KR20230155498A - 단일 통과 역류 정용여과를 위한 시스템 및 방법 - Google Patents
단일 통과 역류 정용여과를 위한 시스템 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
유체 공급물의 단일 통과, 역류 정용여과를 위한 시스템 및 방법이 제공된다. 상기 시스템과 방법은 생물학적 생성물에 대한 영향을 줄이고 정용여과 완충물의 사용을 줄이며 기존 시스템에 비해 장비 크기를 줄이도록 작동한다.
Description
관련 출원
본 출원은 2021년 3월 8일에 출원된 미국 가출원 번호 63/157,877의 우선권을 주장한다. 상기 출원의 전체 내용은 본원에 완전히 기술된 것처럼 참조로 본원에 포함된다.
기술분야
생물학적 생성물의 정용여과(diafiltration)를 위한 시스템 및 방법이 본원에 개시된다. 보다 구체적으로, 정용여과 시스템 및 방법은 생물학적 생성물에 대한 영향을 줄이고 정용여과 완충물의 사용을 줄이며 기존 시스템에 비해 장비 크기를 줄이도록 작동한다.
배경
정용여과는 순수한 용액을 얻기 위해 미세분자 투과성 필터를 사용하여 분자 크기에 따라 용액의 성분을 제거하거나 분리하는 것을 포함하는 희석 공정이다. 정용여과는 생물학적 생성물을 제형화하는 동안 적절한 완충물 조성을 달성하기 위해 완충물 교환을 위해 수행된다.
완충물 교환은 일반적으로 접선방향 유동 여과(TFF) 막과 전체 배치 용적(batch volume)을 수용할 만큼 큰 공급 탱크 사이의 재순환 루프를 사용하는 시스템에서 수행된다. TFF 막은 차단된 분자량보다 작은 성분이 필터를 통과하여 폐기물로 향하는 투과물 스트림으로 들어갈 수 있도록 하는 반면, 더 큰 성분은 보유물 스트림에 유지되어 공급 탱크로 다시 순환된다. 원하는 클리어런스 팩터(clearance factor)를 얻기 위해 지정된 정용여과 완충물의 필요한 용적은 완충물이 투과물을 통해 제거되는 것과 동일한 속도로 공급 탱크 또는 보유물 스트림에 첨가되어 공급 용기에서 일정한 용적을 유지한다.
일정한 용적의 배치 정용여과는 가장 일반적인 공정 구성이다. 배치 정용여과용 상업용 시스템에는 스키드에 수용된 수백 평방 미터의 막 면적이 포함될 수 있다. 제품 비용과 제조 유연성에 대한 우려가 높아지면서 연속 생물공정의 잠재력에 대한 관심도 높아지고 있다.
폴 코포레이션(Pall Corporation)의 미국 특허 번호 10,183,108에는 연속적인 완충물 교환을 위해 설계된 정용여과 시스템이 기술되어 있다. 이러한 스테이지는 지속적인 완충물 교환을 제공하지만, 시스템은 해당 배치 시스템과 동일한 수준의 완충물 교환을 달성하기 위해 더 큰 완충물 용적이 필요하며 멀티헤드 펌핑 시스템은 더 복잡하다.
루커-페지니(Rucker-Pezziniet) 등은 3스테이지 단일 통과 정용여과 시스템을 설명한다(Rucker-Pezzini 등, "완전 연속 mAb 정제 공정에 통합된 단일 통과 정용여과." 바이오기술 및 바이오엔지니어링(Biotechnology and Bioengineering). 2018; 115:1949-1957 참조).
남비아렛(Nambiaret) 등은 연속 정용여과를 위한 단일 통과 접선방향 유동 여과(SPTFF) 스테이지를 사용하는 것을 설명한다(남비아렛 등, "고부가가치 단백질의 제형화를 위한 역류 스테이지 정용여과" 바이오기술 및 바이오엔지니어링. 2018; 115:139-144 참조). 개별 스테이지는 완충물 요구량을 줄이기 위해 역류 구성으로 배열되었다.
생물학적 생성물에 대한 영향을 줄이고, 정용여과 완충물의 소비를 줄이며, 필요한 장비의 크기를 줄이는 개선된 정용여과 시스템 및 방법에 대한 필요성이 여전히 남아 있다.
본원에는 생물학적 생성물의 효율적인 정용여과를 위한 시스템 및 방법이 개시되어 있다. 시스템 및 방법은 연속 또는 배치 공정 뿐 아니라 재사용 가능 또는 일회용 처리도 지원할 수 있다.
본원에 개시된 시스템은 생물학적 생성물의 정용여과에 사용되는 기존 접선방향 유동 여과(TFF) 시스템에 비해 뚜렷한 장점을 제공한다. 특히, 실시예에 따른 시스템으로 수행되는 정용여과는 기존 TFF 시스템에서 약 40 내지 약 80회 펌프 통과에 비해 생물학적 생성물이 단 1회 펌프 통과를 경험하도록 작동한다. 이러한 방식으로 생물학적 생성물에 대한 잠재적인 영향이 감소된다.
본원에 개시된 시스템의 또 다른 이점은 정용여과 완충물의 사용이 실질적으로 감소한다는 것이다. 예컨대, 정용여과 완충물의 사용은 기존 TFF 시스템에 비해 약 60% 이상 감소할 수 있으며, 3스테이지 시스템을 사용하여 정용여과 완충물의 3여과량으로 정용여과의 8 여과량을 달성할 수 있다.
본원에 개시된 시스템의 또 다른 장점은 장비 크기가 기존 TFF 시스템에 비해 실질적으로 감소될 수 있다는 것이다. 일부 실시예에서, 시스템의 공급물 유속은 기존 TFF 시스템의 공급물 유속보다 약 40 내지 약 80배 더 낮다. 특정 실시예에서, 시스템은 기존 TFF 시스템에 비해 유동 경로와 접촉하는 일회용 생성물을 사용하여 더 쉽게 생산된다. 기존 TFF 시스템의 크기로 인해 일회용 건축 자재 사용이 배제될 수 있다.
본원에 기술된 시스템 및 방법은 일정한 보유물 농도에서 완충물 교환 또는 정용여과를 달성한다. 시스템 및 방법에 사용되는 TFF 카세트는 각각 정용여과 채널, 편평한 제1 여과막, 보유물 채널, 편평한 제2 여과막, 및 투과물/정용여과 완충물 수집 채널을 포함하며, 이는 (i) 상기 편평한 제1 여과막이 상기 정용여과 채널과 상기 보유물 채널을 서로로부터 경계를 정하고, (ii) 상기 편평한 제2 여과막이 상기 보유물 채널과 상기 투과물/정용여과 완충물 수집 채널을 서로로부터 경계를 정하고, (iii) 상기 정용여과 채널이 상기 정용여과 배지를 위한 적어도 하나의 입구에 유체 연결되며, (iv) 상기 보유물 채널이 상기 공급물 유체를 위한 적어도 하나의 입구 및 상기 보유물을 위한 적어도 하나의 출구에 유체 연결되고, 및 (v) 상기 투과물/정용여과 완충물 수집 채널이 상기 투과물/정용여과 완충물을 위한 적어도 하나의 출구에 유체 연결되도록 구성된다. 본원에 기술된 시스템 및 방법은 관심 분자(예: 단백질 또는 다른 생물학적 분자)를 포함하는 공급물 배지의 단계적 정용여과를 제공한다. 공급물 배지는 적절한 막을 가로지르는 정용여과 완충물에 대해 정용여과되며, 정용여과는 인접한 정용여과 카세트에서 여러 번(예: 2회, 3회, 4회 이상) 발생한다. 이러한 단계적 정용여과는 공급물 배지에 대한 정용여과 완충물의 역류 유동을 특징으로 한다. 제1 정용여과 카세트(예: 도 1에 표시된 가장 왼쪽 카세트)에서 시스템을 떠나는 투과물(및 정용여과 완충물, 남아 있는 경우)은 세척된 불순물, 이온 혼합물 등을 포함하는 반면, 최종 정용여과 카세트(예: 도 1에 표시된 가장 오른쪽 카세트) 이후의 시스템을 떠나는 보유물은 정용여과 완충물로 교환된 관심 분자를 포함한다.
제1 양태에서, 유체 공급물의 단일 통과 역류 정용여과 시스템이 제공되며, 상기 시스템은: 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 여과 스테이지들; 상기 여과 스테이지들에서 매니폴드들 사이의 유체 연통을 촉진하는 도관들; 제1 여과 유닛에 유체 공급물을 제공하기 위한 도관 및 적어도 하나의 공급물 펌프; 최종 여과 스테이지에 정용여과 완충물을 제공하기 위한 도관 및 하나 이상의 완충물 펌프; 후속 여과 스테이지에서 이전 여과 스테이지까지 투과물 및 정용여과 완충물을 제공하기 위한 여과 스테이지 당 도관 및 적어도 하나의 완충물 펌프; 및 상기 시스템으로부터 투과물(및 남아 있는 경우 정용여과 완충물)을 제거하기 위한 도관 및 여과물 펌프를 포함하고,
각각의 여과 스테이지는:
(i) 본원에 기술된 매니폴드 세그먼트 및 (ii) 하나 이상의 TFF 카세트를 포함하고; 여기서, 상기 매니폴드 세그먼트는: 유체 공급물 또는 보유물을 수용하여 상기 여과 스테이지 내로 운반하기 위한 제1 매니폴드(즉, 입구), 보유물을 수용하고 상기 여과 스테이지 밖으로 운반하기 위한 제2 매니폴드(즉, 출구), 투과물 및 정용여과 완충물을 수용하고 상기 여과 스테이지를 통해 운반하기 위한 제3 매니폴드(즉, 입구), 및 투과물 및 정용여과 완충물을 수용하고 상기 여과 스테이지 밖으로 운반하기 위한 제4 매니폴드(즉, 출구)를 포함하고; 상기 매니폴드 세그먼트는 본원에 기술된 상기 하나 이상의 TFF 카세트에 유체 연결되고;
상기 여과 스테이지들은 하나의 스테이지의 보유물이 다음 여과 스테이지를 위한 공급물로서 역할을 하도록, 후속 여과 스테이지에서 매니폴드 세그먼트의 제2 매니폴드를 매니폴드 세그먼트의 제1 매니폴드에 결합함으로써, 그리고 이전 여과 스테이지에서 매니폴드 세그먼트의 제4 매니폴드를 매니폴드 세그먼트의 제3 매니폴드에 결합함으로써 여과 스테이지들 사이에 유동 경로를 제공하기 위해 상기 매니폴드 세그먼트들을 통해 유체 연결되고;
상기 시스템의 제1 여과 스테이지는 공급물 펌프에 연결된 도관으로부터 유체 공급물을 수용하고; 및 최종(즉, 마지막) 여과 스테이지의 상기 제2 매니폴드는 상기 보유물이 상기 시스템을 떠나는 것을 허용하고 이전 여과 스테이지에 연결되지 않는 보유물 출구이다.
특정 실시예에서, 시스템은 2개의 여과 스테이지를 포함한다. 특정 실시예에서, 시스템은 3개의 여과 스테이지를 포함한다.
제2 양태에서, 본원에 설명된 시스템을 사용하여 유체 공급물을 필터링하는 방법이 제공된다.
