KR20230171422A - 항-c4d 키메라 항원 수용체 조절 t 세포 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
항체 매개 거부반응(ABMR)은 ABO 혈액형 부적합(ABOi) 이식을 포함하여 성공적인 이식에 대한 주요 장애물 중 하나이다. C4d 침착은 ABMR의 마커이며 대부분의 ABOi 동종이식 조직에서도 발견된다. 본원은 ABOi 동종이식에서 ABMR을 억제하는 항-C4d CAR Treg에 대하여 설명된다. CD62L+CD4+CD25+ Treg로의 CAR의 레트로바이러스 형질도입에 의하여 제조된 항-C4d CAR Treg는 형질도입되지 않은 Treg와 유사한 정도로 Foxp3, CD25, CTLA-4, LAP 및 GITR을 발현했다. 항-C4d CAR Treg는 C4d에 대한 특이적 결합에 의해 활성화되었고 비형질도입 Treg뿐만 아니라 in vitro T 세포 증식을 억제했다. 또한, 항-C4d CAR Treg의 입양 전이(adoptive transfer)는 마우스 ABOi 심장 동종이식의 생존을 현저하게 연장시켰다(P < 0.05).
Description
[관련 출원에 대한 상호 참조]
본원은 2021년 1월 20일에 출원된 미국 임시출원 제63/139,617호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 모든 목적을 위하여 그 전체가 참조로써 포함되어 있다.
[ASCII 텍스트 파일로 제출된 "서열 목록"에 대한 참조]
본원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 염기서열 목록을 포함하고 있으며, 이에 따라 그 전체가 참조로 포함된다. 2022년 1월 19일에 생성된 상기 ASCII 사본의 이름은 107568-1292165_SL.txt이고 크기는 39,541 바이트이다.
ABO 혈액형 부적합(ABOi) 이식은 장기 이식 분야에 있어서 공여자 장기 부족이라는 심각한 문제를 극복하기 위하여 개발되었다. 그러나, 항체 매개 거부 반응(ABMR)은 성공적인 ABOi 이식의 주요 한계점이다. 리툭시맙(rituximab)을 병용한 혈장교환술 혹은 면역흡착술로 구성된 탈감작 요법과 타크로리무스(tacrolimus)와 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil)과 같은 강력한 유지 면역 억제 요법의 도래로 ABMR을 억제해 ABOi 이식의 예후를 개선할 수 있으나; 이러한 강력하고 비특이적인 면역 억제는 또한 감염성 합병증을 증가시킨다.
조절 T 세포(Treg)는 비특이적 면역 억제보다 부작용이 훨씬 적으면서 공여자-특이적 이식 면역 관용에 기여할 수 있다. 이러한 Treg의 주입은 동종 이식 거부 반응을 억제하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 항원 특이적 Treg의 수는 매우 낮고 종종 주입 후 Treg의 생존력과 활성을 잃기도 한다. 최근에는 종양 항원을 특이적으로 표적화하여 강력한 항암 효과를 나타내는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포가 개발됐다. 이와 동시에 세포 외 도메인의 항체의 단일 사슬 가변 단편(scFv)으로 구성된 CAR은 Treg에 항원 특이성을 제공하고; 세포 내 도메인의 상호 자극적 분자를 보유하여 기존 Treg의 낮은 항원 특이성, 생존력과 활성을 향상시킨 CAR Treg이 개발됐다.
보체 활성화는 종종 ABMR에 관여하며 항체-매개 보체 활성화의 부산물인 보체 C4d의 침착(deposition)은 ABMR의 진단 기준에 포함된다. 흥미롭게도, 80% 내지 90%의 ABOi 이식 사례에서 'ABMR', 혹은 추가적인 조직 손상 없이 항체 결합 및 근위 보체 연쇄반응의 후속 활성화로 정의되는 '조절(accommodation)'의 결과로 C4d 침착이 관찰된다.
종래 기술의 상기 문제점을 해결하기 위하여, 본원은 ABMR 및 동종 이식 거부 반응을 효과적으로 억제할 수 있는 조성물 및 방법이 설명되어 있다.
본원은 ABMR 및 동종 이식 거부 반응을 효과적으로 억제할 수 있는 조성물 및 방법을 기재한다. 일 측면에서, 상기 조성물은 보체 성분 4d(C4d)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 포함하도록 유전적으로 변형된 조절 T 세포(Treg)이다. 그러므로 본원에 기재된 유전적으로 변형된 조절 T 세포는 자연에 존재하지 않는다는 것이 이해될 것이다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 CAR은 C4d에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 ABP, 상기 CAR 또는 상기 scFv는 하기를 포함한다: 하기를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL):아미노산 서열 SGSSGSYG를 포함하는 경쇄 상보성 결정 부위1(LCDR1), 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 LCDR1; 아미노산 서열 YNDKRPS를 포함하는 LCDR2, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 LCDR2; 아미노산 서열 GSEDSSYVGV를 포함하는 LCDR3, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 LCDR3; 및 하기를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH): 아미노산 서열 SYALE을 포함하는 HCDR1, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 HCDR1; 아미노산 서열 GISSSGSGTNYGSAVKG를 포함하는 HCDR2, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 HCDR2; 아미노산 서열 AYGYVDAYGIDA를 포함하는 HCDR3, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 HCDR3.
일부 구현예들에 있어서, 상기 VL은
LTQPSSVSANPGGTVEITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYYNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTATLTITGVQAEDEAVYFCGSEDSSYVGVFGAGTTLTVL(SEQ ID NO: 2)에 95% 이상의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 상기 VH는
AVTLDESGGGLQTPGGTLSLVCKGSGFTFRSYALEWVRQAPGKGLEYVAGISSSGSGTNYGSAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKSAYGYVDAYGIDAWGHGTEVIVSSTS(SEQ ID NO: 4)와 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 ABP, 상기 CAR 또는 상기 scFv는 하기를 포함한다: 하기를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL): 아미노산 서열 SGGGRWYG를 포함하는 LCDR1, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 LCDR1; 아미노산 서열 HANTKRPS를 포함하는 LCDR2, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 LCDR2; 아미노산 서열 GSGDSSTDSGI를 포함하는 LCDR3, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 LCDR3; 및 하기를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH): 아미노산 서열 DRAMH를 포함하는 HCDR1, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 HCDR1; 아미노산 서열 GIYSSGRYTGYGSAVKG를 포함하는 HCDR2, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 HCDR2; 아미노산 서열 AGSIYCGYADVACIDA를 포함하는 HCDR3, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 HCDR3.
일부 구현예들에 있어서, 상기 VL은 LTQPSSVSANPGETVKITCSGGGRWYGWYQQKSPGSAPVTLIHANTKRPSNIPSRFSGSLSGSTSTLTISGVQAEDEAVYFCGSGDSSTDSGIFGAGTTLTVL(SEQ ID NO: 6)와 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 상기 VH는 AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFSFSDRAMHWVRQAPGKGLEWVAGIYSSGRYTGYGSAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKAGSIYCGYADVACIDAWGHGTEVIVSSTS(SEQ ID NO: 8)와 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 ABP, 상기 CAR 또는 상기 scFv는 하기를 포함한다: 하기를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL): 아미노산 서열 SGGGSYYG를 포함하는 LCDR1, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 LCDR1; 아미노산 서열 SNNKRPS를 포함하는 LCDR2, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 LCDR2; 아미노산 서열 GSYDSNAGI를 포함하는 LCDR3, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 LCDR3; 및 하기를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH): 아미노산 서열 SYAMG를 포함하는 HCDR1, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 HCDR1; 아미노산 서열 EISGSGTSTYYGPAVKG를 포함하는 HCDR2, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 HCDR2; 아미노산 서열 CTRGGGAGSYIDA를 포함하는 HCDR3, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 HCDR3.
본원에 기재된 임의의 구현 예에 있어서, CDR 아미노산 서열은 상기 기재된 서열에 대하여 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 구현 예에 있어서, CDR 아미노산 서열은 상기 기재된 서열에 비해 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 보존적 아미노산 치환은 마우스 또는 인간 C4d와 같은 표적 항원에 대한 ABP, scFv 또는 CAR의 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 VL은 LTQPSSVSANPGETVEITCSGGGSYYGWYQQKSPGSAPVTVIYSNNKRPSDIPSRFSGSKSGSTSTLTITGVQADDEAVYYCGSYDSNAGIFGAGTTLTVL와 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 상기 VH는 AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSYAMGWMRQAPGKGLDFVAEISGSGTSTYYGPAVKGRATISRDNGRSTVRLQLNNLRAEDTGTYFCTRGGGAGSYIDAWGHGTEVIVSSTS와 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 ABP, 상기 CAR 또는 상기 scFv는 SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:6, 또는
LTQPSSVSANPGETVEITCSGGGSYYGWYQQKSPGSAPVTVIYSNNKRPSDIPSRFSGSKSGSTSTLTITGVQADDEAVYYCGSYDSNAGIFGAGTTLTVL와 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, ABP, CAR 또는 scFv는 SEQ ID NO:4, 또는 SEQ ID NO:8, 또는
AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSYAMGWMRQAPGKGLDFVAEISGSGTSTYYGPAVKGRATISRDNGRSTVRLQLNNLRAEDTGTYFCTRGGGAGSYIDHGTEVIVSSTS와 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 scFv는 하기와 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다:
i)
LTQPSSVSANPGGTVEITCSGSSGSYG WYQQKSPGSAPVTVIYYNDKRPS DIPSRFSGSKSGSTATLTITGVQAEDEAVYFCGSEDSSYVGV FGAGTTLTVL
GQSSRSSGGGGSSGGGGS
AVTLDESGGGLQTPGGTLSLVCKGSGFTFRSYALE WVRQAPGKGLEYVAGISSSGSGTNYGSAVKG RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKSAYGYVDAYGIDA WGHGTEVIVSSTS; 또는
ii)
LTQPSSVSANPGETVKITCSGGGRWYG WYQQKSPGSAPVTLIHANTKRPS
NIPSRFSGSLSGSTSTLTISGVQAEDEAVYFCGSGDSSTDSGI
FGAGTTLTVL
GQSSRSSGGGGSSGGGGS
AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFSFSDRAMH WVRQAPGKGLEWVAGIYSSGRYTGYGSAVKG RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKAGSIYCGYADVACIDA WGHGTEVIVSST; 또는
iii) LTQPSSVSANPGETVEITCSGGGSYYGWYQQKSPGSAPVTVIYSNNKRPSDIPSRFSGSKSGSTSTLTITGVQADDEAVYYCGSYDSNAGIFGAGTTLTVL
GQSSRSSGGGGSSGGGGS
AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSYAMGWMRQAPGKGLDFVAEISGSGTSTYYGPAVKGRATISRDNGRSTVRLQLNNLRAEDTGTYFCTRGGGAGSYIDAWGHGTEVIVSSTS.
일부 구현예들에 있어서, 상기 CAR은 리더 서열을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 CAR은 인간 CD8 경첩 부위와 같은 경첩 부위를 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 경첩 부위는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 10과 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 CAR은 CD28 막 관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 CAR은 CD28 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 CAR은 CD28 막 관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 CD28 막 관통 및 세포질 도메인은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 12와 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 CAR은 CD3 제타 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 CD3 제타 세포질 도메인은 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 14와 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 CAR은 c-myc 태그를 포함한다.
또 다른 측면에 있어서, 본원에 기재된 항원 결합 단백질, CAR 또는 scFv를 암호화하는 핵산을 포함하는 조절 T 세포가 제시된다.
또 다른 측면에 있어서, 본원에 기재된 항원 결합 단백질, CAR 또는 scFv를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터이다.
또 다른 측면에 있어서, 본원에 기재된 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포가 제공된다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포 또는 세포주이다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 세포는 T 세포와 같은 면역 세포이다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 세포는 조절 T 세포이다.
또 다른 측면에 있어서, 조절 T 세포를 생산하는 방법이 기재되며, 상기 방법은 본원에 기재된 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 또는 벡터로 조절 T 세포를 형질 주입 또는 형질 도입하는 것, 및 상기 항원 결합 단백질을 발현하는 Treg를 선별하는 것을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 CAR은 C4d에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함한다.
또 다른 측면에 있어서, 면역 반응을 유도하는 in vitro 방법이 기재되며, 상기 방법은 본원에 기재된 유전적으로 변형된 조절 T 세포를 C4d 항원과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 본원에 기재된 유전적으로 변형된 조절 T 세포를 C4d 항원과 접촉시키는 단계는 면역 반응을 억제하는 세포 표면 분자 및/또는 사이토카인의 발현을 초래한다. 일부 구현예들에 있어서, C4d 항원과 접촉한 후, 상기 조절 T 세포는 CD69 발현을 상향 조절(upregulate)하고 C4d에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 발현하지 않는 대조군 조절 T 세포와 비교하여 증가된 수준의 IL-10 및 IFN-γ를 분비한다.
또 다른 측면에 있어서, T 세포 증식을 억제하는 in vitro 방법이 기재되며, 상기 방법은 본원에 기재된 유전적으로 변형된 조절 T 세포를 활성화된 효과 T 세포와 함께 배양하는 것 및 상기 효과 T 세포의 증식 감소를 측정하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에 있어서, 피험자에서 항체-매개 거부 반응(ABMR)을 억제하는 방법이 기재되며, 상기 방법은 본원에 기재된 유전적으로 변형된 조절 T 세포의 치료적 유효량을 피험자에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 피험자는 이전에 이식을 받은 적이 있다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 피험자는 동시에 이식을 받고 있다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 이식은 동종 이식이다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 동종 이식은 ABO 혈액형 부적합(ABOi) 동종 이식이다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 동종 이식은 심장 동종 이식이다.
도 1a 내지 1b. 항-C4d CAR 생산. 도 1a. 유세포 분석을 통한 마우스 C4d+ 라지(Raji) 세포에 대한 항-C4d scFv 클론(SC-8-Cκ, BF-2-Cκ) 및 대조군 scFv 클론(palivizumab-Cκ)의 결합 친화도의 측정 도 1b. 항-C4d CAR, 대조군 CAR 및 항-C4d CAR Treg의 구조. CAR, 키메라 항원 수용체; C4d, 보체 성분 4d; Cyt, 세포질 도메인; LS, 리더 서열; mC4d, 마우스 보체 성분 4d; Myc, myc-태그; scFv, 단일 사슬 가변 단편; TM, 막 관통 도메인; Treg, 조절 T 세포; VH, 중쇄 가변 영역; VL, 경쇄 가변 영역.
도 2a, 2b 및 2c. 항-C4d CAR Treg의 생성 및 표현형. 도 2a. 항-C4d CAR Treg의 생성 모식도. 분류된 CD62L+CD4+CD25+ Treg는 항-C4d CAR 또는 대조군 CAR을 포함하는 레트로바이러스로 형질 도입된 다음 IL-2 및 라파마이신의 존재 하에 항-CD3/CD28 비드에 의해 자극되었다. 도 2b. 생존력(7-AAD)과 함께 형질 도입되지 않은 (Non-transduced, NT) Treg와 비교하여 CAR Treg에서 Foxp3 및 myc의 발현을 생성 완료 후 13 일째에 유세포 분석법(flow cytometry)으로 측정하였다. 도 2c. 대조군 CAR Treg 및 NT Treg 과 비교하여 항-C4d CAR Treg에서의 Foxp3, CD25, CTLA-4, LAP 및 GITR의 발현. 약어: CAR Treg, 키메라 항원 수용체 조절 T 세포; CTLA-4, 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4; Foxp3, 포크헤드 박스 P3; GITR, 글루코코이드 유도 종양 괴사 인자 수용체 관련 단백질; IL-2, 인터루킨-2; LAP, 잠재 관련 펩타이드; NT, 비형질 도입(non-transduced).
도 3a, 3b 및 3c. C4d에 대한 특이적 결합 및 항-C4d CAR Treg의 in vitro 면역 억제능. 도 3a. C4d에 대한 항-C4d CAR Treg의 특이적 결합. 항-C4d CAR Treg 그룹(Student's t test)과 비교하여 ** P < 0.01. 도 3b. 라지(Raji) 세포에 침착된 C4d에 대해 반응한 항-C4d CAR Treg의 활성화에 의한 IL-10 및 IFN-γ의 CD69 발현 및 분비. 항-C4d CAR Treg 그룹(Student's t test)과 비교하여 ** P < 0.01. 도 3c. T 세포 증식에 대한 항-C4d CAR Treg의 in vitro 면역 억제능. T 세포 증식은 CTV-표지된 T 세포의 히스토그램으로 표시하고 분열 지수로 계산하였다. 효과 T 세포 단독과 비교하여 ** P < 0.01, NT Treg 그룹(Student's t test)과 비교하여 ## P < 0.01. 각 그룹당 N = 3. 막대 차트의 각 값은 평균과 평균의 표준 편차를 나타낸다. CAR Treg, 키메라 항원 수용체 조절 T 세포; CTV, 셀 트레이스 바이올렛(CellTrace Violet); IFN-γ, 인터페론-γ; IL-10, 인터루킨-10; MFI, 평균 형광 강도; NT, 비형질 도입; Tresp, 응답자 T 세포.
