KR20230164418A - Propagation method by somatic embryogenesis and inducing of mini tuberous roots in Ligusticum officinale Makino - Google Patents
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Abstract
본 발명은 체세포배 발생을 이용한 식물체의 대량생산과 생존율 향상을 위해 소괴경을 유도하여 순화 후 건전한 식물체를 생산하는 천궁의 대량 생산방법에 관한으로, 본 발명의 체세포배 발생 및 소괴경 유도를 이용한 천궁의 대량 생산방법은 천궁의 대량 종묘 생산에 적합한 효율적인 체세포배 발생 유도와 소괴경 유도를 이용한 순화 기술을 제공할 수 있으며, 본 발명의 체세포배 발생과 소괴경을 이용한 천궁의 종묘 생산방법은 다양한 산림 약용자원의 종묘 생산까지 적용이 가능한 장점이 있다. The present invention relates to a method for mass production of plants using somatic embryo development and a method for mass production of Cheonung to produce healthy plants after acclimatization by inducing small tubers to improve survival rate, using somatic embryo development and small tuber induction of the present invention. The mass production method of Cheongung can provide an efficient induction of somatic embryo development and purification technology using small tuber induction suitable for mass production of Cheongung seedlings, and the method of producing Cheongung seedlings using somatic embryo development and small tuber induction of the present invention can be used in various ways. It has the advantage of being applicable to the production of seedlings from forest medicinal resources.
Description
본 발명은 체세포배 발생 및 소괴경 유도를 이용한 천궁의 대량 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 체세포배 발생을 이용한 식물체의 대량생산과 생존율 향상을 위해 소괴경을 유도하여 순화 후 건전한 식물체를 생산하는 천궁의 대량 생산방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for mass production of aster using somatic embryo development and tuber induction. More specifically, the mass production of plants using somatic embryo development and the production of healthy plants after acclimatization by inducing small tubers to improve survival rate. This is about the mass production method of Cheongung.
천궁(川芎)은 미나리과(Umbelliferae)에 속하는 다년생 초본식물로 학명은 Ligusticum officinale (Makino)로 명명되어 있다. 임가에서 재배되고 있는 천궁은 여러 개의 뿌리줄기(근경)가 덩어리져 뿌리를 만들고 있으며, 이것을 약용으로 사용한다.Cheongung (川芎) is a perennial herbaceous plant belonging to the Umbelliferae family and its scientific name is Ligusticum officinale (Makino). Cheongung, which is cultivated in forest homes, has several rhizomes (rhizomes) clump together to form roots, which are used for medicinal purposes.
천궁의 뿌리는 예로부터 말려서 한약재로 사용하였으며, 현대에서는 뿌리줄기에서 추출된 크로로제닉산(chlorogenic acid), 페루릭산(ferulic acid), 센큐노리드 에이(senkyunolide A), 리구스티리드(ligustilide) 등 단일 물질의 약리적 효능이 밝혀지며 혈관 신생성 억제, 당뇨합병증 억제, 신경세포사멸 억제에 효과가 있다는 연구 결과가 발표되었다.The roots of Cheongung have been dried and used as herbal medicine since ancient times, and in modern times, chlorogenic acid, ferulic acid, senkyunolide A, and ligustilide extracted from the rhizome. The pharmacological efficacy of a single substance has been revealed, and research results have been published showing that it is effective in suppressing angiogenesis, suppressing diabetic complications, and suppressing neuronal cell death.
또한, 이 성분들 중 리구스티드, 센큐노리드 에이와 뷰티리덴프사리드(butylidenpthalide)가 혈행 개선과 고지혈증 억제에 효능이 있다는 연구 결과도 최근에 보고되었다.In addition, research results were recently reported showing that among these ingredients, Rigustide, Sencunolide A, and butylidenpthalide are effective in improving blood circulation and suppressing hyperlipidemia.
천궁은 열매가 결실하지 않는 2배체로 알려져 있으며, 땅에 심은 1년차에 영양생장을 하고, 2년차 이후에는 추대하거나 개화하나 종자가 대부분 결실되지 않는다. 따라서 임가에서는 뿌리줄기를 나누어 그것을 종근으로 이용하여 번식하고 있다.Cheongung is known as a diploid that does not bear fruit. It grows vegetatively in the first year after planting in the ground, and after the second year, it grows or blooms, but most of the seeds do not bear fruit. Therefore, in forestry, the rhizomes are divided and used as seed roots for propagation.
그러나, 종근으로 번식 시 바이러스가 감염된 것을 사용할 경우, 생산량과 품질에 영향을 미침으로 바이러스가 계속 번지는 것에 주의해야 한다. 이러한 이유로 대량생산 및 바이러스를 제거하기 위한 증식 방법이 연구되어야 하는 실정이다. However, if virus-infected plants are used when propagating seedlings, caution must be taken as the virus may continue to spread, affecting production and quality. For this reason, mass production and propagation methods to eliminate viruses must be researched.
체세포배 발생을 통한 식물체의 증식방법은 식물체의 대량 생산을 위해 주로 사용되는 기술로 적은 양의 절편에서 적게는 몇십 개, 많게는 몇천 개의 식물체를 생산할 수 있는 조직배양 기술이다.Plant propagation through somatic embryogenesis is a technology mainly used for mass production of plants. It is a tissue culture technology that can produce from a few dozen to several thousand plants from a small amount of fragments.
또한, 체세포배 발생 유도 방법은 식물체의 바이러스 제거를 위한 기술로도 사용된다. 기존 천궁의 체세포배 발생에 관한 연구는 미숙화기로부터 체세포배 발생 유도(채 등 1994, Lee 등 2009), 화기절편으로 부터 체세포배발생 유도(조 등, 2000), 기내식물체의 줄기로부터 체세포배발생 유도(Adil 등 2018)등의 연구가 보고되어 있다.In addition, the method of inducing somatic embryo development is also used as a technology to remove viruses from plants. Existing studies on somatic embryo development in asteria include inducing somatic embryo development from immature stages (Chae et al. 1994, Lee et al. 2009), inducing somatic embryo development from immature stages (Cho et al., 2000), and somatic embryo development from stems of endophytic plants. Studies such as Yudo (Adil et al. 2018) have been reported.