제3 양태에서, 관심 생물학적 생성물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 방법은:
(I) 세포 배양에서 상기 관심 생물학적 생성물을 발현하는 진핵 세포(eukaryotic cell)를 배양하는 스텝;
(II) (a) 상기 관심 생물학적 생성물 및 (b) 하나 이상의 불순물 및/또는 완충물 성분을 포함하는 유체 공급물의 형태로 상기 세포 배양으로부터 상기 관심 생물학적 생성물을 수확하는 스텝;
(III) 상기 유체 공급물로부터 상기 관심 생물학적 생성물을 격리하도록 상기 관심 생물학적 생성물과 상기 하나 이상의 불순물 및/또는 완충물 성분을 포함하는 상기 유체 공급물을 정제하는 스텝; 및
(IV) 상기 관심 생물학적 생성물을 투여에 적합한 약학적으로 허용되는 제제로 선택적으로 제형화하는 스텝을 포함하고; 및
여기서 상기 방법은: (a) 단일 통과 역류 정용여과 시스템을 통해 상기 유체 공급물을 통과시키는 것, 및 (b) 분리된 컨테이너들에서 상기 시스템으로부터 투과물(및 남아 있는 경우, 정용여과 완충물) 및 보유물을 회수하는 것을 추가로 포함하고; 및
상기 시스템은 본원에 설명된 실시예에 따른 시스템이다.
본 기술의 추가적인 이점은 다음 도면과 상세한 설명으로부터 당업자에게 쉽게 명백해질 것이다. 도면과 설명은 본질적으로 예시적인 것으로 간주되며 제한적인 것으로 간주되지 않는다.
도 1은 예시적인 단일 경로 역류 정용여과 시스템을 도시하는 다이어그램이다.
도 2는 실시예에 따른 하나의 TFF 카세트를 갖는 시스템에 대한 여과량(완충물 유속/공급물 유속) 대 트레이서 클리어런스(tracer clearance)의 그래프이다.
도 3은 2스테이지 단일 통과 역류 정용여과 시스템의 정용여과 효율의 그래프이다.
도 4는 3스테이지 단일 통과 역류 정용여과 시스템에 대한 정용여과 완충물의 포도당 대 여과량의 자연 로그 클리어런스(natural log clearance)의 그래프이다. 수평선(9.2 자연 로그의 클리어런스)은 검출 한계를 표시한다.
도 2는 실시예에 따른 하나의 TFF 카세트를 갖는 시스템에 대한 여과량(완충물 유속/공급물 유속) 대 트레이서 클리어런스(tracer clearance)의 그래프이다.
도 3은 2스테이지 단일 통과 역류 정용여과 시스템의 정용여과 효율의 그래프이다.
도 4는 3스테이지 단일 통과 역류 정용여과 시스템에 대한 정용여과 완충물의 포도당 대 여과량의 자연 로그 클리어런스(natural log clearance)의 그래프이다. 수평선(9.2 자연 로그의 클리어런스)은 검출 한계를 표시한다.
다음의 상세한 설명에서는, 본 기술의 완전한 이해를 제공하기 위해 다수의 특정 세부 사항이 설명된다. 그러나 해당 기술이 이러한 특정 세부 사항 중 일부 없이 실행될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 그 외의 경우, 해당 기술이 모호해지는 것을 방지하기 위해 잘 알려진 구조나 기술은 자세하게 나타내지 않았다. 본 발명의 주어진 양태, 특징, 실시예 또는 매개변수에 대한 선호사항 및 옵션은 문맥상 달리 나타내지 않는 한, 모든 다른 양태, 특징, 실시예 및 매개변수에 대한 임의의 및 모든 선호사항 및 옵션과 조합하여 개시된 것으로 간주되어야 한다.
본 기술의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어 및 문구가 아래에 정의된다. 다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
정의:
본원에 사용된 문법 관사 "하나", "단수 표현"은 달리 표시되지 않는 한 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 포함하도록 의도된다. 따라서, 단수 용어는 기사의 문법적 대상 중 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 언급하기 위해 여기에서 사용된다. 예로서, "구성요소"는 하나 이상의 구성요소를 의미하며, 따라서 아마도 하나보다 많은 구성요소가 고려되고 설명된 실시예의 구현에 채용되거나 사용될 수 있다.
"약"이라는 용어는 일반적으로 특정 신뢰도(보통 68% C.I.에 대해 ±1σ) 내의 실제 값을 포함하는 값의 범위로 언급되는 측정의 약간의 오류를 의미한다. "약"이라는 용어는 정수 및 정수의 ±20% 값으로 기술될 수도 있다.
"생물학적 생성물(biologic product)"이라는 용어는 일반적으로 생물학적 공정을 통해 또는 기존 생물학적 생성물의 화학적 또는 촉매적 변형을 통해 생성된 관심 생성물을 의미한다. 생물학적 공정에는 세포 배양, 발효, 대사, 호흡 등이 포함된다. 관심 있는 생물학적 생성물에는 예컨대 항체, 항체 단편, 단백질, 호르몬, 백신, 천연 단백질 단편(예: 백신으로 사용되는 박테리아 독소 단편, 예컨대 파상풍 톡소이드), 융합 단백질 또는 펩타이드 접합체(예: 하위 스테이지 백신), 바이러스 유사 입자(VLP) 등이 있다.
"시스템"이라는 용어는 단일 통과 역류 정용여과 시스템을 의미한다. 이러한 시스템은 유체가 시스템을 한 번 통과하는 단일 통과 모드에서 작동하도록 구성된다.
"역류(countercurrent)"라는 용어는 특정 여과물이 생성된 상류 위치(스테이지)에서 여과물 스트림을 보유물 스트림으로 역공급하는 것을 의미한다. 따라서 역류는 여과물 스트림의 다스테이지 역공급을 의미할 수 있다.
"TFF 카세트"라는 용어는 일반적으로 생물학적 생성물을 함유하는 공급 용액을 보유물 및 투과물 스트림으로 분리하는 데 적합한 막을 포함하는 접선방향 유동 여과 장치를 의미한다. "TFF 카세트"는 여과막과 TFF 또는 정용여과 공정에 적합한 별도의 공급물/보유물 및 투과물 유동 채널을 포함하는 판-프레임 구조를 의미한다. 특히, 시스템 및 방법에 사용되는 TFF 카세트는 각각 정용여과 채널, 편평한 제1 여과막, 보유물 채널, 편평한 제2 여과막, 및 투과물/정용여과 완충물 수집 채널을 포함하며, 이는 편평한 제1 여과막이 정용여과 채널과 보유물 채널을 서로로부터 경계를 정하고, 평평한 제2 여과막이 보유물과 채널과 투과물/정용여과 완충물 수집 채널을 서로로부터 경계를 정하도록 배열된다. 정용여과 채널은 정용여과 배지용 적어도 하나의 입구에 유체 연결되며; 보유물 채널은 공급물 유체를 위한 적어도 하나의 입구 및 보유물을 위한 적어도 하나의 출구에 유체 연결되며; 및 투과물/정용여과 완충물 수집 채널은 투과물/정용여과 완충물을 위한 적어도 하나의 출구에 유체 연결된다.
"여과막"이라는 용어는 TFF 또는 정용여과 공정을 사용하여 공급물을 투과물 스트림과 보유물 스트림으로 분리하기 위한 선택적으로 투과성인 막을 의미한다. 예시적인 여과막에는 Sartorius에서 구입 가능한 것과 같은 Hydrosart® 막 및 폴리에테르술폰 막(PESU)이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 다른 여과막이 본원에 설명된 시스템 및 방법에 적합할 수 있으며 이러한 막은 안정한 중합체 조성, 넓은 pH 범위 및/또는 넓은 온도 범위를 특징으로 한다. 전형적으로, 본원에 기술된 여과막은 약 5 킬로달톤(kD) 내지 약 300 kD, 또는 약 0.0012 마이크론 내지 약 0.075 마이크론 범위의 기공 크기를 갖는다. 특정 실시예에서, 여과막은 약 20kD 내지 약 40kD, 또는 약 25kD 내지 약 35kD 범위의 기공 크기를 갖는다. 일 실시예에서, 여과막은 약 30 kD의 기공 크기 또는 평균 기공 크기를 갖는다. 일 실시예에서, 여과막은 항체 처리에 적합한 기공 크기를 갖는다.
"공급물" 또는 "공급물 스트림"이라는 용어는 여과될 여과 스테이지로 전달되는 용액을 의미한다. 여과를 위해 여과 스테이지로 전달되는 공급물은 예컨대 시스템 외부의 공급물 컨테이너(예: 용기, 탱크)로부터의 공급물이거나 동일한 시스템의 이전 여과 스테이지로부터의 보유물일 수 있다.
"여과"라는 용어는 일반적으로 공급물을 투과물과 보유물이라는 두 가지 스트림으로 분리하는 행위를 의미한다.
"투과물"이라는 용어는 막을 통해 투과된 공급물 부분을 의미한다.
"여과물"이라는 용어는 막을 통해 투과된 임의의 물질(투과물 및/또는 정용여과 완충물)을 의미한다.
"보유물"이라는 용어는 막에 의해 보유된 용액 부분을 의미한다. 특정 실시예에서, 예시적인 정용여과 공정 동안 보유물의 농후(즉, 농축)이 발생하지 않는다. 실시예에 따르면, 완충물 교환(정용여과)은 일정한 보유물 농도에서 달성된다.
"공급물 도관"은 공급원(예: 공급물 컨테이너)으로부터 여과 스테이지로 공급물을 전달하기 위한 도관을 의미한다.
"보유물 도관"은 보유물을 운반하기 위한 여과 조립체의 도관을 지칭한다.
"투과물 도관"은 투과물을 운반하기 위한 여과 조립체의 도관을 지칭한다.
"유동 경로"라는 표현은 시스템의 전부 또는 일부를 통해 유체(또는 액체)의 유동을 지원하는 채널을 의미한다. 유체는 공급물, 투과물, 정용여과 완충물 또는 보유물일 수 있다. 예컨대, 공급물 입구에서 보유물 출구까지 전체 시스템을 통과하는 유동 경로; 여과 스테이지 내의 유동 경로(예: TFF 카세트 및/또는 여과 스테이지의 매니폴드 세그먼트를 통과하는 유동 경로); 및 2개 이상의 인접한 여과 스테이지 사이의 유동 경로를 포함한다. 유동 경로는 원하는 유동을 지원하는 모든 토폴로지를 가질 수 있다(예: 직선형, 코일형, 지그재그 방식으로 배열). 유동 경로는 병렬 또는 직렬일 수 있다. 유동 경로는 시스템을 단일 통과하게 되는 경로를 나타낼 수도 있다.
"여과 스테이지"는 본원에 기술된 바와 같은 매니폴드 세그먼트 및 하나 이상의 TFF 카세트를 포함하는 시스템의 유닛을 지칭한다.
"매니폴드 세그먼트"는 공급물을 운반하기 위한 매니폴드, 정용여과 완충물을 여과 스테이지로 운반하기 위한 매니폴드, 보유물 및 투과물/정용여과 완충물을 여과 스테이지 밖으로 운반하기 위한 매니폴드를 포함하는 복수의 매니폴드(예: 입구 및 출구)를 갖는 블록을 지칭한다.
본원에서 시스템 유닛을 설명하기 위해 사용된 "복수"라는 용어는 2개 이상의 유닛을 의미한다.
