KR20230158342A - Egcg 및 광감작제-에틸렌글리콜 접합체를 포함하는 신규한 나노 구조체 및 이의 용도 - Google Patents
Egcg 및 광감작제-에틸렌글리콜 접합체를 포함하는 신규한 나노 구조체 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 EGCG (epigallocatechin gallate) 및 광감작제(photosensitizer, PS)-에틸렌글리콜(ethylene glycol, EG) 접합체(PS-EG)를 포함하는, 나노 구조체 및 이의 용도에 관한 것이다.
일 양상에 따르면, 상기 나노 구조체는 HSP 발현 또는 활성의 억제를 통해 종양 내열성을 극복하는 동시에 PDT 동안 항-세포사멸 클라이언트 단백질의 생성을 억제할 수 있으며, ROS 소거능을 갖는 바, 이를 통해 다양한 암의 광역학적 치료, 광열 치료 또는 온열 치료에 유용하게 이용할 수 있다.
일 양상에 따르면, 상기 나노 구조체는 HSP 발현 또는 활성의 억제를 통해 종양 내열성을 극복하는 동시에 PDT 동안 항-세포사멸 클라이언트 단백질의 생성을 억제할 수 있으며, ROS 소거능을 갖는 바, 이를 통해 다양한 암의 광역학적 치료, 광열 치료 또는 온열 치료에 유용하게 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 EGCG (epigallocatechin gallate) 및 광감작제-에틸렌글리콜 접합체(PS-EG)를 포함하는, 나노 구조체 및 이의 용도에 관한 것이다.
광선 요법 (Phototherapy)은 덜 침습적이고, 약물 내성을 최소화할 수 있으며, 시공간적 분포를 선택적으로 수행할 수 있다는 장점이 있다. 광역학적 요법(Photodynamic therapy, PDT) 및 광열 요법(photothermal therapy, PTT)은 각각 적절한 빛에 의해 조사된 광과민제(photosensitizers, PS)에 의해 생성된 각각 활성 산소종(ROS) 및 온열 요법을 활용하여 종양 또는 병변 부위에 선택적인 손상을 초래한다. 특히, 외인성 PS가 없는 LITT (Laser interstitial thermal therapy)이 온열 요법에 임상적으로 적용되었다. 그러나, 다양하게 개발된 광선 요법은 만족스럽지 않은 치료 효과를 나타내거나, 심각한 부작용을 유발할 수 있다. 예를 들어, 대부분의 PS는 치료 효과를 향상시키기 위해 ROS의 생성을 증가시키는 방법에 기반을 두었으나, PDT 동안 항-세포자멸 클라이언트 단백질의 발현에 대한 것은 종종 간과되었다.
열충격단백질(HSP)은 외부 자극에 반응하여 과발현되는데, 이는 내열성으로 인해 PTT를 방해할 뿐만 아니라, HSP에 대한 클라이언트 단백질인 항-세포자멸사 단백질 survivin은 caspase-9의 억제를 통해 PDT에 의해 유도된 세포자멸사를 차단할 수 있기 때문에 PDT의 효율을 크게 저하시킨다. 따라서, PTT가 종양 세포를 완전히 죽이기 위해서는 국부 온도가 50 ℃이상이 되어야 하고, PDT 역시 좋은 효율을 얻기 위해서는 빛의 조사 파워와 시간을 늘려야 하기 때문에 주변 정상 조직과 세포에 손상을 줄 수밖에 없다.
또한, 포르피린 기반 PS는 18개의 π-전자의 큰 고리 접합 구조로 인해 "S 밴드"라고 하는 400nm 부근에서 매우 강한 흡수 밴드를 가지므로, 비 치료 단계에서 자연광에 의해 유도된 우발적인 ROS 생성으로 인한 비표적 조직의 손상을 거의 피할 수 없다. 따라서, PDT의 임상적용에 있어서 환자는 어두운 환경에서 장시간 둔감해야 하며 이는 환자의 행동을 방해할 뿐만 아니라 치료과정의 장애를 증가시키는 바, 임상적용에 큰 지장을 초래한다. 또한, 포르피린 기반 PS에 사용되는 여기 광은 일반적으로 Q 대역에서 600-650nm에 있어 조직 침투 깊이를 제한한다.
이러한 배경 하에, 광열 전환 효율을 높이거나 ROS 생성을 증가시키는 기존의 방법을 우회하여, HSP 과발현의 억제를 통해 종양 내열성을 극복하는 동시에 PDT 동안 항-세포사멸 클라이언트 단백질의 생성을 억제할 수 있으며, ROS 소거능을 갖는 신규한 나노 구조체를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 EGCG (epigallocatechin gallate) 및 광감작제(photosensitizer, PS)-에틸렌글리콜(ethylene glycol, EG) 접합체를 포함하는, 나노 구조체를 제공한다.
다른 양상은 상기 나노 구조체를 포함하는, 광역학적 치료, 광열 치료 또는 온열 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 나노 구조체를 포함하는, 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
일 양상은 EGCG (epigallocatechin gallate) 및 광감작제(photosensitizer, PS)-에틸렌글리콜(ethylene glycol, EG) 접합체를 포함하는, 나노 구조체를 제공하는 것이다.
본 명세서에서의 용어 "EGCG (epigallocatechin gallate)"는 녹차 잎에 존재하는 폴리페놀의 일종으로 강력한 항산화 작용을 하는 것으로 알려져 있으며, 하기 화학식 1로 표현될 수 있다.
[화학식 1]
본 명세에서의 용어 "광감작제 또는 광감각제 (photosensitizer, PS)"는 빛과 산소를 접하면 특정작용을 하는 물질을 의미하는 것으로서, 예를 들어 광역학치료에서 광감각제는 암세포의 파괴를 위해서 조사되는 광원의 특정 파장을 흡수되어 활성화되고, 암세포를 파괴할 수 있도록 활성산소를 생산하는 중요한 역할을 한다. 광감각제는 특정 고유 파장의 빛에 의해서 여기(excitation) 될 때 반응성 산소종(일항 산소; 1O2, 산소라디칼, superoxide, 및 peroxide)을 생성하면서 독성을 보여준다.
상기 광감작제는 소수성 광감작제일 수 있다.
상기 광감작제는 포르피린계(porphyrins) 화합물, 클로린계(chlorins) 화합물, 박테리오클로린계(bacteriochlorins) 화합물, 프탈로시아닌계(phthalocyanines) 화합물, 나프탈로시아닌계 (naphthalocyanines) 화합물, 퍼퓨린계(purpurins) 화합물, 텍사피린계(texaphyrins) 화합물 및 5-아미노레불린 에스테르계(5-aminolevuline esters) 화합물로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있으며, 구체적으로 클로린계 화합물 및 프탈로시아닌계 화합물로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 광감각제는 페오포르비드 a(pheophorbide a) 및 이의 유도체로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "페오포르비드 a (pheophorbide a)"는 엽록소 분해 산물로서, 중앙 마그네슘이 제거되고 식물 꼬리가 가수분해된 pheophytin의 유도체이며, 하기 화학식 2로 표현될 수 있다.
[화학식 2]
또한, 상기 페오포르비드 a 유도체는 메틸 페오포르비드 a (Methyl pheophorbide a, MPa)일 수 있다. 본 명세서에서의 용어 "MPa (Methyl pheophorbide a)"는 페오포르비드 a에 메틸기가 도입된클로린계 기반의 광감작제로서, 하기 화학식 3으로 표현될 수 있다.
[화학식 3]
상기 광감각제는 프탈로시아닌(phthalocyanine) 화합물 및 이의 유도체로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "프탈로시아닌(phthalocyanine, H2Pc)"는 화학식 (C8H4N2)4H2의 거대 방향족 거대고리형 유기 화합물로서, 2차원 기하학적 구조와 18개의 π-전자로 구성된 고리 시스템을 가지고 있다. 또한, H2Pc의 짝염기인 Pc2-에서 파생된 금속 착물은 광역학 요법에서 사용될 수 있다. 프탈로시아닌 화합물은 하기 화학식 4로 표현될 수 있다.
[화학식 4]
상기 광감작제는 프탈로시아닌 유도체로서 프탈로시아닌의 금속 착물을 포함할 수 있으며, 상기 금속 착물은 하기 화학식 5로 표현될 수 있다.
[화학식 5]
상기 M(metal)은 금속 원소로서 2가 금속, 3가 금속 화합물 또는 4가 금속 화합물일 수 있다. 상기 2가 금속으로는 예를 들면, 주기율표 제3족 ~ 제15족에 속하는 금속 원자를 들 수 있으며, 구체적으로는 Cu, Zn, Fe, Co, Ni, Ru, Pb, Rh, Pd, Pt, Mn, Sn, 및 Pb 등으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 3가 또는 4가 금속 화합물로는 예를 들면, 주기율표 제3족 ~ 제15족에 속하는 금속의, 할로겐화물, 수산화물 및 산화물 등을 들 수 있으며, 구체적으로는 AlCl, AlOH, InCl, FeCl, MnOH, SiCl2, SnCl2, GeCl2, Si(OH)2, Si(OCH3)2, Si(OPh)2, Si(OSiCH3)2, Sn(OH)2, Ge(OH)2, VO, 및 TiO 등으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 한편, 상기 Ph는 페닐기를 나타낸다.
상기 광감작제(photosensitizer, PS)-에틸렌글리콜(ethylene glycol, EG) 접합체는 상기에서 서술한 광감작제에 에틸렌글리콜 및 이의 유도체가 결합하여 형성된 접합체를 의미하는 것일 수 있다.
상기 접합체는 1개 이상의 에틸렌글리콜을 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 1개 내지 3개를 포함하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 1개 또는 2개의 에틸렌글리콜이 결합된 것일 수 있다.
또한, 상기 에틸렌글리콜은 디에틸렌글리콜 내지 옥타에틸렌글리콜(디에틸렌글리콜, 트리에틸렌글리콜, 테트라에틸렌글리콜, 펜타에틸렌글리콜, 헥사에틸렌글리콜, 헵타에틸렌글리콜 및 옥타에틸렌글리콜)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 구체적으로 트리에틸글리콜 내지 헥사에틸렌글리콜로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 광감작제-에틸렌글리콜 접합체는 하기 화학식 6으로 표현될 수 있으며, PS는 광감작제를 의미한다.
[화학식 6]
상기 화학식 6에서, m은 1 내지 3의 정수일 수 있고, n는 2 내지 8의 정수일 수 있다. 구체적으로 상기 m은 1 내지 2의 정수일 수 있다. 또한, 상기 n은 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 3, 3 내지 8, 3 내지 7, 3 내지 6, 3 내지 5, 3 내지 4, 4 내지 8, 4 내지 7, 4 내지 6, 4 내지 5, 5 내지 8, 5 내지 7, 5 내지 6, 6 내지 8, 6 내지 7 또는 7 내지 8의 정수일 수 있다.
