KR20230173093A - 친화성 제제 - Google Patents
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- C07K7/56—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation not occurring through 2,4-diamino-butanoic acid
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Abstract
표적 분자에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 친화성 제제가 본원에서 제공된다. 친화성 제제는 결합, 단리 및/또는 정제에 유용하다.
Description
관련 출원에 대한 교차 참조
본 PCT 출원은 2021년 3월 10일자로 출원된 미국 가출원 제63/159,336호의 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
생물학적으로 생산된 치료요법제의 순도는 안전성과 효능을 보장하기 위해 당국에 의해 엄격하게 조사되고 규제된다. 따라서 생물학적으로 생산된 치료요법제를 고순도로 효율적으로 정제하기 위한 수단의 필요성이 남아 있다.
첨단치료 의약품[advanced therapy medicinal product, ATMP]에 대한 임상적 노력을 지원하기 위해, 재조합 공급원으로부터 ATMP를 효율적으로 정제하기 위한 조성물 및 방법이 필요하다. 친화성 정제는 몇 단계 또는 단일 단계로 원하는 순도의 단백질을 단리 및/또는 획득하는 수단이다. 그러나 친화성 제제(예: 친화성 리간드를 포함하는 것)의 개발은 자원 집약적이고 시간 소모적인 작업일 수 있고, 따라서 매우 소수의 단백질에 대한 친화성 제제가 존재한다. 친화성 제제가 없는 경우 정제는 일반적으로 다중-컬럼 공정과 같은 비효율적인 공정이 수반된다.
엑소좀은 치료 효능[therapeutic potential]이 큰 신흥 ATMP이다(문헌 Madhusoodanan 2020). 이들은 세포외 소포의 하위 분류이며, 여기에는 미세소포체와 세포사멸체도 포함된다(문헌 Zaborowski 등 2015). 치료 목적으로 엑소좀을 제조하는 것은 어렵고 비용이 많이 든다. 세포 배양 생산성은 낮으며 일반적으로 리터당 1011 - 1014 엑소좀을 달성한다. 정제는 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 주로 수행된다. 그러나 이 방법은 엑소좀에 대해 선택적이지 않기 때문에 다른 세포외 소포와 공동 정제되고 숙주 세포 단백질이 불충분하게 제거된다. 따라서 엑소좀을 선택적으로 정제하는 것이 여전히 필요하다.
표적을 선택적으로 정제하는 친화성 정제 능력의 인정된 능력을 감안할 때 현대 생물 공정의 엄격함을 충족하는 친화성 제제에 대한 필요성이 존재한다. 면역친화성, 즉 친화성 리간드로서 항체의 사용을 통해 엑소좀 정제에 필요한 선택성이 증명되었다(문헌 Kowal 등 2016). 항체는 엑소좀의 특징인 표면 마커인 테트라스파닌, CD9, CD63 및 CD81에 선택적으로 결합한다. 그러나 항체는 생물공정에 부적절하고/하거나 살균 및 세척제와 호환될 수 있는 충분한 안정성이 부족하다. 따라서, 생물 공정에 적합한 친화성 제제에 대한 필요성이 존재한다.
엑소좀에 결합하고 단리 및/또는 친화성 정제에 유용한 친화성 제제가 본원에 기재된다.
일부 구현예에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 추가로 포함하는 고리형 펩티드를 포함하는 친화성 제제가 본원에 제공된다.
서열 번호 1: X1YWRB1VWFPHAQGB2VX2 X2
여기서 X1은 H 또는 N을 나타내고, X2는 S 또는 T를 나타내고, B1 및 B2는 이를 통해 펩티드가 고리화되는 단위를 나타낸다.
일부 구현예에서, 친화성 제제는 표 5에 나타낸 적어도 하나의 아미노산 서열, 예컨대 서열 번호 2-126 중 임의의 하나를 포함하는 리간드를 포함한다.
일부 구현예에서, CD81에 결합하는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 리간드를 포함하는 친화성 제제가 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 엑소좀에 결합하는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 리간드를 포함하는 친화성 제제가 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열, 또는 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 치환, 첨가 또는 결실에 의해 달라지는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 리간드를 포함하는 친화성 제제가 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 복수의 친화성 리간드를 포함하는 친화성 제제가 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 엑소좀 정제에 사용되는 친화성 제제가 본원에 제공된다.
정의
본 개시가 더 용이하게 이해되도록, 소정의 용어가 하기에 정의된다. 본원에서 달리 정의되지 않는 한, 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
대략 또는 약: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대략" 또는 "약"은 하나 이상의 목적 값에 적용되는 것으로서 언급된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 구현예에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 언급되거나 또는 문맥상 달리 명백하지 않는 한 언급된 참조 값의 어느 방향으로든(초과 또는 미만)에서 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 이하 내에 속하는 값의 범위를 지칭한다(이러한 수가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우는 제외).
생물학적 활성: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생물학적 활성"은 생물학적 시스템, 특히 유기체에서 활성을 갖는 임의의 제제의 특성을 의미한다. 예를 들어, 유기체에 투여될 때, 이 유기체에 생물학적 효과를 갖는 제제는 생물학적으로 활성인 것으로 간주된다.
보존성 및 비보존성 치환: "보존성" 아미노산 치환은 한 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 염기성 측쇄[예컨대, 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H)]; 산성 측쇄[예컨대, 아스파르트산(D), 글루탐산(E)]; 비하전 극성 측쇄[예컨대, 글리신(G), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 티로신(Y), 시스테인(C)]; 비극성 측쇄[예컨대, 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 이소류신(I), 프롤린(P), 페닐알라닌(F), 메티오닌(M), 트립토판(W)]; 베타-분지된 측쇄[예컨대, 트레오닌(T), 발린(V), 이소류신(I)]; 및 방향족 측쇄[예컨대, 티로신(Y), 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 히스티딘(H)]를 비롯한, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당업계에서 정의되어 있다. 예컨대, 티로신에 대한 페닐알라닌의 치환은 보존성 치환이다. 일부 구현예에서, 리간드의 서열에서 보존성 아미노산 치환은 목적 표적에 대한 리간드의 특이적 결합을 부여하거나 개선시킨다. 일부 구현예에서, 리간드의 서열에서 보존성 아미노산 치환은 목적 표적에 대한 리간드의 결합을 감소시키거나 폐기하지 않는다. 일부 구현예에서, 보존성 아미노산 치환은 목적 표적에 대한 리간드의 특이적 결합에 유의미하게 영향을 미치지 않는다. 선택적 결합 친화성을 부여, 변경 또는 유지하는 뉴클레오티드 및 아미노산 보존성 치환 및 비보존성 치환을 확인하는 방법은 당업계에 공지되어 있다[예를 들어, 문헌 Brummell, Biochem. 32:1180-1187(1993); Kobayashi, Protein Eng. 12(10):879-884(1999); 및 Burks, PNAS 94:412-417(1997) 참조]. 일부 구현예에서, 리간드의 서열에서 비보존성 아미노산 치환은 목적 표적에 대한 리간드의 특이적 결합을 부여하거나 개선시킨다. 일부 구현예에서, 리간드의 서열에서 비보존성 아미노산 치환은 목적 표적에 대한 리간드의 결합을 감소시키거나 폐기하지 않는다. 일부 구현예에서, 비보존성 아미노산 치환은 목적 표적에 대한 리간드의 특이적 결합에 유의미하게 영향을 미치지 않는다.
링커: 본원에서 사용되는 "링커"는 달리 독립적인 기능적 도메인을 연결하는 기능을 하는 펩티드 또는 기타 화학적 연결을 의미한다. 일부 구현예에서, 링커는 리간드와 달리 독립적인 기능적 도메인을 함유하는 또 다른 폴리펩티드 구성 요소 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, 링커는 펩티드 또는 리간드 및 표면 사이에 위치한 기타 화학적 결합이다.
자연 발생: 핵산 분자, 폴리펩티드 및 숙주 세포와 같은 생물학적 물질과 관련하여 사용되는 용어 "자연 발생"은 자연에서 발견되고 인간에 의해 변형되지 않은 것을 의미한다. 반대로, 생물학적 물질과 관련하여 사용되는 "비천연" 또는 "합성"은 자연에서 발견되지 않고/거나 인간에 의해 변형된 것을 의미한다.
"비천연 아미노산", "아미노산 유사체" 및 "비표준 아미노산 잔기"는 본원에서 상호 교환 가능하게 사용된다. 본원에 제공된 바와 같은 리간드에서 치환될 수 있는 비천연 아미노산은 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 프롤린으로 치환될 수 있는 4-히드록시프롤린; 리신으로 치환될 수 있는 5-히드록시리신; 히스티딘으로 치환될 수 있는 3-메틸히스티딘; 세린으로 치환될 수 있는 호모세린; 및 리신으로 치환될 수 있는 오르니틴이다. 폴리펩티드 리간드에서 치환될 수 있는 비천연 아미노산의 추가 예는 다음의 분자들을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다: 통상적인 아미노산의 D-이성질체, 2,4-디아미노부티르산, 알파-아미노 이소부티르산, A-아미노부티르산, Abu, 2-아미노 부티르산, 감마-Abu, 엡실론-Ahx, 6-아미노 헥산산, Aib, 2-아미노 이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 히드록시프롤린, 사르코신, 시트룰린, 호모시트룰린, 시스테인산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 시클로헥실알라닌, 베타-알라닌, 란티오닌, 디히드로알라닌, γ-아미노 부티르산, 셀레노시스테인 및 피롤리신 플루오로-아미노산, 설계자 아미노산, 예컨대 베타-메틸아미노산, C 알파-메틸아미노산, 및 N 알파메틸아미노산.
"폴리뉴클레오티드" 및 "핵산 분자": 본원에서 상호 교환 가능하게 사용된 바와 같이 폴리뉴클레오티드와 핵산 분자는 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합성 형태, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 용어는 DNA, RNA, 상보적 DNA[complementary DNA, cDNA], 전령 RNA[messenger RNA, mRNA], 리보솜 RNA[ribosomal RNA, rRNA], 작은 머리핀 RNA[small hairpin RNA, shRNA], 작은 핵 RNA[small nuclear RNA, snRNA], 짧은 핵소체 RNA[short nucleolar RNA, snoRNA], 마이크로 RNA(microRNA, miRNA), 게놈 DNA, 합성 DNA, 합성 RNA, 및/또는 전이 RNA[transfer RNA, tRNA]를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
작동 가능하게 연결된[operably linked]: 본원에 사용된 용어 "작동 가능하게 연결된"은 2개의 분자가 각각 기능적 활성을 유지하도록 부착됨을 나타낸다. 2개의 분자는 직접적으로 부착되든 간접적으로 부착되든 "작동 가능하게 연결"되어 있다.