"유체적으로 연결된"이라는 표현은 시스템의 2개 이상의 구성요소(예: 2개 이상의 매니폴드 세그먼트, 2개 이상의 TFF 카세트, 매니폴드 세그먼트 및 1개 이상의 TFF 카세트)를 의미하며, 이들은 유체가 하나의 구성요소에서 다른 구성요소로 흐를 수 있도록 하나 이상의 도관(예: 공급물 도관, 보유물 도관, 정용여과 완충물 도관, 투과물 및 정용여과 완충물 도관)에 의해 연결된다.
본원에 사용된 "처리"라는 용어는 생물학적 생성물을 함유하는 공급물을 여과하고 후속적으로 정용여과된 생성물을 회수하는 행위를 의미한다. 정용여과된 생성물은 보유물을 적절한 수집 용기로 보내 회수할 수 있다.
"순차 처리", "일련의 처리", "연속 작업" 및 "일련의 작업"이라는 표현은 시스템의 유체 또는 액체를 한 번에 하나의 여과 스테이지로 분배하여, 이전 유닛의 보유물 유동이 후속 인접 유닛의 공급 유동 역할을 하는 것을 의미한다.
"전환" 및 "통과당 전환(conversion per pass)"이라는 표현은 공급물 스트림 용적의 백분율로 표현되는 유동 채널을 통과하는 통과에서 막을 통해 투과하는 공급물 용적의 분율을 나타내기 위해 본원에서 사용된다.
"체류 시간"이라는 용어는 막 공급측의 체류 용적을 유속로 나눈 값을 의미한다.
본원에 사용된 "농도 팩터(concentration factor)"라는 용어는 생성물이 공급물 스트림에 농축된 양을 의미한다. 이는 용적 농도 팩터와 보유량에 따라 달라진다.
"정용여과(diafiltration)" 또는 "DF"라는 용어는 보유물이 동시에 용매로 희석되고 재여과되어 가용성 투과물 성분의 농도를 감소시키는 특수한 종류의 여과를 의미하는 데 사용된다.
"여과량(diavolume)"라는 용어는 정용여과 스텝 동안 수행된 세척 정도의 척도이다. 이는 보유물 용적과 비교하여 스테이지 동작에 도입된 정용여과 완충물의 용적을 기준으로 한다.
"하류" 또는 "하류 처리"라는 용어는 일반적으로 생물학적 생성물이 생성된 원래 용액으로부터 생물학적 생성물을 포획하고, 원하지 않는 성분 및 불순물로부터 생물학적 생성물을 정제하고, 병원체(예: 바이러스, 내독소)의 여과 또는 비활성화, 및 제형화 및 패키징을 하는 데 필요한 스텝들 중 일부 또는 전부를 의미한다.
"한외여과(ultrafiltration)"라는 용어는 생물학적 생성물을 유지하고 분자량 컷오프(molecular weight cutoff)보다 작은 완충물 성분을 필터로 통과시키기 위해 사용되는 여과를 의미한다. 생물학적 생성물을 유지하는 데 사용되는 한외여과 막은 일반적으로 약 5kD에서 약 300kD 사이의 분자량 컷오프를 갖다.
"폴리펩티드", "폴리펩티드 생성물", "단백질" 및 "단백질 생성물"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 당업계에 공지된 바와 같이 2개 이상의 아미노산, 예컨대, 연속적인 펩타이드 결합을 통해 연결된 적어도 하나의 아미노산 사슬로 이루어진 분자를 지칭한다. 일 실시예에서, "관심 단백질" 또는 "관심 폴리펩티드"는 숙주 세포(host cell)로 형질전환된 외인성 핵산 분자(exogenous nucleic acid molecule)에 의해 코딩된 단백질이고, 여기서 외인성 DNA는 아미노산의 서열을 결정한다. 다른 실시예에서, "관심 단백질"은 숙주 세포에 내인성인 핵산 분자에 의해 코딩되는 단백질이다.
본원에 사용된 "보유물"이라는 용어는 막에 의해 보유되는 특정 생물학적 생성물(예: 단백질)의 분획을 의미한다. 또한 겉보기 보유물 또는 고유 보유물로 계산할 수도 있다.
본원에 사용된 "일회용(single-use)"이라는 용어는 일회 사용에 적합한 물품과 이후 폐기에 적합한 물품뿐만 아니라, 본 발명에 따른 공정에서 단 한 번만 사용되고 공정에서 더 이상 사용되지 않는 재사용 가능한 물품을 의미한다. 이러한 물품은 "폐기용"으로도 지칭될 수 있다.
"스키드"라는 용어는 시스템을 쉽게 운반할 수 있도록 하는 프레임 내에 포함된 구성요소 시스템을 의미한다. 개별 스키드는 완전한 공정 시스템 또는 공정의 특정 양태를 수행하는 시스템을 포함할 수 있다. 여러 개의 스키드를 결합하여 더 큰 시스템이나 전체 휴대용 플랜트를 만들 수 있다.
직교류 여과(crossflow filtration)라고도 알려져 있는 "접선방향 유동 여과" 또는 "TFF"라는 용어는 공급물 스트림이 막 면에 평행하게 흐르는 공정을 지칭한다. 가해진 압력으로 인해 유동 스트림의 일부가 막(필터)를 통과하는 동안 나머지(보유물)는 그대로 유지된다.
"막횡단 압력(transmembrane pressure)" 또는 "TMP"라는 용어는 공급물로부터 막의 여과 측으로의 평균 적용 압력을 의미한다.
본원에서 사용되는 "항체"라는 용어는 특정 항원을 인식하고 이에 결합할 수 있는 단백질을 광범위하게 지칭한다. 용어는 구체적으로 단클론 항체, 다클론 항체, 이량체, 다량체, 다중특이적 항체(예: 이중특이적 항체), 항체 단편(예: Fab 단편, F(ab')2, Fv 단편 또는 절단된 항체로부터의 Fc 단편, scFv -Fc 단편, 미니바디, 디아바디 또는 scFv) 및 이중 및 단일 사슬 항체를 포함한다. 이 용어에는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 및 암 항원과 특이적으로 결합하는 항체도 포함된다. 또한, 이 용어에는 유전적으로 조작된 항체 유도체가 포함된다. 항체, 항체 단편 및 유전적으로 조작된 항체는 당업계에 공지된 방법에 의해 얻어질 수 있다.
본원에 사용된 "배양", "세포 배양" 및 "포유동물 세포 배양"이라는 용어는 생존 및/또는 세포 집단의 성장에 적합한 조건 하에 배지(medium)에서 유지되거나 성장되는 표면 부착 또는 현탁액의 세포 집단을 의미한다. 이러한 용어는 세포 집단과 집단이 부유하는 배지를 나타낼 수도 있다.
본원에서 사용된 "불순물"이라는 용어는 배양 공정 동안 생성된 바람직하지 않은 화학적 또는 생물학적 화합물을 지칭한다. 불순물에는 예컨대 에틸 알코올, 부틸 알코올, 젖산, 아세톤 에탄올, 기체 화합물, 펩타이드, 지질, 암모니아, 방향족 화합물, DNA 및 RNA 단편뿐만 아니라 배지 성분 및 생물학적 생성물의 분해 생성물이 포함될 수 있다.
본원에 사용된 "매질" 또는 "배지" 또는 "세포 배양 배지"라는 용어는 배양된 세포에 영양을 공급하는 영양분을 함유하는 용액을 지칭한다. 일반적으로 이러한 용액은 최소 성장 및/또는 생존을 위해 세포에 필요한 필수 및 비필수 아미노산, 비타민, 에너지원, 지질 및 미량 원소를 제공한다. 용액에는 호르몬 및 성장 팩터를 포함하여 최소 속도 이상으로 성장 및/또는 생존을 향상시키는 성분들이 포함될 수도 있다. 이 용액은 세포 생존과 증식에 최적인 pH와 염분 농도로 제조되었다.
정용여과 시스템
단일 통과 역류 정용여과 시스템 및 이 시스템을 사용하여 유체 공급물(예: 액체 공급물 또는 용액 공급물)을 여과하는 방법이 본원에 개시된다.
일 실시예에서, 시스템 및 방법은 유체 공급물의 정용여과에 관한 것이며, 여기서 유체 공급물 및 정용여과 완충물은 보유물을 정용여과하고 회수하기 위해 본원에 기술된 단일 통과 정용여과 시스템을 통해 흐른다.
정용여과 시스템은 보유물이 최종 여과 스테이지에 도달할 때까지 제1 여과 스테이지에서 후속 여과 스테이지로 연속적으로 이동하고 또한 투과물 및 정용여과 완충물이 이후 스테이지로부터 이전 스테이지로 역류로 흐르도록 유체 연결된 복수의 여과 스테이지를 포함한다. 각각의 "여과 스테이지"는 하나 이상의 TFF 카세트, 및 복수의 매니폴드(예: 입구 및 출구)를 갖는 블록을 포함하는 매니폴드 세그먼트를 포함한다. 특정 실시예에서, 하나 이상의 TFF 카세트는 매니폴드 세그먼트 내부에 있거나 매니폴드 세그먼트에 포함되어 있다. 특정 실시예에서, 시스템은 2개 이상의 여과 스테이지를 포함한다. 특정 실시예에서, 시스템은 3개 이상의 여과 스테이지를 포함한다. 특정 실시예에서, 시스템은 2, 3, 또는 4개의 스테이지를 포함한다. 일반적으로 시스템에서 사용할 수 있는 스테이지 수에는 특별한 제한이 없다. 그러나 시스템과 방법은 2, 3 또는 4 스테이지들에서 향상된 정용여과를 달성하도록 설계되었다. 특히, 시스템 및 방법은 생물학적 생성물에 일반적으로 요구되는 정용여과의 최소 8 여과량을 2, 3 또는 4 스테이지들에서 달성하도록 설계되었다. 특정 실시예에서, 시스템 및 방법은 2 스테이지들에서 정용여과의 8 여과량을 달성한다. 특정 실시예에서, 시스템 및 방법은 3 스테이지들에서 정용여과의 8 여과량을 달성한다. 특정 실시예에서, 시스템 및 방법은 4 스테이지들에서 정용여과의 8 여과량을 달성한다.
예시적인 시스템(10)이 도 1에 도시되어 있다. 도 1을 참조하면, 공급원(100)으로부터의 유체 공급물은 공급물 도관(101a, 101b)을 통해 제1 여과 스테이지("스테이지 1")로 흐르고, 제1 여과 스테이지의 공급 입구로 들어간다. 유체 공급물은 공급물 펌프(즉, "공급물 펌프")에 의해 공급물 도관을 통해 강제로 공급된다. 공급물은 TFF 카세트(200)를 통과하며, 이는 제1 여과 스테이지에 존재하는 투과물 및 정용여과 완충물로부터 보유물을 분리한다. 보유물은 공급물 도관(201)을 통해 후속(즉, 제2) 여과 스테이지로 흐른다. 투과물 및 정용여과 완충물은 투과물 및 정용여과 완충물 도관(302a, 302b)을 거쳐 제1 여과 스테이지로 흐르고 투과물 및 정용여과 완충물 입구로 흘러 들어간다. 투과물 및 정용여과 완충물은 완충물 펌프(일명 여과물 펌프)(즉, "여과물 펌프 2")에 의해 제2 여과 스테이지에서 제1 여과 스테이지로 투과물 및 정용여과 완충물 도관을 강제 통과하게 된다. 투과물(및 정용여과 완충물(남아 있는 경우))은 제1 여과 스테이지의 출구를 통해 제1 여과 스테이지에서 흘러나온다. 투과물(및 남아 있는 경우 정용여과 완충물)은 여과물 펌프("즉, "여과물 펌프 3")에 의해 투과물 또는 여과물 도관(202a, 202b)을 통과하게 된다. 투과물(및 정용여과 완충물, 남아 있는 경우)은 이에 따라 폐기될 수 있다.
