KR20230156665A - Method for CRISPR-Cas9-mediated accurate multiplex genome editing and uses thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 CRISPR-Cas9 시스템을 기반으로 한 단일 뉴클레오타이드 수준의 다중 유전체 편집 방법과 그 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이 및 5′-말단 절단(truncated) sgRNA를 이용한 CRISPR 시스템은 동일한 유전체에서 서로 다른 최대 3개 유전자의 표적 DNA에 유의적인 유전체 편집 효과를 달성하는 바, 본 발명의 CRISPR 시스템은 유전자 가위를 이용한 유전자 교정용 조성물, 유전체 수준의 스크리닝, 암을 비롯한 다양한 질병의 치료제, 질병 진단 또는 이미징용 조성물 개발, 형질전환동식물 개발 등의 폭넓은 분야에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.The present invention relates to a single nucleotide-level multiple genome editing method based on the CRISPR-Cas9 system and its use. The CRISPR system using oligonucleotide-induced mutation and 5'-end truncated sgRNA according to the present invention As it achieves a significant genome editing effect on target DNA of up to three different genes in the same genome, the CRISPR system of the present invention is used as a composition for gene editing using gene scissors, genome-level screening, and treatment of various diseases including cancer. It is expected that it can be used in a wide range of fields, such as the development of compositions for disease diagnosis or imaging, and the development of transgenic animals and plants.
Description
본 발명은 CRISPR-Cas9 시스템 기반의 정교한 고효율 다중 유전체 편집 방법과 그 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a sophisticated and highly efficient multiplex genome editing method based on the CRISPR-Cas9 system and its uses.
유전체의 2곳 이상에서 동시에 유전자를 편집하는 다중 유전자 편집은 시간과 효율성 측면에서 여러 개의 유전자를 표적으로 하는 미생물 유전체 편집에 유리하다. MAGE (multiplexed automated genome engineering)는 올리고뉴클레오타이드 라이브러리를 이용하여 표적부위에 무작위 돌연변이(random mutation)를 누적시키고, 진화된 유도체(derivative) 중 원하는 표현형을 가진 균주(strain)을 스크리닝하는 방법이다. 각 균주가 서로 다른 유전자형을 가지기 때문에 어떤 유전자에 변이가 일어났는지 확인하는 과정이 필요하고, 20 bp 내외의 변이만 높은 효율로 가능하며, 전기천공(electroporation) 등 실험적 조건이 잘 최적화된 균주에서만 사용 가능하다는 한계가 있다. 그러나 MAGE는 원하는 표현형을 얻어내기 위해 무작위적인 표적들을 편집하고 선별한다는 점에서 원하는 부위를 정교하게 편집하고자 하는 기술과는 목적성이 다르다.Multi-gene editing, which edits genes simultaneously in two or more places in the genome, is advantageous to microbial genome editing that targets multiple genes in terms of time and efficiency. MAGE (multiplexed automated genome engineering) is a method of accumulating random mutations in target regions using an oligonucleotide library and screening strains with desired phenotypes among evolved derivatives. Since each strain has a different genotype, it is necessary to confirm which gene has mutated. Only mutations of around 20 bp can be performed with high efficiency, and it is only used in strains with well-optimized experimental conditions such as electroporation. There are limits to what is possible. However, MAGE has a different purpose from technologies that aim to precisely edit a desired region in that it edits and selects random targets to obtain the desired phenotype.
다양한 세균 및 고세균 등에서 공통적으로 발견되는 CRISPR-Cas 시스템은, 외부 환경에서 세포 내로 유입된 DNA 일부를 유전체 특정 부위에 삽입하고, 이후 해당 DNA가 재침입하였을 때 인식하고 절단하는 적응 면역 시스템으로 알려져 있다. CRISPR 시스템은 표적 DNA와 base pairing하는 guide RNA와 표적 DNA에 절단을 유발하는 Cas nuclease로 기능이 모듈화 되어 guide RNA에서 서열을 인식하는 TRS (target recognition sequence)만 변경하면 원하는 서열의 DNA를 절단할 수 있다. CRISPR-Cas 시스템의 분류상 Cas nuclease가 single effector로 이루어진 Class 2에 속하는 CRISPR-Cas9은 CRISPR-Cas 시스템 중 유전체 편집 도구로써 현재까지 가장 많이 연구 활용되어 왔다.The CRISPR-Cas system, commonly found in various bacteria and archaea, is known as an adaptive immune system that inserts part of DNA introduced into cells from the external environment into a specific region of the genome, and then recognizes and cuts the DNA when it re-invades. . The CRISPR system is functionally modularized into a guide RNA that base pairs with the target DNA and a Cas nuclease that causes cleavage in the target DNA. It can cleave DNA of a desired sequence by simply changing the TRS (target recognition sequence) that recognizes the sequence in the guide RNA. there is. According to the classification of the CRISPR-Cas system, CRISPR-Cas9, which belongs to Class 2 where Cas nuclease is a single effector, has been the most researched and utilized as a genome editing tool among the CRISPR-Cas systems to date.
Cas9 nuclease는 guide RNA와 결합하여 DNA 표적 부위를 절단하여 blunt end를 형성한다. 이 때 homology를 가지도록 디자인된 donor DNA를 함께 삽입하면, 상동 재조합에 의해 원하는 서열로 변이가 일어나며 절단된 DNA가 복구되는데, 이를 HDR (Homology directed repair)이라 한다. Donor DNA에 의한 재조합을 돕기 위해 박테리오파지 유래의 λ-red recombinase, RecET 등의 재조합 효소들이 사용되기도 한다. 유전체에 저항성 유전자 등 selection marker를 이용한 편집 방법은 유전체에 흔적을 남길 수 있는 반면, CRISPR-Cas9을 이용한 유전체 편집은 scarless, markerless editing이 가능하여 산업적 활용을 위한 유전체 안정성이 높은 균주를 제작할 수 있고 LMO 이슈에서 벗어날 수 있는 이점을 가진다.Cas9 nuclease binds to the guide RNA and cuts the DNA target site to form blunt ends. At this time, when a donor DNA designed to have homology is inserted together, a mutation occurs in the desired sequence through homologous recombination and the cut DNA is repaired. This is called HDR (Homology directed repair). To aid recombination by donor DNA, recombinant enzymes such as bacteriophage-derived λ-red recombinase and RecET are sometimes used. While editing methods using selection markers such as resistance genes can leave traces in the genome, genome editing using CRISPR-Cas9 enables scarless and markerless editing, making it possible to produce strains with high genome stability for industrial use and LMO It has the advantage of being able to escape from issues.
유전체에 2개 이상의 다중 표적에 대한 편집과 동시에 단일 뉴클레오타이드 돌연변이를 정교하게 도입하는 것은 현재까지 알려져 있지 않다. 따라서, 이러한 문제점을 극복하고 유전체에서 여러 부위의 다중 표적을 정교하고 효율적으로 편집할 수 있는 방법에 대한 연구가 필요하다.The precise introduction of single nucleotide mutations simultaneously with editing of two or more multiple targets in the genome is currently unknown. Therefore, research is needed on methods to overcome these problems and enable precise and efficient editing of multiple targets at various sites in the genome.
상술한 상황 하에서, 본 발명자들은 CRISPR-Cas9 시스템을 기반으로 하여 목적 대상의 유전체에서 다수의 표적 부위를 단일 염기 수준에서 고효율로 정교하게 편집할 수 있는 방법을 개발하고자 하였다. 이에, 본 발명자들은, 서로 상이한 다수의 목적 유전자의 표적 부위 서열을 인식할 수 있는 sgRNA를 다중으로 발현하는 플라스미드를 제작하였고, 이와 함께 표적 DNA에 점 돌연변이를 유발하는 올리고뉴클레오타이드를 이용한 위치 유도 돌연변이를 도입하여, 높은 효율로 다수의 목적 유전자의 단일 염기 편집이 가능함을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.Under the above-described situation, the present inventors attempted to develop a method that can precisely edit multiple target sites in the target genome at the single base level with high efficiency based on the CRISPR-Cas9 system. Accordingly, the present inventors constructed a plasmid that expresses multiple sgRNAs that can recognize target site sequences of multiple different target genes, and also performed site-directed mutations using oligonucleotides that cause point mutations in target DNA. The present invention was completed by demonstrating that single base editing of multiple target genes is possible with high efficiency.
따라서, 본 발명의 일 목적은 CRISPR-Cas9 시스템 기반 다중 유전자 편집 방법을 제공하는 데 있다.Therefore, one purpose of the present invention is to provide a multiple gene editing method based on the CRISPR-Cas9 system.