상기 광감작제-에틸렌글리콜 접합체는 또는 Pa-EG(pheophorbide a- ethylene glycol) 또는 MPa-EG(Methylpheophorbide a- ethylene glycol)일 수 있으며, 하기 화학식 7로 표현될 수 있다.
[화학식 7]
상기 화학식 7에서, n는 2 내지 8의 정수일 수 있다. 구체적으로 상기 n은 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 3, 3 내지 8, 3 내지 7, 3 내지 6, 3 내지 5, 3 내지 4, 4 내지 8, 4 내지 7, 4 내지 6, 4 내지 5, 5 내지 8, 5 내지 7, 5 내지 6, 6 내지 8, 6 내지 7 또는 7 내지 8의 정수일 수 있다.
상기 MPa-EG는 MPa과 TEG를 반응시켜, TEG가 결합된 화합물인 MPa-TEG(Methylpheophorbide a- tri (ethylene glycol), MT)일 수 있으며, 하기 화학식 8로 표현될 수 있다.
[화학식 8]
상기 광감작제-에틸렌글리콜 접합체는 Pc-EG(phthalocyanine-ethylene glycol)일 수 있으며, 하기 화학식 9로 표현될 수 있다.
[화학식 9]
상기 화학식 9에서, n은 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 3, 3 내지 8, 3 내지 7, 3 내지 6, 3 내지 5, 3 내지 4, 4 내지 8, 4 내지 7, 4 내지 6, 4 내지 5, 5 내지 8, 5 내지 7, 5 내지 6, 6 내지 8, 6 내지 7 또는 7 내지 8의 정수일 수 있다.
상기 광감작제-에틸렌글리콜 접합체는 SiPc-EG(Silicon phthalocyanine-ethylene glycol)일 수 있으며, 하기 화학식 10으로 표현될 수 있다.
[화학식 10]
상기 화학식 10에서, n은 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 3, 3 내지 8, 3 내지 7, 3 내지 6, 3 내지 5, 3 내지 4, 4 내지 8, 4 내지 7, 4 내지 6, 4 내지 5, 5 내지 8, 5 내지 7, 5 내지 6, 6 내지 8, 6 내지 7 또는 7 내지 8의 정수일 수 있다.
상기 SiPc-EG는 SiPc와 헥사에틸렌글리콜을 반응시켜 생성된, SiPc-HEG(Silicon phthalocyanine- hexa(ethylene glycol), 이하에서는 SiPc-PEG6로 명명함)일 수 있으며, 하기 화학식 11로 표현될 수 있다.
[화학식 11]
상기 광감작제-에틸렌글리콜 접합체는 상기 화학식 6 내지 11로 표현되는 화합물들로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 화합물, 이의 유도체, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 포함하는 것일 수 있다.
상기 나노 구조체는 EGCG, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물; 및 PS-EG 접합체, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 포함하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 나노 구조체는 나노 구조체 그 자체, 이의 염, 또는 이의 용매화물의 형태를 모두 포함할 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "나노 구조체"란, 나노 크기의 입자의 클러스터(cluster)를 포함하여, 나노 크기의 입자가 축적되어 형성된 수 nm 내지 수 ㎛ 크기의 구조체를 의미한다. 상기 나노 구조체는 나노 크기를 갖는 입자라면 특별히 제한되지는 않는다. 특히 본 발명에서는 빌딩 블록으로서 EGCG 및 PS-EG를 포함하는 나노 구조체를 총칭하는 것일 수 있다. 또한, 본 발명에서는 나노 복합체 또는 나노포르피린 등과 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 나노 구조체에 포함되는 상기 PS-EG및 EGCG의 몰 비(PS-EG:EGCG)는 1:1 내지 1:5일 수 있으며, 구체적으로 1:1 내지 1:5, 1:1 내지 1:4.5, 1:1 내지 1:4, 1:1 내지 1:3.5, 1:1.5 내지 1:5, 1:1.5 내지 1:4.5, 1:1.5 내지 1:4, 1:1.5 내지 1:3.5, 1:2 내지 1:5, 1:2 내지 1:4.5, 1:2 내지 1:4, 1:2 내지 1:3.5, 1:2.5 내지 1:5, 1: 2.5 내지 1:4.5, 1: 2.5 내지 1:4, 또는 1: 2.5 내지 1:3.5일 수 있다.
상기 나노 구조체의 다분산 지수 (Poly Dispersity Inde, PdI)는 0.1 내지 0.5일 수 있으며, 구체적으로, 0.1 내지 0.5, 0.1 내지 0.45, 0.1 내지 0.4, 0.1 내지 0.35, 0.1 내지 0.3, 0.15 내지 0.5, 0.15 내지 0.45, 0.15 내지 0.4, 0.15 내지 0.35, 0.15 내지 0.3, 0.2 내지 0.5, 0.2 내지 0.45, 0.2 내지 0.4, 0.2 내지 0.35, 0.2 내지 0.3, 0.25 내지 0.5, 0.25 내지 0.45, 0.25 내지 0.4, 0.25 내지 0.35 또는 0.25 내지 0.3일 수 있다.
상기 나노 구조체의 평균 입자 크기는 100 내지 300 nm인 것일 수 있으며, 구체적으로 100 내지 300 nm, 100 내지 280 nm, 100 내지 250 nm, 100 내지 230 nm, 100 내지 200 nm, 100 내지 180 nm, 100 내지 160 nm, 120 내지 300 nm, 120 내지 280 nm, 120 내지 250 nm, 120 내지 230 nm, 120 내지 200 nm, 120 내지 180 nm, 120 내지 160 nm, 140 내지 300 nm, 140 내지 280 nm, 140 내지 250 nm, 140 내지 230 nm, 140 내지 200 nm, 140 내지 180 nm, 또는 140 내지 160 nm 일 수 있다.
상기 나노 구조체에서 상기 EGCG 및 PS-EG는 π-π 스태킹, 소수성 상호 작용 및 수소 결합으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상으로 상호작용으로 조립된 것일 수 있으며, 구체적으로 π-π 스태킹, 소수성 상호 작용 및 수소 결합에 의해 상호작용으로 조립된 것일 수 있다.
상기 나노 구조체는 J-응집된(J-aggregated) 나노 구조체(J-응집체)일 수 있는 바, J-응집으로부터의 흡수 적색 편이는 빛의 조직 침투 효능을 향상시킬 수 있다.
상기 EGCG는 상기 나노 구조체의 외피를 구성하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 EGCG의 강한 친수성과 PS-EG의 소수성으로 인해, 상기 EGCG는 PS-EG를 둘러싸 상기 나노 구조체의 표면을 둘러싸도록 조립된 것일 수 있으며, 자가조립된 것일 수 있다.
상기 나노 구조체는 열충격단백질(heat shock protein, HSP)의 발현(과발현) 또는 활성 억제능을 갖는 것일 수 있으며, 이로 인해 대상 개체 또는 세포의 열 저항성 또는 내열성을 억제/저하시키는 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "열충격단백질(heat shock protein, HSP)"은 세포가 열충격 등의 스트레스를 받았을 때 증가하는 단백질을 의미한다. 암 세포는 몇 가지 열충격단백질을 고수준으로 발현하여 종양의 공격성을 증강시키고 또한 세포가 치료요법에 의한 사멸과 같은 치사 조건에서 생존하도록 한다. 치료에 대해 내성이 부여되는 것 외에, HSP 발현이 상승되면 프로그래밍된 세포 사멸이 억제되고 자가 성장이 촉진되어 암세포의 성장이 이루어진다. 열충격단백질은 분자량의 크기에 따라 다양한 군(small HSP family, HSP 60 family, HSP 70 family, HSP 90 family)으로 구분될 수 있다. 상기 나노 구조체는 HSP 70 및/또는 HSP 70의 발현 또는 활성을 억제하는 것일 수 있다.
상기 발현 또는 활성 억제능은 단백질을 코딩하는 유전자, mRNA 또는 단백질에 직접적 또는 간접적으로 작용하여 발현 수준을 억제하거나, 단백질 또는 유전자의 신호전달 경로 또는 기능 등의 활성을 억제하는 것일 수 있다.
상기 나노 구조체는 ROS (reactive oxygen species) 소거능을 갖는 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "활성산소종 또는 활성산소(reactive oxygen species, ROS)"는 산소 원자를 포함한, 화학적으로 반응성 있는 분자를 의미하며, 생물체내에서 생성되는 산소의 화합물로 생체 조직을 공격하고 세포를 손상시키는 산화력이 강한 산소이다. 분자들은 산소이온 그리고 과산화수소를 포함하고 있으며, 짝지어지지 않은 전자 때문에 반응성이 매우 높다. 상기 나노 구조체는 광역학적 치료 또는 광열 치료로 인해 발생하는 활성산소종을 소거할 수 있다.
상기 나노 구조체는 항염증 효능을 갖는 것일 수 있으며, 구체적으로 ROS에 의해 발생되는 염증 반응을 완화 또는 억제하는 것일 수 있다.
상기 나노 구조체는 세포자멸사를 촉진 또는 유도하는 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "세포자멸사, 세포사멸 또는 세포자살(apoptosis)"은 우리 몸 안에 입력되어 있는 생체 프로그램으로 비정상 세포, 손상된 세포, 노화된 세포가 스스로 자살해 사멸함으로써 전체적인 신체건강을 유지하게 해 주는 메커니즘을 말한다. 상기 나노 구조체는 광역학적 치료, 광열 치료 또는 온열 치료로 인해 발생하는 세포자멸사를 촉진 또는 유도하는 것일 수 있다.
상기 나노 구조체는 항-세포자멸 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 것일 수 있으며, 구체적으로 survivin의 발현 또는 활성을 억제하는 것일 수 있다.
상기 나노 구조체는 세포자멸 관련 단백질의 발현 또는 활성을 유도하는 것일 수 있으며, 구체적으로 PARP, Caspase 3 및 Caspase 9으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 발현 또는 활성을 유도하는 것일 수 있다.
상기 나노 구조체는 암의 예방 또는 치료 효능을 촉진하거나 증진시키는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 나노 구조체는 HSP의 발현 또는 활성을 억제하거나, 세포자멸사를 유도 또는 촉진하여 암 또는 암 세포의 사멸시키거나 증식을 억제함으로서 암의 예방 또는 치료 효능을 촉진할 수 있다.