도 1에 도시된 제2 여과 스테이지("스테이지 2")에서, 스테이지 1로부터의 보유물은 TFF 카세트(300)를 통과하며, 이는 제2 여과 스테이지에 존재하는 투과물 및 정용여과 완충물로부터 보유물을 분리한다. 스테이지 2로부터의 보유물은 공급물 도관(301)을 통해 후속(즉, 제3) 여과 스테이지로 흐른다. 투과물 및 정용여과 완충물은 투과물 및 정용여과 완충물 도관(402a, 402b)을 거쳐 투과물 입구로 제3 여과 스테이지로부터 제2 여과 스테이지로 흐른다. 투과물 및 정용여과 완충물은 완충물 펌프(즉, "여과물 펌프 1")에 의해 투과물 및 정용여과 완충물 도관을 통해 제3 여과 스테이지에서 제2 여과 스테이지로 강제 이동된다.
도 1에 도시된 바와 같이, 정용여과 완충물("정용여과 완충물")은 정용여과 완충물 공급원(500)으로부터 정용여과 완충물 도관(502a, 502b)을 통해 최종(즉, 제3) 여과 스테이지("스테이지 3")으로 흐르고 최종 여과 스테이지에 있는 정용여과 완충물 입구로 들어간다. 완충물 펌프(즉, "정용여과 완충물 펌프")는 정용여과 완충물을 정용여과 완충물 도관을 통해 최종 여과 스테이지로 강제 압송한다. 최종 여과 스테이지에서, 스테이지 2의 보유물은 TFF 카세트(400)를 통과하며, 이는 제3 여과 스테이지에 존재하는 투과물 및 정용여과 완충물로부터 보유물을 분리한다. 스테이지 3의 보유물은 보유물 출구 및 보유물 도관(401a, 401b)을 통해 시스템에서 배출된다. 그 후 보유물은 저장되거나 다른 하류 구성요소로 계속 진행되어 다른 공정을 거칠 수 있다. 선택적 밸브(403)를 사용하여 배압을 조절할 수 있다.
위에서 언급한 바와 같이, 각각의 여과 스테이지는 공급물(또는 보유물)을 수용하여 여과 스테이지로 운반하기 위한 제1 매니폴드(즉, 입구), 보유물을 수용하고 여과 스테이지 밖으로 운반하기 위한 제2 매니폴드(즉, 출구), 투과물 및/또는 정용여과 완충물을 수용하고 여과 스테이지를 통해 운반하기 위한 제3 매니폴드(즉, 입구), 및 투과물 및 정용여과 완충물을 수용하고 여과 스테이지 밖으로 운반하기 위한 제4 매니폴드(즉, 출구)를 포함하는 매니폴드 세그먼트를 포함한다. 매니폴드 세그먼트는 하나의 스테이지의 보유물이 다음 여과 스테이지를 위한 공급물로서 역할을 하도록, 후속 여과 스테이지에서 매니폴드 세그먼트의 제2 매니폴드를 매니폴드 세그먼트의 제1 매니폴드에 결합함으로써, 그리고 이전 여과 스테이지에서 매니폴드 세그먼트의 제4 매니폴드를 매니폴드 세그먼트의 제3 매니폴드에 결합함으로써 여과 스테이지들 사이에 유동 경로를 제공하기 위해 상기 매니폴드 세그먼트들을 통해 유체 연결된다. 각 스테이지의 매니폴드 세그먼트는 또한 매니폴드 세그먼트의 한쪽 또는 양쪽 면에 적층될 수 있는 하나 이상의 TFF 카세트에 유체 연결된다. 또한, 시스템은 공급물이 처음에 제1 여과 스테이지를 통해 시스템에 들어가고 보유물(즉, 생성물)이 최종 스테이지로부터 시스템에서 배출되도록 시스템의 제1 스테이지에 있는 공급물 입구와 시스템의 최종 스테이지에 보유물 출구를 포함한다.
본원에 기술된 시스템은 투과물 및 정용여과 완충물의 역류 유동을 이용한다. 즉, 투과물 및 정용여과 완충물의 유동 경로는 최종 여과 스테이지에서 제1 여과 스테이지 방향으로 도관 및 여과 스테이지를 통해 이동한다. 도 1은 예컨대 각 스테이지가 단일 TFF 카세트를 갖고 각 TFF 카세트가 단일 정용여과 채널, 단일 공급물/보유물 채널 및 단일 투과물/완충물 수집 채널을 한정하는 2개의 막을 갖는 단일 필터 셀을 구비하는 단일-3 스테이지 시스템을 도시한다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 정용여과 채널(들), 공급물/보유물 채널 및 투과물/완충물 수집 채널 사이의 적당한 조화가 이루어지기만 한다면, 더 복잡한 배열(예: 스테이지당 다중 TFF 카세트, TFF 카세트당 다중 필터 셀 등)도 사용될 수 있다.
카세트의 여과 영역은 임의의 적합한 여과 영역일 수 있다. 특정 실시예에서, 시스템은 카세트당 약 0.3 내지 약 80m2, 약 0.3 내지 약 3m2, 또는 약 10 내지 약 80m2 범위의 여과 면적을 갖는다. 일 실시예에서, 시스템은 카세트당 약 0.3 내지 약 3m2 범위의 여과 면적을 갖는다.
유체 공급물은 여과될 생물학적 생성물 또는 입자(예: 바이러스 입자, 숙주 세포 단백질)를 함유하는 임의의 액체(예: 생물학적 액체) 또는 용액일 수 있다. 예컨대, 유체 공급물은 생물학적 생성물(예: 재조합 단백질과 같은 표적 단백질) 및 하나 이상의 불순물(예: 비표적 단백질) 및/또는 완충물 성분을 함유할 수 있다. 일반적으로 시스템과 방법은 생물학적 생성물의 정제 공정이 끝날 때 또는 거의 끝나갈 때 발생하는 완충물 교환에 사용된다. 특정 실시예에서, 정용여과 동안 제거된 완충물 성분은 단백질이 아니다.
특정 실시예에서, 유체 공급물은 생물학적 생성물의 공급원(예: 단클론 항체(MAb)를 발현하는 하이브리도마 또는 다른 숙주 세포)로부터 획득된다. 특정 실시예에서, 유체 공급물 중의 생물학적 생성물은 크로마토그래피 스텝으로부터의 용출 완충물에 존재하는 MAb이다. 특정 실시예에서, 정용여과 완충물은 약물 물질에 대한 약물 완충물이다.
단일 통과 모드로 시스템을 작동하면, 재순환 없이 생물학적 생성물을 직접 통과하여 정용여과할 수 있으며, 이는 기계적 구성 요소를 제거하여 전체 시스템 크기를 줄이고 높은 전환 수준에서 연속 작동을 허용한다.
일반적으로, 본 발명의 시스템은 잘 알려져 있고 상업적으로 이용 가능한 표준, 기존 구성요소(예: TFF 시스템)를 사용하여 조립 및 작동될 수 있다. 표준 TFF 시스템 구성요소에는 예컨대 카세트 홀더, 공급물용 도관(예: 튜브, 배관), 보유물, 투과물 및 완충물, 하우징 또는 인클로저, 밸브, 개스킷, 펌프 스테이지(예: 펌프 하우징, 다이어프램 및 체크 밸브를 포함하는 펌프 스테이지), 하나 이상의 저장소(예: 공급물, 보유물, 투과물 및 완충물을 위한 공정 컨테이너) 및 압력 게이지가 포함된다.
TFF 카세트
예시적인 시스템 및 방법에 사용하기에 적합한 TFF 카세트는 여과막 및 공급물/보유물, 스테이지로 흐르는 투과물/정용여과 완충물, 및 TFF 또는 정용여과 공정에 적합한 스테이지 밖으로 흐르는 투과물/정용여과 완충물을 위한 별도의 채널을 포함하는 판-프레임 구조를 포함한다. 일반적으로, TFF 카세트는 복수의 인접한 직교류 여과 유닛(즉, 필터 셀)을 포함하며, 이는 일반적으로 여과될 공급물 유체 또는 보유물에 대한 보유물 채널, 2개의 평탄 여과막 층, 투과물/정용여과 완충물 흡입 채널 및 투과물/정용여과 완충물 수집 채널의 반복된 어레이로 이루어진다. 필터 셀의 투과물/정용여과 완충물 흡입 및 수집 채널은 추가 편평한 막 층에 의해 다음 필터 셀의 보유물 채널과 구분된다. 각각의 보유물 채널은 여과될 공급물 유체용 입구 및 보유물용 출구에 유체 전도(연통) 방식으로 연결되며; 각각의 투과물/정용여과 완충물 흡입 채널은 유체 전도 방식으로 투과물/정용여과 완충물의 입구에 연결되며; 각각의 투과물/정용여과 완충물 수집 채널은 유체 전도 방식으로 투과물/정용여과 완충물의 출구에 연결된다.
일 실시예에서, TFF 카세트는 정용여과 채널, 편평한 제1 여과막, 보유물 채널, 편평한 제2 여과막, 및 투과물/정용여과 완충물 수집 채널을 포함하며, 이는 (i) 상기 편평한 제1 여과막이 상기 정용여과 채널과 상기 보유물 채널을 서로로부터 경계를 정하고, (ii) 상기 편평한 제2 여과막이 상기 보유물 채널과 상기 투과물/정용여과 완충물 수집 채널을 서로로부터 경계를 정하고, (iii) 상기 정용여과 채널이 상기 정용여과 배지를 위한 적어도 하나의 입구에 유체 연결되며, (iv) 상기 보유물 채널이 상기 공급물 유체를 위한 적어도 하나의 입구 및 상기 보유물을 위한 적어도 하나의 출구에 유체 연결되고, 및 (v) 상기 투과물/정용여과 완충물 수집 채널이 상기 투과물/정용여과 완충물을 위한 적어도 하나의 출구에 유체 연결되도록 구성된다.
특정 실시예에서, 제1 여과막 및 제2 여과막은 각각의 기공 크기 또는 각각의 분자량 컷오프를 갖고; 제1 여과막의 기공 크기 또는 분자량 컷오프는 적어도 제2 여과막의 기공 크기 또는 분자량 컷오프만큼 크다.
특정 실시예에서, 제1 여과막은 정밀여과막 또는 한외여과막이고, 및/또는 제2 여과막은 한외여과막이다.
일 실시예에서, 제1 여과막은 30 kD 내지 1,500 kD 범위의 분자량 컷오프(MWCO)를 갖는다. 제2 여과막은 5kD 내지 1,500kD, 약 5kD 내지 약 300kD, 약 20kD 내지 약 40kD, 또는 약 25kD 내지 약 35kD 범위의 분자량 컷오프를 갖는다.
특정 실시예에서, 하나 이상의 TFF 카세트는 각각이 각각의 정용여과 채널, 각각의 제1 여과막, 각각의 보유물 채널, 각각의 제2 여과막, 및 각각의 투과물/정용여과 완충물 채널을 포함하는 복수의 적층된 어레이를 포함하여, 적층된 어레이가 결합되어 필터 카세트를 형성한다.
특정 실시예에서, 정용여과 채널 및/또는 보유물 채널의 자유 용적은 공급물 유체의 입구로부터 보유물 출구로의 유동 방향으로 감소한다.