또한, 본 발명의 다른 목적은 CRISPR-Cas9 시스템 기반 다중 유전자 편집용 조성물을 제공하는 데 있다.Additionally, another object of the present invention is to provide a composition for multiple gene editing based on the CRISPR-Cas9 system.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 CRISPR-Cas9 시스템 기반의 다중 유전자 편집 효율 증가 방법을 제공하는 데 있다.Additionally, another purpose of the present invention is to provide a method of increasing the efficiency of multiple gene editing based on the CRISPR-Cas9 system.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 CRISPR-Cas9 시스템 기반의 다중 유전자가 편집된 대상체의 제조 방법을 제공하는 데 있다.Additionally, another object of the present invention is to provide a method for producing a subject with multiple genes edited based on the CRISPR-Cas9 system.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 CRISPR-Cas9 시스템 기반의 다중 유전자가 편집된 대상체의 제조 방법에 의해 제조된, 다중 유전자가 편집된 대상체를 제공하는 데 있다.In addition, another object of the present invention is to provide a subject with multiple genes edited, manufactured by a method for producing a subject with multiple genes edited based on the CRISPR-Cas9 system.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become clearer from the following detailed description and claims.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.The terms used herein are for descriptive purposes only and should not be construed as limiting. Singular expressions include plural expressions unless the context clearly dictates otherwise. In this specification, terms such as “comprise” or “have” are intended to designate the presence of features, numbers, steps, operations, components, parts, or combinations thereof described in the specification, but are not intended to indicate the presence of one or more other features. It should be understood that this does not exclude in advance the possibility of the existence or addition of elements, numbers, steps, operations, components, parts, or combinations thereof.
또한, 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.Additionally, unless otherwise defined, all terms used herein, including technical or scientific terms, have the same meaning as generally understood by a person of ordinary skill in the technical field to which the embodiments pertain. Terms defined in commonly used dictionaries should be interpreted as having a meaning consistent with the meaning in the context of the related technology, and unless explicitly defined in the present application, should not be interpreted in an ideal or excessively formal sense. No.
본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산 서열", "뉴클레오타이드 서열" 및 "폴리뉴클레오타이드 서열"은, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드, 및 이의 단편 또는 일부, 및 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있는 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 의미하고, 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낸다.As used herein, the terms “nucleic acid sequence,” “nucleotide sequence,” and “polynucleotide sequence” refer to oligonucleotides or polynucleotides, and fragments or portions thereof, and DNA of genomic or synthetic origin, which may be single-stranded or double-stranded. or RNA, and refers to the sense or antisense strand.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 2 종 이상의 서로 다른 표적 DNA에, 상보적으로 결합하는 공여 핵산 분자 및 가이드 RNA(guide RNA, gRNA)를 포함하는 CRISPR-Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-associated nuclease 9) 시스템 기반 다중 유전자 편집 방법을 제공하며, 상기 2 종 이상의 서로 다른 표적 DNA에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 2 종 이상의 서로 다른 가이드 RNA의 5′-말단으로부터 2개의 뉴클레오타이드를 결실시키는 단계를 포함한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides CRISPR-Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) comprising a donor nucleic acid molecule and guide RNA (gRNA) that binds complementary to two or more different target DNAs. -CRISPR-associated nuclease 9) Provides a system-based multiple gene editing method, comprising nucleotide sequences complementary to the two or more different target DNAs, two nucleotides from the 5′-end of two or more different guide RNAs It includes the step of fruiting.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "편집한다", "편집하는" 또는 "편집된"은 특정 게놈 표적을 선택적으로 결실시키거나, 외부로부터 공급된 DNA 주형을 사용하여 새로운 특정 서열을 포함시킴으로써 폴리뉴클레오타이드의 핵산 서열(예를 들면, 야생형 천연 생성 핵산 서열 또는 돌연변이된 천연 생성 서열)을 변경시키는 방법을 의미한다. 이러한 특정 게놈 표적은 염색체 영역, 미토콘드리아 DNA, 유전자, 프로모터, 오픈 리딩 프레임 또는 임의의 핵산 서열을 포함하나, 이들로 한정되지 않을 수 있다.As used herein, the terms “edit”, “editing” or “edited” refer to a polynucleotide by selectively deleting a specific genomic target or incorporating a new specific sequence using an externally supplied DNA template. refers to a method of altering a nucleic acid sequence (e.g., a wild-type naturally occurring nucleic acid sequence or a mutated naturally occurring sequence). Such specific genomic targets may include, but are not limited to, chromosomal regions, mitochondrial DNA, genes, promoters, open reading frames, or any nucleic acid sequence.
본 명세서에서 용어 "유전체 교정(genome editing)"은, 특별한 언급이 없는 한, 표적 DNA의 표적 부위에서의 Cas9 절단에 의한 핵산 분자의 결실, 삽입, 치환 등에 의하여 유전자 기능을 편집, 회복, 수정, 상실 및/또는 변경시키는 것을 의미한다.As used herein, the term "genome editing", unless otherwise specified, refers to editing, restoration, modification, etc. of gene function by deletion, insertion, or substitution of nucleic acid molecules by Cas9 cleavage at the target site of target DNA. It means to lose and/or change.
본원에서 사용된 용어 "결실시킨다", "결실된", "결실시키는" 또는 "결실"은 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 부재(제거)하거나 부재하게 되는, 각각 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에서의 변화로서 정의될 수 있다.As used herein, the terms "delete", "deletion", "deletion" or "deletion" are defined as a change in the nucleotide or amino acid sequence, respectively, resulting in the absence (elimination) or absence of one or more nucleotide or amino acid residues. It can be.
바람직하게는, 본 발명에서 2 종 이상의 다수의 서로 다른 표적 DNA에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA의 5′-말단으로부터 2개의 뉴클레오타이드가 결실된(5′-절단(truncated)) 가이드 RNA는, 상기 2 종 이상의 각 표적 DNA에 상보적인 18개의 연속적 뉴클레오타이드로 이루어진 영역을 포함하게 되며, 이러한 절단된 가이드 RNA가 오히려 CRISPR 시스템의 편집 효과를 향상시킬 뿐만 아니라, 다중 유전자(유전체)의 발현을 동시에 편집(예컨대, 억제)할 수 있는 것을 특징으로 한다.Preferably, in the present invention, the guide RNA has two nucleotides deleted (5'-truncated) from the 5'-end of the guide RNA containing nucleotide sequences complementary to two or more different target DNAs. , It contains a region consisting of 18 consecutive nucleotides complementary to each of the two or more types of target DNA, and this truncated guide RNA not only improves the editing effect of the CRISPR system, but also enables the expression of multiple genes (genomes) simultaneously. It is characterized by the ability to edit (e.g., suppress).
본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 결실된 뉴클레오타이드의 수는 제한되지 않으나, 바람직하게는, 결실된 뉴클레오타이드의 수는 1 내지 10개, 보다 바람직하게는 1 내지 2개, 가장 바람직하게는 2개이다.As long as the purpose of the present invention can be achieved, the number of deleted nucleotides is not limited, but preferably, the number of deleted nucleotides is 1 to 10, more preferably 1 to 2, and most preferably 2. It's a dog.
본 발명에 따르면, 본 발명의 가이드 RNA, 즉, 5′-절단(truncated) 가이드 RNA 상의 결실되는 뉴클레오타이드의 위치는, 가이드 RNA 상의 5′-말단으로부터 2개의 뉴클레오타이드가 이격된 바로 근접한 부위에 위치할 수 있다.According to the present invention, the position of the nucleotide to be deleted on the guide RNA of the present invention, that is, the 5'-truncated guide RNA, will be located in the immediate vicinity of the guide RNA, two nucleotides apart from the 5'-end. You can.
본 명세서에서 5′-절단(truncated) 가이드 RNA 상의 결실된 뉴클레오타이드 위치를 언급하면서 사용되는 용어"바로 근접한(immediately adjacent)"은, 표적 DNA에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA 상의 5′-말단 방향으로 인접(juxtaposition)한, 즉, 1 개 뉴클레오타이드만큼 이격된 부위에 위치하는 것을 의미한다. As used herein to refer to the location of a deleted nucleotide on a 5'-truncated guide RNA, the term "immediately adjacent" refers to the 5'-end of the guide RNA that contains the nucleotide sequence complementary to the target DNA. Directionally adjacent (juxtaposition), that is, located at a site spaced apart by one nucleotide.
용어 "가이드 RNA"는 표적 DNA에 특이적인 RNA로, Cas9 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, Cas9 단백질을 표적 DNA에 가져오는 RNA를 말한다.The term “guide RNA” refers to RNA that is specific to the target DNA, can form a complex with the Cas9 protein, and brings the Cas9 protein to the target DNA.
상기 가이드 RNA는 표적 DNA와 혼성화하는 crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA (transactivating crRNA)를 포함하는 이중 RNA (dual RNA), 또는 상기 crRNA 및 tracrRNA의 부분을 포함하고 표적 DNA와 혼성화하는 단일-사슬 가이드 RNA (sgRNA)일 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서 상기 가이드 RNA는 sgRNA이다.The guide RNA is a dual RNA containing a crRNA (CRISPR RNA) and a tracrRNA (transactivating crRNA) that hybridizes with the target DNA, or a single-chain guide RNA that contains parts of the crRNA and tracrRNA and hybridizes with the target DNA. (sgRNA), and in one embodiment of the present invention, the guide RNA is sgRNA.
상기 가이드 RNA가 crRNA 및 tracrRNA의 필수적인 부분 및 표적과 상보적인 부분을 포함한다면, 어떠한 가이드 RNA라도 본 발명에 사용될 수 있다.Any guide RNA can be used in the present invention, as long as the guide RNA includes essential parts of crRNA and tracrRNA and a part complementary to the target.
