 상대 표준 편차(RSD%)를 계산함으로써, 정규화된 임피던스 변화는 11 kHz 내지 91 kHz의 연구된 주파수 범위에서 폴리스티렌(21%) 및 실리카(19%)에 비해 자성 마이크로입자(11%)에 대해 더 우수한 정밀도를 실증하였다. 위에서 언급된 고려 사항들에 기초하여, 그것의 더 높은 출력 신호 및 더 우수한 정밀도로 인해, 결과적인 측정들을 위해 자성 마이크로입자가 선택되었다.
실시예 8
임피던스 변화에 대한 표면 작용화의 영향
표면 작용화 후의 정규화된 임피던스 변화가 도 10에 도시되어 있다. APTES는 노출된 전극들(bare electrodes) 위의 제1 층이고, 고정화된 포획 항체는 제2 층이다. APTES의 단일층 두께는 10 nm 미만으로 가정되지만, 제1 정전용량 층으로서의 그것의 피복은 상당한 임피던스 증가를 발생시킨다. 이는 제1 층의 중요성을 실증하며, 면역분석 동안 감도를 향상시키기 위해 그것의 정전용량을 가능한 한 많이 최소화하는 것을 제안한다. 포획 항체를 첨가한 후, 항체 층으로 인해, 정규화된 임피던스 변화가 증가하였다. 이러한 두께 변화들로부터, 11 kHz는 다른 주파수들에 비해 전기 이중층 정전용량에 의해 가장 응답이 좋은 주파수를 나타내며, 따라서 추가 측정들을 위해 11 kHz의 주파수가 선택되었다.
실시예 9
효과적인 면역분석을 위한 수력학적 세척(Hydrodynamic Washing)
마이크로입자-표지화된 면역분석의 감도가 높은 것을 보장하기 위해서는, 임의의 비특이적 및 미결합 마이크로입자들을 제거하기에 충분한 수력학적 힘으로 기재 표면을 세척해야 한다. 마이크로입자들과 접합된 검출 항체들을 도입한 후, 마이크로유체 채널에서 세척 단계를 수행하였다. 소형 미니 펌프를 사용하여 마이크로채널 출구에 음압을 가함으로써, 완충제 부피 유량을 20 μL/min으로 일정하게 유지하였다. 이 부피 유량은 채널에서의 평균 속도 1.3 mm/s에 해당하며, 이는 마이크로입자들에 대해 40 pN의 총 힘을 발생시킨다. 이러한 총 힘은 면역복합체에서의 접착 강도보다 작다; 그러나, 이러한 총 힘은 표면으로부터 비특이적 결합들을 제거하는 데는 충분하다.
실시예 10
온칩 인간 TNF-α 면역분석(On-chip Human TNF-α Immunoassay)
인간 TNF-α 면역분석이 임피던스 기반 바이오센서에 대해 수행되었다. TNF-α는, 선천성 및 적응성 면역, 세포 증식, 및 세포 사멸 과정에서 중요한 역할을 하는 중요한 염증 유발 특성을 갖는다. TNF-α의 증가된 농도는 급성 및 만성 염증성 질환(예를 들어, 외상, 패혈증, 감염, 관절염)에서 발견된다. 인간 TNF-α는 157개의 아미노산을 함유하고 있으며 분자량은 17.4 kDa이고 등전점(isoelectric point)(pI)은 5.8이다.
