KR20230167920A - Cell-penetrating and amphiphilic novel cyclic peptoids and uses thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포-투과 및 양친매성의 신규 고리형 펩토이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종래 분자 수송체에 비해 세포 투과성 및 생체 안정성이 현저하게 향상된 신규 고리형 펩토이드를 골격으로 하는 분자 수송체 및 이의 제조방법을 제공한다.The present invention relates to a novel cell-permeable and amphipathic cyclic peptoid and its use. More specifically, the present invention relates to a novel cyclic peptoid with significantly improved cell permeability and biostability compared to conventional molecular transporters. A molecular transporter and a method for producing the same are provided.
Description
본 발명은 세포-투과 및 양친매성의 신규 고리형 펩토이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종래 분자 수송체에 비해 세포 투과성 및 생체 안정성이 현저하게 향상된 신규 고리형 펩토이드를 골격으로 하는 분자 수송체 및 이의 제조방법을 제공한다.The present invention relates to a novel cell-permeable and amphipathic cyclic peptoid and its use. More specifically, the present invention relates to a novel cyclic peptoid with significantly improved cell permeability and biostability compared to conventional molecular transporters. A molecular transporter and a method for producing the same are provided.
모든 생명체의 세포는 세포막을 이용해 세포 내의 소기관들이 존재하는 세포질을 보호하면서 외부환경과 경계를 짓게 된다. 세포막은 불필요한 분자가 세포내로 유입되는 것을 막으면서, 적당한 크기, 극성 및 전하를 띤 분자들은 통과시킨다. 따라서, 세포 내에 존재하는 타겟의 많은 약물들이나 화학 프로브들은 세포막을 투과해 세포 내 타겟까지 도달하는 것이 매우 중요하다. 하지만 생체 외(in vitro) 활성을 갖는 많은 약물 후보군들은 종종 낮은 세포 투과성을 보여 약물로써 사용하는 데 한계를 가지게 된다. 이에 따라, 생리활성 물질을 세포 내로 전달하기 위해 다양한 전달 방법들이 연구되었다.The cells of all living things use the cell membrane to protect the cytoplasm, where organelles exist, and establish a boundary with the external environment. The cell membrane prevents unwanted molecules from entering the cell, while allowing molecules of the appropriate size, polarity, and charge to pass through. Therefore, it is very important for many drugs or chemical probes targeting intracellular targets to penetrate the cell membrane and reach intracellular targets. However, many drug candidates with in vitro activity often show low cell permeability, which limits their use as drugs. Accordingly, various delivery methods have been studied to deliver bioactive substances into cells.
세포투과 펩타이드(Cell Penetrating Peptides: CPPs)는 일반적으로 양전하의 아르기닌이 다수 포함된 짧은 서열의 펩타이드이며, 다양한 기작을 통해 세포 내로 투과한다.(J. Biophys., 2011, 2011, 414729-414738.; Acc. Chem. Res., 2012, 45, 1132-1139.) 또한, 세포 투과성이 낮은 생리활성 물질에 CPP를 부착하면 세포 내 흡수가 크게 증가하게 된다. 1988년 프란켈(Frankel) 등이 HIV-1 트랜스작용인자(transactivator) 단백질로부터 TAT 펩타이드를 발견한 이후(Cell, 1988 , 55, 1189-1193; Cell, 1988, 55, 1179-1188), TAT 펩타이드를 모방하는 다른 서열의 다양한 양이온성 아르기닌을 포함하는 펩타이드들이나(J. Biol. Chem., 2001, 276, 5836-5840.; J. Biol. Chem., 1994, 269, 10444-10450.; Angew. Chem. Int. Ed., 2014, 53, 10086-10089.) β-펩타이드 구조의 세포투과 펩타이드들이 개발되었다. 하지만 이러한 세포투과 펩타이드는 세포 투과가 우수하지만, 펩타이드 골격은 생체 내 효소에 불안정한 문제점을 가지고 있다. Cell Penetrating Peptides (CPPs) are generally short-sequence peptides containing multiple positively charged arginines, and penetrate into cells through various mechanisms ( J. Biophys. , 2011 , 2011 , 414729-414738.; Acc. Chem. Res. , 2012 , 45 , 1132-1139.) Additionally, when CPP is attached to a bioactive material with low cell permeability, cellular uptake is greatly increased. After Frankel et al. discovered the TAT peptide from the HIV-1 transactivator protein in 1988 ( Cell, 1988 , 55, 1189-1193; Cell , 1988 , 55 , 1179-1188), the TAT peptide was Peptides containing various cationic arginines of different sequences that mimic ( J. Biol. Chem. , 2001 , 276 , 5836-5840.; J. Biol. Chem. , 1994 , 269 , 10444-10450.; Angew. Chem. . Int. Ed. , 2014 , 53 , 10086-10089.) Cell-penetrating peptides with a β-peptide structure have been developed. However, although these cell-penetrating peptides have excellent cell penetration, the peptide skeleton has the problem of being unstable to enzymes in vivo.
이러한 한계점을 극복하기 위해, 펩타이드 골격이 아닌 올리고카바메이트(oligocarbamate) (J. Am. Chem. Soc., 2002 , 124, 368-369.), 올리고포스포에스터(oligophosphoester) (J. Am. Chem. Soc., 2016, 138, 3510-3517.), α-AA펩타이드(Org. Biomol. Chem., 2012, 10, 1149-1153.), PNA 올리고머(J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 6878-6879.), 펩토이드 (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 13003-13008.; J. Med. Chem., 2008, 51, 376-379.; Bioconjug. Chem., 2018, 29, 1669-1676.)와 저분자 화합물(Angew. Chem. Int. Ed., 2018, 57, 17183-17188.; Nat. Methods., 2007, 4, 153-159.) 등을 이용한 다양한 CPP가 개발되었다. 이와 같이 다양한 세포투과 펩타이드나 펩타이드 유사체를 이용한 분자 수송체가 개발되었지만, 개발된 분자 수송체들은 세포 내에 존재하는 효소에 대해 불안정하거나, 합성에 많은 비용이 드는 문제점을 가지고 있다.To overcome these limitations, oligocarbamates ( J. Am. Chem. Soc., 2002 , 124 , 368-369.), oligophosphoesters ( J. Am. Chem. Soc. , 2016 , 138 , 3510-3517.), α-AA peptide ( Org. Biomol. Chem. , 2012 , 10 , 1149-1153.), PNA oligomer ( J. Am. Chem. Soc. , 2003 , 125 , 6878-6879.), peptoids ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 2000 , 97 , 13003-13008.; J. Med. Chem. , 2008 , 51 , 376-379.; Bioconjug. Chem. . , 2018 , 29 , 1669-1676.) and low molecular compounds ( Angew. Chem. Int. Ed. , 2018 , 57 , 17183-17188.; Nat. Methods. , 2007 , 4 , 153-159.), etc. Various CPPs have been developed. Although molecular transporters using various cell-penetrating peptides or peptide analogs have been developed, the developed molecular transporters have problems such as being unstable to enzymes present in cells or requiring high costs for synthesis.
이러한 펩타이드 계열의 분자 수송체의 문제점을 극복하기 위해 펩타이드 유사체 중 하나인 펩토이드(Peptoid, poly-N-substituted glycine)를 이용한 분자 수송체가 개발되었다. 펩토이드는 합성이 매우 쉽고, 효소에 대해 쉽게 분해되지 않으며, 펩타이드에 비해 세포 투과성이 높은 장점을 가지고 있다. 웬더(Wender) 등은 양이온 선형 펩토이드를 이용해 분자 수송체를 개발하였으며, 기존의 TAT 펩타이드보다 높은 세포 투과성을 보이는 것을 확인하였다.(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 13003-13008.) 이와 같이, 펩토이드는 펩타이드 유사체 계열의 분자 수송체로서 잠재적 가능성이 매우 높지만, 이 구조를 기반으로 구조적 변화를 통해 세포 투과 효율을 극대화시킨 분자 수송체를 개발한 사례가 없으며, 실제 약물을 전달하기 위한 수송체로서 적용한 사례도 전무하다.To overcome these problems with peptide-based molecular transporters, a molecular transporter using peptoid (poly- N -substituted glycine), one of the peptide analogs, was developed. Peptoids are very easy to synthesize, are not easily degraded by enzymes, and have the advantage of high cell permeability compared to peptides. Wender et al. developed a molecular transporter using a cationic linear peptoid and confirmed that it exhibited higher cell permeability than the existing TAT peptide ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 2000 , 97 , 13003 -13008.) As such, peptoids have great potential as a molecular transporter of the peptide analogue series, but there has been no case of developing a molecular transporter that maximizes cell penetration efficiency through structural changes based on this structure, and in practice, There are no cases of application as a transport vehicle for drug delivery.
한편, 거대 고리화 전략을 통해 펩타이드 및 펩타이드 유사체의 골격 구조를 견고하게 하여 세포 투과성이 증가한 결과가 보고되었다. 본 전략이 CPP에 적용된 예시로, 고리형 CPP가 선형 CPP에 비해 세포 투과성이 크게 향상된 바 있다.(Nat. commun., 2011, 2, 453.; ACS Chem. Biol., 2013, 8, 423-431.; Angew. Chem. Int. Ed., 2015, 54, 1950-1953.; Angew. Chem. Int. Ed., 2018, 57, 4756-4759.) 또한, 펩토이드의 경우, 고리형 펩토이드가 선형 펩토이드와 비교하여 더 높은 세포 투과성을 보이기도 하였다.(ACS Comb. Sci., 2018, 20, 237-242.)Meanwhile, results of increased cell permeability were reported by strengthening the framework structure of peptides and peptide analogs through a macrocyclization strategy. As an example of this strategy being applied to CPP, cyclic CPP has significantly improved cell permeability compared to linear CPP ( Nat. commun. , 2011 , 2 , 453.; ACS Chem. Biol. , 2013 , 8 , 423- 431.; Angew. Chem. Int. Ed. , 2015 , 54 , 1950-1953.; Angew. Chem. Int. Ed. , 2018 , 57 , 4756-4759.) Also, in the case of peptoids, cyclic peptides Toids also showed higher cell permeability compared to linear peptoids ( ACS Comb. Sci. , 2018 , 20 , 237-242.)
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 종래 분자 수송체에 비해 우수한 생체 내 안정성 및 세포 투과성을 가지면서, 합성이 매우 용이한 신규 고리형 펩토이드를 골격으로 하여 제조된 분자 수송체 화합물을 개발하고, 이를 이용하여 목적 카르고 (cargo of interest)를 효과적으로 수송할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. Under this background, the present inventors developed a molecular transporter compound prepared using a novel cyclic peptoid as a skeleton that is very easy to synthesize while having excellent in vivo stability and cell permeability compared to conventional molecular transporters, and used it as a molecular transporter compound. The present invention was completed by confirming that the target cargo (cargo of interest) can be transported effectively.
따라서, 본 발명은 종래 분자 수송체에 비해 우수한 생체 내 안정성 및 세포 투과성을 가지면서, 합성이 매우 용이한 신규 고리형 펩토이드를 제공하는 것을 목적으로 한다.Therefore, the purpose of the present invention is to provide a novel cyclic peptoid that is very easy to synthesize while having excellent in vivo stability and cell permeability compared to conventional molecular transporters.
본 발명의 다른 목적은 상기 고리형 펩토이드를 이용한 약물 전달체 및/또는 약물 운반용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a drug carrier and/or drug delivery composition using the cyclic peptoid.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 고리형 펩토이드의 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for producing the cyclic peptoid.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 고리형 펩토이드를 제공한다:In order to solve the above problems, the present invention provides a cyclic peptoid represented by the following formula (1):
[화학식 1][Formula 1]
-RaX1X2X3X4X5X6X7X8-NHC(Rb)HCONH2 -R a _ _ _ _ _ _ _ _ _
상기 화학식 1에서,In Formula 1,
X1, X2, 및 X3은 각각 독립적으로 존재하지 않거나, -C(=O)CH2N(Rc)- 또는 -C(=O)CH2N(Rd)-이고, 여기서, X1, X2, 및 X3은 모두 존재하지 않거나, X3이 존재하지 않는 경우 X1 및 X2는 존재할 수 없고, X2가 존재하지 않는 경우 X1이 존재할 수 없으며; X 1 , X 2 , and X 1 , X 2 , and X 3 cannot all exist, or if X 3 does not exist, then X 1 and
X4, X5, X6, X7 및 X8은 각각 독립적으로 -C(=O)CH2N(Rc)-일 수 있고;X 4 , X 5 , X 6 , X 7 and X 8 may each independently be -C(=O)CH 2 N(R c )-;
Ra는 트리아진기일 수 있으며;R a may be a triazine group;
Rb는 -(CH2)(S)-일 수 있고;R b may be -(CH 2 )(S)-;
Rc는 -NHC(=NH)NH2로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 C2-10 알킬기일 수 있으며;R c may be a straight or branched C 2-10 alkyl group substituted with -NHC(=NH)NH 2 ;
Rd는 하나 이상의 Re로 치환되는 C1-6 직쇄 또는 분지쇄 알킬기이거나, 또는 O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 C5-10 헤테로 아릴기로 치환되는 C1-6 직쇄 또는 분지쇄 알킬기일 수 있고;R d is a C 1-6 straight or branched chain alkyl group substituted with one or more R e , or C substituted with a C 5-10 heteroaryl group containing one or more heteroatoms selected from the group consisting of O, N and S. 1-6 may be a straight or branched chain alkyl group;
Re는 하나 이상의 할로겐으로 치환된 C1-6 직쇄형 알킬기로 치환되는 C6-14 아릴기이거나, 또는 치환되지 않은 C6-14 아릴기일 수 있으며;R e may be a C 6-14 aryl group substituted with a C 1-6 straight-chain alkyl group substituted with one or more halogens, or an unsubstituted C 6-14 aryl group;
Ra와 Rb는 서로 연결될 수 있다.R a and R b can be connected to each other.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 Ra의 트리아진기와 상기 Rb의 -(CH2)(S)-는 탄소-황 결합을 통해 연결될 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the triazine group of R a and -(CH 2 )(S)- of R b may be connected through a carbon-sulfur bond.
본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, According to another preferred embodiment of the present invention,
상기 화학식 1에서,In Formula 1,
X1, X2 및 X3은 각각 독립적으로 존재하지 않거나, N-(2-에틸구아니딘)글리신 (Netg), N-(4-부틸구아니딘)글리신 (Nbtg), N-(6-헥실구아니딘)글리신 (Nhxg), N-(페닐메틸)글리신 (Npm), N-(나프틸메틸)글리신 (Nnaph), N-(2-인돌에틸)글리신 (Ntrp), N-(디페닐에틸)글리신 (Ndp), N-(트리플루오로메틸벤질)글리신 (Ntfmbn) 또는 N-(피페로닐)글리신 (Npip)일 수 있고, 여기서, X1, X2, 및 X3은 모두 존재하지 않거나, X3이 존재하지 않는 경우 X1 및 X2는 존재할 수 없고, X2가 존재하지 않는 경우 X1이 존재할 수 없으며;X 1 , X 2 and Glycine (Nhxg), N-(phenylmethyl)glycine (Npm), N-(naphthylmethyl)glycine (Nnaph), N-(2-indolethyl)glycine (Ntrp), N-(diphenylethyl)glycine ( Ndp), N-(trifluoromethylbenzyl)glycine (Ntfmbn) or N-(piperonyl)glycine (Npip), where X 1 , X 2 , and X 3 are all absent, or If 3 does not exist, then X 1 and X 2 cannot exist, and if X 2 does not exist, then X 1 cannot exist;
X4, X5, X6, X7 및 X8은 각각 독립적으로 N-(2-에틸구아니딘)글리신, N-(4-부틸구아니딘)글리신 또는 N-(6-헥실구아니딘)글리신일 수 있다.X 4 , X 5 , X 6 , X 7 and .