상기 나노 구조체는 암 조직 또는 표적 세포를 표적화하기 위한 하나 이상의 표적화 리간드 또는 모이어티(moiety)를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 표적화 리간드로는 소분자(예컨대, 폴레이트, 염료, 등), 압타머, 항체, 항체 단편, 세포 표면의 특정 수용체와 결합하는 것으로 알려져 있는 화합물 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 당업계에 알려져 있는 표적화 리간드라면 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 나노 구조체는 광역학적 치료, 광열 치료 또는 온열 치료의 효능을 촉진하거나 증진시키는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 나노 구조체는 HSP의 발현 또는 활성을 억제하거나, 세포자멸사를 유도 또는 촉진하여 광역학적 치료, 광열 치료 또는 온열 치료의 효능을 증진시킬 수 있고, ROS의 생성을 억제하거나 소거를 촉진함으로서 광역학적 치료 또는 광열 치료에 의해 발생하는 세포 독성 등의 부작용을 억제할 수 있다.
다른 양상은 상기 나노 구조체를 포함하는, 광역학적 치료, 광열 치료 또는 온열 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.
본 명세서에서의 용어 "광역학적 치료 또는 광역동 치료(Photodynamic therapy, PDT)"는 광과민제(광감작제)를주입하여 암조직에 광과민제가 축적되도록 유도한 다음, 특정 파장의 레이저를 조사하여 암세포만 선택적으로 파괴하게 만드는 치료 요법을 의미한다. 이는 단순히 레이저의 열에 의한 효과가 아니라 레이저의 에너지가 광감작제가 있는 곳에서 화학적 반응을 유도하는 광화학 반응의 결과이다.
본 명세서에서의 용어 "광열 치료(photothermal therapy, PTT)"는 치료상의 작용제가 광자로부터 에너지를 흡수하여 부분적으로 열의 형태로 이용하는 치료법의 한 종류이다. 치료상의 작용제인 나노입자들이 종양 근처에 가까이 다가갔을 때, 온도 증가는 세포 손상을 이끌 수 있는 바, 이 온도 증가가 암 세포를 죽일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "온열 치료(hyperthermia, mild-temperature thermotherapy)"는 선택적으로 종양조직에 40도 이상의 고온의 열을 가하여 암세포만 과사시키거나 스스로 죽게 하는 치료 요법으로서, 암조직에 열을 가하여 암세포의 대사율을 증가시키면서 암세포에 산소의 공급을 막음으로써 암세포의 증식을 억제하여 암세포의 자살을 유도, 서서히 파괴하는 치료법이다. 상기 광열 또는 온열 치료 요법은 LITT (Laser interstitial thermal therapy)를 포함하는 것일 수 있다.
상기 조성물은 광역학적 치료, 광열 치료 또는 온열 치료의 효능을 증진시키기 위한 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 나노 구조체는 HSP의 발현 또는 활성을 억제하거나, 세포자멸사를 촉진하거나, 및/또는 ROS 소거능을 통해 염증을 제거하여 광역학적 치료 또는 광열 치료의 효능을 증진시키고, ROS 소거능을 통해 광역학적 치료 또는 광열 치료의 정상 세포에 대한 독성 등의 부작용을 억제할 수 있다.
상기 광역학적 치료, 광열 치료 또는 온열 치료의 효능을 증진시키기 위해, 상기 나노 구조체 또는 이를 포함하는 조성물을 치료 대상 개체의 표적 조직에 투여한 후, 레이져(광원) 또는 열원를 조사하는 등의 광역학적 치료, 광열 치료 또는 온열 치료를 진행하는 것일 수 있다. 또한, 상기 광역학적 치료, 광열 치료 또는 온열 치료 요법은 공지된 기술을 적용할 수 있다.
상기 광역학적 치료, 광열 치료 또는 온열 치료는 암 치료를 위한 요법일 수 있으며, 상기 치료 요법이 효능을 나타낼 수 있는 다양한 질병에 적용될 수 있다.
상기 조성물은 용매, 버퍼 용액 또는 이들의 혼합물에 전술한 나노 구조체를 첨가하고, 여기에 산, 및/또는 염기를 첨가하여 준비될 수 있다. 또한 상기 조성물은 당업계에서 잘 알려진 다른 첨가제를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 조성물이 포함하는 용매, 산, 염기, 및 버퍼 용액의 함량은 요구되는 성능에 따라 적절히 조절될 수 있다.
상기 조성물은 총 중량에 대하여 상기 나노 구조체를 0.0001 내지 50 중량%로 포함할 수 있으며, 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 더 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 여기서 "약학적으로 허용되는"의 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다. 상기 약학적 조성물에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 락토스, 덱스트로스, 말토 덱스트린, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 글리세롤, 에탄올, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 또는 광물유 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제제화하여 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물을 제제화할 경우, 일반적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 또는 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
상기 약학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 약학적으로 허용되는 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 및/또는 부형제를 포함하여 제제화할 수 있다.
상기 약학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화활 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 들 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화될 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화될 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 상기 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 투여하거나 공지된 광역학, 광열 또는 온열 치료 요법의 효과를 나타내는 것으로 알려진 성분과 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
상기 약학적 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물은 성인 1인당 약 0.1ng 내지 약 1,000 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 100 mg/kg로 투여할 수 있고, 본원의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량 또는 투여횟수는 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또 다른 양상은 상기 나노 구조체를 포함하는, 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.
본 명세서에서의 용어 "치료"는, 본 발명의 조성물의 투여에 의해 암 또는 이와 관련된 질병의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서의 용어 "예방"은, 본 발명의 조성물의 투여에 의해 암 또는 이와 관련된 질병이나 또는 질병의 발병 가능성이 억제되거나 지연되는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서의 용어 "암"은 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자라난 종양, 또는 종양을 형성하는 병을 의미한다. 상기 암은 폐암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 조성물은 암 또는 암세포의 성장, 증식, 전이 및 침투로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 억제하는 것일 수 있으며, 구체적으로 HSP 발현 또는 활성을 억제하거나, 세포자멸사를 유도하거나, 및/또는 ROS 소거능을 통해 염증을 제거하여 암세포의 성장, 증식, 전이 또는 침투를 억제함으로서 암 또는 암 관련 질병을 치료 또는 예방하는 것일 수 있다.
상기 조성물은 암 치료 또는 예방 효능을 증진시키는 것일 수 있으며, 구체적으로 암의 광역학적 치료, 광열 치료 또는 온열 치료의 효능을 증진시키기 위한 것일 수 있다. 상기 조성물은 항암제를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 양상은 상기 나노 구조체 또는 이를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 또는 예방 방법, 또는 광역학적 치료, 광열 치료 또는 온열 치료 방법을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 방법에도 공히 적용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "개체"는 암이 발병되거나 발병할 위험이 있거나 또는 광역학적 치료, 광열 치료 또는 온열 치료 대상이 될 수 있는 개, 고양이, 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물, 조류, 파충류, 양식어류 등을 제한 없이 포함할 수 있으며, 상기 개체는 인간을 제외하는 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 나노 구조체 또는 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 상기 나노 구조체 또는 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.
상기 나노 구조체 또는 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 이때, 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 주사제, 수액제(링겔), 캡슐제, 환제, 정제, 좌제 또는 패치의 형태로 제형화되어 투여할 수 있다. 상기 나노 구조체 또는 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다.
상기 나노 구조체 또는 약학적 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경피패치투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여 될 수 있다. 다만, 경구 투여 시에는 제형화되지 않은 형태로도 투여할 수 있고, 위산에 의하여 상기 약학 조성물의 유효성분이 변성 또는 분해될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화된 형태 또는 경구용 패치형태로 구강내에 투여할 수도 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 방법은 상기 나노 구조체 또는 상기 나노 구조체를 포함하는 조성물을 개체에 투여한 후, 광역학적 치료, 광열 치료 또는 온열 치료를 수행하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 이를 위해 열원 또는 광원(레이저)를 개체의 표적 부위(조직)에 조사하는 것일 수 있다.
또 다른 양상은 나노 구조체를 포함하는, HSP 활성 또는 발현 억제용 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다. 상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.
또 다른 양상은 나노 구조체를 포함하는, ROS 소거 또는 제거용 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다. 상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.
또 다른 양상은 나노 구조체를 포함하는, 세포자멸사 유도용 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다. 상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.
일 양상에 따르면, 상기 나노 구조체는 HSP 발현 또는 활성의 억제를 통해 종양 내열성을 극복하는 동시에 PDT 동안 항-세포사멸 클라이언트 단백질의 생성을 억제할 수 있으며, ROS 소거능을 갖는 바, 이를 통해 다양한 암의 광역학적 치료, 광열 치료 또는 온열 치료에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 MPa-TEG (MT)의 합성 과정을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 MT의 ESI-MS 결과를 나타낸 도면이다 [MS calcd for C41H48N4O8 724.35, found 747.34 (C41H48N4O8Na).
도 3은 DMSO-d 6 에서 MT의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도면이다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 9.53 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 9.14 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.84 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 8.01 (dd, J = 17.8, 11.4 Hz, 1H), 6.41 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 6.26 (dd, J = 17.8, 1.6 Hz, 1H), 6.11 (dd, J = 11.6, 1.5 Hz, 1H), 4.58 (dt, J = 10.7, 8.0 Hz, 1H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.45 - 4.31 (m, 2H), 4.11 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 3.70 - 3.63 (m, 2H), 3.57 (d, J = 9.6 Hz, 4H), 3.50 - 3.45 (m, 4H), 3.45 - 3.39 (m, 3H), 3.35 - 3.24 (m, 7H), 3.20 - 3.16 (m, 2H), 2.97 (d, J = 3.3 Hz, 3H), 2.66 - 2.55 (m, 1H), 2.36 (dt, J = 14.7, 7.6 Hz, 1H), 2.28 - 2.15 (m, 1H), 1.78 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 1.51 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 0.32 (d, J = 42.2 Hz, 1H), -1.90 (d, J = 63.9 Hz, 1H).
도 4는 DMSO-d 6 에서 MT의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 도면이다. 13C NMR (75 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 189.86, 173.54, 173.31, 169.41, 161.92, 155.11, 150.67, 149.20, 145.43, 141.81, 137.60, 136.62, 136.12, 135.82, 135. 14, 132.62, 129.25, 129.12, 128.94, 123.53, 105.86, 105.17, 97.25, 94.30, 72.59, 70.07, 69.90, 68.74, 65.14, 64.75, 60.56, 51.64, 51.04, 49.73, 30.98, 29.39, 23.39, 18.90, 17.84, 12.38, 12.05, 11.09.
도 5는 DMSO 및 H2O에서 MT 및 MPa의 UV-Vis 흡수 스펙트라를 나타낸 도면이다.