그러나, 기 보고된 연구들은 기내에서 체세포배 발생 유도를 통한 기내식물체 생산에 대한 결론만을 도출하였다. 다음 과정인 기내에서 생산된 식물체를 포지 및 노지에 이식한 후 생존율을 높이는 기술은 보고된 것이 없다.However, previously reported studies only drew conclusions about the production of in-flight plants through induction of somatic embryogenesis in-flight. There has been no reported technology to increase the survival rate after transplanting the plants produced in-flight into the field or open field, which is the next process.
위에서 언급한 것과 같이 천궁은 감초와 같이 한약재에 대부분 첨가되는 재료이며, 약용자원으로 가치가 높다. 하지만 종자를 맺지 못하고 근경으로 번식해야 하는 어려움과 기후 온난화로 인한 재배지 감소로 이러한 문제를 타파하기 위해서는 조직배양 기술을 이용하여 외부 환경에 영향을 받지 않고 안정적으로 공급이 가능한 대량생산기술 개발이 필요한 시점이다.As mentioned above, Cheongung is an ingredient added to most herbal medicines, like licorice, and is highly valuable as a medicinal resource. However, in order to overcome these problems due to the difficulty of producing seeds and propagating by rhizome and the decrease in cultivation area due to climate warming, it is necessary to develop mass production technology that can provide a stable supply without being affected by the external environment using tissue culture technology. am.
본 발명에서는 천궁의 근경으로부터 신초를 유도하여 기내로 들인 후 확립된 식물체의 잎, 줄기, 뿌리 중 체세포배발생 유도 효율이 높은 잎 절편으로부터 체세포배발생을 유도한 후 기내식물체를 대량 생산하는 기술과 기내 소괴경을 유도하여 순화 후 포트에 이식 후 순화 생존율을 높이기 위한 기술을 개발하였다. 이러한 방법을 통해 최종적으로는 건전한 종묘 생산과 토양에서의 순화효율 향상에 대한 실용화를 위한 기술개발에 관한 것이다. In the present invention, a technique is provided to induce shoots from the rhizomes of the archaea, introduce them into the plant, induce somatic embryogenesis from leaf segments with high somatic embryogenesis induction efficiency among the leaves, stems, and roots of established plants, and then mass-produce the plants within the plant. We developed a technique to induce acclimatization of tubers in-flight and increase the acclimatization survival rate after transplantation into the port. Through this method, the ultimate goal is to develop technology for practical use in producing healthy seedlings and improving purification efficiency in the soil.
본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 연구를 수행한 결과, 천궁의 체세포배 발생 유도와 소괴경 생산을 통한 토양에서의 생존율 향상을 통하여 우량 종묘를 대량 생산할 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다.As a result of conducting research to solve the problems of the prior art as described above, the present inventors found that it is possible to mass-produce superior seedlings by inducing somatic embryo development and improving the survival rate in the soil through the production of small tubers. The invention was completed.
따라서, 본 발명의 목적은 천궁 기내식물체의 엽, 줄기, 뿌리 절편 중 체세포배발생유도 효율이 가장 높은 엽 절편을 재료로 체세포배 발생을 유도하여 식물체를 생산하고, 상기 식물체로부터 소괴경을 유도하여 순화효율을 향상시킴으로써, 천궁 건전 종묘의 대량 생산방법을 제공하는 것이다.Therefore, the purpose of the present invention is to produce plants by inducing somatic embryo development using leaf fragments with the highest somatic embryogenesis induction efficiency among the leaves, stems, and root fragments of endophytic plants, and to induce tubers from the plants. By improving the purification efficiency, it provides a method for mass production of healthy Cheongung seedlings.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, (a) 천궁의 뇌두를 소독하여 기내식물체를 유도한 후, 상기 유도된 기내식물체의 신초를 증식하는 단계, (b) 상기 유도된 기내식물체로부터 체세포배 발생을 유도하는 단계, (c) 상기 유도된 체세포배로부터 발아체 및 식물체를 유도하는 단계, (d) 상기 유도된 식물체로부터 소괴경을 유도하는 단계, 및 (e) 상기 유도된 소괴경을 순화하는 단계;를 포함하는 천궁의 대량 생산방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention includes the following steps: (a) sterilizing the brain head of the cervix to induce endophytes, and then proliferating shoots of the induced endophytes; (b) somatic cells from the induced endophytes; inducing embryo development, (c) inducing germination bodies and plants from the induced somatic embryos, (d) inducing tubers from the induced plants, and (e) inducing the induced tubers. Provides a mass production method of Cheongung including a purification step.
본 발명의 일 구현예로 상기 (a) 단계는 천궁 뇌두를 적출하여 소독한 후, MS 기본배지에 1.0 mg/L의 벤질아미노 퓨린, 1%(w/w)의 수크로오스 및 0.3%(w/w)의 젤라이트가 첨가된 신초 유도 배지에서 기내식물체의 신초를 유도하는 단계, 및 MS 배지에 3%(w/w)의 수크로오스와 0.3%(w/w)의 젤라이트가 첨가된 신초 증식 배지에서, 상기 유도된 신초를 배양하여 신초를 증식하는 단계를 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, step (a) is performed by extracting and disinfecting the forebrain brain head, and then adding 1.0 mg/L benzylamino purine, 1% (w/w) sucrose, and 0.3% (w/w) to MS basic medium. w) A step of inducing shoots of indoor plants in a shoot induction medium to which Gelite was added, and shoot proliferation to MS medium with 3% (w/w) sucrose and 0.3% (w/w) of Gelite added. It may include the step of culturing the induced shoots in a medium to proliferate the shoots.