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 고리형 펩토이드는:According to another preferred embodiment of the present invention, the cyclic peptoid is:
[화학식 2][Formula 2]
-Ra-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-NHC(Rb)HCONH2 -R a -Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-NHC(R b )HCONH 2
[화학식 3][Formula 3]
-Ra-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-NHC(Rb)HCONH2;-R a -Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[화학식 4][Formula 4]
-Ra-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-NHC(Rb)HCONH2;-R a -Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[화학식 5] [Formula 5]
-Ra-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-NHC(Rb)HCONH2;-R a -Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[화학식 6] [Formula 6]
-Ra-Netg-Netg-Netg-Netg-Netg-Netg-Netg-Netg-NHC(Rb)HCONH2;-R a -Netg-Netg-Netg-Netg-Netg-Netg-Netg-Netg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[화학식 7] [Formula 7]
-Ra-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2; -R a -Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[화학식 8][Formula 8]
-Ra-Npm-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2;-R a -Npm-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[화학식 9] [Formula 9]
-Ra-Npm-Npm-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2;-R a -Npm-Npm-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[화학식 10] [Formula 10]
-Ra-Npm-Npm-Npm-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2;-R a -Npm-Npm-Npm-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[화학식 11] [Formula 11]
-Ra-Npm-Nnaph-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2;-R a -Npm-Nnaph-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[화학식 12] [Formula 12]
-Ra-Npm-Ntrp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2;-R a -Npm-Ntrp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[화학식 13] [Formula 13]
-Ra-Npm-Ndp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2;-R a -Npm-Ndp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[화학식 14] [Formula 14]
-Ra-Ndp-Ndp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2;-R a -Ndp-Ndp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[화학식 15] [Formula 15]
-Ra-Ntfmbn-Ndp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2; 또는-R a -Ntfmbn-Ndp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ; or
[화학식 16][Formula 16]
-Ra-Npip-Ndp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2;로 표시될 수 있고;-R a -Npip-Ndp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ;;
상기 화학식 2 내지 16에서,In Formulas 2 to 16,
Ra는 트리아진기일 수 있고;R a may be a triazine group;
Rb는 -(CH2)(S)-일 수 있으며;R b may be -(CH 2 )(S)-;
Ra와 Rb는 서로 연결될 수 있다.R a and R b can be connected to each other.
본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 트리아진기에 목적 카르고 (cargo of interest)가 결합될 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, a cargo of interest may be bonded to the triazine group.
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 목적 카르고는 화학물질, 나노입자, 펩타이드, 폴리펩타이드, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, 및 PNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the target cargo may include one or more selected from the group consisting of chemicals, nanoparticles, peptides, polypeptides, antisense oligonucleotides, siRNA, shRNA, and PNA. there is.
본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 고리형 펩토이드는 세포질로 투과되는 특성을 가질 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the cyclic peptoid may have the property of permeating into the cytoplasm.
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 고리형 펩토이드는 목적 카르고를 세포 또는 조직 내로 전달하는 특성을 가질 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the cyclic peptoid may have the property of delivering the target cargo into cells or tissues.
본 발명은 또한, (a) 전술한 다양한 형태의 고리형 펩토이드; 및 (b) 상기 고리형 펩토이드에 결합되는 목적 카르고 (cargo of interest)를 포함하는 약물 전달체를 제공한다.The present invention also provides (a) the various types of cyclic peptoids described above; and (b) a cargo of interest bound to the cyclic peptoid.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 목적 카르고 (cargo of interest)는 고리형 펩토이드의 트리아진기에 결합될 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the cargo of interest may be bound to a triazine group of a cyclic peptoid.
본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 목적 카르고는 상기 트리아진기에 공유결합되거나 비공유결합될 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the target cargo may be covalently or non-covalently bound to the triazine group.
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 목적 카르고는 링커를 통해 트리아진기에 결합될 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the target cargo may be bound to a triazine group through a linker.
본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 링커는 상기 고리형 펩토이드와 상기 목적 카르고에 결합되는 형광성 모이어티를 추가로 포함할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the linker may further include a fluorescent moiety bound to the cyclic peptoid and the target cargo.
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 약물 전달체는:According to another preferred embodiment of the present invention, the drug delivery system is:
, ,
, ,
, ,
, ,
, ,
, ,
, ,
, ,
, ,
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, ,
, ,
, ,
또는 or
일 수 있고, It can be,
여기서, 트리아진기에 결합된 R은 목적 카르고일 수 있다.Here, R bound to the triazine group may be the target cargo.
본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 목적 카르고는 화학물질, 나노입자, 펩타이드, 폴리펩타이드, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, 및 PNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the target cargo may include one or more selected from the group consisting of chemicals, nanoparticles, peptides, polypeptides, antisense oligonucleotides, siRNA, shRNA, and PNA. .
추가로, 본 발명은 전술한 다양한 형태의 약물 전달체를 포함하는, 목적 카르고 운반용 조성물을 제공한다.Additionally, the present invention provides a composition for transporting the target cargo, comprising the various types of drug carriers described above.
나아가, 본 발명은 하기 화학식 17로 표시되는 선형 펩토이드를 트리아진을 포함하는 화합물과 반응시켜 고리화 반응을 통해 연결하는 단계를 포함하는, 고리형 펩토이드의 제조방법을 제공한다:Furthermore, the present invention provides a method for producing a cyclic peptoid, comprising the step of reacting a linear peptoid represented by the following formula (17) with a compound containing a triazine and linking it through a cyclization reaction:
[화학식 17][Formula 17]
-X1X2X3X4X5X6X7X8-NHC(Rb)HCONH- -X 1 _ _ _ _ _ _ _
상기 화학식 17에서,In Formula 17 above,
X1, X2, 및 X3은 각각 독립적으로 존재하지 않거나, -C(=O)CH2N(Rc)- 또는 -C(=O)CH2N(Rd)-이고, 여기서, X1, X2, 및 X3은 모두 존재하지 않거나, X3이 존재하지 않는 경우 X1 및 X2는 존재할 수 없고, X2가 존재하지 않는 경우 X1이 존재할 수 없고; X 1 , X 2 , and X 1 , X 2 , and X 3 cannot all exist, or if X 3 does not exist, then X 1 and
X4, X5, X6, X7 및 X8은 각각 독립적으로 -C(=O)CH2N(Rc)-일 수 있으며;X 4 , X 5 , X 6 , X 7 and X 8 may each independently be -C(=O)CH 2 N(R c )-;
Rb는 트리틸 (Trt), 디페닐메틸 (Dpm), 테트라하이드로피라닐 (Thp), tert-부틸 (tBu), 4-메톡시벤질 (Mob), 메틸벤질 (Meb), 1-아다만틸 (Ad), 벤질옥시메틸 (Bom), 2,4,6-트리메톡시벤질 (Tmob), 4,4′,4′′,-트리메톡시-트리페닐메틸 (TMTr), 4-메틸트리틸 (Mtt), 4-메톡시트리틸 (Mmt), 9H-크산텐-9-일 (Xan), 2-메톡시-9H-크산텐-9-일 (2-Moxan), 4,5,6-트리메톡시-2,2-디메틸-2,3-디하이드로벤조퓨란-7-메틸 (Tmbm), 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-메틸 (Pmcm), 2,2,4,6,7-펜타메틸-2,3-디하이드로벤조퓨란-5-메틸 (Pbfm), 4-메톡시벤질옥시메틸 (Mbom), 2,6-디메톡시벤질 (2,6-diMeOBn), 4-메톡시-2-메틸벤질 (4-MeO-2MeBn) 및 4,4′-디메톡시디페닐메틸 (Ddm)로 이루어진 군으로부터 선택되는 보호기로 보호된 -(CH2)(S)-일 수 있고;R b is trityl (Trt), diphenylmethyl (Dpm), tetrahydropyranyl (Thp), tert-butyl (tBu), 4-methoxybenzyl (Mob), methylbenzyl (Meb), 1-adamane Til (Ad), benzyloxymethyl (Bom), 2,4,6-trimethoxybenzyl (Tmob), 4,4′,4′′,-trimethoxy-triphenylmethyl (TMTr), 4-methyl Trityl (Mtt), 4-methoxytrityl (Mmt), 9H-xanthen-9-yl (Xan), 2-methoxy-9H-xanthen-9-yl (2-Moxan), 4,5 ,6-trimethoxy-2,2-dimethyl-2,3-dihydrobenzofuran-7-methyl (Tmbm), 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-methyl (Pmcm) , 2,2,4,6,7-pentamethyl-2,3-dihydrobenzofuran-5-methyl (Pbfm), 4-methoxybenzyloxymethyl (Mbom), 2,6-dimethoxybenzyl (2 -(CH 2 protected with a protecting group selected from the group consisting of ,6-diMeOBn), 4-methoxy-2-methylbenzyl (4-MeO-2MeBn) and 4,4′-dimethoxydiphenylmethyl (Ddm) )(S)-;
Rc는 -NHC(=NH)NH2로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 C2-10 알킬기일 수 있으며;R c may be a straight or branched C 2-10 alkyl group substituted with -NHC(=NH)NH 2 ;
Rd는 하나 이상의 Re로 치환되는 C1-6 직쇄 또는 분지쇄 알킬기이거나, 또는 O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 C6-10 헤테로 아릴기로 치환되는 C1-6 직쇄 또는 분지쇄 알킬기일 수 있고;R d is a C 1-6 straight or branched chain alkyl group substituted with one or more R e , or C substituted with a C 6-10 heteroaryl group containing one or more heteroatoms selected from the group consisting of O, N and S. 1-6 may be a straight or branched chain alkyl group;
Re는 하나 이상의 할로겐으로 치환된 C1-6 직쇄형 알킬기로 치환되는 C6-14 아릴기이거나, 또는 치환되지 않은 C6-14 아릴기일 수 있으며;R e may be a C 6-14 aryl group substituted with a C 1-6 straight-chain alkyl group substituted with one or more halogens, or an unsubstituted C 6-14 aryl group;
N-말단은 알릴옥시카르보닐 (Alloc), 노실 (Nosyl), 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소 사이클로헥스-1-일리덴)에틸 (Dde), 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 트리페닐메틸(트리틸) (Trt)의 화학적 보호기로 보호될 수 있고;N-terminus is allyloxycarbonyl (Alloc), Nosyl, 1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxo cyclohex-1-ylidene)ethyl (Dde), 9-fluorenylme may be protected with a chemical protecting group of toxycarbonyl (Fmoc) or triphenylmethyl(trityl) (Trt);
상기 트리아진을 포함하는 화합물은 X1의 N-말단에 결합하여, 상기 Rb로부터 보호기가 제거된 후의 -(CH2)SH에서 -SH와 탄소-황 결합을 통해 연결될 수 있다.The compound containing the triazine may be bound to the N-terminus of
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 트리아진을 포함하는 화합물은 하기 화학식 18로 표시될 수 있다:According to a preferred embodiment of the present invention, the compound containing the triazine may be represented by the following formula (18):
[화학식 18][Formula 18]
상기 화학식 18에서,In Formula 18 above,
2개의 X는 각각 독립적으로 클로로 (Chloro) 및 브로모 (Bromo) 또는 아이오도 (Iodo)일 수 있고;Each of the two X's may independently be Chloro and Bromo or Iodo;
R은 수소, 할로겐, C1-4알킬아미노 또는 C1-2알킬티오일 수 있다.R may be hydrogen, halogen, C 1-4 alkylamino, or C 1-2 alkylthio.
본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 화학식 17로 표시되는 선형 펩토이드를 트리아진을 포함하는 화합물과 반응시켜 고리화 반응을 통해 연결하는 단계에는 디이소프로필에틸아민(Diisopropylethylamine, DIPEA)가 함께 처리될 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, in the step of reacting the linear peptoid represented by Formula 17 with a compound containing triazine and linking it through a cyclization reaction, diisopropylethylamine (DIPEA) is used. can be processed together.
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 트리아진을 포함하는 화합물과 반응시킨 후, 상기 Rb의 트리틸기 (Trt)를 제거하기 위해 디클로로메탄 (Dichloromethane, DCM)에서 트리플루오로아세트산 (Trifluoroacetic acid, TFA) 및 트리이소프로필실란(triisopropylsilane, TIS 또는 TIPS)를 처리하여 반응시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, after reacting with the compound containing the triazine, trifluoroacetic acid (Dichloromethane, DCM) to remove the trityl group (Trt) of R b It may further include the step of treating and reacting with trifluoroacetic acid (TFA) and triisopropylsilane (TIS or TIPS).
본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 Trt을 제거하기 위한 반응 후에, 레진 상의 트리아진이 포함된 펩토이드를 디메틸포름아미드 (dimethyl formamide, DMF) 용매에서 DIPEA과 반응시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, after the reaction to remove Trt, the step of reacting the peptoid containing triazine on the resin with DIPEA in a dimethyl formamide (DMF) solvent is further included. can do.
본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 트리아진을 포함하는 화합물이 염화시아누르인 경우, 상기 선형 펩토이드가 염화시아누르로 고리화된 후, 트리아진에 결합된 염소를 C1-4 알킬아민 또는 C1-2 알킬티올로 치환된 1차 아민으로 치환할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, when the compound containing the triazine is cyanuric chloride, after the linear peptoid is cyclized with cyanuric chloride, the chlorine bound to the triazine is C 1-4 It may be substituted with an alkylamine or a primary amine substituted with a C 1-2 alkylthiol.
골격구조에 양이온성 또는 소수성 작용기를 도입하여 제조된 본 발명에 따른 고리형 펩토이드는 종래에 개발된 세포-투과 펩타이드들과 비교하여 세포막 투과성이 월등히 우수하며, 생체내 안정성 또한 매우 우수하므로, 세포막 투과가 어려워 의약품으로 개발하기 어려웠던 치료용 또는 진단용 물질에 결합시켜 세포, 조직, 장기 내로 효과적으로 수송할 수 있는 분자 수송체로서의 활용 가치가 매우 높다.The cyclic peptoid according to the present invention, manufactured by introducing a cationic or hydrophobic functional group into the framework structure, has significantly better cell membrane permeability compared to conventionally developed cell-penetrating peptides, and has excellent in vivo stability, so it can penetrate the cell membrane. It has great utility as a molecular transporter that can be effectively transported into cells, tissues, and organs by binding to therapeutic or diagnostic substances that were difficult to develop into pharmaceuticals due to difficulty in penetrating.
도 1은 본 발명에 따른 형광이 표지된 고리형 펩토이드의 합성 방법을 나타낸다.
도 2a 내지 2d는 도 1의 합성 방법으로 수득된 4종의 선형 펩토이드 L1 내지 L4의 MS 및 LC 데이터를 나타내고, 도 2e 내지 2h는 도 1의 합성 방법으로 수득된 4종의 고리형 펩토이드 C1 내지 C4의 MS 및 LC 데이터를 나타내며, 도 2i는 선형 펩토이드 L1 내지 L4 및 고리형 펩토이드 C1 내지 C4의 세포막 투과도를 형광 강도로 비교하여 나타낸 것이다.
도 3a 및 3b는 도 1의 합성 방법으로 수득된 2종의 고리형 펩토이드 C5 및 C6의 MS 및 LC 데이터를 나타내고, 도 3c는 고리형 펩토이드 C4 내지 C6의 세포막 투과성을 형광 강도로 비교하여 나타낸 것이다.
도 4a 내지 4i는 도 1의 합성 방법으로 수득된 9종의 고리형 펩토이드 C7 내지 C15의 MS 및 LC 데이터를 나타내고, 도 4j는 고리형 펩토이드 C6 내지 C15 및 아르기닌 8량체 R8의 세포막 투과성을 형광 강도로 비교하여 나타낸 것이다.
도 5는 고리형 펩토이드의 세포투과 메커니즘을 확인하기 위해, 조건별 (4 ℃ 조건 또는 아자이드화 나트륨이 첨가된 배지에서 37 ℃, 5 % CO2 조건)로 고리형 펩토이드 C15 및 아르기닌 8량체 R8을 각각 A549 세포에 처리한 후 세포 투과도를 형광 강도로 비교하여 나타낸 것이다.
도 6은 고리형 펩토이드 C15와 아르기닌 8량체 R8의 트립신 내 안정성을 비교하여 나타낸 것이다.
