KR20230156688A - 자폐 스펙트럼 장애 진단 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 대상체의 ASD를 진단하는 방법에 관한 것으로, a) 대상체로부터 샘플을 제공하는 단계; b) 상기 샘플에서 리비톨, 록소네이트, 에리스리톨, 리보스 및 요산염으로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 하나의 대사 마커의 수준을 측정하는 단계; 및 c) 적어도 하나의 대사 마커의 수준이 일반적으로 발달 중인 대조군과 비교하여 구체적으로 다른 경우 ASD로 진단하는 단계를 포함한다.

Description

자폐 스펙트럼 장애 진단
본 발명은 자폐 스펙트럼 장애(ASD)를 진단하는 방법 및 자폐 스펙트럼 장애의 진행을 모니터링하는 방법에 관한 것입니다.
지폐 스펙트럼 장애(autism spectrum disorder, ASD)는 가장 흔하고, 장애를 유발하는 신경 발달 장애 중 하나이다. ASD의 유병률은 현재 전 세계적으로 1%로 추정되며 미국에서는 학령기 아동 59명 중 1명(남아 37명 중 1명, 여아 151명 중 1명)이 ASD 진단을 받는다(Baio et al. Prevalence of Autism Spectrum Disorder Among Children Aged 8 Years - Autism and Developmental Disabilities Monitoring Network, 11 sites, United States, MMWR. Surveillance Summaries 67, no. 6: 1-23).
현재 ASD는 1) 사회적-정서적 상호성의 결함, 사회적 상호작용에 사용되는 비언어적 의사소통 행동의 결함, 관계의 발달, 유지 및 이해의 결함을 포함한 사회적 상호작용 및 의사소통의 결함; 2) 정형화되거나 반복적인 운동 동작, 동일성 고집 또는 일상에 대한 융통성 없는 고집, 매우 제한적이고 고정된 관심사, 감각 입력에 대한 과잉 또는 과민 반응, 환경의 감각적 측면에 대한 비정상적인 관심 등 제한적이거나 반복적인 행동의 하위 영역 4개 이상을 특징으로 하는 단일 진단 항목으로 간주된다(Baird G, et al. Neurodevelopmental disorders. American Psychiatric Association. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders-Fifth Edition (DSM-5). Washington, D.C.: American Psychiatric Publishing, 2013: p. 31-86).
핵심 증상의 초기 증상은 빠르면 9~12개월에 관찰될 수 있고(Roger SL et al. Autism treatment in the first year of life: a pilot study of infant start, a parent-implemented intervention for symptomatic infants.. J Autism Dev Disord. 2014;44(12):2981-95), 14 개월째부터 안정적인 진단을 내릴 수 있다(Pierce K et al. Evaluation of the Diagnostic Stability of the Early Autism Spectrum Disorder Phenotype in the General Population Starting at 12 Months: JAMA Pediatr. 2019;173(6):578-587).
그러나 핵심 증상은 사회적 요구가 제한된 능력을 초과할 때까지 완전히 드러나지 않거나 나중에 학습자의 전략에 의해 가려질 수 있다(Baird G. Classification of Diseases and the Neurodevelopmental Disorders: The Challenge for DSM-5 and ICD-11. Developmental Medicine & Child Neurology. 2013;55(3):200-201). ASD가 진단되려면 그 증상이 다른 사람, 특히 소아 환자의 경우 같은 또래의 사람들과 상호 작용하는 능력에 영향을 미치는 임상적으로 심각한 장애를 유발해야 한다. 즉, 고전적 진단을 사용하면 증상이 나타나기 시작해야만 의료적 개입이 가능하다.
ASD의 근본적인 원인은 파악하기 어렵기 때문에, 특정 유전적 특징(Bernier et al; Disruptive CHD8 mutations define a subtype of autism early in development ; Cell 2014 Jul 17; 158 (2): 263-276.) 또는 행동 및 임상 표현형(Eapen V. and Clarke R.A.; Autism Spectrum Disorders: From genotypes to phenotyes; Front Hum Neurosci. 2014;8:914)을 활용하여 ASD 환자를 더 작고 동질적인 하위 그룹으로 분류하려는 시도가 이루어지고 있다. 그러나 이러한 전략은 ASD의 유전적 및 표현형적 이질성을 포괄하는 데 어려움이 있으며 질병의 기저에 있는 특정 신경생물학적 경로를 식별하는 데 도움이 되지 않을 수 있다.
분자 단위의 분석은 ASD 환자를 분류하는 방법을 제공할 수 있다. 그러나 ASD의 본질적인 복잡성, 이질성, 유전적 및 환경적 인과 요인이 복잡하게 얽혀 있기 때문에 이러한 분석법을 확립하는 데 사용할 수 있는 ASD 특이적 바이오마커는 아직 밝혀지지 않았다. 또한, 이러한 바이오마커는 그 특이성 때문에 대규모의 ASD 환자 그룹을 포괄할 수 없다. 그러나 이러한 분석법은 단기간에 유전자형, 표현형 또는 치료 반응에 따라 미리 식별된 하위 그룹의 특성화를 지원할 수 있다.
이전에는 ASD 표현형 1(ASD phenotype 1)이라고 하는 특발성 자폐 스펙트럼 장애(idiopathic ASD)의 하위 집합을 식별하는 방법이 보고된 바 있다. 이 환자의 하위 집합은 임상 징후와 증상의 동시 발생에 따라 식별할 수 있다. 이러한 임상 징후 및 증상 외에도, PCT/EP2018/080372 및 PCT/EP2019/080450에 기술된 바와 같이, 설포라판(Nrf2 활성화제)을 ASD 환자 또는 환자 부모의 혈액에서 각각 추출한 림프모구 세포주(lymphblastoid cell lines, LCL)에 투여하여 ASD 표현형 1을 확인할 수 있고, 환자가 부정적인 행동 반응을 보이거나 Nrf2 활성화제를 투여한 후 환자의 세포에서 에너지 생산 감소가 나타나지 않으면 해당 환자를 ASD 표현형 1로 식별한다. 그러나 PCT/EP2018/080372에 설명된 방법은 생체 내 특성으로 인해 임상 개발이 크게 제한된다. PCT/EP2019/080450에 기술된 방법의 경우, 환자 혈액에서 LCL을 생성한 후 체외에서 테스트하는 절차가 길고 복잡하여 임상 적용 가능성이 제한된다. 혈액, 소변 또는 혈장과 같이 최소한의 기술적 준비가 필요한 생체 샘플과 같이 환자의 미가공 생체 샘플에 대해 수행되는 실험실 테스트는 당업자에게 알려진 생체 내 및 체외 테스트 방법의 한계를 우회하는 데 큰 이점이 될 수 있다 .