도 4a, 4b, 4c 및 4d. ABOi 심장 이식에서 동종 이식 거부 반응에 대한 항-C4d CAR Treg의 면역억제능. 도 4a. ABOi 심장 이식 및 면역 억제 요법의 전체 모식도. 감작된 C57BL6/J 마우스는 항-C4d CAR Treg, 대조군 CAR Treg 또는 NT Treg의 입양 전달(adoptive transfer) 후 하루 뒤 A-TG BALB/c 심장 이식을 받았다. 항-A IgM 및 IgG의 혈청 역가는 유세포 분석으로 측정되었다. 도 4b. ABOi 심장 이식에서 심장 동종 이식 생존율. PBS 그룹과 비교하여 * P < 0.01; 대조군 CAR Treg 그룹과 비교하여 # P < 0.01(로그 랭크 테스트, Log rank test). 도 4c. 심장 동종 이식에서 친염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6 및 IFN-γ)의 발현을 실시간 PCR로 측정하였다. 막대 차트의 각 값은 평균과 평균의 표준 편차를 나타낸다. PBS 대조군(Student's t test)과 비교하여 ** P < 0.01. 도 4d. ABOi 동종 이식 손상을 보여주는 H&E 염색 이미지(배율 ×200) 및 C4d+ ABOi 심장 동종 이식 조직(C4d, 녹색; CD45.1, 빨간색, Myc, 노란색, 파란색, DAPI)에 CD45.1+Myc+ 항-C4d CAR Tregs의 침윤을 보여주는 IF 이미지(배율 ×400)의 병합된 뷰. ABOi, ABO 혈액형 부적합; A-TG, 인간 혈액형 A 항원-트랜스제닉; CAR Treg, 키메라 항원 수용체 조절 T 세포; DAPI, 4,6-디아미디노-2-페닐인돌; H&E, 헤마톡실린 및 에오신; IF, 면역형광 염색; IL, 인터루킨; IFN-γ, 인터페론-γ; NT, 비형질 도입; PCR, 중합 효소 연쇄 반응; WT, 야생형.
도 5a는 L-세포를 포함하는 배양물에서 다클론 자극에 의한 조절 T 세포의 확장을 위한 대표적인 프로토콜을 나타낸다. 도 5b는 항-C4d CAR Treg 세포를 대조군 세포와 비교하는 생존 곡선을 나타낸다. 상기 데이터는 도 4a~4d에 설명된 대로 생성되었다.
도 6a 및 6b는 항-인간 C4d CAR 조절 T 세포(항-인간 C4d CAR-Treg)를 생성하기 위한 대표적인 프로토콜을 나타낸다. 도 6a는 인간 조절 T 세포를 분리하기 위한 대표적인 게이팅 전략을 나타낸다. 도 6b는 대조군 및 항-인간 C4d CAR로 형질 도입된 조절 T 세포에 의해 발현되는 대표적인 마커를 나타낸다.
도 7은 K562 세포를 포함하는 배양물에서 다클론성의 자극에 의해 항-인간 C4d CAR 조절 T 세포(항-인간 C4d CAR-Treg)를 생성하기 위한 대표적인 프로토콜을 나타낸다.
도 2a, 2b 및 2c. 항-C4d CAR Treg의 생성 및 표현형. 도 2a. 항-C4d CAR Treg의 생성 모식도. 분류된 CD62L+CD4+CD25+ Treg는 항-C4d CAR 또는 대조군 CAR을 포함하는 레트로바이러스로 형질 도입된 다음 IL-2 및 라파마이신의 존재 하에 항-CD3/CD28 비드에 의해 자극되었다. 도 2b. 생존력(7-AAD)과 함께 형질 도입되지 않은 (Non-transduced, NT) Treg와 비교하여 CAR Treg에서 Foxp3 및 myc의 발현을 생성 완료 후 13 일째에 유세포 분석법(flow cytometry)으로 측정하였다. 도 2c. 대조군 CAR Treg 및 NT Treg 과 비교하여 항-C4d CAR Treg에서의 Foxp3, CD25, CTLA-4, LAP 및 GITR의 발현. 약어: CAR Treg, 키메라 항원 수용체 조절 T 세포; CTLA-4, 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4; Foxp3, 포크헤드 박스 P3; GITR, 글루코코이드 유도 종양 괴사 인자 수용체 관련 단백질; IL-2, 인터루킨-2; LAP, 잠재 관련 펩타이드; NT, 비형질 도입(non-transduced).
도 3a, 3b 및 3c. C4d에 대한 특이적 결합 및 항-C4d CAR Treg의 in vitro 면역 억제능. 도 3a. C4d에 대한 항-C4d CAR Treg의 특이적 결합. 항-C4d CAR Treg 그룹(Student's t test)과 비교하여 ** P < 0.01. 도 3b. 라지(Raji) 세포에 침착된 C4d에 대해 반응한 항-C4d CAR Treg의 활성화에 의한 IL-10 및 IFN-γ의 CD69 발현 및 분비. 항-C4d CAR Treg 그룹(Student's t test)과 비교하여 ** P < 0.01. 도 3c. T 세포 증식에 대한 항-C4d CAR Treg의 in vitro 면역 억제능. T 세포 증식은 CTV-표지된 T 세포의 히스토그램으로 표시하고 분열 지수로 계산하였다. 효과 T 세포 단독과 비교하여 ** P < 0.01, NT Treg 그룹(Student's t test)과 비교하여 ## P < 0.01. 각 그룹당 N = 3. 막대 차트의 각 값은 평균과 평균의 표준 편차를 나타낸다. CAR Treg, 키메라 항원 수용체 조절 T 세포; CTV, 셀 트레이스 바이올렛(CellTrace Violet); IFN-γ, 인터페론-γ; IL-10, 인터루킨-10; MFI, 평균 형광 강도; NT, 비형질 도입; Tresp, 응답자 T 세포.
도 4a, 4b, 4c 및 4d. ABOi 심장 이식에서 동종 이식 거부 반응에 대한 항-C4d CAR Treg의 면역억제능. 도 4a. ABOi 심장 이식 및 면역 억제 요법의 전체 모식도. 감작된 C57BL6/J 마우스는 항-C4d CAR Treg, 대조군 CAR Treg 또는 NT Treg의 입양 전달(adoptive transfer) 후 하루 뒤 A-TG BALB/c 심장 이식을 받았다. 항-A IgM 및 IgG의 혈청 역가는 유세포 분석으로 측정되었다. 도 4b. ABOi 심장 이식에서 심장 동종 이식 생존율. PBS 그룹과 비교하여 * P < 0.01; 대조군 CAR Treg 그룹과 비교하여 # P < 0.01(로그 랭크 테스트, Log rank test). 도 4c. 심장 동종 이식에서 친염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6 및 IFN-γ)의 발현을 실시간 PCR로 측정하였다. 막대 차트의 각 값은 평균과 평균의 표준 편차를 나타낸다. PBS 대조군(Student's t test)과 비교하여 ** P < 0.01. 도 4d. ABOi 동종 이식 손상을 보여주는 H&E 염색 이미지(배율 ×200) 및 C4d+ ABOi 심장 동종 이식 조직(C4d, 녹색; CD45.1, 빨간색, Myc, 노란색, 파란색, DAPI)에 CD45.1+Myc+ 항-C4d CAR Tregs의 침윤을 보여주는 IF 이미지(배율 ×400)의 병합된 뷰. ABOi, ABO 혈액형 부적합; A-TG, 인간 혈액형 A 항원-트랜스제닉; CAR Treg, 키메라 항원 수용체 조절 T 세포; DAPI, 4,6-디아미디노-2-페닐인돌; H&E, 헤마톡실린 및 에오신; IF, 면역형광 염색; IL, 인터루킨; IFN-γ, 인터페론-γ; NT, 비형질 도입; PCR, 중합 효소 연쇄 반응; WT, 야생형.
도 5a는 L-세포를 포함하는 배양물에서 다클론 자극에 의한 조절 T 세포의 확장을 위한 대표적인 프로토콜을 나타낸다. 도 5b는 항-C4d CAR Treg 세포를 대조군 세포와 비교하는 생존 곡선을 나타낸다. 상기 데이터는 도 4a~4d에 설명된 대로 생성되었다.
도 6a 및 6b는 항-인간 C4d CAR 조절 T 세포(항-인간 C4d CAR-Treg)를 생성하기 위한 대표적인 프로토콜을 나타낸다. 도 6a는 인간 조절 T 세포를 분리하기 위한 대표적인 게이팅 전략을 나타낸다. 도 6b는 대조군 및 항-인간 C4d CAR로 형질 도입된 조절 T 세포에 의해 발현되는 대표적인 마커를 나타낸다.
도 7은 K562 세포를 포함하는 배양물에서 다클론성의 자극에 의해 항-인간 C4d CAR 조절 T 세포(항-인간 C4d CAR-Treg)를 생성하기 위한 대표적인 프로토콜을 나타낸다.
[명명법]
기재된 구현 예를 설명하는 맥락에서(특히 하기 청구범위의 맥락에서) 용어 "a" 및 "an" 및 "상기(the)" 및 유사한 참조 대상의 사용은 여기에 달리 명시되지 않았거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한, 단수형 및 복수형 모두를 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "포함하는", "갖는", 및 "함유하는"은 달리 명시되지 않는 한 개방형 용어(즉, "포함하지만 이에 제한되지 않음"을 의미)로 해석되어야 한다. 용어 "또는"은 기재된 대안 중 하나, 둘 다 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 값의 범위를 기재하는 것은, 본원에서 달리 나타내지 않는 한, 단지 범위의 끝점을 포함하여 범위 내에 속하는 각각의 별도의 값을 개별적으로 언급하는 약식 방법의 역할을 하기 위한 것이며, 각 개별 값은 본원에 개별적으로 기재된 것처럼 본원에 포함된다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에서 달리 나타내지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 여기에 제공된 임의의 및 모든 예 또는 예시적인 언어(예를 들어, "~와 같은")의 사용은 단지 본원의 구현 예를 더 잘 설명하기 위한 것이며 달리 청구되지 않는 한 본원의 범위를 제한하지 않는다. 본원의 어떤 언어도 청구되지 않은 요소를 본원의 실시에 필수적인 것으로 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에서 사용되는 용어 "조절 T 세포"("Treg")는 면역계에서 다른 세포의 기능을 조절하거나 억제하는 T 세포를 의미한다. 예를 들어, Treg는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 활성화, 증식 및 사이토카인 생성을 억제하고 B 세포 및 수지상 세포도 억제할 수 있다. Treg는 TGF-베타, IL-10 및 아데노신을 포함하여 억제 기능이 있는 용해성 메신저를 생성할 수 있다. Treg는 일반적으로 세포 표면 마커 CD4(T 세포 공동 수용체) 및 CD25와 전사 인자 포크헤드 박스 P3 (Forkhead box P3; FoxP3)를 발현한다. immunology.org/public-information/bitesized-immunology/cells/regulatory-t-cells-tregs 참조.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항원 결합 단백질"(ABP)은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 단백질을 지칭하고 본원에 기재된 항체, scFv 및 CAR을 포함한다. 용어 "항원 결합 도메인"은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질의 일부를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린(Ig) 분자 또는 그의 포맷 단편을 의미한다. 상기 용어는 단클론 항체와 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM 동종형 및 아형을 포함한다. 상기 용어는 또한 Fab(단편, 항원 결합), Fv(가변 도메인), scFv(가변 단일 사슬 단편), 이황화 결합 안정화 scFv(ds-scFv), 단일 사슬 Fab(scFab), 디아-, 트리아- 및 테트라-바디와 같은 이량체 및 다량체 항체 포맷, 올리고머화 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 미니바디(miniAbs), 카멜리드(camelid) 중쇄 Abs의 VHH/VH 및 단일 도메인 Abs(sdAb)와 같은 항원 결합 단편 또는 이의 포맷을 포함한다. 상기 용어는 또한 scFv-경쇄 융합 단백질 또는 scFv-Fc 융합 단백질과 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 융합 단백질을 포함한다. 상기 용어는 또한 항체 의존 세포 매개 세포 독성(ADCC, Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity) 및 보체 의존 세포 독성(CDC, Complement Dependent Cytotoxicity)과 같은 효과기(effector) 기능을 제공하는 Fc 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
용어 "인간화 (humanized)"는 인간 아미노산 서열을 포함하도록 변형된 비-인간 종으로부터의 항원 결합 단백질, 또는 그의 항원 결합 단편 또는 포맷을 지칭한다. 상기 인간화 ABP는 ABP가 인간에게 투여될 때 잠재적인 면역원성을 감소시키는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간화 ABP는 인간이 아닌 종의 상보성 결정 부위(CDR)와 인간 항체의 항체 프레임워크 또는 스캐폴드 영역을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합"은 대조군 또는 비특이적 항원 결합 단백질에 의한 결합과 비교하여 항원 결합 단백질과 그의 동족 표적 항원 사이의 결합 강도 또는 결합 친화성을 의미한다. 친화도는 단일 분자가 리간드에 결합하는 강도를 말하며 일반적으로 평형 해리 상수(KD)에 의해 결정된다. KD는 결합 속도(kon)(ABP가 항원에 결합하는 속도)에 대한 해리 속도(koff)(ABP가 항원으로부터 얼마나 빨리 해리되는지)의 비율이다. KD 값은 특정 ABP 또는 항체/항원 상호작용의 kon 및 koff 속도를 측정한 다음 상기 값의 비율을 사용하여 KD 값을 계산함으로써 결정될 수 있다. 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 일반적으로 낮은 마이크로몰(10-6) 내지 피코몰(10-12) 범위의 KD 값을 가진다. 고친화도 항체는 일반적으로 낮은 나노몰 범위(10-9)의 KD를 갖는 반면, 매우 고친화도 항체는 피코몰(10-12) 범위의 KD를 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "실질적으로 동일한"은 서열 비교 알고리즘을 사용하여 측정하거나 수동 정렬 및 육안 검사를 통해 측정한 결과, 비교 윈도우 또는 지정된 영역에 대하여 최대 상응을 위하여 비교 및 정렬되었을 때 지정된 영역에 대하여 약 30% 이상 내지 약 99.9% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 약 30 % 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98 % 이상, 약 99% 이상, 약 99.5% 이상 또는 약 99.9% 이상의 서열 동일성)을 갖는 2 개의 핵산 혹은 아미노산 서열을 의미한다. 또한, 용어 "실질적으로 동일한"은 동일성 100% 미만의 동일한 서열, 예를 들어 30%, 40%, 50% 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 아미노산 서열이 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 99.5% 이상, 또는 약 99.9% 이상의 서열 동일성을 가질 때, 2 개의 단백질(또는 단백질의 영역)은 실질적으로 동일하다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 아미노산 서열이 약 30%, 약 40%, 약 50% 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.5%, 또는 약 99.9% 서열 동일성을 가질 때, 2 개의 단백질(또는 단백질의 영역)은 실질적으로 동일하다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 아미노산 서열이 30% 초과 100% 미만의 동일성, 예를 들어 30%, 40%, 50%, 60%, 65% 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9% 서열 동일성을 가질 때 2 개의 단백질(또는 단백질의 영역)은 실질적으로 동일하다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 핵산 서열이 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 99.5% 이상, 또는 약 99.9% 이상의 서열 동일성을 가질 때 2 개의 핵산 서열은 실질적으로 동일하다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 핵산 서열이 약 30%, 약 40%, 약 50% 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.5%, 또는 약 99.9% 서열 동일성을 가질 때 2 개의 핵산 서열은 실질적으로 동일하다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 핵산 서열이 30% 초과 100% 미만의 동일성을 가질 때, 예를 들어, 30%, 40%, 50% 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9% 서열 동일성을 가질 때, 2개의 핵산 서열은 실질적으로 동일하다. 2 개의 아미노산 서열 또는 2 개의 핵산 서열의 퍼센트 동일성을 결정하기 위하여, 상기 서열은 최적의 비교 목적으로 정렬된다 (예를 들어, 최적 정렬을 위하여 첫 번째 및 두 번째 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 다에 갭이 도입될 수 있고 비-상동 서열은 비교 목적에서 무시될 수 있다). 일부 구현예들에 있어서, 비교 목적으로 정렬된 참조 서열의 길이는 참조 서열 대비 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 또는 70% 이상, 80%, 90%, 100%이다. 그 후, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 첫 번째 서열의 특정 위치 아미노산 잔기 혹은 뉴클레오티드가 두 번째 서열의 상응하는 위치의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드와 동일하다면, 상기 두 분자는 해당 위치에서 동일하다 (본원에서 사용된 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"과 동일함). 2 개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이며, 이는 2개의 서열의 최적 정렬을 위하여 도입될 필요가 있다. BLAST 컴퓨터 프로그램은 핵산과 아미노산 서열 간의 퍼센트 서열 동일성을 정렬하고 결정하는 데 사용될 수 있다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성 (예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R기)를 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변경하지 않는다. 보존적 치환에 의하여 2 개 이상의 아미노산 서열이 서로 상이한 경우, 서열 동일성 퍼센티지 또는 상동성 정도를 상향 조정하여 치환의 보존적 특성을 보정할 수 있다. 이러한 조정을 위한 수단은 본 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다 (Pearson W. R., 1994, Methods in Mol Biol 25: 365-89 참조).
하기 6 개 그룹은 각각 서로에 대하여 보존적 치환이 가능한 아미노산을 포함한다: 1) 세린(S), 트레오닌(T); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 리신(K); 5) 이소류신(I), 류신(L), 알라닌(A), 발린(V), 및 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W).