면역분석을 수행하기 위해, 먼저, 7가지 서로 다른 농도들(10 μg/mL 내지 100 pg/mL)의 인간 TNF-α를, 무표지 검출(label-free detection)을 위한 포획 항체-개질된 IDE들 상에서 배양하였다. 임피던스 신호를 측정한 후, 항-TNF-α 항체-접합된 자성 마이크로입자를 첨가하여 샌드위치 면역분석을 수행함으로써 신호 강화를 조사하였다. 도 11a는 다양한 농도의 TNF-α와 관련된 마이크로입자들의 분포를 보여준다. 도 11a에 도시된 표면 피복률 이미지들로부터, 마이크로입자 피복률은 표적 분석물 생체분자의 농도에 비례한다는 것을 관찰할 수 있었다. 배경 신호에 의해 조정된 일련의 임피던스 변화들을 얻음으로써, 도 12에 도시된 바와 같이, 마이크로입자들의 개수 및 표면 피복률의 증가로 인해 이러한 차등 크기(differential magnitudes)가 증가한다는 것을 알 수 있었다. 11 kHz에서의 LOD 계산으로부터, 이 센서는, 0.1% 정도로 낮은, 자성 마이크로입자들의 표면 피복률의 변화를 검출할 수 있다. 임피던스 분석기를 사용하여 추가 측정들이 수행되었다. 도 11b 및 도 11c는 무표지 및 마이크로입자-표지 면역분석들에 대한 상대 임피던스 신호와 분석물 농도 사이의 관계를 나타내는 표준 곡선들을 보여준다. 통계 분석에 따르면, 무표지 면역분석 및 마이크로입자-표지 면역분석에 대해 각각 0.9 ng/mL 및 83.46 pg/mL의 LOD가 달성되었다. 마이크로입자들은 LOD의 한 자리수 규모 향상을 가능하게 한다. 무표지 분석의 경우, TNF-α 분자는 포획 항체에 결합하고, 얇은 TNF-α 분자 층을 형성함으로써 추가적인 정전용량 층을 제공한다. TNF-α의 pI는 5.8이므로, TNF-α는 pH 7.4의 PBS 완충제 내에서 부분적으로 음전하를 갖는다. TNF-α 항원의 농도가 증가함에 따라, 전극들 사이에 음전하가 더 많이 축적되어, 더 높은 전기장 분산 및 임피던스 변화를 발생시킨다. 자성 마이크로입자들로 표지화할 경우, 마이크로입자들의 전기장 및 재료 특성의 차단으로 인해, 무표지 분석에 비해 더 높은 임피던스 변화가 관찰된다. 더 높은 표적 농도의 경우, 자성 마이크로입자들은 서로 더 가까워지고, 비록 자성 마이크로입자들이 유리의 작용화된 영역 상의 전극들 사이에 고정화될 것으로 예상되기는 하지만, 자성 마이크로입자들은 전극들 상에 위치할 수 있다. 이 경우, 전기장 하에서 IDE들 사이의 분극된 마이크로입자들은, 특히 거리가 디바이(Debye) 길이보다 작을 때, 추가적인 자기장을 발생시킨다. 이로 인해, 더 높은 농도의 표적(>100 ng/mL)에 대해 높은 임피던스 변화 신호가 발생한다. 그러나, 그것은 또한, 마이크로입자들 간의 거리들의 변화 및 무작위적인 분극으로 인해, 표준 편차도 증가시킨다. 또한, 분석의 정밀도를 정량화하기 위해, 변동 계수(coefcient of variations: CV)를 조사하였다. 이 연구에서는, 무표지 분석 및 마이크로입자-표지 분석 둘 다로부터 20% 미만의 CV가 달성되었으며, 이는 표적 생체분자 농도의 동적 범위에 걸쳐서 적절한 CV이다.
아래 표 2는, 이전 연구들에 기초한 다양한 표적들 및 계면들(interfaces)에 대한 비패러데이성 IDE-기반 면역센서들을 강조한다. 통상적으로, 무표지 검출은 신호 강화 기술을 채용하는 검출에 비해 감도가 낮다. 비록 IDE들의 검출 프로토콜 및 핑거 기하학을 최적화함으로써 일부 무표지 면역센서들의 감도가 향상되었지만, 신호 강화 기술은 전체 LOD의 개선을 위한 더욱 유망하고 비용-효율적인 결과를 보여준다. 본 연구에서 마이크로입자 표지화 방법 및 마이크로유체 채널을 통한 제어된 수력학적 세척력을 사용하여 한 자리수 초과 규모의 전체 LOD가 제공되었으므로, 신호 강화 기술이 최적화된 IDE 간격 특성으로 보완되면 임피던스 신호는 추가적으로 향상될 수 있다.
표 2. IDE-기반 면역센서들로부터의 분석 파라미터들 사이의 비교
표적
생체분자 		LOD
[ng/mL] 		전극
간격 		마이크로유체 성분 시간 비고
작용화/제조 분석 [min]
인간 혈청
알부민 [1] 		200 4-20 μm 없음 >135h 60 무표지
심장
트로포닌 I [2] 		0.2 - 없음 >12h 120 무표지;
GNP에 의해 표면적 향상
플라스모듐
락테이트
탈수소효소 [3] 		0.25 8 μm 없음 >12h 120 무표지
암배아 항원 (CEA) [4] 1 20 μm 없음 >44h 30 GNP에 의해 향상된 임피던스 신호; 단일 전극 사용
TNF- α 0.083 10 μm 있음 <2h 30 신호 강화를 위한
자성 마이크로입자
[1] Chuang et al., Biosens Bioelectron, 2011, 28, 368-372.
[2] Bhalla et al., Sensors and Actuators B: Chemical, 2012, 161, 761-768.