신체 검체(예: 혈장, 혈청, 소변)의 대사산물 분석은 최근 ASD를 포함한 여러 복잡한 장애의 병원성 메커니즘을 규명하는 데 활용되고 있다(Kuwabara, H. et al. Altered metabolites in the plasma of autism spectrum disorder: a capacillary electrophoresis time-of-flight mass spectroscopy study. PloS One 8, e73814 (2013); West, P. R. et al. metabolomics as a tool for discovery of biomarkers of autism spectrum disorder in the blood plasma of children. PloS One 9, e112445 (2014); Wang, H. et al. Potential serum biomarkers from a metabolomics study of autism. J. Psychiatry Neurosci. JPN 41, 27-37 (2016); Delaye, J.-B. et al. Post hoc analysis of plasma amino acid profiles: towards a specific pattern in autism spectrum disorder and intellectual disability. Ann. Clin. Biochem. 55, 543-552 (2018); Rangel-Huerta, O. D. et al. Metabolic profiling in children with autism spectrum disorder with and without mental regression: preliminary results from a cross-sectional case-control study. Metabolomics Off. J. Metabolomic Soc. 15, 99 (2019); Orozco, J. S., Herz-Picciotto, I., Abbeduto, L. & Slupsky, C. M. Metabolomics analysis of children with autism, idiopathic-developmental delays, and Down syndrome. Transl. Psychiatry 9, 243 (2019); Smith, A. M. et al. A Metabolomics Approach to Screening for Autism Risk in the Children's Autism Metabolome Project. Autism Res. Off. J. Int. Soc. Autism Res. (2020); Yang, J. et al. Assessing the Casual effects of Human Serum Metabolites on 5 Major Psychiatric Disorders. Schizophr. Bull. 46, 804-813 (2020)). 또한, 소변의 대사 분석은 최근 ASD에 대한 약물 치료의 효능을 모니터링하는 데 활용되고 있다(Bent, S. et al. Identification of urinary metabolites that correlate with clinical improvements in children with autism treated with sulforaphane from broccoli. Mol. Autism 9, 35 (2018)). 이와 관련하여 몇몇 그룹은 4-에틸페닐설페이트, 인돌피루베이트, 글리콜레이트 또는 이미다졸 프로프레이트와 같은 특정 대사물질(Hsaio et al., US20140065132A1), 분자량이 약 10달톤에서 약 1500달톤인 복수의 대사산물(Gebrin Cezar et al. EP2564194A1), 12-HETE, 15-HETE 및 스핑고신/콜린(Srivastava et al. US20170067884A1)과 같은 대사산물의 측정을 기반으로 ASD 진단을 개선하거나 조기 진단을 제공하는 방법을 제안했다. 탄수화물 대사 효소 단백질의 발현(Lipkin et al. US20120207726A1) 또는 Gc 글로불린 단백질의 발현(Horning et al. W020133130953A2)과 같은 다른 제안된 방법은 발현의 차이를 감지한다.
따라서 ASD 하위 그룹의 근본적인 분자 기능 장애를 해결하는 표적 약제 개입의 혜택을 받을 수 있는 ASD 환자를 진단하고 분류하는 효율적이고 쉬운 실험실 방법이 필요하다.
해결해야 할 과제는 ASD, 특히 ASD 환자의 특정 하위 그룹, 즉 ASD 표현형 1을 효율적으로 식별하고 진단할 수 있는 수단을 제공하는 것이다.
해결해야 할 또 다른 과제는 이 하위 그룹의 환자에 특이적인 생물학 마커를 사용하여 질병 중증도, 질병 중증도 개선 또는 약리학적 또는 치료적 치료 효능을 효율적으로 모니터링하는 것이다.
상기 과제는,
a) 대상체에서 샘플 마련하는 단계;
b) 상기 샘플에서 리비톨, 록소네이트, 에리스리톨, 리보스 및 요산염으로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 하나의 대사 마커의 수준(level)을 측정하는 단계; 및
c) 상기 단계 b)에서 측정된 적어도 하나의 대사 마커의 수치가 일반적으로 발달 중인 대조군과 비교하여 구체적으로 다른 경우 자폐 스펙트럼 장애(autism spectrum disorder, ASD)로 진단하는 단계;
를 포함하는, 대상체의 ASD 진단 방법으로 해결된다.
상기 과제는 또한,
a) 대상체에서 샘플을 마련하는 단계;
b) 상기 샘플에서 리비톨/크레아티닌, 리비톨/1,5-안하이드로글루시톨, 리비톨/데옥시카르니틴, 요산염/N-아세틸카르노신, 에리스리톨/1,5-안하이드로글루시톨 및 에리스리톨/N-아세틸카르노신으로 구성된 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 대사산물 비율을 측정하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계에서 측정한 적어도 하나의 대사산물 비율이 일반적으로 발달 중인 대조군과 비교하여 증가한 경우 자폐 스펙트럼 장애(ASD)로 진단하는 단계;
를 포함하는, 대상체의 ASD 진단 방법으로 해결된다.
상기 과제는 또한, a) t0 시점에 환자로부터 첫 번째 샘플을 채취하는 단계;
b) 상기 첫 번째 샘플에서 리비톨, 록소네이트, 에리스리톨, 리보스 및 요산염으로 구성된 그룹에서 선택한 적어도 하나의 대사 마커의 수준을 측정하는 단계;
c) t1 시점에 환자로부터 두 번째 샘플을 채취하는 단계;
d) 단계 b)에서와 동일한 대사 마커의 수준을 측정한다; 및
e) 단계 b)에서 얻은 수준과 d) 단계에서 얻은 수준을 비교하여 환자에게 ASD가 진행되었는지 여부를 결정하는 단계;
를 포함하는, ASD를 앓고 있는 환자의 ASD 진행을 모니터링하는 방법으로 해결된다.
상기 과제는 또한,
a) 환자로부터 첫 번째 샘플 s0를 마련하는 단계;
b) 상기 첫 번째 샘플에서 리비톨/크레아티닌, 리비톨/1,5-안드로글루시톨, 리비톨/데옥시카르니틴, 요산염/N-아세틸카르노신, 에리스리톨/1,5-안드로글루시톨 및 에리스리톨/N-아세틸카르노신으로 구성된 그룹에서 선택한 적어도 하나의 대사산물 비율을 측정하는 단계;
c) 환자로부터 두 번째 샘플 s1을 마련하는 단계;
d) 상기 제2 샘플에서 단계 b)에서와 같이 리비톨/크레아티닌, 리비톨/1,5-안드로글루시톨, 리비톨/데옥시카르니틴, 요산염/N- 아세틸카르노신, 에리스리톨/1,5-안드로글루시톨 및 에리스리톨/N- 아세틸카르노신으로 구성된 그룹으로부터 선택된 동일한 대사산물 비율을 측정하는 단계; 및
e) 단계 b)에서 측정한 비율과 단계 d)에서 얻은 비율을 비교하여 환자의 ASD가 진행되었는지 여부를 결정하는 단계;
를 포함하는, ASD를 앓고 있는 환자의 ASD 진행 모니터링 방법으로 해결된다.
상기 과제는 또한,
a) 치료 적용 전과 후에 얻은 환자의 샘플을 마련하는 단계; 및
b) 단계 a)의 샘플에서 리비톨/크레아티닌, 리피톨/1,5-안드로글루시톨, 리비톨/데옥시카르니틴, 요산염/N-아세틸카르노신, 에리스리톨/1,5-안드로글루시톨 및 에리스리톨/N-아세틸카르노신으로 구성된 그룹에서 선택한 적어도 하나의 대사산물 비율을 측정하는 단계;
를 포함하는, ASD 환자에게서 ASD 치료의 효율을 결정하는 방법으로 해결된다.
도 1은 ASD 표현형 1의 혈장 샘플에서 TD 개인과 비교하여 구체적으로 다른 것으로 밝혀진 대사산물의 수준을 그래픽으로 표현한 것이다. 데이터는 개별 값(평균 ±표준편차)으로 표시된다. 1,5-AG: 1,5-안하이드로글루시톨; NAC: N-아세틸카르노신. TD의 경우 N = 5, ASD-Phen1의 경우 N = 10.
도 2는 선택된 대사산물의 비율을 그래픽으로 표현한 것이다. 데이터는 개별 값(평균 ± 표준편차)으로 표시된다. 1,5-AG: 1,5-안하이드로글루시톨; NAC: N-아세틸카르노신. TD의 경우 N = 5, ASD-Phen1의 경우 N = 10.
도 3은 주성분 분석(PCA)의 차원 1과 차원 2의 바이플롯 표현이다. 데이터는 개별 데이터 포인트(평균 ±표준편차)로 표시된다. TD의 경우 N = 5, ASD-Phen1의 경우 N = 10.
도 4는 a) 리비톨/크레아티닌 비율과 ABC 과민성 하위 척도 간의 상관관계를 그래픽으로 나타낸 것이다. N = ASD 표현형 1 환자 10명. b) 리비톨/크레아티닌 비율과 ABC 과잉행동 하위 척도 간의 상관관계를 그래픽으로 표현한 것이다. N = ASD 표현형 1 환자 10명.