용어 "피험자"는 동물, 예를 들어 인간을 포함하나 이에 제한되지 않는 포유동물, 마우스 또는 래트와 같은 설치류, 개 또는 고양이와 같은 반려 동물 및 소, 말, 양과 같은 가축을 의미한다. 용어 피험자는 또한 용어 "환자"와 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된"은 연결된 프로모터 및/또는 조절 서열이 기능적으로 단백질 암호화 서열의 발현을 제어하도록 핵산 프로모터 및/또는 조절 서열과 단백질 암호화 서열 사이의 기능적 연결을 의미한다.
용어 "약"은 본원에 기재된 수치 또는 값의 범위를 수정할 때 본 기술분야의 정상 변이 및 실험적 오차를 포함하는 값을 포함하고, 기재된 값 또는 범위의 +/- 10%, 예를 들어 기재된 값 또는 범위의 +/- 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%을 포함할 수 있다.
용어 "상보성 결정 부위"(CDR)는 특정 항원에 결합하는 항체의 가변 영역 또는 도메인 내에 위치한 아미노산 서열을 의미한다. CDR은 'Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991); by Al-Lazikani, B.; Lesk, A. M.; Chothia, C. (1997). "Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins". Journal of Molecular Biology. 273 (4): 927-948; and North, B.; Lehmann, A.; Dunbrack Jr, R. L. (2011). "A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations". Journal of Molecular Biology. 406 (2): 228-256'에 기재되어 있다. 본 기술분야에서 잘 이해되는 바와 같이, 각 가변 영역, 즉 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)의 아미노산 서열에는 3 개의 비연속적인 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)이 있다. 상기 VL의 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 의미한다. 상기 VH의 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 의미한다.
용어 "유전적으로 변형된 조절 T 세포"는 외인성 핵산 서열 또는 외인성 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질 주입 또는 형질 도입된 Treg 세포를 의미한다. 상기 용어는 본원에 기재된 항-C4d ABP, 항-C4d scFv 또는 항-C4d CAR을 발현하는 Treg 세포를 포함한다.
[상세한 설명]
ABMR 및 동종 이식 거부 반응을 억제하는 것에 유용한 조성물, 및 조성물의 제조 및 사용 방법이 본원에 기재되어 있다. 일 측면에 있어서, 상기 조성물은 보체 성분 4d(C4d)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 조절 T 세포(Treg)를 포함한다. 상기 유전자 변형된 항-C4d Treg는 하기와 같은 예상치 못한 이점을 제공한다. 첫째, 피험자에게 투여했을 때 ABMR 및 동종 이식 거부 반응의 억제에 효과적이다. 둘째, 이들은 in vitro T 세포 증식 억제 및 형질 도입되지 않은 Treg의 증식에 효과적이다. 셋째, 항-C4d Treg의 입양 전이는 마우스 모델에서 심장 동종 이식 생존 기간을 상당히 연장시켰다. 따라서, 상기 항-C4d Treg는 ABOi 동종 이식과 관련된 거부 반응을 포함하여 ABMR을 제어하기 위한 유망한 치료제이다.
● 보체 성분 4d(C4d)에 특이적으로 결합하는 조절 T 세포(Treg).
일 측면에 있어서, 보체 성분 4d(C4d)에 특이적으로 결합할 수 있는 유전적으로 변형된 Treg가 본원에 기재되어 있다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 변형된 Treg는 C4d 또는 이의 항원 단편에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질(ABP)을 발현한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 변형된 Treg는 포유동물 C4d 또는 이의 항원 단편에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질(ABP)을 발현한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 변형된 Treg는 설치류 (예를 들어, 래트 또는 마우스) C4d 또는 이의 항원 단편에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질(ABP)을 발현한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 변형된 Treg는 인간 C4d 또는 이의 항원 단편에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질(ABP)을 발현한다. 본원에 기재된 임의의 구현예에 있어서, 상기 변형된 Treg는 C4d-인간 Fc 융합 단백질과 같은 C4d-Fc 융합 단백질에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질(ABP)을 발현한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 ABP는 항체 또는 이의 항원 결합 포맷이다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 ABP는 키메라 또는 인간화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 포맷이다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 ABP는 단일 사슬 가변 단편(scFv)이다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 ABP는 키메라 항원 수용체(CAR)이다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 CAR은 하기 요소 중 하나 이상을 포함한다: (i) C4d에 결합하는 항체(항-C4d 항체); (ii) 경첩 부위; (iii) 막 관통 도메인; (iv) 세포질 도메인; 및/또는 (v) 리더 서열, 또는 이들의 조합. 일부 구현예들에 있어서, 상기 CAR은 아미노 말단에서 시작하여 하기 순서로 요소를 포함한다: (i) 리더 서열; (ii) 항-C4d 항체; (iii) 경첩 부위; (iv) 막 관통 도메인; 및 (v) 세포질 도메인. 상기 세포질 도메인은 T 세포 활성화를 담당하는 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 구현예들에 있어서, 상기 항-C4d 항체는 C4d에 특이적으로 결합하는 scFv이다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 scFv는 인간 또는 마우스와 같은 포유동물, 또는 닭과 같은 조류로부터 유래한 중쇄 및/또는 경쇄 서열을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 항-C4d 항체 또는 항-C4d scFv는 키메라 또는 인간화 서열을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 항-C4d 항체는 키메라 또는 인간화 C4d 항체, 또는 이의 항원 결합 단편 또는 형식을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 항-C4d 항체 또는 scFv의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:6과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 항-C4d 항체 또는 scFv의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:6을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 항-C4d 항체 또는 상기 scFv의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:8과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 항-C4d 항체 또는 상기 scFv의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:8을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 항-C4d 항체 또는 항-C4d scFv는 설치류 (예를 들어, 래트 또는 마우스) 또는 인간 C4d를 포함하나 이에 제한되지 않는 포유동물 C4d, 또는 그의 항원성 단편에 결합한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 항-C4d 항체 또는 상기 항-C4d scFv는 C4d-Fc 융합 단백질에 결합한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 경첩 부위는 인간 CD8 경첩 부위다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 경첩 부위는 SEQ ID NO:10과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 경첩 부위는 SEQ ID NO:10을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 막 관통 도메인은 CD28 막 관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 막 관통 도메인은 마우스 CD28 막 관통 도메인을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 CAR은 CD28, CD27, 4-1BB 또는 OX40으로부터 선택되는 공동 자극 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 세포질 도메인은 CD28 공동 자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 세포질 도메인은 마우스 CD28 공동 자극 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 CAR은 CD28 막 관통 및/또는 CD28 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 CAR은 마우스 CD28 막 관통 및/또는 마우스 CD28 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 CD28 막 관통 및 세포질 도메인은 SEQ ID NO:12와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, CD28 상기 막 관통 및 세포질 도메인은 SEQ ID NO:12를 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 세포질 도메인은 CD3ζ(CD3zeta) 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 세포질 도메인은 인간 CD3ζ 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 인간 CD3ζ 세포질 도메인은 SEQ ID NO:22와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 인간 CD3ζ 세포질 도메인은 SEQ ID NO:22를 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 세포질 도메인은 마우스 CD3ζ 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 마우스 CD3ζ 세포질 도메인은 SEQ ID NO:14와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 마우스 CD3ζ 세포질 도메인은 SEQ ID NO:14를 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 세포질 도메인은 하나 이상의 면역-수용체-티로신-기반-활성화-모티프(ITAM) 서열을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 세포질 도메인은 CD28 공동 자극 신호전달 도메인 및 CD3ζ 세포질 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 세포질 도메인은 마우스 CD28 공동 자극 신호전달 도메인 및 인간 CD3ζ 세포질 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 세포질 도메인은 마우스 CD28 동시 자극 신호전달 도메인 및 마우스 CD3ζ 세포질 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 CAR은 CD28 세포외 도메인, CD28 막 관통 도메인 및/또는 CD28 세포질 도메인, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 CAR은 마우스 CD28 세포외 도메인, 마우스 CD28 막 관통 도메인, 및/또는 마우스 CD28 세포질 도메인, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 CAR은 SEQ ID NO: 20과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 마우스 CD28 세포외 도메인, 마우스 CD28 막 관통 도메인, 및 마우스 CD28 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 CAR은 SEQ ID NO: 20을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 CD28 세포외 도메인, CD28 막 관통 도메인, 및 CD28 세포질 도메인을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 CAR은 CD28 세포외 도메인, CD28 막 관통 도메인, CD28 세포질 도메인 및 CD3-제타 세포질 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 CAR은 마우스 CD28 세포외 도메인, 마우스 CD28 막 관통 도메인, 마우스 CD28 세포질 도메인 및/또는 마우스 CD3-제타 세포질 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 CAR은 SEQ ID NO: 24와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 마우스 CD28 세포외 도메인, 마우스 CD28 막 관통 도메인, 마우스 CD28 세포질 도메인 및 마우스 CD3-제타 세포질 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 CAR은 SEQ ID NO: 24를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 CD28 세포외 도메인, CD28 막 관통 도메인, CD28 세포질 도메인 및 CD3-제타 세포질을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 CAR은 아미노산 태그, 예컨대 CAR로 형질 주입된 세포를 분류 및 선별하는 것에 유용한 c-myc 태그를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 태그는 상기 항-C4d 항체와 상기 CAR의 경첩 부위 사이에 위치한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 태그는 SEQ ID NO:26과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 태그는 SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 CAR은 SEQ ID NO:16 또는 SEQ ID NO:18과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 CAR은 SEQ ID NO:16 또는 SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 조절 T 세포는 마커 CD62L, CD4 및 CD25를 발현한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 조절 T 세포는 항-C4d ABP 또는 CAR을 발현하고, 또한 Foxp3, CD25, CTLA-4, LAP 및 GITR을 대조군 (예를 들어, 형질 도입되지 않은) 또는 천연 조절 T 세포와 유사한 수준으로 발현한다.
● 핵산
또한, 본원에 기재된 항원 결합 단백질의 하나 이상의 성분을 암호화하는 핵산 분자 및/또는 핵산 서열이 기재된다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 핵산 분자는 본원에 기재된 CAR의 하나 이상의 성분을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예들에 있어서, 상기 핵산 분자는 (i) 리더 서열; (ii) 항-C4d 항체; (iii) 경첩 부위; (iv) 막 관통 도메인; 및/또는 (v) 세포질 도메인을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 핵산 서열은 항-C4d 항체를 암호화한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 핵산 서열은 C4d에 특이적으로 결합하는 항-C4d scFv를 암호화한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 핵산 서열은 항-C4d 항체 또는 scFv의 경쇄 가변 영역을 암호화한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 항-C4d 항체 또는 scFv의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 분자는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:5와 실질적으로 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 항-C4d 항체 또는 scFv의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 분자는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:5의 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 핵산 서열은 항-C4d 항체 또는 scFv의 중쇄 가변 영역을 암호화한다. 일부 구현예들에 있어서, 항-C4d 항체 또는 scFv의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:7과 실질적으로 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 항-C4d 항체 또는 scFv의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:7의 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 핵산 서열은 경첩 부위를 암호화한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 핵산 서열은 인간 CD8 경첩 부위를 암호화한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 경첩 부위를 암호화하는 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO:9와 실질적으로 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 경첩 부위를 암호화하는 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO:9의 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 핵산 서열은 막 관통 도메인을 암호화한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 핵산 서열은 CD28 막 관통 도메인을 암호화한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 핵산 서열은 CD28 막 관통 및 세포질 도메인을 암호화한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 핵산 서열은 마우스 CD28 막 관통 및 세포질 도메인을 암호화한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 막 관통 및 세포질 도메인을 암호화하는 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO:11과 실질적으로 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 막 관통 도메인을 암호화하는 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO:11의 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 핵산 서열은 CD28 세포외 도메인, CD28 막 관통 도메인, 및/또는 CD28 세포질 도메인, 또는 이들의 조합을 암호화한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 핵산 서열은 마우스 CD28 세포외 도메인, 마우스 CD28 막 관통 도메인, 및/또는 마우스 CD28 세포질 도메인, 또는 이들의 조합을 암호화한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 마우스 CD28 세포외 도메인, 상기 마우스 CD28 막 관통 도메인 및 상기 마우스 CD28 세포질 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:19와 실질적으로 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 마우스 CD28 세포외 도메인, 상기 마우스 CD28 막 관통 도메인 및 상기 마우스 CD28 세포질 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:19를 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 핵산 서열은 CD3ζ(CD3zeta) 세포질 도메인을 암호화한다. 일부 구현예들에 있어서, 핵산 서열은 인간 CD3ζ 세포질 도메인을 암호화한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 인간 CD3ζ 세포질 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:21과 실질적으로 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 인간 CD3ζ 세포질 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:21을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 핵산 서열은 마우스 CD3ζ 세포질 도메인을 암호화한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 마우스 CD3ζ 세포질 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:14와 실질적으로 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 마우스 CD3ζ 세포질 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:14를 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 핵산 서열은 CD28 세포외 도메인, CD28 막 관통 도메인, CD28 세포질 도메인 및 CD3-제타 세포질 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 핵산 서열은 마우스 CD28 세포외 도메인, 마우스 CD28 막 관통 도메인, 마우스 CD28 세포질 도메인 및/또는 마우스 CD3-제타 세포질 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화한다. 일부 구현예들에 있어서, 마우스 CD28 세포외 도메인, 마우스 CD28 막 관통 도메인, 마우스 CD28 세포질 도메인 및 마우스 CD3-제타 세포질 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산은 SEQ ID NO: 23와 실질적으로 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, CD28 세포외 도메인, CD28 막 관통 도메인, CD28 세포질 도메인 및 CD3-제타 세포질을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산은 SEQ ID NO: 23의 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 핵산은 CAR로 형질 주입된 세포를 분류 및 선별하는 것에 유용한 c-myc 태그와 같은 아미노산 태그를 암호화한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 태그를 암호화하는 핵산 서열은 상기 항-C4d 항체/scFv를 암호화하는 핵산 서열과 상기 CAR의 경첩 부위를 암호화하는 핵산 서열 사이에 위치한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 태그를 암호화하는 핵산은 SEQ ID NO:25와 실질적으로 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 태그를 암호화하는 핵산은 SEQ ID NO:25의 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 CAR을 암호화하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:15 또는 SEQ ID NO:17과 실질적으로 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 CAR을 암호화하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:15 또는 SEQ ID NO:17의 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 구현예에 있어서, 상기 핵산 또는 상기 아미노산 서열은 기재된 SEQ ID NO을 포함할 수 있다.
● 벡터
일 측면에 있어서, 이 공표에서는 본원에 기재된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터는 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있거나 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 일부 구현예들에 있어서, 벡터는 C4d에 결합하는 scFv를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 벡터는 scFv-Cκ 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 벡터는 본원에 기재된 항-C4d CAR의 하나 이상의 요소를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 벡터는 항-C4d 항체, 아미노산 태그, 경첩 부위, 막 관통 영역 및/또는 세포질 영역을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 벡터는 항-C4d 항체, c-myc 태그, 인간 CD8 경첩 부위, 마우스 CD28 막 관통 영역 및 세포질 영역, 및 인간 CD3ζ 세포질 영역을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 벡터는 전사 및/또는 번역 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 RNA 및/또는 단백질 발현을 조절하는 전사 및/또는 번역 조절 요소를 포함하는 발현 벡터이다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 벡터는 본원에 기재된 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 프로모터는 지속적 프로모터이다. 일부 구현예들에 있어서, 프로모터는 유도성 프로모터이다.
● 변형된 조절 T 세포를 생산하는 방법
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 변형된 Treg를 생성하는 방법이 제공된다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 방법은 본원에 기재된 핵산 또는 벡터로 조절 T 세포를 형질 주입 또는 형질 도입하는 것을 포함하며, 상기 핵산 또는 상기 벡터는 본원에 기재된 항-C4d ABP를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 핵산 또는 상기 벡터는 본원에 기재된 항-C4d scFv를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 형질 주입 또는 형질 도입 후, Treg는 핵산 서열에 의해 암호화된 항원 결합 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 항-C4d ABP를 발현하는 Treg는 항-C4d ABP의 성분에 결합하는 항체로 Treg를 염색하고 유세포 분석법 또는 형광 활성화 세포 분류(FACS, fluorescence-activated cell sorting)로 세포를 분류함으로써 선택될 수 있다. 일부 구현예들에 있어서, 항-C4d ABP를 발현하는 Treg는 c-myc 태그와 같은 아미노산 태그의 발현을 검출함으로써 선택될 수 있다.
일부 구현예들에 있어서, 변형된 Treg는 항-CD3 및 항-CD28 항체 및 사이토카인 IL-2와 함께 배양된다. 일부 구현예들에 있어서, 변형된 Treg는 항-CD3 및 항-CD28 항체, IL-2, 및 라파마이신과 함께 배양된다.
● 면역 반응을 유도하는 방법
또 다른 측면에 있어서, 면역 반응을 유도하는 방법이 기재되어 있다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 방법은 항-C4d ABP를 발현하는 조절 T 세포를 C4d 항원과 접촉시키는 것, 및 면역 반응이 생성되는지를 측정하는 것을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 방법은 in vitro 방법이고, 항-C4d ABP를 발현하는 변형된 조절 T 세포를 C4d 항원과 함께 배양하는 것을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 C4d 항원은 수용성 C4d 항원이다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 C4d 항원은 수용성 C4d 항원-인간 Fc 융합 단백질이다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 면역 반응은 항-C4d ABP를 발현하지 않는 대조군 Treg(예: 형질 도입되지 않은 Treg(NT Treg) 또는 팔리비주맙(palivizumab) scFv를 포함하는 대조군 CAR과 같이 관련 없는 ABP를 발현하는 Treg)와 비교하여 변형된 조절 T 세포에 의한 증가된(상향 조절된) CD69 발현, 증가된 IL-10 발현 또는 분비, 및/또는 증가된 IFN-γ 발현 또는 분비를 포함한다.