본 발명의 일 구현예로 상기 소독은 0.1%(w/w)의 HgCl2와 2%(w/w)의 차아염소산나트륨의 혼합물에 침지시켜 수행할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the disinfection can be performed by immersing in a mixture of 0.1% (w/w) HgCl 2 and 2% (w/w) sodium hypochlorite.
본 발명의 일 구현예로 상기 (b) 단계는 상기 유도된 기내식물체의 엽 절편을 가로, 세로 0.5cm 길이로 조제하는 단계, 및 MS 배지에 0.5mg/L의 키네틴, 3%(w/w)의 수크로오스, 0.3%(w/w)의 겔라이트 및 pH 5.7의 배발생조직 유도 배지에서, 상기 조제된 엽 절편을 배양하여 상기 유도된 기내식물체로부터 체세포배 발생을 유도하는 단계를 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, step (b) includes preparing leaf segments of the induced in vitro plant to a length of 0.5 cm horizontally and vertically, and adding 0.5 mg/L of kinetin, 3% (w/w) to MS medium. ) of sucrose, 0.3% (w/w) of gelite, and culturing the prepared leaf fragment in an embryonic tissue induction medium of pH 5.7 to induce somatic embryo development from the induced in vitro plant. there is.
본 발명의 일 구현예로 상기 (c) 단계는 호르몬이 제거된 1/2MS 기본배지에 2%(w/w)의 수크로오스 및 0.3％(w/w)의 겔라이트가 첨가된 체세포배 유도 배지에서, 상기 유도된 체세포배를 배양하여, 상기 유도된 체세포배로부터 발아체 및 식물체를 유도하는 단계를 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, step (c) is a somatic cell embryo induction medium containing 2% (w/w) sucrose and 0.3% (w/w) Gellite added to 1/2MS basic medium from which hormones have been removed. may include the step of culturing the induced somatic cell embryo and inducing germinants and plants from the induced somatic cell embryo.
본 발명의 일 구현예로 상기 (d) 단계는 1/2 MS 기본배지에 2%(w/w)의 수크로오스 및 0.3％(w/w)의 겔라이트가 첨가된 배지에서, 상기 유도된 발아체 및 식물체를 생육시켜 소괴경을 유도하는 단계를 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, step (d) is performed in a medium to which 2% (w/w) sucrose and 0.3% (w/w) gelite are added to 1/2 MS basic medium, and the induced germination It may include the step of growing the body and plant to induce small tubers.
본 발명의 일 구현예로 상기 배지의 교체 없이, 상기 유도된 발아체 및 식물체를 75~85일간 생육시켜 소괴경을 유도할 수 있다.In one embodiment of the present invention, small tubers can be induced by growing the induced sprouts and plants for 75 to 85 days without replacing the medium.
본 발명의 일 구현예로 상기 (e) 단계는 상기 유도된 소괴경을 펄라이트에 식재하는 단계; 및 80%의 공기중 습도를 2주간 유지한 후, 60％의 공중 습도를 유지하고, 25±1℃의 온도가 유지되는 순화실에서, 상기 식재된 소괴경을 생육시키는 단계를 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, step (e) includes planting the induced tubers in perlite; And after maintaining the air humidity of 80% for 2 weeks, the air humidity of 60% is maintained, and the step of growing the planted tubers in an acclimatization room where the temperature is maintained at 25 ± 1 ° C. .
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 상기의 방법에 의해 대량 생산된 천궁 기내식물체를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides an endophytic plant mass-produced by the above method.
본 발명의 체세포배 발생 및 소괴경 유도를 이용한 천궁의 대량 생산방법은 천궁의 대량 종묘 생산에 적합한 효율적인 체세포배 발생 유도와 소괴경 유도를 이용한 순화 기술을 제공할 수 있으며, 본 발명의 체세포배 발생과 소괴경을 이용한 천궁의 종묘 생산방법은 다양한 산림 약용자원의 종묘 생산까지 적용이 가능한 장점이 있다. The method for mass production of Aspergillus using somatic embryo development and tuber induction of the present invention can provide an efficient induction of somatic embryo development and purification technology using small tuber induction suitable for mass production of Somatic embryo development and somatic embryo development of the present invention. Cheongung's seed production method using and tubers has the advantage of being applicable to seed production from various forest medicinal resources.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 기내식물체에서 유도된 천궁 체세포배의 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 천궁 체세포배로부터 유도된 발아체의 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 천궁 발아체로부터 유도된 완전한 기내식물체의 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 천궁 기내식물체로부터 유도된 소괴경의 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 소괴경을 식재하여 순화 후 포트에서 생육하고 있는 천궁 식물체의 사진이다. Figure 1 is a photograph of a somatic cell embryo derived from an in vitro plant according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 is a photograph of a germinant derived from a somatic cell embryo according to an embodiment of the present invention.
Figure 3 is a photograph of a complete intracellular plant derived from a sac germination body according to an embodiment of the present invention.
Figure 4 is a photograph of a tuber derived from an endophyte according to an embodiment of the present invention.
Figure 5 is a photograph of a plant growing in a pot after planting and acclimating tubers according to an embodiment of the present invention.