상기 crRNA는 표적 DNA와 혼성화될 수 있다.The crRNA can hybridize with target DNA.
가이드 RNA는 RNA의 형태 또는 가이드 RNA를 암호화하는 DNA의 형태로 세포 또는 유기체에 전달될 수 있다. 또한, 가이드 RNA는 분리된 RNA의 형태, 바이러스 벡터에 포함되어 있는 RNA, 또는 벡터에 암호화되어있는 형태일 수도 있다. 바람직하게, 상기 벡터는 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 또는 아그로박테리움 (agrobacterium) 벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Guide RNA can be delivered to a cell or organism in the form of RNA or DNA encoding the guide RNA. Additionally, the guide RNA may be in the form of isolated RNA, RNA contained in a viral vector, or encoded in the vector. Preferably, the vector may be a viral vector, a plasmid vector, or an agrobacterium vector, but is not limited thereto.
본 발명에서 CRISPR-Cas9 시스템 기반 유전체 편집을 언급하면서 사용되는 용어 "5′-절단(truncated) 가이드 RNA"는 표적 DNA에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA의 5′-말단으로부터 2개의 뉴클레오타이드가 결실된 crRNA를 포함하는 sgRNA로서, 본 명세서에서 5′-truncated sgRNA와 혼용하여 사용된다.The term "5'-truncated guide RNA" used in the present invention while referring to the CRISPR-Cas9 system-based genome editing refers to a guide RNA containing a nucleotide sequence complementary to the target DNA, two nucleotides from the 5'-end. As an sgRNA containing a deleted crRNA, it is used interchangeably with 5′-truncated sgRNA in this specification.
또한, 본 발명은 스캐폴드 및 표적 DNA 서열에 상보성을 가지는 서열 또는 표적 서열과 상보적인 결합을 하는 서열인 프로토스페이서를 포함하는 crRNA를 암호화하는 핵산 서열; 및 상기 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 다중 유전자 편집(발현 억제)용 재조합 벡터를 포함할 수 있다.In addition, the present invention provides a nucleic acid sequence encoding a crRNA including a protospacer, which is a sequence complementary to a scaffold and a target DNA sequence or a sequence that binds complementary to the target sequence; and a recombinant vector for multiple gene editing (expression suppression) including a promoter operably linked to the nucleic acid sequence.
상기 프로토스페이서 서열은 PAM 서열의 5′-말단 또는 3′-말단에 위치하는 서열로, 프로토스페이서 서열과 표적 서열 간의 상관관계는 표적 서열과 가이드 서열 간의 상관관계와 유사하다. 이러한 특징에 의해, 일반적으로 가이드 서열 설계시 프로토스페이서 서열을 이용하여 설계할 수 있다. 즉, 표적 서열에 상보적으로 결합하는 가이드 서열을 설계 시, 가이드 서열은 프로토스페이서 서열과 동일한 염기서열을 가지는 뉴클레오타이드 서열로 설계할 수 있다. 이때, 프로토스페이서 서열의 염기서열 중 T는 U로 대체하여 가이드 서열을 설계한다.The protospacer sequence is a sequence located at the 5'-end or 3'-end of the PAM sequence, and the correlation between the protospacer sequence and the target sequence is similar to the correlation between the target sequence and the guide sequence. Due to these characteristics, the guide sequence can generally be designed using a protospacer sequence. That is, when designing a guide sequence that binds complementary to the target sequence, the guide sequence can be designed as a nucleotide sequence having the same base sequence as the protospacer sequence. At this time, T in the nucleotide sequence of the protospacer sequence is replaced with U to design the guide sequence.
본 발명에서 CRISPR-Cas9 시스템 기반 유전체 편집을 언급하면서 사용되는 용어 "공여 핵산 분자" 또는 "공여체 핵산 서열"은 표적 DNA에 삽입하고자 하는 목적의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 천연의 또는 변형된 폴리뉴클레오타이드, RNA-DNA 키메라, 또는 DNA 단편, 또는 PCR 증폭된 ssDNA 또는 dsDNA 단편 또는 이의 유사체를 지칭한다.In the present invention, the term "donor nucleic acid molecule" or "donor nucleic acid sequence" used while referring to genome editing based on the CRISPR-Cas9 system refers to a natural or modified polynucleotide, RNA, containing the nucleotide sequence intended to be inserted into the target DNA. -refers to a DNA chimera, or a DNA fragment, or a PCR amplified ssDNA or dsDNA fragment, or an analog thereof.
이러한 공여 핵산 분자는 표적 DNA 상에 변형을 유발하여 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 임의의 형태, 예컨대, 단일-가닥 및 2중-가닥 형태를 포함할 수 있다.These donor nucleic acid molecules may include any form, such as single-stranded and double-stranded forms, as long as they can cause modifications on the target DNA to achieve the purposes of the present invention.
상기 표적 DNA 상의 변형은 임의의 목적 위치에서의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 녹아웃(knockout), 녹인(knockin), 내인성 핵산 서열의 상동, 이종상동성(endogenous) 또는 이종 핵산 서열로의 치환, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.Modifications on the target DNA include substitution of one or more nucleotides at any desired position, insertion of one or more nucleotides, deletion of one or more nucleotides, knockout, knockin, homology to an endogenous nucleic acid sequence, or orthology (endogenous). ) or substitution with a heterologous nucleic acid sequence, or a combination thereof.
본 발명에서, 바람직하게는, 상기 표적 DNA 상의 변형은 야생형 DNA 서열에서 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환에 의해 점 돌연변이가 도입(유도)된 것이고, 이러한 점 돌연변이의 도입은 예컨대, 올리고뉴클레오타이드에 의한 것이다.In the present invention, preferably, the modification on the target DNA is a point mutation introduced (induced) by substitution of one or more nucleotides in the wild-type DNA sequence, and the introduction of this point mutation is, for example, by an oligonucleotide.
본 명세서에서 사용된 용어 "혼성화(hybridization)"는 상보적인 단일 가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2 개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. As used herein, the term “hybridization” refers to the formation of complementary single-stranded nucleic acids into a double-stranded nucleic acid. Hybridization may occur when the complementarity between the two nucleic acid strands is perfect (perfect match) or even when some mismatched bases exist.
본원에서 사용된, 용어 "Cas 단백질"은 CRISPR-Cas 시스템에서 필수적인 단백질 요소를 의미하고, CRISPR RNA (crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA (trans-activating crRNA, tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성할 때, 활성 엔도뉴클레아제 또는 니카아제 (nickase)를 형성한다.As used herein, the term "Cas protein" refers to an essential protein component in the CRISPR-Cas system, which forms a complex with two RNAs called CRISPR RNA (crRNA) and trans-activating crRNA (tracrRNA). When formed, an active endonuclease or nickase is formed.
Cas 유전자 및 단백질의 정보는 국립생명공학정보센터 (national center for biotechnology information, NCBI)의 GenBank에서 구할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Cas 단백질을 암호화하는 CRISPR-연관 (CRISPR-associated, cas) 유전자는 종종 CRISPR-반복 스페이서 배열(CRISPR repeat-spacer array)과 관련된다. CRISPR-Cas 시스템은 두 개의 class와 여섯 개의 type이 존재하며, 이들 중에서, Cas9 단백질 및 crRNA 및 tracrRNA를 수반하는 type ±-Cas 시스템이 대표적으로 잘 알려져 있다.Information on Cas genes and proteins can be obtained from GenBank of the National Center for Biotechnology Information (NCBI), but is not limited thereto. CRISPR-associated (cas) genes, which encode Cas proteins, are often associated with CRISPR repeat-spacer arrays. The CRISPR-Cas system exists in two classes and six types, and among these, the type ±-Cas system involving the Cas9 protein and crRNA and tracrRNA is well known.
상기 표적 DNA는 상기 crRNA 또는 sgRNA와 상보적인 서열의 뉴클레오타이드 및 프로토스페이서-인접 모티프(protospacer-adjacent motif, PAM)를 포함한다.The target DNA includes nucleotides and a protospacer-adjacent motif (PAM) of a complementary sequence to the crRNA or sgRNA.
상기 올리고뉴클레오타이드는 표적 DNA의 프로토스페이서-인접 모티프(protospacer-adjacent motif, PAM)를 포함한다.The oligonucleotide contains a protospacer-adjacent motif (PAM) of the target DNA.
상기 PAM은 5′-NGG-3′트리뉴클레오타이드 (trinucledotide)이다.The PAM is 5'-NGG-3' trinucleotide (trinucledotide).
종래 기술인 돌연변이 유발 올리고뉴클레오타이드를 세포에 삽입하면, DNA를 복제하는 과정에서 낮은 수율로 돌연변이가 도입될 뿐이었다. 종래 CRISPR-Cas9 시스템을 이용하는 경우에도 CRISPR-Cas9의 불일치 허용으로 인해 단일 염기 점 돌연변이를 도입하는데 어려움이 있었다.When conventional mutagenic oligonucleotides were inserted into cells, mutations were introduced at a low yield during the DNA replication process. Even when using the conventional CRISPR-Cas9 system, it was difficult to introduce a single base point mutation due to the mismatch tolerance of CRISPR-Cas9.