도 6은 우수한 항종양 PDT 및 온열 LITT 보조제 용도로 사용할 수 있는, 천연 EGCG 및 MT를 기반으로 하는 J-응집 나노포르피린(MTE)의 개략도를 나타낸 도면이다. 상기 MTE는 EGCG의 항산화 효과 및 HSP 억제제 효과로 인해 ROS를 소거하고 HSP의 발현을 억제하여 안전하고 우수한 PDT 및 온열 LITT 보조제로서의 우수한 능력을 갖는다.
도 7은 MTE의 제작 및 이의 특성에 대해 나타낸 도면이다. (a) MT와 EGCG의 비율에 따른 광학 사진 및 개략적인 구조를 나타낸다. (b) 다양한 MT-EGCG의 비율의 MTE의 DLS 프로필을 나타낸다 (MT: 단일 MT, 1:1은 MT: EGCG=1:1, 1:3은 MT: EGCG=1:3, 1:5는 MT: EGCG=1:5). (c) 10 μM MTE의 DLS 프로파일을 나타낸다. (d) 10 μM MTE의 TEM 이미지를 나타낸다. (e) SiPc-PEG6와 EGCG의 비율에 따른 광학 사진을 나타낸다. (f) 1:5의 EGCG 및 SiPc-PEG6 나노구조체의 DLS 프로필을 나타낸다.
도 8은 시간에 따른 MTE의 안정성을 나타낸 도면이다.
도 9는 생리학적 조건에서 J-응집의 안정성을 확인하 도면이다. (a) 다양한 농도의 FBS와 함께 배양한 MTE 및 MT의 전자 흡수. (b) 600 nm에서 750 nm까지의 전자 흡수.
도 10은 FBS에 의해 향상된 형광 수준을 나타내는 도면이다.
도 11은 MTE 형성의 자기 조립 메커니즘을 나타낸 도면이다. (a) MTE, 단량체 MT 및 EGCG의 전자 흡수 분석 결과를 나타낸다. (b) MTE, 단량체 MT 및 EGCG의 형광 분석 결과를 나타낸다. (c) MTE, 단량체 MT 및 EGCG의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸다. (d) 온도가 다른 MTE의 DLS 프로파일을 나타낸다.
도 12는 MTE의 광화학 및 광열 성능을 나타낸 도면이다. DCFHDA를 프로브로 사용하는 수용액에서 (a) 대조군, (b) MT (c) MPa 및 (d) MTE(모두 10μM임)의 ROS 생성을 나타낸다. (e) 조사(690 nm 레이저, 0.1 W/cm2)에 따른 526 nm에서의 형광 강도를 나타낸다. (f) DCFHDA를 형광 프로브로 사용하여 MTE의 ROS 소거 능력을 나타낸다. (inlet은 형광 강도임).
도 13은 MTE의 세포 수준에서의 성능 평가 결과를 나타낸 도면이다. (a) Hela 세포에서 MTE의 세포 흡수에 대한 CLSM 이미지를 나타낸다(스케일 바: 50μm). (b) Hela 세포에서 tracker를 사용한 MTE의 공동 국소화 CLSM 이미지를 나타낸다(스케일 바: 20μm). (c) 다른 농도의 MTE로 처리된 Hela 세포의 690 nm 레이저 조사에 따른 세포 생존율을 나타낸다. (d) 다른 농도의 MTE로 처리된 Hela 세포의 45 ℃ 수조 처리에 따른 세포 생존율을 나타낸다.
도 14는 Hela 세포에서 ROS 생성 정도를 확인한 도면이다.
도 15는 MTE 처리된 Hela 세포의 세포 자멸 메커니즘을 나타낸 도면이다. (a) Live/Dead 세포 분석을 위해, Calcein-AM 및 PI로 염색하여 공초점 현미경으로 형광 이미지를 확인하였다(Calcein AM ex: 473 nm/em: 490-590nm, PI: ex: 559 nm/em: 575-675 nm), 스케일 바: 30μm. (b) Annexin V-FITC 및 7-AAD(7-아미노액티노마이신 D)로 염색하고 유세포 분석한 결과를 나타낸다. (c) 세포 자멸이 진행된 세포 비율의(early + late apoptosis) 정량적 분석 결과를 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균±표준 편차로 표시된다. (* P<0.05) (1. 대조군, 2. 45 ℃ 30분, 3. 690 nm 레이져, 4. MTE, 5. MTE + 45 ℃ 30 분, 6. MTE + 690 nm 레이져).
도 16 MTE 처리에 따른 HSP의 발현 수준을 나타내는 도면이다. (a) HSP 억제제의 존재 또는 부재 하에 광선 요법에 의한 암세포의 세포자멸사 및 이의 억제에 대한 개략도를 나타낸다. (b 및 c) MTE 처리된 Hela 세포에서의 HSP 90 및 HSP 70의 발현 수준을 나타낸다 (*, P<0.05). (d) HSP 90 및 HSP 70의 발현 수준을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다 (1. 대조군, 2. 45 ℃ 30분, 3. 690 nm 레이져, 4. MTE, 5. MTE + 45 ℃ 30 분, 6. MTE + 690 nm 레이져).
도 17은 MTE 처리에 따른 survivin 의 발현 수준을 나타내는 도면이다. (a) HeLa 세포에서 survivin 단백질의 발현 수준을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다 (b) HeLa 세포에서 survivin 단백질의 발현 수준을 정량적으로 나타낸 도면이다 (1. 대조군, 2. 45 ℃ 30분, 3. 690 nm 레이져, 4. MTE, 5. MTE + 45 ℃ 30 분, 6. MTE + 690 nm 레이져).
도 18은 MTE 처리에 따른 PARP, Caspase 3 및 Caspase 9의 발현 수준을 나타내는 도면이다. (a) HeLa 세포에서 PARP 및 Caspase 3의 발현 수준을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다. (b 및 c) HeLa 세포에서 PARP 및 Caspase 3의 발현 수준을 정량적으로 나타낸 도면이다. (d) HeLa 세포에서 Caspase 9의 발현 수준을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다. (e) HeLa 세포에서 Caspase 9의 발현 수준을 정량적으로 나타낸 도면이다.
도 19는 ROS 소거 어세이 결과를 나타낸 도면이다. (a) 종양 주변의 종양 염증에 대한 개략도를 나타낸다. (b) MTE 처리에 따른 ROS 소거능을 공초점 현미경(CM-H2DCFDA: ex. 490 nm/em. 490-590 nm)으로 얻은 형광 이미지를 통해 분석한 결과를 나타낸다 (스케일 바: 30μm). (c) ROS 잔류량을 확인하기 위한, CLSM 이미지에 의해 분석된 정량적 형광 강도를 나타낸다. (d) MTE 처리에 따른 ROS 소거능을 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타낸다. (e) ROS 잔류량을 확인하기 위한, 유세포 분석 결과에 의해 분석된 정량적 형광 강도를 나타낸다. (f) H2O2 ± 다양한 농도의 MTE로 처리된 Hela 세포의 세포 생존율을 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차로 표시되며, *는 P<0.05를 나타낸다.
도 2는 MT의 ESI-MS 결과를 나타낸 도면이다 [MS calcd for C41H48N4O8 724.35, found 747.34 (C41H48N4O8Na).
도 3은 DMSO-d 6 에서 MT의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도면이다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 9.53 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 9.14 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.84 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 8.01 (dd, J = 17.8, 11.4 Hz, 1H), 6.41 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 6.26 (dd, J = 17.8, 1.6 Hz, 1H), 6.11 (dd, J = 11.6, 1.5 Hz, 1H), 4.58 (dt, J = 10.7, 8.0 Hz, 1H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.45 - 4.31 (m, 2H), 4.11 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 3.70 - 3.63 (m, 2H), 3.57 (d, J = 9.6 Hz, 4H), 3.50 - 3.45 (m, 4H), 3.45 - 3.39 (m, 3H), 3.35 - 3.24 (m, 7H), 3.20 - 3.16 (m, 2H), 2.97 (d, J = 3.3 Hz, 3H), 2.66 - 2.55 (m, 1H), 2.36 (dt, J = 14.7, 7.6 Hz, 1H), 2.28 - 2.15 (m, 1H), 1.78 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 1.51 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 0.32 (d, J = 42.2 Hz, 1H), -1.90 (d, J = 63.9 Hz, 1H).
도 4는 DMSO-d 6 에서 MT의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 도면이다. 13C NMR (75 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 189.86, 173.54, 173.31, 169.41, 161.92, 155.11, 150.67, 149.20, 145.43, 141.81, 137.60, 136.62, 136.12, 135.82, 135. 14, 132.62, 129.25, 129.12, 128.94, 123.53, 105.86, 105.17, 97.25, 94.30, 72.59, 70.07, 69.90, 68.74, 65.14, 64.75, 60.56, 51.64, 51.04, 49.73, 30.98, 29.39, 23.39, 18.90, 17.84, 12.38, 12.05, 11.09.
도 5는 DMSO 및 H2O에서 MT 및 MPa의 UV-Vis 흡수 스펙트라를 나타낸 도면이다.
도 6은 우수한 항종양 PDT 및 온열 LITT 보조제 용도로 사용할 수 있는, 천연 EGCG 및 MT를 기반으로 하는 J-응집 나노포르피린(MTE)의 개략도를 나타낸 도면이다. 상기 MTE는 EGCG의 항산화 효과 및 HSP 억제제 효과로 인해 ROS를 소거하고 HSP의 발현을 억제하여 안전하고 우수한 PDT 및 온열 LITT 보조제로서의 우수한 능력을 갖는다.
도 7은 MTE의 제작 및 이의 특성에 대해 나타낸 도면이다. (a) MT와 EGCG의 비율에 따른 광학 사진 및 개략적인 구조를 나타낸다. (b) 다양한 MT-EGCG의 비율의 MTE의 DLS 프로필을 나타낸다 (MT: 단일 MT, 1:1은 MT: EGCG=1:1, 1:3은 MT: EGCG=1:3, 1:5는 MT: EGCG=1:5). (c) 10 μM MTE의 DLS 프로파일을 나타낸다. (d) 10 μM MTE의 TEM 이미지를 나타낸다. (e) SiPc-PEG6와 EGCG의 비율에 따른 광학 사진을 나타낸다. (f) 1:5의 EGCG 및 SiPc-PEG6 나노구조체의 DLS 프로필을 나타낸다.
도 8은 시간에 따른 MTE의 안정성을 나타낸 도면이다.
도 9는 생리학적 조건에서 J-응집의 안정성을 확인하 도면이다. (a) 다양한 농도의 FBS와 함께 배양한 MTE 및 MT의 전자 흡수. (b) 600 nm에서 750 nm까지의 전자 흡수.