특정 실시예에서, 보유물 채널의 자유 용적이 유동 방향으로 감소하도록 보유물 채널 내에 복수의 텍스타일 재료 층이 서로 포개어 배열된다.
특정 실시예에서, 하나 이상의 TFF 카세트의 여과막은 안정화된 셀룰로오스 유도체 중합체 여과막이다. 특정 실시예에서, TFF 카세트는 각각 하나 이상의 안정화된 셀룰로오스 유도체 중합체 여과막, 예컨대 생명공학 및 제약 산업에 최적화된 안정화된 셀룰로오스 유도체 중합체 막을 포함한다. 특정 실시예에서, 안정화된 셀룰로오스 유도체 중합체 막은 넓은 pH 및 온도 범위를 가지며 친수성이다. 특정 실시예에서, 안정화된 셀룰로오스 유도체 중합체 막은 단백질 결합 및 오염에 저항한다. 특정 실시예에서, 안정화된 셀룰로오스 유도체 중합체 막은 증기 또는 오토클레이브에 의해 멸균될 수 있다. 특정 실시예에서, 안정화된 셀룰로오스 유도체 중합체 막은 열의 존재 또는 부재 하에 NaOH를 사용하여 재생되거나 발열원소화될 수 있다. 특정 실시예에서, 하나 이상의 TFF 카세트는 유체 공급물로부터 다음을 제거하는 데 사용될 수 있다: CHO 및 BHK와 같은 포유동물 세포; E. Coli 및 Pasteurella C. diphtheria와 같은 박테리아; 효모; 및 세포 용해물 생성물. 특정 실시예에서, TFF 카세트의 여과막 또는 중합체막은 약 5kD 내지 약 300kD, 또는 약 0.0012미크론 내지 약 0.075미크론 범위의 기공 크기를 갖는다. 특정 실시예에서, 여과막은 약 20kD 내지 약 40kD, 또는 약 25kD 내지 약 35kD 범위의 기공 크기를 갖는다. 일 실시예에서, 여과막은 약 30 kD의 기공 크기를 갖는다. 일 실시예에서, 여과막은 항체 처리에 적합한 기공 크기를 갖는다.
특정 실시예에서, TFF 카세트의 여과막 또는 중합체막은 약 0.3 내지 약 3.0m2의 막 면적을 갖는다. 특정 실시예에서, TFF 카세트의 여과막 또는 중합체막은 약 10 내지 약 80m2의 여과 면적을 갖는다.
특정 실시예에서, 하나 이상의 TFF 카세트의 여과막은 폴리에테르술폰(PESU) 여과막이다. 특정 실시예에서, TFF 카세트는 각각 하나 이상의 PESU 중합체 여과막, 예컨대 생명공학 및 제약 산업에 최적화된 PESU 중합체 막을 포함한다. 특정 실시예에서, PESU 막은 넓은 pH 범위, 넓은 온도 범위를 가지며 친수성이다. 특정 실시예에서, PESU 막은 단백질 결합 및 오염에 저항한다. 특정 실시예에서, PESU 막은 증기 또는 오토클레이브에 의해 멸균될 수 있다. 특정 실시예에서, PESU 막은 열의 존재 또는 부재 하에 NaOH를 사용하여 재생되거나 발열원소화될 수 있다. 특정 실시예에서, TFF 카세트 내의 PESU 여과막은 약 0.05 ㎛내지 약 0.2 ㎛, 또는 약 0.1 ㎛내지 약 0.2 ㎛범위의 기공 크기를 갖는다.
특정 실시예에서, 각각의 정용여과 카세트는 동일한 기본 설계를 갖는다. 다른 실시예에서, 상이한 정용여과 카세트(예: 상이한 막 재료, 상이한 기공 크기 등)의 조합이 사용될 수 있다.
일 실시예에서, 유체 공급물의 단일 통과 역류 정용여과 시스템은:
2개 이상의 여과 스테이지들; 상기 여과 스테이지들에서 매니폴드들 사이의 유체 연통을 촉진하는 도관들; 제1 여과 유닛에 유체 공급물을 제공하기 위한 도관 및 적어도 하나의 공급물 펌프; 최종 여과 스테이지에 정용여과 완충물을 제공하기 위한 도관 및 하나 이상의 완충물 펌프; 후속 여과 스테이지에서 이전 여과 스테이지까지 투과물 및 정용여과 완충물을 제공하기 위한 여과 스테이지 당 도관 및 적어도 하나의 완충물 펌프; 및 상기 시스템으로부터 투과물(및 남아 있는 경우 정용여과 완충물)을 제거하기 위한 도관 및 여과물 펌프를 포함하고;
각각의 여과 스테이지는:
(i) 매니폴드 세그먼트 및 (ii) 하나 이상의 TFF 카세트를 포함하고; 여기서, 상기 매니폴드 세그먼트는: 유체 공급물 또는 보유물을 수용하여 상기 여과 스테이지 내로 운반하기 위한 제1 매니폴드(즉, 입구), 보유물을 수용하고 상기 여과 스테이지 밖으로 운반하기 위한 제2 매니폴드(즉, 출구), 투과물 및 정용여과 완충물을 수용하고 상기 여과 스테이지를 통해 운반하기 위한 제3 매니폴드(즉, 입구), 및 투과물 및 정용여과 완충물을 수용하고 상기 여과 스테이지 밖으로 운반하기 위한 제4 매니폴드(즉, 출구)를 포함하고; 상기 매니폴드 세그먼트는 상기 하나 이상의 TFF 카세트에 유체 연결되고;
상기 여과 스테이지들은 하나의 스테이지의 보유물이 다음 여과 스테이지를 위한 공급물로서 역할을 하도록, 후속 여과 스테이지에서 매니폴드 세그먼트의 제2 매니폴드를 매니폴드 세그먼트의 제1 매니폴드에 결합함으로써, 그리고 이전 여과 스테이지에서 매니폴드 세그먼트의 제4 매니폴드를 매니폴드 세그먼트의 제3 매니폴드에 결합함으로써 여과 스테이지들 사이에 유동 경로를 제공하기 위해 상기 매니폴드 세그먼트들을 통해 유체 연결되고;
상기 시스템의 제1 여과 스테이지는 공급물 펌프에 연결된 도관으로부터 유체 공급물을 수용하고; 및 최종(즉, 마지막) 여과 스테이지의 상기 제2 매니폴드는 상기 보유물이 상기 시스템을 떠나는 것을 허용하고 이전 여과 스테이지에 연결되지 않는 보유물 출구이다.
특정 실시예에서, 각 스테이지의 매니폴드 세그먼트는 또한 하나 이상의 TFF 카세트에 유체 연결된다. 특정 실시예에서, 하나 이상의 TFF 카세트는 매니폴드 세그먼트 내부에 있고 매니폴드 세그먼트의 한쪽 또는 양쪽 면에 적층되어 있다.
각각의 매니폴드 세그먼트는 세그먼트가 인접한 여과 스테이지의 매니폴드 세그먼트에 유체 연결될 수 있게 하는 매니폴드 구조 또는 배열을 갖는다. 매니폴드 세그먼트는 매니폴드 세그먼트에서 매니폴드 세그먼트로 직렬 유동 경로를 촉진하는 방식으로 연결된다. 예컨대, 인접한 매니폴드 세그먼트는 각 매니폴드 세그먼트의 제1 매니폴드가 인접한 매니폴드 세그먼트의 제2 매니폴드에 연결되도록 배열된다. 이러한 배열의 결과로, 한 스테이지의 보유물(매니폴드 세그먼트의 제2 매니폴드를 통해 스테이지에서 나옴)은 다음 스테이지(매니폴드 세그먼트의 제1 매니폴드에 수용됨)에 대한 공급물 역할을 한다. 매니폴드 세그먼트의 매니폴드는 여과 스테이지로부터 투과물 및 정용여과 완충물을 배출하고 일련의 이전 여과 스테이지에서 투과물 및 정용여과 완충물(즉, 투과물 및 정용여과 완충물의 역류 유동)을 수용하기 위한 별도의 경로를 제공한다.
특정 실시예에서, 인접한 매니폴드 세그먼트들 사이의 병렬 유동은 스테이지들 사이의 직렬 유동 경로를 촉진하기 위해 시일 또는 밸브(예: 위생 밸브)를 사용하여 방지된다. 예컨대, 공급물과 보유물을 운반하는 매니폴드에 시일 또는 밸브를 배치하여 유체가 인접한 매니폴드 세그먼트로 평행하게 흐르는 것을 차단할 수 있다. 병렬 유동을 방지하기 위해 시일 또는 밸브를 사용하는 것은 매니폴드 세그먼트가 완전히 천공되어 제1, 제2 및 제3 매니폴드 각각이 매니폴드 세그먼트를 통해 완전히 연장되는 경우 특히 바람직하다.
매니폴드에 배치하기에 적합한 시일(예: 기계적 시일)에는 링(예: O-링, 금속 링), 성형, 패킹, 시일재 및 개스킷이 포함되지만 이에 제한되지는 않다. 바람직하게는, 시일은 예컨대 개구를 폐쇄하는 개스킷 또는 개구와 매니폴드의 제1 통로 사이의 임의의 데드 용적을 폐쇄하기에 충분한 길이를 갖는 개스킷과 같은 개스킷이다. 바람직하게는, 개스킷은 유연하고 위생적이다(예: 흘리지 않고, 세척 가능하고, 위생적이며, 추출 가능량이 작다). 개스킷은 엘라스토머 재료 또는 금속(예: 금속 포일)을 포함할 수 있다.
시일 대신 밸브를 사용하면, 밸브가 열릴 때 매니폴드 세그먼트들 사이에 병렬 유동을 허용하고 밸브가 닫힐 때 직렬 유동을 허용함으로써 더 큰 작동 유연성을 제공한다. 매니폴드에 사용하기에 적합한 밸브에는 예컨대 핀치 밸브(예: 다이어프램 밸브)가 포함된다. 바람직하게는, 밸브는 전단력이 낮고 위생적이다(예: 적합성, 무독성, 위생성, 비탈출성). 본원에 사용된 "위생 밸브"는 밸브가 열려 있는지 닫혀 있는지에 관계없이 멸균 연결을 유지할 수 있는 밸브이다. 일반적으로 위생 밸브는 호환성이 있고, 무독성이며, 살균 가능하고, 비탈출성이다.
각 여과 스테이지의 매니폴드 세그먼트는 또한 본원에 설명된 바와 같이 하나 이상의 TFF 카세트에 유체 연결된다. 예컨대, 매니폴드 세그먼트는 매니폴드 세그먼트의 제1 매니폴드 또는 공급 매니폴드로부터 복수의 TFF 카세트를 통해 연장되는 유동 채널, 및 복수의 TFF를 통해 매니폴드 세그먼트의 제2 채널 또는 보유물 채널로 다시 연장되는 보유물 유동 채널을 통해 TFF 카세트에 유체 연결될 수 있다.
TFF 카세트는 매니폴드 세그먼트의 한 면 또는 양면에 위치(예: 적층)될 수 있다. 일반적으로 각 여과 스테이지는 여과 스테이지당 총 약 20m2의 면적에 대해 매니폴드 세그먼트의 각 면에서 최대 약 10m2의 여과막 면적을 수용할 수 있다. 일반적으로 매니폴드 세그먼트의 각 측면에 적층될 수 있는 카세트의 수는 특정 카세트의 막 면적에 따라 달라진다. 특정 실시예에서, 시스템의 여과 스테이지 각각은 동일한 수와 배열의 TFF 카세트를 포함한다.