이에, 상술한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 다수의 표적 DNA의 5′-말단의 뉴클레오타이드를 결실시킨 5′-절단(truncated) sgRNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 시스템에, 표적 DNA에서 단일 염기 불일치를 가지는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드로 위치 유도 돌연변이를 도입하였다.Accordingly, in order to solve the above-mentioned problem, the present inventors applied a CRISPR-Cas9 system containing 5'-truncated sgRNAs in which nucleotides at the 5'-terminals of multiple target DNAs were deleted, and a single base mismatch in the target DNA. A site-directed mutation was introduced with an oligonucleotide containing a base sequence.
그 결과, 상기 다수의 표적 DNA와 이에 대해 상동성을 갖는 상기 가이드 5′-절단(truncated) sgRNA에서 5′-말단의 2 개 뉴클레오타이드가 결실되면 CRISPR-Cas9 시스템이 단일염기 불일치를 구분하는 불일치 불허용 (mismatch intolerance)를 보여 이를 이용한 목적 다중 유전자의 단일 염기 편집(교정) 효율 및 정확도가 크게 향상되는 효과를 달성함을 규명하였다.As a result, when two nucleotides at the 5'-end are deleted from the guide 5'-truncated sgRNA having homology to the plurality of target DNAs, the CRISPR-Cas9 system disallows mismatches to distinguish single base mismatches. It was found that the efficiency and accuracy of single base editing (correction) of the target multiple genes using this method were significantly improved by showing mismatch intolerance.
따라서, 본 발명의 방법은 단일 염기 돌연변이를 도입하여 목적 대상체의 목적 유전자 다수를 효과적으로 단일 염기 단위로 정교하게 편집할 수 있음을 입증한다.Therefore, it is demonstrated that the method of the present invention can effectively and precisely edit a large number of target genes in a target subject by single base by introducing a single base mutation.
또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 2 종 이상의 서로 다른 표적 DNA에, 상보적으로 결합하는 공여 핵산 분자 및 가이드 RNA(guide RNA, gRNA)를 포함하는 CRISPR-Cas9 시스템 기반 다중 유전자 편집용 조성물을 제공하며, 상기 2 종 이상의 서로 다른 표적 DNA에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 2 종 이상의 서로 다른 가이드 RNA는 이의 5′-말단으로부터 2개의 뉴클레오타이드가 결실된 것이다.In addition, according to another aspect of the present invention, the present invention provides multiple gene editing based on the CRISPR-Cas9 system including a donor nucleic acid molecule and a guide RNA (gRNA) that bind complementary to two or more different target DNAs. Provided is a composition for two or more different guide RNAs comprising nucleotide sequences complementary to the two or more different target DNAs with two nucleotides deleted from the 5'-end thereof.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 CRISPR-Cas9 시스템에서 다수의 표적 유전자를 인식하나, 선택된 표적 DNA 서열보다 2개의 뉴클레오타이드가 결실된 가이드 RNA를 발현할 수 있는 구조물을 포함하며, 가이드 RNA 및 공여 DNA(예컨대, 올리고뉴클레오타이드)가 동시에 세포 내로 전달되고, Cas9 단백질에 의한 표적 DNA의 절단 시 공여 DNA를 통해 표적 DNA 대신 돌연변이 서열을 포함하는 공여 DNA가 유전체 내에 포함되어 표적 DNA의 치환 돌연변이 효율을 높일 수 있는 것을 특징으로 한다.According to one embodiment of the present invention, the composition of the present invention recognizes multiple target genes in the CRISPR-Cas9 system, but includes a construct capable of expressing a guide RNA with two nucleotides deleted than the selected target DNA sequence, Guide RNA and donor DNA (e.g., oligonucleotide) are simultaneously delivered into the cell, and when the target DNA is cut by the Cas9 protein, the donor DNA containing the mutation sequence instead of the target DNA is included in the genome through the donor DNA, resulting in substitution of the target DNA. It is characterized by being able to increase mutation efficiency.
본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 방법을 이용하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Since the composition of the present invention uses the method of the present invention described above, duplicate content is omitted to avoid excessive complexity of the specification.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 2 종 이상의 서로 다른 표적 DNA에, 상보적으로 결합하는 공여 핵산 분자 및 가이드 RNA(guide RNA, gRNA)를 포함하는 CRISPR-Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-associated nuclease 9) 시스템 기반 다중 유전자 편집 효율 증가 방법을 제공하며, 상기 2 종 이상의 서로 다른 표적 DNA에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 2 종 이상의 서로 다른 가이드 RNA의 5′-말단으로부터 2개의 뉴클레오타이드를 결실시키는 단계를 포함한다.In addition, according to another aspect of the present invention, the present invention provides CRISPR-Cas9 (Clustered Regularly Interspaced) comprising a donor nucleic acid molecule and guide RNA (gRNA) that binds complementary to two or more different target DNAs. Short Palindromic Repeats-CRISPR-associated nuclease 9) Provides a system-based method of increasing the efficiency of multiple gene editing, wherein the 5′- of two or more different guide RNAs containing nucleotide sequences complementary to the two or more different target DNAs are used. and deleting two nucleotides from the end.
본 발명의 방법은 상술한 방법을 이용하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Since the method of the present invention uses the above-described method, duplicate content is omitted to avoid excessive complexity of the specification.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, CRISPR-Cas9 시스템 기반의 다중 유전자가 편집된 대상체의 제조 방법을 제공한다:In addition, according to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for producing a subject with multiple genes edited based on the CRISPR-Cas9 system, comprising the following steps:
(a) 2 종 이상의 서로 다른 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 상기 2 종 이상의 서로 다른 표적 DNA 상에 변형을 유발하는 공여 핵산 분자를 제작하는 단계; (a) preparing a donor nucleic acid molecule that binds complementary to two or more different target DNAs and causes modifications in the two or more different target DNAs;
(b) 상기 2 종 이상의 서로 다른 표적 DNA에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 2 종 이상의 서로 다른 가이드 RNA의 5′-말단으로부터 1개 내지 3개의 뉴클레오타이드가 결실된(truncated) 가이드 RNA를 제작하는 단계; 및 (b) producing guide RNAs in which 1 to 3 nucleotides are truncated from the 5′-ends of two or more different guide RNAs, including nucleotide sequences complementary to the two or more different target DNAs. step; and
(c) 상기 (a) 단계의 공여 핵산 분자 및 상기 (b) 단계의 가이드 RNA를, 편집시키고자 하는 대상체에 형질전환시켜, 대상체의 표적 DNA를 편집하는 단계.(c) Transforming the donor nucleic acid molecule of step (a) and the guide RNA of step (b) into a subject to be edited, thereby editing the target DNA of the subject.
또한, 본 발명의 상기 CRISPR-Cas9 시스템은 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 당업계에 공지된 임의의 선별마커를 이용할 수 있다.Additionally, the CRISPR-Cas9 system of the present invention can use any selection marker known in the art as long as it can achieve the purpose of the present invention.
본 발명의 대상체는, 본 발명의 방법을 적용할 수 있는 한, 제한되지 않으나, 바람직하게는 플라스미드, 바이러스, 원핵 세포, 분리된 진핵 세포 또는 인간을 제외한 진핵 유기체일 수 있다.The subject of the present invention is not limited as long as the method of the present invention can be applied, but preferably may be a plasmid, a virus, a prokaryotic cell, an isolated eukaryotic cell, or a eukaryotic organism other than a human.
상기 진핵 세포는 효모, 곰팡이, 식물, 곤충, 양서류, 포유동물 등의 세포일 수 있고, 예를 들어, 당업계에서 일반적으로 사용되는 인 비트로에서 배양된 세포, 이식된 세포, 일차 세포 배양, 인 비보 세포, 인간을 포함하는 포유 동물의 세포일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.The eukaryotic cells may be cells of yeast, mold, plants, insects, amphibians, mammals, etc., for example, cells commonly used in the art, such as cells cultured in vitro, transplanted cells, primary cell culture, human cells, etc. It may be a vivo cell or a mammalian cell, including a human, but is not limited thereto.
상기 Cas9 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas9 단백질은 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 임의의 것도 이용할 수 있으나, 바람직하게는 스트렙토코커스 속 (genus Streptococcus)으로부터 유래한 것이다.Any nucleic acid encoding the Cas9 protein or Cas9 protein may be used as long as it can achieve the purpose of the present invention, but is preferably derived from the genus Streptococcus .
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 다중 유전자가 편집된 대상체의 제조 방법에 의해 제조된, 다중 유전자가 편집된 대상체를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a subject with multiple genes edited, produced by the method for producing a subject with multiple genes edited.