펩티드 태그: 본원에서 사용되는 용어 "펩티드 태그"는 생성된 융합체에 기능을 제공하기 위해 다른 단백질의 일부이거나 이 단백질에 부착된(예를 들어 유전 공학을 통해) 펩티드 서열을 의미한다. 펩티드 태그는 이것들이 융합된 단백질에 비해 보통 상대적으로 짧다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 길이가 4개 이상의 아미노산, 예컨대 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개, 20개 또는 25개 이상의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 리간드는 펩티드 태그를 포함하는 단백질이다. 본원에 제공된 바와 같은 용도를 갖는 수많은 펩티드 태그가 당업계에 공지되어 있다. 리간드 융합 단백질 또는 리간드에 의해 결합된 표적(예: 리간드 융합 단백질)의 구성 요소일 수 있는 펩티드 태그의 예에는 헤마글루티닌(HA), c-myc, 단순 헤르페스 바이러스 당단백질 D[gD], T7, GST, GFP, MBP, 스트렙(Strep)-태그, His-태그, Myc-태그, TAP-태그 및 FLAG 태그를 포함하지만 이에 제한되지 않는다(문헌 Eastman Kodak, Rochester, N.Y.). 마찬가지로, 태그 에피토프에 대한 항체는 예를 들어, 친화성 정제, 웨스턴 블롯, ELISA 분석 및 세포의 면역염색에서 융합 단백질의 검출 및 국소화를 가능하게 한다.
폴리펩티드: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 함께 연결된 아미노산의 순차적인 쇄를 의미한다. 이 용어는 임의의 길이의 아미노산 쇄를 지칭하는 데 사용되지만, 당업자는 이 용어가 긴 쇄로 제한되지 않고, 펩티드 결합을 통해서 함께 연결된 2개의 아미노산을 포함하는 최소 쇄를 지칭할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 폴리펩티드는 가공 및/또는 변형될 수 있다.
단백질: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단백질"은 별개의 단위로서 기능하는 하나 이상의 폴리펩티드를 지칭한다. 단일 폴리펩티드가 별개의 기능 단위이고, 별개의 기능 단위를 형성하기 위해서 다른 폴리펩티드와 영구적인 또는 임시적인 물리적 회합을 필요로 하지 않는 경우, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다. 별개의 기능적 단위가 서로 물리적으로 회합하는 둘 이상의 폴리펩티드를 포함하는 경우, 용어 "단백질"은 물리적으로 커플링되어 별개의 단위로서 함께 기능하는 다수의 폴리펩티드를 의미한다.
특이적으로 결합한다: 리간드와 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합하다" 또는 "선택적 친화성을 갖는다"는 리간드가 더 자주, 더 빠르게, 더 긴 기간 동안, 더 큰 친화도로, 또는 이들의 조합으로, 관련 없는 단백질을 포함하여 대체 물질보다 특정 에피토프, 단백질 또는 표적 분자에 반응하거나 회합하는 것을 의미한다. 상이한 종에서 상동성 단백질 사이의 서열 동일성 때문에, 특이적 결합은 둘 이상의 종에서 단백질 또는 표적을 인식하는 결합제를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 상이한 단백질의 폴리펩티드 서열의 특정 영역 내의 상동성 때문에, 특이적 결합은 둘 이상의 단백질 또는 표적을 인식하는 결합제를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 표적에 특이적으로 결합하는 결합제는 제2 표적에 특이적으로 결합하거나 결합하지 않을 수 있다고 이해된다. 이렇게 해서, “특이적 결합”은 배타적 결합, 즉, 단일 표적에 대한 결합을 (포함할 수는 있지만) 반드시 필요로 하지는 않는다. 따라서, 리간드 또는 친화성 제제는 특정 구현예에서 둘 이상의 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 다수의 표적은 친화성 제제상의 동일한 항원 결합 부위에 의해 결합될 수 있다.
실질적으로: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로"는 목적 특징 또는 목적 특성의 전체 또는 거의 전체 범위 또는 정도를 나타내는 정성적 조건을 지칭한다. 생물학 기술 분야의 당업자는 생물학적 및 화학적 현상이, 설령 있다고 해도, 완료되고/되거나 완전하게 진행되거나 절대적인 결과를 달성하거나 피하지 않는다는 것을 이해할 것이다. 용어 "실질적으로"는 이런 이유로, 많은 생물학적 및 화학적 현상에 내재하는 완전함의 잠재적 결여를 표현하기 위해 본원에서 사용된다.
도 1은 CD81 ELISA에 대해 획득한 전형적인 표준 곡선을 보여준다.
도 2는 실시예 6에 기재된 정제 엑소좀의 CD63 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. 각 레인에 대한 설명(왼쪽에서 오른쪽으로)은 다음과 같다: (1) 분자량 마커, (2) CD63-Fc 융합 단백질, (3) 엑소좀 표준품, 4E10 입자, (4) 엑소좀 표준품, 8E9입자, (5) 엑소좀 표준품, 3E9 입자, (6) 미정제 정제 공급 스트림, (7) 미정제 정제 공급 스트림, 10배 희석, (8) 컬럼 통과[flow through], (9) 피크 정점의 용출 분획, (10) 스트립 및 (11) 용출 풀(전체 피크).
도 3은 실시예 6에 기재된 정제 엑소좀의 크로마토그램을 보여준다.
도 4는 18시간 동안 0.1M NaOH로 처리하기 전과 후의 서열 번호 43을 포함하는 수지의 정적 결합을 비교한 것이다. 블랭크(비유도체화된) 비드가 대조군으로 포함되었다.
도 5는 서열 번호 58에 해당하는 고정화된 리간드에 대한 다양한 농도에서 Fc-CD81 융합 단백질의 결합에 대한 센서그램을 보여준다.
도 6은 Fc-CD81에 대한 여러 리간드의 결합에 대한 용량 반응 곡선을 보여준다.
도 2는 실시예 6에 기재된 정제 엑소좀의 CD63 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. 각 레인에 대한 설명(왼쪽에서 오른쪽으로)은 다음과 같다: (1) 분자량 마커, (2) CD63-Fc 융합 단백질, (3) 엑소좀 표준품, 4E10 입자, (4) 엑소좀 표준품, 8E9입자, (5) 엑소좀 표준품, 3E9 입자, (6) 미정제 정제 공급 스트림, (7) 미정제 정제 공급 스트림, 10배 희석, (8) 컬럼 통과[flow through], (9) 피크 정점의 용출 분획, (10) 스트립 및 (11) 용출 풀(전체 피크).
도 3은 실시예 6에 기재된 정제 엑소좀의 크로마토그램을 보여준다.
도 4는 18시간 동안 0.1M NaOH로 처리하기 전과 후의 서열 번호 43을 포함하는 수지의 정적 결합을 비교한 것이다. 블랭크(비유도체화된) 비드가 대조군으로 포함되었다.
도 5는 서열 번호 58에 해당하는 고정화된 리간드에 대한 다양한 농도에서 Fc-CD81 융합 단백질의 결합에 대한 센서그램을 보여준다.
도 6은 Fc-CD81에 대한 여러 리간드의 결합에 대한 용량 반응 곡선을 보여준다.
본 개시는, 그 중에서도, 확인되고 특성화된 펩티드 리간드로부터 제조된 친화성 제제가 하나 이상의 목적 표적, 예를 들어 일부 구현예에서는 바이러스 입자의 고도로 정제된 제제를 생성하는 것으로 나타났다는 인식을 포괄한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 친화성 수지는, 그 중에서도, 단백질 생성물 관련 불순물뿐만 아니라 숙주 세포 유래 오염물을 제거하는 데 유용하다.
친화성 제제에 사용하기 위한 목적 표적에 대한 리간드 결합
표적에 결합하는 리간드의 특성은 이러한 활성을 평가하기 위해 공지된 또는 변형된 분석, 생물 분석 및/또는 당업계에 공지된 동물 모델을 사용하여 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "표적에 대한 결합 친화도", "표적에 대한 결합" 등과 같은 용어는 예를 들어, 친화도 상수(예: 주어진 항원 농도에서 회합 및 해리되는 리간드의 양)의 결정을 통해 직접적으로 측정될 수 있는 리간드의 특성을 의미한다. 경쟁 분석, 평형 분석 및 미량 열량 분석, 표면 플라즈몬 공명 상호 작용에 기반한 실시간 상호 작용 분석(예: BIACORE 기기 사용)과 같이 분자 상호 작용을 특성화하는 데 몇 가지 방법을 사용할 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있으며 Neri D 등(1996) Tibtech 14:465-470 및 Jansson M 등(1997) J Biol Chem 272:8189-8197과 같은 간행물에서 논의된다.
주어진 리간드 결합 이벤트에 대한 친화성 요구 사항은 결합 매트릭스의 구성 및 복잡성, 리간드 및 표적 분자 모두의 원자가 및 밀도, 및 리간드의 기능적 적용을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 요인에 따라 달라진다. 일부 구현예에서, 리간드는 5Х10-3M, 10-3M, 5Х10-4M, 10-4M, 5Х10-5M, 또는 10-5M 이하의 해리상수[KD]로 목적 표적에 결합한다. 일부 구현예에서, 리간드는 5Х10-6M, 10-6M, 5Х10-7M,10-7M, 5Х10-8M, 또는 10-8M 이하의 KD로 목적 표적에 결합한다. 일부 구현예에서, 리간드는 5Х10-9M, 10-9M, 5Х10-10M, 10-10M, 5Х10-11M, 10-11M, 5Х10-12M, 10-12M, 5Х10-13M, 10-13M, 5Х10-14M, 10-14M, 5Х10-15M, 또는 10-15M 이하의 KD로 목적 표적에 결합한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 리간드는 약 10-4M 내지 약 10-5M, 약 10-5M 내지 약 10-6M, 약 10-6M 내지 약 10-7M, 약 10-7M 내지 약 10-8M, 약 10-8M 내지 약 10-9M, 약 10-9M 내지 약 10-10M, 약 10-10M 내지 약 10-11M, 또는 약 10-11M 내지 약 10-12M의 해리상수를 갖는다.
KD 및 해리속도[off-rate]를 결정하기 위한 결합 실험은 다양한 조건에서 수행될 수 있다. 이러한 용액을 제조하기 위한 완충액은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 최종 용액의 원하는 pH에 크게 좌우된다. 낮은 pH 용액(<pH 5.5)은 예를 들어 구연산염 완충액, 글리신-HCl 완충액 또는 숙신산 완충액에서 제조될 수 있다. 높은 pH 용액은 예를 들어 트리스-HCl, 인산염 완충액 또는 중탄산나트륨 완충액으로 제조될 수 있다. 다양한 조건이 사용되어 예를 들어 최적의 pH 및/또는 염 농도를 결정하기 위한 목적으로 KD 및 해리속도를 결정할 수 있다.
일부 구현예에서, 리간드는 0.1 내지 10-7sec-1, 10-2 내지 10-7sec-1, 또는 0.5x10-2 내지 10-7sec -1 범위의 해리속도[koff]로 목적 표적에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 리간드는 5x10-2sec-1, 10-2sec-1, 5x10-3sec-1, 또는 10-3sec-1 미만의 해리속도[koff]로 목적 표적에 결합한다. 일부 구현예에서, 리간드는 5x10-4sec-1, 10-4sec-1, 5x10-5sec-1, 또는 10-5sec-1, 5x10-6sec-1, 10-6sec-1, 5x10-7sec-1 또는 10-7sec-1 미만의 해리속도[koff]로 목적 표적에 결합한다.