[3] Low et al., Sensors (Basel), 2019, 19.
[4] Yeh et al., Sensor Actuat a-Phys, 2016, 241, 203-211
생체분자를 검출하기 위한 다양한 바이오센서를 개발함으로써, 이들 플랫폼의 감도를 향상시키는 것이 많은 주목을 받고 있다. 이러한 연구들은, 소형 임피던스 분석기, 데이터 수집 보드, 및 성공적으로 개발된 마이크로유체 채널과 통합된 IDE 배열로 이루어진 임피던스 측정식 바이오센서를 실증한다. 이 플랫폼으로부터의 임피던스 신호는 먼저 MATLAB Simulink의 시뮬레이션 및 LCR 미터에 의해 검증되었다. 생체분자의 단일층 검출 및 마이크로입자 검출을 위한 플랫폼의 분해능을 조사하였고, 인간 TNF-α를 정량화하기 위해 실제 분석을 수행하였다. 세 가지 서로 다른 유형의 마이크로입자들을 시험한 후, 가장 높고 일관된 임피던스 신호를 발생시키는 마이크로입자로 검출기 항체들을 표지화하였다. LOD는, 자성 마이크로입자들을 사용하는 무표지 생물분석에 비해, 한 자리수 규모만큼 향상될 수 있었다. 신호 강화를 위한 마이크로입자-표지화 방법을 갖춘 이 새롭고 민감한 임피던스 바이오센서는, POC 적용 가능성을 갖는 제어된 수력학적 세척력을 위해 마이크로유체를 활용한다.
다양한 디지탈화된 바이오센서들 중에서, 임피던스 측정식 바이오센서는, 통합 용이성, 소형화, 빠른 응답, 비용 효율적인 분석, 및 스마트폰과의 간편한 통신으로 인해, POC에 대한 가능성을 보여주었다. 본 명세서에서 설명된 플랫폼은 분석물의 자발적이고 순차적인 전달을 위해 모세관 구동 마이크로유체와 통합될 수 있다. 이러한 마이크로유체 접근법은, 마이크로입자-표지 면역분석법을 위한 제어된 수력학적 세척력을 갖기 위해 특정 범위로 유량을 제어하도록 정밀하게 설계되어야 한다. 기능성 및 LOD를 향상시키기 위해, 추가적인 특성분석 및 최적화를 수행할 수 있다. 이전에 실증된 바와 같이, 마이크로- 또는 나노입자들의 크기는 임피던스 신호에 큰 영향을 미치지 않는다. 그러나, 마이크로/나노입자 크기에 대한 전극 갭의 비율을 고려함으로써, 최적의 바이오센싱 성능이 결정될 수 있다. 또한, 마이크로유체 칩 상에 혈청 분리 멤브레인을 통합시키고, 스마트폰 또는 랩톱과 상호작용할 수 있는 통신 칩을 포함함으로써, 이 장치는 높은 감도 및 다중 진단 능력을 갖춘 이상적인 독립형 POC 플랫폼이 될 것이다.
실시예 11
모세관 구동 마이크로유체
마이크로입자 표지화 방법을 사용하여 신호 증폭 샌드위치 면역분석을 수행하는 데 필요한 모든 구성요소들을 함유하는 통합 모세관 마이크로유체 및 임피던스-기반 바이오센서가 설명된다. 제어된 모세관 구동력이 유체 조작에 활용되며, 자성 마이크로입자들은 LOD 개선을 위해 임피던스 신호들을 강화시키도록 적합화된다. 생물분석을 수행하기 위해, 필요한 모든 샘플들 및 시약들을 감지 영역 내로 순차적으로 전달하는 마이크로유체 칩에 작은 부피의 샘플(μL 범위)이 도입된다. 이 통합 칩(또는, 카트리지)은 신호를 판독하기 위해 휴대용 임피던스 측정식 바이오센서 내로 삽입된다. 실제 면역분석의 경우, 모세관 작용 마이크로유체를 사용하여 사용자 개입을 최소화하면서 이 통합 플랫폼 상에서 시약들이 약 6 분 만에 순차적으로 전달된다. 실증을 위해, 인간 트로포닌 I을 시험하여 이 통합 플랫폼의 전체 기능을 확인할 수 있다. 통합 마이크로유체 및 IDE 플랫폼은 신속한 분자 진단을 위한 샘플-인-응답-아웃 면역분석 플랫폼(sample-in-answer-out immunoassay platform)을 가능하게 한다.