본 발명의 제1 구현예는 (a) 천궁의 뇌두를 소독하여 기내식물체를 유도한 후, 상기 유도된 기내식물체의 신초를 증식하는 단계, (b) 상기 유도된 기내식물체로부터 체세포배 발생을 유도하는 단계, (c) 상기 유도된 체세포배로부터 발아체 및 식물체를 유도하는 단계, (d) 상기 유도된 식물체로부터 소괴경을 유도하는 단계, 및 (e) 상기 유도된 소괴경을 순화하는 단계;를 포함하는 천궁의 대량 생산방법에 관한 것이다.The first embodiment of the present invention includes the steps of (a) disinfecting the brain head of the sac to induce endophytes, then proliferating shoots of the induced endophytes, (b) inducing somatic embryo development from the induced endophytes. (c) inducing sprouts and plants from the induced somatic embryos, (d) inducing tubers from the induced plants, and (e) purifying the induced tubers; It relates to a mass production method of Cheongung including.
천궁의 체세포배 발생을 통한 재분화 연구에서 중요한 점은 체세포배발생 유도 시의 적정 배지, 그리고 엽, 줄기, 뿌리 중 적정한 절편체를 선발하여 배발생세포의 유도 효율을 높여 주어야 하며, 기내에서 소괴경을 형성시키는 방법 및 인공토양 식재 후 온도와 습도관리를 철저히 해야 한다는 점이다.An important point in the study of redifferentiation through somatic embryogenesis of Achyranthes is that the induction efficiency of embryogenic cells must be increased by selecting an appropriate medium and appropriate explants from leaves, stems, and roots when inducing somatic embryogenesis, and the induction efficiency of embryonic cells must be increased in vitro. It is important to thoroughly manage the temperature and humidity after planting in the artificial soil and how to form it.
천궁은 고습과 고온에 약하므로, 기내에서 순화 시에도 이 점을 유의해야 한다. 천궁은 근경으로 증식을 하기 때문에, 바이러스나 병에 걸린 근경으로 증식을 하게 되면 향후 생산량과 품질에 큰 영향을 미친다. 따라서 바이러스나 병이 없는 건전한 개체를 생산하여 증식시켜야 하며, 이러한 건전한 개체를 증식시키고 종근으로 대량생산하기 위해서는 조직배양 방법은 필수적이다.Since the celestial body is vulnerable to high humidity and temperature, this must be kept in mind when acclimatizing on board the aircraft. Since aster proliferates by rhizomes, if it proliferates by viruses or diseased rhizomes, it will have a significant impact on future production and quality. Therefore, healthy individuals without viruses or diseases must be produced and propagated, and tissue culture methods are essential to proliferate these healthy individuals and mass-produce them as seed roots.
이하, 각 단계 별로 본 발명의 제1 구현예를 상세히 설명한다.Hereinafter, the first embodiment of the present invention will be described in detail for each step.
상기 (a) 단계는 기내식물체 유도 및 신초 증식을 위해 천궁 뇌두를 적출하여 소독 후 배지 접종을 위한 절편으로 사용한다. 신초 유도 배지는 MS 기본배지에 1.0mg/L 벤질아미노 퓨린(BA), 1%(w/w) 수크로오스 및 0.3%(w/w) 겔라이트가 첨가된 배지에 배양 후 신초가 유도되면, 유도된 식물체로부터 신초를 증식하기 위해 MS기본배지에 3%(w/w) 수크로오스와 0.3%(w/w) 겔라이트가 첨가된 유리배양병(100×150mm) 배지에서 6개월 이상 4주 간격으로 계대배양하는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.In step (a), for induction of in vitro plants and proliferation of shoots, the sacral brain heads are removed, disinfected, and then used as sections for inoculation with medium. The shoot induction medium is MS basic medium with 1.0 mg/L benzylamino purine (BA), 1% (w/w) sucrose, and 0.3% (w/w) gelite. After culture, shoots are induced. In order to proliferate shoots from plants, they are cultured in a glass culture bottle (100 Subculture is preferred, but is not limited to this.
상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 유도된 기내식물체의 일부분을 재료로 하여 배발생조직 및 체세포배를 유도하기 위한 것으로, 엽, 엽병, 뿌리 절편 중 배발생조직 유도 효율이 가장 높은 엽 절편을 재료로 사용하는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.The step (b) is to induce embryogenic tissue and somatic embryos using parts of the in-flight plant induced in step (a). Among the leaves, petioles, and root segments, the leaf with the highest embryogenic tissue induction efficiency is used. It is preferable to use slices as the material, but it is not limited to this.
상기 엽 절편은 가로, 세로 0.5cm 길이로 엽맥을 포함한 부분을 사용하는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. The leaf section is preferably 0.5 cm long and 0.5 cm long and includes leaf veins, but is not limited to this.
체세포배 유도 배지는 MS 배지에 0.5∼1.0mg/L 키네틴(kinetin), 3%(w/w) 수크로오스(sucrose), 0.3%(w/w) 겔라이트(gelrite), 및 pH 5.7의 배발생조직 유도 배지에서 배양하는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. The somatic embryo induction medium is MS medium containing 0.5 to 1.0 mg/L kinetin, 3% (w/w) sucrose, 0.3% (w/w) gelrite, and pH 5.7 for embryo development. Culture in tissue induction medium is preferred, but is not limited thereto.
상기 (c) 단계는 상기 (b) 단계에서 유도된 배발생조직 및 체세포배를 발아식물체로 유도하기 위한 것으로, 호르몬을 제거한 1/2MS 기본배지에 2%(w/w) 수크로오스, 0.3％(w/w) 겔라이트가 첨가된 체세포배 발아 배지에 배양하는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.Step (c) is to induce the embryonic tissue and somatic embryos induced in step (b) into germinated plants, and 2% (w/w) sucrose and 0.3% ( It is preferable to culture in somatic cell embryo germination medium supplemented with (w/w) Gelite, but is not limited thereto.