본 발명은 목적 대상의 유전체, 즉, 다수의 목적 유전자를 단일 염기 단위로 편집, 수선하는 방법에 관한 것으로서, 목적 유전자에 변이가 일어난 목적 대상, 예컨대, 미생물 균주들의 유전체를 올바르게 수선하거나, 코돈의 변화 등을 유발함으로써 유용 물질 등의 생산능을 최적화시킨 균주를 제작하는 방법을 제공하는 효과가 있다.The present invention relates to a method for editing and repairing the genome of a target target, that is, a plurality of target genes, in single base units, and to correctly repair the genome of the target target, such as microbial strains, in which a mutation has occurred in the target gene, or to correct the codon of the target gene. It has the effect of providing a method of producing strains that optimize the production capacity of useful substances by causing changes, etc.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이 및 5′-말단 절단(truncated) sgRNA를 이용한 CRISPR 정교한 다중 편집 시스템은 동일한 유전체에 서로 다른 부위의 표적 DNA에 유의적인 유전체 단일 뉴클레오타이드 수준의 편집 효과를 달성하여, 다중 유전자 편집에서 유의미한 활용도를 가질 것으로 기대된다. 정교한 고속 유전체 편집에 사용될 수 있으며, 산업바이오, 농식품, 의약학 등 폭넓은 분야에 이용될 수 있을 것으로 전망된다.The CRISPR sophisticated multiple editing system using oligonucleotide-induced mutation and 5'-end truncated sgRNA according to the present invention achieves a significant genome single nucleotide-level editing effect on target DNA at different sites in the same genome, It is expected to have significant utility in multiple gene editing. It can be used for sophisticated, high-speed genome editing, and is expected to be used in a wide range of fields, including industrial biotechnology, agriculture and food, and medicine.
도 1A 및 1B는 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 돌연변이를 유발하고, CRISPR-Cas9 음성 선택을 통해 서로 다른 위치의 2가지 표적에서 동시에 뉴클레오타이드 편집을 수행하는 방법에 관한 개념도를 나타낸 것이다.
도 2A 및 2B는 2개의 표적 편집 시 다중 sgRNA 발현 플라스미드를 제작하는 방법에 관한 개념도(도 2A) 및 해당 플라스미드에서 발현된 다중 sgRNA가 각각 기능하는지를 그래프로 나타낸 것이다(도 2B).
도 3은 본 발명의 방법을 이용하여 galK 및 xylB 다중 표적에 대한 단일 내지 사중 뉴클레오타이드 치환에 대해 올리고뉴클레오타이드 길이와 양에 따른 동시 편집 효율을 그래프로 나타낸 것이다.
도 4A 및 4B는 다중 유전자 편집 시 5′-말단 절단(truncated) sgRNA를 이용한 CRISPR-Cas9 시스템의 불일치 허용 극복에 관한 개념도(도 4A)와 galK 및 xylB 다중 표적에 대한 단일 뉴클레오타이드 치환, 삽입, 결실 동시 편집 효율 그래프이다(도 4B).
도 5A 내지 5C는 3개의 표적 편집 시 다중 sgRNA 발현 플라스미드의 형태(도 5A)와 galK, xylB, srlD 다중 표적에 대한 단일, 사중 뉴클레오타이드 치환 동시 편집 효율 그래프이다(도 5B 및 5C).
도 6A 및 6B는 5′-말단 절단(truncated) sgRNA를 이용한 다중 유전자 편집 방법의 실제적인 활용 가능성 검증을 위해 표현형이 나타나지 않는 배지에서 무작위적으로 10개의 콜로니를 골라 편집되었는지 Sanger 염기 서열 분석(도 6A) 및 표현형(도 6B)을 통해 확인해 본 결과이다.Figures 1A and 1B show a conceptual diagram of a method for inducing mutations using oligonucleotides and simultaneously performing nucleotide editing on two targets at different positions through CRISPR-Cas9 negative selection.
Figures 2A and 2B are a conceptual diagram of a method for constructing a multiple sgRNA expression plasmid when editing two targets (Figure 2A) and a graphical representation of the function of multiple sgRNAs expressed from the corresponding plasmid (Figure 2B).
Figure 3 graphically shows the simultaneous editing efficiency according to oligonucleotide length and amount for single to quadruple nucleotide substitutions for galK and xylB multiple targets using the method of the present invention.
Figures 4A and 4B show the use of 5'-end truncated sgRNA during multiple gene editing. A conceptual diagram of overcoming mismatch tolerance in the CRISPR-Cas9 system (Figure 4A) and a graph of the simultaneous editing efficiency of single nucleotide substitutions, insertions, and deletions for galK and xylB multiple targets (Figure 4B).
Figures 5A to 5C are graphs of the morphology of multiple sgRNA expression plasmids when editing three targets (Figure 5A) and the simultaneous editing efficiency of single and quadruple nucleotide substitutions for galK , xylB , and srlD multiple targets (Figures 5B and 5C).
Figures 6A and 6B show Sanger base sequence analysis of whether 10 colonies were randomly selected from a phenotypic medium and edited to verify the practical applicability of the multiple gene editing method using 5'-truncated sgRNA (Figure 6B). 6A) and phenotype (Figure 6B).
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the examples are only for illustrating the present invention in more detail, and it is understood by those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. It will be self-evident.
실시예 1.Example 1. 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이와 CRISPR-Cas9 음성 선택을 통한 다중 유전체 편집Multiplex genome editing via oligonucleotide-induced mutagenesis and CRISPR-Cas9 negative selection
본 발명자들은 대장균 유전체의 동시 다중 편집을 위해, 본 발명자들에 의해 제작되고 공지된 대장균 균주 HK1059 (E. coli MG1655 araBAD::PBAD-cas9-KmR)와 pHK463 플라스미드를 사용하였다.The present inventors used the known E. coli strain HK1059 ( E. coli MG1655 araBAD ::P BAD - cas9 -KmR) and the pHK463 plasmid, which were produced by the present inventors and were known to be used for simultaneous multiple editing of the E. coli genome.
간략하게는, 삽입할 Cas9 유전자는 pCas (Addgene plasmid #62225) 로부터 PCR로 증폭되고, 카나마이신 유전자와 함께 재조합을 위한 상동 서열을 갖도록 cas9-KmR 카세트로 PCR로 증폭되었다. 증폭된 PCR 산물은 정제된 후 L-arabinose에 의해 pKD46 플라스미드의 람다-레드 재조합 효소가 과발현된 대장균 MG1655에 삽입되어 아라비노스 오페론의 PBAD 프로모터 뒷부분에 위치됨으로써 HK1059 균주로 제작되었다. 올리고뉴클레오타이드에 의한 재조합을 돕기 위한 람다-레드 베타 발현 플라스미드 pHK463은 pKD46 backbone과 bet 유전자 부분을 각각 PCR로 증폭하여, isothermal assembly를 통하여 제작하였으며, L-arabinose 유도 시에만 베타 단백질을 발현하도록 만들어졌다.Briefly, the Cas9 gene to be inserted was amplified by PCR from pCas (Addgene plasmid #62225), and the cas9-KmR cassette was amplified by PCR to have a homologous sequence for recombination with the kanamycin gene. The amplified PCR product was purified by L-arabinose and then inserted into E. coli MG1655 overexpressing the lambda-red recombinase of the pKD46 plasmid and placed behind the P BAD promoter of the arabinose operon, thereby creating the HK1059 strain. Lambda-Red beta expression plasmid pHK463, to aid recombination by oligonucleotides, was constructed by amplifying the pKD46 backbone and bet gene parts by PCR and isothermal assembly, and was designed to express beta protein only when L-arabinose is induced.
또한, 대장균 HK1059 유전체의 Cas9과 람다-레드 베타 발현 플라스미드 pHK463의 Bet 단백질을 과발현시키기 위해, 30℃에서 배양 후 OD600nm가 0.4에 도달했을 때 L-arabinose를 1 mM 농도로 첨가한 후 3시간 배양하였다. 배양이 끝난 세포는 회수하여 10% 글리세롤로 두 번 세척 후 재현탁 및 분주하여 electrocompetent cell로 제작하고 -80℃에서 보관하였다.In addition, to overexpress Cas9 of the E. coli HK1059 genome and Bet protein of the lambda-red beta expression plasmid pHK463, after culturing at 30°C, when the OD 600nm reached 0.4, L-arabinose was added at a concentration of 1 mM and cultured for 3 hours. did. After culturing, cells were recovered, washed twice with 10% glycerol, resuspended and dispensed to produce electrocompetent cells, and stored at -80°C.
돌연변이를 유발하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 의해 두 개의 유전자에 모두 돌연변이가 도입되면 CRISPR-Cas9 음성 선택에 의해 세포가 살아남고, 하나의 유전자라도 돌연변이가 도입되지 않으면 세포가 사멸한다.If a mutation is introduced into both genes by a single-stranded oligonucleotide that causes a mutation, the cell survives through CRISPR-Cas9 negative selection, and if a mutation is not introduced in even one gene, the cell dies.