● T 세포 증식을 억제하는 방법
또 다른 측면에 있어서, T 세포 증식을 억제하기 위한 in vitro 방법이 제공된다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 방법은 활성화된 효과 T 세포(Teff)와 함께 항-C4d ABP를 발현하는 변형된 Treg를 배양하는 것 및 효과 T 세포의 증식 및/또는 활성화의 감소를 측정하는 것을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 효과 T 세포는 실험을 시작하기 전에 그리고 시간이 지남에 따라 세포가 활성화되고 분열할 때 딸 세포에서 염료의 희석을 모니터링하기 위해 카르복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르(CFSE)와 같은 형광 추적 염료로 표지된다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 변형된 Treg는 표적 Teff 게이트로부터 Treg 세포를 배제하고 동일한 공동 배양물로부터 Treg의 동시 변화를 모니터링하기 위하여 셀트레이스 바이올렛 염료(CellTrace Violet dye; CTV)와 같은 효과 T 세포 표지 염료와 상이한 형광 추적 염료로 표지된다. T 세포 억제 분석은 'Zappasodi, R. et al. "In vitro assays for effector T cell functions and activity of immunomodulatory antibodies." Methods in enzymology vol. 631 (2020): 43-59. doi:10.1016/bs.mie.2019.08.012.'에 기재되어 있다.
● 항체-매개 거부 반응(ABMR)을 억제하는 방법
또 다른 측면에 있어서, 항체-매개 거부 반응을 억제하기 위한 in vivo 방법이 제공된다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 방법은 항-C4d ABP를 발현하는 조절 T 세포를 이식된 장기의 거부를 감소 또는 예방하는데 유효한 양으로 장기 이식을 받은 피험자에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 유효량은 약 1 × 106 내지 약 1 × 109 개의 항-C4d CAR 발현 Treg 세포를 피험자에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 유효량은 약 1 × 106/kg 내지 약 1 × 109/kg(체중) 항-C4d CAR 발현 Treg 세포를 피험자에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 이식은 동종 이식이다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 동종 이식은 ABO 혈액형 부적합(ABOi) 동종 이식이다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 동종 이식은 심장 동종 이식이다.
일부 구현예들에 있어서, 상기 피험자는 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트), 소, 양, 말, 돼지, 개, 고양이 또는 비인간 영장류와 같은 포유동물이나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 피험자는 인간이다.
실시예
● 실시예 1
재료 및 방법
● 동물
C57BL/6J 및 CD45.1+ 동종 C57BL/6J 마우스는 잭슨 래보라토리(Jackson Laboratory) (Bar Harbor, ME, USA)에서 구입했다. 인간 혈액형 A 항원-트랜스제닉(A-TG) BALB/c 마우스는 피터 코완(Peter Cowan) (St Vincent's Hospital, University of Melbourne, Australia)과 로리 웨스트(Lori West) (University of Alberta, Canada)에 의하여 관대하게 제공되었다.
● 조합 scFv 표시 파지 라이브러리 생성 및 바이오 패닝
4 마리의 흰색 레그혼 닭을 3 개의 부스터를 사용하여 5 ㎍의 재조합 마우스 C4d-Fc로 면역했다. 면역화 후 cDNA는 이전에 설명한 대로 합성되었다. C4d-Cκ 결합 자기 비드로 4 회 바이오 패닝을 수행하였다. 출력 역가 플레이트에서 scFv 클론은 C4d-Cκ로 코팅된 마이크로타이터 플레이트(3690; Corning Life Sciences, Corning, NY, USA)를 사용한 파지 효소 면역 분석을 위하여 무작위로 선택되었다. C4d-Cκ에 대하여 반응성(A405> 2.0)인 클론은 코스모진텍(Cosmogenetech) (Seoul, Korea)의 OmpSeq 프라이머를 사용하여 시퀀싱되었다.
● scFv-Cκ 융합 단백질의 발현 및 정제
scFv-Cκ 융합 단백질을 암호화하기 위하여 pCEP4 발현 벡터가 제조되었다. 팔리비주맙(Palivizumab) scFv 또한 벡터에 대조군으로 클로닝되었다. 상기 구조체는 펙토프로 (FectoPRO) (Polyplus, Illkirch, France)를 사용하여 인간 배아 신장-293F 세포(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 형질 주입되었고 상술된 대로 친화성 크로마토그래피로 정제되었다.
● 레트로바이러스 벡터의 구축 및 형질 주입
레트로바이러스 벡터를 구축하기 위하여, 항-C4d 항체의 scFv 단편, c-myc 태그, 인간 CD8 경첩 부위, 마우스 CD28 경막 영역 및 세포질 영역 및 인간 CD3ζ 세포질 영역의 유전자를 포함하는 플라스미드가 인티그레이티드 디엔에이 테크놀로지스 (Integrated DNA Technologies) (Coralville, IA, USA)에 의해 합성되었다. 상기 CAR 구조체는 pMSCV-puro 레트로바이러스 벡터(Takara Bio, Shiga Japan)의 PGK 프로모터의 뒤쪽 서열에 클로닝되었다. 자세한 형질 주입 및 레트로바이러스 패킹 절차는 보충 방법 A.1에 설명되어 있다.
● CAR Treg 생성
분류된 CD62L+CD4+CD25+ T 세포를 다이나비즈 마우스 T-액티베이터 CD3/CD28 (DYNABEADS™ Mouse T-Activator CD3/CD28) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 및 인터루킨(IL)-2(4,000 IU, PROLEUKIN, Boehringer Ingelheim Pharma Biberach/Riss, 독일)로 하루 동안(도 2a) 자극하였다. 다음으로, 상기 세포는 연속 2 일에 걸쳐 레트로넥션(Takara Bio)을 사용하여 레트로바이러스로 형질 도입되었다. 형질 도입된 Treg는 IL-2 및 라파마이신(100 nM, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)의 존재 하에 항-CD3/CD28 다이나비즈(Dynabeads)에 의하여 2 회 동안 자극되었다. 대조군으로서, 형질 도입되지 않은 Treg(NT Treg)는 바이러스 형질 도입을 제외하고 동일한 방식으로 자극되었다.
● CAR Treg에 대한 바인딩 및 활성화 분석
C4d에 대한 CAR Treg의 결합을 평가하기 위하여, NT Treg, 대조군 CAR Treg, 또는 항-C4d CAR Treg를 C4d-인간 Fc 융합 단백질과 함께 2 시간 동안 배양한 다음, 유세포 분석을 위하여 항-인간 Fc를 첨가하였다. 활성화 분석을 위하여 C4d+ 라지(Raji) 세포를 세 그룹의 Treg와 48 시간 동안 공동 배양했다. Treg에서 CD69의 발현 및 IL-10 및 인터페론-γ(IFN-γ)의 분비는 각각 유세포 분석법 및 효소 결합 면역 흡착 분석법(Biolegend, San Diego, CA, USA)으로 측정되었다.
● In vitro 억제 분석
CTV(CELLTRACETM Violet Cell Proliferation Kit, Thermo Fisher Scientific)로 표지된 비장 CD45.1+CD4+ T 세포는 항-CD3/CD28 다이나비즈(Dynabeads)로 3 일 동안 4 대 1 비율의 CD45.2+ CAR Treg를 포함하거나 포함하지 않고 자극되었다. T 세포 증식은 분열 지수로 표현되었다.
● 심장 이식 및 면역 억제 요법
야생형 C57BL/6J 마우스는 상술된 바와 같이 인간 혈액형 A 항원에 의해 감작되었다. A-TG BALB/c 마우스의 심장은 감작된 C57BL/6J 마우스에 이식되었다. CD45.1+ NT, 대조군 CAR 또는 항-C4d CAR Treg(1 × 106)를 이식 하루 전에 수여받는 마우스로 옮겼다. 프레드니솔론 (prednisolone) (Yuhan, Seoul, Korea), 타크로리무스 (tacrolimus) (Astellas Pharma, Tokyo, Japan), 및 라파마이신 (rapamycin) (Rapamune, Pfizer Pharmaceutical Korea, Seoul, Korea)이 매일 투여되었다.
● 유세포 분석
유세포 분석에 사용되는 항체는 표 1에 설명되어 있다. 7-아미노악티노마이신 D(7-AAD; BD Biosciences, San Diego, CA, USA)를 첨가하여 죽은 세포를 염색하였다. 아튠 Nxt 플로우 사이토미터 (Attune NxT Flow Cytometer) (써모 피셔 사이언티픽 (Thermo Fisher Scientific))를 사용하여 유세포 분석이 수행되었다. 데이터는 플로우조(FlowJo) 소프트웨어(Tree Star, Ashland, OR, USA)를 사용하여 분석되었다.
● 실시간 중합효소연쇄반응
심장 동종 이식 조직에 대한 실시간 폴리머라제 연쇄 반응이 수행되었다; 사용된 해당 프라이머를 포함한 자세한 정보는 표 2 및 보충 방법 A.1에 설명되어 있다. IL-1β, IL-6, 및 IFN-γ 유전자의 mRNA 수준은 글리세르알데히드-3-인산탈수소효소(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; Gapdh)의 mRNA 수준으로 정규화되었고 인산완충생리식염수(phosphate-buffered saline; PBS) 그룹의 mRNA 수준과 비교하여 상대적 발현으로 나타내었다.
● 조직학적 분석
심장 동종 이식 조직에 대하여 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin) 염색이 수행되었다. C4d, Myc 및 CD45.1에 대하여 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, Sigma-Aldrich)로 면역형광 염색도 수행되었다. 이 분석에 사용된 항체를 포함한 자세한 정보는 A.1 보충 방법에 설명되어 있다.
● 통계 분석
데이터는 평균의 평균 ± 표준 오차로 표시되고 양측 스튜던트 t 테스트로 분석되었다. 이식편 생존(graft survival)은 로그-랭크 테스트(log-rank test)로 분석되었다. P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 모든 분석은 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) (v. 7.0; GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)을 사용하여 수행되었다.
● 결과 및 토론
닭 면역화 후 조합 scFv-디스플레이된 파지 라이브러리로부터 항-C4d 항체의 선택
바이오 패닝된 scFv 디스플레이된 파지 라이브러리를 이용한 파지 효소 면역 분석을 통하여, 여러 반응성 클론이 후보 클론으로 확인되었다. C4d 에 대하여 양호한 결합 친화도를 나타내는 2 개의 클론(SC-8, BF-2) 중 결합 활성 및 발현 수준에 기초하여 BF-2 클론이 추가 연구를 위하여 선택되었다(도 1a).
● 항-C4d CAR 레트로바이러스 벡터의 구축
항-C4d CAR을 함유하는 레트로바이러스 벡터는 항-C4d scFv를 2세대 CAR 구조 형태로 CD8, CD28 및 CD3ζ의 상이한 영역으로 클로닝함으로써 생성되었다 (도 1b). 팔리비주맙(palivizumab) scFv를 포함하는 대조군 CAR 벡터 또한 제작되었다 (도 1b).
● 항-C4d CAR Treg의 생성 및 표현형
항-C4d 및 대조군 CAR Treg는 도 2a의 프로토콜에 따라 생성되었다. 두 CAR Treg는 모두 CAR 발현(Myc+)을 발현했고 우수한 생존력(7-AAD-)과 보존된 포크헤드 박스 P3 (forkhead box P3; Foxp3) 발현을 보인 반면, NT Treg는 Myc를 발현하지 않았다(도 2b). 두 CAR Treg 모두 Foxp3, CD25, 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA-4), 잠복기 관련 펩타이드(LAP), 글루코코르티코이드 유도 종양괴사인자 수용체 관련 단백질(GITR)을 NT Treg와 비슷한 정도로 발현하여(도 2c), Treg의 면역 억제 기능 관련 분자가 항-C4d CAR Treg에서 잘 보존되었음을 시사하였다.
● C4d에 대한 특이적 결합에 의한 항-C4d CAR Treg의 활성화
수용성 C4d-인간 Fc는 항-C4d CAR Treg에 성공적으로 결합한 반면, 대조군 CAR Treg 또는 NT Treg에는 결합하지 않았다 (도 3a). 더욱이, 항-C4d CAR Treg는 C4d 결합에 반응하여 CD69 발현을 상향 조절하였고 대조군 CAR Treg 및 NT Treg 모두보다 훨씬 더 많은 IL-10 및 IFN-γ를 분비하였다 (P < 0.01, 도 3b). 이러한 데이터는 항-C4d CAR Treg가 C4d에 특이적으로 결합할 수 있고 C4d에 대한 결합에 의해 활성화됨을 나타낸다.
● 항-C4d CAR Treg의 in vitro 면역 억제능
Treg의 세 그룹 모두 T 세포 증식을 억제하였으나, 두 CAR Treg는 NT Treg보다 약간 더 강한 억제 효과를 가졌다 (P < 0.05, 도 3c). 이러한 결과는 항-C4d CAR Treg가 기능적으로 활성을 나타내는 Treg이며 Treg의 면역 억제능을 보임을 나타낸다.
● ABOi 심장 이식에서 심장 동종 이식 거부 반응에 대한 항-C4d CAR Treg의 억제능
도 4a는 ABOi 심장 이식에서 ABMR에 대한 항-C4d CAR Treg의 in vivo 면역 억제능을 나타낸다. 감작된 수여자는 이식 전에 높은 역가의 항 A IgM 및 IgG를 생성하였다 (도 4a). Anti-C4d CAR Treg는 PBS 대조군 및 대조군 CAR Treg와 비교하여 ABOi 심장 동종 이식 생존율을 상당히 연장시켰다 (P < 0.05, 도 4b). 심장 동종 이식에서 친염증성 사이토카인의 발현을 비교했을 때, 상기 항-C4d CAR Treg 그룹은 PBS 대조군보다 낮은 IL-6 발현을 보였다 (P < 0.01, 도 4c); 그러나 상기 항-C4d CAR Treg 그룹과 상기 NT Treg 그룹 간에는 차이가 없었다.
조직학적 검사는 혈관주위 염증 및 C4d 침착을 나타내었고, 이는 ABMR이 실제로 ABOi 심장 이식에서 발생했음을 나타낸다 (도 4d). 면역형광 이미지에서 C4d+ 내피 세포 주위의 CD45.1+Myc+ 항-C4d CAR Treg의 침윤이 현저하게 관찰되었다 (도 4d). 그러나 조직 손상에 대한 CAR Treg의 보호 효과는 현저하지 않은 것으로 나타났으며, 아마도 모든 조직 연구가 이식 실패 후 수득된 말단 샘플을 사용하여 수행되었기 때문일 수 있다.
● 논의
상기 제시된 데이터는 항-C4d CAR Treg가 C4d에 대한 특이적 결합에 의해 활성화되었고 T 세포의 in vitro 증식을 효과적으로 억제하였음을 입증한다. 또한, 항-C4d CAR Treg는 ABOi 심장 이식 후 ABMR을 억제하고 ABOi 심장 동종 이식 생존을 상당히 연장시켰다.
현재까지 항-HLA-A2 CAR Treg는 이식 분야에 적용되는 유일한 CAR Treg이며 동종 이식 거부 반응에 대하여 우수한 면역억제 효과를 보였다. 그러나, 공여자-특이적 HLA를 표적으로 하는 항-HLA-A2 CAR Treg는 모든 공여자-수여자 쌍을 포함할 수 없다. 대조적으로, 상기 항-C4d CAR Treg는 잘 알려진 ABMR 관련 분자인 C4d를 표적으로 하며 공여자와 수여자의 HLA 조합에 관계없이 대부분의 ABMR을 치료하는 데 사용될 수 있다. 항-C4d CAR Treg의 잠재적 한계 중 하나는 C4d-음성 ABMR을 억제하는 능력이 낮다는 것이다.
한편, 항-C4d CAR Treg는 C4d+ ABOi 동종 이식에 침윤함으로써 ABOi 이식에서 ABMR을 예방할 수 있는데, 이는 ABOi 이식의 고유한 메커니즘을 통해 ABMR이 있거나 없더라도 대부분의 ABOi 동종 이식에서 C4d 침착이 발생하기 때문이다. 이 가설과 일관되게, 본원에 제시된 데이터는 항-C4d CAR Treg가 ABOi 동종 이식 생존을 상당히 연장시켰음을 입증한다.
본원에 기재된 데이터는 ABMR 및 ABOi 이식 모두에 대하여 C4d를 표적으로 하는 새로운 유형의 조절 T 세포를 제공함으로써 이식 분야에서 CAR Treg 요법 및 동종 이식 거부 반응 제어에 기여한다. 위에서 설명한 결과는 마우스 ABOi 심장 이식 모델을 사용하여 동종 이식 거부에 대한 항-C4d CAR Treg의 표현형 및 면역억제 효과를 처음으로 입증한다.
요약하면, 본 실시예는 ABMR을 억제함으로써 ABOi 심장 동종 이식 생존을 증가시키는 항-C4d CAR Treg를 설명하고 따라서 인간 이식에서의 적용에 유망하다.