도 10은 FBS에 의해 향상된 형광 수준을 나타내는 도면이다.
도 11은 MTE 형성의 자기 조립 메커니즘을 나타낸 도면이다. (a) MTE, 단량체 MT 및 EGCG의 전자 흡수 분석 결과를 나타낸다. (b) MTE, 단량체 MT 및 EGCG의 형광 분석 결과를 나타낸다. (c) MTE, 단량체 MT 및 EGCG의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸다. (d) 온도가 다른 MTE의 DLS 프로파일을 나타낸다.
도 12는 MTE의 광화학 및 광열 성능을 나타낸 도면이다. DCFHDA를 프로브로 사용하는 수용액에서 (a) 대조군, (b) MT (c) MPa 및 (d) MTE(모두 10μM임)의 ROS 생성을 나타낸다. (e) 조사(690 nm 레이저, 0.1 W/cm2)에 따른 526 nm에서의 형광 강도를 나타낸다. (f) DCFHDA를 형광 프로브로 사용하여 MTE의 ROS 소거 능력을 나타낸다. (inlet은 형광 강도임).
도 13은 MTE의 세포 수준에서의 성능 평가 결과를 나타낸 도면이다. (a) Hela 세포에서 MTE의 세포 흡수에 대한 CLSM 이미지를 나타낸다(스케일 바: 50μm). (b) Hela 세포에서 tracker를 사용한 MTE의 공동 국소화 CLSM 이미지를 나타낸다(스케일 바: 20μm). (c) 다른 농도의 MTE로 처리된 Hela 세포의 690 nm 레이저 조사에 따른 세포 생존율을 나타낸다. (d) 다른 농도의 MTE로 처리된 Hela 세포의 45 ℃ 수조 처리에 따른 세포 생존율을 나타낸다.
도 14는 Hela 세포에서 ROS 생성 정도를 확인한 도면이다.
도 15는 MTE 처리된 Hela 세포의 세포 자멸 메커니즘을 나타낸 도면이다. (a) Live/Dead 세포 분석을 위해, Calcein-AM 및 PI로 염색하여 공초점 현미경으로 형광 이미지를 확인하였다(Calcein AM ex: 473 nm/em: 490-590nm, PI: ex: 559 nm/em: 575-675 nm), 스케일 바: 30μm. (b) Annexin V-FITC 및 7-AAD(7-아미노액티노마이신 D)로 염색하고 유세포 분석한 결과를 나타낸다. (c) 세포 자멸이 진행된 세포 비율의(early + late apoptosis) 정량적 분석 결과를 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균±표준 편차로 표시된다. (* P<0.05) (1. 대조군, 2. 45 ℃ 30분, 3. 690 nm 레이져, 4. MTE, 5. MTE + 45 ℃ 30 분, 6. MTE + 690 nm 레이져).
도 16 MTE 처리에 따른 HSP의 발현 수준을 나타내는 도면이다. (a) HSP 억제제의 존재 또는 부재 하에 광선 요법에 의한 암세포의 세포자멸사 및 이의 억제에 대한 개략도를 나타낸다. (b 및 c) MTE 처리된 Hela 세포에서의 HSP 90 및 HSP 70의 발현 수준을 나타낸다 (*, P<0.05). (d) HSP 90 및 HSP 70의 발현 수준을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다 (1. 대조군, 2. 45 ℃ 30분, 3. 690 nm 레이져, 4. MTE, 5. MTE + 45 ℃ 30 분, 6. MTE + 690 nm 레이져).
도 17은 MTE 처리에 따른 survivin 의 발현 수준을 나타내는 도면이다. (a) HeLa 세포에서 survivin 단백질의 발현 수준을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다 (b) HeLa 세포에서 survivin 단백질의 발현 수준을 정량적으로 나타낸 도면이다 (1. 대조군, 2. 45 ℃ 30분, 3. 690 nm 레이져, 4. MTE, 5. MTE + 45 ℃ 30 분, 6. MTE + 690 nm 레이져).
도 18은 MTE 처리에 따른 PARP, Caspase 3 및 Caspase 9의 발현 수준을 나타내는 도면이다. (a) HeLa 세포에서 PARP 및 Caspase 3의 발현 수준을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다. (b 및 c) HeLa 세포에서 PARP 및 Caspase 3의 발현 수준을 정량적으로 나타낸 도면이다. (d) HeLa 세포에서 Caspase 9의 발현 수준을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다. (e) HeLa 세포에서 Caspase 9의 발현 수준을 정량적으로 나타낸 도면이다.
도 19는 ROS 소거 어세이 결과를 나타낸 도면이다. (a) 종양 주변의 종양 염증에 대한 개략도를 나타낸다. (b) MTE 처리에 따른 ROS 소거능을 공초점 현미경(CM-H2DCFDA: ex. 490 nm/em. 490-590 nm)으로 얻은 형광 이미지를 통해 분석한 결과를 나타낸다 (스케일 바: 30μm). (c) ROS 잔류량을 확인하기 위한, CLSM 이미지에 의해 분석된 정량적 형광 강도를 나타낸다. (d) MTE 처리에 따른 ROS 소거능을 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타낸다. (e) ROS 잔류량을 확인하기 위한, 유세포 분석 결과에 의해 분석된 정량적 형광 강도를 나타낸다. (f) H2O2 ± 다양한 농도의 MTE로 처리된 Hela 세포의 세포 생존율을 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차로 표시되며, *는 P<0.05를 나타낸다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 실험 재료 및 기기 정보
EGCG ((-)-Epigallocatechin Gallate)는 TCI에서 구입했고, DMSO(Dimethylsulfoxide)와 DCFH-DA (2,7-dichlorofluorescin diacetate)는 Sigma-Aldrich에서 구입했으며, Mito-Tracker 및 Lyso-Tracker는 Life Technologies Co.에서 구입했다. 상기 제품들은 추가 정제없이 사용하였다. 1H NMR 및 13C NMR은 Bruker 300MHz 분광계로 측정하였다. ESI-MS (Electrospray ionization mass spectrometry) 데이터는 한국기초과학연구원(오창)의 SYNAPT G2(Waters, U.K.) 분광계로 얻었다. UV-가시광 흡수 스펙트럼은 Thermo Scientific Evolution 201 UV-Visible 분광 광도계로 측정되었으며 모든 형광 측정값은 FS-2 형광 분광기(Scinco)에서 기록되었다. DLS (dynamic light scattering) 측정은 Nano-ZS(Malvern)를 사용하여 수행되었다. 투과 전자 현미경(TEM) 이미지는 200kV에서 작동하는 전자 현미경(JEOL-2100F)을 이용하여 수득하였다. FTIR (Fourier transform infrared) 스펙트럼은 VERTEX 80/80v FTIR 분광계(BRUKER)에서 기록되었다. 모든 공초점 레이저 스캐닝 현미경 이미지는 Olympus Fluoview FV1200 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 수행되었다.
실시예 2: MPa-TEG (MT) 의 합성 (R=-OCH
2
CH
2
OCH
2
CH
2
-OCH
2
CH
2
OH)
광감작제(photosensitizer, PS)-에틸렌글리콜(ethylene glycol, EG) 접합체(PS-EG)의 일 예로서, MPa-TEG (MT)를 합성하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
MPa (Methylpheophorbide a) (0.1 g, 0.16 mmol) 및 4-(디메틸아미노) 피리딘[4-(dimethylamino) pyridine] (0.016 g, 0.13 mmol)을 톨루엔에 용해시켰다. 이어서, 트리(에틸렌 글리콜)[tri(ethylene glycol)](0.033mL, 0.25mmol)을 첨가하고 전체 혼합물을 16시간 동안 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 수성 염화암모늄으로 처리하였다. 그 다음 혼합물을 메틸렌 클로라이드(methylene chloride)로 2회 추출하였고, 유기층을 물로 세척하고 용매를 증발시켰다. 잔류 고체를 실리카 상에서 구배 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 빠르게 움직이는 비극성 부산물을 먼저 (CH2Cl2/EtOAc = 19/1)로 컬럼을 용리하여 분리하였다. 그 다음, 원하는 생성물(MT)을 (EtOAc/THF = 9/1)로 용리하여 분리하였다. CH2Cl2/Hexanes로부터 재결정화하여 흑색 자주색 생성물을 얻었고, 0.073g(61%)을 얻었다.
실시예 3: 나노복합체의 제작
광감작제-에틸렌글리콜 접합체(PS-EG) 및 EGCG를 포함하는 나노 복합체를 제작하기 위해, 먼저 10mM PS-EG (예를 들어, MT 또는 SiPc-PEG6)(in DMSO) 및 10mM EGCG(in water)를 스톡 용액으로 준비했다. 그런 다음 각각 10, 30, 50 μL EGCG 스톡 용액을 980, 960 및 940 μL 물에 추가하였다. 마지막으로, 초음파 교반 하에 10 μL PS-EG 스톡 용액을 각각 첨가하였으며, 밤새 진동시킨 후 균일하게 분산된 나노복합체를 얻었다.
실시예 4: ROS (Reactive oxygen species) 생성 테스트
수중 ROS 생성은 DCFHDA를 형광 프로브로 사용하여 측정되었다. DCFHDA는 약 473 nm에서 여기되고 형광을 방출할 수 있는 산화된 디클로로플루오레세인일 수 있다. 샘플(MPa, MT 및 MTE, 10μM)을 20μM DCFHDA와 함께 용해시키고, 단일 20μM DCFHDA 수용액을 대조군으로 사용하였다. 그런 다음 혼합 용액에 0.1 W/cm2 690 nm 레이저를 여러 번 조사하고, 형광 강도(504 nm에서 여기)를 기록했다.
실시예 5: 광열 특성 (Photothermal properties)의 평가
1 mL MTE 수용액(10 μM)을 석영 큐벳에 넣고 690 nm 레이저(1.5 W/cm2)를 이용하여 10분간 조사하였다. 또는 다양한 농도의 시료 수용액을 플레이트에 놓고 690 nm 레이저를 이용하여 5분간 조사하였다. 온도는 디지털 온도계 또는 열화상 카메라와 결합된 열전쌍 프로브로 확인하였다. 순수한 물을 대조군으로 사용하였다.
실시예 6: 세포 배양
인간 자궁경부 선암종인 HeLa 세포를 한국 세포주 은행(서울, 한국)에서 구입하고 10% 소태아 혈청, 100U/ml 페니실린 및 100U/ml 스트렙토마이신이 보충된 EMEM(Eagle's Minimum Essential Medium included NEAA 포함)에서 37℃ 습윤 대기 및 5% CO2 조건으로 배양했다.