즉, 도 1B에 나타낸 바와 같이, 맥콘키 선택배지에는 갈락토오스(0.5%), 자일로오스(0.5%) 및 spectinomycin (75 μg mL-1)을 첨가하였다. galK와 xylB 유전자에 돌연변이가 모두 도입된 경우 각 유전자가 정상적으로 발현되지 않아 갈락토오스 또는 자일로오스의 대사가 불가능하고, 그 결과로 맥콘키 선택배지에서 흰색 콜로니를 형성한다. 반대로 돌연변이가 일어나지 않은 경우 갈락토오스 또는 자일로오스의 대사가 이루어지면서 대사산물에 의해 맥콘키 배지의 pH가 6.8 이하로 낮아져 적색 콜로니를 형성한다.That is, as shown in Figure 1B, galactose (0.5%), xylose (0.5%), and spectinomycin (75 μg mL -1 ) were added to McConkey's selection medium. If mutations are introduced into both the galK and xylB genes, each gene is not expressed normally, making galactose or xylose metabolism impossible, and as a result, white colonies are formed on McConkey's selective medium. Conversely, if no mutation occurs, metabolism of galactose or xylose occurs and the pH of the McConkey medium is lowered to 6.8 or lower due to metabolites, forming red colonies.
실시예 2. 다중 sgRNA 발현 플라스미드의 제작과 검증Example 2. Construction and validation of multiple sgRNA expression plasmids
본 발명자들은 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 대장균 유전체의 다중 표적 편집을 위해 서로 다른 표적 인식 서열을 가지는 2가지의 sgRNA를 동시에 발현하도록 플라스미드를 제작하였다. 두 가지 sgRNA의 스캐폴드(scaffold) 부분이 동일한 서열을 가지므로, 재조합으로 인한 sgRNA 유전자의 결실을 방지하기 위해 아래와 같은 방식으로 플라스미드 조각을 제작하였다. 첫번째 조각은 첫번째 sgRNA 유전자 및 spectinomycin 저항성 유전자와 두번째 sgRNA의 표적 인식 서열을 포함하도록 제작하였으며, 두번째 조각은 두번째 sgRNA 유전자 및 플라스미드의 복제원점과 첫번째 sgRNA의 표적 인식 서열을 포함하도록 제작하였다(도 2A). 이후 두 조각을 Gibson assembly 방법으로 ligation 시킨 후, 대장균 DH5α에 형질전환으로 삽입하고 spectinomycin이 포함된 LB 배지에 도말하였다. 상기의 경우 플라스미드의 복제원점과 spectinomycin 저항성 유전자를 동시에 가지고 발현되어야 해당 항생제가 포함된 LB 배지에서 콜로니가 생존할 수 있으므로, 동일한 2개의 sgRNA scaffold 서열 사이 상동성 재조합에 의한 다중 sgRNA 플라스미드의 변형을 방지할 수 있다. 이후 배지에서 자라난 colony를 Sanger 염기 서열 분석하여 다중 sgRNA 플라스미드의 제작을 확인하였다. The present inventors created a plasmid to simultaneously express two sgRNAs with different target recognition sequences for multi-target editing of the E. coli genome using the CRISPR-Cas9 system. Since the scaffold portions of the two sgRNAs have the same sequence, plasmid fragments were constructed in the following manner to prevent deletion of the sgRNA gene due to recombination. The first fragment was constructed to contain the first sgRNA gene, the spectinomycin resistance gene, and the target recognition sequence of the second sgRNA, and the second fragment was constructed to include the second sgRNA gene, the origin of replication of the plasmid, and the target recognition sequence of the first sgRNA (Figure 2A). . Afterwards, the two fragments were ligated using the Gibson assembly method, then transformed into E. coli DH5α and plated on LB medium containing spectinomycin. In the above case, the origin of replication of the plasmid and the spectinomycin resistance gene must be expressed simultaneously in order for the colony to survive in LB medium containing the corresponding antibiotic, preventing modification of multiple sgRNA plasmids due to homologous recombination between the same two sgRNA scaffold sequences. can do. Afterwards, colonies grown in the medium were subjected to Sanger base sequencing to confirm the production of multiple sgRNA plasmids.
제작된 다중 sgRNA 플라스미드에서 발현되는 각각의 sgRNA가 원활하게 Cas9와 복합체를 이루어서 표적 DNA를 절단할 수 있는지 확인하였다. galK 또는 xylB 유전자가 kanamycin 저항성 유전자로 치환되어 표적이 하나만 존재하는 대장균 세포와, 두 유전자가 모두 넉-아웃(knock-out)되어 표적 서열이 존재하지 않는 대장균 세포, 그리고 야생형(wild type) 대장균 세포를 대상으로 다중 sgRNA 플라스미드를 형질전환했을 때의 CFU/㎍ DNA를 확인하였다. 그 결과, 도 2B에 나타낸 바와 같이, 표적이 존재하지 않는 대장균 세포에서는 108 CFU/㎍ DNA 수준으로 세포가 사멸되지 않았고, 표적이 하나만 존재하는 대장균 세포에서는 104 CFU/㎍ DNA 수준으로 야생형에서와 유사한 수치를 보였다. 따라서, 제작된 다중 sgRNA 플라스미드에서 변형이 일어나지 않고 두 개의 sgRNA를 안정적으로 발현하고 있음이 확인되었다.It was confirmed whether each sgRNA expressed in the constructed multi-sgRNA plasmid could smoothly form a complex with Cas9 and cleave the target DNA. E. coli cells in which only one target exists because the galK or xylB gene is replaced with a kanamycin resistance gene, E. coli cells in which both genes are knocked out and no target sequence exists, and wild type E. coli cells. CFU/㎍ DNA when transformed with multiple sgRNA plasmids was confirmed. As a result, as shown in Figure 2B, in E. coli cells in which no target was present, the cells were not killed at the level of 10 8 CFU/μg DNA, and in E. coli cells in which only one target was present, the cells died at the level of 10 4 CFU/μg DNA in the wild type. showed similar figures. Therefore, it was confirmed that no modification occurred in the constructed multi-sgRNA plasmid and that two sgRNAs were stably expressed.
실시예 3. 고효율 다중 유전체 편집을 위한 올리고뉴클레오타이드 길이와 양의 최적화Example 3. Optimization of oligonucleotide length and amount for high-throughput multiplex genome editing
CRISPR-Cas9 음성 선택에 의한 galK, xylB의 편집효율은 맥콘키 선택배지에서의 전체 콜로니 수 대비 유전체 편집된 흰색 콜로니 수[백색 콜로니/(백색 콜로니 + 적색 콜로니)]로 계산하였다. 갈락토오스와 자일로오스를 모두 첨가한 맥콘키 선택배지에서 생존한 콜로니 수를 세고 대조군과 비교하여 플라스미드 형질전환 후에 생존된 세포 수를 계산하여 CRISPR-Cas9의 표적 DNA 절단이 효율적으로 작동하였는지 확인하였다.The editing efficiency of galK and xylB by CRISPR-Cas9 negative selection was calculated as the number of genome-edited white colonies [white colonies/(white colonies + red colonies)] compared to the total number of colonies on MacConkey selection medium. The number of surviving colonies was counted in MacConkey's selection medium containing both galactose and xylose, and compared to the control group, the number of surviving cells after plasmid transformation was calculated to confirm whether CRISPR-Cas9's target DNA cleavage worked efficiently.
돌연변이 유발 올리고뉴클레오타이드는 galK 유전자와 xylB 유전자에서 각각 단일, 이중, 삼중, 사중 올리고뉴클레오타이드가 치환되도록 제작되었다. 올리고뉴클레오타이드의 길이는 41 mer 또는 70 mer로 하였고, 양은 100pmol 또는 500pmol로 하여 2개의 서로 다른 위치의 표적에 대한 sgRNA를 발현하는 플라스미드와 각각의 표적에 대한 올리고뉴클레오타이드를 pHK463/HK1059에 전기 천공으로 함께 삽입하였다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 5′-말단이 절단되지 않은 다중 sgRNA가 발현되었을 때는 치환되는 뉴클레오타이드의 수가 4개일 때 최대 74% 효율로 편집이 가능했으나, 단일 뉴클레오타이드 치환된 콜로니는 얻을 수 없었다. 또한, 모든 경우 70 mer 500pmol 조건에서 가장 높은 효율로 유전체 편집을 할 수 있었다.Mutagenic oligonucleotides were constructed to produce single, double, triple, and quadruple oligonucleotide substitutions in the galK and xylB genes, respectively. The length of the oligonucleotide was 41 mer or 70 mer, the amount was 100 pmol or 500 pmol, and plasmids expressing sgRNA for targets at two different positions and oligonucleotides for each target were electroporated together in pHK463/HK1059. inserted. As a result, as shown in Figure 3, when multiple sgRNAs without cleaved 5'-ends were expressed, editing was possible with up to 74% efficiency when the number of substituted nucleotides was 4, but colonies with a single nucleotide substitution could not be obtained. There wasn't. Additionally, in all cases, genome editing was possible with the highest efficiency under the 70 mer 500 pmol condition.