● 레트로바이러스 벡터 형질 주입 및 레트로바이러스 패키징
바이러스 외피 단백질로서 수포성 구내염 인디애나 바이러스 G 단백질(VSV-G)을 암호화하는 DNA를 함유하는 pMD2.G 플라스미드(ATCC)와 함께, 상기 레트로바이러스 구조체는 피닉스 GP (Phoenix GP) (ATCC, Manassas, VA, USA) 세포주에 형질 주입되었다. 리포펙타민 (Lipofectamine) 3000(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용한 형질 주입 48 시간 후, VSV-G 슈도 타입 (pseudo typed) 레트로바이러스를 포함하는 상등액이 수확되었고 레트로바이러스 감염을 위하여 피닉스 에코 (Phoenix Eco) (ATCC) 세포주와 직접 배양되었다.
● CAR Treg에 대한 활성화 분석
활성화 분석을 위하여 CD20+ 라지(Raji) 세포는 이전에 설명한 대로 리툭시맙(rituximab)-mIgG2a(3μg/mL)와 함께 배양되었다. 항-마우스 C5 항체(200nM, ImmunAbs, Seoul, Korea)를 5% NSG마우스 혈청(Chemon, Seoul, Korea)과 혼합 후, 혼합물을 리툭시맙-전처리된 라지 세포에 첨가하여 세포 손상 없이 라지 세포에 C4d를 침착시켰다. 다음으로, C4d+ 라지 세포를 NT Treg, 대조군 CAR Treg 또는 항-C4d CAR Treg와 함께 48 시간 동안 공동 배양했다. Treg에서의 CD69의 발현 및 인터루킨(IL)-10 및 인터페론-γ(IFN-γ)의 분비는 각각 유세포 분석법 및 효소 결합 면역 흡착 분석법에 의하여 측정되었다.
● 심장 이식 및 면역 억제 요법
야생형 C57BL/6J 마우스를 -21일 및 -14일에 인간 혈액형 A 항원에 의해 감작시켰고, 항-A IgM 및 IgG의 혈청 역가를 이전과 같이 유세포 분석법에 의해 -7일에 측정하였다. 프레드니솔론(prednisolone) (1 mg/kg/day, Yuhan, Seoul, Korea), 타크로리무스(tacrolimus) (Advagraf, 1 mg/kg/day, Astellas Pharma, Tokyo, Japan) 및 라파마이신(rapamycin) (Rapamune, 1 mg/kg/day, 한국화이자제약, Seoul, Korea)이 매일 투여되었다. 심장 동종 이식 거부의 발생은 촉진 점수가 0인 순간으로 간주하였다.
● 실시간 중합효소연쇄반응
심장 동종 이식 조직을 트리졸(Trizol) 시약 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)으로 균질화하고 RNA를 Superscript II 역전사효소를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 각 반응 혼합물은 2× SYBR 그린 PCR 마스터 믹스(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 및 10 pmol/μL의 상응하는 프라이머로 구성되었다 (표 2). 실시간 PCR 분석은 퀀트스튜디오(QuantStudio) (v.3.o; Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 수행되었다.
● 조직학적 분석
심장 동종 이식을 4% 파라포름알데하이드에 24 시간 동안 고정하고 파라핀 포매 절편(paraffin-embedded sections) (4 μm)을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 면역형광 염색을 위하여 세포막 절편(두께 4 μm)을 토끼 항마우스 C4d(1:100, polyclonal, Hycult Biotech, Plymouth Meeting, PA, USA) 및 래트 항-마우스 myc(1:200, 클론 9E10, Abcam, Cambridge, UK)로 밤새 4℃로 염색하였다. 다음으로, 상기 절편을 당나귀 항-토끼 IgG-Alexa Fluor 488 및 염소 항-래트 IgG-알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647(Thermo Fisher Scientific)과 함께 37℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 항-마우스 CD45.1-알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 594(clone ly-5.1, Biolegend, San Diego, CA, USA)는 37℃에서 2 시간 동안 배양되었고 핵 DNA는 4,6-디아미디노-2-페닐린돌 (4,6-diamidino-2-phenylindole) (DAPI, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 시각화되었다. 이미지는 라이카(Leica) TCS Sp8 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Wetzlar, Germany)로 수득하였고 LAS AF lite(Leica)를 사용하여 내보냈다.
| 항체 | 클론 | 형광 | 구입처 |
| Human C-Kappa | TB28-2 | APC | BD 바이오사이언스 |
| Human IgGFc | FITC | 써모피셔 사이언티픽 | |
| CD25 | PC61 | PE | BD 바이오사이언스 |
| CD4 | GK1.5 | PE-cy7 | 이바이오사이언스 |
| CD62L | MEL-14 | APC-cy7 | BD 바이오사이언스 |
| Foxp3 | FJK-16S | FITC | 이바이오사이언스 |
| CTLA-4 | UC10-4B9 | APC | 바이오레전드 |
| LAP(TGF-β1) | TW7-16B4 | Brilliant Violet 421 | 바이오레전드 |
| GITR | DTA-1 | APC | 바이오레전드 |
| CD45.1 | A20 | APC-cy7 | 바이오레전드 |
| CD45.2 | 104 | APC | 바이오레전드 |
APC, 알로피코시아닌(Allophycocyanin); Foxp3, 포크헤드 박스 P3(forkhead box P3); CTLA-4, 세포독성 T 림프구 관련 단백질 4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4); Cy7, 사이아닌7; FITC, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (fluorescein Isothiocyanate); GITR, 글루코코르티코이드 유도 종양 괴사인자 수용체 관련 단백질 (glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor-related protein); LAP, 잠재 연관 펩타이드(latency-associated peptide); PE, 피코에리트린(phycoerythrin).
| 유전자 | 프라이머 시퀀스 | 어닐링 온도(℃) |
| IL-1 β | F: ACTCATTGTGGCTGTGGAGA (SEQ ID NO: 27) R: TTGTTCATCTCGGAGCCTGT (SEQ ID NO: 28) |
60 |
| IL-6 | F: CTGGGGATGTCTGTAGCTCA (SEQ ID NO: 29) R: CTGTGAAGTCTCCTCTCCGG (SEQ ID NO: 30) |
60 |
| IFN- γ | F: GATTGCGGGGTTGTATCTGG (SEQ ID NO: 31) R: GCTTTCTTTCAGGGACAGCC (SEQ ID NO: 32) |
60 |
| GAPDH | F: CAACTCCCACTCTTCCACCT (SEQ ID NO: 33) R: GAGTTGGGATAGGGCCTCTC (SEQ ID NO: 34) |
60 |
F, 순방향; GAPDH, 글리세르알데히드 3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase); IFN-γ, 인터페론-γ; IL-1β, 인터류킨-1β; IL-6, 인터류킨-6; R, 역방향
● 실시예 2
본 실시예는 항-C4d CAR을 발현하는 조절 T 세포를 생성하기 위한 대표적인 방법을 설명한다.
● 마우스 항-C4d CAR Treg의 생성
FACS 아리아(Aria) II(BD Biosciences, San Diego, CA)를 사용하여 분류함으로써 C57BL/6J 마우스의 비장 및 림프절로부터 CD62L+CD4+CD25+ T 세포가 분리되었다. 분류된 Treg는 다이나비즈 마우스 T-액티베이터 (DYNABEADS™ Mouse T-Activator) CD3/CD28(bead to cell, 1:1) 및 IL-2(4,000 IU)로 하루 동안 자극되었다. 그런 다음 연속 2 일 동안 3000 rpm, 32℃에서 90 분 동안 접종된 레트로넥틴(retronectin) 시약을 사용하여 이들 세포는 레트로바이러스로 형질 도입되었다. 3 일째에 원심분리기를 사용하여 레트로바이러스를 1500 rpm으로 3 분 동안 세척한 후, 형질 도입된 Treg는 항-CD3 mAb로 CD86/CD64를 발현하는 L 세포, IL-2 및 라파마이신(100 nM)의 존재 하에 7 일까지 자극되었고 13 일째에 CAR Treg에 두 번째 자극이 가해졌다 (도 5a 참조). 대조군으로서 비형질 도입 Treg(NT Treg)은 바이러스 형질 도입을 제외하고 동일한 방식으로 자극되었다. CAR의 형질 도입 효율은 Myc 태그를 염색하여 FACS로 확인되었다.
● 인간 항-C4d CAR Treg의 생성
모조소트(Mojosort) 인간 CD4 T 세포 단리 키트를 통해 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 인간 CD4+ T 세포를 분리하였다. CD8-CD4+CD45RA+CD127lowCD25+ T 세포는 FACS 아리아(Aria) II(BD Biosciences, San Diego, CA)를 사용하여 형광 보조 세포 분류에 의하여 정제되었다. 도 6a 참조. 분류된 Treg는 다이나비즈 마우스 T-액티베이터 (DYNABEADS™ Mouse T-Activator) CD3/CD28(bead to cell, 1:1) 및 IL-2(4,000 IU)로 하루 동안 자극되었다. 그런 다음, 연속 2 일 동안 25,000 rpm, 25℃에서 40 분 동안 접종된 폴리브렌(polybrene) (6 ug/ml) 시약을 사용하여 상기 세포는 레트로바이러스로 형질 도입되었다. 3 일째에 원심분리기를 사용하여 레트로바이러스를 1500 rpm으로 3 분 동안 세척한 후, 형질 도입된 Treg는 항-CD3 mAb로 CD86/CD64를 발현하는 K562 세포, IL-2 및 라파마이신(100nM)의 존재 하에 Treg를 7 일까지 자극되었고 13 일째에 CAR Treg에 두번째 자극이 가해졌다 (도 7 참조). 대조군으로서 비형질 도입 Treg(NT Treg)는 바이러스 형질 도입을 제외하고 동일한 방식으로 자극되었다.
● 실시예 3
본 실시예는 항-마우스 C4d CAR Treg가 상기 실시예 1 및 도 4에 기재된 바와 같이 ABOi 심장 이식에서 심장 동종 이식 생존율을 증가시킨다는 것을 입증한다. 도 5b에 나타낸 바와 같이, 항-마우스 C4d CAR Treg는 PBS 대조군(P < 0.001), NT reg(P < 0.003) 및 대조군 CAR Treg(P < 0.025)에 비해 ABOi 심장 동종 이식 생존율을 상당히 연장시켰다.
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본원에 기재된 실시예 및 구현예는 단지 예시를 위한 것이며, 이에 비추어 다양한 수정 또는 변경이 본 기술 분야의 기술자에게 제안될 것이며 본 출원의 사상 및 범주 및 본원의 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다. 본원에 인용된 모든 간행물, 젠뱅크 수탁 번호, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위하여 전체적으로 참조로 포함된다.
Informal Sequence Listing:
SEQ ID NO: 1. Anti-C4d scFv (BF-2) light chain (LC) nucleotide sequence
CTGACTCAGCCGTCCTCGGTGTCAGCAAACCCAGGAGGAACCGTCGAGATCACCTGCTCCGGGAGTAGTGGCAGCTATGGCTGGTATCAGCAGAAGTCACCTGGCAGTGCCCCTGTCACTGTGATCTATTACAACGACAAGAGACCCTCGGACATCCCTTCACGATTCTCCGGTTCCAAATCCGGCTCCACAGCCACATTAACCATCACTGGGGTCCAAGCCGAGGACGAGGCTGTCTATTTCTGTGGGAGTGAAGACAGCAGCTATGTTGGTGTATTTGGGGCCGGGACAACCCTGACCGTCCTA
SEQ ID NO: 2. Anti-C4d scFv (BF-2) light chain (LC) amino acid sequence
LTQPSSVSANPGGTVEITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYYNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTATLTITGVQAEDEAVYFCGSEDSSYVGVFGAGTTLTVL
SEQ ID NO: 3. Anti-C4d scFv (BF-2) heavy chain (HC) nucleotide sequence
GCCGTGACGTTGGACGAGTCCGGGGGCGGCCTCCAGACGCCCGGAGGAACGCTCAGCCTCGTCTGCAAGGGCTCCGGGTTCACCTTCAGGAGTTATGCCCTGGAGTGGGTGCGCCAGGCACCCGGCAAGGGGCTGGAATACGTCGCGGGTATTAGCAGCAGTGGCAGTGGCACAAACTACGGGTCGGCGGTGAAGGGCCGTGCCACCATCTCGAGGGACAACGGGCAGAGCACAGTGAGGCTGCAGCTGAACAACCTCAGGGCTGAGGACACCGGCACCTACTACTGCGCCAAAAGTGCTTACGGTTATGTTGATGCTTACGGCATCGACGCATGGGGCCACGGGACCGAAGTCATCGTCTCCTCCACTAGT
SEQ ID NO: 4. Anti-C4d scFv (BF-2) heavy chain (HC) amino acid sequence
AVTLDESGGGLQTPGGTLSLVCKGSGFTFRSYALEWVRQAPGKGLEYVAGISSSGSGTNYGSAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKSAYGYVDAYGIDAWGHGTEVIVSSTS
SEQ ID NO: 5. Anti-C4d scFv (SC-8) light chain (LC) nucleotide sequence
CTGACTCAGCCGTCCTCGGTGTCAGCAAACCCGGGAGAAACCGTCAAGATCACCTGCTCCGGGGGTGGTAGGTGGTATGGCTGGTACCAGCAGAAGTCTCCTGGCAGTGCCCCTGTCACTCTGATCCATGCTAATACCAAAAGACCCTCGAACATCCCTTCACGATTCTCCGGTTCCCTATCCGGCTCCACAAGCACATTAACCATCTCTGGGGTCCAAGCCGAGGACGAGGCTGTCTATTTCTGTGGGAGTGGAGACAGCAGCACTGATAGTGGTATATTTGGGGCCGGGACAACCCTGACCGTCCTA
SEQ ID NO: 6. Anti-C4d scFv (SC-8) light chain (LC) amino acid sequence
LTQPSSVSANPGETVKITCSGGGRWYGWYQQKSPGSAPVTLIHANTKRPSNIPSRFSGSLSGSTSTLTISGVQAEDEAVYFCGSGDSSTDSGIFGAGTTLTVL
SEQ ID NO: 7. Anti-C4d scFv (SC-8) heavy chain (HC) nucleotide sequence
GCCGTGACGTTGGACGAGTCCGGGGGCGGCCTCCAGACGCCCGGAGGAGCGCTCAGCCTCGTCTGCAAGGCCTCCGGGTTCTCCTTCAGTGACCGTGCAATGCACTGGGTGCGACAGGCACCCGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCGGGTATTTACAGCAGTGGTAGATACACAGGCTACGGGTCGGCGGTGAAGGGCCGTGCCACCATCTCGAGGGACAACGGGCAGAGCACAGTGAGGCTGCAGCTGAACAACCTCAGGGCTGAGGACACCGGCACCTACTACTGCGCCAAAGCTGGTAGTATTTACTGTGGGTATGCTGATGTTGCTTGCATCGACGCGTGGGGCCACGGGACCGAAGTCATCGTCTCCTCCACTAGT
SEQ ID NO: 8. Anti-C4d scFv (SC-8) heavy chain (HC) amino acid sequence
AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFSFSDRAMHWVRQAPGKGLEWVAGIYSSGRYTGYGSAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKAGSIYCGYADVACIDAWGHGTEVIVSSTS
SEQ ID NO: 9. Human CD8 Hinge nucleotide sequence
TCAGCGCTGAGCAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCATGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGAT
SEQ ID NO: 10. Human CD8 Hinge amino acid sequence
SALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLD
SEQ ID NO: 11. Mouse CD28 Transmembrane & Cytoplasmic nucleotide sequence
CCTAAGCTGTTTTGGGCACTGGTCGTGGTTGCTGGAGTCCTGTTTTGTTATGGCTTGCTAGTGACAGTGGCTCTTTGTGTTATCTGGACAAATAGTAGAAGGAACAGACTCCTTCAAAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGGAGGCCTGGGCTCACTCGAAAGCCTTACCAGCCCTACGCCCCTGCCAGAGACTTTGCAGCGTACCGCCCC