일 실시예에서, TFF 카세트(예: 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 TFF 카세트)는 매니폴드 세그먼트의 양면에 위치한다. 다른 실시예에서, TFF 카세트(예: 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 TFF 카세트)는 매니폴드 세그먼트의 한 면에만 위치한다. TFF 카세트가 매니폴드 세그먼트의 양면에 위치하는 경우, 매니폴드 세그먼트의 각 면에 있는 TFF 카세트의 수는 다르거나 동일할 수 있다. 특정 실시예에서, 매니폴드 세그먼트의 각 면에 있는 TFF 카세트의 총 개수는 동일하다.
특정 실시예에서, 시스템은 병렬 처리를 위해 구성된 카세트를 갖는 하나 이상의 여과 스테이지, 및 직렬 처리를 위해 구성된(예: 밸브, 개스킷 또는 전환기 플레이트를 사용하는) 카세트를 갖는 하나 이상의 여과 스테이지를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 병렬 처리를 위해 구성된 카세트를 갖는 여과 스테이지는 시스템에서 직렬 처리를 위해 구성된 카세트를 갖는 여과 스테이지보다 앞에 온다. 특정 실시예에서, 시스템의 모든 여과 스테이지는 직렬 처리를 위해 배열된 카세트를 갖는 최종 또는 마지막 여과 스테이지를 제외하고 병렬 처리를 위해 구성된 카세트를 갖는다.
엔드 플레이트 또는 카세트 홀더는 일반적으로 여과 스테이지에서 TFF 카세트를 유지하거나 밀봉하는 데 사용된다. 엔드 플레이트와 카세트 홀더는 특정 카세트와 함께 사용하도록 장착할 수 있다.
본 발명의 시스템은 전형적으로 공급물 입구 및 보유물 출구를 포함한다. 일반적으로 공급물 입구는 시스템의 제1 여과 스테이지에 위치하며 일 단부는 공급물 탱크에 연결된 도관(예: 파이프, 튜브)에 연결되고 다른 단부는 시스템에 공급되는 공급물을 받기 위한 제1 스테이지의 매니폴드 세그먼트에 있는 제1 매니폴드에 연결된다. 보유물 출구는 일반적으로 시스템의 마지막 또는 최종 여과 스테이지에 위치하며, 일 단부는 최종 스테이지의 매니폴드 세그먼트에 있는 제2 매니폴드에 연결되고 다른 단부는 보유물 컨테이너에 연결된 도관(예: 파이프, 채널)에 연결된다.
본원에 기술된 시스템은 정용여과 공정을 수행하는데 유용한 하나 이상의 추가 구성요소를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 하나 이상의 추가 구성요소는 당업계에 공지되어 있는 다음 예들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 하나 이상의 샘플링 포트, T-라인(예: 인라인 완충물 추가의 경우), 압력 센서, 압력 센서용 다이어프램, 시스템의 밸브가 열려 있는지 닫혀 있는지 여부를 나타내는 밸브 센서 및 유량계. 특정 실시예에서, 시스템은 시스템의 하나 이상의 위치에 샘플링 포트(예: 위생 샘플링 포트)를 포함한다. 예컨대, 샘플링 포트는 보유물 라인, 투과/정용여과 완충물 라인 또는 둘 다의 단부에 포함될 수 있다. 일반적으로 샘플링 포트는 여과 스테이지의 매니폴드 세그먼트에 위치한다. 일 실시예에서, 시스템에는 전환기 플레이트가 부족하다.
일부 실시예에서, 시스템의 하나 이상의 구성요소는 일회용일 수 있다.
특정 실시예에서, 시스템은 정용여과 완충물 라인 상의 유량계를 포함한다. 특정 실시예에서, 시스템은 여과물 라인에 유량계를 포함한다. 특정 실시예에서, 시스템은 생성물 공급 라인에 유량계를 포함한다. 특정 실시예에서, 시스템은 보유물 라인에 유량계를 포함한다. 특정 실시예에서, 시스템은 생성물과 정용여과 완충물 및/또는 여과물 사이의 상대 유속을 제어하는 자동화를 포함한다.
일반적으로, 모든 완충물(또는 여과물) 펌프는 동일한 유속으로 작동하도록 (기계적으로 또는 자동화를 통해) 제어된다. 이는 전체 유속을 변화시키는 능력을 유지하면서 각 펌프를 통해 동일한 유속을 달성하기 위해 다중 헤드 연동 펌프를 사용하여 실험실 규모에서 달성할 수 있다.
방법
본원에는 본원에 기술된 단일 통과 역류 정용여과 시스템을 사용하여 유체 공급물을 여과하는 방법이 개시되어 있다.
일 실시예에서, 방법은 유체 공급물의 정용여과에 관한 것이며, 여기서 유체 공급물 및 정용여과 완충물은 유체 공급물의 보유물 및 투과물 부분을 분리하고 회수하기 위해 본원에 기술된 단일 통과 정용여과 시스템을 통해 흐른다.
일 실시예에서, 방법은 단일 통과 역류 정용여과 시스템을 통해 유체 공급물을 통과시키는 것 및 별도의 컨테이너에 있는 시스템으로부터 투과물(및 정용여과 완충물, 남아 있는 경우) 및 보유물을 회수하는 것을 포함한다. 특정 실시예에서, 투과물/완충물 및 보유물은 시스템을 통해 재순환되지 않는다(즉, 방법은 시스템을 통한 단일 통과로 발생한다).
본원에 기술된 방법은 정용여과(예: 유체 공급물에서 염 또는 용매의 농도를 제거하거나 낮추기 위해, 또는 완충물 교환을 달성하기 위해)를 수행하는 것을 포함한다. 특정 실시예에서, 정용여과는 정용여과 용적을 감소시키기 위해 유체 공급물을 농축한 다음, 정용여과 용액을 첨가하여 공급물을 초기 용적으로 복원함으로써 수행되며, 이 공정은 당업계에 불연속 또는 일괄 정용여과로 공지되어 있다. 다른 실시예에서, 정용여과는 정용여과 용액을 보유물에 첨가하여 정용여과 용적을 증가시킨 다음 샘플을 농축하여 원래 용적으로 복원함으로써 수행된다. 또 다른 실시예에서, 정용여과는 투과물이 시스템으로부터 제거되는 것과 동일한 속도로 여과되지 않은 공급물에 정용여과 용액을 첨가함으로써 수행되며, 이 공정은 당업계에 연속적 또는 일정한 용적의 정용여과로 공지되어 있다. 적합한 정용여과 용액은 잘 알려져 있으며, 예컨대 물 및 다양한 수성 정용여과 완충물 용액을 포함한다.
정용여과를 수행하기 위해, 시스템은 정용여과 용액을 위한 저장소 또는 컨테이너, 및 정용여과 용액 컨테이너로부터 최종 여과 스테이지까지 정용여과 용액을 운반하기 위한 하나 이상의 도관을 포함할 수 있다.
정용여과 공정의 일부로서 극단적인 농축 및 인라인 희석을 피하기 위해, 보유물 섹션의 유동을 초기 공급물과 동일한 유동으로 유지하도록 정용여과물을 여과 조립체로 펌핑하는 것이 바람직하다. 이를 위해서는 정용여과 완충물 추가 속도와 투과물 제거 속도를 일치시켜야 한다. 각 펌프는 펌핑 속도가 밀접하게 일치하므로 이 공정의 균형이 유지되고 효율적인 완충물 교환이 유지된다.
특정 실시예에서, 배치 TFF에 사용되는 적어도 8 여과량과 동등한 정용여과를 달성하기 위해 2스테이지 시스템이 사용될 수 있다.
당업계에 공지된 관심 생물학적 생성물의 제조 또는 생산 방법은 본원에 기술된 유체 공급물을 여과하는 시스템 및 방법과 조합하여 사용될 수 있다. 예컨대, 당업자는 발효를 사용하여 재조합 단백질과 같은 생물학적 생성물을 제조 또는 생산하는 방법을 알고 있다. 특정 실시예에서, 관심 생물학적 생성물의 생산은 세포 배양에서 관심 생물학적 생성물을 발현하는 진핵 세포를 배양하는 것을 포함한다. 세포 배양에서 관심 생물학적 생성물을 발현하는 진핵 세포를 배양하는 것은 진핵 세포를 성장 및/또는 단백질 생산/발현을 허용하는 적합한 배지 및 조건 하에서 유지하는 것을 포함할 수 있다. 관심 생물학적 생성물은 유가식 또는 연속 세포 배양에 의해 생산될 수 있다. 따라서, 진핵 세포는 유가식 또는 연속 세포 배양, 바람직하게는 연속 세포 배양으로 배양될 수 있다.
특정 실시예에서, 진핵 숙주 세포는 효모 세포이다. 일 실시예에서, 진핵 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 본원에 사용된 포유동물 세포는 분비된 재조합 치료 단백질의 생산에 적합한 포유동물 세포주이며, 따라서 "숙주 세포"로도 지칭될 수 있다. 특정 실시예에서, 포유동물 세포는 햄스터 세포와 같은 설치류 세포이다. 포유동물 세포는 분리된 세포 또는 세포주이다. 특정 실시예에서, 포유동물 세포는 형질전환 및/또는 불멸화 세포주이다. 특정 실시예에서, 포유동물 세포는 세포 배양에서 연속 계대(serial passage)에 적응되고, 일차 비형질전환 세포 또는 기관 구조의 일부인 세포를 포함하지 않는다. 특정 실시예에서, 포유동물 세포는 BHK21, BHK TK-, Jurkat 세포, 293 세포, HeLa 세포, CV-1 세포, 3T3 세포, CHO, CHO-K1, CHO-DXB11(CHO-DUKX 또는 DuxB11로도 지칭됨), CHO-S 세포 또는 CHO-DG44 세포 또는 이러한 세포주의 유도체/후손이다. 특정 실시예에서, 포유동물 세포는 CHO-DG44, CHO-K1 및 BHK21과 같은 CHO 세포이고, 더욱 바람직하게는 CHO-DG44 및 CHO-K1 세포이다. 특정 실시예에서, 포유동물 세포는 CHO-DG44 세포이다. 포유류 세포, 특히 CHO-DG44 및 CHO-K1 세포의 글루타민 합성효소(GS) 결핍 유도체도 포함된다. 일 실시예에서, 포유동물 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예컨대 CHO-DG44 세포, CHO-K1 세포, CHO DXB11 세포, CHO-S 세포, CHO GS 결핍 세포 또는 유도체이다.
특정 실시예에서, 숙주 세포는 이종 단백질, 예컨대 치료 단백질, 예컨대 재조합 분비 치료 단백질을 코딩하는 하나 이상의 발현 카세트(들)를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 숙주 세포는 또한 NS0 및 Sp2/0 세포와 같은 쥐 골수종 세포와 같은 쥐과 세포 또는 임의의 이러한 세포주의 유도체/후손일 수 있다.
관심 생물학적 생성물 또는 재조합 단백질의 발현은 관심 생물학적 생성물 또는 재조합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 세포에서 발생하며, 이는 전환 후 변형을 포함하여 단백질 서열로 전사되고 전환되어 관심 생물학적 생성물 또는 세포 배양 내 재조합 단백질을 생성한다.