일부 구현예에서, 리간드는 약 103 내지 107M-1sec-1, 103 내지106M-1sec-1, 또는 103 내지 105M-1sec-1 범위의 결합속도[kon]로 목적 표적에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 리간드(예: 리간드 융합 단백질)는 103M-1sec-1, 5x103M-1sec-1, 104M-1sec-1 또는 5x104M-1sec-1 초과의 결합속도[kon]로 목적 표적에 결합한다. 추가 구현예에서, 리간드는 105M-1sec-1, 5x105M-1sec-1, 106M-1sec-1, 5x106M-1sec-1 또는 107M-1sec-1 초과의 결합속도[kon]로 목적 표적에 결합한다.
목적 표적
다양한 구현예에 따르면, 리간드에 의해 특이적으로 결합된 목적 표적은 이것이 친화성 제제의 리간드가 결합하는 것이 바람직한 임의의 분자일 수 있다. 예를 들어, 리간드에 의해 특이적으로 결합된 표적은 정제, 제조, 제형화, 치료, 진단 또는 예후적 관련성 또는 가치의 임의의 표적일 수 있다. 비제한적인 용도는 치료 및 진단 용도를 포함한다. 다수의 예시적인 표적이 예로서 본원에 제공되며, 이는 예시를 위한 것이지 제한하려는 것이 아니다. 목적 표적은 자연적으로 발생하거나 합성될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적은 AAV2 및/또는 AAV2로부터 유래된 변이체이다.
링커
용어 "링커" 및 "스페이서"는 본원에서 상호 교환 가능하게 사용되며, 달리 독립적인 기능적 도메인을 연결하는 기능을 하는 펩티드 또는 다른 화학적 연결을 의미한다. 일부 구현예에서, 링커는 리간드와 달리 독립적인 기능적 도메인을 함유하는 또 다른 폴리펩티드 구성 요소 사이에 위치한다. 2개 이상의 연결된 리간드를 커플링하는 데 적합한 링커는 일반적으로 펩티드, 단백질 또는 다른 유기 분자를 연결하기 위해 당업계에서 사용되는 임의의 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 링커는 약학적 용도로 의도된 단백질 또는 폴리펩티드를 구성하는 데 적합하다.
단일 쇄 아미노산 서열에서 리간드 융합 단백질의 추가 구성 요소와 리간드를 작동 가능하게 연결하기 위해 적합한 링커는 폴리펩티드 링커, 예컨대 글리신 링커, 세린 링커, 혼합 글리신/세린 링커, 글리신이 풍부한 및 세린이 풍부한 링커 또는 주로 극성 폴리펩티드 단편으로 구성된 링커를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 링커는 글리신, 알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민 및 리신에서 선택된 다수의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 글리신, 알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 아스파르트산, 트레오닌, 글루타민 및 리신에서 선택된 다수의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 리간드 링커는 다수의 비입체 장애 아미노산으로 제조된다. 일부 구현예에서, 링커는 글리신, 세린 및/또는 알라닌에서 선택되는 다수의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 폴리글리신[예컨대, (Gly)5, 및 (Gly)8, 폴리(Gly-Ala), 및 폴리알라닌으로부터 선택된다.
링커는 리간드가 목적 표적에 결합하도록 허용하는 방식으로 리간드를 작동 가능하게 연결할 수 있는 한 임의의 크기 또는 조성물일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 약 1 내지 50개의 아미노산, 약 1 내지 20개의 아미노산, 약 1 내지 15개의 아미노산, 약 1 내지 10개의 아미노산, 약 1 내지 5개의 아미노산, 약 2 내지 20개의 아미노산, 약 2 내지 15개의 아미노산, 약 2 내지 10개의 아미노산, 또는 약 2 내지 5개의 아미노산이다. 링커(들)의 길이, 유연성 정도 및/또는 기타 특성이 친화성 제제에 사용하기 위한 리간드의 특정 특성, 예를 들어, 목적 표적에 대한, 또는 하나 이상의 다른 목적 표적 단백질에 대한, 또는 목적 단백질이 아닌 단백질(즉, 비표적 단백질)에 대한 친화성, 특이성 또는 결합력[avidity]에 영향을 미칠 수 있다는 것이 분명해야 한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 링커가 이용된다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 링커는 동일하다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 링커는 상이하다.
일부 구현예에서, 링커는 알킬 링커 또는 PEG 링커와 같은 비펩티드 링커이다. 예를 들어, s=2-20인 -NH-(CH2)s-C(O)-와 같은 알킬 링커가 이용될 수 있다. 이들 알킬 링커는 저가 알킬(예: C1 C6) 저가 아실, 할로겐(예: Cl, Br), CN, NH2, 페닐 등과 같은 임의의 비입체 장애 그룹에 의해 추가로 치환될 수 있다. 예시적인 비-펩티드 링커는 PEG 링커이다. 일부 구현예에서, PEG 링커는 약 100 내지 5000kDa, 또는 약 100 내지 500kDa의 분자량을 갖는다.
링커는 본원에 기재된 기법, 및/또는 당업계에 달리 공지된 기법을 사용하여 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 표적 분자에 결합하는 리간드의 능력을 변경하지 않는다(예를 들어, 방해하지 않는다).
접합(conjugated) 리간드를 포함하는 친화성 제제
목적 표적에 대한 특이적 결합을 촉진하는 리간드는 다양한 크로마토그래피 조성물(예: 비드, 수지, 겔, 멤브레인, 모놀리스 등)과 화학적으로 접합되어 친화성 제제를 제조할 수 있다. 리간드를 포함하는 친화성 제제는 정제 및 제조 적용에 특히 유용하다.
일부 구현예에서, 리간드(예: 리간드 융합 단백질)는 적어도 하나의 반응성 잔기를 포함하거나 함유한다. 반응성 잔기는 예를 들어 화학요법 약물과 같은 접합체의 부착을 위한 부위로서 유용하다. 예시적인 반응성 아미노산 잔기는 리신이다. 반응성 잔기(예: 리신)는 말단에서 또는 리간드 서열 내에서 리간드에 첨가될 수 있고/있거나 리간드 서열에서 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 적합한 반응성 잔기(예를 들어, 리신 등)는 또한 첨가 또는 치환을 필요로 하지 않고 확인된 리간드의 서열 내에 위치할 수 있다. 예시적인 반응성 아미노산 잔기는 시스테인이다.
고형 표면에 부착
"고형 표면", "지지체", 또는 "매트릭스"는 본원에서 상호 교환 가능하게 사용되며, 리간드, 친화성 제제, 항체, 또는 다른 단백질이 직접적으로 또는 간접적으로(예를 들어, 다른 항체 또는 단백질 A와 같은 다른 결합 파트너 중간체를 통해) 부착(즉, 커플링, 연결 또는 접착)될 수 있거나 (예를 들어, 수용체 또는 채널을 통하여) 리간드 또는 항체가 매립될 수 있는 임의의 컬럼(또는 컬럼 재료), 비드, 시험관, 미량적정 디쉬, 고형 입자(예를 들어, 아가로스 또는 세파로스), 마이크로칩[예를 들어, 실리콘(silicon), 실리콘 유리, 또는 금 칩] 또는 멤브레인[합성(예를 들어, 필터) 또는 생물학적(예를 들어, 리포좀 또는 소포) 기원]을 의미하며, 이에 제한되지 않는다. 폴리펩티드를 고형 지지체(예: 매트릭스, 수지, 플라스틱 등)에 부착하기 위한 시약 및 기법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 적합한 고형 지지체에는 다음의 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 크로마토그래피 수지 또는 매트릭스(예: 세파로스-4 FF 아가로스 비드), 플라스틱 미량적정 접시 웰의 벽 또는 바닥, 실리카-기반 바이오칩, 폴리아크릴아미드, 아가로스, 실리카, 니트로셀룰로스, 종이, 플라스틱, 나일론, 금속 및 이들의 조합. 리간드 및 기타 조성물은 당업계에 공지된 시약 및 기법을 사용하여 비공유적 회합 또는 공유적 결합에 의해 지지체 물질에 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, 리간드는 링커를 사용하여 크로마토그래피 물질에 커플링된다.
리간드 생산
제공된 방법의 여러 구현예를 실시하는데 유용한 리간드의 생산은 당업계에 공지된 화학 합성, 반-합성 방법 및 재조합 DNA 방법을 위한 다양한 표준 기법을 사용하여 수행될 수 있다. 또한 가용성 제제 및 세포 회합 단백질로서 리간드를 개별적으로 또는 다중-도메인 융합 단백질의 일부로서 생산하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 리간드에 대한 전반적인 생산 계획은 기준 단백질 스캐폴드를 얻는 것과 변형을 위한 스캐폴드 내의 복수의 잔기를 확인하는 것을 포함한다. 구현예에 따라, 기준 스캐폴드는 하나 이상의 알파-나선 영역 또는 다른 3차 구조를 갖는 단백질 구조를 포함할 수 있다. 일단 확인되면, 예를 들어 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해 다수의 잔기 중 임의의 잔기를 변형시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 보존성 치환이 이루어진다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 비보존성 치환이 이루어진다. 일부 구현예에서, 천연 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 또는 발린 중 하나)은 기준 스캐폴드에서 변형을 목표로 하는 위치에서 치환된다. 일부 구현예에서, 변형은 시스테인 또는 프롤린으로의 치환을 포함하지 않는다. 특정 구현예에서 원하는 확인된 위치에서 변형이 이루어진 후, 생성된 변형된 폴리펩티드(예: 후보 리간드)는 예를 들어 플라스미드, 박테리아, 파지 또는 기타 벡터에서 (예: 변형된 폴리펩티드들 각각의 수를 증가시키기 위해) 재조합적으로 발현될 수 있다. 이어서, 변형된 폴리펩티드를 정제하고 스크리닝하여 특정 목적 표적에 특이적 결합을 갖는 변형된 폴리펩티드를 식별할 수 있다. 변형된 폴리펩티드는 기준 스캐폴드와 비교하여 목적 표적에 대한 향상된 결합 특이성을 나타낼 수 있거나 주어진 목적 표적(또는 비표적 단백질)에 대해 전혀 또는 거의 결합하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 목적 표적에 따라, 기준 스캐폴드는 목적 표적과 약간의 상호작용(예를 들면, 비특이적 상호작용)을 보일 수 있는 한편, 특정 변형된 폴리펩티드들은 목적 표적에 대해 적어도 약 2 배, 적어도 약 5 배, 적어도 약 10 배, 적어도 약 20 배, 적어도 약 50 배, 또는 적어도 약 100 배(또는 그 이상) 증가된 결합 특이성을 나타낼 수 있다. 리간드의 생산, 선택 및 단리에 관한 추가 세부 사항은 아래에서 자세히 제공된다.