실시예 4. 5′-말단 절단 sgRNA를 이용한 단일 뉴클레오타이드 다중 유전체 편집 Example 4. Single nucleotide multiplex genome editing using 5′-terminal truncated sgRNA
본 발명자들은 이전에 sgRNA의 5′-말단 절단으로 CRISPR-Cas9의 불일치 허용을 극복하고 단일 염기 수준의 편집에 성공한 바 있다(출원번호 10-2022-0027564). 유전자의 최소 단위는 개별 뉴클레오타이드이나, 유전체의 다중 편집에서는 표적에 대한 단일 뉴클레오타이드 수준의 편집의 효율이 매우 낮다. 이에, 본 발명자들은 이러한 문제를 해결하고 편집의 효율성을 향상시키기 위해, 5′-말단 절단(truncated) sgRNA(표적 DNA에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA의 5′-말단으로부터 2개의 뉴클레오타이드를 결실시킴)를 다중 유전체 편집에 적용하였다(도 4A).The present inventors have previously overcome the mismatch tolerance of CRISPR-Cas9 and succeeded in editing at the single base level by cutting the 5'-end of sgRNA (Application No. 10-2022-0027564). The minimum unit of a gene is an individual nucleotide, but in multiple editing of the genome, the efficiency of editing at the single nucleotide level for the target is very low. Therefore, to solve this problem and improve editing efficiency, the present inventors created a 5'-end truncated sgRNA (two nucleotides from the 5'-end of the guide RNA containing a nucleotide sequence complementary to the target DNA). deletion) was applied to multiple genome editing (Figure 4A).
돌연변이 유발 올리고뉴클레오타이드들은, galK 유전자의 504번 위치의 티민(Thymine)이 아데닌(Adenine)으로 치환되거나, 510번 위치에 구아닌(Guanine)이 삽입되거나, 509번 위치의 구아닌(Guanine)이 결실되도록, xylB 유전자의 652번 위치의 아데닌(Adenine)이 티민(Thymine)으로 치환되거나, 643번 위치에 아데닌(Adenine)이 삽입되거나, 643번 위치의 구아닌(Guanine)이 결실되도록 각각 제작되었다.Mutagenic oligonucleotides replace thymine at position 504 of the galK gene with adenine, insert guanine at position 510, or delete guanine at position 509. The xylB gene was constructed so that Adenine at position 652 was replaced with Thymine, Adenine was inserted at position 643, or Guanine at position 643 was deleted.
그 결과, 도 4B에 나타낸 바와 같이, 다중 sgRNA 발현 플라스미드만 세포에 도입했을 때는 donor DNA가 없기 때문에 흰색 콜로니를 관찰할 수 없었다. 반면, 다중 sgRNA 발현 플라스미드와 galK, xylB 각각에 대한 mutagenic oligo를 동시에 함께 세포에 전기천공법으로 도입한 경우에는 갈락토오스와 자일로오스 모두를 함유한 맥콘키 배지에서 다중 단일 뉴클레오타이드 치환 93%, 삽입 71%, 결실 85%의 비율로 흰색 콜로니가 각각 관찰되었다. 따라서 2개의 표적 유전자에서 단일 뉴클레오타이드 수준의 정확한 편집이 높은 효율로 이루어짐을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 4B, when only the multiple sgRNA expression plasmid was introduced into the cells, white colonies could not be observed because there was no donor DNA. On the other hand, when multiple sgRNA expression plasmids and mutagenic oligos for each of galK and xylB are simultaneously introduced into cells by electroporation, both galactose and xylose are added. White colonies were observed in McConkey medium containing multiple single nucleotide substitutions at a rate of 93%, insertion at 71%, and deletion at a rate of 85%. Therefore, it was confirmed that accurate editing at the single nucleotide level in the two target genes was achieved with high efficiency.
실시예 5. 3개의 표적 유전자에서 5′-말단 절단 sgRNA를 이용한 단일 뉴클레오타이드 다중 유전체 편집 Example 5. Single nucleotide multiplex genome editing using 5′-terminal truncated sgRNA in three target genes
본 발명자들은 추가적으로 표적 유전자가 3개일 때도 같은 방법을 활용하여 다중 sgRNA 발현 플라스미드를 제작하였다(도 5A). srlD 유전자를 3번째 표적 유전자로 하였으며, srlD 유전자를 편집하기 위한 단일 뉴클레오타이드 돌연변이 유발 올리고뉴클레오타이드는, 328번 위치의 사이토신(Cytosine)이 티민(Thymine)으로 치환되도록 하였다. 사중 뉴클레오타이드 치환을 위해서는 galK 유전자의 504-507번 서열이 ATCA로 바뀌도록, xylB 유전자의 649-553번 서열이 AACT로 바뀌도록, srlD 유전자의 323번-326번 서열이 GTTA로 치환되도록 하였다. 편집된 콜로니 및 편집되지 않은 콜로니들의 발효 표현형 관찰을 위해 맥콘키 배지에는 갈락토오스, 자일로오스, 솔비톨을 각각 0.5% 첨가하였다.The present inventors additionally used the same method to construct multiple sgRNA expression plasmids when there were three target genes (Figure 5A). The srlD gene was selected as the third target gene, and the single nucleotide mutagenesis oligonucleotide to edit the srlD gene was such that cytosine at position 328 was replaced with thymine. For quadruple nucleotide substitution, sequence 504-507 of the galK gene was replaced with ATCA, sequence 649-553 of the xylB gene was replaced with AACT, and sequence 323-326 of the srlD gene was replaced with GTTA. To observe the fermentation phenotype of edited and unedited colonies, 0.5% each of galactose, xylose, and sorbitol was added to McConkey medium.
그 결과, 도 5B 및 5C에 나타낸 바와 같이, 표적 유전자가 두 개일 때와 마찬가지로, 다중 sgRNA 발현 플라스미드만 세포에 도입했을 때는 donor DNA가 없기 때문에 흰색 콜로니를 관찰할 수 없었다. 반면, 다중 sgRNA 발현 플라스미드와 galK, xylB, srlD 각각에 대한 mutagenic oligo를 동시에 함께 세포에 전기천공법으로 도입한 경우에는 단일 뉴클레오타이드 치환의 경우 9%, 사중 뉴클레오타이드 치환의 경우 13%의 흰색 콜로니를 맥콘키 배지에서 관찰할 수 있었다. 3반복 실험 후 2개의 흰색 콜로니를 무작위로 골라 각각의 유전자들을 PCR 후 Sanger 염기 서열 분석하였으며, 세 유전자 모두 원하지 않는 돌연변이 없이 정교하게 편집되었음을 확인하였다.As a result, as shown in Figures 5B and 5C, when only the multiple sgRNA expression plasmid was introduced into the cells, like when there were two target genes, white colonies could not be observed because there was no donor DNA. On the other hand, when multiple sgRNA expression plasmids and mutagenic oligos for galK , It could be observed on Conky medium. After three repeated experiments, two white colonies were randomly selected and each gene was subjected to PCR and Sanger base sequencing. It was confirmed that all three genes were precisely edited without unwanted mutations.
실시예 6. 5′-말단 절단 sgRNA를 이용한 정교한 다중 유전체 편집 방법의 활용성 검증 Example 6. Verification of utility of sophisticated multiplex genome editing method using 5′ -terminal truncated sgRNA
본 발명자들은, 상기 실시예들에서 맥콘키 선택배지에 탄소원(갈락토오스, 자일로오스, 또는 솔비톨)을 첨가하여 표현형(흰색 콜로니 또는 적색 콜로니)의 비율을 관찰함으로써 편집 효율을 확인하였고, 흰색 콜로니들을 무작위로 골라 편집되었는지 염기 서열을 분석하여 확인하였다. 그러나, 실제 이러한 유전자 편집을 수행할 때는 표현형으로 편집된 콜로니를 구분해내기 어려운 경우가 대부분이다. In the above examples, the present inventors confirmed the editing efficiency by adding a carbon source (galactose, xylose, or sorbitol) to the McConkey selection medium and observing the ratio of phenotypes (white colonies or red colonies), and white colonies were selected. The nucleotide sequence was analyzed to confirm whether it was randomly selected and edited. However, when actually performing such gene editing, it is often difficult to distinguish phenotypically edited colonies.
이에, 본 발명자들은 cI과 ilvG 유전자 2개를 동시에 편집하고, LB 고체배지에서 무작위적으로 콜로니 10개를 골라 Sanger 염기 서열 분석을 통해 편집 효율을 확인함으로써 5′-말단 절단 sgRNA를 이용한 정교한 다중 유전체 편집 방법의 활용성을 검증하였다. 실험에 사용된 cI 유전자에는 cI 857 돌연변이가 있어서, 배양 온도가 37도 이상이 되면 세포가 lysis된다. 또한, 유전자 편집에 사용된 MG1655 균주에는 ilvG frameshift 돌연변이가 있어 발린(L-valine)에 대한 독성에 의해 일정 농도 이상으로 발린이 배지에 첨가되면 잘 자라지 않는다. 이 두 유전자를 편집하여 야생형으로 되돌리기 위해 돌연변이 유발 올리고뉴클레오타이드들은 각각 cI 유전자에서 199번 위치의 아데닌(Adenine)을 구아닌(Guanine)으로 치환하고, ilvG 유전자의 979번 위치에 A,T 두 개의 뉴클레오타이드가 삽입될 수 있도록 제작되었다.Therefore, the present inventors simultaneously edited two cI and ilvG genes, randomly selected 10 colonies from LB solid medium, and confirmed the editing efficiency through Sanger base sequence analysis, thereby creating a sophisticated multiplex genome using 5'-end truncated sgRNA. The usability of the editing method was verified. The cI gene used in the experiment has the cI 857 mutation, so cells lyse when the culture temperature exceeds 37 degrees. In addition, the MG1655 strain used for gene editing has an ilvG frameshift mutation and does not grow well when valine is added to the medium above a certain concentration due to the toxicity of valine (L-valine). To edit these two genes and return them to the wild type, mutagenic oligonucleotides replace adenine at position 199 in the cI gene with guanine, and two nucleotides A and T at position 979 in the ilvG gene. It is designed to be inserted.