관심 생물학적 생성물을 제조하는 방법이 본원에 개시되고, 상기 방법은:
(I) 세포 배양에서 관심 생물학적 생성물을 발현하는 진핵 세포를 배양하는 스텝;
(II) (a) 관심 생물학적 생성물 및 (b) 하나 이상의 불순물 및/또는 완충물 성분을 포함하는 유체 공급물의 형태로 세포 배양물로부터 관심 생물학적 생성물을 수확하는 스텝;
(III) 관심 생물학적 생성물과 하나 이상의 불순물 및/또는 완충물 성분을 포함하는 유체 공급물을 정제하여 유체 공급물로부터 관심 생물학적 생성물을 분리하는 스텝; 및
(IV) 임의로 관심 생물학적 생성물을 투여에 적합한 약학적으로 허용되는 제제로 제형화하는 스텝을 포함하고;
상기 방법은 (a) 단일 통과 역류 정용여과 시스템을 통해 유체 공급물을 통과시키는 스텝, 및 (b) 별도의 컨테이너에 있는 시스템으로부터 투과물(및 정용여과 완충물, 남아 있는 경우) 및 보유물을 회수하는 스텝을 추가로 포함하고;
여기서 시스템은 본원에 설명된 실시예에 따른 시스템이다.
특정 실시예에서, 관심 생물학적 생성물은 재조합 단백질이다. 특정 실시예에서, 세포 배양에서 관심 생물학적 생성물을 발현하는 진핵 세포를 배양하는 스텝은 유가식 세포 배양에서 일어난다. 특정 실시예에서, 세포 배양에서 관심 생물학적 생성물을 발현하는 진핵 세포를 배양하는 스텝은 연속 세포 배양에서 일어난다.
다음 예는 예시 목적으로만 제시되며 제한하려는 의도는 없다.
예
예 1.
다중 완충물(또는 여과물) 펌프의 유동은 다중 헤드 연동 펌프를 사용하여 제어되어 전체 유속을 변경하는 능력을 유지하면서 각 펌프를 통해 동일한 유속을 달성했다. 실험실 데이터는 Boehringer Ingelheim Fremont Incorporated(BIFI)의 0.33m2 Sartopure® 30kd Hydrosart® TFF 카세트와 항체 용액을 사용하여 생성되었다. 단일 카세트가 일정 범위의 유속으로 작동되었다. 표 1은 각 실험에 대한 공급물, 보유물, 투과물 및 정용여과 완충물에 해당하는 유속을 보여준다.
| 목표 DF 비율 | 입구 비율 | 출구 비율 | 공급물(mL/min) | 보유물 (mL/min) | 투과물 (mL/min) | 완충물 (mL/min) | 입구 비율/출구 비율 |
| 1.5 | 1.255 | 1.277 | 47 | 47 | 60 | 59 | 0.983 |
| 2 | 1.935 | 1.735 | 46 | 49 | 85 | 89 | 1.115 |
| 2.5 | 2.353 | 2.250 | 51 | 56 | 126 | 120 | 1.046 |
| 3 | 2.860 | 2.574 | 50 | 54 | 139 | 143 | 1.111 |
| 3.5 | 3.056 | 2.780 | 54 | 59 | 164 | 165 | 1.099 |
| 4 | 4.103 | 3.548 | 29 | 31 | 110 | 119 | 1.156 |
| 4.5 | 4.500 | 4.500 | 30 | 30 | 135 | 135 | 1.000 |
| 5 | 4.028 | 3.919 | 36 | 37 | 145 | 145 | 1.028 |
공급물은 약 6 g/L 및 153g/L 포도당의 단클론 항체의 항체 용액이었다. 보유물 샘플의 포도당 농도는 Cedex 세포 계수기 Bio HT 포도당 시험을 위한 GLC3D 및 GLC3B 방법을 사용하여 측정되었다. 표 2는 항체 용액 내 포도당 희석 팩터와 Bio HT 포도당 시험 방법에 의한 포도당 농도 결정 사이의 관계를 보여준다.
| 라벨/샘플 | 희석 | 스파이크 단백질 | 정용여과 완충물 | 예상 농도 | 실제 농도 | % 차이 | ||
| (μL) | (μL) | (g/L) | (mmol/L) | (g/L) | (mmol/L) | |||
| A / 0 DV | 1.00 | 15,000 | 0 | 153.32 | 851.07 | 153.32 | 851.07 | 0 |
| B / 1 DV | 2.73 | 5,500 | 9,500 | 56.22 | 312.06 | 53.29 | 295.81 | 5 |
| C / 2 DV | 7.50 | 2,000 | 13,000 | 20.44 | 113.48 | 16.77 | 93.09 | 20 |
| D / 3 DV | 20.00 | 750 | 14,250 | 7.67 | 42.55 | 7.20 | 39.97 | 6 |
| E / 4 DV | 50.00 | 300 | 14,700 | 3.07 | 17.02 | 2.94 | 16.29 | 4 |
| F / 5 DV | 150.00 | 100 | 14,900 | 1.02 | 5.67 | 0.99 | 5.47 | 4 |
| G / 6 DV | 376.00 | 40 | 15,000 | 0.41 | 2.26 | 0.42 | 2.30 | -2 |
| H / 7 DV | 1,001.00 | 15 | 15,000 | 0.15 | 0.85 | 0.15 | 0.83 | 2 |
| I /8 DV | 3,001.00 | 5 | 15,000 | 0.05 | 0.28 | 0.06 | 0.33 | -16 |
| J /9 DV | 7,501.00 | 2 | 15,000 | 0.02 | 0.11 | 0.02 | 0.11 | 2 |
| K /10 DV | 15,001.00 | 1 | 15,000 | 0.01 | 0.06 | 0.00 | 0.00 | 200 |
데이터는 시험 방법이 153g/L의 포도당 농도로 시작할 때 정용여과 완충물의 9 여과량을 사용한 정용여과와 동등한 포도당 농도를 정확하게 측정할 수 있다는 것을 뒷받침한다. 도 2는 정용여과 완충물 유속과 생성물 공급물 유속(공급물과 보유물 유속은 동일함)의 비율과 보유물 스트림에서 트레이서(tracer)의 클리어런스 사이의 관계를 보여준다. 도 2는 사용된 정용여과 완충물의 여과량 수(정용여과 완충물 유속/공급물 유속)에 대한 포도당 농도의 자연 로그 감소로 표현된 포도당의 예상 클리어런스를 보여준다. 표시된 일 대 일 선형 관계는 막 길이를 따라 정용여과 완충물이 균일하게 도입되고 정용여과 완충물과 보유물이 완벽하게 혼합되는 경우 예상된다. 실험 데이터는 정용여과 완충물 유속이 공급물 유속의 약 3배 미만일 때 클리어런스가 이러한 예상 값보다 높고, 정용여과 완충물 유속 대 공급물 유속 비율이 실험 유속에서 작동할 경우 약 3.5:1보다 높을 때 클리어런스가 예상 값보다 낮다는 것을 보여준다(표 1 참조). 도 2에서 캡처한 데이터를 기반으로, 3개의 스테이지를 갖춘 시스템은 3:1의 정용여과 완충물 유속 대 공급물 유속 비율에서 작동할 수 있으며 역류 유동을 활용하여 8개 초과의 자연 로그 클리어런스를 달성할 수 있다. 이 유속 비율과 표 1의 유속과 유사한 표준화된 유속에서, 보유물의 농도는 작업 전반에 걸쳐 일정하게 유지되어야 한다.
도 3의 실험 데이터는 2스테이지 시스템에서 정용여과 완충물 유속 대 공급물(또는 보유물) 유속의 비율이 4:1 미만인 것을 사용하여 정용여과(포도당 감소)의 8 자연 로그를 달성할 수 있다는 것을 보여준다. 정용여과 완충물 유동 대 보유물 유동의 유속 비율이 3.2:1인 실험은 먼저 정용여과 완충물의 유동을 시작한 다음 보유물 측에서 유동을 시작하여 수행되었다. 정용여과 완충물 유동 대 보유물 유동의 유속 비율이 3.7:1인 실험은 먼저 보유물 측에서 유동을 시작한 다음 정용여과 완충물 유동을 시작하여 수행되었다. 정용여과 완충물로 시스템을 완전히 프라이밍하고 정용여과 완충물 유동을 먼저 시작하는 것보다 처음에 이러한 방식으로 시스템을 시작하면 클리어런스가 더 낮다. 두 경우, 모두 시간이 지남에 따라 시스템은 결국 동일한 정상 상태에 도달하게 된다. 도 3에서 3.7 정용여과 완충물 유동 대 보유물 유동 비율에 대해 달성된 최종 클리어런스는 정용여과 완충물 프라이밍 및 유동으로 작동을 시작하는 실제 항체 생산 처리 조건과 비교한 최소 클리어런스를 나타낸다. 데이터는 2스테이지 시스템에서 4:1 미만(정용여과 완충물/공급물)의 역류 유동으로 8 여과량 정용여과가 달성될 수 있음을 보여준다. 생물학적 생성물 제조에서 일반적으로 사용되는 8 여과량의 정용여과 작업의 경우, 사용되는 정용여과 완충물을 50%까지 줄일 수 있다. 표 3은 2스테이지 시스템의 실험실 데이터를 동일한 시간에 동일한 양의 단클론 항체 생성물을 정용여과하는 기존 TFF 시스템의 계산된 값과 비교한다. 데이터는 다중 스테이지 역류 시스템의 효율성 향상을 보여준다. 특히, 데이터는 예시적인 단일 통과 역류 정용여과 시스템에 대한 펌프 통과의 약 40배 내지 약 80배 감소를 뒷받침한다.
| 예시적인 시스템 | 기존 TFF | |
| 펌프 통과 | 1 | 40 내지 80 |
| 유속 | 1X | 100X 내지 200X |
| 정용여과 완충물 요구사항 | 4 여과량 | 8 여과량 |
도 4의 실험 데이터는 3스테이지 시스템에서 정용여과 완충물 유속 대 공급물(또는 보유물) 유속의 비율이 3:1 미만인 것을 사용하여 정용여과(포도당 감소)의 8 초과의 자연 로그를 달성할 수 있다는 것을 보여준다. 생물학적 생성물 제조에서 일반적으로 사용되는 8 여과량의 정용여과 작업의 경우, 사용되는 정용여과 완충물이 63% 감소한다. 표 4는 3스테이지 시스템의 실험실 데이터를 동일한 시간에 동일한 양의 단클론 항체 생성물을 정용여과하는 기존 TFF 시스템의 계산된 값과 비교한다. 데이터는 다중 스테이지 역류 시스템의 효율성 향상을 보여준다. 특히, 데이터는 예시적인 단일 통과 역류 정용여과 시스템에 대한 펌프 통과의 약 40배 내지 약 80배 감소를 뒷받침한다.
| 예시적인 시스템 | 기존 TFF | |
| 펌프 통과 | 1 | 40 내지 80 |
| 유속 | 1X | 100X 내지 200X |
| 정용여과 완충물 요구사항 | 3 여과량 | 8 여과량 |
이전 명세서에서, 다양한 실시예는 예시를 참고하여 설명하였다. 그러나, 다음의 청구범위에 설명된 예시적인 실시예의 더 넓은 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 수정 및 변경이 이루어질 수 있고 추가적인 실시예가 구현될 수 있다는 것이 명백할 것이다. 따라서 명세서와 도면은 제한적인 의미가 아닌 예시적인 의미로 간주되어야 한다.