실시예 7: 세포 흡수(Cellular uptake) 및 공재화(co-localization) 평가
세포 흡수(Cellular uptake) 분석을 위해, 세포를 35mm 공초점 접시에 시딩하고 24시간 동안 배양했다. 그런 다음 DPBS로 세척한 후 배지를 MTE(5μM)를 포함하는 1mL 배지로 교체했습니다. 세포 이미징은 다양한 배양 시간 후 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 기록되었다.
공재화(co-localization) 어세이를 위해, 세포를 35mm 공초점 접시에 시딩하고 24시간동안 배양했다. 그런 다음 DPBS로 세척한 후 배지를 MTE(5μM)를 포함하는 1mL 배지로 교체하고 2시간동안 배양했다. LysoTracker Green DND 및 MitoTracker Green FM(500nM)을 사용하여 30분 동안 세포를 별도로 염색하였으며, 세포 이미징은 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 기록되었다.
실시예 8: 세포 독성 평가
MTT 어세이를 수행하기 위해, 웰당 3 X 104 세포를 100 μL의 배양 배지가 있는 96-웰 플레이트에 접종한 다음 24시간 동안 인큐베이션했다. DPBS로 세척한 후 농도가 다른 샘플을 포함하는 새로운 배양 배지 100 μL를 플레이트에 추가하고 2시간 동안 추가로 배양했다. 비처리군의 경우, 배지를 제거하고 각 웰에 10μL의 MTT 용액(5mg/mL)과 함께 90μL의 신선한 MEM에 첨가한 다음 4시간 동안 추가 배양하였다. 처리군의 경우, 시료가 포함된 배지를 새로운 배지로 대체하고, 빛 또는 워터 배쓰 처리 후 24시간 배양하였다. 마지막으로 배지를 다시 제거하고 각 웰에 DMSO 100μL를 첨가하고 10분 동안 저속으로 흔들어주어 청색 포르마잔 결정을 완전히 용해시켰다. 각 웰의 흡광도는 SpectraMax Microwell 플레이트 판독기로 OD 490 nm에서 측정되었다. 샘플과 함께 배양하지 않고 비처리 세포의 세포 생존율은 100%로 정규화되었다. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균 및 표준 편차(SD)로 표시하였다.
형광 현미경 분석을 위해, 접시당 3 X 105개 세포를 배양 배지가 있는 35mm 유리 바닥 접시에 접종했다. 24시간 후, 세포를 3μM 샘플로 2시간 동안 인큐베이션하고 45 ℃, 30분 또는 690nm 레이저(0.1 W/cm2)로 처리하고 16시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 Calcein-AM 및 Propidium iodide로 세포를 염색하고 공초점 현미경(FV1200, Olympus, Japan)을 이용하여 형광 이미지를 획득했다.
세포자멸사 수준을 평가하기 위한 유세포 분석을 수행하기 위해(7-AAD가 포함된 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit를 사용), 세포를 6웰 플레이트에서 24시간 동안 배양하고 3μM 샘플로 2시간 동안 인큐베이션하고 45℃, 30분 또는 690nm 레이저(0.1W/cm2)로 처리하고 16시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 트립신 처리하고 차가운 PBS로 2회 세척하고 Annexin V-FITC/7-AAD(7-amino-actinomycin D)를 함유하는 Annexin V 결합 완충액에 재현탁하고 암실에서 실온으로 15분 동안 인큐베이션하고 BD LSRFortessa(Becton Dickinson)를 사용하여 분석했다. 각 분석에는 10,000개의 세포가 사용되었으며 실험은 3반복으로 수행되었다.
실시예 9: ROS 제거 (ROS scavenging) 평가
형광 현미경 분석을 위해, 접시당 3 X 105개 세포를 배양 배지가 있는 35mm 유리 바닥 접시에 접종했다. 24시간 후, HeLa 세포를 2시간 동안 20μM MTE로 사전 배양하고 500μM H2O2 또는 100μM Antimycin A로 30분 동안 처리하였다. 이후 5μM CM-H2DCFDA로 30분 동안 염색하고 공초점 현미경으로 형광 이미지를 획득했다.
유세포 분석을 수행하기 위해, 세포를 6웰 플레이트에서 24시간 동안 배양한 다음 20μM MTE로 2시간 동안 사전 배양하고 500μM H2O2 또는 100μM Antimycin A로 30분 동안 처리하고 5μM CM-H2DCFDA로 30분 동안 염색하였다. 세포를 트립신 처리하고 차가운 PBS로 2회 세척하고 PBS에 재현탁하고 BD LSRFortessa(Becton Dickinson)를 사용하여 분석했다. 각 분석에는 10,000개의 세포가 사용되었으며 실험은 3반복으로 수행되었습니다.
실시예 10: 웨스턴 블랏팅
HeLa 세포를 3μM 샘플과 함께 2시간 동안 인큐베이션하고 45℃, 30분 또는 690nm 레이저(0.1W/cm2)로 처리하고 16시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 RIPA 완충액(50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 1mM EDTA, pH 7.4)으로 단백질 용해물을 수확했다. 단백질 용해물을 얼음에서 30분 동안 인큐베이션하고 13,000 rpm, 10분, 4 ℃에서 원심분리하였다. 상청액을 수집하고 BCA 단백질 분석 키트(Thermo Scientific)를 사용하여 단백질 농도를 정량화했다. 등가량의 단백질(35μg)을 SDS-PAGE로 분리하고 PVDF(폴리비닐리덴 디플루오라이드) 막으로 옮겼다. 상기 PVDF막을 차단 완충액(TTBS 중 5% 무지방 분유(0.1% Tween 20-TBS))에서 1시간 동안 차단하고, TTBS로 세척하고 차단 완충액에 희석된 1차 항체로 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그런 다음 막을 TTBS로 3회 세척하고 2차 항체와 함께 2시간 동안 인큐베이션하고 Pierce ECL 웨스턴 블롯팅 기질(Thermo Scientific)을 사용하여 단백질을 검출하였다. 1차 항체, HSP70, HSP90, PARP, caspase-3, β-actin은 Santacruz Biotechnology에서 구입했으며 2차 항체 항-마우스 IgG HRP 연결 항체는 Cell signaling Tech에서 구입했다.
실시예 11: 통계적 분석
모든 통계 분석은 Excel 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 데이터는 수행된 n 실험의 측정값의 평균 ± SD로 표시하였다. 통계적 유의성은 독립 표본 t-검정을 사용하여 평가되었다. P 값 < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주된다.
실험예 1: EGCG 및 광감작제-에틸렌글리콜 접합체를 포함하는 나노 복합체 제작
본 발명의 EGCG 및 광감작제(photosensitizer, PS)-에틸렌글리콜(ethylene glycol, EG) 접합체(PS-EG)를 포함하는 나노 복합체를 제작하기 위해, 하나의 대표예로서 EGCG-MT 나노 복합체(MTE)를 하기와 같은 실험을 통해 제작하였다.
구체적으로, 녹차의 주요 천연 성분인 EGCG ((-)-Epigallocatechin Gallate)는 우수한 생체 적합성과 생물학적 활성으로 인해 바이오 나노 물질을 구성하는 데에 주로 사용될 수 있다. 또한, 많은 수의 하이드록실 그룹의 존재는 비공유 상호작용을 위한 다중 작용 부위를 제공할 수 있다. 또한, MPa (Methylpheophorbide a)에 트리에틸렌글리콜[tri (ethylene glycol)]이 결합된 MT는 포르피린-기반 광감작제(photosensitizer, PS)의 우수한 광학적 특성으로 인해, 핵심 광감작제로 선호되며, 여기서 트리(에틸렌 글리콜)은 도 1과 같이 MPa (Methylpheophorbide a)와 접합된다. 상기 트리에탄올의 도입은 MT의 친수성을 증가시킬 뿐만 아니라, EGCG와 수소 결합의 결합 부위를 증가시켜 나노복합체 형성을 용이하게 하기 위해 적용될 수 있다.
먼저, 고순도 conjugated 화합물은 MALDI-TOF MS에 의해 확인되었으며, NMR 결과는 도 2 내지 도 4에 나타냈다. 구조적인 조절로 인해 MT는 MPa에 비해 수용액에서 더 큰 적색 편이와 더 높은 흡광 계수를 가질 수 있음을 확인하였다 (도 5). 또한, MT를 포함하는 용매를 EGCG를 포함하는 수용액에 첨가했을 때, MT는 초음파의 도움 하에 빠르게 핵화되고 균일하게 분포되었다. 동시에, 유사하면서 큰 π-접합 구조적인 EGCG와 MT 사이의 상승적 상호작용은 안정한 나노복합체(MTE)를 형성하기 위해 촉진될 수 있다(도 6). 또한, EGCG의 강한 친수성과 MT의 소수성으로 인해 EGCG는 MT의 표면을 덮는 형태로 구조체가 형성되었으며, 개별적인 MT의 강력한 응집 거동과 비교하여, EGCG의 존재는 MT의 Ostwald 성숙으로 인한 응집 및 침전을 효과적으로 억제할 수 있었다.
다음으로, 작고 균일한 나노복합체를 얻기 위해 EGCG와 MT의 조성 비율을 조절하고자 하였다. EGCG와 MT의 조성 비율에 따라 형성된 나노복합체를 광학 사진으로 확인한 결과, MT의 심각한 소수성으로 인해 단일 MT 수용액에서는 심각한 응집 및 침전이 발생하는 반면 EGCG 농도가 증가함에 따라 침전이 사라지는 것을 확인하였다(도 7a). 이는 EGCG의 존재가 MT의 Ostwald 숙성을 효과적으로 방지할 수 있음을 나타낸다.
다음으로, 동적 광산란(dynamic light scatterin, DLS) 분석 결과 또한 수용액에서 단일 MT가 심각한 응집을 생성하는 반면 EGCG의 추가는 나노복합체의 형성에 기여함을 보여준다. 특히, 제타 전위가 -18.57±0.35 mV인 1:3(MT: EGCG)의 비율의 경우 가장 좋은 다분산 지수(PdI: 0.284)로서 좁은 크기 분포를 가졌고 크기가 약 150 nm를 나타냈다 (도 7b). 따라서, 상기 비율로 제작된 나노구조체를 선택하였으며, 이를 MTE로 명명하였다. 한편, 1:3(MT: EGCG)의 비율보다 더 많은 EGCG를 추가할 경우에는 다분산성에 영향을 미쳐 자유 EGCG 분자의 존재로 이어질 수 있음을 확인하였다.