상기 (d) 단계는 상기 (c) 단계에서 유도된 발아 식물체 및 유식물체로\부터 소괴경을 유도하여 순화 후 포트묘에 이식하기 위한 순화 단계로 유도된 소괴경을 인공상토(버미큘라이트 : 펄라이트=1 : 1(v:v))에 식재하고, 공중습도 80% 이상, 순화실 온도를 25±1℃에서 순화시키는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.The step (d) is an acclimation step for inducing tubers from the germinated plants and seedlings induced in step (c) and transplanting them into pot seedlings after acclimatization. The induced tubers are placed in an artificial medium (vermiculite: perlite = It is preferable to plant at 1:1(v:v)) and acclimatize at an air humidity of 80% or more and an acclimatization room temperature of 25±1°C, but it is not limited to this.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 다만, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것에 불과하며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, the following examples and experimental examples are merely illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following examples.
[실시예 1] 뇌두 소독 후 기내식물체 유도 및 신초 증식 [Example 1] Plant induction and shoot proliferation after disinfection of brain heads
1년생 천궁의 근경에서 0.5∼1.0cm 뇌두를 적출하여 재료로 사용하였다. 천궁의 뇌두를 적출하여 기내로 들이기 위한 소독 조건으로 70% 에탄올에 1분 예비세척을 한 후, 소독제로는 0.1%(w/w) HgCl2와 2%(w/w) NaOCl을 사용하고 완전하게 침지 시킨 후, 각각 10분간 200rpm에 맞추어 두고 흔들어 소독을 실시하였다.A 0.5-1.0 cm brain head was extracted from the rhizome of a one-year-old syringa and used as material. As a disinfection condition for removing the head of the cervix and bringing it into the aircraft, it was prewashed in 70% ethanol for 1 minute, and the disinfectant used was 0.1% (w/w) HgCl 2 and After being completely immersed in 2% (w/w) NaOCl, disinfection was performed by shaking at 200 rpm for 10 minutes each.
그 후 멸균한 증류수를 이용하여 4∼5회 세척하고, 멸균된 필터 페이퍼에 올려 두고 물기를 제거한 후 배지에 접종하였다. 접종 배지는 1/2MS 배지에 1.0mg/L BA, 1%(w/w) 수크로오스 그리고 0.3%(w/w) 겔라이트를 첨가한 후, pH 5.7로 맞추어 만들어진 신초 유도 배지에 배양하여 신초를 유도하였다.Afterwards, it was washed 4 to 5 times using sterilized distilled water, placed on sterilized filter paper, dried, and inoculated into the medium. For the inoculation medium, 1.0 mg/L BA, 1% (w/w) sucrose, and 0.3% (w/w) Gelite were added to 1/2MS medium, and then cultured in shoot induction medium adjusted to pH 5.7 to produce shoots. induced.
이 때 상기 배양 조건은 온도 25±1℃, 광은 냉백색 형광등 하에서 60 μmol·m-2·s-1로 1일 16시간 조명, 8시간 암조건으로 5주간 배양하였다.At this time, the culture conditions were 25 ± 1°C, light of 60 μmol·m -2 ·s -1 under cool white fluorescent lamps, and cultured for 5 weeks under conditions of 16 hours of illumination and 8 hours of darkness per day.
유도된 식물체를 증식시키기 위한 과정으로 상기 식물체를 재료로 사용하였다. 기내식물체 증식을 위한 배지는 MS 배지에 3%(w/w) 수크로오스와 0.3%(w/w) 겔라이트가 포함된 유리배양병(10×15mm) 배지에서 6개월 이상 4주 간격으로 계대배양하였다.In a process for propagating the induced plant, the plant was used as a material. The medium for in-house plant growth is MS medium containing 3% (w/w) sucrose and 0.3% (w/w) gelite in a glass culture bottle (10×15 mm) and subcultured at 4-week intervals for over 6 months. did.
상기 계대배양 후, 4주 된 기내식물체의 엽, 엽병 그리고 뿌리 절편을 체세포배 발생 유도를 위한 재료로 사용하였다. 이 때 배양환경은 25±1℃, 광조건(70μmol m-2·s-1 냉백색 형광등, 16시간 조명)에서 배양하였다.After the subculture, the leaves, petioles, and root segments of 4-week-old indoor plants were used as materials for inducing somatic embryo development. At this time, the culture environment was 25 ± 1°C and light conditions (70 μ mol m -2 ·s -1 cold white fluorescent light, illumination for 16 hours).
하기 표 1은 천궁의 기내식물체 유도를 위한 배지 조성표, 표 2는 신초 증식을 위한 배지 조성표이다. Table 1 below is a table of medium composition for inducing in vitro plants of Aspergillus aerobium, and Table 2 is a table of medium composition for shoot multiplication.
[실시예 2] 천궁의 체세포배 발생 유도[Example 2] Induction of somatic embryogenesis in the cervix
체세포배 발생을 유도하는 과정으로 상기 실시예 1에서 증식된 기내식물체의 엽, 줄기, 뿌리 절편을 배발생조직 유도를 위한 절편으로 사용하였다. 배발생조직 유도를 위해 기내식물체의 엽 절편은 0.5×0.5cm, 줄기와 뿌리는 0.5∼1cm의 길이로 조제하였다.In the process of inducing somatic embryo development, leaf, stem, and root sections of the in vitro plant propagated in Example 1 were used as sections for inducing embryonic development tissue. To induce embryogenic tissue, leaf sections of the in-flight plants were prepared to a length of 0.5 × 0.5 cm, and stems and roots were prepared to a length of 0.5 to 1 cm.
배발생조직 유도 배지는 MS 배지에 3%(w/w) 수크로오스, 0.3%(w/w) 겔라이트, pH 5.7 조건의 배지에 사이토키닌으로 벤질아미노 퓨린(BA), 키네틴, 티디아주론(TDZ)과 옥신으로 2,4-D, 피클로람(picloram)을 각 0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0mg/L의 농도별로 첨가 후 절편체를 배양하였다. The embryonic tissue induction medium is MS medium containing 3% (w/w) sucrose, 0.3% (w/w) gelite, and cytokinins such as benzylaminopurine (BA), kinetin, and thidiazuron in a medium at pH 5.7. (TDZ) and auxin such as 2,4-D and picloram were added at concentrations of 0, 0.5, 1.0, 2.0, and 3.0 mg/L, respectively, and the explants were cultured.