모세관 마이크로유체 설계
도 13에 도시된 바와 같이, 정밀하게 제어된 샌드위치 면역분석을 수행하기 위해 2단 모세관-구동 마이크로유체 시스템이 개발되었다. 두 단 모두 AutoCAD로 설계되었으며 해당 마스크는 CAD/Art Services로부터 얻었다. 완충제 저장 및 폐기 구역들에서의 채널의 폭은 500 μm로 채택된 한편, 분기로부터 감지 영역까지의 채널의 폭은 200 μm이다. 종래의 포토리소그래피 공정 이후에, 실리콘 웨이퍼 상에 마스터 몰드로서의 목적하는 패턴을 현상하였다. 두 단의 채널 높이는 100 μm로 고정된다. PDMS를 경화 시약과 10:1 w/w 비율로 혼합하고, 대류 오븐에서 밤새 경화하였다. 경화 후, PDMS를 마스터 몰드로부터 떼어내고 생검 펀치(biopsy punches)로 펀칭하였다. 완충제 입구, 가교(bridging) 개구부, 및 출구를, 각각, 2.5 mm, 1 mm, 및 0.5 mm의 직경으로 제1 단 상에서 펀칭하였다. PDMS 필름(HT6240, Rogers Corporation, USA)으로부터 중간층을 커팅하고, 두 PDMS 단들(PDMS stages) 사이에서 모세관 정지 밸브(CSV) 역할을 하는 250 μm 개구부를 중간층 상에 생성하였다. 표적 분석물을 센서들 내로 전달하도록 설계된 최상층은, 각각 1.5 mm 및 0.5 mm 크기의 표적 입구 및 탈기(벤트)를 위한 2개의 개구부들을 갖는다.
모세관-구동 마이크로유체의 작동 원리
완충제 용액(청색 염료)인, PBS 10 mM(PBSB 1%) 중의 1% 소 혈청 알부민을 먼저, 출구 벤트를 덮은 상태에서 완충제 용액 입구에 첨가한다(도 14 참조). 모세관 현상은 감지 영역으로부터 통과하는 출구 쪽으로 완충제를 구동한다. 채널의 단부가 닫혀 있으므로(출구 벤트를 덮는 경우에), 총 0.2 μL의 부피가 각각의 분기의 감지 영역으로 진행하고, 가교(bridging) 개구부 이후 5 mm에서 정지한다. 완충제는 가교 개구부에 도달한 후, 두 단들의 중간에서 CSV에 의해 저지될 때까지, 개구부 위로 올라가기 시작한다. 그 다음, 표적 분석물을 포함하는 샘플들(적색 염료)을 상부 마이크로유체 단 상의 샘플 입구 개구부 내로 도입함으로써, 장치는 실행될 준비가 된다. 샘플들은 먼저 채널 중앙의 검출기 항체(dAb)-접합 마이크로입자들에 부딪히고, 감지 지점들 상의 포획 항체(cAb)에 의해 포획될 준비가 된 면역복합체들을 형성한다. 이 샘플 용액을 가교 개구부에 접촉시킴으로써, 이 샘플 용액은 하부 단으로부터의 완충제와 혼합되고, 감지 영역 내로 흘러 들어간다. 이때, 출구 벤트로부터 덮개를 제거함으로써, 모든 분석물들이, 감지 영역 위로 통과하고 IDE들 상에 면역복합체들을 발생시킴으로써, 출구를 향해 흐르기 시작한다.
통합 IDE 감지 플랫폼의 설계 및 제작
임피던스 측정식 바이오센서를 사용하여 모세관-구동 마이크로입자-표지 샌드위치 면역분석을 수행하는 데 필요한 모든 구성요소들을 포함하는 통합 휴대용 장치가 설계되었다. IDE 칩 위의 마이크로유체 칩은 장치의 상자 내로 삽입될 수 있는 슬라이더 상에 배치된다(도 15a 및 도 15b). 12-비트 임피던스 변환기 칩인 AD 5933(Analog Devices Inc.)에 의한 분석기 회로의 전기 임피던스는, 스프링 핀으로 마이크로칩 카트리지 상의 전극 패드들과 접촉되도록 설계되었다. 장치는, 도 15a에 도시된 바와 같이, DAQ 보드로부터의 USB 포트를 사용하여 랩톱에 연결된다. 도 15b에 도시된 대안적인 설계를 사용하여, 모든 하우징 및 회로를 3D 프린터로 제작하였다.