도 5는 a) 리비톨/1,5-안하이드로글루시톨(1,5-AG) 비율과 ABC 고정관념 하위 척도 간의 상관관계를 그래픽으로 나타낸 것이다. N = ASD 표현형 1 환자 10명. b) 리비톨/1,5-안하이드로글루시톨(1,5-AG) 비율과 ABC 과잉행동 하위 척도 간의 상관관계를 그래픽으로 나타낸 것이다. N = ASD 표현형 1 환자 10명.
첫 번째 측면에서, 본 발명은
a) 대상체에서 샘플을 마련하는 단계;
b) 상기 샘플에서 리비톨, 록소네이트, 에리스리톨, 리보스 및 요산염으로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 하나의 대사 마커의 수준(level)을 측정하는 단계; 및
c) 상기 단계 b)에서 측정된 적어도 하나의 대사 마커의 수치가 일반적으로 발달 중인 대조군과 비교하여 구체적으로 다른 경우 자폐 스펙트럼 장애(autism spectrum disorder, ASD)로 진단하는 단계;
를 포함하는, 대상체의 ASD 진단 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 자폐 스펙트럼 장애(ASD)라는 용어는 사회적 의사소통 및 상호작용의 결함과 행동, 관심사 또는 활동의 제한적이고 반복적인 패턴을 특징으로 하는 신경 발달 장애 계열을 포괄하는 것으로 이해된다.
"자폐 스펙트럼 장애(ASD) 환자"라는 용어는 공식적인 ASD 진단을 받은 환자를 의미한다. 본 명세서에서 "대상체"라는 용어는 ASD가 의심되는 사람, 즉 ASD의 행동 특성을 보이고 ASD의 임상 징후를 보이지만 아직 공식적인 진단 검증을 받지 않은 대상체를 지칭한다.
당업자는 대상체가 ASD, 특히 특발성 ASD로 진단되는 방법을 잘 알고 있다. 예를 들어, 당업자는 "American Psychiatric Association; Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders(DSM-5) Fifth edition"에 설정된 기준을 따라 대상체에게 ASD 진단을 내릴 수 있다. 마찬가지로, ASD 환자는 DSM-IV, ICD-9, ICD-10, DISCO, ADI-R, ADOS, CHAT 등을 포함하되 이에 국한되지 않는 표준화된 평가 도구에 따라 진단을 받았을 수 있다. 다른 경우에는 ASD 또는 달리 명시되지 않은 전반적 발달 장애(pervasive developmental disorder not otherwise specified, PDD-NOS)로 잘 정립된 DSM-IV 진단을 받았을 수도 있다.
여기서 '일반적으로 발달 중인 대조군(TD)'이라는 용어는 ASD 진단을 받지 않았거나 ASD의 임상적 징후 및 증상을 보이지 않는 대상체를 의미한다.
본 발명에 따른 방법은 ASD, 특히 ASD 표현형 1을 진단하기 위해 대상체로부터 확보한 샘플에 대해 수행되는 실험실 테스트를 처음으로 제공한다. 당업자에 알려진 평가 도구와 달리, 본 발명의 방법은 평가 중에 환자가 입회할 필요 없이 환자의 샘플에 대해 수행될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 의사의 입회가 필요하지 않고 실험실 조교가 자동화된 방식으로 수행할 수 있다. 이는 비용을 절감할 뿐만 아니라 진단의 신뢰성을 향상시킨다.
본 발명의 방법은 대상체 또는 환자로부터 샘플을 마련하는 단계를 포함한다. 샘플은 혈액, 타액, 소변, 대변 또는 뇌척수액과 같은 임의의 적절한 생물학적 샘플일 수 있다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 샘플은 쉽게 얻을 수 있고 수술이 필요하지 않으므로 어느 정도의 사회적 장애를 나타낼 가능성이 있는 대상체를 대상으로 작업할 때 특히 유리하다.
바람직한 실시예에서, 샘플은 혈장 샘플 또는 혈청 샘플과 같은 혈액 샘플이다. 당업자는 대상체의 혈액으로부터 혈장을 분리할 수 있는 방법을 알고 있다. 혈액 샘플은 말초 혈액 또는 개별 화합물 또는 소변 또는 뇌척수액의 정제 또는 분리와 같이 처리된 전혈 샘플(whole-blood sample)일 수 있다.
샘플은 후속 단계를 용이하게 하기 위해 정제 또는 제조될 수 있다. 특히, 샘플은 단백질을 제거하거나 다른 방식으로 정제하여 제조할 수 있다. 제조 후 샘플은 즉시 처리하거나 추가 분석이 이루어질 때까지 -70°C에서 보관할 수 있다.
본 발명의 방법은 상기 샘플에서 리비톨(ribitol), 록소네이트(lyxonate), 에리스리톨(erythritol), 리보스(ribose) 및 요산염(urate)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 대사산물 마커(metabolite marker)의 수준(level)을 측정하는 단계를 더 포함한다.
아도니톨(adonitol)이라고도 불리는 리비톨(인간 대사체 데이터베이스(human metabolome database, HMDB) 식별 번호: HMDB0002917, HMDB0000508, HMDB0001851, HMDB0000568)은 리보스가 환원되어 형성되며 하기 화학식 (I)의 구조를 가진 결정성 펜토오스 알코올(C5H12O5)이다:
화학식 (I)
2,3,4,5-테트라하이드록시펜타노산이라고도 하는 릭소네이트는 하기 화학식 (II)의 구조를 가지고 있다.
화학식 (II)
(2R,3S)-부탄-1,2,3,4-테트롤(C4H10O4)로도 불리는 에리스리톨(HMDB 식별 번호: HMDB0002994)은 당 알코올류에 속하며 하기 화학식 (III)의 구조를 가지고 있다:
화학식 (III)
일반적으로 단순히 리보스라고 부르거나 D-리보푸라노사이드 또는 (3R,4S,5R)-5-(히드록시메틸)옥소란-2,3,4-트리올(C5H10O5)로 불리는 D-리보스(HMDB 식별 번호: HMDB0000283)는 5탄당으로 펜토오스 계열에 속하는 당류이다. 화학식 (IV)의 구조를 가지고 있다:
화학식 (IV)
요산염(HMBD 식별 번호: HMDB0000289)은 요산 또는 2,3,6,7,8,9-헥사하이드로-1H-퓨린-2,6,8-트리온(C5H4N4O3)이라고도 하며, 퓨린 부분(moiety)의 탄소 2와 6에 케톤기가 접합된 크산틴 계열의 퓨린 유도체이다. 화학식 (V)의 구조를 가지고 있다:
화학식(V)
당업자는 샘플에서 대사산물 마커의 수준을 평가하는 방법을 잘 알고 있다.
샘플에서 대사 산물의 수준을 검출하는 것은 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법과 같이 당업자에게 알려진 모든 방법으로 수행될 수 있습니다(Wamelink M.M.C et al. Quantification of sugar phosphate intermediates of the pentose phosphate pathway by LC-MS/MS: application to two new inherited defects of metabolism, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 823(1):18-25 (2005)). 다른 방법으로는 비색 분석법(Novello F. et al. The pentose phosphate pathway of glucose metabolism. Measurement of the non-oxidative reactions of the cycle, Biochem J. 107(6):775-91 (1968)), 14C-표지된 기질을 사용한 크로마토그래피(Becker M.A. Patterns of phosphoribosylpyrophosphate and ribose-5-phosphate concentration and generation in fibroblasts from patients with gout and purine overproduction, J Clin Invest. 57(2):308-18 (1976)), 질량 분석과 결합된 모세관 전기영동(Soga T. Capillary electrophoresis-mass spectrometry for metabolomics, Methods Mol Biol 358:129-3 (2007)), 질량 분석과 결합된 기체 크로마토그래피(Koek M.M. et al. Microbial metabolomics with gas chromatography/mass spectrometry, Analytical Chemistry, 15;78(4):1272-81 (2006)) 또는 핵자기공명(Ardenkjaer-Larsen J.H. et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. PNAS 100(18):10158-63 (2003))이 있다.