도 7a는 PIP-box 펩타이드 (SAVLQKKITDYFHPKK)의 MS 및 LC 데이터를 나타내고, 도 7b는 시스테인기를 포함하는 아르기닌 8량체 C-R8의 MS 및 LC 데이터를 나타내고, 도 7c는 티올기를 포함하는 고리형 펩토이드 HS-C15의 MS 및 LC 데이터를 나타내며, 도 7d는 PIP-Box 펩타이드-R8 결합체의 MS 및 LC 데이터를 나타내며, 도 7e는 PIP-Box 펩타이드-C15 결합체의 MS 및 LC 데이터를 나타내고, 도 7f는 PIP-box 펩타이드, PIP-Box 펩타이드-R8 결합체 및 PIP-Box 펩타이드-C15 결합체를 각각 처리한 HeLa 세포 또는 A549 세포의 세포 생존율을 비교하여 나타낸 것이며, 도 7g는 고리형 펩토이드 C15, PIP-Box 펩타이드 및 PIP-Box 펩타이드-C15 결합체를 각각 처리한 HeLa 세포의 아넥신-V 세포사멸 분석 (Annexin-V Apoptosis assay) 결과를 나타낸 것이다.Figure 1 shows a method for synthesizing fluorescently labeled cyclic peptoids according to the present invention.
Figures 2A to 2D show MS and LC data of four types of linear peptoids L1 to L4 obtained by the synthesis method of Figure 1, and Figures 2E to 2H show four types of cyclic peptides obtained by the synthesis method of Figure 1. MS and LC data of peptoids C1 to C4 are shown, and Figure 2i shows a comparison of the cell membrane permeability of linear peptoids L1 to L4 and cyclic peptoids C1 to C4 in terms of fluorescence intensity.
Figures 3a and 3b show MS and LC data of two types of cyclic peptoids C5 and C6 obtained by the synthesis method of Figure 1, and Figure 3c shows the cell membrane permeability of cyclic peptoids C4 to C6 in terms of fluorescence intensity. It is shown by comparison.
Figures 4a to 4i show MS and LC data of nine types of cyclic peptoids C7 to C15 obtained by the synthesis method of Figure 1, and Figure 4j shows the cell membrane of cyclic peptoids C6 to C15 and arginine octamer R8. Permeability is expressed by comparing fluorescence intensity.
Figure 5 shows the cell permeation mechanism of cyclic peptoids, cyclic peptoids C15 and The cell permeability was compared by fluorescence intensity after treating each A549 cell with arginine octamer R8.
Figure 6 shows a comparison of the stability of cyclic peptoid C15 and arginine octamer R8 in trypsin.
Figure 7a shows the MS and LC data of the PIP-box peptide (SAVLQKKITDYFHPKK), Figure 7b shows the MS and LC data of the arginine octamer C-R8 containing a cysteine group, and Figure 7c shows the cyclic peptoy containing a thiol group. Figure 7d shows MS and LC data of HS-C15, Figure 7d shows MS and LC data of PIP-Box peptide-R8 conjugate, Figure 7e shows MS and LC data of PIP-Box peptide-C15 conjugate, Figure 7f shows a comparison of the cell survival rates of HeLa cells or A549 cells treated with PIP-box peptide, PIP-Box peptide-R8 conjugate, and PIP-Box peptide-C15 conjugate, respectively, and Figure 7g shows cyclic peptoid C15, PIP This shows the results of Annexin-V Apoptosis assay of HeLa cells treated with -Box peptide and PIP-Box peptide-C15 conjugate, respectively.
상술한 바와 같이, 다양한 세포투과 펩타이드나 펩타이드 유사체를 이용한 분자 수송체가 개발되었지만, 개발된 분자 수송체들은 세포 내에 존재하는 효소에 대해 불안정하거나, 합성에 많은 비용이 드는 문제점을 가지고 있다. 또한, 펩토이드는 펩타이드 유사체 계열의 분자 수송체로서 잠재적 가능성이 매우 높지만, 이 구조를 기반으로 구조적 변화를 통해 세포 투과 효율을 극대화시킨 분자 수송체를 개발한 사례가 없으며, 실제 약물을 전달하기 위한 수송체로서 적용한 사례도 전무한 실정이다. 이에 본 발명자들은 종래 분자 수송체에 비해 우수한 생체 내 안정성 및 세포 투과성을 가지면서, 합성이 매우 용이한 신규 고리형 펩토이드를 골격으로 하여 제조된 분자 수송체 화합물을 개발하고, 이를 이용하여 목적 카르고 (cargo of interest)를 효과적으로 수송할 수 있음을 확인함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다.As described above, molecular transporters using various cell-penetrating peptides or peptide analogs have been developed, but the developed molecular transporters have problems such as being unstable to enzymes present in cells or requiring high costs for synthesis. In addition, peptoids have great potential as a molecular transporter of the peptide analog family, but there has been no case of developing a molecular transporter that maximizes cell penetration efficiency through structural changes based on this structure, and there is no case for developing a molecular transporter that maximizes cell penetration efficiency through structural changes based on this structure. There are no cases of application as a transport vehicle. Accordingly, the present inventors developed a molecular transporter compound prepared using a novel cyclic peptoid as a framework that is very easy to synthesize while having excellent in vivo stability and cell permeability compared to conventional molecular transporters, and used it to A solution to the above-mentioned problem was sought by confirming that cargo of interest could be transported effectively.
본 발명에 따른 고리형 펩토이드는 골격구조에 양이온성 또는 소수성 작용기가 도입되어, 종래에 개발된 세포-투과 펩타이드들과 비교하여 세포막 투과성이 월등히 우수하며, 생체내 안정성 또한 매우 우수하므로, 세포막 투과가 어려워 의약품으로 개발하기 어려웠던 치료용 또는 진단용 물질에 결합시켜 세포, 조직, 장기 내로 효과적으로 수송할 수 있는 분자 수송체로서 사용하기에 적합하다.The cyclic peptoid according to the present invention has a cationic or hydrophobic functional group introduced into the framework structure, and has significantly better cell membrane permeability compared to conventionally developed cell-penetrating peptides. It also has excellent in vivo stability, so it can penetrate the cell membrane. It is suitable for use as a molecular transporter that can be effectively transported into cells, tissues, and organs by binding to therapeutic or diagnostic substances that have been difficult to develop into pharmaceuticals.
따라서, 본 발명의 제1 측면은 하기 화학식 1로 표시되는 고리형 펩토이드에 관한 것이다:Accordingly, a first aspect of the present invention relates to a cyclic peptoid represented by the formula (1):
[화학식 1][Formula 1]
-RaX1X2X3X4X5X6X7X8-NHC(Rb)HCONH2 -R a _ _ _ _ _ _ _ _ _
상기 화학식 1에서,In Formula 1,
X1, X2, 및 X3은 각각 독립적으로 존재하지 않거나, -C(=O)CH2N(Rc)- 또는 -C(=O)CH2N(Rd)-이고, 여기서, X1, X2, 및 X3은 모두 존재하지 않거나, X3이 존재하지 않는 경우 X1 및 X2는 존재할 수 없고, X2가 존재하지 않는 경우 X1이 존재할 수 없으며; X 1 , X 2 , and X 1 , X 2 , and X 3 cannot all exist, or if X 3 does not exist, then X 1 and
X4, X5, X6, X7 및 X8은 각각 독립적으로 -C(=O)CH2N(Rc)-일 수 있고;X 4 , X 5 , X 6 , X 7 and X 8 may each independently be -C(=O)CH 2 N(R c )-;
Ra는 트리아진기일 수 있으며;R a may be a triazine group;
Rb는 -(CH2)(S)-일 수 있고;R b may be -(CH 2 )(S)-;
Rc는 -NHC(=NH)NH2로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 C2-10 알킬기일 수 있으며;R c may be a straight or branched C 2-10 alkyl group substituted with -NHC(=NH)NH 2 ;
Rd는 하나 이상의 Re로 치환되는 C1-6 직쇄 또는 분지쇄 알킬기이거나, 또는 O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 C5-10 헤테로 아릴기로 치환되는 C1-6 직쇄 또는 분지쇄 알킬기일 수 있고;R d is a C 1-6 straight or branched chain alkyl group substituted with one or more R e , or C substituted with a C 5-10 heteroaryl group containing one or more heteroatoms selected from the group consisting of O, N and S. 1-6 may be a straight or branched chain alkyl group;
Re는 하나 이상의 할로겐으로 치환된 C1-6 직쇄형 알킬기로 치환되는 C6-14 아릴기이거나, 또는 치환되지 않은 C6-14 아릴기일 수 있으며;R e may be a C 6-14 aryl group substituted with a C 1-6 straight-chain alkyl group substituted with one or more halogens, or an unsubstituted C 6-14 aryl group;
Ra와 Rb는 서로 연결될 수 있다.R a and R b can be connected to each other.
본 발명에서 용어 "알킬"은 직쇄 또는 분지쇄 알킬 라디칼을 지칭한다. 상기 Rc의 직쇄 또는 분지쇄 C2-10 알킬기의 예로는 에틸, 프로필, 1-메틸에틸, 부틸, 1-메틸프로필, 2-메틸프로필, 펜틸, 1-메틸부틸, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, 1,1-디메틸프로필, 1,2-디메틸프로필, 2,2-디메틸프로필, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 Rd 및 Re의 직쇄 또는 분지쇄 C1-6 알킬기의 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 1-메틸에틸, 부틸, 1-메틸프로필, 2-메틸프로필, 펜틸, 1-메틸부틸, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, 1,1-디메틸프로필, 1,2-디메틸프로필, 2,2-디메틸프로필, 헥실 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.As used herein, the term “alkyl” refers to a straight or branched chain alkyl radical. Examples of the straight or branched C 2-10 alkyl group of R c include ethyl, propyl, 1-methylethyl, butyl, 1-methylpropyl, 2-methylpropyl, pentyl, 1-methylbutyl, 2-methylbutyl, 3 -Includes, but is not limited to, methylbutyl, 1,1-dimethylpropyl, 1,2-dimethylpropyl, 2,2-dimethylpropyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, etc. Examples of the straight-chain or branched C 1-6 alkyl groups of R d and R e include methyl, ethyl, propyl, 1-methylethyl, butyl, 1-methylpropyl, 2-methylpropyl, pentyl, 1-methylbutyl, 2 -Includes, but is not limited to, methylbutyl, 3-methylbutyl, 1,1-dimethylpropyl, 1,2-dimethylpropyl, 2,2-dimethylpropyl, hexyl, etc.
본 발명에서 용어 "아릴"은 단일 또는 융합된 방향족 고리를 의미하며, 상기 단일 방향족 고리는 예를 들어, 페닐, 치환된 페닐, 바이페닐일 수 있으나, 이로 한정되지 않으며, 상기 융합된 방향족 고리는 예를 들어, 나프틸, 페난트레닐일 수 있으나, 이로 한정되지 않는다.In the present invention, the term "aryl" refers to a single or fused aromatic ring, and the single aromatic ring may be, for example, phenyl, substituted phenyl, or biphenyl, but is not limited thereto, and the fused aromatic ring may be For example, it may be naphthyl or phenanthrenyl, but is not limited thereto.
본 발명에서 용어 "헤테로아릴"은 방향족 고리에 적어도 하나의 헤테로원자 S, O 또는 N을 포함하는 방향족 그룹을 의미한다. 예를 들어, 헤테로아릴은 적어도 하나의 O, S 또는 N을 함유하는, 5 또는 6개의 고리 원자를 갖는 단일 방향족 고리, 또는 O, S 또는 N을 함유하는, 8 내지 10개의 고리 원자를 갖는 융합된 방향족 고리를 포함하며, 구체적으로, 피롤릴, 피리딜, 인돌릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 옥사지닐, 퓨라닐, 피페로닐 수 있으나, 이로 한정되지 않는다.As used herein, the term “heteroaryl” refers to an aromatic group containing at least one heteroatom S, O or N in the aromatic ring. For example, heteroaryl is a single aromatic ring with 5 or 6 ring atoms, containing at least one O, S, or N, or a fused ring with 8 to 10 ring atoms, containing O, S, or N. It includes an aromatic ring, specifically, pyrrolyl, pyridyl, indolyl, oxazolyl, thiazolyl, oxazinyl, furanyl, and piperonyl, but is not limited thereto.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 Ra의 트리아진기와 상기 Rb의 -(CH2)(S)-는 탄소-황 결합을 통해 연결될 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the triazine group of R a and -(CH 2 )(S)- of R b may be connected through a carbon-sulfur bond.
본 발명의 고리형 펩토이드에 있어서, 상기 X1, X2 및 X3은 각각 독립적으로 존재하지 않거나, N-(2-에틸구아니딘)글리신 (Netg), N-(4-부틸구아니딘)글리신 (Nbtg), N-(6-헥실구아니딘)글리신 (Nhxg), N-(페닐메틸)글리신 (Npm), N-(나프틸메틸)글리신 (Nnaph), N-(2-인돌에틸)글리신 (Ntrp), N-(디페닐에틸)글리신 (Ndp), N-(트리플루오로메틸벤질)글리신 (Ntfmbn) 또는 N-(피페로닐)글리신 (Npip)일 수 있고, 여기서, X1, X2, 및 X3은 모두 존재하지 않거나, X3이 존재하지 않는 경우 X1 및 X2는 존재할 수 없고, X2가 존재하지 않는 경우 X1이 존재할 수 없으며;In the cyclic peptoid of the present invention, X 1 , X 2 and (Nbtg), N-(6-hexylguanidine)glycine (Nhxg), N-(phenylmethyl)glycine (Npm), N-(naphthylmethyl)glycine (Nnaph), N-(2-indoleethyl)glycine ( Ntrp), N-(diphenylethyl)glycine (Ndp), N-(trifluoromethylbenzyl)glycine (Ntfmbn) or N-(piperonyl)glycine ( Npip ), where 2 , and X 3 cannot both exist, or if X 3 does not exist, then X 1 and
상기 X4, X5, X6, X7 및 X8은 각각 독립적으로 N-(2-에틸구아니딘)글리신, N-(4-부틸구아니딘)글리신 또는 N-(6-헥실구아니딘)글리신일 수 있다.Wherein X 4 , X 5 , X 6 , X 7 and there is.
본 발명에서, 용어 “Nbtg”는 N-(4-부틸구아니딘)글리신을 의미하며, 하기 화학식 19의 구조로 표시된다.In the present invention, the term “Nbtg” refers to N-(4-butylguanidine)glycine, and is represented by the structure of Formula 19 below.
[화학식 19][Formula 19]
본 발명에서, 용어 “Netg”는 N-(2-에틸구아니딘)글리신을 의미하며, 하기 화학식 20의 구조로 표시된다.In the present invention, the term “Netg” refers to N-(2-ethylguanidine)glycine, and is represented by the structure of Formula 20 below.
[화학식 20][Formula 20]
본 발명에서, 용어 “Nhxg”는 N-(6-헥실구아니딘)글리신을 의미하며, 하기 화학식 21의 구조로 표시된다.In the present invention, the term “Nhxg” refers to N-(6-hexylguanidine)glycine, and is represented by the structure of Formula 21 below.
[화학식 21][Formula 21]
본 발명에서, 용어 “Npm”은 N-(페닐메틸)글리신을 의미하며, 하기 화학식 22의 구조로 표시된다.In the present invention, the term “Npm” refers to N-(phenylmethyl)glycine, and is represented by the structure of Formula 22 below.
[화학식 22][Formula 22]
본 발명에서, 용어 “Nnaph”는 N-(나프틸메틸)글리신을 의미하며, 하기 화학식 23의 구조로 표시된다.In the present invention, the term “Nnaph” refers to N-(naphthylmethyl)glycine and is represented by the structure of Formula 23 below.
[화학식 23][Formula 23]
본 발명에서, 용어 “Ntrp”는 N-(2-인돌에틸)글리신을 의미하며, 하기 화학식 24의 구조로 표시된다.In the present invention, the term “Ntrp” refers to N-(2-indolethyl)glycine and is represented by the structure of Formula 24 below.
[화학식 24][Formula 24]
본 발명에서, 용어 “Ndp”는 N-(디페닐에틸)글리신을 의미하며, 하기 화학식 25의 구조로 표시된다.In the present invention, the term “Ndp” refers to N-(diphenylethyl)glycine, and is represented by the structure of Formula 25 below.