모세관 마이크로유체 채널의 흐름 제어
모세관-구동 마이크로유체 시스템에서 유량을 제어하는 것은 채널을 설계할 때 신중하게 고려해야 하는 중요한 파라미터인데, 이는 특정 재료의 경우 유량이 채널 기하학에만 의존하기 때문이다. 다른 몸체 힘(body forces)(예를 들어, 중력) 없이 층류 및 정상 상태 흐름에 대한 나비어-스톡스(Navier-Stocks) 방정식을 단순화함으로써, 부피 유량을 다음에 의해 추산할 수 있다:
,
여기서, h, w, μ, 및 L(t)는 각각 채널 높이, 폭, 액체 점도, 및 채널에서의 시간 의존성 액체 길이이다. 이 추산은 h = w에 대해 13% 오차를 갖고, h = w/2에 대해서는 0.2%로 내려간다. ΔP를 영-라플라스(Young-Laplace) 방정식으로 대체하면, 모세관-구동 시스템에 대한 유량을 계산할 수 있다.
CSV의 경우, 압력 장벽은, 다음 방정식에 따라, 액체 접촉각뿐만 아니라 기하학적 파라미터들에도 의존한다:
,
여기서, γ 및 h는 각각 계면 장력과 채널 높이이다.
1 분 산소 플라즈마 처리 후 1 시간이 지나면 물 접촉각이 약 45°에 도달하는 것으로 보고되었으며, 이를 θ로서 사용하여 CSV에서의 파열 압력(burst pressure)을 계산하였다. γ = 20 mN/m 및 h = 250 μm(모세관 밸브의 크기)라고 가정하면, 각각의 CSV의 파열 압력은 55 Pa(5.5 mmH2O와 동일)이 될 것이다. h = 110 μm에 대한 유체 채널들의 부피 용량은 55 mm3(=μL)이며, 이는 입구로부터 분기점까지의 13 mm3, 및 각각의 분기에 대한 10.5 mm3로 이루어진다. 완충제가 가교 개구부에 도달하면, 분석을 완료하는 데 필요한 총 부피는 35μL이다. 완충제 입구 크기를 3 mm로 하고 PDMS 층 두께가 2 mm인 것으로 고려하면, 이 35μL 완충제 부피에 의해 발생되는 수두(hydraulic head)는 CSV의 파열 압력보다 작을 것이다. 이는 유체 네트워크를 위한 설계된 CSV의 성능을 보장한다.
전체 분석 시간을 추산하기 위해, 다양한 구역들에 대한 충전 시간들(filling times)을 조사하였다. 완충제가 프라이밍 구역(priming section)을 완전히 채우고 감지 영역에 도달하는 데 약 3 분이 소요된다. 가교 개구부에서의 완충제의 CSV까지의 상승 시간에 대한 가교 개구부 직경의 영향을 조사하였으며, 이를 도 16에 플롯하였다. 1 mm 미만의 가교 개구부 직경은 상승 시간을 크게 변화시키지 않는 것으로 확인되었으며, 따라서 1 mm 가교 개구부 직경이 선택되었다. 이 1 mm 개구부 크기의 경우, 모세관-구동 완충제 충전에 2분이 소요된다. 표적 분석물 도입(~1분), 분석물 확산을 위한 기다림(~1분), 및 출구로부터의 덮개 테이프 제거 후, 폐기물 통을 채우고 분석을 완료하는 데 약 1 분이 소요된다. 모든 시간을 고려하면, 이 설계를 사용하여 전체 분석을 완료하는 데 총 6 분이 소요된다.
인간 트로포닌 I 분석물을 사용한 생물분석 실증
도 17에 도시된 바와 같이, 다양한 색상의 염료를 사용하여 상세한 유체 시퀀스들을 실증하였다. 도 17의 캡처된 프레임들을 사용하면, 분석은 초기에 완충제 입구로부터의 완충제 적재 단계로 시작한다. 완충제(청색 염료)는 영 라플라스 압력(Young Laplace pressure)이 정상 상태에 도달할 때까지 모세관 채널을 통해 흐른다. 그 다음, 순차적인 반응을 위해 각각의 웰에 샘플 액체(적색 염료) 및 검출 항체-접합 마이크로입자(황색 염료)를 적재하였다. 출구들에서 덮개 테이프를 제거한 후, 압력이 증가하여 모든 액체들이 모세관 채널들을 통해 이동하도록 강제하며, 흐름 동안 항원 및 항체 반응들이 발생한다.