리간드의 재조합 발현
일부 구현예에서, 리간드 이를 테면, 리간드 융합 단백질은 "재조합적으로 생산된다"(즉, 재조합 DNA 기술을 이용하여 생산된다). 리간드(예: 리간드 융합 단백질)를 합성하는 데 이용 가능한 예시적인 재조합 방법에는 중합효소 연쇄 반응[polymerase chain reaction, PCR] 기반 합성, 콘카테머화(concatemerization), 심리스(seamless) 클로닝 및 반복적 방향성 결찰[recursive directional ligation, RDL]이 포함되나, 이에 제한되지 않는다[예를 들면, 문헌 Meyer 등, Biomacromolecules 3:357-367(2002), Kurihara 등, Biotechnol. Lett. 27:665-670(2005), Haider 등, Mol. Pharm. 2:139-150(2005); 및 McMillan 등, Macromolecules 32(11):3643-3646 (1999) 참조].
리간드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산도 제공된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 조절 요소를 임의로 더 포함한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 발현 조절 요소로서 하나 이상의 프로모터 또는 전사 인핸서, 리보솜 결합 부위, 전사 종결 신호 및 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 적합한 벡터 내에 삽입될 수 있고, 이 백터는 발현을 위해 임의의 적합한 숙주 세포 내 함유될 수 있다.
리간드를 암호화하는 핵산의 발현은 리간드를 암호화하는 핵산을 발현 벡터의 프로모터에 작동 가능하게 연결함으로써 전형적으로 이루어진다. 전형적인 발현 벡터는 원하는 핵산 서열의 발현 조절에 유용한 전사 및 번역 종결자, 개시 서열 및 프로모터를 함유한다. 대장균에서 발현에 유용한 예시적인 프로모터에는, 예를 들어, T7 프로모터가 포함된다.
당업계에 공지된 방법을 사용하여 적절한 전사/번역 조절 신호와 함께 리간드를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이들 방법은 생체 외 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체 내 재조합/유전자 재조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오티드의 발현은 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포 또는 포유동물 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 적합한 발현 숙주에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 서열이 숙주 내에서 리간드로 전사 및/또는 번역되도록 리간드를 암호화하는 핵산 서열은 적합한 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된다.
리간드를 암호화하는 핵산을 발현하기 위해 다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 이용될 수 있다. 리간드(예: 개별 리간드 하위단위 또는 리간드 융합체)를 암호화하는 핵산을 함유하는 벡터 또는 이의 일부 또는 단편에는 플라스미드 벡터, 단일 가닥 및 이중 가닥 파지 벡터 및 단일 가닥 및 이중 가닥 RNA 또는 DNA 바이러스 벡터가 포함된다. 파지 벡터 및 바이러스 벡터는 또한 감염 및 형질도입을 위한 공지된 기법을 사용하여 패키징된 또는 캡슐화된 바이러스 형태로 숙주 세포에 도입될 수 있다. 더욱이, 바이러스 벡터는 복제 능력이 있거나 또는 그렇지 않으면 복제 결함이 있을 수 있다. 그렇지 않으면, 무세포 번역 시스템은 또한 DNA 발현 작제물로부터 유래된 RNA를 사용하여 단백질을 생산하는데 사용될 수 있다(예를 들어, WO86/05807 및 WO89/01036; 및 미국 특허 번호 제5,122,464호 참조).
일반적으로, 임의의 유형의 세포 또는 배양 세포주가 본원에 제공된 리간드를 발현하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서 조작된 숙주 세포를 생성하는 데 사용되는 배경 세포주는 파지, 박테리아 세포, 효모 세포 또는 포유동물 세포이다. 다양한 숙주-발현 벡터 시스템을 이용하여 리간드 또는 리간드 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 발현시킬 수 있다. 포유동물 세포는 목적 표적을 암호화하는 핵산 서열 및 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나 함유하는 재조합 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포 시스템으로 사용될 수 있다. 세포는 유기체, 배양물, 또는 형질전환 또는 이식유전자적 성질의 세포주로부터의 1차 단리물일 수 있다.
적합한 숙주 세포에는 미생물, 이를 테면, 리간드 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아[예를 들면, 대장균, B. 서브틸리스(B. subtilis)]; 리간드 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모[예를 들면, 사카로미세스(Saccharomyces), 피치아(Pichia)]; 리간드 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들면, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터[예를 들면, 콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus, CaMV); 타바코 모자이크 바이러스(tobacco mosaic virus, TMV)]에 감염된, 또는 리간드 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들면, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
리간드 생산에 있어서 숙주 세포로서 유용한 원핵생물에는 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 이를 테면, 대장균 및 B. 서브틸리스가 포함된다. 원핵 숙주 세포에서 사용하기 위한 발현 벡터는 일반적으로 하나 이상의 표현형 선별 마커 유전자(예를 들어, 항생제 저항성을 부여하거나 독립영양 요건을 제공하는 단백질을 암호화하는 유전자)를 함유한다. 유용한 원핵 숙주 발현 벡터에는 pKK223-3(Pharmacia, Uppsala, Sweden), pGEMl(Promega, Wis., USA), pET(Novagen, Wis., USA) 및 pRSET(Invitrogen, Calif., USA) 일련의 벡터들[예를 들면, 문헌 Studier, J. Mol. Biol. 219:37(1991) 및 Schoepfer, Gene 124:83(1993) 참조]이 포함된다. 원핵 숙주 세포 발현 벡터에 빈번하게 이용되는 예시적인 프로모터 서열에는 T7[Rosenberg 등, Gene 56:125-135(1987)], 베타-락타마제(페니실리나제), 락토즈 프로모터 시스템[Chang 등, Nature 275:615(1978)]; 및 Goeddel 등, Nature 281 :544(1979)], 트립토판[trp] 프로모터 시스템[Goeddel 등, Nucl. Acids Res. 8:4057, (1980)], 및 tac 프로모터[Sambrook 등, 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.]가 포함된다.
일부 구현예에서, 리간드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 세포를 포함하는, 진핵 숙주 세포 시스템이 이용된다. 본 발명의 조성물을 생산하기 위해 이용될 수 있는 예시적인 효모에는 사카로미세스(Saccharomyces), 피치아(Pichia), 악티노미세테스(Actinomycetes) 및 클루베로미세스(Kluyveromyces) 속의 효모들이 포함된다. 효모 벡터는 2mu 효모 플라스미드로부터의 복제 기원 서열, 자가 복제 서열[Autonomously replicating sequence, ARS], 프로모터 영역, 폴리아데닐화를 위한 서열, 전사 종료를 위한 서열, 및 선별 마커 유전자를 전형적으로 함유한다. 효모 발현 작제물에서 프로모터 서열의 예는 메탈로티오네인, 3-포스포글리세레이트 키나제[문헌 Hitzeman, J. Biol. Chem. 255:2073(1980)] 및 다른 당분해 효소, 예컨대 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다. 효모 발현 및 효모 형질전환 프로토콜에 사용하기 위한 적합한 추가 벡터 및 프로모터는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌 Fleer, Gene 107:285-195(1991) 및 Hinnen, PNAS 75:1929(1978)을 참조한다.
곤충 및 식물 숙주 세포 배양 시스템은 또한 본원에 기재된 리간드를 생산하는 데 유용하다. 이러한 숙주 세포 시스템에는 미국 특허 번호 제6,815,184호; 미국 공개 번호 제60/365,769호, 및 제60/368,047호; 및 WO2004/057002, WO2004/024927 및 WO2003/078614에서 교시된 발현 시스템을 포함하나 이에 제한되지 않는, 예를 들어, 리간드를 암호화하는 핵산 서열을 함유하거나 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터[예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV); 타바코 모자이크 바이러스(TMV)]에 감염된, 또는 리간드를 암호화하는 핵산 서열을 함유하거나 포함하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템이 포함된다.
일부 구현예에서, 이중-미소[double-minute] 염색체에서 안정적으로 증폭된 (CHO/dhfr) 또는 안정적으로 증폭되지 않은 리간드를 암호화하는 다수의 DNA 복사체를 함유하도록 조작된 세포주(예를 들어, 쥐 세포주)를 포함하여, 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 렌티바이러스)로 감염된 동물 세포 시스템을 포함하는, 숙주 세포 시스템이 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 리간드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(들)를 함유하는 벡터는 폴리시스트론성[polycistronic]이다. 이러한 조성물 생산에 유용한 예시적인 포유동물류 세포에는 293 세포(예를 들어, 293T 및 293F), CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6(Crucell, Netherlands) 세포 VERY, Hela 세포, COS 세포, MDCK 세포, 3T3 세포, W138 세포, BT483 세포, Hs578T 세포, HTB2 세포, BT20 세포, T47D 세포, CRL7O30 세포, HsS78Bst 세포, 하이브리도마 세포, 및 기타 포유동물류 세포이 포함된다. 본 발명을 실행하는 데 유용한 추가 예시적인 포유동물류 숙주 세포는 T 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 발현 시스템 및 선택 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 다음 참고문헌 및 참고문헌에 인용된 것들을 포함한다: Borth 등, Biotechnol. Bioen. 71(4):266-73(2000), Werner 등, Arzneimittelforschung/Drug Res. 48(8):870-80(1998), Andersen 등, Curr. Op. Biotechnol. 13:117-123(2002), Chadd 등, Curr. Op, Biotechnol. 12:188-194(2001), 및 Giddings, Curr. Op. Biotechnol. 12:450-454(2001)에 인용된 것. 발현 시스템 및 선택 방법의 추가 예시는 문헌[Logan 등, PNAS 81:355-359(1984), Birtner 등 Methods Enzymol. 153:51-544(1987)]에 기재되어 있다. 포유동물류 숙주 세포 발현 벡터에 대한 전사 조절 및 번역 조절 서열은 보통 바이러스 게놈에서 유래한다. 포유동물 발현 벡터에서 통상적으로 사용되는 프로모터 서열 및 인핸서 서열은 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스 2, 유인원 바이러스 40[Simian Virus 40, SV40] 및 인간 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus, CMV)로부터 유래된 서열을 포함한다. 포유동물류 숙주 세포에서 사용하기 위한 예시적인 시판되는 발현 벡터는 pCEP4(Invitrogen) 및 pcDNA3(Invitrogen)을 포함한다.
핵산을 숙주 세포(예를 들어, 포유동물류 숙주 세포)에 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주입, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook 등(2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)]을 참조한다.
목적 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 생물학적 방법에는 DNA 벡터 및 RNA 벡터의 사용이 포함된다. 바이러스 벡터, 특히 레트로바이러스 벡터는 유전자를 포유동물류(예를 들어, 인간) 세포에 삽입하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,350,674호 및 제5,585,362호를 참조한다.