그 결과, 도 6A에 나타낸 바과 같이, 10개 중 3개의 콜로니에서 다중 유전체 편집이 성공하였음을 Sanger 염기분석을 통해 확인하였다. 또한, 도 6B에 나타낸 바와 같이, 다중 유전자-편집된 콜로니는 발린에 의한 독성을 갖지 않으며 42℃ 배양 온도에서도 대조군 균주들과 유사한 수준으로 자라는 것이 확인되었다. M9 최소배지에는 탄소원으로 포도당(0.4%)이 첨가되었으며 필요에 의해 발린이 0.1mM 첨가되었다. As a result, as shown in Figure 6A, it was confirmed through Sanger base analysis that multiple genome editing was successful in 3 out of 10 colonies. Additionally, as shown in Figure 6B, it was confirmed that the multiple gene-edited colonies were not toxic by valine and grew at a similar level to the control strains even at a culture temperature of 42°C. Glucose (0.4%) was added as a carbon source to the M9 minimal medium, and 0.1mM of valine was added if necessary.
따라서, 본 발명은 기존 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 다중 유전체 편집에 비해 단일 염기 및 뉴클레오타이드 수준의 정교한 유전자 편집 효과를 달성한 바, 고속으로 세포 내의 유전체를 올바르게 수선하는 등 산업바이오, 농식품, 의약학적 활용에 매우 유용할 것으로 생각된다.Therefore, the present invention has achieved a sophisticated gene editing effect at the single base and nucleotide level compared to multiple genome editing using the existing CRISPR-Cas9 system, and can be used in industrial biotechnology, agricultural food, and medicine, including correctly repairing the genome within cells at high speed. I think it will be very useful.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As the specific parts of the present invention have been described in detail above, it is clear to those skilled in the art that these specific techniques are merely preferred embodiments and do not limit the scope of the present invention. will be. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
Claims (11)
상기 2 종 이상의 서로 다른 표적 DNA에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 2 종 이상의 서로 다른 가이드 RNA의 5′-말단으로부터 1개 내지 3개의 뉴클레오타이드를 결실시키는 단계를 포함하는, CRISPR-Cas9 시스템 기반 다중 유전자 편집 방법.
Multiple genes based on the CRISPR-Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-associated nuclease 9) system, which includes a donor nucleic acid molecule and guide RNA (gRNA) that bind complementary to two or more different target DNAs As an editing method,
CRISPR-Cas9 system-based multiplexing, comprising the step of deleting 1 to 3 nucleotides from the 5′-end of two or more different guide RNAs, comprising nucleotide sequences complementary to the two or more different target DNAs Gene editing methods.
상기 가이드 RNA는, 상기 표적 DNA에 상보적인 20 내지 18개의 연속적 뉴클레오타이드로 이루어진 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는,
CRISPR-Cas9 시스템 기반 다중 유전자 편집 방법.
According to paragraph 1,
The guide RNA is characterized in that it contains a region consisting of 20 to 18 consecutive nucleotides complementary to the target DNA.
Multiple gene editing method based on CRISPR-Cas9 system.
상기 가이드 RNA는 표적 DNA와 혼성화하는 crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA (transactivating crRNA)를 포함하는 이중 RNA (dual RNA), 또는 상기 crRNA 및 tracrRNA의 부분을 포함하고 표적 DNA와 혼성화하는 단일-사슬 가이드 RNA (sgRNA)인 것을 특징으로 하는,
CRISPR-Cas9 시스템 기반 다중 유전자 편집 방법.
According to paragraph 1,
The guide RNA is a dual RNA containing a crRNA (CRISPR RNA) and a tracrRNA (transactivating crRNA) that hybridizes with the target DNA, or a single-chain guide RNA that contains parts of the crRNA and tracrRNA and hybridizes with the target DNA. Characterized in that (sgRNA),
Multiple gene editing method based on CRISPR-Cas9 system.
상기 표적 DNA는 crRNA 또는 sgRNA와 상보적인 서열의 뉴클레오타이드 및 프로토스페이서-인접 모티프(protospacer-adjacent motif, PAM)를 포함하는 것을 특징으로 하는,
CRISPR-Cas9 시스템 기반 다중 유전자 편집 방법.
According to paragraph 3,
The target DNA is characterized in that it contains nucleotides of a sequence complementary to the crRNA or sgRNA and a protospacer-adjacent motif (PAM),
Multiple gene editing method based on CRISPR-Cas9 system.
상기 공여 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태인 것을 특징으로 하는,
CRISPR-Cas9 시스템 기반 다중 유전자 편집 방법.
According to paragraph 1,
Characterized in that the donor nucleic acid molecule is in single-stranded or double-stranded form,
Multiple gene editing method based on CRISPR-Cas9 system.
상기 공여 핵산 분자는 표적 DNA 상에 변형을 유발하는 것을 특징으로 하는,
CRISPR-Cas9 시스템 기반 다중 유전자 편집 방법.
According to paragraph 1,
Characterized in that the donor nucleic acid molecule causes modifications on the target DNA,
Multiple gene editing method based on CRISPR-Cas9 system.
상기 변형은 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 녹아웃(knockout), 녹인(knockin), 내인성 핵산 서열의 상동, 이종상동성(endogenous) 또는 이종 핵산 서열로의 치환, 또는 이의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는,
CRISPR-Cas9 시스템 기반 다중 유전자 편집 방법.
According to clause 5,
The modification includes substitution of one or more nucleotides, insertion of one or more nucleotides, deletion of one or more nucleotides, knockout, knockin, substitution of an endogenous nucleic acid sequence with a homologous, endogenous or heterologous nucleic acid sequence, or a combination thereof,
Multiple gene editing method based on CRISPR-Cas9 system.
상기 2 종 이상의 서로 다른 표적 DNA에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 2 종 이상의 서로 다른 가이드 RNA는 이의 5′-말단으로부터 2개의 뉴클레오타이드가 결실된 것을 특징으로 하는,
CRISPR-Cas9 시스템 기반 다중 유전자 편집 방법.
A composition for multiple gene editing based on the CRISPR-Cas9 system, comprising a donor nucleic acid molecule and a guide RNA (gRNA) that bind complementary to two or more different target DNA,
The two or more different guide RNAs comprising nucleotide sequences complementary to the two or more different target DNAs are characterized in that two nucleotides are deleted from their 5′-ends,
Multiple gene editing method based on CRISPR-Cas9 system.
상기 2 종 이상의 서로 다른 표적 DNA에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 2 종 이상의 서로 다른 가이드 RNA의 5′-말단으로부터 2개의 뉴클레오타이드를 결실시키는 단계를 포함하는, CRISPR-Cas9 시스템 기반 다중 유전자 편집 효율 증가 방법.
A method of increasing the efficiency of multiple gene editing based on the CRISPR-Cas9 system, which includes a donor nucleic acid molecule and guide RNA (gRNA) that binds complementary to two or more different target DNA,
Multiple gene editing efficiency based on the CRISPR-Cas9 system, comprising the step of deleting two nucleotides from the 5′-end of two or more different guide RNAs, comprising nucleotide sequences complementary to the two or more different target DNAs. How to increase.
(a) 2 종 이상의 서로 다른 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 상기 2 종 이상의 서로 다른 표적 DNA 상에 변형을 유발하는 공여 핵산 분자를 제작하는 단계;
(b) 상기 2 종 이상의 서로 다른 표적 DNA에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 2 종 이상의 서로 다른 가이드 RNA의 5′-말단으로부터 2개의 뉴클레오타이드가 결실된(truncated) 가이드 RNA를 제작하는 단계; 및
(c) 상기 (a) 단계의 공여 핵산 분자 및 상기 (b) 단계의 가이드 RNA를, 편집시키고자 하는 대상체에 형질전환시켜, 대상체의 표적 DNA를 편집하는 단계.
Method for producing a subject with multiple gene editing based on the CRISPR-Cas9 system, comprising the following steps:
(a) preparing a donor nucleic acid molecule that binds complementary to two or more different target DNAs and causes modifications in the two or more different target DNAs;
(b) constructing guide RNAs in which two nucleotides are truncated from the 5′-ends of two or more different guide RNAs, including nucleotide sequences complementary to the two or more different target DNAs; and
(c) Transforming the donor nucleic acid molecule of step (a) and the guide RNA of step (b) into a subject to be edited, thereby editing the target DNA of the subject.
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| Li Y, Lin Z, Huang C, Zhang Y, Wang Z, Tang Y-j, Chen T, Zhao X. 2015. Metabolic engineering of Escherichia coli using CRISPR-Cas9 meditated genome editing. Metab. Eng. 31: 13-21. |
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