이 실증에 이어, 이 통합 IDE 플랫폼의 추가적인 실증을 위해 트로포닌 I 분석이 수행되었다. 도 18a 및 도 18b는 모든 유체 시퀀스를 확인하는 예비 분석 결과를 보여준다. 세 가지 서로 다른 농도들의 트로포닌 I를 시험함으로써, IDE 신호는, 인간 트로포닌 I의 농도가 증가함에 따라, 선형적으로 증가하는 것으로 관찰되었다. 이 분석 실증을 통해, IDE 및 모세관-구동 마이크로유체 칩을 포함하여, 임피던스 분석기 및 통합 IDE 칩의 기능이 검증되었다.
이 모세관-구동 마이크로유체 장치는 마이크로입자-표지 면역분석을 수행하는 데 필요한 시약들의 자발적이고 순차적인 전달을 위해 설계되고 시험되었다. 마이크로유체 시스템은 추가적인 소형화 및 샘플 제조의 추가를 위해 2단(two stages)으로 설계되었다. 처음으로, 수직형 CSV가 마이크로유체의 두 단들을 연결하도록 설계 및 특성분석되었다. 채널들에서의 흐름을 특성분석함으로써, 이 일회용 바이오칩을 사용하는 전체 분석에는 약 6 분이 소요된다. 이 칩은 임피던스-기반 생체분자 측정을 위한 모든 필요한 구성요소들을 포함하는 휴대용 소형 케이스 내로 삽입되도록 설계된다.
모세관 마이크로유체를 사용하여 1단계 면역분석을 수행하는 데 있어 필수적인 단계는 전혈 샘플로부터 인간 혈청을 분리하는 것이다. 마이크로유체-기반 POC 적용 분야에서, 이러한 분리는 전형적으로 혈청 분리 멤브레인에 의해 달성된다. 본 명세서에 설명된 2층 마이크로유체 칩은 샘플 입구를 통해 일회용 카트리지 내로의 혈청 분리 멤브레인의 용이한 구현을 가능하게 한다.
이 플랫폼을 장기간 사용하고 표면 젖음 특성을 유지하기 위해, 마이크로유체 칩에서의 유량은 두 가지 주요 수정을 통해 제어될 수 있다. 첫째, 폴리카보네이트(PC), 폴리메틸메타아크릴레이트(PMMA), 고리형 올레핀 코폴리머(COC), 및 폴리이미드와 같은 다양한 폴리머 재료를 활용하여 PDMS의 본래의 단점들을 극복할 수 있다. 둘째, PDMS 표면들에 대해, 층별 침착, 플라즈마 처리 후 폴리비닐 알코올 침착, 또는 폴리(에틸렌 글리콜) 코팅 생성을 포함한 표면 개질 기술들을 수행하여, PDMS의 친수성을 미세하게 제어하고 마이크로유체 네트워크의 전체 유량을 조절할 수 있다. 게다가, 폐기물 영역에 또는 마이크로유체 네트워크의 상부 마이크로유체 단(stage)에 하나 이상의 흡수제 패드를 추가함으로써, 완충제 및 샘플 용액들의 유량을 쉽게 조절할 수 있으며, 결과적으로 더 넓은 범위의 속도를 얻을 수 있다.
실시예 12
DNA 마이크로배열 적용(DNA Microarray Applications)
개시된 장치 및 센서 배열은 또한, 포획 항체가 아닌, 고정화된 "포획" 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자로 센서 표면을 작용화함으로써, DNA 혼성화 칩(DNA hybridization chips)(즉, DNA 마이크로배열)에 사용될 수 있다. 이 개념을 구현하기 위해, 동일한 표면 화학 및 작용화 공정을 사용하여, 다양한 ssDNA 분자들을 고정화할 수 있다. 그 다음, 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로부터 증폭된 표적 분석물 DNA를 센서 배열 상에서 분석할 수 있다. 전형적으로 형광 신호를 활용하는 마이크로배열 판독기 대신에, 차등 임피던스 신호를 측정하여, 임의의 추가 기기에 대한 필요성 없이, DNA 또는 RNA 샘플로부터 다수의 유전자들의 농도 수준을 결정할 수 있다. 따라서, 본 개시된 장치 및 방법은, 예를 들어, 면역분석 및 DNA 마이크로배열을 포함하는 광범위한 생물분석 적용분야들에서 사용될 수 있다.