다음으로, MTE가 10배 희석된 후에도 여전히 약 150nm의 크기를 유지함을 확인하였으며 (도 7c), 이는 투과 전자 현미경(TEM) 이미지(도 7d)의 결과와 일치하였는 바, MTE가 희석에 대한 저항성이 우수함을 알 수 있다.
다음으로, 상기 나노 복합체의 다른 구현예로서 EGCG와 SiPc(Silicon phthalocyanine, 실리콘프탈로시아닌)에 헥사에틸렌글리콜[hexa (ethylene glycol)]이 결합된 SiPc-PEG6를 이용하여 나노 복합체를 제작하였다. 그 결과, 상기 MT를 이용하여 나노 복합체를 제작한 것과 유사하게 1:3(SiPc-PEG6:EGCG) 비율에서 효과적으로 나노 복합체가 제작되었으며(도 7e), 1:3(SiPc-PEG6: EGCG)의 비율의 경우 가장 좋은 다분산 지수(PdI: 0.334)로서 좁은 크기 분포를 가졌고 크기가 약 197 nm를 나타냈다 (도 7b).
또한, MTE의 크기는 일주일 후에도 거의 변화가 없었음을 확인하였다(도 8).
다음으로, J-응집(aggregation)은 일반적으로 생물학적 환경에서 중단된다는 점을 고려하여, 생리학적 조건에서 J-응집의 안정성을 조사하기 위해 다양한 농도의 FBS에 MT 및 MTE를 인큐베이션하였다. 그 결과, FBS의 농도가 증가함에 따라 MT는 점차적으로 단량체가 되었으나, 대조적으로 MTE는 90% FBS와 함께 배양하더라도 안정적인 J-응집을 유지하는 것을 확인하였다(도 9). 또한, 바이오마커 FBS가 J-응집 안정성을 유지하면서 형광을 적절히 향상시킬 수 있음을 확인하였다(도 10).
실험예 2: MTE 나노 복합체의 자가조립 메커니즘 분석
EGCG 및 광감작제(photosensitizer, PS)-에틸렌글리콜(ethylene glycol, EG) 접합체(PS-EG)를 포함하는 나노 복합체 형성의 자기조립 메커니즘을 확인하기 위해, 일 예로서, MTE 형성의 전자 흡수(Electronic absorption), 형광, 푸리에 변환 적외선(Fourier transform infrared, FTIR) 분광법 및 다양한 MTE 온도에 따른 DLS를 측정하였다.
먼저, 전자 흡수는 MT 단량체 분자와 비교하여 조립체가 J-응집체의 형성을 나타내는 상당한 적색 이동을 겪었음을 나타냈으며(도 11a), 이는 조직의 침투를 향상시킬 뿐만 아니라 근적외선(NIR) 생물학적 흡수 창으로 인한 피부와 조직의 손상을 줄일 수 있음을 나타내는 바, 생물의학적 이용에 유리할 수 있음을 알 수 있다. 또한, 형광 소광은 π-π 스태킹 및 벤젠 고리와 포르핀 고리 사이의 소수성 상호 작용의 존재를 나타낸다(도 11b).
다음으로, MTE의 FT-IR 스펙트럼은 4개의 특성 밴드를 나타냈다(도 11c). 3350 cm-1의 밴드는 EGCG의 해당 밴드에 비해 현저한 적색편이와 약화를 겪은 O-H 그룹의 신축진동에 할당된다. 1733 cm-1의 밴드는 C=O의 신축 진동 흡수로 인한 것이며 피크 강도의 상대적 감소는 수소 결합의 형성 때문일 수 있으며, 이것은 MT와 EGCG의 O-H 그룹 사이에 수소 결합이 형성되기 때문일 수 있다. 2981 및 2895 cm-1의 밴드는 아미드 N-H 신축에 해당한다. 상기 결과를 통해 MTE의 형성이 MT와 EGCG에 의해 공동작용되었음을 알 수 있다. 또한, 1030 cm-1의 밴드는 C-O에 할당되었으며, 성공적인 공동 조립으로 인해 MT 및 EGCG의 FTIR 스펙트럼에서 해당 밴드와 비교하여 향상되었다.
다음으로, 수소 결합을 추가로 확인하기 위해 다양한 온도에서 MTE의 DLS 프로파일을 테스트했다. 그 결과, MTE의 크기는 온도가 증가함에 따라 감소했는데, 이는 MT와 EGCG 사이의 수소 결합 파괴로 인한 것일 수 있으며, 이는 공동 조립 과정이 매개되는 분자 사이의 수소 결합에 의해 주로 매개됨을 나타낸다(도 11d).
실험예 3: MTE 나노 복합체의 광화학 (photochemical) 및 광열(photothermal) 성능 평가
광선 요법에 대한 EGCG 및 PS-EG를 포함하는 나노 복합체의 잠재력을 확인하기 위해, 일 예로서 MTE의 광화학적 성능을 평가하였다. 먼저, DCFHDA (2,7-dichlorofluorescin diacetate)를 프로브로 사용하고 DCFHDA만 포함하는 그룹을 대조군으로 사용하여 서로 다른 PS의 ROS 생성을 평가하였다. 그 결과, MT는 MPa에 비해 ROS 생산 효율이 우수하였으며, 이는 구조적 변형으로 이어지는 흡광 계수의 향상이 광화학 반응에 유리함을 확인시켜준다(도 12a 내지 c). 또한, MTE는 MT보다 적은 ROS를 생성하는 것으로 확인되었으며(도 12d 및 e), 이는 주로 에너지 감쇠 경로의 변화로 이어지는 응집 모드 및 EGCG의 ROS 소거 능력에 의한 것임을 알 수 있다.
다음으로, ROS 제거 능력을 확인하기 위해 DCFHDA를 프로브로 사용하여 다양한 농도의 MTE 용액을 H2O2와 공동 인큐베이션했다. 그 결과, 형광 강도는 MTE 농도가 증가함에 따라 감소하였는 바, MTE가 우수한 ROS 소거 능력을 가지는 것을 알 수 있다 (도 12f).
한편, 포르피린을 기반으로 하는 임상적으로 사용되는 PS는 약 400 nm에서 "S 밴드" 흡광도 피크가 있기 때문에, 이로인해 불가피하게 가시광선에 의한 광독성을 받게된다. 따라서, MTE 나노구조체의 ROS 소거능은 치료하지 않은 시간에 의도하지 않은 가시광선에 의한 광독성을 효과적으로 피할 수 있을 뿐만 아니라 잠재적인 항염증 효과를 가진다는 점에서 의의가 있다. 암 세포 및 조직의 비정상적인 대사는 과도한 ROS의 존재를 초래하여, 염증을 유발하고 정상 조직에 손상을 일으키고 치료를 더욱 제한할 수 있는 바, ROS 소거능에 의한 염증의 제거는 효과적인 종양 치료의 핵심 요소로 판단된다.
실험예 4: MTE 나노 복합체의 세포 수준에서의 성능 평가
상기 실험예에서 MTE의 우수한 광 특성과 ROS 소거 능력을 확인하였는 바, 이를 세포 수준에서 평가하기 위해 실험을 수행하였다.
먼저, Hela 세포에서 MTE의 세포 흡수 수준을 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용하여 확인하였다. 그 결과, MTE의 형광은 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 점진적으로 증가하여 MTE가 효과적으로 세포질로 내재화되었음을 나타냈으며, 이는 주로 세포내이입(endocytosis)을 통해 MTE가 세포로 유입된 것으로 확인되었다(도 13a). 복구 형광의 경우 세포 환경에서 FBS에 의해 적절히 활성화되기 때문일 수 있다 (도 10).
다음으로, MTE의 세포내 위치를 탐색하기 위해, Hela 세포에 LTG(LysoTracker Green) 또는 MTG(MitoTracker Green)를 MTE와 공동 염색했다. 그 결과 MTE는 LTG와 0.81의 높은 Pearson 계수를 나타냈는 바, MTE는 라이소좀(lysosome)에 주로 분포하는 것을 알 수 있다(도 13b).
다음으로, 종양 세포에서 MTE의 PDT 효능을 추가로 평가하기 위해 일반적인 MTT 분석을 수행했다. 이를 위해, Hela 세포를 다양한 농도의 MTE와 함께 2시간 동안 공동 배양한 다음 새 배지를 교체한 후 각기 다른 조건으로 처리했다. 그 결과 빛 조사가 없는 상태에서 MTE로 처리된 Hela 세포가 세포 독성을 전혀 나타내지 않음을 보여주었는 바, MTE의 우수한 생체 적합성을 나타냄을 알 수 있다. 또한, 광 조사와 결합하여 MTE 처리한 경우의 세포 생존력을 평가한 결과, MTE 농도 및 레이저 출력에 의존하여 세포 생존 억제 효율이 증가하는 것을 확인하였다 (도 13c). 구체적으로, Hela 세포를 10μM MTE, 0.1W/cm2로 30초 배양한 경우 세포 생존율이 18.16%로 우수한 PDT 효과를 보였다.
다음으로, MTE가 광열/온열 요법에 도움이 될 수 있는지 여부를 추가로 확인하기 위해, Hela 세포에 45 ℃ 수조를 적용하여 MTE가 종양의 내열성을 감소시킬 수 있는지 여부를 평가하였다. 그 결과, MTE의 농도가 증가함에 따라 세포 생존율이 효과적으로 억제되었으며, 이는 Hela 세포의 열 저항이 감소했기 때문임을 알 수 있다. 구체적으로, MTE를 처리하지 않은 대조군은 45 ℃에서 60분 동안 90.33%의 세포 생존율을 유지하여 Hela 세포가 열 스트레스에 대한 저항성을 나타냈으나, 10μM MTE로 처리된 Hela 세포의 세포 생존율은 15.36%였다. 이는 EGCG에 의한 HSP 발현의 억제로 인한 것으로 예상할 수 있으며, MTE는 LITT와 같은 외인성 열원과 결합된 우수한 온열 치료의 보조제로 이용할 수 있음을 알 수 있다.
추가적으로, DCFH-DA를 형광성 ROS 프로브로 사용하여 CLSM 결과를 분석한 결과, MPa의 트리에탄올의 도입은 세포 환경에서 ROS의 생산을 크게 향상시켰으며, MTE가 MT에 비해 불가피한 가시광선에 의한 의도하지 않은 ROS 생성을 효과적으로 피할 수 있음을 확인하였다(도 14).