SEQ ID NO: 12. Mouse CD28 Transmembrane & Cytoplasmic amino acid sequence
PKLFWALVVVAGVLFCYGLLVTVALCVIWTNSRRNRLLQSDYMNMTPRRPGLTRKPYQPYAPARDFAAYRP
SEQ ID NO: 13. Mouse CD3-zeta Cytoplasmic nucleotide sequence
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
SEQ ID NO: 14. Mouse CD3-zeta Cytoplasmic amino acid sequence
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 15. Anti-C4d (BF-2) CAR-Treg Nucleotide Sequence (scFv-hCD8 hinge-mCD28 trans+cyto-mCD3z)
CTGACTCAGCCGTCCTCGGTGTCAGCAAACCCAGGAGGAACCGTCGAGATCACCTGCTCCGGGAGTAGTGGCAGCTATGGCTGGTATCAGCAGAAGTCACCTGGCAGTGCCCCTGTCACTGTGATCTATTACAACGACAAGAGACCCTCGGACATCCCTTCACGATTCTCCGGTTCCAAATCCGGCTCCACAGCCACATTAACCATCACTGGGGTCCAAGCCGAGGACGAGGCTGTCTATTTCTGTGGGAGTGAAGACAGCAGCTATGTTGGTGTATTTGGGGCCGGGACAACCCTGACCGTCCTAGGTCAGTCCTCTAGATCTTCCGGCGGTGGTGGCAGCTCCGGTGGTGGCGGTTCCGCCGTGACGTTGGACGAGTCCGGGGGCGGCCTCCAGACGCCCGGAGGAACGCTCAGCCTCGTCTGCAAGGGCTCCGGGTTCACCTTCAGGAGTTATGCCCTGGAGTGGGTGCGCCAGGCACCCGGCAAGGGGCTGGAATACGTCGCGGGTATTAGCAGCAGTGGCAGTGGCACAAACTACGGGTCGGCGGTGAAGGGCCGTGCCACCATCTCGAGGGACAACGGGCAGAGCACAGTGAGGCTGCAGCTGAACAACCTCAGGGCTGAGGACACCGGCACCTACTACTGCGCCAAAAGTGCTTACGGTTATGTTGATGCTTACGGCATCGACGCATGGGGCCACGGGACCGAAGTCATCGTCTCCTCCACTAGTGCGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGTCACCGTCTCTTCAGCGCTGAGCAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCATGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGATCCTAAGCTGTTTTGGGCACTGGTCGTGGTTGCTGGAGTCCTGTTTTGTTATGGCTTGCTAGTGACAGTGGCTCTTTGTGTTATCTGGACAAATAGTAGAAGGAACAGACTCCTTCAAAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGGAGGCCTGGGCTCACTCGAAAGCCTTACCAGCCCTACGCCCCTGCCAGAGACTTTGCAGCGTACCGCCCCCTCGAGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
SEQ ID NO: 16. Anti-C4d (BF-2) CAR-Treg Amino Acid Sequence (scFv-hCD8 hinge-mCD28 trans+cyto-mCD3z)
LTQPSSVSANPGGTVEITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYYNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTATLTITGVQAEDEAVYFCGSEDSSYVGVFGAGTTLTVLGQSSRSSGGGGSSGGGGSAVTLDESGGGLQTPGGTLSLVCKGSGFTFRSYALEWVRQAPGKGLEYVAGISSSGSGTNYGSAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKSAYGYVDAYGIDAWGHGTEVIVSSTSAAAEQKLISEEDLNGVTVSSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDPKLFWALVVVAGVLFCYGLLVTVALCVIWTNSRRNRLLQSDYMNMTPRRPGLTRKPYQPYAPARDFAAYRPLERVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 17. Anti-C4d (SC-8) CAR-Treg Nucleotide Sequence (scFv-hCD8 hinge-mCD28 trans+cyto-mCD3z)
CTGACTCAGCCGTCCTCGGTGTCAGCAAACCCGGGAGAAACCGTCAAGATCACCTGCTCCGGGGGTGGTAGGTGGTATGGCTGGTACCAGCAGAAGTCTCCTGGCAGTGCCCCTGTCACTCTGATCCATGCTAATACCAAAAGACCCTCGAACATCCCTTCACGATTCTCCGGTTCCCTATCCGGCTCCACAAGCACATTAACCATCTCTGGGGTCCAAGCCGAGGACGAGGCTGTCTATTTCTGTGGGAGTGGAGACAGCAGCACTGATAGTGGTATATTTGGGGCCGGGACAACCCTGACCGTCCTAGGTCAGTCCTCTAGATCTTCCGGCGGTGGTGGCAGCTCCGGTGGTGGCGGTTCCGCCGTGACGTTGGACGAGTCCGGGGGCGGCCTCCAGACGCCCGGAGGAGCGCTCAGCCTCGTCTGCAAGGCCTCCGGGTTCTCCTTCAGTGACCGTGCAATGCACTGGGTGCGACAGGCACCCGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCGGGTATTTACAGCAGTGGTAGATACACAGGCTACGGGTCGGCGGTGAAGGGCCGTGCCACCATCTCGAGGGACAACGGGCAGAGCACAGTGAGGCTGCAGCTGAACAACCTCAGGGCTGAGGACACCGGCACCTACTACTGCGCCAAAGCTGGTAGTATTTACTGTGGGTATGCTGATGTTGCTTGCATCGACGCGTGGGGCCACGGGACCGAAGTCATCGTCTCCTCCACTAGTGCGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGTCACCGTCTCTTCAGCGCTGAGCAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCATGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGATCCTAAGCTGTTTTGGGCACTGGTCGTGGTTGCTGGAGTCCTGTTTTGTTATGGCTTGCTAGTGACAGTGGCTCTTTGTGTTATCTGGACAAATAGTAGAAGGAACAGACTCCTTCAAAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGGAGGCCTGGGCTCACTCGAAAGCCTTACCAGCCCTACGCCCCTGCCAGAGACTTTGCAGCGTACCGCCCCCTCGAGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
SEQ ID NO: 18. Anti-C4d (SC-8) CAR-Treg Amino Acid Sequence (scFv-hCD8 hinge-mCD28 trans+cyto-mCD3z)
LTQPSSVSANPGETVKITCSGGGRWYGWYQQKSPGSAPVTLIHANTKRPSNIPSRFSGSLSGSTSTLTISGVQAEDEAVYFCGSGDSSTDSGIFGAGTTLTVLGQSSRSSGGGGSSGGGGSAVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFSFSDRAMHWVRQAPGKGLEWVAGIYSSGRYTGYGSAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKAGSIYCGYADVACIDAWGHGTEVIVSSTSAAAEQKLISEEDLNGVTVSSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDPKLFWALVVVAGVLFCYGLLVTVALCVIWTNSRRNRLLQSDYMNMTPRRPGLTRKPYQPYAPARDFAAYRPLERVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 19. Mouse CD28 (Extracellular+Transmembrane+Cytoplasmic) nucleotide sequence
ATCGAGTTCATGTACCCACCACCCTACCTTGACAATGAACGGAGTAACGGAACTATCATTCACATCAAGGAAAAGCATCTTTGCCACACACAATCTAGTCCAAAACTCTTTTGGGCATTGGTCGTTGTGGCTGGGGTGCTTTTCTGTTATGGACTTCTTGTGACCGTAGCACTCTGTGTCATCTGGACAAATAGCCGCCGAAACCGCGGCGGGCAGTCCGACTACATGAACATGACTCCTAGACGCCCTGGACTGACTCGCAAACCCTATCAACCTTATGCTCCCGCTAGGGACTTCGCAGCCTATAGGCCC
SEQ ID NO: 20. Mouse CD28 (Extracellular+Transmembrane+Cytoplasmic) amino acid sequence
IEFMYPPPYLDNERSNGTIIHIKEKHLCHTQSSPKLFWALVVVAGVLFCYGLLVTVALCVIWTNSRRNRGGQSDYMNMTPRRPGLTRKPYQPYAPARDFAAYRP
SEQ ID NO: 21. Human CD3-zeta Cytoplasmic nucleotide sequence.
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
SEQ ID NO: 22. Human CD3-zeta Cytoplasmic amino acid sequence
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 23. Mouse CD28 (Extracellular+Transmembrane+Cytoplasmic) + mouse CD3-zeta nucleotide sequence
ATCGAGTTCATGTACCCACCACCCTACCTTGACAATGAACGGAGTAACGGAACTATCATTCACATCAAGGAAAAGCATCTTTGCCACACACAATCTAGTCCAAAACTCTTTTGGGCATTGGTCGTTGTGGCTGGGGTGCTTTTCTGTTATGGACTTCTTGTGACCGTAGCACTCTGTGTCATCTGGACAAATAGCCGCCGAAACCGCGGCGGGCAGTCCGACTACATGAACATGACTCCTAGACGCCCTGGACTGACTCGCAAACCCTATCAACCTTATGCTCCCGCTAGGGACTTCGCAGCCTATAGGCCCAGAGCCAAATTTTCCCGATCTGCTGAGACTGCCGCCAATCTCCAGGACCCAAATCAATTGTTTAACGAACTGAACCTTGGACGGCGGGAAGAGTTTGATGTTTTGGAGAAGAAGCGCGCACGCGACCCTGAGATGGGTGGCAAGCAGCAACGCCGACGAAACCCTCAAGAGGGTGTTTACAATGCCCTGCAAAAGGACAAGATGGCAGAGGCTTATAGCGAAATAGGAACAAAGGGGGAACGGAGACGAGGAAAGGGACATGATGGACTTTTTCAGGGGCTCTCCACAGCCACAAAGGATACATTCGACGCCTTGCACATGCAAACCCTTGCTCCTAGA
SEQ ID NO: 24. Mouse CD28 (Extracellular+Transmembrane+Cytoplasmic) + mouse CD3-zeta amino acid sequence
IEFMYPPPYLDNERSNGTIIHIKEKHLCHTQSSPKLFWALVVVAGVLFCYGLLVTVALCVIWTNSRRNRGGQSDYMNMTPRRPGLTRKPYQPYAPARDFAAYRPRAKFSRSAETAANLQDPNQLFNELNLGRREEFDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQTLAPR
SEQ ID NO:25. c-myc tag nucleotide sequence
GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG
SEQ ID NO:26. c-myc tag amino acid sequence
EQKLISEEDL
SEQ ID NO: 35. N2-7 scFv nucleotide sequence:
CTGACTCAGCCGTCCTCGGTGTCAGCGAACCCGGGAGAAACCGTCGAGATCACCTGCTCCGGGGGTGGCAGCTACTATGGCTGGTACCAGCAGAAGTCTCCTGGCAGTGCCCCTGTCACTGTGATCTATAGCAACAACAAGAGACCCTCGGACATCCCTTCACGATTCTCCGGTTCCAAATCCGGCTCCACAAGCACATTAACCATCACTGGGGTCCAAGCCGACGACGAGGCTGTCTATTACTGTGGGAGCTACGACAGCAATGCTGGTATATTTGGGGCCGGGACAACCCTGACCGTCCTA
GGTCAGTCCTCTAGATCTTCCGGCGGTGGTGGCAGCTCCGGTGGTGGCGGTTCC
GCCGTGACGTTGGACGAGTCCGGGGGCGGCCTCCAGACGCCCGGAGGAGCACTCAGCCTCGTCTGCAAGGCCTCCGGGTTCACCTTCAGCAGTTATGCCATGGGTTGGATGCGCCAGGCACCCGGCAAGGGGCTGGACTTCGTCGCTGAAATTAGCGGCAGTGGCACTAGCACATACTACGGGCCGGCGGTGAAGGGCCGTGCCACCATCTCGAGGGACAACGGGCGGAGCACAGTGAGGCTGCAGCTGAACAACCTCAGGGCTGAGGACACCGGCACCTACTTCTGCACGAGAGGTGGTGGTGCTGGTAGTTACATCGACGCATGGGGCCACGGGACCGAAGTCATCGTCTCCTCCACTAGT
SEQ ID NO:39. N2-7 Light chain nucleotide sequence:
CTGACTCAGCCGTCCTCGGTGTCAGCGAACCCGGGAGAAACCGTCGAGATCACCTGCTCCGGGGGTGGCAGCTACTATGGCTGGTACCAGCAGAAGTCTCCTGGCAGTGCCCCTGTCACTGTGATCTATAGCAACAACAAGAGACCCTCGGACATCCCTTCACGATTCTCCGGTTCCAAATCCGGCTCCACAAGCACATTAACCATCACTGGGGTCCAAGCCGACGACGAGGCTGTCTATTACTGTGGGAGCTACGACAGCAATGCTGGTATATTTGGGGCCGGGACAACCCTGACCGTCCTA
SEQ ID NO:40. N2-7 scFv Linker nucleotide sequence:
GGTCAGTCCTCTAGATCTTCCGGCGGTGGTGGCAGCTCCGGTGGTGGCGGTTCC
SEQ ID NO:41. N2-7 Heavy chain nucleotide sequence:
GCCGTGACGTTGGACGAGTCCGGGGGCGGCCTCCAGACGCCCGGAGGAGCACTCAGCCTCGTCTGCAAGGCCTCCGGGTTCACCTTCAGCAGTTATGCCATGGGTTGGATGCGCCAGGCACCCGGCAAGGGGCTGGACTTCGTCGCTGAAATTAGCGGCAGTGGCACTAGCACATACTACGGGCCGGCGGTGAAGGGCCGTGCCACCATCTCGAGGGACAACGGGCGGAGCACAGTGAGGCTGCAGCTGAACAACCTCAGGGCTGAGGACACCGGCACCTACTTCTGCACGAGAGGTGGTGGTGCTGGTAGTTACATCGACGCATGGGGCCACGGGACCGAAGTCATCGTCTCCTCCACTAGT
SEQ ID NO: 36. N2-7 scFv amino acid sequence:
LTQPSSVSANPGETVEITCSGGGSYYGWYQQKSPGSAPVTVIYSNNKRPSDIPSRFSGSKSGSTSTLTITGVQADDEAVYYCGSYDSNAGIFGAGTTLTVL
GQSSRSSGGGGSSGGGGS
AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSYAMGWMRQAPGKGLDFVAEISGSGTSTYYGPAVKGRATISRDNGRSTVRLQLNNLRAEDTGTYFCTRGGGAGSYIDAWGHGTEVIVSSTS
SEQ ID NO:42. N2-7 light chain amino acid sequence:
LTQPSSVSANPGETVEITCSGGGSYYGWYQQKSPGSAPVTVIYSNNKRPSDIPSRFSGSKSGSTSTLTITGVQADDEAVYYCGSYDSNAGIFGAGTTLTVL
SEQ ID NO:43. N2-7 LCDR1 amino acid sequence:
SGGGSYYG
SEQ ID NO:44. N2-7 LCDR2 amino acid sequence:
SNNKRPS
SEQ ID NO:45. N2-7 LCDR3 amino acid sequence:
GSYDSNAGI
SEQ ID NO:46. N2-7 scFv linker amino acid sequence:
GQSSRSSGGGGSSGGGGS
SEQ ID NO:47. N2-7 heavy chain amino acid sequence:
AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSYAMGWMRQAPGKGLDFVAEISGSGTSTYYGPAVKGRATISRDNGRSTVRLQLNNLRAEDTGTYFCTRGGGAGSYIDAWGHGTEVIVSSTS
SEQ ID NO:48. N2-7 HCDR1 amino acid sequence:
SYAMG
SEQ ID NO:49. N2-7 HCDR2 amino acid sequence:
EISGSGTSTYYGPAVKG
SEQ ID NO:50. N2-7 HCDR3 amino acid sequence:
CTRGGGAGSYIDA
SEQ ID NO: 37. Human GM-CSF-Myc-h28z nucleotide sequence.
ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCA
GAGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTG
ATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGGGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
SEQ ID NO:51. GM-CSF nucleotide sequence:
ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCA
SEQ ID NO:52. Myc-tag nucleotide sequence:
GAGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTG
SEQ ID NO:53. Human CD28 Transmembrane nucleotide sequence:
ATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGGGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
SEQ ID NO:54. Human CD3-zeta nucleotide sequence:
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
SEQ ID NO: 38. Human GM-CSF-Myc-h28z amino acid sequence:
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
EQKLISEEDL
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:55. GM-CSF amino acid sequence:
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
SEQ ID NO:56. Myc-tag amino acid sequence:
EQKLISEEDL
SEQ ID NO:57. Human CD28 Transmembrane amino acid sequence:
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
SEQ ID NO:58. Human CD3-zeta amino acid sequence:
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:59. BF-2 scFv nucleotide sequence:
CTGACTCAGCCGTCCTCGGTGTCAGCAAACCCAGGAGGAACCGTCGAGATCACCTGCTCCGGGAGTAGTGGCAGCTATGGC TGGTATCAGCAGAAGTCACCTGGCAGTGCCCCTGTCACTGTGATCTATTACAACGACAAGAGACCCTCG GACATCCCTTCACGATTCTCCGGTTCCAAATCCGGCTCCACAGCCACATTAACCATCACTGGGGTCCAAGCCGAGGACGAGGCTGTCTATTTCTGTGGGAGTGAAGACAGCAGCTATGTTGGTGTA TTTGGGGCCGGGACAACCCTGACCGTCCTA
GGTCAGTCCTCTAGATCTTCCGGCGGTGGTGGCAGCTCCGGTGGTGGCGGTTCC
GCCGTGACGTTGGACGAGTCCGGGGGCGGCCTCCAGACGCCCGGAGGAACGCTCAGCCTCGTCTGCAAGGGCTCCGGGTTCACCTTCAGGAGTTATGCCCTGGAG TGGGTGCGCCAGGCACCCGGCAAGGGGCTGGAATACGTCGCGGGTATTAGCAGCAGTGGCAGTGGCACAAACTACGGGTCGGCGGTGAAGGGC CGTGCCACCATCTCGAGGGACAACGGGCAGAGCACAGTGAGGCTGCAGCTGAACAACCTCAGGGCTGAGGACACCGGCACCTACTACTGCGCCAAAAGTGCTTACGGTTATGTTGATGCTTACGGCATCGACGCA TGGGGCCACGGGACCGAAGTCATCGTCTCCTCCACTAGT
SEQ ID NO:60. BF-2 LCDR1 nucleotide sequence:
TCCGGGAGTAGTGGCAGCTATGGC
SEQ ID NO:61. BF-2 LCDR2 nucleotide sequence:
TACAACGACAAGAGACCCTCG
SEQ ID NO:62. BF-2 LCDR3 nucleotide sequence:
GGGAGTGAAGACAGCAGCTATGTTGGTGTA
SEQ ID NO:63. BF-2 HCDR1 nucleotide sequence:
AGTTATGCCCTGGAG
SEQ ID NO:64. BF-2 HCDR2 nucleotide sequence:
GGTATTAGCAGCAGTGGCAGTGGCACAAACTACGGGTCGGCGGTGAAGGGC
SEQ ID NO:65. BF-2 HCDR3 nucleotide sequence:
GTGCTTACGGTTATGTTGATGCTTACGGCATCGACGCA
SEQ ID NO:66. BF-2 scFv linker nucleotide sequence:
GGTCAGTCCTCTAGATCTTCCGGCGGTGGTGGCAGCTCCGGTGGTGGCGGTTCC
SEQ ID NO:67. BF-2 scFv amino acid sequence
LTQPSSVSANPGGTVEITCSGSSGSYG WYQQKSPGSAPVTVIYYNDKRPS DIPSRFSGSKSGSTATLTITGVQAEDEAVYFCGSEDSSYVGV FGAGTTLTVL
GQSSRSSGGGGSSGGGGS
AVTLDESGGGLQTPGGTLSLVCKGSGFTFRSYALE WVRQAPGKGLEYVAGISSSGSGTNYGSAVKG RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKSAYGYVDAYGIDA WGHGTEVIVSSTS
SEQ ID NO:68. BF-2 LCDR1 amino acid sequence:
SGSSGSYG
SEQ ID NO:69. BF-2 LCDR2 amino acid sequence:
YNDKRPS
SEQ ID NO:70. BF-2 LCDR3 amino acid sequence:
GSEDSSYVGV
SEQ ID NO:71. BF-2 HCDR1 amino acid sequence:
SYALE
SEQ ID NO:72. BF-2 HCDR2 amino acid sequence:
GISSSGSGTNYGSAVKG
SEQ ID NO:73. BF-2 HCDR3 amino acid sequence:
AYGYVDAYGIDA
SEQ ID NO:74. BF-2 scFv linker amino acid sequence:
GQSSRSSGGGGSSGGGGS
SEQ ID NO:75. SC-8 scFv nucleotide sequence:
CTGACTCAGCCGTCCTCGGTGTCAGCAAACCCGGGAGAAACCGTCAAGATCACCTGCTCCGGGGGTGGTAGGTGGTATGGC TGGTACCAGCAGAAGTCTCCTGGCAGTGCCCCTGTCACTCTGATCCATGCTAATACCAAAAGACCCTCG AACATCCCTTCACGATTCTCCGGTTCCCTATCCGGCTCCACAAGCACATTAACCATCTCTGGGGTCCAAGCCGAGGACGAGGCTGTCTATTTCTGTGGGAGTGGAGACAGCAGCACTGATAGTGGTATA TTTGGGGCCGGGACAACCCTGACCGTCCTA
GGTCAGTCCTCTAGATCTTCCGGCGGTGGTGGCAGCTCCGGTGGTGGCGGTTCC
GCCGTGACGTTGGACGAGTCCGGGGGCGGCCTCCAGACGCCCGGAGGAGCGCTCAGCCTCGTCTGCAAGGCCTCCGGGTTCTCCTTCAGTGACCGTGCAATGCAC TGGGTGCGACAGGCACCCGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCGGGTATTTACAGCAGTGGTAGATACACAGGCTACGGGTCGGCGGTGAAGGGC CGTGCCACCATCTCGAGGGACAACGGGCAGAGCACAGTGAGGCTGCAGCTGAACAACCTCAGGGCTGAGGACACCGGCACCTACTACTGCGCCAAAGCTGGTAGTATTTACTGTGGGTATGCTGATGTTGCTTGCATCGACGCG TGGGGCCACGGGACCGAAGTCATCGTCTCCTCCACTAGT
SEQ ID NO:76. SC-8 LCDR1 nucleotide sequence:
TCCGGGGGTGGTAGGTGGTATGGC
SEQ ID NO:77. SC-8 LCDR2 nucleotide sequence:
CATGCTAATACCAAAAGACCCTCG
SEQ ID NO:78. SC-8 LCDR3 nucleotide sequence:
GGGAGTGGAGACAGCAGCACTGATAGTGGTATA
SEQ ID NO:79. SC-8 HCDR1 nucleotide sequence:
GACCGTGCAATGCAC
SEQ ID NO:80. SC-8 HCDR2 nucleotide sequence:
GGTATTTACAGCAGTGGTAGATACACAGGCTACGGGTCGGCGGTGAAGGGC
SEQ ID NO:81. SC-8 HCDR3 nucleotide sequence:
GCTGGTAGTATTTACTGTGGGTATGCTGATGTTGCTTGCATCGACGCG
SEQ ID NO:82. SC-8 scFv linker nucleotide sequence:
GGTCAGTCCTCTAGATCTTCCGGCGGTGGTGGCAGCTCCGGTGGTGGCGGTTCC
SEQ ID NO:83. SC-8 scFv amino acid sequence:
LTQPSSVSANPGETVKITCSGGGRWYG WYQQKSPGSAPVTLIHANTKRPS NIPSRFSGSLSGSTSTLTISGVQAEDEAVYFCGSGDSSTDSGI FGAGTTLTVL
GQSSRSSGGGGSSGGGGS
AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFSFSDRAMH WVRQAPGKGLEWVAGIYSSGRYTGYGSAVKG RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKAGSIYCGYADVACIDA WGHGTEVIVSSTS
SEQ ID NO:84. SC-8 LCDR1 amino acid sequence:
SGGGRWYG
SEQ ID NO:85. SC-8 LCDR2 amino acid sequence:
HANTKRPS
SEQ ID NO:86. SC-8 LCDR3 amino acid sequence:
GSGDSSTDSGI
SEQ ID NO:87. SC-8 HCDR1 amino acid sequence:
DRAMH
SEQ ID NO:88. SC-8 HCDR2 amino acid sequence:
GIYSSGRYTGYGSAVKG
SEQ ID NO:89. SC-8 HCDR3 amino acid sequence:
AGSIYCGYADVACIDA
SEQ ID NO:90. SC-8 scFv linker amino acid sequence:
GQSSRSSGGGGSSGGGGS
SEQUENCE LISTING
<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R&DB FOUNDATION
SEOUL NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL
THE ASAN FOUNDATION
<120> ANTI-C4D CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR REGULATORY T CELLS AND USES
THEREOF
<130> IP20230095KR
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<151> 2021-01-20
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<170> PatentIn version 3.5
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<211> 306
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
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ctgactcagc cgtcctcggt gtcagcaaac ccaggaggaa ccgtcgagat cacctgctcc 60
gggagtagtg gcagctatgg ctggtatcag cagaagtcac ctggcagtgc ccctgtcact 120
gtgatctatt acaacgacaa gagaccctcg gacatccctt cacgattctc cggttccaaa 180
tccggctcca cagccacatt aaccatcact ggggtccaag ccgaggacga ggctgtctat 240
ttctgtggga gtgaagacag cagctatgtt ggtgtatttg gggccgggac aaccctgacc 300
gtccta 306
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 2
Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Gly Thr Val Glu
1 5 10 15
Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Gly Ser Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln Lys
20 25 30
Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Tyr Asn Asp Lys Arg
35 40 45
Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Thr
50 55 60
Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val Tyr
65 70 75 80
Phe Cys Gly Ser Glu Asp Ser Ser Tyr Val Gly Val Phe Gly Ala Gly
85 90 95
Thr Thr Leu Thr Val Leu
100
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<211> 372
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 3
gccgtgacgt tggacgagtc cgggggcggc ctccagacgc ccggaggaac gctcagcctc 60
gtctgcaagg gctccgggtt caccttcagg agttatgccc tggagtgggt gcgccaggca 120
cccggcaagg ggctggaata cgtcgcgggt attagcagca gtggcagtgg cacaaactac 180
gggtcggcgg tgaagggccg tgccaccatc tcgagggaca acgggcagag cacagtgagg 240
ctgcagctga acaacctcag ggctgaggac accggcacct actactgcgc caaaagtgct 300
tacggttatg ttgatgctta cggcatcgac gcatggggcc acgggaccga agtcatcgtc 360
tcctccacta gt 372
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 4
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Val Cys Lys Gly Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
Ala Leu Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asn Tyr Gly Ser Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Ala Tyr Gly Tyr Val Asp Ala Tyr Gly Ile Asp Ala Trp
100 105 110
Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Thr Ser
115 120
<210> 5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 5
ctgactcagc cgtcctcggt gtcagcaaac ccgggagaaa ccgtcaagat cacctgctcc 60
gggggtggta ggtggtatgg ctggtaccag cagaagtctc ctggcagtgc ccctgtcact 120
ctgatccatg ctaataccaa aagaccctcg aacatccctt cacgattctc cggttcccta 180
tccggctcca caagcacatt aaccatctct ggggtccaag ccgaggacga ggctgtctat 240
ttctgtggga gtggagacag cagcactgat agtggtatat ttggggccgg gacaaccctg 300
accgtccta 309
<210> 6
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 6
Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val Lys
1 5 10 15
Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Arg Trp Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln Lys
20 25 30
Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile His Ala Asn Thr Lys Arg
35 40 45
Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ser Gly Ser Thr
50 55 60
Ser Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val Tyr
65 70 75 80
Phe Cys Gly Ser Gly Asp Ser Ser Thr Asp Ser Gly Ile Phe Gly Ala
85 90 95
Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100
<210> 7
<211> 381
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 7
gccgtgacgt tggacgagtc cgggggcggc ctccagacgc ccggaggagc gctcagcctc 60
gtctgcaagg cctccgggtt ctccttcagt gaccgtgcaa tgcactgggt gcgacaggca 120
cccggcaagg ggctggagtg ggtcgcgggt atttacagca gtggtagata cacaggctac 180
gggtcggcgg tgaagggccg tgccaccatc tcgagggaca acgggcagag cacagtgagg 240
ctgcagctga acaacctcag ggctgaggac accggcacct actactgcgc caaagctggt 300
agtatttact gtgggtatgc tgatgttgct tgcatcgacg cgtggggcca cgggaccgaa 360
gtcatcgtct cctccactag t 381
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 8
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asp Arg
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Tyr Ser Ser Gly Arg Tyr Thr Gly Tyr Gly Ser Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Gly Ser Ile Tyr Cys Gly Tyr Ala Asp Val Ala Cys Ile
100 105 110
Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Thr Ser
115 120 125
<210> 9
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
tcagcgctga gcaactccat catgtacttc agccacttcg tgccggtctt cctgccagcg 60
aagcccacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 120
cccctgtccc tgcgcccaga ggcatgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 180
gggctggat 189
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val
1 5 10 15
Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
20 25 30
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
35 40 45
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
50 55 60
<210> 11
<211> 213
<212> DNA
<213> Mus sp.
<400> 11
cctaagctgt tttgggcact ggtcgtggtt gctggagtcc tgttttgtta tggcttgcta 60
gtgacagtgg ctctttgtgt tatctggaca aatagtagaa ggaacagact ccttcaaagt 120
gactacatga acatgactcc ccggaggcct gggctcactc gaaagcctta ccagccctac 180
gcccctgcca gagactttgc agcgtaccgc ccc 213
<210> 12
<211> 71
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 12
Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val Leu Phe Cys
1 5 10 15
Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp Thr Asn Ser
20 25 30
Arg Arg Asn Arg Leu Leu Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
35 40 45
Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg
50 55 60
Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro
65 70
<210> 13
<211> 339
<212> DNA
<213> Mus sp.
<400> 13
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 14
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 15
<211> 1533
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 15
ctgactcagc cgtcctcggt gtcagcaaac ccaggaggaa ccgtcgagat cacctgctcc 60
gggagtagtg gcagctatgg ctggtatcag cagaagtcac ctggcagtgc ccctgtcact 120
gtgatctatt acaacgacaa gagaccctcg gacatccctt cacgattctc cggttccaaa 180
tccggctcca cagccacatt aaccatcact ggggtccaag ccgaggacga ggctgtctat 240
ttctgtggga gtgaagacag cagctatgtt ggtgtatttg gggccgggac aaccctgacc 300
gtcctaggtc agtcctctag atcttccggc ggtggtggca gctccggtgg tggcggttcc 360
gccgtgacgt tggacgagtc cgggggcggc ctccagacgc ccggaggaac gctcagcctc 420
gtctgcaagg gctccgggtt caccttcagg agttatgccc tggagtgggt gcgccaggca 480
cccggcaagg ggctggaata cgtcgcgggt attagcagca gtggcagtgg cacaaactac 540
gggtcggcgg tgaagggccg tgccaccatc tcgagggaca acgggcagag cacagtgagg 600
ctgcagctga acaacctcag ggctgaggac accggcacct actactgcgc caaaagtgct 660
tacggttatg ttgatgctta cggcatcgac gcatggggcc acgggaccga agtcatcgtc 720
tcctccacta gtgcggccgc agaacaaaaa ctcatctcag aagaggatct gaatggggtc 780
accgtctctt cagcgctgag caactccatc atgtacttca gccacttcgt gccggtcttc 840
ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 900
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcatgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 960
cacacgaggg ggctggatcc taagctgttt tgggcactgg tcgtggttgc tggagtcctg 1020
ttttgttatg gcttgctagt gacagtggct ctttgtgtta tctggacaaa tagtagaagg 1080
aacagactcc ttcaaagtga ctacatgaac atgactcccc ggaggcctgg gctcactcga 1140
aagccttacc agccctacgc ccctgccaga gactttgcag cgtaccgccc cctcgagaga 1200
gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 1260
aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1320
gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1380
ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1440
aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1500
gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgc 1533
<210> 16
<211> 511
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 16
Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Gly Thr Val Glu
1 5 10 15
Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Gly Ser Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln Lys
20 25 30
Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Tyr Asn Asp Lys Arg
35 40 45
Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Thr
50 55 60
Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val Tyr
65 70 75 80
Phe Cys Gly Ser Glu Asp Ser Ser Tyr Val Gly Val Phe Gly Ala Gly
85 90 95
Thr Thr Leu Thr Val Leu Gly Gln Ser Ser Arg Ser Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly Thr Leu Ser Leu Val Cys Lys Gly
130 135 140
Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Ala Leu Glu Trp Val Arg Gln Ala
145 150 155 160
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val Ala Gly Ile Ser Ser Ser Gly Ser
165 170 175
Gly Thr Asn Tyr Gly Ser Ala Val Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg
180 185 190
Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala
195 200 205
Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys Ser Ala Tyr Gly Tyr Val
210 215 220
Asp Ala Tyr Gly Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val
225 230 235 240
Ser Ser Thr Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp
245 250 255
Leu Asn Gly Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr
260 265 270
Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr
275 280 285
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
290 295 300
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
305 310 315 320
His Thr Arg Gly Leu Asp Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val
325 330 335
Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys
340 345 350
Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Leu Leu Gln Ser Asp Tyr
355 360 365
Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln
370 375 380
Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro Leu Glu Arg
385 390 395 400
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
405 410 415
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
420 425 430
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
435 440 445
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
450 455 460
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
465 470 475 480
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
485 490 495
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 17
<211> 1545
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 17
ctgactcagc cgtcctcggt gtcagcaaac ccgggagaaa ccgtcaagat cacctgctcc 60
gggggtggta ggtggtatgg ctggtaccag cagaagtctc ctggcagtgc ccctgtcact 120
ctgatccatg ctaataccaa aagaccctcg aacatccctt cacgattctc cggttcccta 180
tccggctcca caagcacatt aaccatctct ggggtccaag ccgaggacga ggctgtctat 240
ttctgtggga gtggagacag cagcactgat agtggtatat ttggggccgg gacaaccctg 300
accgtcctag gtcagtcctc tagatcttcc ggcggtggtg gcagctccgg tggtggcggt 360
tccgccgtga cgttggacga gtccgggggc ggcctccaga cgcccggagg agcgctcagc 420
ctcgtctgca aggcctccgg gttctccttc agtgaccgtg caatgcactg ggtgcgacag 480
gcacccggca aggggctgga gtgggtcgcg ggtatttaca gcagtggtag atacacaggc 540
tacgggtcgg cggtgaaggg ccgtgccacc atctcgaggg acaacgggca gagcacagtg 600
aggctgcagc tgaacaacct cagggctgag gacaccggca cctactactg cgccaaagct 660
ggtagtattt actgtgggta tgctgatgtt gcttgcatcg acgcgtgggg ccacgggacc 720
gaagtcatcg tctcctccac tagtgcggcc gcagaacaaa aactcatctc agaagaggat 780
ctgaatgggg tcaccgtctc ttcagcgctg agcaactcca tcatgtactt cagccacttc 840
gtgccggtct tcctgccagc gaagcccacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 900
gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcatgccg gccagcggcg 960
gggggcgcag tgcacacgag ggggctggat cctaagctgt tttgggcact ggtcgtggtt 1020
gctggagtcc tgttttgtta tggcttgcta gtgacagtgg ctctttgtgt tatctggaca 1080
aatagtagaa ggaacagact ccttcaaagt gactacatga acatgactcc ccggaggcct 1140
gggctcactc gaaagcctta ccagccctac gcccctgcca gagactttgc agcgtaccgc 1200
cccctcgaga gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag 1260
aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag 1320
agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1380
ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1440
ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1500
aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgc 1545
<210> 18
<211> 515
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 18
Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val Lys
1 5 10 15
Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Arg Trp Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln Lys
20 25 30
Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile His Ala Asn Thr Lys Arg
35 40 45
Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ser Gly Ser Thr
50 55 60
Ser Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val Tyr
65 70 75 80
Phe Cys Gly Ser Gly Asp Ser Ser Thr Asp Ser Gly Ile Phe Gly Ala
85 90 95
Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Gly Gln Ser Ser Arg Ser Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys
130 135 140
Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asp Arg Ala Met His Trp Val Arg Gln
145 150 155 160
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Gly Ile Tyr Ser Ser Gly
165 170 175
Arg Tyr Thr Gly Tyr Gly Ser Ala Val Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser
180 185 190
Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg
195 200 205
Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys Ala Gly Ser Ile Tyr
210 215 220
Cys Gly Tyr Ala Asp Val Ala Cys Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr
225 230 235 240
Glu Val Ile Val Ser Ser Thr Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile
245 250 255
Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn
260 265 270
Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys
275 280 285
Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
290 295 300
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
305 310 315 320
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Pro Lys Leu Phe Trp Ala
325 330 335
Leu Val Val Val Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr
340 345 350
Val Ala Leu Cys Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Leu Leu
355 360 365
Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg
370 375 380
Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg
385 390 395 400
Pro Leu Glu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
405 410 415
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
420 425 430
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
435 440 445
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
450 455 460
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
465 470 475 480
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
485 490 495
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
500 505 510
Pro Pro Arg
515
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<212> DNA
<213> Mus sp.