배양 8주 후부터 배발생조직이 유도되었으며, 유도된 배발생조직은 MS 배지에 1.0mg/L 2,4-D, 3%(w/w) 수크로오스 및 0.3%(w/w) 겔라이트가 첨가된 페트리디쉬 배지에서 증식하였다. 이 때 배양 환경은 25±1℃, 암배양 하에서 수행하였다. Embryonic tissue was induced after 8 weeks of culture, and 1.0 mg/L 2,4-D, 3% (w/w) sucrose, and 0.3% (w/w) Gellite were added to the induced embryonic tissue in MS medium. Proliferated in Petri dish medium. At this time, the culture environment was 25 ± 1°C and dark culture was performed.
천궁의 엽 절편으로부터 체세포배 발생 유도 결과를 나타내는 하기 표 4의 결과와 같이, 5종의 식물생장 호르몬 벤질아미노 퓨린(BA), 키네틴, 티디아주론(thidiazuron), 피클로람, 2,4-D를 처리한 결과, 키네틴을 첨가한 배지에서 배발생조직 및 체세포배 유도를 통한 재분화 효율이 가장 좋은 것을 확인하였다. As shown in Table 4 below, which shows the results of inducing somatic embryo development from leaf sections of the arch, five plant growth hormones benzylaminopurine (BA), kinetin, thidiazuron, picloram, 2,4- As a result of treatment with D, it was confirmed that the medium containing kinetin had the best redifferentiation efficiency through induction of embryogenic tissue and somatic embryos.
또한. 엽절편을 재료로 사용한 사이토키닌 처리 배지에서 배발생조직 유도율은 0.5mg/L 키네틴 처리에서 95.8%로 높은 유도율을 보여주었다. 또한 절편당 유도된 체세포배의 개수는 0.5mg/L 키네틴 처리에서는 11.6개로 가장 좋은 결과를 보였다. also. In the cytokinin-treated medium using leaf fragments, the embryonic tissue induction rate was as high as 95.8% at 0.5 mg/L kinetin treatment. In addition, the number of somatic embryos induced per section was 11.6 in the treatment with 0.5 mg/L kinetin, which showed the best results.
배양 2주 이후부터 절편의 절단면을 따라 직접 체세포배 발생(Direct somtic embryogenesis)과 간접 체세포배 발생(In-direct somatic embryogenesis) 형태가 섞인 형태로 배발생조직과 체세포배가 유도되었다. After 2 weeks of culture, embryogenic tissue and somatic embryos were induced along the cut surface of the slice in a mixed form of direct somtic embryogenesis and indirect somatic embryogenesis.
따라서, 천궁의 체세포배 발생 방법을 이용한 건전한 기내식물체 대량생산 방법으로는 천궁 체세포배발생 유도 배지 조합인 하기 표 3과 같이, MS 기본 배지에 0.5mg/L 키네틴이 첨가된 배지에 3%(w/w) 수크로오스 및 0.3%(w/w) 겔라이트를 첨가한 배지를 조제하여 사용하는 것이 가장 효과적임을 알 수 있다. Therefore, as shown in Table 3 below, a healthy method of mass production of in vitro plants using the somatic embryo development method of Cheonggung is a combination of a medium for inducing Cheongung somatic embryogenesis, in which 0.5 mg/L kinetin is added to MS basic medium and 3% (w) is used. /w) It can be seen that it is most effective to prepare and use a medium containing sucrose and 0.3% (w/w) gelite.
도 1은 0.5mg/L 키네틴 처리에서 유도된 체세포배 사진, 도 2는 체세포배 발아 배지에서 유도된 엽 유래 체세포배 및 식물체 사진이다. Figure 1 is a photograph of somatic embryos induced by treatment with 0.5 mg/L kinetin, and Figure 2 is a photograph of somatic cell embryos and plant bodies derived from leaves induced in somatic embryo germination medium.
절편당per section
[실시예 3] 체세포배 발아 및 기내식물체 유도[Example 3] Somatic cell embryo germination and induction of in vitro plants
체세포배 발아 단계는 상기 실시예 2에서 유도된 체세포배를 발아시켜 정상적인 기내식물체를 유도하는 단계이다. 체세포배 발아 배지는 1/2MS 기본배지에 3%(w/w) 수크로오스 및 0.3%(w/w) 겔라이트에 호르몬을 첨가하지 않은 배지를 사용하여 체세포배 발아를 유도하였다. 발아 배지는 페트리디쉬(90×10mm, SPL)를 사용하였고, 배양 4주마다 새로운 배지로 계대배양 하였다.The somatic embryo germination step is a step of germinating the somatic embryos derived in Example 2 to induce normal in vitro plants. The somatic embryo germination medium was 1/2MS basic medium containing 3% (w/w) sucrose and 0.3% (w/w) gelite without any added hormones to induce somatic embryo germination. Petri dishes (90 × 10 mm, SPL) were used as the germination medium, and subculture was performed with new medium every 4 weeks.
기내 식물체 유도배지는 1/2MS 배지에 2%(w/w) 수크로오스 및 0.3%(w/w) 겔라이트가 첨가된 기본 배지를 사용하였으며, 배양 용기는 유리배양병(100×150mm)을 사용하여 발아된 체세포배로부터 기내식물체를 유도하였다. 모든 실험의 배양조건은 25±1℃의 광조건(70μmol m-2·s-1 냉백색 형광등, 16시간 조명)하에서 배양하였다. The in vitro plant induction medium used was a basic medium containing 1/2MS medium with 2% (w/w) sucrose and 0.3% (w/w) gelite added, and a glass culture bottle (100 × 150 mm) was used as the culture vessel. In vitro plants were derived from germinated somatic embryos. The culture conditions for all experiments were cultured under light conditions of 25 ± 1°C (70 μ mol m -2 ·s -1 cool white fluorescent light, illumination for 16 hours).