Claims (20)
- 유체 공급물의 단일 통과 역류 정용여과 시스템에 있어서, 상기 시스템은:
2개 이상의 여과 스테이지들; 상기 여과 스테이지들에서 매니폴드들 사이의 유체 연통을 촉진하는 도관들; 제1 여과 유닛에 유체 공급물을 제공하기 위한 도관 및 적어도 하나의 공급물 펌프; 최종 여과 스테이지에 정용여과 완충물을 제공하기 위한 도관 및 하나 이상의 완충물 펌프; 후속 여과 스테이지에서 이전 여과 스테이지까지 투과물 및 정용여과 완충물을 제공하기 위한 여과 스테이지 당 도관 및 적어도 하나의 완충물 펌프; 및 상기 시스템으로부터 투과물(및 남아 있는 경우 정용여과 완충물)을 제거하기 위한 도관 및 여과물 펌프를 포함하고,
각각의 여과 스테이지는:
(i) 매니폴드 세그먼트 및 (ii) 하나 이상의 TFF 카세트를 포함하고; 여기서, 상기 매니폴드 세그먼트는: 유체 공급물 또는 보유물을 수용하여 상기 여과 스테이지 내로 운반하기 위한 제1 매니폴드(즉, 입구), 보유물을 수용하고 상기 여과 스테이지 밖으로 운반하기 위한 제2 매니폴드(즉, 출구), 투과물 및 정용여과 완충물을 수용하고 상기 여과 스테이지를 통해 운반하기 위한 제3 매니폴드(즉, 입구), 및 투과물 및 정용여과 완충물을 수용하고 상기 여과 스테이지 밖으로 운반하기 위한 제4 매니폴드(즉, 출구)를 포함하고; 상기 매니폴드 세그먼트는 상기 하나 이상의 TFF 카세트에 유체 연결되고;
상기 여과 스테이지들은 하나의 스테이지의 보유물이 다음 여과 스테이지를 위한 공급물로서 역할을 하도록, 후속 여과 스테이지에서 매니폴드 세그먼트의 제2 매니폴드를 매니폴드 세그먼트의 제1 매니폴드에 결합함으로써, 그리고 이전 여과 스테이지에서 매니폴드 세그먼트의 제4 매니폴드를 매니폴드 세그먼트의 제3 매니폴드에 결합함으로써 여과 스테이지들 사이에 유동 경로를 제공하기 위해 상기 매니폴드 세그먼트들을 통해 유체 연결되고;
상기 시스템의 제1 여과 스테이지는 공급물 펌프에 연결된 도관으로부터 유체 공급물을 수용하고; 및 최종(즉, 마지막) 여과 스테이지의 상기 제2 매니폴드는 상기 보유물이 상기 시스템을 떠나는 것을 허용하고 이전 여과 스테이지에 연결되지 않는 보유물 출구이고; 및
상기 TFF 카세트는 정용여과 채널, 편평한 제1 여과막, 보유물 채널, 편평한 제2 여과막, 및 투과물/정용여과 완충물 수집 채널을 포함하며, 이는 (i) 상기 편평한 제1 여과막이 상기 정용여과 채널과 상기 보유물 채널을 서로로부터 경계를 정하고, (ii) 상기 편평한 제2 여과막이 상기 보유물 채널과 상기 투과물/정용여과 완충물 수집 채널을 서로로부터 경계를 정하고, (iii) 상기 정용여과 채널이 상기 정용여과 배지를 위한 적어도 하나의 입구에 유체 연결되며, (iv) 상기 보유물 채널이 상기 공급물 유체를 위한 적어도 하나의 입구 및 상기 보유물을 위한 적어도 하나의 출구에 유체 연결되고, 및 (v) 상기 투과물/정용여과 완충물 수집 채널이 상기 투과물/정용여과 완충물을 위한 적어도 하나의 출구에 유체 연결되도록 구성되는, 시스템. - 제1항에 있어서,
상기 시스템이 2개의 여과 스테이지들을 포함하는 시스템. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 시스템이 3개의 여과 스테이지들을 포함하는 시스템. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 여과막이 30 kD 내지 1,500 kD 범위의 분자량 컷오프(molecular weight cut-off)를 갖는 시스템. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 여과막이 5 kD 내지 1,500 kD 범위의 분자량 컷오프를 갖는 시스템. - 유체 공급물을 여과하는 방법에 있어서,
(i) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 단일 통과 역류 정용여과 시스템을 통해 유체 공급물을 통과시키는 것, 및 (ii) 분리 컨테이너들에서 상기 시스템으로부터 투과물 및 보유물을 회수하는 것을 포함하는 여과 방법. - 제6항에 있어서,
상기 방법이 적어도 8 여과량(diavolume)과 동등한 정용여과를 달성하기 위해 사용될 수 있는 여과 방법. - 제6항 또는 제7항에 있어서,
상기 시스템이 2개의 여과 스테이지(stage)들을 포함하는 여과 방법. - 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 시스템이 3개의 여과 스테이지들을 포함하는 여과 방법. - 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 유체 공급물이 생물학적 생성물 및 하나 이상의 불순물 또는 완충물 성분을 포함하는 여과 방법. - 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법이 생물학적 생성물들을 위한 정제 공정이 끝날 때 또는 그 근처에서 수행되는 여과 방법. - 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 유체 공급물이 상기 생물학적 생성물의 공급원으로부터 얻어지는 방법. - 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 유체 공급물 중의 생물학적 생성물이 크로마토그래피 스텝(chromatography step)으로부터의 용출 완충물(elution buffer)에 존재하는 단일클론 항체인 여과 방법. - 관심 생물학적 생성물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 방법은:
(I) 세포 배양에서 상기 관심 생물학적 생성물을 발현하는 진핵 세포(eukaryotic cell)를 배양하는 스텝;
(II) (a) 상기 관심 생물학적 생성물 및 (b) 하나 이상의 불순물 및/또는 완충물 성분을 포함하는 유체 공급물의 형태로 상기 세포 배양으로부터 상기 관심 생물학적 생성물을 수확하는 스텝;
(III) 상기 유체 공급물로부터 상기 관심 생물학적 생성물을 격리하도록 상기 관심 생물학적 생성물과 상기 하나 이상의 불순물 및/또는 완충물 성분을 포함하는 상기 유체 공급물을 정제하는 스텝; 및
(IV) 상기 관심 생물학적 생성물을 투여에 적합한 약학적으로 허용되는 제제로 선택적으로 제형화하는 스텝을 포함하고; 및
여기서 상기 방법은:
(a) 단일 통과 역류 정용여과 시스템을 통해 상기 유체 공급물을 통과시키는 것, 및 (b) 분리된 컨테이너들에서 상기 시스템으로부터 투과물(및 남아 있는 경우, 정용여과 완충물) 및 보유물을 회수하는 것을 추가로 포함하고;
상기 유체 공급물의 단일 통과 역류 정용여과 시스템은: 2개 이상의 여과 스테이지들; 상기 여과 스테이지들에서 매니폴드들 사이의 유체 연통을 촉진하는 도관들; 상기 유체 공급물을 제1 여과 유닛에 제공하기 위한 도관 및 적어도 하나의 공급물 펌프; 최종 여과 스테이지에 정용여과 완충물을 제공하기 위한 도관 및 적어도 하나의 완충물 펌프; 후속 여과 스테이지에서 이전 여과 스테이지로 투과물 및 정용여과 완충물을 제공하기 위한 여과 스테이지 당 도관 및 적어도 하나의 완충물 펌프; 및 상기 시스템에서 투과물(및 남아 있는 경우 정용여과 완충물)을 제거하기 위한 도관 및 여과물 펌프를 포함하고;
각각의 여과 스테이지는:
(i) 매니폴드 세그먼트 및 (ii) 하나 이상의 TFF 카세트를 포함하고; 여기서, 상기 매니폴드 세그먼트는: 상기 유체 공급물 또는 보유물을 수용하여 상기 여과 스테이지 내로 운반하기 위한 제1 매니폴드(즉, 입구), 보유물을 수용하고 상기 여과 스테이지 밖으로 운반하기 위한 제2 매니폴드(즉, 출구), 상기 투과물 및 정용여과 완충물을 수용하여 상기 여과 스테이지를 통해 운반하기 위한 제3 매니폴드(즉, 입구), 및 투과물 및 정용여과 완충물을 수용하고 상기 여과 스테이지 밖으로 운반하기 위한 제4 매니폴드(즉, 출구)를 포함하고; 상기 매니폴드 세그먼트는 상기 하나 이상의 TFF 카세트에 유체 연결되고;
상기 여과 스테이지들은 하나의 스테이지의 보유물이 다음 여과 스테이지를 위한 공급물로서 역할을 하도록, 후속 여과 스테이지에서 매니폴드 세그먼트의 제2 매니폴드를 매니폴드 세그먼트의 제1 매니폴드에 결합함으로써, 그리고 이전 여과 스테이지에서 매니폴드 세그먼트의 제4 매니폴드를 매니폴드 세그먼트의 제3 매니폴드에 결합함으로써 여과 스테이지들 사이에 유동 경로를 제공하기 위해 상기 매니폴드 세그먼트들을 통해 유체 연결되고;
상기 시스템의 제1 여과 스테이지는 공급물 펌프에 연결된 도관으로부터 유체 공급물을 수용하고; 최종(즉, 마지막) 여과 스테이지의 제2 매니폴드는 상기 보유물이 상기 시스템을 떠나는 것을 허용하고 이전 여과 스테이지에 연결되지 않는 보유물 출구이고; 및
상기 TFF 카세트는 정용여과 채널, 편평한 제1 여과막, 보유물 채널, 편평한 제2 여과막, 및 투과물/정용여과 완충물 수집 채널을 포함하며, 이는 (i) 상기 편평한 제1 여과막이 상기 정용여과 채널과 상기 보유물 채널을 서로로부터 경계를 정하고, (ii) 상기 편평한 제2 여과막이 상기 보유물 채널과 상기 투과물/정용여과 완충물 수집 채널을 서로로부터 경계를 정하고, (iii) 상기 정용여과 채널이 상기 정용여과 배지를 위한 적어도 하나의 입구에 유체 연결되며, (iv) 상기 보유물 채널이 상기 공급물 유체를 위한 적어도 하나의 입구 및 상기 보유물을 위한 적어도 하나의 출구에 유체 연결되고, 및 (v) 상기 투과물/정용여과 완충물 수집 채널이 상기 투과물/정용여과 완충물을 위한 적어도 하나의 출구에 유체 연결되도록 구성되는, 제조 방법. - 제14항에 있어서,
상기 관심 생물학적 생성물이 재조합 단백질(recombinant protein)인 제조 방법. - 제14항 또는 제15항에 있어서,
세포 배양에서 상기 관심 생물학적 생성물을 발현하는 진핵 세포를 배양하는 스텝이 유가식 세포 배양(fed-batch cell culture)에서 일어나는 제조 방법. - 제14항 또는 제15항에 있어서,
세포 배양에서 상기 관심 생물학적 생성물을 발현하는 진핵 세포를 배양하는 스텝이 연속 세포 배양에서 일어나는 제조 방법. - 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
스텝들 (a) 및 (b)이 적어도 8 여과량과 동등한 정용여과를 달성하기 위해 사용될 수 있는 제조 방법. - 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 시스템이 2개의 여과 스테이지들을 포함하는 제조 방법. - 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 시스템이 3개의 여과 스테이지들을 포함하는 제조 방법.
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