실험예 5: MTE 나노 복합체의 광역학 및 온열 치료 관련 메커니즘 확인
먼저, MTE의 2개의 경로로 증강된 우수한 광선요법 효능(우수한 PDT와 온열 요법 보조 효능)을 확인하기 위해, calcein AM(녹색, 살아있는 세포) 및 Propidium iodide(PI)(적색, 죽은 세포)을 이용하여 살아있는 세포 및 죽은 세포 동시 염색을 수행했다. 또한, 광역학 치료 및 온열 요법에서 MTE의 우수한 촉진 효과를 확인하기 위해, HeLa 세포에 3μM MTE를 처리하여 2시간 동안 인큐베이션하고, 45 ℃ 수조에서 30분 또는 690nm 레이저(0.1W/cm2)에서 처리했다. 그 결과, MTE를 전처리한 군이 대조군에 비해 온열 치료 또는 광조사 처리 후 Hela 세포에 대한 사멸 효과가 우수한 것으로 나타났다 (도 15a). 다음으로, 세포 사멸 속도를 보다 구체적으로 확인하기 위해 유세포 분석을 수행한 결과, 대조군과 비교하여 MTE로 전처리된 Hela 세포는 온열 치료 후 더 높은 세포 자멸을 유발하였고, 690 nm 레이저를 조사한 경우 세포자멸률(early + late apoptosis)은 78.5%로 높았음을 확인하였다(도 15b 및 c). 따라서, MTE에 의한 세포 사멸은 주로 세포 자멸 경로에 의해 매개됨을 알 수 있다.
다음으로, 개념 증명 연구로서 MTE의 EGCG가 HSP의 억제제로서 작용할 수 있는지 가정하였다(도 16a). 정상적인 상황에서 세포는 외부 자극에 의해 자극될 때 세포에 대한 열 손상에 저항하기 위해 HSP를 과발현한다. 동시에 HSP는 일부 항-세포자멸 단백질과 결합하여 세포자멸을 차단한다. HSP의 클라이언트 단백질인 Survivin은 PDT에 의해 유도된 세포자멸사를 억제한다. HSP의 발현이 억제되면 종양세포의 열저항이 감소될 뿐만 아니라 PDT 동안의 항-세포자멸 단백질의 생성도 억제되는 바, 2가지 경로로 작용함으로써 탁월한 치료 효과를 얻을 수 있다.
따라서, 효율적인 세포 자멸의 메커니즘을 확인하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 HSP 70 및 HSP 90의 발현 수준을 평가한 결과, 대조군 세포에 비해 열 또는 광 조사로 처리된 Hela 세포에서 더 높게 발현되었다. 대조적으로, MTE와 함께 배양된 Hela 세포는 온열 요법과 광조사에 의해 유도된 HSP 70 및 HSP 90의 과발현을 효과적으로 억제하였다 (도 16b 내지 d).
다음으로, PDT에 의해 증가된 항-세포자멸 단백질인 survivin의 발현 수준을 평가한 결과, 45 ℃ 또는 광 조사 하에서 처리된 Hela 세포에서는 survivin의 발현 수준이 증가하는 반면, MTE에 의해 효과적으로 억제되는 것을 확인하였다 (도 17a 및 b). 또한, 세포자멸사 경로 평가를 위해 세포자멸사의 주요 이펙터로서 절단된 PARP, 절단된 caspase-3 및 절단된 caspase-9의 발현 수준을 확인하였다 (도 18a 내지 e).
상기 결과를 토대로, HSP 발현에 의해 Hela 세포의 세포자멸사가 억제되는 것을 확인하였으며, MTE는 상기 HSP에 의한 세포자멸사의 억제 효과를 제거함으로써 세포자멸사를 가속화하는 것을 알 수 있다.
실험예 6: MTE 나노 복합체의 세포 수준에서의 ROS 소거능 평가
종양의 비정상적인 대사는 ROS가 과도하게 축적되어 종양 주변에 염증을 유발하며(도 19a), 이는 종종 임상 치료를 방해하는 핵심 포인트 중 하나인 바, 따라서 암 및 기타 관련 질병의 병리학에서 ROS를 제거하는 것이 특히 중요하다. MTE는 우수한 ROS 소거 효과가 있어 비치료 단계에서 불가피한 가시광선으로 인한 세포 독성을 피할 수 있다. 상향 조절된 ROS는 종종 종양 및 기타 병변과 연관되어 염증을 유발하는 바, 나노복합체 자체가 치료 과정에서 항염증 효과를 가진다면 암 치료에 도움이 될 뿐만 아니라 염증 인자의 손상으로부터 정상 세포를 보호할 수 있다.
따라서, ROS 소거 능력을 보다 면밀히 확인하기 위해, CLSM에 의한 형광 이미지 및 LSRFortessa에 의한 유세포 분석 데이터를 이용하여 세포 내 ROS 수준 측정을 통해 세포 수준에서 ROS 소거 능력을 평가하였다. 그 결과, 500μM H2O2와 함께 배양된 Hela 세포는 H2O2에 의해 유도된 밝은 녹색 형광을 나타냈다대조적으로, MTE로 전처리된 후 H2O2로 처리된 Hela 세포는 낮은 ROS 수준을 나타내는 바, MTE의 ROS 소거 능력을 확인할 수 있다. 또한, ROS를 생성하는 것으로 알려져 있는 Antimycin A를 처리한 Hela 세포의 경우 밝은 녹색 형광을 나타냈으나, MTE를 처리한 경우에는 ROS 수준이 현저히 감소하였다 (도 19a 및 c). 다음으로 유세포 분석을 수행한 결과, MTE가 세포에서 초과된 ROS를 효과적으로 제거할 수 있음을 확인하였는 바(도 19d 및 e), MTE는 염증과 같은 세포에 대한 과도한 ROS의 손상을 효과적으로 제거하고 치료 과정에서 부작용을 감소시킬 수 있음을 알 수 있다.
또한, MTT 분석으로 세포 생존력을 확인한 결과, MTE가 H2O2에 의해 유도된 세포 손상에서 농도 의존적으로 완화 효과가 있음을 확인하였다(도 19f). H2O2는 대식세포에서 상당한 수준의 TNF-α 생산을 유도하여 심각한 염증을 일으키는 것으로 알려져 있는 바, 상기 결과를 토대로 MTE가 항염증 효능을 갖고 있음을 알 수 있다.
본 발명에서는, 방향족인 광감작제(photosensitizer, PS)-에틸렌글리콜(ethylene glycol, EG) 접합체(PS-EG)와 EGCG 사이의 수소 결합, π-π 스태킹 및 소수성 상호 작용의 시너지 효과에 의해 PS-EG 및 EGCG를 기반으로 하는 나노 구조체를 성공적으로 개발했다. EGCG가 HSP 억제제일 수 있다는 개념 증명 연구로서, 상기 나노 구조체는 외부 자극에 의해 유도된 HSP70 및 HSP90의 과발현을 억제할 수 있는 바, 열 저항을 제거하여 외인성 열 에너지가 조합된 온열 치료 보조제로 이용할 수 있다.
한편, HSP에 대한 클라이언트 단백질인 Survivin은 억제되어 PDT의 세포자멸사에 대한 억제를 완화하여, 세포자멸사 경로를 통해 PDT 효율을 향상시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 나노 구조체는 안전하고 효과적인 PDT와 온열 LITT 보조제로 이용할 수 있다. 또한, 상기 나노 구조체는 우수한 ROS 소거 효과가 있어 광선 요법 과정에서 불가피한 가시광선에 의해 발생할 수 있는 부작용을 줄일 수 있을 뿐만 아니라 항염 효과가 있어 치료를 가속화할 수 있다. 본 발명의 나노 구조체는 종양의 내열성을 크게 줄이고 Survivin의 발현을 억제함으로써 부작용을 최소화하고 2-경로로 증강된 우수한 PDT 및 온열 LITT 보조제로서의 기능을 통합할 수 있다. 상기 결과는 다기능 나노플랫폼을 제작하기 위한 방안을 제공할 뿐만 아니라 효율적이고 독성이 낮은 광선 요법의 개발을 위한 새로운 대책을 제공하여 향후 임상 적용에 응용할 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (14)
- EGCG (epigallocatechin gallate) 및 광감작제(photosensitizer, PS)-에틸렌글리콜(ethylene glycol, EG) 접합체(PS-EG)를 포함하는, 나노 구조체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 광감작제는 포르피린계(porphyrins) 화합물, 클로린계(chlorins) 화합물, 박테리오클로린계(bacteriochlorins) 화합물, 프탈로시아닌계(phthalocyanines) 화합물, 나프탈로시아닌계 (naphthalocyanines) 화합물, 퍼퓨린계(purpurins) 화합물, 텍사피린계(texaphyrins) 화합물 및 5-아미노레불린 에스테르계(5-aminolevuline esters) 화합물로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 나노 구조체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 에틸렌글리콜은 디에틸렌글리콜(Di ethylene glycol) 내지 옥타에틸렌글리콜(Octa ethylene glycol)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 나노 구조체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 PS-EG 및 EGCG의 몰 비는 1:1 내지 1:5인 것인, 나노 구조체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 나노 구조체의 다분산 지수 (Poly Dispersity Inde, PdI)는 0.1 내지 0.5인 것인, 나노 구조체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 나노 구조체의 평균 입자 크기는 100 내지 300 nm인 것인, 나노 구조체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 EGCG는 상기 나노 구조체의 표면을 둘러싸도록 조립된 것인, 나노 구조체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 나노 구조체는 열충격단백질(heat shock protein, HSP)의 발현 또는 활성 억제능을 갖는 것인, 나노 구조체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 나노 구조체는 ROS (reactive oxygen species) 소거능을 갖는 것인, 나노 구조체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 나노 구조체는 세포자멸사(apoptosis)를 촉진하는 것인, 나노 구조체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 나노 구조체는 광역학적 치료, 광열 치료 또는 온열 치료의 효능을 증진시키는 것인, 나노 구조체.
- 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항의 나노 구조체를 포함하는, 광역학적 치료, 광열 치료 또는 온열 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항의 나노 구조체를 포함하는, 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 청구항 13에 있어서, 상기 암은 폐암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220057984A KR20230158342A (ko) | 2022-05-11 | 2022-05-11 | Egcg 및 광감작제-에틸렌글리콜 접합체를 포함하는 신규한 나노 구조체 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220057984A KR20230158342A (ko) | 2022-05-11 | 2022-05-11 | Egcg 및 광감작제-에틸렌글리콜 접합체를 포함하는 신규한 나노 구조체 및 이의 용도 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230158342A true KR20230158342A (ko) | 2023-11-20 |
Family
ID=88974144
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220057984A KR20230158342A (ko) | 2022-05-11 | 2022-05-11 | Egcg 및 광감작제-에틸렌글리콜 접합체를 포함하는 신규한 나노 구조체 및 이의 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20230158342A (ko) |
-
2022
- 2022-05-11 KR KR1020220057984A patent/KR20230158342A/ko not_active Application Discontinuation
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