목적 DNA 및 RNA 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하는 방법에는 세포의 전기천공법이 포함되며, 이때 세포 멤브레인의 투과성을 증가시키기 위해 전기장을 세포에 적용하고, 이로써 화학물질, 약물 또는 폴리뉴클레오티드들이 세포로 유입되는 것이 가능하게 된다. 리간드 함유 DNA 또는 RNA 작제물은 전기천공법을 사용하여 포유동물류 세포 또는 원핵 세포에 도입될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포의 전기천공은 T 세포, NK 세포 및/또는 NKT 세포의 표면 상에서 리간드-CAR의 발현을 초래한다. 이러한 발현은 세포의 수명 동안 일시적이거나 안정할 수 있다. 전기천공은 MaxCyte GT® 및 STX® 형질감염 시스템(MaxCyte, Gaithersburg, MD, USA)을 포함하여 당업계에 공지된 방법으로 달성할 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 안으로 도입시키는 화학적 수단에는 콜로이드성 분산 시스템, 이를 테면, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구, 비드, 및 수중유[oil-in-water] 유탁액, 미셀, 혼합 미셀 및 리포좀을 포함하는 지질-기반 시스템이 포함된다. 시험관 내 및 생체 내 전달 비히클로 사용하기 위한 예시적인 콜로이드성 시스템은 리포좀(예를 들어, 인공 멤브레인 소포)이다. 비바이러스성 전달 시스템이 이용되는 경우, 예시적인 전달 비히클은 리포좀일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 지질 제형의 사용은 숙주 세포(시험관 내, 생체 외 또는 생체 내)에 핵산을 도입하기 위해 고려된다. 일부 구현예에서, 핵산은 지질과 회합된다. 지질과 회합된 핵산은 리포좀의 수성 내부에 캡슐화될 수 있으며, 리포좀의 지질 이중층 내에 산재되어 리포좀 및 올리고 뉴클레오티드 둘 다와 회합된 연결 분자를 통해 리포좀에 부착되어 리포좀에 포획될 수 있고, 리포좀과 복합체를 이루고, 지질을 함유하는 용액에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 결합되거나, 지질 중 현탁액으로서 함유되거나, 미셀과 함유 또는 복합체화되거나, 또는 그렇지 않으면 지질과 회합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 회합 조성물은 용액 중의 임의의 특정 구조에 제한되지 않는다. 예를 들어, 이들은 이중층 구조로, 미셀로서, 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 이들은 단순히 용액에 산재되어 있어 크기 또는 모양이 균일하지 않은 응집체를 형성할 수도 있다. 지질은 자연 발생 또는 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 장쇄 지방족 탄화수소 및 이의 유도체, 예컨대 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올 및 알데히드를 함유하는 화합물 부류뿐만 아니라 세포질에서 자연적으로 발생하는 지방 방울을 포함한다.
사용하기에 적합한 지질을 시판되는 공급원으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 디미리스티 포스파티딜콜린(dimyristyi phosphatidylcholine, "DMPC")은 Sigma, St. Louis, MO에서 얻을 수 있으며; 디세틸 포스페이트 (dicetyl phosphate, "DCP")는 K & K Laboratories(Plainview, NY)에서 얻을 수 있고; 콜레스테롤(cholesterol, "Choi")은 Calbiochem-Behring에서 얻을 수 있고; 디미리스티 포스파티딜글리세롤(dimyristyi phosphatidylglycerol, "DMPG") 및 기타 지질은 Avanti Polar Lipids, Inc.(Birmingham, AL)에서 얻을 수 있다. 클로로폼 또는 클로로폼/메탄올의 지질의 저장 용액은 약 -20℃에서 보관할 수 있다. 클로로폼은 메탄올보다 쉽게 증발하기 때문에 단독 용매로 사용할 수 있다. "리포좀"은 봉입된 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다중-박층 지질 비히클을 포괄하는 일반적인 용어다. 리포좀은 인지질 이중층 멤브레인 및 내부 수성 매질을 갖는 소포 구조를 갖는 것이 특징이 될 수 있다. 다중-박층 리포좀은 수성 매질로 분리된 여러 지질 층을 가지고 있다. 이들은 인지질이 과량의 수용액에 현탁될 때, 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 폐쇄 구조가 형성되기 전에 자가-재배열을 거쳐, 지질 이중층 사이에 물과 용해된 용질을 포획한다[문헌 Ghosh 등, Glycobiology 5:505-510(1991)]. 그러나 용액에서 정상적인 소포 구조와 다른 구조를 갖는 조성물도 포괄한다. 예를 들어, 지질은 미셀 구조로 추정될 수 있거나, 또는 단순히 지질 분자의 비균일 응집체로 존재할 수 있다. 리포펙타민-핵산 복합체 또한 고려된다.
숙주 세포 안으로 외인성 핵산을 도입하는 데 사용되는 방법과 무관하게, 숙주 세포에서 재조합 핵산 서열의 존재는 당업계에 공지된 다양한 분석을 통하여 통상적으로 확인될 수 있다. 이러한 분석에는 예를 들어, 당업계에 공지된 "분자 생물학적" 분석, 이를 테면, 서던 및 노던 블로팅, RT-PCR 및 PCR; "생화학적" 분석, 이를 테면 특정 펩티드의 존재 또는 부재를 가령, 면역학적 방법(ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의해 탐지하는 분석, 또는 제제를 식별하기 위해 본원에 기재된 분석에 의해 탐지하는 방법이 포함된다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 확인하고 조절 서열의 기능성을 평가하는 데 이용될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용자 유기체 또는 조직 또는 세포에 존재하지 않거나 발현되지 않는 유전자이며, 폴리펩티드의 발현으로 일부 쉽게 검출 가능한 특성, 예를 들어, 효소 활성이 나타나는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포에 도입된 후 적절한 시간에 분석된다. 적합한 리포터 유전자는 루시페라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리 포스파타제를 암호화하는 유전자, 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다[예컨대, 문헌 Ui-Tei 등 FEBS Lett. 479:79-82(2000)]. 적합한 발현 시스템이 당업계에 공지되어 있고, 공지된 기법을 사용하여 제조되거나 시판되는 것을 얻을 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 최대 발현 수준을 나타내는 최소 5' 측면 영역을 갖는 작제물은 프로모터로써 식별된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 통상적으로 연결될 수 있고, 프로모터-구동된 전사를 조절하는 능력에 대하여 제제를 평가하는 데 이용될 수 있다.
포유동물류 숙주-벡터 발현 시스템에는 다수의 선택 시스템이 이용될 수 있는데, 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 유전자, 히포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제[문헌 Lowy 등, Cell 22:817(1980)] 유전자를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 추가로, 항대사물질 저항성은 예를 들어 dhfr, gpt, neo, hygro, trpB, hisD, ODC(오르니틴 데카르복실라제) 및 글루타민 신타제 시스템을 선택하는 데 있어 근거로서 사용될 수 있다.
리간드 정제
일단 리간드 또는 리간드 융합 단백질이 재조합 발현에 의해 생산되었다면, 재조합 단백질의 정제를 위해 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성 및/또는 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도에 의해, 또는 단백질 정제를 위한 다른 표준 기법에 의해 정제될 수 있다. 일부 구현예에서, 리간드는 정제를 용이하게 하기 위해 본원에 구체적으로 개시되거나, 또는 당업계에 달리 공지된 이종 폴리펩티드 서열에 임의적으로 융합된다. 일부 구현예에서, 친화성 정제를 위하고/하거나 리간드 친화성 컬럼을 위한 리간드들(예: 항체들과 기타 친화성 매트릭스), 그리고 임의적으로, 이 리간드 또는 이들 리간드에 의해 결합된 리간드 융합 조성물의 다른 성분들은 당업계에 공지된 기법을 사용하여 이 리간드의 최종 제조 전, 이 조성물로부터 제거된다.
리간드의 화학적 합성
재조합 방법에 추가하여, 당업계에 공지된 다양한 액상 화학적 공정과 고형상 화학 공정을 사용하여, 원하는 폴리펩티드의 유기 화학적 합성을 사용함으로써 리간드 생산을 수행할 수도 있다. 다양한 자동 합성기가 시판 중이고 공지된 프로토콜에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Tam 등, J. Am. Chem. Soc., 105:6442(1983); Merrifield, Science, 232:341-347(1986); Barany and Merrifield, The Peptides, Gross 및 Meienhofer, eds, Academic Press, New York, 1- 284; Barany 등, Int. J. Pep. Protein Res., 30:705 739(1987); Kelley 등 in Genetic Engineering Principles and Methods, Setlow, J. K., ed. Plenum Press, NY. 1990, vol. 12, pp. 1-19; Stewart 등, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, 1989]을 참조한다. 이러한 방법론의 한 가지 장점은 비천연 아미노산 잔기가 리간드의 아미노산 서열에 통합될 수 있다는 것이다.
본 발명의 방법들에서 이용되는 리간드들은 합성 또는 번역 과정 동안 또는 그 이후, 예를 들자면, 당화, 아세틸화, 벤질화, 인산화, 아미드화, 페길화, 포르밀화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질 분해 절단, 항체 분자에 연결, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 페길화, 단백질 분해 처리, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 유비퀴틴화, 등에 의해 변형될 수 있다[예를 들어, 문헌 Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties, 2d Ed.(W.H. Freeman and Co., N.Y., 1992); Postranslational Covalent Modification of Proteins, Johnson, ed.(Academic Press, New York, 1983), pp. 1-12; Seifter, Meth. Enzymol., 182:626-646(1990); Rattan, Ann. NY Acad. Sci., 663:48-62(1992) 참조]. 일부 구현예에서, 리간드는 N-말단에서 아세틸화되거나/되고 C-말단에서 아미드화된다.
다양한 화학적 변형 중 임의의 변형은 아세틸화, 포르밀화, 등을 포함하는 공지된 기법에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 추가적으로, 유도체들은 하나 이상의 비고전적 아미노산을 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 이들 펩티드 백본의 고리화 또는 거대-고리화는 측쇄-측쇄 연결[linkage] 형성에 의해 달성된다. 이를 달성하기 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며 천연 및 비-천연 아미노산이 관련될 수 있다. 이러한 접근법에는 이황화 형성, 란티오닌 형성 또는 티올 알킬화(예: 마이클 첨가), 아미노 측쇄 및 카르복실레이트 측쇄 간 아미드화, 클릭 화학(예: 아지드 - 알킨 축합), 펩티드 스테이플링, 고리닫힘 복분해[ring closing metathesis] 및 효소 사용이 포함된다.
정제용 친화성 제제
친화성 크로마토그래피를 기반으로 하는 정제에서, 목적 표적(예: 단백질 또는 분자)은 일반적으로 크로마토그래피 매트릭스에 공유적으로 커플링된 리간드에 특이적이고 및 가역적으로 결합하는 능력에 따라 선택적으로 단리된다. 일부 구현예에서, 리간드는 재조합 공급원 또는 생물학적 샘플(예: 혈청)과 같은 천연 공급원으로부터 목적 표적의 친화성 정제를 위한 시약으로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 목적 표적에 특이적으로 결합하는 리간드는 비드에 고정된 다음 표적을 친화성 정제하는 데 사용된다.