[화학식 25][Formula 25]
본 발명에서, 용어 "Ntfmbn"은 N-(트리플루오로메틸벤질)글리신을 의미하며, 하기 화학식 26의 구조로 표시된다.In the present invention, the term “Ntfmbn” refers to N-(trifluoromethylbenzyl)glycine, and is represented by the structure of Formula 26 below.
[화학식 26][Formula 26]
본 발명에서, 용어 "Npip"는 N-(피페로닐)글리신을 의미하며, 하기 화학식 27의 구조로 표시된다.In the present invention, the term “Npip” refers to N-(piperonyl)glycine, and is represented by the structure of Formula 27 below.
[화학식 27][Formula 27]
본 발명에 따른 고리형 펩토이드는 상기 화학식 1의 X1 내지 X8에 5개 내지 8개의 구아니딘을 연속적으로 포함하는 5량체 내지 8량체일 수 있다.The cyclic peptoid according to the present invention may be a pentamer to an octamer containing 5 to 8 guanidines in succession in X 1 to X 8 of Formula 1 above.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 고리형 펩토이드는:According to a specific embodiment of the present invention, the cyclic peptoid is:
[화학식 2] [Formula 2]
-Ra-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-NHC(Rb)HCONH2 -R a -Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-NHC(R b )HCONH 2
[화학식 3][Formula 3]
-Ra-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-NHC(Rb)HCONH2;-R a -Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[화학식 4][Formula 4]
-Ra-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-NHC(Rb)HCONH2;-R a -Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[화학식 5] [Formula 5]
-Ra-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-NHC(Rb)HCONH2;-R a -Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[화학식 6] [Formula 6]
-Ra-Netg-Netg-Netg-Netg-Netg-Netg-Netg-Netg-NHC(Rb)HCONH2;-R a -Netg-Netg-Netg-Netg-Netg-Netg-Netg-Netg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[화학식 7] [Formula 7]
-Ra-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2; -R a -Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[화학식 8][Formula 8]
-Ra-Npm-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2;-R a -Npm-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[화학식 9] [Formula 9]
-Ra-Npm-Npm-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2;-R a -Npm-Npm-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[화학식 10] [Formula 10]
-Ra-Npm-Npm-Npm-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2;-R a -Npm-Npm-Npm-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[화학식 11] [Formula 11]
-Ra-Npm-Nnaph-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2;-R a -Npm-Nnaph-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[화학식 12] [Formula 12]
-Ra-Npm-Ntrp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2;-R a -Npm-Ntrp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[화학식 13] [Formula 13]
-Ra-Npm-Ndp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2;-R a -Npm-Ndp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[화학식 14] [Formula 14]
-Ra-Ndp-Ndp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2;-R a -Ndp-Ndp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[화학식 15] [Formula 15]
-Ra-Ntfmbn-Ndp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2; 또는-R a -Ntfmbn-Ndp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ; or
[화학식 16][Formula 16]
-Ra-Npip-Ndp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2;로 표시될 수 있고;-R a -Npip-Ndp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ;;
상기 화학식 2 내지 16에서,In Formulas 2 to 16,
Ra는 트리아진기일 수 있고;R a may be a triazine group;
Rb는 -(CH2)(S)-일 수 있으며;R b may be -(CH 2 )(S)-;
Ra와 Rb는 서로 연결될 수 있다.R a and R b can be connected to each other.
본 발명에서는 종래의 선형 펩토이드보다 구조적인 견고함을 주어 세포 투과성을 향상시키기 위한 전략으로 고리형 펩토이드를 사용하며, 추가로 펩토이드 길이를 조절하여 세포 투과성을 향상시키고자 하였다.In the present invention, cyclic peptoids were used as a strategy to improve cell permeability by providing structural rigidity compared to conventional linear peptoids, and additionally, the length of the peptoid was adjusted to improve cell permeability.
이에 따라, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 형광이 표지된, 5개 내지 8개의 구아니딘을 연속적으로 포함하는 5량체 내지 8량체의 펩토이드를 선형과 고리형으로 제조하고, 유동 세포 분석법을 통해 형광 세기를 측정함으로써 세포막 투과성을 확인하였다. 제조된 고리형 펩토이드 C1 내지 C4는 하기 화학식 28의 구조로 표시되며, 이에 대응되는 선형 펩토이드 L1 내지 L4도 함께 제조되었다.Accordingly, in one specific embodiment of the present invention, fluorescently labeled pentameric to octamer peptoids containing 5 to 8 guanidines in succession are prepared in linear and cyclic forms, and analyzed through flow cytometry. Cell membrane permeability was confirmed by measuring fluorescence intensity. The prepared cyclic peptoids C1 to C4 are represented by the structure of Formula 28 below, and the corresponding linear peptoids L1 to L4 were also prepared.
[화학식 28][Formula 28]
도 2i에서 확인되는 바와 같이, 고리형 펩토이드 C1 내지 C4는 선형 펩토이드 L1 내지 L4에 비해 현저히 향상된 세포 투과성을 나타내며, 고리형 펩토이드들 중 8개의 구아니딘으로 구성된 8량체 펩토이드 C4의 세포 투과성이 가장 우수함을 알 수 있다. As seen in Figure 2i, cyclic peptoids C1 to C4 show significantly improved cell permeability compared to linear peptoids L1 to L4, and among the cyclic peptoids, they are octamer peptoids composed of eight guanidines. It can be seen that C4 has the best cell permeability.
본 발명의 다른 구체적인 일 실시예에서는 8량체 고리형 펩토이드 C4보다 세포 투과성이 향상된 고리형 펩토이드를 찾기 위한 전략으로 구아니딘기와 골격 구조의 질소 사이의 메틸렌기 수를 조절하였다. 제조된 고리형 펩토이드 C5 및 C6는 하기 화학식 29의 구조로 표시되며, 이의 세포막 투과성을 확인하였다.In another specific example of the present invention, the number of methylene groups between the guanidine group and the nitrogen of the skeleton structure was adjusted as a strategy to find a cyclic peptoid with improved cell permeability than the octamer cyclic peptoid C4 . The prepared cyclic peptoids C5 and C6 were represented by the structure of Formula 29 below, and their cell membrane permeability was confirmed.
[화학식 29][Formula 29]
도 3c에서 확인되는 바와 같이, 메틸렌기의 수가 증가할수록 세포 투과성이 향상됨을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 구체적인 일 실시예에서는, C6의 세포 투과성을 향상시키기 위한 전략으로 구아니딘 작용기를 다양한 소수성 작용기들로 치환하여 양친매성의 구조적인 특징을 갖는 고리형 펩토이드를 제조하고 이의 세포 투과성을 확인하였다. 제조된 고리형 펩토이드 C7 내지 C15는 하기 화학식 30의 구조로 표시된다.As confirmed in Figure 3c, it can be seen that cell permeability improves as the number of methylene groups increases. Therefore, in another specific embodiment of the present invention, as a strategy to improve the cell permeability of C6 , a cyclic peptoid with amphipathic structural characteristics is prepared by substituting the guanidine functional group with various hydrophobic functional groups. Cell permeability was confirmed. The prepared cyclic peptoids C7 to C15 are represented by the structure of Formula 30 below.
[화학식 30] [Formula 30]
도 4j에서 확인되는 바와 같이, R1은 Nhxg, R2는 Ndp, R3은 Npip인 C15의 세포 투과성이 가장 우수함을 알 수 있다.As confirmed in Figure 4j, it can be seen that the cell permeability of C15 , where R 1 is Nhxg, R 2 is Ndp, and R 3 is Npip, is the best.
추가로, 공초점 형광 현미경을 통해 종래 펩타이드 분자 수송체인 아르기닌 8량체 R8, C6 및 C15의 형광의 세기 및 세포 내에서 존재하는 위치를 비교하였다. 도 4j에서 확인되는 바와 같이, C15는 R8 및 C6에 비해 형광의 세기가 강하며, C6과 C15는 세포 내 미토콘드리아로 이동한다는 것을 알 수 있다. Additionally, the fluorescence intensity and intracellular location of arginine octamers R8, C6, and C15, which are conventional peptide molecule transporters, were compared through confocal fluorescence microscopy. As seen in Figure 4j, C15 has a stronger fluorescence intensity than R8 and C6, and it can be seen that C6 and C15 move to intracellular mitochondria.
본 발명의 또 다른 구체적인 일 실시예에서는, 양친매성 고리형 펩토이드가 세포 내로 투과되는 메커니즘을 확인하기 위해, 4 ℃ 조건 및 아자이드화 나트륨이 첨가된 배지에서 37 ℃, 5 % CO2의 조건 하에서 각각 C15의 세포 투과성을 확인하였다. 도 5에서 확인되는 바와 같이, 4 ℃에서 C15의 세포 투과도는 현저하게 감소하여 C15의 세포 투과에 엔도시토시스(endocytosis)가 크게 관여한다는 것을 알 수 있다. 또한, 아자이드화 나트륨이 첨가된 Opti-MEM에서 C15의 세포 투과도가 크게 감소하였으므로, 이를 통해 C15가 에너지 의존 엔도시토시스에 의해 세포를 투과한다는 것을 알 수 있다.In another specific embodiment of the present invention, in order to confirm the mechanism by which amphipathic cyclic peptoids permeate into cells, conditions of 4°C and 37°C and 5% CO 2 in a medium supplemented with sodium azide were used. Cell permeability of C15 was confirmed under each condition. As seen in Figure 5, the cell permeability of C15 was significantly reduced at 4°C, indicating that endocytosis is significantly involved in cell permeation of C15. In addition, the cell permeability of C15 was greatly reduced in Opti-MEM to which sodium azide was added, indicating that C15 penetrates cells through energy-dependent endocytosis.
본 발명의 다른 구체적인 일 실시예에서는, 고리형 펩토이드의 생체 내 안정성을 확인하기 위해 R8과 C15를 각각 트립신과 배양하여 이들의 분해 정도를 확인하였다. 도 6에서 확인되는 바와 같이, C15는 R8에 비해 트립신 내에서 월등히 우수한 안정성을 나타내며, 이러한 안정성이 12시간 이상 지속된다는 것을 알 수 있다.In another specific example of the present invention, in order to confirm the in vivo stability of the cyclic peptoid, R8 and C15 were each incubated with trypsin to confirm the degree of decomposition. As can be seen in Figure 6, C15 shows significantly superior stability in trypsin compared to R8, and this stability lasts for more than 12 hours.
이와 같이, 본 발명에 따른 고리형 펩토이드는 우수한 세포 투과성 및 생체 내 안정성을 나타내는바, 세포, 조직 또는 장기 내로 수송하고자 하는 목적 카르고 (cargo of interest)를 결합시켜 치료, 진단 등 다양한 분야에 활용할 수 있다.As such, the cyclic peptoid according to the present invention exhibits excellent cell permeability and stability in vivo, and can be used in various fields such as treatment and diagnosis by combining it with cargo of interest for transport into cells, tissues or organs. You can utilize it.
본 발명에서 용어 "목적 카르고 (cargo of interest)"는 세포, 조직 또는 장기 내로 수송하여 의도하는 효과를 나타낼 수 있는 모든 물질을 포함하며, 예를 들어, 화학물질, 나노입자, 핵산, 펩타이드 및 폴리펩타이드를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 상기 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 및 PNA (peptide-nucleic acid)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 상기 목적 카르고는 형광물질이거나, 또는 화학물질 또는 펩타이드 형태의 생리활성물질 일 수 있다.In the present invention, the term "cargo of interest" includes all substances that can be transported into cells, tissues or organs and produce the intended effect, such as chemicals, nanoparticles, nucleic acids, peptides and Including, but not limited to, polypeptides. The nucleic acids include, but are not limited to, antisense oligonucleotides, siRNA, shRNA, miRNA, and PNA (peptide-nucleic acid). For example, the target cargo may be a fluorescent substance, or a biologically active substance in the form of a chemical substance or peptide.
본 발명의 고리형 펩토이드에 있어서, 상기 목적 카르고는 트리아진기에 결합될 수 있다.In the cyclic peptoid of the present invention, the target cargo may be bound to a triazine group.
본 발명의 고리형 펩토이드는 세포질로 투과되는 특성을 가지며, 이에 따라 고리형 펩토이드에 결합된 목적 카르고를 세포 또는 조직 내로 전달하는 특성을 가진다.The cyclic peptoid of the present invention has the property of penetrating into the cytoplasm, and thus has the property of delivering the target cargo bound to the cyclic peptoid into cells or tissues.
따라서, 본 발명의 제2 측면은 전술한 다양한 형태의 고리형 펩토이드와 이에 결합되는 목적 카르고 (cargo of interest)를 포함하는 약물 전달체에 관한 것이다.Accordingly, the second aspect of the present invention relates to a drug carrier comprising the various types of cyclic peptoids described above and a cargo of interest bound thereto.
본 발명의 약물전달체는 전달하고자 하는 목적 카르고의 종류에 따라, 질병 또는 질환의 치료, 특정 세포의 검출, 질병(예컨대, 암)의 진단, 특정 세포의 위치 추적 및 생체 내 (in vivo) 이미징 등에 이용될 수 있다.The drug delivery system of the present invention can be used for treatment of a disease or disease, detection of specific cells, diagnosis of a disease (e.g., cancer), tracking of the location of a specific cell, and in vivo imaging, depending on the type of target cargo to be delivered. It can be used, etc.
본 발명의 약물 전달체에 있어서, 상기 목적 카르고는 상기 고리형 펩토이드의 트리아진기에 공유결합 또는 비공유결합을 통해 연결될 수 있다.In the drug delivery system of the present invention, the target cargo may be linked to the triazine group of the cyclic peptoid through a covalent or non-covalent bond.
본 발명의 약물 전달체에 있어서, 상기 목적 카르고는 링커를 통해 트리아진기에 연결될 수 있다. In the drug delivery system of the present invention, the target cargo may be connected to a triazine group through a linker.
본 발명의 약물 전달체에 있어서, 상기 링커는 세포투과 활성에 영향을 미치지 않는 한 당업계에 공지된 다양한 링커를 이용할 수 있다. 예를 들어, 3-(2-피리딜다이티오)부티르산, (S)-2-아미노-6-(4-(피리딘-2-일다이설파닐)부탄아미도)헥사노익산, 페닐케톤-유래 하이드라존, para-아미노벤질-카보네이트, 다이설파이드-카바메이트, 발린-시트룰린 para-아미노벤질-카바메이트, 사이클로부탄-1,1-디카르복스아미드-시트룰린 para-아미노벤질 카바메이트, 글루쿠로나이드 및 갈락토사이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커를 사용할 수 있으나, 이로 한정되지 않는다.In the drug delivery system of the present invention, various linkers known in the art can be used as long as the linker does not affect cell penetration activity. For example, 3-(2-pyridyldithio)butyric acid, (S)-2-amino-6-(4-(pyridin-2-yldisulfanyl)butanamido)hexanoic acid, phenylketone- Derived from Hydrazone, para-aminobenzyl-carbonate, disulfide-carbamate, valine-citrulline para-aminobenzyl-carbamate, cyclobutane-1,1-dicarboxamide-citrulline para-aminobenzyl carbamate, glue A linker selected from the group consisting of coronide and galactoside may be used, but is not limited thereto.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 PIP-box 펩타이드를 고리형 펩토이드에 연결하기 위한 링커로 3-(2-피리딜다이티오)부티르산 링커를 사용하였으나, 당해 기술분야의 통상의 기술자는 연결되는 목적 카르고의 종류 또는 링커의 절단 (cleavage) 메커니즘에 따라 적절한 링커를 선택하여 사용할 수 있다 (Chem. Soc. Rev., 2019,48, 4361).In a specific example of the present invention, a 3-(2-pyridyldithio)butyric acid linker was used as a linker to connect the PIP-box peptide to the cyclic peptoid, but those skilled in the art would An appropriate linker can be selected and used depending on the type of target cargo or the cleavage mechanism of the linker (Chem. Soc. Rev., 2019,48, 4361).