바람직한 실시예에서, 양이온 모드 전기 분무 이온화(ESI)를 사용하는 역상/초고성능 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법 또는 음이온 모드 ESI를 사용하는 역상/초고성능 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법이 사용된다.
일 실시예에서, 각 대사산물에 해당하는 피크의 식별은 체류 시간/지수(RI), 질량 대 전하비(m/z) 및 크로마토그래피 데이터(MS/MS 스펙트럼 데이터 포함)를 기반으로 한다. 획득한 패턴을 기존 인증 표준 라이브러리와 비교하여 대사산물의 신원을 확인한다. 보존 지수가 제안된 식별의 좁은 RI 창 내에 있고, 라이브러리와의 정확한 질량 일치 +/- 10 입자/백만, 실험 데이터와 인증 표준 간의 MS/MS 순방향 및 역방향 점수가 일치하면 대사 산물의 동일성이 확인됩니다. 각 대사 산물은 이러한 방법에서 특정 피크가 특징이며 대사 산물의 수준은 이러한 피크의 곡선 아래 면적에 해당한다.
본 발명에 따른 방법의 단계 c)에서, 적어도 하나의 대사 마커의 수준은 일반적으로 발달 중인 대조군의 샘플에서 동일한 대사 마커의 수준과 비교되고, 대상체의 대사 마커의 수준이 일반적으로 발달 중인 대조군의 수준과 구체적으로 다른 경우 ASD를 진단한다.
일반적으로 발달 중인 대조군의 샘플은 특정 개인의 샘플 또는 여러 다른 개인으로부터 채취한 여러 샘플의 풀(pool)일 수 있다. 일반적으로 발달 중인 대조군은 대상체와 연령 및 성별이 일치하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면, “구체적으로 다르다”는 것은 대사 마커가 리비톨, 록소네이트, 에리스리톨 또는 리보스인 경우, 대상체의 샘플 내 수준이 일반적으로 발달 중인 대조군보다 높고, 대사 마커가 요산염인 경우, 대상체의 샘플 내 수준이 일반적으로 발달 중인 대조군보다 낮다는 것을 의미한다.
일 실시예에서, "더 높다"는 것은 적어도 15%의 증가를 의미하고, "더 낮다"는 것은 적어도 15%의 감소를 의미한다.
두 번째 측면에서, 본 발명은
a) 대상체에서 샘플을 마련하는 단계;
b) 상기 샘플에서 리비톨/크레아티닌, 리비톨/1,5-안하이드로글루시톨, 리비톨/데옥시카르니틴, 요산염/N-아세틸카르노신, 에리스리톨/1,5-안하이드로글루시톨 및 에리스리톨/N-아세틸카르노신으로 구성된 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 대사산물 비율을 측정하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계에서 측정한 적어도 하나의 대사산물 비율이 일반적으로 발달 중인 대조군과 비교하여 증가한 경우 자폐 스펙트럼 장애(ASD)로 진단하는 단계;
를 포함하는, 대상체의 ASD 진단 방법에 관한 것이다.
적어도 하나 이상의 대사산물 비율을 측정하는 단계에서는 첫 번째 및 두 번째 대사산물의 수치를 측정한 다음 선택적으로 동일한 단위로 변환한다. 마지막으로, 첫 번째 수준을 두 번째 수준으로 나누어 수준 간의 비율을 얻는다.
본 발명에 따르면, 적어도 하나의 대사산물 비율은 리비톨/크레아티닌, 리비톨/1,5-안하이드로글루시톨, 리비톨/데옥시카르니틴, 요산염/N-아세틸카르노신, 에리스리톨/1,5-안하이드로글루시톨 및 에리스리톨/N-아세틸카르노신으로 구성된 그룹 중에서 선택된다.
크레아틴 무수물 또는 2-이미노-1-메틸이미다졸리딘-4-원(C4H7N3O)이라고도 하는 크레아티닌(HMDB 식별 번호: HMDB0000562)은 알파 아미노산 및 유도체에 속하며 크레아틴 인산염의 분해 산물이고, 하기 화학식 (VI)의 구조를 가지고 있다:
화학식 (VI)
1,5-안하이드로글루시톨 또는 1,5-안하이드로소르비톨(HMDB 식별 번호: HMDB0002712)은 (2R,3S,4R,5S)-2-(히드록시메틸)옥산-3,4,5-트리올(C6H12O5)이라고도 하며 단당류의 종류에 속하고, 하기 화학식 (VII)의 구조를 가지고 있다:
화학식 (VII)
3-디하이드록시카르니틴 또는 4-트리메틸암모늄부탄산 또는 감마-부티로베타인 또는 4-(트리메틸아자니우닐)부탄산염(C7H15NO2)이라고도 하는 데옥시카르니틴(HMBD 식별 번호: HMDB0001161)은 직쇄 지방산 계열에 속하고, 하기 화학식 (VIII)의 구조를 가지고 있다:
화학식 (VIII)
(2R)-2-(3-아세트아미도프로판아미도)-3-(3H-이미다졸-4-일)프로판산(C11H16N4O4)이라고도 하는 N-아세틸카르노신(HMDB 식별 번호: HMDB0012881)은 하이브리드 펩타이드로 알려진 유기 화합물 부류에 속하고, 하기 화학식 (IX)의 구조를 가지고 있다:
화학식(IX)
본 발명자들은 놀랍게도 리비톨/크레아티닌, 리비톨/1,5-안하이드로글루시톨, 리비톨/데옥시카르니틴, 요산염/N-아세틸카르노신, 에리스리톨/1,5-안드로글루시톨 및 에리스리톨/N-아세틸카르노신 대사 비율의 증가가 ASD 진단과 관련이 있다는 사실을 발견하였다.
메커니즘에 얽매이고 싶지 않지만, ASD 환자의 하위 유형(subtype)은 펜토오스 인산염 경로의 활성 증가를 경험한다고 믿어진다. 이는 WO2020094748 A1에 자세히 설명되어 있다. 결과적으로, 이러한 환자들은 이 경로와 관련된 대사산물, 즉 리비톨, 릭소네이트, 에리스리톨, D-리보스 및 요산염 수치가 증가될 것으로 예상된다. 이와는 대조적으로 크레아티닌, 1,5-안하이드로글루시톨, 데옥시카르니틴 또는 N-아세틸카르노신 수치는 이러한 환자에서 증가하지 않거나 심지어 다른 NDD 환자 집단에서 관찰된 것처럼 감소할 것으로 예상된다 (Neul, J. L. et al. Metabolic Signatures Differentiate Rett Syndrome From Unaffected Siblings. Front. Integr. Neurosci. 14, 7 (2020)). 따라서 리비톨/크레아티닌, 리비톨/1,5-안하이드로글루시톨, 리비톨/데옥시카르니틴, 요산염/N-아세틸카르노신, 에리스리톨/1,5-안드로글루시톨 및 에리스리톨/N-아세틸카르노신 비율은 일반적으로 발달 중인 개인(typically developing individuals)에 비해 ASD 환자에서 더 높을 것으로 예상된다.
일 실시예에서, 적어도 하나의 대사산물 비율의 증가는 일반적으로 발달 중인 대조군에서 각각의 대사산물 비율에 비해 적어도 15%, 바람직하게는 30%, 가장 바람직하게는 50% 증가한다.
일 실시예에서, 2개, 바람직하게는 4개, 가장 바람직하게는 6개의 대사산물 비율이 측정된다. 더 많은 대사산물 비율이 측정될수록 진단의 신뢰도가 높아진다.
둘 이상의 대사산물 비율이 측정되는 경우, 샘플에서 측정된 대사산물 비율의 평균값을 계산하고 이를 일반적으로 발달 중인 대조군에서 측정된 각 대사산물 비율의 평균값과 비교하여 대사산물 비율의 증가를 측정한다. 일 실시예에서, 이러한 증가가 일반적으로 발달 중인 대조군에서 측정된 각 대사산물 비율의 평균값의 적어도 15%, 바람직하게는 30%, 가장 바람직하게는 50% 이상인 경우 ASD가 진단된다.