Claims (36)

  1. 생체분자(biomolecules)의 검출 및 정량을 위한 마이크로유체 장치(microfluidic device)로서, 다음을 포함하는 마이크로유체 장치:
    (a) 마이크로유체 칩(microfluidic chip)으로서, 상기 마이크로유체 칩은:
    마이크로유체 채널, 완충제 입구, 샘플 입구, 및 폐기물 출구를 포함하는 다층 마이크로유체 네트워크(multi-layer microfluidic network)로서, 상기 완충제 입구, 상기 샘플 입구, 및 상기 폐기물 출구는 상기 마이크로유체 채널을 통해 서로 유체연통하고, 상기 다층 마이크로유체 네트워크는 완충제 용액 및 샘플을 수용하도록 구성된, 다층 마이크로유체 네트워크; 및
    공유결합적으로 부착된 제1 항체를 갖는 표면을 포함하는 기재 층으로서, 상기 제1 항체는 표적 분석물(target analyte)에 특이적으로 결합하도록 적합화되고, 상기 제1 항체는 제1 전극과 제2 전극 사이에 부착되고, 상기 기재 층은 상기 마이크로유체 채널과 유체연통하고, 상기 제1 항체는 상기 마이크로유체 채널 내에 위치된, 기재 층;을 포함하는,
    마이크로유체 칩; 및
    (b) 전기 임피던스의 변화를 검출하기 위한 검출기.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 다층 마이크로유체 네트워크는, 폴리카보네이트(PC), 폴리메틸메타아크릴레이트(PMMA), 고리형 올레핀 코폴리머(COC), 폴리이미드, 폴리디메틸실록산(PDMS), 또는 이들의 조합 중 어느 하나로부터 선택된 폴리머 재료로 구성된, 마이크로유체 장치.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 다층 마이크로유체 네트워크가 PDMS로 구성된, 마이크로유체 장치.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 다층 마이크로유체 네트워크는 상기 완충제 용액 및 상기 샘플의 자발적 모세관 작용 흐름(autonomous capillary action flow)을 위한 기하학적 치수를 갖는(geometrically dimensioned), 마이크로유체 장치.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 다층 마이크로유체 네트워크는 상기 마이크로유체 채널 위에 위치된 챔버 층, 모세관 밸브, 및 가교 개구부(bridging hole)를 포함하고, 상기 챔버 층 및 상기 마이크로유체 채널은 상기 모세관 밸브 및 상기 가교 개구부를 통해 서로 유체연통하고, 상기 샘플 입구는 상기 챔버 층 내에 위치된, 마이크로유체 장치.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 챔버 층은 제2 항체를 포함하고, 상기 제2 항체는 상기 표적 분석물에 특이적으로 결합하도록 적합화되고, 상기 제2 항체는 마이크로입자에 접합된(conjugated), 마이크로유체 장치.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 제2 항체는 비오틴 모이어티를 포함하고, 상기 마이크로입자는 스트렙타비딘 코팅을 포함하고, 상기 제2 항체는 상기 스트렙타비딘 코팅에의 상기 비오틴 모이어티의 결합을 통해 상기 마이크로입자에 접합된(conjugated), 마이크로유체 장치.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 마이크로입자는, 자성 비드(magnetic bead), 폴리스티렌 비드, 실리카 비드, 또는 이들의 조합을 포함하는, 마이크로유체 장치.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 마이크로입자는 직경이 약 1 μm 내지 약 5 μm의 범위인 크기를 갖는, 마이크로유체 장치.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 마이크로입자는 직경이 약 2.8 μm인 크기를 갖는 자성 비드를 포함하는, 마이크로유체 장치.
  11. 제 6 항에 있어서, 상기 챔버 층은 상기 샘플 입구에 부착된 다공성 폴리카보네이트(PC) 멤브레인을 더 포함하고, 상기 제2 항체에 접합된 상기 마이크로입자는 상기 다공성 PC 멤브레인에 고정화된(immobilized), 마이크로유체 장치.
  12. 제 5 항에 있어서, 상기 모세관 밸브는 직경이 약 100 μm 내지 약 300 μm의 범위인 크기를 갖는 오리피스를 포함하는, 마이크로유체 장치.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 모세관 밸브는 직경이 약 250 μm인 크기를 갖는 오리피스를 포함하는, 마이크로유체 장치.
  14. 제 5 항에 있어서, 상기 가교 개구부는 직경이 약 0.5 mm 내지 약 2.5 mm의 범위인 크기를 갖는 오리피스를 포함하는, 마이크로유체 장치.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 가교 개구부는 직경이 약 1 mm인 크기를 갖는 오리피스를 포함하는, 마이크로유체 장치.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 완충제 용액은 약 0.001 mM 내지 약 1 mM 범위의 농도로 포스페이트 완충 염수(phosphate buffered saline: PBS)를 포함하는, 마이크로유체 장치.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 완충제 용액은 약 0.01 mM 농도로 PBS를 포함하는, 마이크로유체 장치.