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 본 발명에 따른 고리형 펩토이드의 실제 약물 전달 능력을 확인하기 위해, PIP-box 펩타이드, PIP-box 펩타이드-R8 결합체 및 PIP-box 펩타이드-C15 결합체를 세포에 처리하여 세포 생존력을 비교하였다. 도 7f에서 확인되는 바와 같이, PIP-box 펩타이드-C15 결합체를 처리한 군의 세포 생존력이 가장 낮았다. 또한, PIP-box 펩타이드-C15 결합체의 세포 독성이 세포 사멸에 의한 것인지 확인하기 위해, C15, PIP-box 펩타이드 및 PIP-box 펩타이드-C15를 각각 세포에 처리하고 아넥신-V 세포사멸 분석(Annexin-V Apoptosis assay)을 수행하였다. 도 7g에서 확인되는 바와 같이 PIP-Box 펩타이드-C15 결합체를 처리하였을 때 Annexin V 와 PI의 세기가 증가하였으며, 이는 결합체에 의해 초기 세포사멸과 후기 세포사멸 세포의 분포가 높은 것을 의미한다. 결과적으로, C15를 이용한 약물 전달 시스템이 실제 약물을 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있다는 것을 알 수 있다.In a specific embodiment of the present invention, in order to confirm the actual drug delivery ability of the cyclic peptoid according to the present invention, PIP-box peptide, PIP-box peptide-R8 conjugate, and PIP-box peptide-C15 conjugate were administered to cells. Cell viability was compared after treatment. As shown in Figure 7f, the group treated with the PIP-box peptide-C15 conjugate had the lowest cell viability. In addition, to confirm that the cytotoxicity of the PIP-box peptide-C15 conjugate is due to cell death, cells were treated with C15, PIP-box peptide, and PIP-box peptide-C15, respectively, and Annexin-V apoptosis assay was performed. -V Apoptosis assay) was performed. As seen in Figure 7g, the intensity of Annexin V and PI increased when the PIP-Box peptide-C15 conjugate was treated, which means that the distribution of early and late apoptotic cells was high due to the conjugate. As a result, it can be seen that the drug delivery system using C15 can effectively deliver drugs into cells.
본 발명의 약물 전달체에 있어서, 상기 링커는 고리형 펩토이드와 목적 카르고에 결합되는 형광성 모이어티(moiety)를 추가로 포함할 수 있다. 예시적인 형광성 모이어티의 종류로는 형광물질[예컨대, 플루오레신, FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민 6G(rhodamine 6G), 로다민 B(rhodamine B), TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), Cy-3, Cy-5, Texas Red, Alexa Fluor, DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole) 및 쿠마린(Coumarin)], 형광 단백질(fluorescence protein; GFP, RFP, CFP, YFP, BFP, 루시퍼라제 또는 이의 변이체), 방사능동위원소(예컨대, C14 , I125 , P32 및 S35), 화학물질 (예컨대, 바이오틴), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함한다. 본 발명의 약물전달체가 방사능동위원소를 포함하여 구성되는 경우, 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT, Single Photon Emission Computed Tomography) 또는 양전자 방출 단층촬영(PET, Positron Emission Tomography)에 적용되어 조직의 이미징에 이용될 수도 있다.In the drug delivery system of the present invention, the linker may further include a cyclic peptoid and a fluorescent moiety bound to the target cargo. Exemplary types of fluorescent moieties include fluorescent substances [e.g., fluorescein, fluoresein isothiocyanate (FITC), rhodamine 6G, rhodamine B, and 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine (TAMRA). , Cy-3, Cy-5, Texas Red, Alexa Fluor, DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) and Coumarin], fluorescence protein (GFP, RFP, CFP, YFP, BFP, luciferase or variants thereof), radioisotopes (e.g. C 14 , I 125 , P 32 and S 35 ), chemicals (e.g. biotin), luminescent substances, chemiluminescence and fluorescence resonance energy transfer (FRET) ) includes. When the drug delivery system of the present invention includes a radioactive isotope, it can be applied to single photon emission computed tomography (SPECT) or positron emission tomography (PET) for tissue imaging. It may also be used.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 약물 전달체는: According to a specific embodiment of the present invention, the drug delivery system is:
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또는 or
일 수 있고, It can be,
여기서, 트리아진기에 결합된 R은 목적 카르고일 수 있다.Here, R bound to the triazine group may be the target cargo.
본 발명의 약물 전달체에 있어서, 상기 목적 카르고의 종류는 전술한 바와 동일하므로 그 기재를 생략한다.In the drug delivery system of the present invention, the type of target cargo is the same as described above, so its description is omitted.
본 발명의 제3 측면은 전술한 약물 전달체를 포함하는 목적 카르고 운반용 조성물에 관한 것이다.The third aspect of the present invention relates to a composition for transporting the target cargo containing the above-described drug carrier.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시 에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미 네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다. The composition of the present invention may be administered together with a pharmaceutically acceptable carrier. Pharmaceutically acceptable carriers are those commonly used in preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, poly Includes, but is not limited to, vinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
본 발명의 목적 카르고 운반용 조성물은 비경구 방식으로 투여되는 것이 바람직하다. 비경구 투여를 하는 경우, 정맥내 주입, 피내 주입, 병변내(intralesional) 주입, 근육내 주입, 복강내 주입 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물의 적 합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 결정될 수 있으며 일반적으로 0.0001-100 mg/kg의 범위일 수 있다.The composition for carrying cargo for the purpose of the present invention is preferably administered parenterally. When administered parenterally, it can be administered by intravenous injection, intradermal injection, intralesional injection, intramuscular injection, or intraperitoneal injection. The appropriate dosage of the composition of the present invention can be determined in various ways by factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity. and can generally range from 0.0001-100 mg/kg.
본 발명의 목적 카르고 운반용 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The purpose of the present invention is to provide a cargo transport composition in unit dosage form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily performed by a person skilled in the art. It can be manufactured by or by placing it in a multi-capacity container. At this time, the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, granule, tablet, or capsule, and may additionally contain a dispersant or stabilizer.
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 포유동물, 보다 구체적으로는 인간, 마우스, 래트, 기니어 피그, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개 및 고양이에 적용될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.In certain embodiments of the present invention, the methods and compositions of the present invention are administered to mammals, more specifically humans, mice, rats, guinea pigs, rabbits, monkeys, pigs, horses, cattle, sheep, antelopes, dogs and cats. It may be applied, but is not limited to this.
본 발명의 제4 측면은 하기 화학식 17로 표시되는 선형 펩토이드를 트리아진을 포함하는 화합물과 반응시켜 고리화 반응을 통해 연결하는 단계를 포함하는 고리형 펩토이드의 제조방법에 관한 것이다:The fourth aspect of the present invention relates to a method for producing a cyclic peptoid, comprising the step of reacting a linear peptoid represented by the following formula (17) with a compound containing a triazine and linking it through a cyclization reaction:
[화학식 17][Formula 17]
-X1X2X3X4X5X6X7X8-NHC(Rb)HCONH- -X 1 _ _ _ _ _ _ _
상기 화학식 17에서,In Formula 17 above,
X1, X2, 및 X3은 각각 독립적으로 존재하지 않거나, -C(=O)CH2N(Rc)- 또는 -C(=O)CH2N(Rd)-이고, 여기서, X1, X2, 및 X3은 모두 존재하지 않거나, X3이 존재하지 않는 경우 X1 및 X2는 존재할 수 없고, X2가 존재하지 않는 경우 X1이 존재할 수 없고; X 1 , X 2 , and X 1 , X 2 , and X 3 cannot all exist, or if X 3 does not exist, then X 1 and
X4, X5, X6, X7 및 X8은 각각 독립적으로 -C(=O)CH2N(Rc)-일 수 있으며;X 4 , X 5 , X 6 , X 7 and X 8 may each independently be -C(=O)CH 2 N(R c )-;
Rb는 트리틸 (Trt), 디페닐메틸 (Dpm), 테트라하이드로피라닐 (Thp), tert-부틸 (tBu), 4-메톡시벤질 (Mob), 메틸벤질 (Meb), 1-아다만틸 (Ad), 벤질옥시메틸 (Bom), 2,4,6-트리메톡시벤질 (Tmob), 4,4′,4′′,-트리메톡시-트리페닐메틸 (TMTr), 4-메틸트리틸 (Mtt), 4-메톡시트리틸 (Mmt), 9H-크산텐-9-일 (Xan), 2-메톡시-9H-크산텐-9-일 (2-Moxan), 4,5,6-트리메톡시-2,2-디메틸-2,3-디하이드로벤조퓨란-7-메틸 (Tmbm), 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-메틸 (Pmcm), 2,2,4,6,7-펜타메틸-2,3-디하이드로벤조퓨란-5-메틸 (Pbfm), 4-메톡시벤질옥시메틸 (Mbom), 2,6-디메톡시벤질 (2,6-diMeOBn), 4-메톡시-2-메틸벤질 (4-MeO-2MeBn) 및 4,4′-디메톡시디페닐메틸 (Ddm)로 이루어진 군으로부터 선택되는 보호기로 보호된 -(CH2)(S)-일 수 있고;R b is trityl (Trt), diphenylmethyl (Dpm), tetrahydropyranyl (Thp), tert-butyl (tBu), 4-methoxybenzyl (Mob), methylbenzyl (Meb), 1-adamane Til (Ad), benzyloxymethyl (Bom), 2,4,6-trimethoxybenzyl (Tmob), 4,4′,4′′,-trimethoxy-triphenylmethyl (TMTr), 4-methyl Trityl (Mtt), 4-methoxytrityl (Mmt), 9H-xanthen-9-yl (Xan), 2-methoxy-9H-xanthen-9-yl (2-Moxan), 4,5 ,6-trimethoxy-2,2-dimethyl-2,3-dihydrobenzofuran-7-methyl (Tmbm), 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-methyl (Pmcm) , 2,2,4,6,7-pentamethyl-2,3-dihydrobenzofuran-5-methyl (Pbfm), 4-methoxybenzyloxymethyl (Mbom), 2,6-dimethoxybenzyl (2 -(CH 2 protected with a protecting group selected from the group consisting of ,6-diMeOBn), 4-methoxy-2-methylbenzyl (4-MeO-2MeBn) and 4,4′-dimethoxydiphenylmethyl (Ddm) )(S)-;
Rc는 -NHC(=NH)NH2로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 C2-10 알킬기일 수 있으며;R c may be a straight or branched C 2-10 alkyl group substituted with -NHC(=NH)NH 2 ;
Rd는 하나 이상의 Re로 치환되는 C1-6 직쇄 또는 분지쇄 알킬기이거나, 또는 O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 C6-10 헤테로 아릴기로 치환되는 C1-6 직쇄 또는 분지쇄 알킬기일 수 있고;R d is a C 1-6 straight or branched chain alkyl group substituted with one or more R e , or C substituted with a C 6-10 heteroaryl group containing one or more heteroatoms selected from the group consisting of O, N and S. 1-6 may be a straight or branched chain alkyl group;
Re는 하나 이상의 할로겐으로 치환된 C1-6 직쇄형 알킬기로 치환되는 C6-14 아릴기이거나, 또는 치환되지 않은 C6-14 아릴기일 수 있으며;R e may be a C 6-14 aryl group substituted with a C 1-6 straight-chain alkyl group substituted with one or more halogens, or an unsubstituted C 6-14 aryl group;
N-말단은 알릴옥시카르보닐 (Alloc), 노실 (Nosyl), 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소 사이클로헥스-1-일리덴)에틸 (Dde), 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 트리페닐메틸(트리틸) (Trt)의 화학적 보호기로 보호될 수 있고;N-terminus is allyloxycarbonyl (Alloc), Nosyl, 1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxo cyclohex-1-ylidene)ethyl (Dde), 9-fluorenylme may be protected with a chemical protecting group of toxycarbonyl (Fmoc) or triphenylmethyl(trityl) (Trt);
상기 트리아진을 포함하는 화합물은 X1의 N-말단에 결합하여, 상기 Rb로부터 보호기가 제거된 후의 -(CH2)SH에서 -SH와 탄소-황 결합을 통해 연결될 수 있다.The compound containing the triazine may be bound to the N-terminus of
본 발명의 고리형 펩토이드의 제조방법에 있어서, 상기 트리아진을 포함하는 화합물은 하기 화학식 18로 표시될 수 있다:In the method for producing a cyclic peptoid of the present invention, the compound containing the triazine may be represented by the following formula (18):
[화학식 18][Formula 18]
상기 화학식 18에서,In Formula 18 above,
2개의 X는 각각 독립적으로 클로로 (Chloro), 브로모 (Bromo) 또는 아이오도 (Iodo)이고;Two X's are each independently Chloro, Bromo or Iodo;
R은 수소, 할로겐, C1-4알킬아미노 또는 C1-2알킬티오일 수 있다.R may be hydrogen, halogen, C 1-4 alkylamino, or C 1-2 alkylthio.
본 발명의 고리형 펩토이드의 제조방법에 있어서, 상기 고리화 반응에 사용 가능한 유기용매로는 반응에 영향을 미치지 않는 메탄올, 디메틸포름아미드(DMF), 테트라하이드 로퓨란(THF), 디클로로메탄, 톨루엔 등을 이용하여 반응을 수행할 수 있고, 바람직하게는 디메틸포름아미드 (DMF)를 사용할 수 있다.In the method for producing cyclic peptoids of the present invention, organic solvents that can be used in the cyclization reaction include methanol, dimethylformamide (DMF), tetrahydrofuran (THF), and dichloromethane, which do not affect the reaction. The reaction can be performed using , toluene, etc., preferably dimethylformamide (DMF).
본 발명의 고리형 펩토이드의 제조방법에 있어서, 상기 화학식 17로 표시되는 선형 펩토이드를 트리아진을 포함하는 화합물과 반응시켜 고리화 반응을 통해 연결하는 단계에는 디이소프로필에틸아민(Diisopropylethylamine, DIPEA)가 함께 처리될 수 있으나, 이로 한정되지 않는다.In the method for producing a cyclic peptoid of the present invention, in the step of reacting the linear peptoid represented by Formula 17 with a compound containing triazine and linking it through a cyclization reaction, diisopropylethylamine is used. , DIPEA) may be processed together, but are not limited to this.
본 발명의 고리형 펩토이드의 제조방법은 상기 트리아진을 포함하는 화합물과 반응시킨 후, 상기 Rb의 트리틸기 (Trt)를 제거하기 위해 디클로로메탄 (Dichloromethane, DCM)에서 트리플루오로아세트산 (Trifluoroacetic acid, TFA) 및 트리이소프로필실란(triisopropylsilane, TIS 또는 TIPS)를 처리하여 반응시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.The method for producing a cyclic peptoid of the present invention is to react with a compound containing the triazine, and then react with trifluoroacetic acid (Dichloromethane, DCM) to remove the trityl group (Trt) of R b . It may further include the step of treating and reacting with trifluoroacetic acid (TFA) and triisopropylsilane (TIS or TIPS).
본 발명의 고리형 펩토이드의 제조방법은 상기 Trt을 제거하기 위한 반응 후에, 레진 상의 트리아진이 포함된 펩토이드를 디메틸포름아미드 (dimethyl formamide, DMF) 용매에서 DIPEA과 반응시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. The method for producing a cyclic peptoid of the present invention includes, after the reaction to remove Trt, the step of reacting the peptoid containing triazine on the resin with DIPEA in a dimethyl formamide (DMF) solvent. It can be included.
본 발명의 고리형 펩토이드의 제조방법에 있어서, 상기 트리아진을 포함하는 화합물이 염화시아누르인 경우, 상기 선형 펩토이드를 염화시아누르와 반응시켜 고리화한 후, 트리아진에 결합된 염소를 C1-4 알킬아민 또는 C1-2 알킬티올로 치환된 1차 아민으로 치환할 수 있다.In the method for producing a cyclic peptoid of the present invention, when the compound containing the triazine is cyanuric chloride, the linear peptoid is cyclized by reacting with cyanuric chloride, and then bound to the triazine. Chlorine can be replaced with a primary amine substituted with C 1-4 alkylamine or C 1-2 alkylthiol.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따른 형광이 표지된 고리형 펩토이드의 전체 합성과정은 도 1의 반응식과 같다.The overall synthesis process of fluorescently labeled cyclic peptoid according to a specific embodiment of the present invention is the same as the reaction scheme in FIG. 1.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, and it will be obvious to those skilled in the art that the scope of the present invention should not be construed as limited by these examples.