일 실시예에서, 대상체는 ASD 표현형 1이라고 하는 ASD의 하위 유형(subtype)으로 추가 진단된다. ASD 표현형 1로 진단되는 대상체는 이전에 특발성 ASD로 진단된 적이 있을 수 있다. 이하 "특발성 자폐 스펙트럼 장애", "특발성 자폐증" 및 "특발성 ASD"라는 용어를 상호 교환적으로 사용한다. 마찬가지로 "ASD 표현형 1", "표현형 1" 및 "ASD-Phen1"이라는 용어는 같은 의미로 사용된다.
ASD 증상을 보이는 환자의 15~20%에서만 유전적 요인을 확인할 수 있다. 따라서 대다수의 ASD 환자에게 적용되는 '특발성 ASD'이라는 진단은 실제로는 다양한 원인에 따라 분자적, 유전적 차이가 큰 신경발달 장애를 포괄하는 행동학적 용어이다.
과학계에서는 이러한 접근 방식을 표적 치료가 가능한 환자 분류로 대체해야 한다는 인식이 확산되고 있다. 그러나 최근 새로운 유전자 스크리닝 방법의 개발로 ASD의 가능성을 높일 수 있는 흔한 유전적 변이와 희귀 유전적 변이를 포함한 수백 가지의 유전적 위험 요인을 감지할 수 있게 되었지만(Ronemus M. et al; The role of the novo mutations in the genetics of autism spectrum disorders; Nat Rev Genet. 2014 Feb; 15(2): 133-41), 이러한 개별 위험 요인 중 어느 것도 그 자체로는 ASD를 명확하게 진단할 수 있을 만큼 충분히 중요하지 않다.
그러나, 계속 늘어나는 ASD 민감성 유전자가 제한된 수의 분자 경로로 수렴한다는 가설이 제기되고 있다. 이러한 경로를 확인하면 진단과 치료 모두에 흥미로운 기회를 제공할 수 있으며, 증상에 기반하지 않고, 실제 분자 및 유전적 원인에 기반하고 표적화할 수 있다.
특발성 ASD의 포괄적인 정의와 달리, ASD 표현형 1 환자는 스트레스에 대한 적응, 세포 사멸 또는 세포 분화, 세포 증식, 세포 주기 진행, 세포 분열 및 분화에 관여하는 경로(특히 PI3K, AKT, mTOR, MAPK, ERK/JNK-P38에 한정되지 않음)의 상향 조절이 특징인 분자 및 유전적으로 정의된 ASD 환자 하위 집합을 나타낸다. 이러한 환자의 뇌에서는 건강한 대조군 환자에 비해 전염증성(proinflammatory) 사이토카인(TNF-α, IL-6, IL-1βIL-17A, IL-22 및 GM-CSF), Th1 사이토카인(INF-γ및 케모카인(IL-8)도 유의하게 증가할 수 있다.
ASD 표현형 1형 환자는 다음과 같은 추가 특징이 있을 수 있다:
· 다음 두 가지 필수 임상 징후 및 증상 중 하나 이상의 존재:
o 생후 첫 24개월 동안 평균 머리둘레(HC)보다 최소 1 표준편차 이상 큰 대조군 대비 머리 크기 확대 및/또는 공식적인 거대 두부외반증(일반 인구의 97% 초과의 머리 둘레); 및/또는
o 감염성 사건, 탈락성 치아 손실, 외상 후 부상, 내인성 및 외인성 온도 변화에 의해 강화된 핵심 증상의 주기적 악화.
및
· 다음 20가지 특성 중 2개 이상, 가장 바람직하게는 3개 이상의 특성이 존재한다:
o 대조군 대비 모발 및 손발톱 성장 속도 가속화
o 같은 인종에 비해 피부와 눈의 색이 더 밝은 경향의 증가
o 같은 인종의 대조군 대상체보다 훨씬 더 긴 속눈썹.
o 특히 환자의 등에 나타나는 저색소성 피부의 5개 이상의 비접촉 부위
o 감염, 치아 상실, 외상 후 부상, 체온을 조절하는 내인성 및 외인성 요인으로 인한 부종의 징후, 특히 눈 주위와 이마 부위에 위치하는 안면 부종
o 같은 인종의 일반적인 발달 중인 개인에 비해 증가된 감마-글루타밀 트랜스펩티다제(GGT)의 혈중 농도.
o 선천성 비뇨생식기 기형 및/또는 배뇨를 시작할 수 있는 기능 장애
o 슬개골 저형성증
o 특히 5세 이전에 잦은 설사를 하는 경우
o 잦은 이명
o 뇌량의 얇아짐 또는 부재
o 특히 골수종 및 급성 골수성 백혈병에 국한되지 않는 혈액 악성 종양에 대한 양성 가족력
o 2세대 연속으로 최소 2명의 1촌 친척이 류마티스 관절염에 걸린, 류마티스 관절염에 대한 양성 가족력
o 아세틸살리실산 또는 그 유도체에 대한 부작용
o 단측성 또는 양측성 홍채 결장종
o 특히 영아, 유아 및 어린이의 수면 다한증(특히 유아기 및 아동기에 밤에 땀을 많이 흘리며 침대 시트를 교체해야 한다고 친척들이 종종 보고함)
o Th1/Th2 비율 증가(즉, 인터루킨 1 베타, 인터루킨 6, TNF-알파, 인터페론 감마 수치 상승)
o 선천성 부수(accessory) 또는 중복 비장
o 선천성 유미조(cisterna chyli)의 부재
o 치아 성장 지연
o 임신 중 산모가 바이러스 또는 박테리아 감염을 앓은 병력이 있고/있거나 임신 중 산모의 면역 활성화가 생물학적으로 확인된 경우가 보고된 이력
ASD 표현형 1형 환자는 공통된 분자 병리를 공유하기 때문에, 환자를 ASD 표현형 1형으로 식별하면 행동 증상만 치료하는 것이 아니라 근본적인 유전적 원인을 표적으로 하는 적절한 치료법을 선택할 수 있다. ASD 표현형 1 환자에 특화된 치료법은 이전에 설명된 바 있다(EP 3498297 A1). 따라서 본 발명의 방법은 이러한 특정 치료의 혜택을 받을 수 있는 환자를 선별할 수 있다.
세 번째 측면에서, 본 발명은
a) t0 시점에 환자로부터 첫 번째 샘플을 채취하는 단계;
b) 상기 첫 번째 샘플에서 리비톨, 록소네이트, 에리스리톨, 리보스 및 요산염으로 구성된 그룹에서 선택한 적어도 하나의 대사 마커의 수준을 측정하는 단계;
c) t1 시점에 환자로부터 두 번째 샘플을 채취하는 단계;
d) 단계 b)에서와 동일한 대사 마커의 수준을 측정한다; 및
e) 단계 b)에서 얻은 수준과 d) 단계에서 얻은 수준을 비교하여 환자에게 ASD가 진행되었는지 여부를 결정하는 단계;
를 포함하는, ASD를 앓고 있는 환자의 ASD 진행을 모니터링하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 두 개의 서로 다른 샘플, 즉 첫 번째 샘플(s0)과 두 번째 샘플(s1)에서 대사산물 마커의 수준을 측정하는 것으로 구성된다. 바람직하게는, 첫 번째 샘플과 두 번째 샘플은 동일한 종류의 샘플, 즉 둘 다 혈장 샘플과 같은 혈액 샘플이거나 둘 다 소변 샘플인 것이 좋다.
본 발명에 따르면, 첫 번째 샘플은 시점 t0에서 획득되고 두 번째 샘플은 이후 시점 t1에서 획득된다. t0와 t1 사이에 서로 다른 이벤트가 발생할 수 있다. 예를 들어, 환자는 의료 개입을 받을 수 있다.