체세포배의 발아를 위해 1/2MS 호르몬 무처리 배지에 어뢰형∼자엽단계 체세포배를 접종한 결과, 직접 체세포배 발생을 통해 유도된 엽절편 유래 체세포배는 배양 4주 이후 절편체로부터 직접 식물체로 발달하는 것이 관찰되었다.For germination of somatic embryos, torpedo-shaped to cotyledon stage somatic embryos were inoculated into 1/2MS hormone-free medium. As a result, somatic embryos derived from leaf explants induced through direct somatic embryo development were directly converted to plants from the explants after 4 weeks of culture. development was observed.
간접 체세포배 발생으로 유도된 엽절편 유래 어뢰형∼자엽단계 이상의 체세포배는 배양 5주 이후 체세포배 발아를 거쳐 유식물체로 발달되었다. 발아 배지에서 생육한 체세포배 유래 식물체는 90% 이상 정상적인 식물체로 생육하였다.Somatic embryos of torpedo-shaped to cotyledon stage or higher derived from leaf fragments induced by indirect somatic embryo development developed into seedlings through somatic embryo germination after 5 weeks of culture. More than 90% of somatic embryo-derived plants grown in germination medium grew as normal plants.
도 3은 체세포배로 부터 유도된 기내식물체의 사진이다. Figure 3 is a photograph of an in vitro plant derived from a somatic embryo.
[실시예 4] 소괴경 유도 및 순화 단계[Example 4] Tuber induction and purification step
소괴경 유도 및 순화 단계는 상기 실시예 3에서 유도된 기내식물체로부터 소괴경을 유도하고, 유도된 소괴경을 이용하여 순화하여 식물체를 생산하는 단계이다. The small tuber induction and acclimation step is a step of inducing small tubers from the in-flight plants induced in Example 3 and producing plants by acclimating them using the induced small tubers.
소괴경은 1/2 MS 기본배지에 2%(w/w) 수크로오스 및 0.3%(w/w) 겔라이트가 첨가된 배지에서 기내식물체를 80일간 계대배양 없이 생육시켜 유도하였다. 배양 80일 후 유도된 소괴경 유도율은 90%로 나타났다.Tubers were induced by growing the plants in a 1/2 MS basic medium supplemented with 2% (w/w) sucrose and 0.3% (w/w) gelite for 80 days without subculture. The tuber induction rate after 80 days of culture was found to be 90%.
소괴경이 유도된 식물체는 7cm 이상의 건전한 개체를 선발하여 인공상토인 펄라이트와 버미큘라이트(1:1=v:v)를 혼합한 것과 펄라이트를 단독 처리한 것에 순화를 위해 각 30개씩 이식하였다.For the plants from which small tubers were induced, healthy individuals over 7 cm were selected and transplanted to a mixture of perlite and vermiculite (1:1=v:v), which are artificial media, and 30 plants treated with perlite alone for acclimatization.
소괴경의 순화를 위해 기내식물체의 뿌리는 흐르는 물에서 배지를 모두 제거한 후 이식하였다. 순화 후 80%의 공기 중 습도를 2주간 유지하였으며, 2주 이후 60%의 습도를 유지하며 순화하였다. 이 때 순화실은 25±1℃, 70μmol m-2·s-1 냉백색 형광등, 16시간 조명하에서 생육시켰다.To purify the small tubers, the roots of the indoor plants were transplanted after removing all medium under running water. After acclimatization, 80% air humidity was maintained for 2 weeks, and after 2 weeks, 60% humidity was maintained for acclimatization. At this time, the acclimation room was grown at 25 ± 1°C, under 70 μ mol m -2 ·s -1 cool white fluorescent light, for 16 hours.
체세포배 유래 기내식물체의 순화율은 80% 이상으로, 순화 30일 후 온실로 이동하여 생육시켰다. 그 결과 펄라이트를 단독 사용한 인공상토에서 생육한 식물체의 생존율이 펄라이트와 버미큘라이트를 혼합한 인공상토 대비 높게 나타났다. The acclimatization rate of somatic embryo-derived in-flight plants was over 80%, and they were moved to the greenhouse and grown 30 days after acclimatization. As a result, the survival rate of plants grown in artificial media using perlite alone was higher than that in artificial media mixed with perlite and vermiculite.
하기 표 5와 같이, 펄라이트(Perlite)와 버미큘라이트(Vermiculite) 혼합 처리에서는 1번 라인 73.3%, 2번 라인 33.3%, 3번 라인 10%, 4번 라인 100%로 생존율을 보였다. 펄라이트 단독 처리에서는 1번 라인 93.3%, 2번 라인 86.7％, 3번 라인 73.3%, 4번 라인 100%를 보여, 4번 라인을 제외한 처리에서 펄라이트 단독으로 있는 인공상토에서 순화가 효과적임을 확인하였다.As shown in Table 5 below, in the perlite and vermiculite mixed treatment, the survival rate was 73.3% for line 1, 33.3% for line 2, 10% for line 3, and 100% for line 4. In the treatment with perlite alone, line 1 was 93.3%, line 2 was 86.7%, line 3 was 73.3%, and line 4 was 100%, confirming that acclimation was effective in artificial media with perlite alone in treatments excluding line 4. .