[준비예][Preparation example]
시약 및 일반적 시험 방법Reagents and general test methods
모든 화학 물질과 시약은 상업적 공급 업체 (Sigma-Aldrich, Alfa Aesar 및 TCI)에서 구입하였으며, 별도의 정제과정 없이 사용하였다. 링크 아미드 MBHA 레진 (0.45 mmol/g)은 Beadtech으로부터 구입하였다. 합성 펩토이드의 순도를 결정하기 위해 C18 역상 HPLC 컬럼 (Eclipse XDB, 3.5 μm, 4.6 mm x 150 mm)이 장착된 Agilent 1200 LC/MS 시스템에서 분석을 수행했다. 이때, 용매 조건은 (용매 A : 100 % H2O, 0.01 % 트리플루오로아세트산 (Trifluoroacetic acid, TFA), 용매 B : 100 % 아세토니트릴, 0.01 % TFA) 10 % B에서 100 % B로 용매 B의 비율을 높이면서 진행하였고, 0.7 mL/분의 유속에서 합성 펩타이드의 순도 분석을 수행하였다. 정제의 경우, 합성된 펩타이드를 40 분에 걸쳐 10 % B 에서 100 % B 까지 용매 B의 비율을 변화시키면서 C18 역상 컬럼 (Eclipse XDB, 5 μm, 21.2 mm x 150 mm)을 장착한 Agilent 1120 compact LC system (Agilent Technology)을 이용하여 수행하였다. MALDI-TOF MS는 α-시아노-4-하이드록시신남산을 매트릭스로 사용하여 4700 Proteomics Analyzer (Applied Biosystems)에서 수행하였다.All chemicals and reagents were purchased from commercial suppliers (Sigma-Aldrich, Alfa Aesar, and TCI) and used without further purification. Link amide MBHA resin (0.45 mmol/g) was purchased from Beadtech. To determine the purity of the synthetic peptoids, analysis was performed on an Agilent 1200 LC/MS system equipped with a C18 reversed-phase HPLC column (Eclipse XDB, 3.5 μm, 4.6 mm x 150 mm). At this time, the solvent conditions were (Solvent A: 100% H 2 O, 0.01% trifluoroacetic acid (TFA), Solvent B: 100% acetonitrile, 0.01% TFA) from 10% B to 100% B. We proceeded by increasing the ratio, and purity analysis of the synthetic peptide was performed at a flow rate of 0.7 mL/min. For purification, the synthesized peptides were purified on an Agilent 1120 compact LC equipped with a C18 reversed-phase column (Eclipse This was performed using the system (Agilent Technology). MALDI-TOF MS was performed on a 4700 Proteomics Analyzer (Applied Biosystems) using α-cyano-4-hydroxycinnamic acid as a matrix.
형광 표지된 고리형 펩토이드의 합성 및 정제Synthesis and purification of fluorescently labeled cyclic peptoids
본 발명의 형광 표지된 고리형 펩토이드는 도 1에 나타난 바와 같이 합성하였다. 구체적으로, 링크 아미드 MBHA 레진 (100 mg, 45 μmol)을 4 ℃에서 8시간 동안 5 mL 프릿티드 (fritted) 주사기에서 DMF (2 mL)로 팽창(swelling) 시켰다. DMF 용액 상의 20 % 피페리딘 (2 x 10 분)을 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 화합물이 합성될 레진에 Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 당량), HBTU (5 당량), HOBt (5 당량), 및 DIPEA (10 당량)을 DMF (1mL) 용매에서 실온 하에 반응하였다. 2 시간 동안 반응을 시킨 뒤, 반응 혼합물을 배출시키고, 레진을 DMF (3x), DCM (3x), MeOH (3x) 및 DMF (3x)로 세척하였다. Fmoc를 탈보호시킨 후, 결과물인 아민에, 실온에서 DMF에서 1 M 브로모아세트산 (20 당량) 및 1 M DIC (20 당량)를 처리하여 브로모아세틸화시켰다. 비드를 동량으로 실온에서 DMF에서 2 M 1차 아민을 처리하였다. 5-8 MER의 선형 펩토이드가 합성될 때까지 이 과정을 반복하였다. 펩토이드 합성의 마지막 단계에서, 펩토이드의 N-말단을 트리아진 형태로 만들기 위해, THF 에서 염화사이아누르 (5 당량) 및 DIPEA (10 당량)를 처리하여 실온에서 3시간 동안 반응시킨 후, 레진을 DMF (3x), DCM (3x), MeOH (3x) 및 DMF (3x)로 세척하였다. 시스테인 잔기의 Trt기를 제거하기 위해, 레진에 DCM에서 5 % 트리플루오로아세트산 (TFA)과 5 % 트리이소프로필실란 (TIS)을 처리하여 30분 반응시킨 후, DCM (3x), MeOH (3x) 및 DMF (3x)로 세척하였다. 레진 상의 트리아진이 포함된 펩토이드를 DMF 용매에서 10 % DIPEA로 실온에서 밤새 반응시킨 후, DMF (3x), DCM (3x), MeOH (3x) 및 DMF (3x)로 세척하였다. 고리화된 펩토이드의 트리아진에 남아있는 염화기를 디아미노부틸기로 치환하기 위해, DMF 내 DIPEA (20 당량)의 존재 하에서 디아미노부탄 (100 당량)을 처리하여 40 ℃에서 밤새 반응시켰다. 형광 표지된 고리형 펩토이드의 합성을 위해, 고리형 펩토이드의 디아미노부틸기에 5,6-카르복시플루오레세인 (5 당량) 및 HOBt (5 당량)를 DCM (500 μL)와 DMF (500 μL) 내에서 6 시간 동안 처리한 후, DMF (3x), DCM (3x), MeOH (3x) 및 DMF (3x)로 세척하였다.The fluorescently labeled cyclic peptoid of the present invention was synthesized as shown in Figure 1. Specifically, Linkamide MBHA resin (100 mg, 45 μmol) was swelling with DMF (2 mL) in a 5 mL fritted syringe for 8 hours at 4 °C. The Fmoc protecting group was removed by treatment with 20% piperidine in DMF solution (2 x 10 min). Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 equivalents), HBTU (5 equivalents), HOBt (5 equivalents), and DIPEA (10 equivalents) were reacted with the resin to be synthesized at room temperature in DMF (1 mL) solvent. After reaction for 2 hours, the reaction mixture was discharged and the resin was washed with DMF (3x), DCM (3x), MeOH (3x) and DMF (3x). After deprotection of Fmoc, the resulting amine was bromoacetylated by treatment with 1 M bromoacetic acid (20 equiv) and 1 M DIC (20 equiv) in DMF at room temperature. Equal amounts of beads were treated with 2 M primary amine in DMF at room temperature. This process was repeated until linear peptoids of 5-8 MER were synthesized. In the final step of peptoid synthesis, in order to convert the N-terminus of the peptoid into a triazine form, cyanuric chloride (5 equivalents) and DIPEA (10 equivalents) were treated in THF and reacted at room temperature for 3 hours. Afterwards, the resin was washed with DMF (3x), DCM (3x), MeOH (3x), and DMF (3x). To remove the Trt group of the cysteine residue, the resin was treated with 5% trifluoroacetic acid (TFA) and 5% triisopropylsilane (TIS) in DCM and reacted for 30 minutes, followed by DCM (3x) and MeOH (3x). and DMF (3x). The peptoid containing triazine on the resin was reacted with 10% DIPEA in DMF solvent at room temperature overnight, and then washed with DMF (3x), DCM (3x), MeOH (3x), and DMF (3x). To replace the chloride group remaining in the triazine of the cyclized peptoid with a diaminobutyl group, diaminobutane (100 equivalents) was treated in the presence of DIPEA (20 equivalents) in DMF and reacted at 40° C. overnight. For the synthesis of fluorescently labeled cyclic peptoids, 5,6-carboxyfluorescein (5 equiv) and HOBt (5 equiv) were added to the diaminobutyl group of the cyclic peptoid in DCM (500 μL) and DMF (500 μL). 500 μL) for 6 hours and then washed with DMF (3x), DCM (3x), MeOH (3x) and DMF (3x).
레진에서 합성된 화합물을 분리하기 위해서, 레진은 실온에서 2 시간 동안 1 mL 절단 칵테일 (cleavage cocktail) (95 % TFA, 2.5 % 트리이소프로필실레인 (triisopropylsilane, TIS), 및 2.5 % 물)이 처리되었다. 분리된 화합물은 HPLC로 정제하였다. To separate the synthesized compounds from the resin, the resin was treated with 1 mL cleavage cocktail (95% TFA, 2.5% triisopropylsilane (TIS), and 2.5% water) for 2 hours at room temperature. It has been done. The isolated compound was purified by HPLC.
정제된 화합물 L1-4의 MS 및 LC 데이터는 도 2a 내지 2d, 정제된 화합물 C1-4의 MS 및 LC 데이터는 도 2e 내지 2h, 정제된 화합물 C5-6의 MS 및 LC 데이터는 도 3a 내지 3b, 정제된 화합물 C7-15의 MS 및 LC 데이터는 도 4a 내지 4i에 나타내었다.MS and LC data of purified compound L1-4 are shown in Figures 2A to 2D, MS and LC data of purified compound C1-4 are shown in Figures 2E to 2H, and MS and LC data of purified compound C5-6 are shown in Figures 3A to 3B. , MS and LC data of purified compound C7-15 are shown in Figures 4A to 4I.
세포 투과성 확인Check cell permeability
실시예 1에서 합성된 4종의 선형 펩토이드 L1-4 및 15종의 고리형 펩토이드를 A549 세포에 처리하여 유세포 분석과 공초점형 형광현미경 실험을 통해서 세포에 얼마나 잘 투과되는지 확인하였다. 이때, 종래 세포-투과 펩타이드로 알려진 아르기닌 8량체 (R8)와의 세포 투과성을 비교하기 위해, 형광이 표지된 아르기닌 8량체 (R8-FL)를 합성하여 대조군으로 사용하였다.Four types of linear peptoids L1-4 and 15 types of cyclic peptoids synthesized in Example 1 were treated with A549 cells, and how well they penetrated the cells was confirmed through flow cytometry and confocal fluorescence microscopy experiments. At this time, in order to compare cell permeability with arginine octamer ( R8 ), known as a conventional cell-penetrating peptide, fluorescently labeled arginine octamer ( R8 -FL) was synthesized and used as a control.
2-1. 세포 배양2-1. cell culture
A549 세포 (ATCC CCL-185™)는 10 % FBS와 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 RPMI 1640 배지에서 37 ℃, 5 % CO2 조건으로 배양되었다. A549 cells (ATCC CCL-185™) were cultured in RPMI 1640 medium containing 10% FBS and penicillin-streptomycin at 37°C and 5% CO 2 conditions.
2-2. 공초점 현미경을 이용한 이미징2-2. Imaging using confocal microscopy
A549 세포를 8-웰 플레이트에 7,500개의 세포 밀도로 37 ℃, 5 % CO2 의 밀도로 24 시간 동안 배양하였다. 세포를 24 시간동안 Opti-MEM 배지에서 10 μM의 형광 표지된 펩토이드를 처리하였다. 배양 후, Hoechst 33342 (10 μg/mL)를 첨가하여 37 ℃, 5 % CO2에서 20 분 동안 세포핵을 염색하였다. 세포를 둘베코 인산염완충식염수 (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, DPBS)로 세척하였다. 그 후, MitoTrackerTM Red CMSRos (4 μM)를 첨가하여 37 ℃, 5 % CO2에서 20분 동안 미토콘드리아를 염색하였고, DPBS 로 세척하였다. 이미징은 공초점 현미경 (Olympus FV1000)을 사용하여 상온에서 수행하였다.A549 cells were cultured in an 8-well plate at a density of 7,500 cells at 37°C and 5% CO 2 for 24 hours. Cells were treated with 10 μM of fluorescently labeled peptoid in Opti-MEM medium for 24 hours. After incubation, Hoechst 33342 (10 μg/mL) was added to stain cell nuclei for 20 minutes at 37°C and 5% CO 2 . Cells were washed with Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS). Afterwards, MitoTracker TM Red CMSRos (4 μM) was added to stain mitochondria for 20 minutes at 37°C in 5% CO 2 and washed with DPBS. Imaging was performed at room temperature using a confocal microscope (Olympus FV1000).
2-3. 유세포 실험2-3. flow cytometry experiments
A549 세포를 24-웰 플레이트에 75,000개의 세포 밀도로 37 ℃, 5 % CO2에서 24시간 동안 배양하였다. 형광이 표지된 펩타이드를 Opti-MEM 배지에서 10 μM의 농도로 세포에 처리하였다. 그 후, 세포를 37 ℃, 5 % CO2에서 1 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 차가운 DPBS로 2회 세척하고 트립신 처리하였다. 트립신 처리된 세포를 에펜도르프 튜브에 옮겨 침전시킨 후, 차가운 DPBS에 재현탁시켰다. 프로피디움 요오드화물 (propidium iodide, PI) (0.5 μg/mL)을 포함한 DPBS와 세포를 함께 배양하였고, BD FACS 칼리버 유세포 분석기에 의해 10,000 개의 살아있는 세포에 대하여 분석하였다. PI로 염색된 세포는 죽은 세포이므로 분석에서 제외시켰다.A549 cells were cultured at a density of 75,000 cells in a 24-well plate at 37°C and 5% CO 2 for 24 hours. Fluorescently labeled peptide was treated with cells at a concentration of 10 μM in Opti-MEM medium. Afterwards, the cells were cultured at 37°C and 5% CO 2 for 1 hour. After incubation, cells were washed twice with cold DPBS and trypsinized. The trypsinized cells were transferred to an Eppendorf tube, precipitated, and then resuspended in cold DPBS. Cells were cultured with DPBS containing propidium iodide (PI) (0.5 μg/mL), and 10,000 live cells were analyzed by BD FACS caliber flow cytometer. Cells stained with PI were dead cells and were therefore excluded from the analysis.
도 2i에 나타난 바와 같이, 구아니딘기의 숫자가 증가할수록 세포에 잘 투과되었고, 구아니딘기의 숫자에 상관없이 고리형 펩토이드가 선형 펩토이드에 비해 현저하게 향상된 세포 투과성을 나타냄을 확인하였다.As shown in Figure 2i, as the number of guanidine groups increased, cell penetration improved, and it was confirmed that cyclic peptoids showed significantly improved cell permeability compared to linear peptoids, regardless of the number of guanidine groups.
또한, 도 3c에 나타난 바와 같이, 구아니딘기와 골격의 질소 사이 메틸렌기 수가 4개인 8량체 고리형 펩토이드 C4와 비교하였을 때, 구아니딘기와 골격의 질소 사이 메틸렌기 수가 6개인 8량체 고리형 펩토이드 C6의 세포 투과성이 더 좋아진 것을 확인하였다.In addition, as shown in Figure 3c, compared to the octameric cyclic peptoid C4 , which has 4 methylene groups between the guanidine group and the nitrogen of the skeleton, the octameric cyclic peptoid has 6 methylene groups between the guanidine group and the nitrogen of the skeleton. It was confirmed that the cell permeability of de C6 was improved.