  18. 제 16 항에 있어서, 상기 완충제 용액은 약 1 wt%로 소 혈청 알부민(bovine serum albumin: BSA)을 더 포함하는 장치.
  19. 제 1 항에 있어서, 상기 다층 마이크로유체 네트워크는 하나 이상의 흡수제 패드들(absorbent pads)을 더 포함하는, 마이크로유체 장치.
  20. 제 1 항에 있어서, 상기 샘플 입구는 혈청 분리 멤브레인을 더 포함하는, 마이크로유체 장치.
  21. 제 1 항에 있어서, 상기 기재 층은 유리 기재 또는 플라스틱 기재를 포함하는, 마이크로유체 장치.
  22. 제 1 항에 있어서, 상기 제1 전극 및 상기 제2 전극은 전기전도성 금속으로 코팅된, 마이크로유체 장치.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 전기전도성 금속은, 금(Au), 티타늄(Ti), 또는 이들의 조합으로부터 선택되는, 마이크로유체 장치.
  24. 제 1 항에 있어서, 상기 제1 전극과 상기 제2 전극 사이의 거리는 약 1 μm 내지 약 10 μm인, 마이크로유체 장치.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 제1 전극과 상기 제2 전극 사이의 거리는 약 10 μm인, 마이크로유체 장치.
  26. 제 1 항에 있어서, 상기 제1 전극 및 상기 제2 전극은 약 1 kHz 내지 약 100 kHz 범위의 주파수에서 작동하는, 마이크로유체 장치.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 제1 전극 및 상기 제2 전극은 약 10 kHz의 주파수에서 작동하는, 마이크로유체 장치.
  28. 제 1 항에 있어서, 상기 제1 전극 및 상기 제2 전극은 복수의 전극들의 일부이고, 상기 복수의 전극들은 상호 맞물린(interdigitated), 마이크로유체 장치.
  29. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항의 마이크로유체 장치를 사용하여 샘플 내 표적 분석물의 존재를 검출 및 측정하기 위한 방법으로서, 다음 단계들을 포함하는 방법:
    (a) 완충제 용액을 상기 완충제 입구 내로 적재하는 단계;
    (b) 상기 완충제 용액을 상기 기재 층 위로 흐르게 하는 단계;
    (c) 샘플을 상기 샘플 입구 내로 적재하는 단계;
    (d) 상기 완충제 용액을 상기 샘플과 혼합하는 단계;
    (e) 상기 완충제 용액과 상기 샘플의 혼합물을 상기 기재 층 위로 순차적으로 흐르게 하는 단계로서, 상기 표적 분석물은 상기 제1 항체에 결합하는, 단계;
    (f) 상기 완충제 용액을 상기 기재 층 위로 연속적으로 흐르게 하여 미결합 표적 분석물을 제거하는 단계; 및
    (g) 전기 임피던스의 변화를 검출하여 상기 샘플 내 표적 분석물의 농도를 정량화하는 단계.
  30. 제 29 항에 있어서, 흐르게 하는 것은 모세관 작용을 통해 자발적으로 이루어지는, 방법.
  31. 제 29 항에 있어서, 상기 샘플은, 상기 완충제 용액과 혼합되기 전에, 제2 항체에 접합된 마이크로입자와 함께 배양(incubation)되고, 상기 표적 분석물은 상기 마이크로입자에 접합된 상기 제2 항체에 결합하는, 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 제2 항체에 접합된 상기 마이크로입자는 다공성 PC 멤브레인 상에 고정화되고, 상기 샘플을 상기 샘플 입구 내로 적재한 후 상기 샘플은 상기 다공성 PC 멤브레인에 적가되고, 상기 마이크로입자는 상기 다공성 PC 멤브레인으로부터 방출되고, 상기 샘플은 상기 제2 항체에 접합된 상기 방출된 마이크로입자와 함께 배양되는, 방법.
  33. 제 29 항에 있어서, 상기 샘플은, 상기 완충제 용액이 모세관 밸브에 도달한 후에 상기 샘플 입구 내로 적재되는, 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 모세관 밸브는, 상기 샘플이 상기 완충제 용액과 접촉할 때 열리는, 방법.
  35. 제 29 항에 있어서, 상기 샘플은 대상체(subject)로부터의 혈액 샘플 또는 기타 생물학적 유체 샘플을 포함하는, 방법.
  36. 제 29 항에 있어서, 상기 방법은 약 5 분 내지 약 10 분 범위의 총 분석 시간을 포함하는, 방법.
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