여기서 의료 개입은 건강을 개선하고 질병을 치료할 목적으로 개인에게 지시되거나 수행되는 활동으로 정의된다. 의학적 개입의 예로는 약물 또는 약물 조합 투여, 유전자 치료 또는 행동 요법 적용 등이 있다.
t0과 t1 사이에 의료 개입이 이루어지는 경우, 이 방법은 치료가 환자에게 효과적인지 여부를 판단하는 데 적합하다. t0과 t1 사이에 일정 시간(예: 1개월, 3개월, 6개월 또는 1년)이 경과하도록 t1을 선택할 수도 있다. 이 경우 이 방법은 일정 기간 동안 질병 진행을 모니터링하는 데 유용하다.
단계 e)에서, 샘플 s0 및 s1에 대해 얻어진 적어도 하나의 대사산물 마커의 수준이 서로 비교된다. 일 실시예에서, 적어도 하나의 대사 마커가 리비톨, 록소네이트, 에리스리톨 또는 리보스인 경우, 제 2 샘플의 수준이 제 1 샘플의 수준보다 높은 경우, 또는 적어도 하나의 대사 마커가 요산염인 경우, 제 2 샘플의 수준이 제 1 샘플의 수준보다 낮은 경우에, 환자에서 ASD가 진행된 것으로 결정된다.
네 번째 측면에서, 본 발명은 a) 환자로부터 첫 번째 샘플 s0를 마련하는 단계;
b) 상기 첫 번째 샘플에서 리비톨/크레아티닌, 리비톨/1,5-안드로글루시톨, 리비톨/데옥시카르니틴, 요산염/N-아세틸카르노신, 에리스리톨/1,5-안드로글루시톨 및 에리스리톨/N-아세틸카르노신으로 구성된 그룹에서 선택한 적어도 하나의 대사산물 비율을 측정하는 단계;
c) 환자로부터 두 번째 샘플 s1을 마련하는 단계;
d) 상기 제2 샘플에서 단계 b)에서와 같이 리비톨/크레아티닌, 리비톨/1,5-안드로글루시톨, 리비톨/데옥시카르니틴, 요산염/N- 아세틸카르노신, 에리스리톨/1,5-안드로글루시톨 및 에리스리톨/N- 아세틸카르노신으로 구성된 그룹으로부터 선택된 동일한 대사산물 비율을 측정하는 단계; 및
e) 단계 b)에서 측정한 비율과 단계 d)에서 얻은 비율을 비교하여 환자의 ASD가 진행되었는지 여부를 결정하는 단계;
를 포함하는, ASD를 앓고 있는 환자의 ASD 진행 모니터링 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 제 1 샘플(s0)은 시점 t0에서 획득되고, 제 2 샘플(s1)은 이후 시점 t1에서 획득된다. 시점 t0와 시점 t1 사이에서, 다른 이벤트가 발생할 수 있다. 예를 들어, 환자는 의료 개입을 받을 수 있다.
환자가 t0과 t1 사이에 의료 개입을 받은 경우 이 방법은 환자에게 치료가 효과적인지 여부를 판단하는 데 적합하다. t1 또한 t0와 t1 사이에 일정 시간(예: 1개월, 3개월, 6개월 또는 1년)이 경과하도록 선택할 수 있다. 이 경우 상기 방법은 일정 기간 동안 환자의 질병 진행을 모니터링하는 데 유용하다.
방법의 단계 e)에서, 샘플(0 ) 및 샘플(1 )에 대해 얻어진 적어도 하나의 대사산물 비율은 서로 비교된다. 일 실시예에서, 제 2 샘플에서 측정된 비율이 제 1 샘플에서 측정된 해당 비율보다 높은 경우, 환자에서 ASD가 진행된 것으로 결정된다.
일 실시예에서, 각 샘플에 대한 2, 4 또는 6개의 비율이 측정되고, 각 샘플에 대해 이러한 비율의 평균값이 계산된다. 이러한 평균값은 ASD가 진행되었는지 여부를 결정하기 위한 비율 대신에 단계 e)에서 사용된다. 여러 다른 대사산물 비율의 평균값을 사용하면 본 발명의 방법의 예측 값이 더욱 향상된다.
다섯 번째 측면에서, 본 발명은a) 치료 적용 전과 후에 얻은 환자의 샘플을 마련하는 단계; 및
b) 단계 a)의 샘플에서 리비톨/크레아티닌, 리비톨/1,5-안드로글루시톨, 리비톨/데옥시카르니틴, 요산염/N-아세틸카르노신, 에리스리톨/1,5-안드로글루시톨 및 에리스리톨/N-아세틸카르노신으로 구성된 그룹에서 선택한 적어도 하나의 대사산물 비율을 측정하는 단계;
를 포함하는, ASD 환자에게서 ASD 치료의 효율을 결정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은 특정 의료 개입에 대한 환자의 반응을 평가하는 데 유용하다. 상기 의료 개입은 확립된 치료법일 수 있으므로, 이 방법은 특정 의료 개입이 특정 환자의 ASD 진행을 개선하는 데 효능을 보이는지 여부를 결정하는 데 사용된다. 상기 의료 개입은 아직 대규모로 환자를 대상으로 테스트 되지 않은 새로운 치료법일 수도 있다. 이 경우 이 방법은 해당 의료 개입의 효능을 판단하는 데 유용하다.
[실시예]
실시예 1
재료 및 방법
ASD 표현형 1 환자의 혈장 샘플에 대한 대사산물 특성 분석에 앞서, 환자들은 ASD 표현형 1 또는 대조군으로 분류되었다.
특발성 ASD를 가진 개인이 다음과 같은 증상을 보이면 ASD 표현형 1로 분류하였다:
· 필수 기준 1개 이상:
o 생후 첫 24개월 동안 평균 머리둘레(HC)보다 최소 1 표준편차 이상 큰 대조군 대비 머리 크기 확대 및/또는 공식적인 거대 두부외반증(일반 인구의 97% 초과의 머리 둘레).
및/또는
o 감염성 사건, 탈락성 치아 손실, 외상 후 부상, 내인성 및 외인성 온도 변화에 의해 강화된 핵심 증상의 주기적 악화.
및
· 다음 20가지 특성 중 2개 이상, 가장 바람직하게는 3개 이상에 해당한다:
o 대조군 대비 모발 및 손발톱 성장 속도 가속화
o 같은 인종에 비해 피부와 눈의 색이 더 밝은 경향의 증가
o 같은 인종의 대조군 대상체보다 훨씬 더 긴 속눈썹.
o 특히 환자의 등에 나타나는 저색소성 피부의 5개 이상의 비접촉 부위
o 감염, 치아 상실, 외상 후 부상, 체온을 조절하는 내인성 및 외인성 요인으로 인한 부종의 징후, 특히 눈 주위와 이마 부위에 위치하는 안면 부종
o 같은 인종의 일반적인 발달 중인 개인에 비해 증가된 감마-글루타밀 트랜스펩티다제(GGT)의 혈중 농도.
o 선천성 비뇨생식기 기형 및/또는 배뇨를 시작할 수 있는 기능 장애
o 슬개골 저형성증
o 특히 5세 이전에 잦은 설사를 하는 경우
o 잦은 이명
o 뇌량의 얇아짐 또는 부재
o 특히 골수종 및 급성 골수성 백혈병에 국한되지 않는 혈액 악성 종양에 대한 양성 가족력
o 2세대 연속으로 최소 2명의 1촌 친척이 류마티스 관절염에 걸린, 류마티스 관절염에 대한 양성 가족력
o 아세틸살리실산 또는 그 유도체에 대한 부작용
o 단측성 또는 양측성 홍채 결장종
o 특히 영아, 유아 및 어린이의 수면 다한증(특히 유아기 및 아동기에 밤에 땀을 많이 흘리며 침대 시트를 교체해야 한다고 친척들이 종종 보고함)
o Th1/Th2 비율 증가(즉, 인터루킨 1 베타, 인터루킨 6, TNF-알파, 인터페론 감마 수치 상승)
o 선천성 부수(accessory) 또는 중복 비장
o 선천성 유미조(cisterna chyli)의 부재
o 치아 성장 지연
o 임신 중 산모가 바이러스 또는 박테리아 감염을 앓은 병력이 있고/있거나 임신 중 산모의 면역 활성화가 생물학적으로 확인된 경우가 보고된 이력
대조군 환자는 신경행동장애의 징후나 증상이 발견되지 않아 일반적으로 발달 중인 개인(TD)으로 간주되는 개인으로 확인되었다.