또한, 도 4j에 나타난 바와 같이, 8량체의 고리형 펩토이드에 각각 1개, 2개 및 3개의 벤질기를 도입한 C7-9의 양친매성 고리형 펩토이드들 중에서, R2와 R3에 2개의 벤질기를 가지는 C8의 세포 투과성이 우수한 것을 확인하였다. 이 결과를 바탕으로 나프틸기, 인돌기, 또는 디페닐에틸기의 방향성 작용기를 R2에 치환하여 세포 투과성을 비교하였고, R2에 디페닐에틸기로 치환된 C12의 세포 투과성이 뛰어난 것을 확인하였다. 그 후, R2가 벤질기로 치환되고, R3에 디페닐에틸, 트리플루오로메틸벤질, 또는 피페로닐기로 치환하였을 때 세포 투과성을 비교하였고, R3가 피페로닐기로 치환된 C15의 세포 투과성이 가장 좋은 것을 확인하였다. 또한, C15의 세포 투과성은 종래 세포-투과 펩타이드로 알려진 R8과 비교하여 8 배 이상 세포 투과성이 우수한 것을 확인하였다.In addition, as shown in Figure 4j, among the amphipathic cyclic peptoids of C7-9 in which 1, 2, and 3 benzyl groups are introduced into the octamer cyclic peptoid, respectively, R 2 and R 3 It was confirmed that C8 , which has two benzyl groups, has excellent cell permeability. Based on these results, the cell permeability was compared by substituting R 2 with an aromatic functional group such as a naphthyl group, indole group, or diphenylethyl group, and it was confirmed that C12 in which R 2 was substituted with a diphenylethyl group had excellent cell permeability. Afterwards, cell permeability was compared when R 2 was substituted with a benzyl group and R 3 was substituted with a diphenylethyl, trifluoromethylbenzyl, or piperonyl group, and C15 cells in which R 3 was substituted with a piperonyl group were compared. It was confirmed that the permeability was the best. In addition, it was confirmed that the cell permeability of C15 was more than 8 times better than that of R8 , which was previously known as a cell-penetrating peptide.
또한, 도 4j의 공초점 형광 현미경 사진 나타난 바와 같이, C15는 R8 및 C6에 비해 형광의 세기가 강하며, C6과 C15는 세포 내 미토콘드리아로 이동하는 것으로 확인되었다.In addition, as shown in the confocal fluorescence microscopy of Figure 4j, C15 has a stronger fluorescence intensity than R8 and C6, and C6 and C15 were confirmed to move into intracellular mitochondria.
세포 투과 메커니즘 확인Confirmation of cell penetration mechanism
본 실시예에서는 양친매성 고리형 펩토이드가 세포 내로 투과하는 메커니즘을 확인하기 위해, 4 ℃ 조건 및 아자이드화 나트륨이 첨가된 배지에서 37 ℃, 5 % CO2의 조건 하에서의 C15의 세포 투과성을 비교하였다.In this example, in order to confirm the mechanism by which the amphipathic cyclic peptoid penetrates into cells, the cell permeability of C15 was compared under conditions of 4°C and 37°C and 5% CO 2 in a medium supplemented with sodium azide. did.
구체적으로, A549 세포를 24-웰 플레이트에 75,000개의 세포 밀도로 37 ℃, 5 % CO2에서 24시간 동안 배양하였다. 형광이 표지된 펩타이드를 처리하기 전, 세포를 4 ℃에서 Opti-MEM에서, 또는 37 ℃에서 아자이드화 나트륨이 첨가된 Opti-MEM에서 30 분 동안 배양하였고, 그 이후, 동일한 조건에서 Opti-MEM 배지 내에서 10 μM의 농도로 세포에 처리하였다. 그 후, 세포를 37 ℃, 5 % CO2에서 1 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 차가운 DPBS로 2회 세척하고 트립신 처리하였다. 트립신 처리된 세포를 에펜도르프 튜브에 옮겨 침전시킨 후, 차가운 DPBS에 재현탁시켰다. 프로피디움 요오드화물 (propidium iodide, PI) (0.5 μg/mL)을 포함한 DPBS와 세포를 함께 배양하였고, BD FACS 칼리버 유세포 분석기에 의해 10,000 개의 살아있는 세포에 대하여 분석하였다. PI로 염색된 세포는 죽은 세포이므로 분석에서 제외시켰다. 각 조건의 세포 투과성은 형광의 세기로 측정하였다. 각 조건의 세포 투과도 (%)는 37 ℃, 5 % CO2에서 C15의 세포 투과성의 형광의 세기와 비교하였다.Specifically, A549 cells were cultured in a 24-well plate at a density of 75,000 cells at 37°C and 5% CO 2 for 24 hours. Before treatment with fluorescently labeled peptides, cells were incubated for 30 min in Opti-MEM at 4°C or in Opti-MEM supplemented with sodium azide at 37°C, and then incubated in Opti-MEM under the same conditions. Cells were treated at a concentration of 10 μM in medium. Afterwards, the cells were cultured at 37°C and 5% CO 2 for 1 hour. After incubation, cells were washed twice with cold DPBS and trypsinized. The trypsinized cells were transferred to an Eppendorf tube, precipitated, and then resuspended in cold DPBS. Cells were cultured with DPBS containing propidium iodide (PI) (0.5 μg/mL), and 10,000 live cells were analyzed by BD FACS caliber flow cytometer. Cells stained with PI were dead cells and were therefore excluded from the analysis. Cell permeability in each condition was measured by the intensity of fluorescence. The cell permeability (%) of each condition was compared with the fluorescence intensity of cell permeability of C15 at 37°C and 5% CO 2 .
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 4 ℃에서의 C15의 세포 투과도는 크게 감소하였고, 이는 엔도시토시스가 C15의 세포투과에 크게 관여하는 것을 의미한다. 또한, 아자이드화 나트륨이 첨가된 Opti-MEM에서 C15의 세포 투과도가 크게 감소하였고, 이는 에너지 의존 엔도시토시스에 의해 C15이 세포 투과 하는 것을 의미한다.As a result, as shown in Figure 5, the cell permeability of C15 at 4°C was greatly reduced, which means that endocytosis is greatly involved in the cell permeation of C15 . In addition, the cell permeability of C15 was greatly reduced in Opti-MEM to which sodium azide was added, which means that C15 penetrates cells through energy-dependent endocytosis.
트립신 내 안정성 실험Stability test in trypsin
고리형 펩토이드가 기존의 펩타이드 기반의 분자 수송체에 비해서 가지는 중요한 특성 중 하나는 생분해 효소에 대한 저항성이다. 이를 확인하기 위해서, 본 실시예에서는 C15 또는 R8을 트립신과 함께 37 ℃에서 배양하여 이들의 효소 내 안정성을 LC/MS를 통해 분석하고자 하였다.One of the important properties that cyclic peptoids have compared to existing peptide-based molecular transporters is resistance to biodegradation enzymes. To confirm this, in this example, C15 or R8 was incubated with trypsin at 37°C and their stability in the enzyme was analyzed through LC/MS.
구체적으로, 펩토이드 또는 펩타이드 용액을 37 ℃에서 0.1 μg mL-1 트립신을 포함하는 DPBS 버퍼에서 배양하였다. 다양한 시점 (0 - 12 시간)에 샘플의 50 μL를 분취하였다. 분취액을 200 μL로 묽히고 필터로 걸러낸 후, C18 칼럼이 장착된 LC/MS 로 분석하였다. 남아있는 펩토이드 또는 펩타이드 (%)는 크로마토그램에서 피크 면적을 490 nm에서 측정하고 적분하여 결정하였다. 면적을 트립신에 배양하기 전 샘플과 비교 하였다.Specifically, the peptoid or peptide solution was incubated in DPBS buffer containing 0.1 μg mL -1 trypsin at 37 °C. 50 μL of sample was aliquoted at various time points (0 - 12 hours). The aliquot was diluted to 200 μL, filtered, and analyzed by LC/MS equipped with a C18 column. The remaining peptoid or peptide (%) was determined by measuring the peak area at 490 nm in the chromatogram and integrating. Areas were compared to samples before incubation in trypsin.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 30 분만에 거의 모두 분해되는 R8에 비해 고리형 펩토이드 C15는 향상된 생분해 효소 저항성을 가지는 것을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 6, it was confirmed that cyclic peptoid C15 had improved biodegradation enzyme resistance compared to R8 , which was almost completely decomposed in 30 minutes.
고리형 펩토이드를 이용한 세포내 생리활성물질 전달Delivery of intracellular bioactive substances using cyclic peptoids
5-1. PIP-Box 펩타이드-링커 (SAVLQKKITDYFHPKK) 합성5-1. PIP-Box peptide-linker (SAVLQKKITDYFHPKK) synthesis
링크 아미드 MBHA 레진 (100 mg, 45 μmol)을 4 ℃에서 8시간 동안 5 mL 프릿티드 (fritted) 주사기에서 DMF (2 mL)로 팽창(swelling) 시켰다. DMF 용액 상의 20 % 피페리딘 (2 x 10 분)을 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 화합물이 합성될 레진에 Fmoc 보호 아미노산 (5 당량), HBTU (5 당량), HOBt (5 당량), 및 DIPEA (10 당량)을 DMF (1mL) 용매에서 실온 하에 반응하였다. 2 시간 동안 반응을 시킨 뒤, 반응 혼합물을 배출시키고, 레진을 DMF (3x), DCM (3x), MeOH (3x) 및 DMF (3x)로 세척하였다. 이 과정을 반복하여 원하는 16 잔기의 선형 펩타이드를 얻었다. 16 잔기의 선형 펩타이드에 연결할 3-(2-피리딜다이티오)부티르산 링커는 기존 과정(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2008, 105, 12128-12133.)을 참고하여 합성하였고, 16 잔기 펩타이드에 펩타이드 반응으로 연결하였다.Linkamide MBHA resin (100 mg, 45 μmol) was swelling with DMF (2 mL) in a 5 mL fritted syringe for 8 hours at 4°C. The Fmoc protecting group was removed by treatment with 20% piperidine in DMF solution (2 x 10 min). Fmoc-protected amino acid (5 equivalents), HBTU (5 equivalents), HOBt (5 equivalents), and DIPEA (10 equivalents) were reacted to the resin to be synthesized at room temperature in DMF (1 mL) solvent. After reaction for 2 hours, the reaction mixture was discharged and the resin was washed with DMF (3x), DCM (3x), MeOH (3x) and DMF (3x). This process was repeated to obtain the desired 16-residue linear peptide. The 3-(2-pyridyldithio)butyric acid linker to connect to the 16-residue linear peptide was synthesized by referring to the existing process ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 2008 , 105 , 12128-12133.), and the 16-residue It was connected to the peptide through a peptide reaction.
레진에서 합성된 화합물을 분리하기 위해서, 레진은 실온에서 2 시간 동안 1 mL 절단 칵테일 (cleavage cocktail) (95 % TFA, 2.5 % 트리이소프로필실레인 (triisopropylsilane, TIS), 및 2.5 % 물)이 처리되었다. 분리된 화합물은 HPLC로 정제하였다.To separate the synthesized compounds from the resin, the resin was treated with 1 mL cleavage cocktail (95% TFA, 2.5% triisopropylsilane (TIS), and 2.5% water) for 2 hours at room temperature. It has been done. The isolated compound was purified by HPLC.
정제된 화합물 PIP-Box 펩타이드의 MS 및 LC 데이터는 도 7a에 나타내었다.MS and LC data of the purified compound PIP-Box peptide are shown in Figure 7a.
5-2. 티올기를 포함하는 고리형 펩토이드 (5-2. Cyclic peptoid containing a thiol group ( HS-C15)HS-C15) 합성 synthesis
마찬가지로, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 도 1에 나타난 바와 같이 티올기를 포함하는 고리형 펩토이드 HS-C15를 합성하였다. 티올기를 포함하는 고리형 펩토이드는 트리아진에 남아있는 염소를 Mmt로 티올기가 보호된 시스테아민으로 치환하기 위해, NMP 내 DIPEA (20 당량)의 존재 하에서 Mmt로 티올기가 보호된 시스테아민 (20 당량)을 처리하여 60 ℃에서 밤새 반응시켰다.Likewise, cyclic peptoid HS-C15 containing a thiol group was synthesized as shown in Figure 1 in the same manner as in Example 1. Cyclic peptoids containing a thiol group are prepared by cysteamine (cysteamine) with a thiol group protected with Mmt in the presence of DIPEA (20 equivalents) in NMP in order to replace the chlorine remaining in the triazine with cysteamine with a thiol group protected with Mmt. 20 equivalents) was treated and reacted at 60°C overnight.
레진에서 합성된 화합물을 분리하기 위해서, 레진은 실온에서 2 시간 동안 1 mL 절단 칵테일 (cleavage cocktail) (95 % TFA, 2.5 % 트리이소프로필실레인 (triisopropylsilane, TIS), 및 2.5 % 물)이 처리되었다. 분리된 화합물은 HPLC로 정제하였다. To separate the synthesized compounds from the resin, the resin was treated with 1 mL cleavage cocktail (95% TFA, 2.5% triisopropylsilane (TIS), and 2.5% water) for 2 hours at room temperature. It has been done. The isolated compound was purified by HPLC.
정제된 화합물 HS-C15 의 MS 및 LC 데이터는 도 7b에 나타내었다.MS and LC data of purified compound HS-C15 are shown in Figure 7b.
5-3. 시스테인기를 포함하는 아르기닌 8량체 (5-3. Arginine octamer containing a cysteine group ( CRRRRRRRRCRRRRRRRR ) 합성) synthesis
상기 실시예 5-1의 PIP-Box 펩타이드 합성과 유사한 방법을 이용하여 시스테인기를 포함하는 아르기닌 8량체 펩타이드를 합성하였다. An arginine octamer peptide containing a cysteine group was synthesized using a method similar to the PIP-Box peptide synthesis in Example 5-1.
레진에서 합성된 화합물을 분리하기 위해서, 레진은 실온에서 2 시간 동안 1 mL 절단 칵테일 (cleavage cocktail) (95 % TFA, 2.5 % 트리이소프로필실레인 (triisopropylsilane, TIS), 및 2.5 % 물)이 처리되었다. 분리된 화합물은 HPLC로 정제하였다.To separate the synthesized compounds from the resin, the resin was treated with 1 mL cleavage cocktail (95% TFA, 2.5% triisopropylsilane (TIS), and 2.5% water) for 2 hours at room temperature. It has been done. The isolated compound was purified by HPLC.
정제된 화합물 R8의 MS 및 LC 데이터는 도 7c에 나타내었다.MS and LC data of purified compound R8 are shown in Figure 7c.
5-4. PIP-Box 펩타이드-분자 수송체 결합체 (PIP-Box 펩타이드-5-4. PIP-Box peptide-molecular transporter conjugate (PIP-Box peptide- C15C15 및 PIP-Box 펩타이드- and PIP-Box peptide- R8R8 ) 합성) synthesis
C-R8와 HS-C15 (1 당량)을 PIP-Box 펩타이드-링커와 500 μL 무수 DMF에 용해시키고 상온에서 밤새 교반하였다. 이렇게 합성한 화합물은 HPLC로 정제하였다. C-R8 and HS-C15 (1 equivalent) were dissolved with PIP-Box peptide-linker in 500 μL anhydrous DMF and stirred at room temperature overnight. The compound synthesized in this way was purified by HPLC.
정제된 화합물 PIP-Box 펩타이드-C15 및 PIP-Box 펩타이드-R8의 MS 및 LC 데이터는 각각 도 7d 및 7e에 나타내었다.MS and LC data of purified compounds PIP-Box peptide- C15 and PIP-Box peptide- R8 are shown in Figures 7d and 7e, respectively.
5-5. 세포 독성 실험5-5. Cytotoxicity experiments
세포 독성 분석을 위해, 1,000 개의 HeLa 세포 (ATCC CCL-2™) 또는 A549 세포 (ATCC CCL-185™)를 96-웰 플레이트의 각 웰에 24 시간 동안 배양하였다. 그 후, DPBS로 2회 세척한 다음, 다양한 농도의 HS-C15, PIP-Box 펩타이드, PIP-Box 펩타이드-C15 결합체, PIP-Box 펩타이드-R8 결합체 또는 DMSO를 24 시간 동안 Opti-MEM 배지에서 처리하였다. 세포 생존 정도는 Cyto X Cell Viability Assay kit (LPS 솔루션)의 프로토콜을 사용하여 측정하였다. For cytotoxicity assays, 1,000 HeLa cells (ATCC CCL-2™) or A549 cells (ATCC CCL-185™) were cultured in each well of a 96-well plate for 24 hours. Afterwards, the cells were washed twice with DPBS and then treated with various concentrations of HS-C15 , PIP-Box peptide, PIP-Box peptide- C15 conjugate, PIP-Box peptide- R8 conjugate or DMSO in Opti-MEM medium for 24 hours. did. The degree of cell survival was measured using the protocol of the Cyto
그 결과, 도 7f에 나타난 바와 같이 HS-C15와 PIP-Box 펩타이드는 세포 생존에 영향을 미치지 않았고, PIP-Box 펩타이드-C15 결합체가 PIP-Box 펩타이드-R8 결합체와 비교하여 더 낮은 농도에서 농도 의존적으로 HeLa 세포 또는 A549 세포의 생장을 저해하는 것을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 7f, HS-C15 and PIP-Box peptides did not affect cell survival, and the PIP-Box peptide- C15 conjugate showed a concentration-dependent effect at a lower concentration compared to the PIP-Box peptide- R8 conjugate. It was confirmed that the growth of HeLa cells or A549 cells was inhibited.