<400> 19
atcgagttca tgtacccacc accctacctt gacaatgaac ggagtaacgg aactatcatt 60
cacatcaagg aaaagcatct ttgccacaca caatctagtc caaaactctt ttgggcattg 120
gtcgttgtgg ctggggtgct tttctgttat ggacttcttg tgaccgtagc actctgtgtc 180
atctggacaa atagccgccg aaaccgcggc gggcagtccg actacatgaa catgactcct 240
agacgccctg gactgactcg caaaccctat caaccttatg ctcccgctag ggacttcgca 300
gcctataggc cc 312
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<211> 104
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 20
Ile Glu Phe Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Arg Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Ile Lys Glu Lys His Leu Cys His Thr Gln Ser
20 25 30
Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val Leu Phe
35 40 45
Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp Thr Asn
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala
85 90 95
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro
100
<210> 21
<211> 336
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 21
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 22
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 23
<211> 651
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 23
atcgagttca tgtacccacc accctacctt gacaatgaac ggagtaacgg aactatcatt 60
cacatcaagg aaaagcatct ttgccacaca caatctagtc caaaactctt ttgggcattg 120
gtcgttgtgg ctggggtgct tttctgttat ggacttcttg tgaccgtagc actctgtgtc 180
atctggacaa atagccgccg aaaccgcggc gggcagtccg actacatgaa catgactcct 240
agacgccctg gactgactcg caaaccctat caaccttatg ctcccgctag ggacttcgca 300
gcctataggc ccagagccaa attttcccga tctgctgaga ctgccgccaa tctccaggac 360
ccaaatcaat tgtttaacga actgaacctt ggacggcggg aagagtttga tgttttggag 420
aagaagcgcg cacgcgaccc tgagatgggt ggcaagcagc aacgccgacg aaaccctcaa 480
gagggtgttt acaatgccct gcaaaaggac aagatggcag aggcttatag cgaaatagga 540
acaaaggggg aacggagacg aggaaaggga catgatggac tttttcaggg gctctccaca 600
gccacaaagg atacattcga cgccttgcac atgcaaaccc ttgctcctag a 651
<210> 24
<211> 217
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 24
Ile Glu Phe Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Arg Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Ile Lys Glu Lys His Leu Cys His Thr Gln Ser
20 25 30
Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val Leu Phe
35 40 45
Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp Thr Asn
50 55 60
Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
65 70 75 80
Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala
85 90 95
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro Arg Ala Lys Phe Ser Arg Ser Ala
100 105 110
Glu Thr Ala Ala Asn Leu Gln Asp Pro Asn Gln Leu Phe Asn Glu Leu
115 120 125
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Phe Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg Ala
130 135 140
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Gln Gln Arg Arg Arg Asn Pro Gln
145 150 155 160
Glu Gly Val Tyr Asn Ala Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
165 170 175
Ser Glu Ile Gly Thr Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
180 185 190
Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe Asp Ala
195 200 205
Leu His Met Gln Thr Leu Ala Pro Arg
210 215
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 25
gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg 30
<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 26
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 27
actcattgtg gctgtggaga 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 28
ttgttcatct cggagcctgt 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 29
ctggggatgt ctgtagctca 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 30
ctgtgaagtc tcctctccgg 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 31
gattgcgggg ttgtatctgg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 32
gctttctttc agggacagcc 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 33
caactcccac tcttccacct 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 34
gagttgggat agggcctctc 20
<210> 35
<211> 720
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 35
ctgactcagc cgtcctcggt gtcagcgaac ccgggagaaa ccgtcgagat cacctgctcc 60
gggggtggca gctactatgg ctggtaccag cagaagtctc ctggcagtgc ccctgtcact 120
gtgatctata gcaacaacaa gagaccctcg gacatccctt cacgattctc cggttccaaa 180
tccggctcca caagcacatt aaccatcact ggggtccaag ccgacgacga ggctgtctat 240
tactgtggga gctacgacag caatgctggt atatttgggg ccgggacaac cctgaccgtc 300
ctaggtcagt cctctagatc ttccggcggt ggtggcagct ccggtggtgg cggttccgcc 360
gtgacgttgg acgagtccgg gggcggcctc cagacgcccg gaggagcact cagcctcgtc 420
tgcaaggcct ccgggttcac cttcagcagt tatgccatgg gttggatgcg ccaggcaccc 480
ggcaaggggc tggacttcgt cgctgaaatt agcggcagtg gcactagcac atactacggg 540
ccggcggtga agggccgtgc caccatctcg agggacaacg ggcggagcac agtgaggctg 600
cagctgaaca acctcagggc tgaggacacc ggcacctact tctgcacgag aggtggtggt 660
gctggtagtt acatcgacgc atggggccac gggaccgaag tcatcgtctc ctccactagt 720
<210> 36
<211> 240
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 36
Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val Glu
1 5 10 15
Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln Lys
20 25 30
Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Ser Asn Asn Lys Arg
35 40 45
Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Thr
50 55 60
Ser Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala Val Tyr
65 70 75 80
Tyr Cys Gly Ser Tyr Asp Ser Asn Ala Gly Ile Phe Gly Ala Gly Thr
85 90 95
Thr Leu Thr Val Leu Gly Gln Ser Ser Arg Ser Ser Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser
130 135 140
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Met Arg Gln Ala Pro
145 150 155 160
Gly Lys Gly Leu Asp Phe Val Ala Glu Ile Ser Gly Ser Gly Thr Ser
165 170 175
Thr Tyr Tyr Gly Pro Ala Val Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp
180 185 190
Asn Gly Arg Ser Thr Val Arg Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu
195 200 205
Asp Thr Gly Thr Tyr Phe Cys Thr Arg Gly Gly Gly Ala Gly Ser Tyr
210 215 220
Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Thr Ser
225 230 235 240
<210> 37
<211> 753
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 37
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccagagc agaagctgat cagcgaggag gacctgattg aagttatgta tcctcctcct 120
tacctagaca atgagaagag caatggaacc attatccatg tgaaagggaa acacctttgt 180
ccaagtcccc tatttcccgg accttctaag cccttttggg tgctggtggt ggttggggga 240
gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt 300
aagaggagca ggctcctgca cagtgactac atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc 360
acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca ccacgcgact tcgcagccta tcgctccaga 420
gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 480
aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 540
gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 600
ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 660
aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 720
gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgc 753
<210> 38
<211> 251
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 38
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
20 25 30
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
35 40 45
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
50 55 60
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
65 70 75 80
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
85 90 95
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
100 105 110
Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr
115 120 125
Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser
130 135 140
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
145 150 155 160
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
165 170 175
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
180 185 190
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
195 200 205
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
210 215 220
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
225 230 235 240
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
245 250
Claims (35)
- 보체 성분 4d(C4d)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질(ABP)을 포함하는, 유전적으로 변형된 조절 T 세포(Treg).
- 제 1 항에 있어서,
상기 항원 결합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 것인, 조절 T 세포.
- 제 2 항에 있어서,
상기 CAR은 C4d에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함하는 것인, 조절 T 세포.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 ABP, 상기 CAR 또는 상기 scFv는 하기를 포함하는 것인, 조절 T 세포:
하기를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL):
아미노산 서열 SGSSGSYG, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 LCDR1을 포함하는 상보성 결정 부위(CDR) 1;
아미노산 서열 YNDKRPS를 포함하는 LCDR2, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 LCDR2;
아미노산 서열 GSEDSSYVGV를 포함하는 LCDR3, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 LCDR3; 및
하기를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH):
아미노산 서열 SYALE을 포함하는 HCDR1, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 HCDR1;
아미노산 서열 GISSSGSGTNYGSAVKG를 포함하는 HCDR2, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 HCDR2;
아미노산 서열 AYGYVDAYGIDA를 포함하는 HCDR3, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 HCDR3.
- 제 4 항에 있어서,
상기 VL은 LTQPSSVSANPGGTVEITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYYNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTATLTITGVQAEDEAVYFCGSEDSSYVGVFGAGTTLTVL(SEQ ID NO: 2)와 95% 이상의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이고; 및
상기 VH는 AVTLDESGGGLQTPGGTLSLVCKGSGFTFRSYALEWVRQAPGKGLEYVAGISSSGSGTNYGSAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKSAYGYVDAYGIDAWGHGTEVIVSSTS(SEQ ID NO: 4)와 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조절 T 세포.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 ABP, 상기 CAR 또는 상기 scFv는 하기를 포함하는 것인, 조절 T 세포:
하기를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL):
아미노산 서열 SGGGRWYG를 포함하는 LCDR1, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 LCDR1;
아미노산 서열 HANTKRPS를 포함하는 LCDR2, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 LCDR2;
아미노산 서열 GSGDSSTDSGI를 포함하는 LCDR3, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 LCDR3; 및
하기를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH):
아미노산 서열 DRAMH를 포함하는 HCDR1, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 HCDR1;
아미노산 서열 GIYSSGRYTGYGSAVKG를 포함하는 HCDR2, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 HCDR2;
아미노산 서열 AGSIYCGYADVACIDA를 포함하는 HCDR3, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 HCDR3.
- 제 6 항에 있어서,
상기 VL은 LTQPSSVSANPGETVKITCSGGGRWYGWYQQKSPGSAPVTLIHANTKRPSNIPSRFSGSLSGSTSTLTISGVQAEDEAVYFCGSGDSSTDSGIFGAGTTLTVL(SEQ ID NO: 6)와 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이고; 및
상기 VH는 AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFSFSDRAMHWVRQAPGKGLEWVAGIYSSGRYTGYGSAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKAGSIYCGYADVACIDAWGHGTEVIVSSTS(SEQ ID NO: 8)와 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조절 T 세포.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 ABP, 상기 CAR 또는 상기 scFv가 하기를 포함하는 것인, 조절 T 세포:
하기를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL):
아미노산 서열 SGGGSYYG를 포함하는 LCDR1, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 LCDR1;
아미노산 서열 SNNKRPS를 포함하는 LCDR2, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 LCDR2;
아미노산 서열 GSYDSNAGI를 포함하는 LCDR3, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 LCDR3; 및
하기를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH):
아미노산 서열 SYAMG를 포함하는 HCDR1, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 HCDR1;
아미노산 서열 EISGSGTSTYYGPAVKG를 포함하는 HCDR2, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 HCDR2;
아미노산 서열 CTRGGGAGSYIDA를 포함하는 HCDR3, 또는 상기 서열에 대하여 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 아미노산이 치환된 변이체 HCDR3.
- 제 8 항에 있어서,
상기 VL은 LTQPSSVSANPGETVEITCSGGGSYYGWYQQKSPGSAPVTVIYSNNKRPSDIPSRFSGSKSGSTSTLTITGVQADDEAVYYCGSYDSNAGIFGAGTTLTVL와 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이며; 및
상기 VH는 AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSYAMGWMRQAPGKGLDFVAEISGSGTSTYYGPAVKGRATISRDNGRSTVRLQLNNLRAEDTGTYFCTRGGGAGSYIDAWGHGTEVIVSSTS와 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조절 T 세포.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 ABP, 상기 CAR 또는 상기 scFv는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, 또는 LTQPSSVSANPGETVEITCSGGGSYYGWYQQKSPGSAPVTVIYSNNKRPSDIPSRFSGSKSGSTSTLTITGVQADDEAVYYCGSYDSNAGIFGAGTTLTVL과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조절 T 세포.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 ABP, 상기 CAR 또는 상기 scFv는 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8, 또는 AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSYAMGWMRQAPGKGLDFVAEISGSGTSTYYGPAVKGRATISRDNGRSTVRLQLNNLRAEDTGTYFCTRGGGAGSYIDAWGHGTEVIVSSTS와 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조절 T 세포.
- 제 3 항에 있어서,
상기 scFv는 하기와 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조절 T 세포:
i) LTQPSSVSANPGGTVEITCSGSSGSYG WYQQKSPGSAPVTVIYYNDKRPS DIPSRFSGSKSGSTATLTITGVQAEDEAVYFCGSEDSSYVGV FGAGTTLTVL
GQSSRSSGGGGSSGGGGS
AVTLDESGGGLQTPGGTLSLVCKGSGFTFRSYALE WVRQAPGKGLEYVAGISSSGSGTNYGSAVKG RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKSAYGYVDAYGIDA WGHGTEVIVSSTS;
ii) LTQPSSVSANPGETVKITCSGGGRWYG WYQQKSPGSAPVTLIHANTKRPS NIPSRFSGSLSGSTSTLTISGVQAEDEAVYFCGSGDSSTDSGI FGAGTTLTVL
GQSSRSSGGGGSSGGGGS
AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFSFSDRAMH WVRQAPGKGLEWVAGIYSSGRYTGYGSAVKG RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKAGSIYCGYADVACIDA WGHGTEVIVSST; 또는
iii) LTQPSSVSANPGETVEITCSGGGSYYGWYQQKSPGSAPVTVIYSNNKRPSDIPSRFSGSKSGSTSTLTITGVQADDEAVYYCGSYDSNAGIFGAGTTLTVL
GQSSRSSGGGGSSGGGGS
AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSYAMGWMRQAPGKGLDFVAEISGSGTSTYYGPAVKGRATISRDNGRSTVRLQLNNLRAEDTGTYFCTRGGGAGSYIDAWGHGTEVIVSSTS.
- 제 2 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CAR은 리더 서열을 포함하는 것인, 조절 T 세포.
- 제 2 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CAR은 힌지 영역을 포함하는 것인, 조절 T 세포.
- 제 14 항에 있어서,
상기 힌지 영역은 인간 CD8 힌지 영역을 포함하는 것인, 조절 T 세포.
- 제 15 항에 있어서,
상기 힌지 영역은 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 10과 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인, 조절 T 세포.
- 제 2 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CAR은 CD28 막관통 도메인을 포함하는 것인, 조절 T 세포.
- 제 2 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CAR은 CD28 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 것인, 조절 T 세포.
- 제 18 항에 있어서,
상기 CD28 막관통 및 세포질 도메인은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 12와 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인, 조절 T 세포.
- 제 2 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CAR은 CD3 제타 세포질 도메인을 포함하는 것인, 조절 T 세포.
- 제 20 항에 있어서,
상기 CD3 제타 세포질 도메인은 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 14와 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인, 조절 T 세포.
- 제 2 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CAR은 c-myc 태그를 포함하는 것인, 조절 T 세포.
- 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는, 조절 T 세포.
- 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는, 벡터.
- 제 24 항에 있어서,
상기 벡터는 레트로바이러스 벡터인, 벡터.
- 제 24 항의 벡터를 포함하는, 세포.
- 제 26 항에 있어서,
상기 세포는 포유동물 세포 또는 세포주인, 세포.
- 제 24 항 또는 제 25 항의 벡터로 상기 조절 T 세포를 형질주입 또는 형질도입하는 것, 및 상기 항원 결합 단백질을 발현하는 Treg를 선택하는 것을 포함하는, 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 조절 T 세포를 생산하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항의 조절 T 세포를 C4d 항원과 접촉시키는 것을 포함하는, 면역 반응을 유도하는 in vitro 방법.
- 제 29 항에 있어서,
상기 조절 T 세포는 CD69 발현을 상향 조절(upregulate)하고 C4d에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 발현하지 않는 대조군 조절 T 세포와 비교하여 증가된 수준의 IL-10 및 IFN-γ를 분비하는 것인, 방법.
- 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항의 조절 T 세포를 활성화된 효과 T 세포(effector T cell)와 함께 배양하는 것 및 상기 효과 T 세포의 증식 감소를 측정하는 것을 포함하는, T 세포 증식을 억제하는 in vitro 방법.
- 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항의 조절 T 세포의 치료 유효량을 피험자에게 투여하는 것을 포함하는, 이식을 받는 피험자의 항체-매개 거부반응(ABMR)을 억제하는 방법.
- 제 32 항에 있어서,
상기 이식은 동종이식인 것인, 방법.
- 제 33 항에 있어서,
상기 동종이식은 ABO 혈액형 부적합(ABOi) 동종이식인 것인, 방법.
- 상기 동종이식은 심장 동종이식인 것인, 방법.
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