단백질을 표면에 공유적으로 커플링시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 고형 표면에 리간드를 부착시키는 데 사용될 수 있는 펩티드 태그는 당업자에게 공지되어 있다. 또한, 리간드는 당업계에 공지된 임의의 시약 또는 기법을 사용하여 고형 표면에 부착(예: 커플링, 연결 및/또는 접착)될 수 있다. 일부 구현예에서, 고형 지지체는 비드, 유리, 슬라이드, 칩 및/또는 젤라틴을 포함한다. 따라서, 당업계에 공지된 기법에 의해, 일련의 리간드를 사용하여 고형 표면상에 어레이를 만들 수 있다. 예를 들어, 미국 공개 번호 제2004/0009530호에는 어레이 제조 방법이 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 리간드는 친화성 크로마토그래피에 의해 목적 표적을 분리하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 리간드는 고형 지지체상에 고정된다. 리간드는 본원에 기재되거나 당업계에 달리 공지된 기법 및 시약을 사용하여 고형 지지체상에 고정될 수 있다. 적합한 고형 지지체는 본원에 기재되어 있거나 당업계에 달리 공지되어 있고 특정 구현예에서 크로마토그래피 컬럼을 패킹하기에 적합하다. 고정된 리간드는 리간드와 목적 표적 사이에 복합체를 형성하기에 유리한 조건하에서 용액에 로딩되거나 용액과 접촉될 수 있다. 비결합 물질들은 씻어낼 수 있다. 적합한 세척 조건은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 적합한 세척 조건의 예는 문헌[Shukla 및 Hinckley, Biotechnol Prog. 2008 Sep-Oct;24(5):1115-21. doi: 10.1002/btpr.50]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 크로마토그래피는 리간드와 목적 표적을 함유하는 용액을 혼합한 다음, 목적 표적 및 리간드의 복합체를 단리함으로써 수행된다. 예를 들어, 리간드는 비드와 같은 고형 지지체에 고정된 다음 여과에 의해 목적 표적과 함께 용액에서 분리된다. 일부 구현예에서, 리간드는 펩티드 태그, 이를 테면, 폴리-HIS 꼬리 또는 스트렙타비딘 결합 영역을 함유하는 융합 단백질이거나 융합단백질을 포함하며, 이를 이용하여 복합체가 형성된 후, 고정된 금속 친화성 크로마토그래피 수지 또는 스트렙타비딘-피복 기판을 사용하여 리간드를 단리할 수 있다. 일단 분리되면, 목적 표적은 용출 조건하의 리간드로부터 방출되어 정제된 형태로 회수될 수 있다.
실시예
실시예 1
펩티드를 표준 Fmoc 고상 펩티드 합성 기법에 의해 합성하였고 예비 역상 HPLC로 정제하였다. 펩티드의 순도는 UV 및 사중극자 비행 시간형 질량 분석 검출[quadrupole time-of-flight mass spectrometric detection]을 모두 사용하여 RP-UPLC로 평가하였다.
실시예 2
본 실시예는 바이오층 간섭법[biolayer interferometry(ForteBio, Menlo Park, CA)]을 사용하여, CD81에 대한 비오티닐화된 리간드의 결합을 보여준다. 비오티닐화된 리간드를 센서에 고정시키고 0.01% (w/v) 소 혈청 알부민 및 pH 7.4의 0.1% (v/v) Tween-20을 함유하는 PBS에서 다양한 농도의 Fc-CD81(R&D Systems, Minneapolis, MN)을 함유하는 용액과 함께 이를 인큐베이션하였다. 블랭크 센서가 대조군으로 포함되었다. 예시적인 센서그램을 도 5에 나타내었고 예시 데이터를 도 6에 나타내었다.
실시예 3
본 실시예는 테트라스파닌 엑소좀 마커 CD9, CD63 및 CD81을 모니터링하는 데 사용되는 분석법을 설명한다. 웨스턴 블롯용 시약을 표 1에 나타내었다. 겔을 PVDF 멤브레인상에 블로팅하고 GOBlot 프로세서(Cytoskeleton, Denver, CO)로 처리하였다. 블롯은 SuperSignal™ West Pico PLUS 화학발광 기판(Thermo Scientific, Waltham, MA)로 현상하고 BioRad ChemiDoc MP 시스템(BioRad, Hercules, CA)으로 이미지화하였다.
| 표적 단백질 | 1차 항체 및 희석 | 2차 항체 및 희석 |
| CD9 | BD Pharmingen 555370 1:1000 |
BioRad 염소 항마우스 HRP 1706516 1:1000 |
| CD63 | NovusBio NBP2-42225 1:1000 |
BioRad 염소 항마우스 HRP 1706516 1:1000 |
| CD81 | Invitrogen MA5-13548 1:1000 |
BioRad 염소 항마우스 HRP 1706516 1:1000 |
또한 PS Capture™ 엑소좀 ELISA 키트(Fujifilm, Richmond, VA)를 적용하여 CD81을 분석하였다. 키트에 포함된 항-CD63 항체를 1:500으로 희석한 항-CD81 항체 MA5-13548(Invitrogen, Waltham, MA)로 대체하였다. 예시적인 표준 곡선을 도 1에 나타내었다.
실시예 4
본 실시예는 본원에서 확인하고 개시한 리간드를 포함하는 친화성 수지의 생산 및 특징분석을 보여준다. 아민화된 리간드를 아가로스 비드에 접합시켜 친화성 수지를 제조하였다. RAPID RUN 6% 아가로스 비드(ABT, Madrid, Spain) 및 Praesto® Jetted A50 비드(Purolite, King of Prussia, PA)를 디숙신이미딜 카르보네이트로 활성화하고 리간드 밀도 1-8 mg/mL 수지의 리간드와 커플링시켰다. 모든 수지의 실제 리간드 밀도는 다음 식에 따라 감산 RP-HPLC 방법을 사용하여 측정하였다.
실제 리간드 밀도 = [공급물에서 측정한 (리간드) - 유출액에서 측정한 (리간드)].
아가로스 비드에 접합된 티올화 리간드를 갖는 친화성 수지를 제조하기 위해 Praesto® Jetted A50 비드(Purolite, King of Prussia, PA)를 디숙신이미딜 카르보네이트로 활성화하고 과량의 에틸렌디아민과 결합시켰다. 세척 후, EDC 활성화를 이용하여 브로모아세테이트를 아민화 비드에 접합시켰다. 세척 후, 실온에서 리간드를 비드에 접합시켰다. 세척 후 비드를 과량의 티오글리세롤로 비활성화시켰다. 리간드 밀도는 위에서 설명한 대로 결정하였다.
실시예 5
본 실시예는 엑소좀의 친화성 포획을 위해 본원에 기재된 결합 리간드를 포함하는 친화성 제제의 결합 능력을 보여준다. 표 2에 나타난 대로 Durapore Membrane 카탈로그 번호 MSHVS4510(Millipore, Burlington MA)을 이용한 필터 플레이트 결합 실험을 수행하였다.
| 단계 | 완충액 | uL | 시간(분) | 주기 수 |
| 사전 차단 | PBS 중 1% BSA+0.002% Tween 20 | 100 | 15 | 2 |
| 수지 첨가 | 20% 에탄올에 용해된 수지 슬러리 | 5(수지) | N/A | 1 |
| 평형화 | PBS+0.002% Tween 20 | 100 | 2 | 5 |
| 샘플 로드 | PBST의 1E10 입자/mL | 100 | 60 | 1 |
| 세척 | PBS+0.002% Tween 20 | 100 | 5 | 3 |
| 용출 | 다양함 | 100 | 10 | 2 |
| 스트립 | 0.1M NaOH | 100 | 5 | 1 |
리간드를 A50 비드에 접합시켜 수지를 제조하였다. 각 수지의 리간드 밀도와 포획 효율을 표 3에 나타내었다.
| 서열 번호 | 리간드 밀도 | 평균 포획(%) |
| 28 | 9.8mg/mL | 97 |
| 28 | 7.7mg/mL | 38 |
| 43 | 11.2mg/mL | 98 |
| 43 | 7.4mg/mL | 89 |
| 블랭크 비드 | - | -2 |
실시예 6
본 실시예는 엑소좀의 친화성 정제를 위해 본원에 기재된 결합 리간드를 포함하는 친화성 제제의 용도를 보여준다. 11.2mg/mL 리간드 밀도에서 서열 번호 43에 해당하는 리간드를 포함하는 수지를 사용하여 0.18mL 유리 컬럼(3x25mm)을 패킹하고 표 4에 나타낸 대로 이를 수행하였다.
| 단계 | 완충액 | 용적(mL) | 체류 시간(분) | CV |
| 평형화 | PBS + 0.002% Tween20, pH 7.4 | 5 | 0.9 | 28 |
| 샘플 로드 | 정제된 세포 상청액 공급물 | 2 | 3.5 | 11 |
| 체이스(Chase) | PBS + 0.002% Tween20, pH 7.4 | 2 | 3.5 | 11 |
| 세척 | PBS + 0.002% Tween20, pH 7.4 | 4 | 0.9 | 23 |
| 용출 | 1M L-아르기닌, pH 9 | 4 | 0.9 | 23 |
| CIP/스트립 | 0.1M NaOH | 4 | 0.9 | 23 |
| 재평형 | PBS + 0.002% Tween20, pH 7.4 | 12 | 0.9 | 68 |
도 2에 나타낸 바와 같이 엑소좀 마커 CD63에 대해 웨스턴 블로팅으로 컬럼 작업에서의 분획물을 분석하였고, 이 크로마토그램을 도 3에 나타내었다. 웨스턴 블롯은 엑소좀을 포획하고 용출하는 데 수지가 효과적이었음을 확실하게 보여준다.
실시예 7
본 실시예는 본원에 기재된 리간드를 포함하는 친화성 제제의 수산화나트륨에 대한 안정성을 보여준다. 서열 번호 43을 포함하는 수지를 18시간 동안 0.1M NaOH와 함께 인큐베이션하고 세척한 후 실시예 5에 나타낸 정적 결합 실험을 수행하였다. 0.1M NaOH와 인큐베이션하지 않은 수지를 대조군으로 포함시켰고 도 4에서 결합 비교를 보여주고 있다. 도 4는 수지가 0.1M NaOH에 대해 안정하다는 것을 명확하게 보여준다.
위에서 개시된 대로 구현예의 구체적인 특징 및 양태의 다양한 조합 또는 하위조합을 만들 수 있고 이들이 여전히 본 발명 내에 해당할 수 있음이 고려된다. 또한, 구현예와 관련된 임의의 특정 특징, 양태, 방법, 속성, 특성, 품질, 속성, 요소 등에 대한 본원의 개시는 본원에 기술된 다른 모든 구현예에서 사용할 수 있다. 따라서, 개시된 구현예의 다양한 특징 및 양태가 서로 조합될 수 있고 서로 치환될 수 있음으로 이해해야 한다. 따라서 본원에 기재된 발명의 범위는 위에서 기재된 특정 구현예로 제한하지 않음을 의도한다. 또한, 본 발명은 여러 방식으로 쉽게 변형될 수 있고, 이의 대안적인 형태, 특정 예들은 도면에 나타내있고 본원에서 상세히 설명하고 있다. 그러나, 본 발명은 개시된 특정 형태나 방법으로 제한되지 않아야 하며, 오히려, 본 발명은 기재된 다양한 구현예의 사상과 범위 내에 있는 모든 변형, 균등물 및 대안을 다뤄야 함을 이해해야 한다.