이러한 PIP-Box 펩타이드-C15 결합체의 세포 독성이 세포 사멸에 의한 것인지 확인하기 위하여, 아넥신-V 세포사멸 분석(Annexin-V Apoptosis assay)을 실시하였다. 구체적으로, 100,000 개의 HeLa 세포를 24-웰 플레이트의 각 웰에 24 시간동안 배양하였고, DPBS로 2회 세척하였다. 그 후, 10 μM의 HS-C15, PIP-Box 펩타이드, PIP-Box 펩타이드-C15 결합체 또는 DMSO를 24 시간동안 Opti-MEM 배지에서 처리하였다. 배양 후, 세포를 에펜도르프 튜브에 침전시키고, 차가운 DPBS로 재현탁시켰다. 세포사멸 활성은 Ezway Annexin V-FITC apoptosis kit (KOMABIOTECH)의 프로토콜을 사용하여 측정하였다. BD FACS 칼리버 유세포 분석기에 의해 10,000 개의 살아있는 세포에 대하여 분석하였다.To confirm whether the cytotoxicity of the PIP-Box peptide- C15 complex was caused by cell death, Annexin-V Apoptosis assay was performed. Specifically, 100,000 HeLa cells were cultured in each well of a 24-well plate for 24 hours and washed twice with DPBS. Afterwards, 10 μM of HS-C15 , PIP-Box peptide, PIP-Box peptide- C15 conjugate or DMSO was treated in Opti-MEM medium for 24 hours. After incubation, cells were settled in Eppendorf tubes and resuspended with cold DPBS. Apoptotic activity was measured using the protocol of the Ezway Annexin V-FITC apoptosis kit (KOMABIOTECH). 10,000 live cells were analyzed by BD FACS caliber flow cytometer.
그 결과, 도 7g에 나타난 바와 같이 PIP-Box 펩타이드-C15 결합체를 처리하였을 때 Annexin V 와 PI의 세기가 증가하였으며, 이는 결합체에 의해 초기 세포사멸과 후기 세포사멸 세포의 분포가 높은 것을 의미한다. 결과적으로, 양친매성 고리형 펩토이드 C15이 세포막 투과가 어려운 펩타이드를 세포 내로 전달하였으며, 이로 인해 세포 사멸을 유발하였음을 시사한다.As a result, as shown in Figure 7g, when the PIP-Box peptide- C15 conjugate was treated, the intensity of Annexin V and PI increased, which means that the distribution of early and late apoptotic cells was high due to the conjugate. As a result, this suggests that the amphipathic cyclic peptoid C15 delivered a peptide that had difficulty penetrating the cell membrane into the cells, thereby causing cell death.
Claims (22)
[화학식 1]
-RaX1X2X3X4X5X6X7X8-NHC(Rb)HCONH2
상기 화학식 1에서,
X1, X2, 및 X3은 각각 독립적으로 존재하지 않거나, -C(=O)CH2N(Rc)- 또는 -C(=O)CH2N(Rd)-이고, 여기서, X1, X2, 및 X3은 모두 존재하지 않거나, X3이 존재하지 않는 경우 X1 및 X2는 존재할 수 없고, X2가 존재하지 않는 경우 X1이 존재할 수 없으며;
X4, X5, X6, X7 및 X8은 각각 독립적으로 -C(=O)CH2N(Rc)-이고;
Ra는 트리아진기이며;
Rb는 -(CH2)(S)-이고;
Rc는 -NHC(=NH)NH2로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 C2-10 알킬기이며;
Rd는 하나 이상의 Re로 치환되는 직쇄 또는 분지쇄 C1-6 알킬기이거나, 또는 O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 C5-10 헤테로 아릴기로 치환되는 직쇄 또는 분지쇄 C1-6 알킬기이고;
Re는 하나 이상의 할로겐으로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 C1-6 알킬기로 치환되는 C6-14 아릴기이거나, 또는 치환되지 않은 C6-14 아릴기이며;
Ra와 Rb는 서로 연결될 수 있다.Cyclic peptoid represented by Formula 1:
[Formula 1]
-R a _ _ _ _ _ _ _ _ _
In Formula 1,
X 1 , X 2 , and X 1 , X 2 , and X 3 cannot all exist, or if X 3 does not exist, then X 1 and
X 4 , X 5 , X 6 , X 7 and X 8 are each independently -C(=O)CH 2 N(R c )-;
R a is a triazine group;
R b is -(CH 2 )(S)-;
R c is a straight or branched C 2-10 alkyl group substituted with -NHC(=NH)NH 2 ;
R d is a straight chain or branched C 1-6 alkyl group substituted with one or more R e , or a straight chain substituted with a C 5-10 heteroaryl group containing one or more heteroatoms selected from the group consisting of O, N and S. or a branched chain C 1-6 alkyl group;
R e is a C 6-14 aryl group substituted with a straight-chain or branched C 1-6 alkyl group substituted with one or more halogens, or an unsubstituted C 6-14 aryl group;
R a and R b can be connected to each other.
X1, X2 및 X3은 각각 독립적으로 존재하지 않거나, N-(2-에틸구아니딘)글리신 (Netg), N-(4-부틸구아니딘)글리신 (Nbtg), N-(6-헥실구아니딘)글리신 (Nhxg), N-(페닐메틸)글리신 (Npm), N-(나프틸메틸)글리신 (Nnaph), N-(2-인돌에틸)글리신 (Ntrp), N-(디페닐에틸)글리신 (Ndp), N-(트리플루오로메틸벤질)글리신 (Ntfmbn) 또는 N-(피페로닐)글리신 (Npip)일 수 있고, 여기서, X1, X2, 및 X3은 모두 존재하지 않거나, X3이 존재하지 않는 경우 X1 및 X2는 존재할 수 없고, X2가 존재하지 않는 경우 X1이 존재할 수 없으며;
X4, X5, X6, X7 및 X8은 각각 독립적으로 N-(2-에틸구아니딘)글리신, N-(4-부틸구아니딘)글리신 또는 N-(6-헥실구아니딘)글리신인, 고리형 펩토이드.According to paragraph 1,
X 1 , X 2 and Glycine (Nhxg), N-(phenylmethyl)glycine (Npm), N-(naphthylmethyl)glycine (Nnaph), N-(2-indolethyl)glycine (Ntrp), N-(diphenylethyl)glycine ( Ndp), N-(trifluoromethylbenzyl)glycine (Ntfmbn) or N-(piperonyl)glycine (Npip), where X 1 , X 2 , and X 3 are all absent, or If 3 does not exist, then X 1 and X 2 cannot exist, and if X 2 does not exist, then X 1 cannot exist;
X 4 , X 5 , X 6 , X 7 and type peptoid.
[화학식 2]
-Ra-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-NHC(Rb)HCONH2
[화학식 3]
-Ra-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-NHC(Rb)HCONH2;
[화학식 4]
-Ra-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-NHC(Rb)HCONH2;
[화학식 5]
-Ra-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-NHC(Rb)HCONH2;
[화학식 6]
-Ra-Netg-Netg-Netg-Netg-Netg-Netg-Netg-Netg-NHC(Rb)HCONH2;
[화학식 7]
-Ra-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2;
[화학식 8]
-Ra-Npm-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2;
[화학식 9]
-Ra-Npm-Npm-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2;
[화학식 10]
-Ra-Npm-Npm-Npm-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2;
[화학식 11]
-Ra-Npm-Nnaph-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2;
[화학식 12]
-Ra-Npm-Ntrp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2;
[화학식 13]
-Ra-Npm-Ndp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2;
[화학식 14]
-Ra-Ndp-Ndp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2;
[화학식 15]
-Ra-Ntfmbn-Ndp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2; 또는
[화학식 16]
-Ra-Npip-Ndp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(Rb)HCONH2;로 표시될 수 있고;
상기 화학식 2 내지 16에서,
Ra는 트리아진기일 수 있고;
Rb는 -(CH2)(S)-일 수 있으며;
Ra와 Rb는 서로 연결되어 있는, 고리형 펩토이드.The method of claim 1, wherein the cyclic peptoid is:
[Formula 2]
-R a -Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-NHC(R b )HCONH 2
[Formula 3]
-R a -Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[Formula 4]
-R a -Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[Formula 5]
-R a -Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-Nbtg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[Formula 6]
-R a -Netg-Netg-Netg-Netg-Netg-Netg-Netg-Netg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[Formula 7]
-R a -Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[Formula 8]
-R a -Npm-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[Formula 9]
-R a -Npm-Npm-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[Formula 10]
-R a -Npm-Npm-Npm-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[Formula 11]
-R a -Npm-Nnaph-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[Formula 12]
-R a -Npm-Ntrp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[Formula 13]
-R a -Npm-Ndp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[Formula 14]
-R a -Ndp-Ndp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ;
[Formula 15]
-R a -Ntfmbn-Ndp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ; or
[Formula 16]
-R a -Npip-Ndp-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-Nhxg-NHC(R b )HCONH 2 ;;
In Formulas 2 to 16,
R a may be a triazine group;
R b may be -(CH 2 )(S)-;
R a and R b are cyclic peptoids that are linked to each other.
(b) 상기 고리형 펩토이드에 결합되는 목적 카르고 (cargo of interest)를 포함하는 약물 전달체.(a) the cyclic peptoid of any one of claims 1 to 4; and
(b) A drug carrier comprising a cargo of interest bound to the cyclic peptoid.
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
또는
이고,
여기서, 트리아진기에 결합된 R은 목적 카르고인, 약물 전달체.The method of claim 9, wherein the drug carrier:
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
or
ego,
Here, R bound to the triazine group is the target cargo, a drug carrier.
[화학식 17]
-X1X2X3X4X5X6X7X8-NHC(Rb)HCONH-
상기 화학식 17에서,
X1, X2, 및 X3은 각각 독립적으로 존재하지 않거나, -C(=O)CH2N(Rc)- 또는 -C(=O)CH2N(Rd)-이고, 여기서, X1, X2, 및 X3은 모두 존재하지 않거나, X3이 존재하지 않는 경우 X1 및 X2는 존재할 수 없고, X2가 존재하지 않는 경우 X1이 존재할 수 없고;
X4, X5, X6, X7 및 X8은 각각 독립적으로 -C(=O)CH2N(Rc)-이며;
Rb는 트리틸 (Trt), 디페닐메틸 (Dpm), 테트라하이드로피라닐 (Thp), tert-부틸 (tBu), 4-메톡시벤질 (Mob), 메틸벤질 (Meb), 1-아다만틸 (Ad), 벤질옥시메틸 (Bom), 2,4,6-트리메톡시벤질 (Tmob), 4,4′,4′′,-트리메톡시-트리페닐메틸 (TMTr), 4-메틸트리틸 (Mtt), 4-메톡시트리틸 (Mmt), 9H-크산텐-9-일 (Xan), 2-메톡시-9H-크산텐-9-일 (2-Moxan), 4,5,6-트리메톡시-2,2-디메틸-2,3-디하이드로벤조퓨란-7-메틸 (Tmbm), 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-메틸 (Pmcm), 2,2,4,6,7-펜타메틸-2,3-디하이드로벤조퓨란-5-메틸 (Pbfm), 4-메톡시벤질옥시메틸 (Mbom), 2,6-디메톡시벤질 (2,6-diMeOBn), 4-Methoxy-2-메틸벤질 (4-MeO-2MeBn) 및 4,4′-디메톡시디페닐메틸 (Ddm)로 이루어진 군으로부터 선택되는 보호기로 보호된 -(CH2)(S)-이고;
Rc는 -NHC(=NH)NH2로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 C2-10 알킬기이며;
Rd는 하나 이상의 Re로 치환되는 C1-6 직쇄 또는 분지쇄 알킬기이거나, 또는 O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 C6-10 헤테로 아릴기로 치환되는 C1-6 직쇄 또는 분지쇄 알킬기이고;
Re는 하나 이상의 할로겐으로 치환된 C1-6 직쇄형 알킬기로 치환되는 C6-14 아릴기이거나, 또는 치환되지 않은 C6-14 아릴기이며;
N-말단은 알릴옥시카르보닐 (Alloc), 노실 (Nosyl), 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소 사이클로헥스-1-일리덴)에틸 (Dde), 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 트리페닐메틸(트리틸) (Trt)의 화학적 보호기로 보호되고;
상기 트리아진을 포함하는 화합물은 X1의 N-말단에 결합하여, 상기 Rb로부터 보호기가 제거된 후의 -(CH2)SH에서 -SH와 탄소-황 결합을 통해 연결될 수 있다.A method for producing a cyclic peptoid, comprising the step of reacting a linear peptoid represented by the following formula (17) with a compound containing triazine and linking it through a cyclization reaction:
[Formula 17]
-X 1 _ _ _ _ _ _ _
In Formula 17 above,
X 1 , X 2 , and X 1 , X 2 , and X 3 cannot all exist, or if X 3 does not exist, then X 1 and
X 4 , X 5 , X 6 , X 7 and X 8 are each independently -C(=O)CH 2 N(R c )-;
R b is trityl (Trt), diphenylmethyl (Dpm), tetrahydropyranyl (Thp), tert-butyl (tBu), 4-methoxybenzyl (Mob), methylbenzyl (Meb), 1-adamane Til (Ad), benzyloxymethyl (Bom), 2,4,6-trimethoxybenzyl (Tmob), 4,4′,4′′,-trimethoxy-triphenylmethyl (TMTr), 4-methyl Trityl (Mtt), 4-methoxytrityl (Mmt), 9H-xanthen-9-yl (Xan), 2-methoxy-9H-xanthen-9-yl (2-Moxan), 4,5 ,6-trimethoxy-2,2-dimethyl-2,3-dihydrobenzofuran-7-methyl (Tmbm), 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-methyl (Pmcm) , 2,2,4,6,7-pentamethyl-2,3-dihydrobenzofuran-5-methyl (Pbfm), 4-methoxybenzyloxymethyl (Mbom), 2,6-dimethoxybenzyl (2 -(CH 2 ) protected with a protecting group selected from the group consisting of ,6-diMeOBn), 4-Methoxy-2-methylbenzyl (4-MeO-2MeBn) and 4,4′-dimethoxydiphenylmethyl (Ddm) (S)-;
R c is a straight or branched C 2-10 alkyl group substituted with -NHC(=NH)NH 2 ;
R d is a C 1-6 straight or branched chain alkyl group substituted with one or more R e , or C substituted with a C 6-10 heteroaryl group containing one or more heteroatoms selected from the group consisting of O, N and S. 1-6 is a straight-chain or branched-chain alkyl group;
R e is a C 6-14 aryl group substituted with a C 1-6 straight-chain alkyl group substituted with one or more halogens, or an unsubstituted C 6-14 aryl group;
N-terminus is allyloxycarbonyl (Alloc), Nosyl, 1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxo cyclohex-1-ylidene)ethyl (Dde), 9-fluorenylme protected with a chemical protecting group of toxycarbonyl (Fmoc) or triphenylmethyl(trityl) (Trt);
The compound containing the triazine may be bound to the N-terminus of
[화학식 18]
화학식 18에서,
2개의 X는 각각 독립적으로 클로로 (Chloro) 및 브로모 (Bromo) 또는 아이오도 (Iodo)이고;
R은 수소, 할로겐, C1-4알킬아미노 또는 C1-2알킬티오인, 고리형 펩토이드의 제조방법.The method of claim 17, wherein the triazine-containing compound is represented by the following formula (18):
[Formula 18]
In formula 18,
Two X's are each independently Chloro and Bromo or Iodo;
R is hydrogen, halogen, C 1-4 alkylamino or C 1-2 alkylthio, method for producing cyclic peptoid.
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