본 특허에 보고된 데이터는 말초혈액에서 분리된 혈장에서 생성되었다. 항응고제 헤파린이 함유된 튜브를 사용하여 정맥 천자를 통해 혈액 샘플을 채취하였다. 채혈 후 30~40분 이내에 전혈을 회전하는 버킷 로터에서 실온에서 15분간 원심분리하여 혈장을 분리하였다.
초고성능 액체 크로마토그래피-텐덤 질량 분석법(UPLC-MS/MS)으로 분석할 샘플은 화학적으로 다양한 대사산물을 회수하기 위해 단백질을 제거하여 제조하였다. 양이온 모드 전기분무 이온화(ESI)를 사용하는 두 개의 개별 역상(RP)/UPLC-MS/MS 분석법, 음이온 모드 ESI를 사용하는 RP/UPLC-MS/MS 분석법, 음이온 모드 ESI를 사용하는 HILIC/UPLC-MS/MS 분석법의 5가지 분획으로 나눴다. 샘플 추출물을 건조시킨 다음 네 가지 방법 각각에 호환되는 용매로 재구성했다. 각각의 재구성된 용매에는 주입 및 크로마토그래피 일관성을 보장하기 위해 고정 농도의 일련의 표준물질이 포함되었다. 원시 데이터를 추출하고 정제된 표준 또는 반복되는 미확인 개체의 라이브러리 항목과 비교하여 피크를 식별하였다.
결과
인구 통계 : 특정 임상 징후 및 증상의 연관성에 따라 ASD 표현형 1을 식별하기 위해 Greenwood Genetic Center(GGC, SC, USA) 데이터베이스에 임상 데이터가 완료된 ASD 환자 313명의 코호트(cohort)를 고려하였다.
GGC의 데이터베이스에 등록된 313명의 ASD 환자 중 90명(28.8%)은 생후 첫 24개월 동안 숙련된 의사가 최소 두 번 이상 머리둘레를 측정한 경험이 있다. 이 90명의 환자 중 47명(52.2%)은 적어도 하나의 주요 기준(즉, 머리둘레(HC))과 일치하였다.
머리둘레가 75 초과(HC>75)인 환자 47명의 가족에게 전화로 연락하여 ASD 표현형 1형에 대한 두 번째 필수 기준이 있는지 여부를 문의하였다. GGC는 47명의 환자 중 5명(10.6%)의 가족들과 연락을 취하는 데 실패하였다. 추가 임상 정보 수집이 가능했던 나머지 42명의 환자 중 21명(50%)이 ASD 표현형 1 기준을 충족하였다. 추적 관찰이 불가능했던 5명을 제외하면 전체적으로 85명의 환자 중 21명(24.7%)이 ASD 표현형 1 기준에 부합했으며 3~8개의 이차적 특성을 나타냈다.
21명의 ASD 표현형 1 환자 중 혈장 대사산물 프로파일링을 위해 10명의 환자를 무작위로 선정하였다. 신경 발달 장애 병력이 없고 연령이 일치하는 일반적으로 발달 중인 개인 5명도 선정하였다.
대사체 결과 : ASD 표현형 1 혈장에서 펜토오스 및 퓨린 대사와 관련된 대사 산물의 수준이 서로 다르다는 분명한 증거가 있었다(도 1 참조). 각 대사산물의 혈장 수치를 UPLC-MS/MS로 측정하고 블록 보정 방법을 사용하여 정규화했다. 도 1에서 볼 수 있듯이, 리비톨, 록소네이트, 에리스리톨 수치는 TD의 혈장에 비해 ASD 표현형 1 환자의 혈장에서 유의하게 높았다. 요산염 수치는 TD의 혈장에 비해 ASD 표현형 1 환자의 혈장에서 유의하게 낮았으며, 리보스 수치는 TD 혈장에 비해 ASD 표현형 1 환자의 혈장에서 증가하는 경향을 보였다.
또한, 신경발달장애(NDD)인 레트 증후군(Rett Syndrome)과 연관성이 있는 것으로 밝혀진 대사산물의 수치를 사용하였다(Neul et al. Metabolic Signatures Differentiate Rett Syndrome From Unaffected Siblings. Front Integr. Neurosci. 2020 Feb 25;14:7.) 및 ASD 표현형 1, 즉 크레아티닌, 1,5-안하이드로글루시톨, N-아세틸카르노신 및 데옥시카르니틴을 NDD 질병 상태에 대한 대조군으로 사용하였다. 가능한 모든 조합에 대해 ASD 표현형 1 특이적 대사산물과 NDD 질병 상태 대사산물 간의 비율을 계산하고, ASD 표현형 1과 TD 간의 변별력을 보여주는 6가지 비율을 보유하였다.
도 2에서 볼 수 있듯이 리비톨과 크레아티닌, 리비톨과 1,5-안하이드로글루시톨, 리비톨과 5-데옥시카르니틴, 요산염과 N-아세틸 카르노신, 에리스리톨과 1,5-안하이드로글루시톨, 에리스리톨과 N-아세틸카르노신의 비율은 모두 ASD 표현형 1 환자에서 TD 개인에 비해 더 높게 나타났다.
주성분 분석(Principal Component Analysis, PCA)을 사용하여 이 모든 비율을 조합하면 ASD 표현형 1형 환자와 TD형 환자를 명확하게 구분할 수 있는지 확인하였다. 도 3에서 볼 수 있듯이, 데이터 포인트는 표현형에 따라 두 개의 클러스터로 그룹화되었다(예: ASD 표현형 1과 TD). 이 결과는 6가지 비율을 한 분석에 결합하면 ASD 표현형 1과 TD를 명확하게 구분할 수 있음을 나타낸다.
실시예 2
ASD 표현형 1 환자의 혈장 샘플을 대사체 특성화(metabolomic characterization)하기 전에 실시예 1에서와 같이 환자를 ASD 표현형 1 또는 대조군으로 분류하였다. 또한, 이상 행동 체크리스트(Aberrant Behavior Checklist, ABC)-제2판-Community(Kaat et al. Validity of the Aberrant Behavior Checklist in Children with Autism Spectrum Disorder. Journal of Autism and Developmental Disorders. 2014 May; 44:5)를 사용하여 환자의 증상을 정량화하였다.
ABC 척도에 대한 설명
ABC는 5개의 하위 척도로 구성된 설문지이다: 과민성, 무기력/사회적 위축, 고정관념적 행동, 과잉 행동, 부적절한 언어. ABC 체크리스트는 환자에게 정보를 제공하는 간병인/정보 제공자에게 제공됩니다. 하위 척도에서 점수가 높을수록 해당 증상의 하위 범주에서 행동 결함의 수준이 높다는 것을 의미한다.
혈장 샘플 분석 및 대사물질 정량화는 상기 실시예 1에 설명된 것과 동일한 방식으로 수행되었다. 각 개인에 대해 대사물질 비율과 ABC 설문지의 각 하위 척도 결과 사이의 상관 계수를 구하였다. 상관 계수(R2)가 0.3 이상이면 양의 상관관계로 간주하였다. 리비톨 대 크레아티닌 비율과 과민성 및 과잉행동 수준, 리비톨 대 1,5-안하이드로글루시톨 비율과 과민성 및 과잉행동 수준 간에 4가지 양의 상관관계가 확인되었다.
도 4는 리비톨 대 크레아티닌 비율과 활동-특이적 균형 신뢰도(Activities-Specific Balance Confidence, ABC) 척도를 사용하여 측정한 과민성 및 과잉행동 수준 간의 상관관계를 보여줍니다. 상기 ABC 척도에서 점수가 높을수록 증상이 악화되고, 점수가 낮을수록 당뇨병 환자에서 발견되는 수준과 관련이 있다. 리비톨 대 크레아티닌 비율과 과민성 및 과잉행동 수준 사이의 음의 상관관계는 비율이 높을수록 행동 증상의 정도가 낮다는 것을 나타낸다.