본원에 개시된 임의의 방법은 언급된 순서대로 수행할 필요는 없다. 본원에 개시된 방법은 수행자에 의해 취해진 특정 조치를 포함하고 있지만; 이러한 작업에 대한 명시적 또는 암시에 의한 제3자 지침도 포함할 수 있다.
| 1 | X1YWRBVWFPHAQGBVX2X2 |
| 2 | HYWRCVWFPHAQGCVSTA |
| 3 | NYWRCVWFPHAQGCVSTA |
| 4 | SucYWRCVWFPHAQGCVSTA |
| 5 | YWRCVWFPHAQGCVSTA |
| 6 | 3WRCVWFPHAQGCVSTA |
| 7 | Ac-HYWRCVWFPHAQGCVSTA-아미드 |
| 8 | Ac-NYWRCVWFPHAQGCVSTA-아미드 |
| 9 | SucYWRCVWFPHAQGCVSTA-아미드 |
| 10 | Ac-YWRCVWFPHAQGCVSTA-아미드 |
| 11 | 3WRCVWFPHAQGCVSTA-아미드 |
| 12 | Ac-HYWRCVWFPHAQGCVSTA-(Peg)3K-아미드 |
| 13 | Ac-NYWRCVWFPHAQGCVSTA-(Peg)3K-아미드 |
| 14 | SucYWRCVWFPHAQGCVSTA-(Peg)3K-아미드 |
| 15 | Ac-YWRCVWFPHAQGCVSTA-(Peg)3K-아미드 |
| 16 | 3WRCVWFPHAQGCVSTA-(Peg)3K-아미드 |
| 17 | HYWR5VWFPHAQG4VSTA |
| 18 | NYWR5VWFPHAQG4VSTA |
| 19 | SucYWR5VWFPHAQG4VSTA |
| 20 | YWR5VWFPHAQG4VSTA |
| 21 | 3WR5VWFPHAQG4VSTA |
| 22 | Ac-HYWR5VWFPHAQG4VSTA-아미드 |
| 23 | Ac-NYWR5VWFPHAQG4VSTA-아미드 |
| 24 | SucYWR5VWFPHAQG4VSTA-아미드 |
| 25 | Ac-YWR5VWFPHAQG4VSTA-아미드 |
| 26 | 3WR5VWFPHAQG4VSTA-아미드 |
| 27 | Ac-HYWR5VWFPHAQG4VSTA-(Peg)3K-아미드 |
| 28 | Ac-NYWR5VWFPHAQG4VSTA-(Peg)3K-아미드 |
| 29 | SucYWR5VWFPHAQG4VSTA-(Peg)3K-아미드 |
| 30 | Ac-YWR5VWFPHAQG4VSTA-(Peg)3K-아미드 |
| 31 | 3WR5VWFPHAQG4VSTA-(Peg)3K-아미드 |
| 32 | HYWR5VWFPHAQG2VSTA |
| 33 | NYWR5VWFPHAQG2VSTA |
| 34 | SucYWR5VWFPHAQG2VSTA |
| 35 | YWR5VWFPHAQG2VSTA |
| 36 | 3WR5VWFPHAQG2VSTA |
| 37 | Ac-HYWR5VWFPHAQG2VSTA-아미드 |
| 38 | Ac-NYWR5VWFPHAQG2VSTA-아미드 |
| 39 | SucYWR5VWFPHAQG2VSTA-아미드 |
| 40 | Ac-YWR5VWFPHAQG2VSTA-아미드 |
| 41 | 3WR5VWFPHAQG2VSTA-아미드 |
| 42 | Ac-HYWR5VWFPHAQG2VSTA-(Peg)3K-아미드 |
| 43 | Ac-NYWR5VWFPHAQG2VSTA-(Peg)3K-아미드 |
| 44 | SucYWR5VWFPHAQG2VSTA-(Peg)3K-아미드 |
| 45 | Ac-YWR5VWFPHAQG2VSTA-(Peg)3K-아미드 |
| 46 | 3WR5VWFPHAQG2VSTA-(Peg)3K-아미드 |
| 47 | Ac-HYWRCVWFPHAQGCVSTA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 48 | Ac-NYWRCVWFPHAQGCVSTA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 49 | SucYWRCVWFPHAQGCVSTA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 50 | Ac-YWRCVWFPHAQGCVSTA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 51 | 3WRCVWFPHAQGCVSTA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 52 | Ac-HYWR5VWFPHAQG4VSTA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 53 | Ac-NYWR5VWFPHAQG4VSTA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 54 | SucYWR5VWFPHAQG4VSTA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 55 | Ac-YWR5VWFPHAQG4VSTA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 56 | 3WR5VWFPHAQG4VSTA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 57 | Ac-HYWR5VWFPHAQG2VSTA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 58 | Ac-NYWR5VWFPHAQG2VSTA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 59 | SucYWR5VWFPHAQG2VSTA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 60 | Ac-YWR5VWFPHAQG2VSTA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 61 | 3WR5VWFPHAQG2VSTA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 62 | Ac-HYWRCVWFPHAQGCVATA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 63 | Ac-NYWRCVWFPHAQGCVATA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 64 | SucYWRCVWFPHAQGCVATA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 65 | Ac-YWRCVWFPHAQGCVATA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 66 | 3WRCVWFPHAQGCVATA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 67 | Ac-HYWR5VWFPHAQG4VATA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 68 | Ac-NYWR5VWFPHAQG4VATA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 69 | SucYWR5VWFPHAQG4VATA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 70 | Ac-YWR5VWFPHAQG4VATA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 71 | 3WR5VWFPHAQG4VATA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 72 | Ac-HYWR5VWFPHAQG2VATA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 73 | Ac-NYWR5VWFPHAQG2VATA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 74 | SucYWR5VWFPHAQG2VATA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 75 | Ac-YWR5VWFPHAQG2VATA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 76 | 3WR5VWFPHAQG2VATA-(Peg)3K(비오틴)-아미드 |
| 77 | Ac-HYWRCVWFPHAQGCVSTAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 78 | Ac-NYWRCVWFPHAQGCVSTAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 79 | SucYWRCVWFPHAQGCVSTAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 80 | Ac-YWRCVWFPHAQGCVSTAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 81 | 3WRCVWFPHAQGCVSTAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 82 | Ac-HYWR5VWFPHAQG4VSTAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 83 | Ac-NYWR5VWFPHAQG4VSTAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 84 | SucYWR5VWFPHAQG4VSTAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 85 | Ac-YWR5VWFPHAQG4VSTAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 86 | 3WR5VWFPHAQG4VSTAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 87 | Ac-HYWR5VWFPHAQG2VSTAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 88 | Ac-NYWR5VWFPHAQG2VSTAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 89 | SucYWR5VWFPHAQG2VSTAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 90 | Ac-YWR5VWFPHAQG2VSTAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 91 | 3WR5VWFPHAQG2VSTAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 92 | Ac-HYWRCVWFPHAQGCVATAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 93 | Ac-NYWRCVWFPHAQGCVATAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 94 | SucYWRCVWFPHAQGCVATAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 95 | Ac-YWRCVWFPHAQGCVATAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 96 | 3WRCVWFPHAQGCVATAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 97 | Ac-HYWR5VWFPHAQG4VATAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 98 | Ac-NYWR5VWFPHAQG4VATAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 99 | SucYWR5VWFPHAQG4VATAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 100 | Ac-YWR5VWFPHAQG4VATAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 101 | 3WR5VWFPHAQG4VATAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 102 | Ac-HYWR5VWFPHAQG2VATAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 103 | Ac-NYWR5VWFPHAQG2VATAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 104 | SucYWR5VWFPHAQG2VATAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 105 | Ac-YWR5VWFPHAQG2VATAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 106 | 3WR5VWFPHAQG2VATAPEGGK(비오틴)-아미드 |
| 107 | HYWR5VWFPHAQG2VATA |
| 108 | NYWR5VWFPHAQG2VATA |
| 109 | SucYWR5VWFPHAQG2VATA |
| 110 | YWR5VWFPHAQG2VATA |
| 111 | 3WR5VWFPHAQG2VATA |
| 112 | Ac-HYWR5VWFPHAQG2VATA-아미드 |
| 113 | Ac-NYWR5VWFPHAQG2VATA-아미드 |
| 114 | SucYWR5VWFPHAQG2VATA-아미드 |
| 115 | Ac-YWR5VWFPHAQG2VATA-아미드 |
| 116 | 3WR5VWFPHAQG2VATA-아미드 |
| 117 | Ac-HYWR5VWFPHAQG2VATA-(Peg)3K-아미드 |
| 118 | Ac-NYWR5VWFPHAQG2VATA-(Peg)3K-아미드 |
| 119 | SucYWR5VWFPHAQG2VATA-(Peg)3K-아미드 |
| 120 | Ac-YWR5VWFPHAQG2VATA-(Peg)3K-아미드 |
| 121 | 3WR5VWFPHAQG2VATA-(Peg)3K-아미드 |
| 122 | Ac-HYWR5VWFPHAQG2VATAPEGGK-아미드 |
| 123 | Ac-NYWR5VWFPHAQG2VATAPEGGK-아미드 |
| 124 | SucYWR5VWFPHAQG2VATAPEGGK-아미드 |
| 125 | Ac-YWR5VWFPHAQG2VATAPEGGK-아미드 |
| 126 | 3WR5VWFPHAQG2VATAPEGGK-아미드 |
·
X1 = H 또는 N
·
X2 -= S 또는 T
·
Ac-는 N-말단 아세틸화를 나타낸다.
·
-아미드는 C-말단 아미드화를 나타낸다.
·
5는 카르복실 측쇄가 4로 나타나는 리신 잔기의 엡실론 아미노기, 또는 2로 나타나는 2,3-디아미노프로피온산 잔기의 베타 아미노기에 접합된 아스파르트산 잔기를 나타낸다.
·
Suc는 숙시네이트(부탄디오산)를 나타낸다.
·
3은 3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트를 나타낸다.
·
(Peg)3-는 12-아미노-4,7,10-트리옥사도데칸산 하위단위를 나타낸다.
·
시스테인 잔기는 분자 내 이황화 결합을 형성할 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> AVITIDE, INC.