도 4는 기내에서 유도된 천궁 소괴경의 사진, 도 5는 소괴경 유래 온실에서 생육하고 있는 천궁의 사진이다.Figure 4 is a photograph of aerial tubers derived in-flight, and Figure 5 is a photograph of adenomyceae growing in a greenhouse from which tubers were derived.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다.As the specific parts of the present invention have been described in detail above, it is clear to those skilled in the art that these specific techniques are merely preferred embodiments and do not limit the scope of the present invention. It will be obvious.
따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents. Simple modifications or changes of the present invention can be easily used by those skilled in the art, and all such modifications or changes can be considered to be included in the scope of the present invention.
Claims (9)
(b) 상기 유도된 기내식물체로부터 체세포배 발생을 유도하는 단계;
(c) 상기 유도된 체세포배로부터 발아체 및 식물체를 유도하는 단계;
(d) 상기 유도된 식물체로부터 소괴경을 유도하는 단계; 및
(e) 상기 유도된 소괴경을 순화하는 단계;를 포함하는 천궁의 대량 생산방법.
(a) disinfecting the head of the cervix to induce endophytes, and then proliferating shoots of the induced endophytes;
(b) inducing somatic embryo development from the induced intracellular plant;
(c) inducing sprouts and plants from the induced somatic cell embryos;
(d) inducing small tubers from the induced plants; and
(e) purifying the derived tubers.
천궁 뇌두를 적출하여 소독한 후, MS 기본배지에 1.0 mg/L의 벤질아미노 퓨린, 1%(w/w)의 수크로오스 및 0.3%(w/w)의 젤라이트가 첨가된 신초 유도 배지에서 기내식물체의 신초를 유도하는 단계; 및
MS 배지에 3%(w/w)의 수크로오스와 0.3%(w/w)의 젤라이트가 첨가된 신초 증식 배지에서, 상기 유도된 신초를 배양하여 신초를 증식하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 천궁의 대량 생산방법.
The method of claim 1, wherein step (a) is,
After extracting and disinfecting the forebrain heads, they were fed in a shoot induction medium containing 1.0 mg/L benzylamino purine, 1% (w/w) sucrose, and 0.3% (w/w) gelite in MS basic medium. Inducing shoots of the object; and
Characterized in that it comprises the step of growing the shoots by culturing the induced shoots in a shoot growth medium containing 3% (w/w) sucrose and 0.3% (w/w) gelite added to the MS medium. Mass production method of Cheongung.
상기 소독은 0.1%(w/w)의 HgCl2와 2%(w/w)의 차아염소산나트륨의 혼합물에 침지시켜 수행하는 것을 특징으로 하는 천궁의 대량 생산방법.
According to paragraph 1,
The disinfection is performed by immersing in a mixture of 0.1% (w/w) HgCl 2 and 2% (w/w) sodium hypochlorite.
상기 유도된 기내식물체의 엽 절편을 가로, 세로 0.5cm 길이로 조제하는 단계; 및
MS 배지에 0.5mg/L의 키네틴, 3%(w/w)의 수크로오스, 0.3%(w/w)의 겔라이트 및 pH 5.7의 배발생조직 유도 배지에서, 상기 조제된 엽 절편을 배양하여 상기 유도된 기내식물체로부터 체세포배 발생을 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 천궁의 대량 생산방법.
The method of claim 1, wherein step (b) is:
Preparing leaf segments of the induced in vitro plant to a length of 0.5 cm horizontally and vertically; and
The prepared leaf fragments were cultured in MS medium containing 0.5 mg/L of kinetin, 3% (w/w) of sucrose, 0.3% (w/w) of gelite, and pH 5.7 for embryogenesis tissue induction medium. A method for mass production of aster, comprising the step of inducing somatic embryo development from an induced intracellular plant.
호르몬이 제거된 1/2MS 기본배지에 2%(w/w)의 수크로오스 및 0.3％(w/w)의 겔라이트가 첨가된 체세포배 유도 배지에서, 상기 유도된 체세포배를 배양하여, 상기 유도된 체세포배로부터 발아체 및 식물체를 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 천궁의 대량 생산방법.
The method of claim 1, wherein step (c) is:
The induced somatic embryos were cultured in somatic embryo induction medium containing 2% (w/w) sucrose and 0.3% (w/w) Gelite added to 1/2MS basic medium from which hormones were removed. A method for mass production of aster, comprising the step of inducing a germination body and a plant body from a somatic cell embryo.
1/2 MS 기본배지에 2%(w/w)의 수크로오스 및 0.3％(w/w)의 겔라이트가 첨가된 배지에서, 상기 유도된 발아체 및 식물체를 생육시켜 소괴경을 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 천궁의 대량 생산방법.
The method of claim 1, wherein step (d) is,
The step of inducing small tubers by growing the induced sprouts and plants in a medium to which 2% (w/w) sucrose and 0.3% (w/w) gelite were added to 1/2 MS basic medium. A mass production method of Cheongung, characterized in that it includes.
상기 배지의 교체 없이, 상기 유도된 발아체 및 식물체를 75~85일간 생육시켜 소괴경을 유도하는 것을 특징으로 하는 천궁의 대량 생산방법.
According to clause 6,
A method for mass production of Cheonung, characterized in that the induced sprouts and plants are grown for 75 to 85 days to induce tubers without replacing the medium.
상기 유도된 소괴경을 펄라이트에 식재하는 단계; 및
80%의 공기중 습도를 2주간 유지한 후, 60％의 공중 습도를 유지하고, 25±1℃의 온도가 유지되는 순화실에서, 상기 식재된 소괴경을 생육시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 천궁의 대량 생산방법.
The method of claim 1, wherein step (e) is,
Planting the induced tubers in perlite; and
After maintaining the air humidity of 80% for 2 weeks, the air humidity of 60% is maintained and the temperature of 25 ± 1°C is maintained in an acclimatization chamber, comprising the step of growing the planted tubers. Mass production method of Cheongung.
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