도 5는 리비톨과 1,5-안하이드로글루시톨의 수치와 활동별 균형 신뢰도(ABC) 척도를 사용하여 측정한 과민성 및 과잉행동 수치 사이의 상관관계를 보여준다. 상기 ABC 척도의 점수가 높을수록 증상이 악화되고, 점수가 낮을수록 TD 개인에게서 발견되는 수준과 관련이 있다. 리비톨 대 크레아티닌 비율과 과민성 및 과잉행동 수준 사이의 음의 상관관계는 비율이 높을수록 행동 증상의 정도가 낮다는 것을 나타낸다.
이러한 결과는 ASD의 하위 집단, 즉 ASD 표현형 1을 식별하는 것 외에도, 이 두 가지 비율의 수준이 질병 증상의 심각성을 반영한다는 것을 시사한다. 따라서 이러한 대사산물 간의 비율은 ASD 환자에 특이적인 생물학 마커를 사용하여 질병 진행을 포함한 증상의 심각성을 모니터링하고 약리학 적 또는 치료적 치료 효능을 모니터링하는 데 사용될 수 있다.

Claims (15)

  1. a) 대상체에서 샘플을 마련하는 단계;
    b) 상기 샘플에서 리비톨, 록소네이트, 에리스리톨, 리보스 및 요산염으로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 하나의 대사 마커의 수준(level)을 측정하는 단계; 및
    c) 상기 단계 b)에서 측정된 적어도 하나의 대사 마커의 수치가 일반적으로 발달 중인 대조군(typically developing control, TD)과 비교하여 구체적으로 다른 경우 자폐 스펙트럼 장애(autism spectrum disorder, ASD)로 진단하는 단계;
    를 포함하는, 대상체의 ASD 진단 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    구체적으로 다른은 리비톨, 록소네이트, 에리스리톨 또는 리보스의 경우 더 높은 수준을 의미하고, 요산염의 경우 더 낮은 수준을 의미하는 것인, 대상체의 ASD 진단 방법.
  3. a) 대상체에서 샘플을 마련하는 단계;
    b) 상기 샘플에서 리비톨/크레아티닌, 리비톨/1,5-안하이드로글루시톨, 리비톨/데옥시카르니틴, 요산염/N-아세틸카르노신, 에리스리톨/1,5-안하이드로글루시톨 및 에리스리톨/N-아세틸카르노신으로 구성된 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 대사산물 비율을 측정하는 단계; 및
    c) 상기 b) 단계에서 측정한 적어도 하나의 대사산물 비율이 일반적으로 발달 중인 대조군과 비교하여 증가한 경우 자폐 스펙트럼 장애(ASD)로 진단하는 단계;
    를 포함하는, 대상체의 ASD 진단 방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 단계 b)에서 2, 4 또는 6개의 대사산물 비율을 측정하여 평균을 구하고, 상기 단계 c)에서, 이 평균은 일반적으로 발달 중인 대조군으로부터의 샘플에서 측정된 각각의 2, 4 또는 6개의 대사산물 비율의 평균과 비교되는 것인, 대상체의 ASD 진단 방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 대상체는 일반적으로 발달 중인 대조군과 비교하여 비율의 평균값이 최소 15 % 증가한 것으로 나타나면 ASD로 진단되는 것인, 대상체의 ASD 진단 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 c)에서, 상기 진단은 ASD 표현형 1인, 대상체의 ASD 진단 방법.
  7. a) 환자로부터 첫 번째 샘플 s0를 마련하는 단계;
    b) 상기 첫 번째 샘플에서 리비톨, 록소네이트, 에리스리톨, 리보스 및 요산염으로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 하나의 대사 마커의 수준을 측정하는 단계;
    c) 환자로부터 두 번째 샘플 s1을 마련하는 단계;
    d) 상기 두 번째 샘플에서 단계 b)에서와 동일한 대사 마커의 수준을 측정하는 단계; 및
    e) 단계 b)에서 얻은 수준과 단계 d) 단계에서 얻은 수준을 비교하여 환자에게 ASD가 진행되었는지 여부를 결정하는 단계;
    를 포함하는, ASD를 앓고 있는 환자의 ASD 진행 모니터링 방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    단계 e)에서,
    적어도 하나의 대사 마커가 리비톨, 록소네이트, 에리스리톨 또는 리보스인 경우, 제2 샘플의 수치가 제1 샘플의 수치보다 높은 경우, 또는
    적어도 하나의 대사 마커가 요산염인 경우, 제2 샘플의 수치가 제1 샘플의 수치보다 낮은 경우,
    환자에서 ASD가 진행된 것으로 판단하는 것인, ASD를 앓고 있는 환자의 ASD 진행 모니터링 방법.
  9. a) 환자로부터 첫 번째 샘플 s0를 마련하는 단계;
    b) 상기 첫 번째 샘플에서 리비톨/크레아티닌, 리비톨/1,5-안드로글루시톨, 리비톨/데옥시카르니틴, 요산염/N-아세틸카르노신, 에리스리톨/1,5-안드로글루시톨 및 에리스리톨/N-아세틸카르노신으로 구성된 그룹에서 선택한 적어도 하나의 대사산물 비율을 측정하는 단계;
    c) 환자로부터 두 번째 샘플 s1을 마련하는 단계;
    d) 상기 제2 샘플에서 단계 b)에서와 같이 리비톨/크레아티닌, 리비톨/1,5-안드로글루시톨, 리비톨/데옥시카르니틴, 요산염/N- 아세틸카르노신, 에리스리톨/1,5-안드로글루시톨 및 에리스리톨/N- 아세틸카르노신으로 구성된 그룹으로부터 선택된 동일한 대사산물 비율을 측정하는 단계; 및
    e) 단계 b)에서 측정한 비율과 단계 d)에서 얻은 비율을 비교하여 환자의 ASD가 진행되었는지 여부를 결정하는 단계;
    를 포함하는 ASD를 앓고 있는 환자의 ASD 진행 모니터링 방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    단계 e)에서, 제 2 샘플에서 측정된 비율이 제 1 샘플에서 측정된 해당 비율보다 높은 경우, 환자에서 ASD가 진행된 것으로 판단하는 것인, ASD를 앓고 있는 환자의 ASD 진행 모니터링 방법.
  11. 제 9항 또는 제 10항에 있어서,
    각 샘플에 대한 2, 4 또는 6의 비율이 측정되고, 각 샘플에 대한 상기 비율의 평균값이 계산되며, 상기 평균값은 ASD의 진행 여부를 결정하기 위한 비율 대신 단계 e)에서 사용되는, ASD를 앓고 있는 환자의 ASD 진행 모니터링 방법.
  12. 제 7항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 ASD 표현형 1을 앓는 것인, ASD를 앓고 있는 환자의 ASD 진행 모니터링 방법.
  13. a) 치료 적용 전과 후에 얻은 환자의 샘플을 마련하는 단계; 및
    b) 단계 a)의 샘플에서 리비톨/크레아티닌, 리비톨/1,5-안드로글루시톨, 리비톨/데옥시카르니틴, 요산염/N-아세틸카르노신, 에리스리톨/1,5-안드로글루시톨 및 에리스리톨/N-아세틸카르노신으로 구성된 그룹에서 선택한 적어도 하나의 대사산물 비율을 측정하는 단계;
    를 포함하는, ASD 환자에게서 ASD 치료의 효율을 결정하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    치료 적용 후에 얻어진 샘플에서 측정된 비율이 치료 적용 전에 얻어진 샘플에서 측정된 비율보다 낮으면 치료가 효과적인 것으로 판단하는 것인, ASD 환자에게서 ASD 치료의 효율을 결정하는 방법.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샘플은 혈액 샘플, 바람직하게는 혈장 샘플인, ASD 환자에게서 ASD 치료의 효율을 결정하는 방법.
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