<120> AFFINITY AGENTS
<130> 2011039-0048
<140> PCT/US2022/019839
<141> 2022-03-10
<150> 63/159,336
<151> 2021-03-10
<160> 128
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> H or N
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Any amino acid
<220>
<221> SITE
<222> (5)..(14)
<223> Cyclic
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(17)
<223> S or T
<400> 1
Xaa Tyr Trp Arg Xaa Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Xaa Val Xaa
1 5 10 15
Xaa
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 2
His Tyr Trp Arg Cys Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Cys Val Ser
1 5 10 15
Thr Ala
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 3
Asn Tyr Trp Arg Cys Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Cys Val Ser
1 5 10 15
Thr Ala
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> N-term Succinate
<400> 4
Tyr Trp Arg Cys Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Cys Val Ser Thr
1 5 10 15
Ala
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 5
Tyr Trp Arg Cys Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Cys Val Ser Thr
1 5 10 15
Ala
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> N-term 3-(4-hydroxyphenyl)propionate
<400> 6
Trp Arg Cys Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Cys Val Ser Thr Ala
1 5 10 15
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> N-term Acetyl
<220>
<223> C-term Amide
<400> 7
His Tyr Trp Arg Cys Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Cys Val Ser
1 5 10 15
Thr Ala
<210> 8
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> N-term Acetyl
<220>
<223> C-term Amide
<400> 8
Asn Tyr Trp Arg Cys Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Cys Val Ser
1 5 10 15
Thr Ala
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> N-term Succinate
<220>
<223> C-term Amide
<400> 9
Tyr Trp Arg Cys Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Cys Val Ser Thr
1 5 10 15
Ala
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> N-term Acetyl
<220>
<223> C-term Amide
<400> 10
Tyr Trp Arg Cys Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Cys Val Ser Thr
1 5 10 15
Ala
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> N-term 3-(4-hydroxyphenyl)propionate
<220>
<223> C-term Amide
<400> 11
Trp Arg Cys Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Cys Val Ser Thr Ala
1 5 10 15
<210> 12
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> N-term Acetyl
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> (Peg)3Lys
<220>
<223> C-term Amide
<400> 12
His Tyr Trp Arg Cys Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Cys Val Ser
1 5 10 15
Thr Ala Lys
<210> 13
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> N-term Acetyl
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> (Peg)3Lys
<220>
<223> C-term Amide
<400> 13
Asn Tyr Trp Arg Cys Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Cys Val Ser
1 5 10 15
Thr Ala Lys
<210> 14
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> N-term Succinate
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> (Peg)3Lys
<220>
<223> C-term Amide
<400> 14
Tyr Trp Arg Cys Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Cys Val Ser Thr
1 5 10 15
Ala Lys
<210> 15
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> N-term Acetyl
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> (Peg)3Lys
<220>
<223> C-term Amide
<400> 15
Tyr Trp Arg Cys Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Cys Val Ser Thr
1 5 10 15
Ala Lys
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> N-term 3-(4-hydroxyphenyl)propionate
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> (Peg)3Lys
<220>
<223> C-term Amide
<400> 16
Trp Arg Cys Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Cys Val Ser Thr Ala
1 5 10 15
Lys
<210> 17
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> SITE
<222> (5)..(14)
<223> Cyclic
<400> 17
His Tyr Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Lys Val Ser
1 5 10 15
Thr Ala
<210> 18
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> SITE
<222> (5)..(14)
<223> Cyclic
<400> 18
Asn Tyr Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Lys Val Ser
1 5 10 15
Thr Ala
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> N-term Succinate
<220>
<221> SITE
<222> (4)..(13)
<223> Cyclic
<400> 19
Tyr Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Lys Val Ser Thr
1 5 10 15
Ala
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> SITE
<222> (4)..(13)
<223> Cyclic
<400> 20
Tyr Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Lys Val Ser Thr
1 5 10 15
Ala
<210> 21
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> N-term 3-(4-hydroxyphenyl)propionate
<220>
<221> SITE
<222> (3)..(12)
<223> Cyclic
<400> 21
Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Lys Val Ser Thr Ala
1 5 10 15
<210> 22
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> N-term Acetyl
<220>
<221> SITE
<222> (5)..(14)
<223> Cyclic
<220>
<223> C-term Amide
<400> 22
His Tyr Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Lys Val Ser
1 5 10 15
Thr Ala
<210> 23
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> N-term Acetyl
<220>
<221> SITE
<222> (5)..(14)
<223> Cyclic
<220>
<223> C-term Amide
<400> 23
Asn Tyr Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Lys Val Ser
1 5 10 15
Thr Ala
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> N-term Succinate
<220>
<221> SITE
<222> (4)..(13)
<223> Cyclic
<220>
<223> C-term Amide
<400> 24
Tyr Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Lys Val Ser Thr
1 5 10 15
Ala
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> N-term Acetyl
<220>
<221> SITE
<222> (4)..(13)
<223> Cyclic
<220>
<223> C-term Amide
<400> 25
Tyr Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Lys Val Ser Thr
1 5 10 15
Ala
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> N-term 3-(4-hydroxyphenyl)propionate
<220>
<221> SITE
<222> (3)..(12)
<223> Cyclic
<220>
<223> C-term Amide
<400> 26
Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Lys Val Ser Thr Ala
1 5 10 15
<210> 27
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> N-term Acetyl
<220>
<221> SITE
<222> (5)..(14)
<223> Cyclic
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> (Peg)3Lys
<220>
<223> C-term Amide
<400> 27
His Tyr Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Lys Val Ser
1 5 10 15
Thr Ala Lys
<210> 28
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> N-term Acetyl
<220>
<221> SITE
<222> (5)..(14)
<223> Cyclic
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> (Peg)3Lys
<220>
<223> C-term Amide
<400> 28
Asn Tyr Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Lys Val Ser
1 5 10 15
Thr Ala Lys
<210> 29
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> N-term Succinate
<220>
<221> SITE
<222> (4)..(13)
<223> Cyclic
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> (Peg)3Lys
<220>
<223> C-term Amide
<400> 29
Tyr Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Lys Val Ser Thr
1 5 10 15
Ala Lys
<210> 30
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> N-term Acetyl
<220>
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1 5 10 15
Ala Pro Glu Gly Gly Lys
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Pro Glu Gly Gly Lys
20
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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1 5 10 15
Thr Ala
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Tyr Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Xaa Val Ala Thr
1 5 10 15
Ala
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<211> 17
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<400> 110
Tyr Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Xaa Val Ala Thr
1 5 10 15
Ala
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> N-term 3-(4-hydroxyphenyl)propionate
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<223> 2,3-diaminopropionic acid
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Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Xaa Val Ala Thr Ala
1 5 10 15
<210> 112
<211> 18
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His Tyr Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Xaa Val Ala
1 5 10 15
Thr Ala
<210> 113
<211> 18
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> N-term Acetyl
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<222> (14)..(14)
<223> 2,3-diaminopropionic acid
<220>
<223> C-term Amide
<400> 113
Asn Tyr Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Xaa Val Ala
1 5 10 15
Thr Ala
<210> 114
<211> 17
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<400> 114
Tyr Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Xaa Val Ala Thr
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Ala
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Tyr Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Xaa Val Ala Thr
1 5 10 15
Ala
<210> 116
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<213> Artificial Sequence
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<223> N-term 3-(4-hydroxyphenyl)propionate
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<220>
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<220>
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1 5 10 15
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<211> 19
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<220>
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<220>
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<223> (Peg)3Lys
<220>
<223> C-term Amide
<400> 118
Asn Tyr Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Xaa Val Ala
1 5 10 15
Thr Ala Lys
<210> 119
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<220>
<223> N-term Succinate
<220>
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<220>
<221> MOD_RES
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<223> 2,3-diaminopropionic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> (Peg)3Lys
<220>
<223> C-term Amide
<400> 119
Tyr Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Xaa Val Ala Thr
1 5 10 15
Ala Lys
<210> 120
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> N-term Acetyl
<220>
<221> SITE
<222> (4)..(13)
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<220>
<221> MOD_RES
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<223> 2,3-diaminopropionic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
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<220>
<223> C-term Amide
<400> 120
Tyr Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Xaa Val Ala Thr
1 5 10 15
Ala Lys
<210> 121
<211> 17
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> N-term 3-(4-hydroxyphenyl)propionate
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<221> SITE
<222> (3)..(12)
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<220>
<221> MOD_RES
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<223> (Peg)3Lys
<220>
<223> C-term Amide
<400> 121
Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Xaa Val Ala Thr Ala
1 5 10 15
Lys
<210> 122
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> N-term Acetyl
<220>
<221> SITE
<222> (5)..(14)
<223> Cyclic
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<222> (14)..(14)
<223> 2,3-diaminopropionic acid
<220>
<223> C-term Amide
<400> 122
His Tyr Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Xaa Val Ala
1 5 10 15
Thr Ala Pro Glu Gly Gly Lys
20
<210> 123
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> N-term Acetyl
<220>
<221> SITE
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<223> Cyclic
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<222> (14)..(14)
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<220>
<223> C-term Amide
<400> 123
Asn Tyr Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Xaa Val Ala
1 5 10 15
Thr Ala Pro Glu Gly Gly Lys
20
<210> 124
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<220>
<223> N-term Succinate
<220>
<221> SITE
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<220>
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<222> (13)..(13)
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<400> 124
Tyr Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Xaa Val Ala Thr
1 5 10 15
Ala Pro Glu Gly Gly Lys
20
<210> 125
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
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<220>
<221> SITE
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<400> 125
Tyr Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Xaa Val Ala Thr
1 5 10 15
Ala Pro Glu Gly Gly Lys
20
<210> 126
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> N-term 3-(4-hydroxyphenyl)propionate
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<221> SITE
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<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 2,3-diaminopropionic acid
<220>
<223> C-term Amide
<400> 126
Trp Arg Asp Val Trp Phe Pro His Ala Gln Gly Xaa Val Ala Thr Ala
1 5 10 15
Pro Glu Gly Gly Lys
20
<210> 127
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 127
Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 128
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 128
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
Claims (15)
- 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 고리형 펩티드를 포함하는 CD81에 결합하는 리간드를 포함하는 친화성 제제로서,
서열 번호 1: X1YWRB1VWFPHAQGB2VX2 X2,
여기서 X1은 H 또는 N을 나타내고, X2는 S 또는 T를 나타내고, B1 및 B2는 이를 통해 펩티드가 고리화되는 단위를 나타내는, 친화성 제제. - 표 5에 나타낸 적어도 하나의 아미노산 서열, 예컨대 서열 번호 2-126 중 임의의 하나를 포함하는 리간드를 포함하는 친화성 제제.
- CD81에 결합하는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 리간드를 포함하는 친화성 제제.
- 하나 이상의 엑소좀에 결합하는, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 리간드를 포함하는 친화성 제제.
- 서열 번호 1의 아미노산 서열, 또는 3개 이하의 치환, 첨가 또는 결실, 2개 이하의 치환, 첨가 또는 결실, 또는 1개 이하의 치환, 첨가 및/또는 결실에 의해 달라지는 아미노산 서열을 포함하는 리간드를 포함하는 친화성 제제.
- 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 고리형 펩티드를 포함하는 하나 이상의 엑소좀에 결합하는 리간드를 포함하는 친화성 제제로서,
서열 번호 1: X1YWRB1VWFPHAQGB2VX2 X2,
여기서 X1은 H 또는 N을 나타내고, X2는 S 또는 T를 나타내고, B1 및 B2는 이를 통해 펩티드가 고리화되는 단위를 나타내는, 친화성 제제. - 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 리간드를 포함하는 친화성 제제.
- 서열 번호 2-126 중 임의의 하나의 적어도 하나의 아미노산 서열, 또는 3개 이하의 치환, 첨가 또는 결실, 2개 이하의 치환, 첨가 또는 결실, 또는 1개 이하의 치환, 첨가 및/또는 결실에 의해 달라지는 아미노산 서열을 포함하는 리간드를 포함하는 친화성 제제.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드는 고체 표면에 부착되는, 친화성 제제.
- 제9항에 있어서, 상기 고체 표면은 수지 또는 비드인, 친화성 제제.
- 제9항에 있어서, 상기 고체 표면은 멤브레인인, 친화성 제제.
- 제9항에 있어서, 상기 고체 표면은 모놀리스인, 친화성 제제.
- 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드는 링커를 통해 상기 고체 표면에 접합되는, 친화성 제제.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 엑소좀의 정제에 사용되는 친화성 제제.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 리간드를 고체 표면에 접합시키는 단계를 포함하는 친화성 제제의 제조 방법.
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